CN102660577B - 利用锌指核酸酶敲除牛整合素β6亚基基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用锌指核酸酶(ZFNs)敲除牛整合素β6亚基基因的方法，其是根据牛整合素β6基因序列，设计可特异性识别该基因的锌指核酸酶ZFNs，构建表达载体并转染牛的细胞，如成纤维细胞，获得整合素β6亚基基因敲除的细胞。本发明利用ZFNs介导的基因敲除技术，设计合成了可特异性识别并切割整合素β6亚基基因的一对ZFNs，并成功获得整合素β6亚基双等位基因敲除的转基因克隆牛。利用一次转染，得到双等位基因敲除的细胞克隆，省去了药物筛选过程，促进了细胞单克隆的形成，提高了后续转基因胚胎的发育率。在转基因动物体内不含有外源基因，减少了对外源基因生物安全评价的环节。

Description

利用锌指核酸酶敲除牛整合素β6亚基基因的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种利用锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)敲除牛整合素(Integrin)β6亚基基因的方法。

背景技术

口蹄疫病毒(FMDV)可引起牛、羊、猪等偶蹄动物发生口蹄疫(FMD)，该病不仅造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的持续健康发展以及相关产品的对外贸易。我国通过免疫控制并结合局部强制捕杀的综合防控政策，虽然取得了显著成效，但始终存在FMD散发、地方性流行等。由于FMDV流行株血清型多、变异快、持续性及亚临床感染等原因，通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，需要采取多种手段控制FMD的发生及流行。病毒受体是能够被病毒识别并与之结合，进而导致病毒感染的宿主细胞表面分子，是病毒宿主特异性和组织嗜性的关键因素。若能发现并敲除或封闭FMDV的关键受体，则可阻断病毒感染，进而达到控制和根除FMD的目的。

据报道，整合素αvβ6是启动FMDV感染牛、羊等易感动物的关键受体。在FMDV感染的上皮细胞可同时检测出病毒抗原和整合素受体αvβ6(O′Donnell等，2009；Dash等，2010)；体外重组的αvβ6可与所有血清型的FMDV结合(Ferris等，2011)，是FMDV利用率最高的整合素受体(Duque等，2003)，提升了FMDV的感染效率(Dicara等，2008；Duque等，2004)；抗β6抗体可阻断受体与病毒间的结合并抑制病毒感染(Jackson等，2000)；敲除β6亚基基因的转基因小鼠生长发育正常，3日龄转基因乳鼠可完全抵抗低剂量病毒的攻击。因此，整合素β6亚基基因可作为抗口蹄疫病毒育种研究的靶点。

基因打靶是改变生物体遗传信息的转基因技术，包括通过同源重组将外源基因/修饰的自身基因定点整合到受体细胞基因组(knock in)及将宿主细胞特定基因区段敲除(knock out)。依赖于同源重组及体细胞克隆的传统的基因打靶方法，其打靶效率低、成本高、周期长。因此，人们尝试发现新的基因打靶技术并应用于转基因研究中，ZFN技术的应用大大提高了基因打靶效率。

ZFN由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶的剪切结构域融合而成。此酶N末端为锌指蛋白DNA结合域，由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。C末端为非特异性核酸酶FokI剪切结构域，FokI是海床黄杆菌表达的一种限制性内切酶(Flavobacterium okeanokoites)，当两个单体形成二聚体时才具有活性。ZFNs利用了锌指结构域对DNA序列的特异性识别来达到准确定位靶点的目的，同时利用核酸酶的DNA水解活性，使靶DNA双链断裂，然后利用细胞的修复机制，引入基因突变。该项技术已经被成功用于动物基因改造实验中，具有非常高的基因整合效率。例如，利用ZFNs技术，获得GGTA1基因敲除的猪，其打靶效率为5.7％(Hauschild等，2011)。针对肾素设计的一对ZFNs使其第5外显子上10个碱基缺失，从而产生移码突变，产生的Ren^-/-转基因小鼠的肾素无血浆活性(Moreno等，2011)。

参考文献

1.Dash P，Barnett PV，Denyer MS，et al.Foot-and-mouth disease virus replicates only transiently inwell-differentiated porcine nasal epithelial cells.J Virol.，2010，84(18)：9149-9160.

2.Dicara D，Burman A，Clark S，et al.Foot-and-mouth disease virus forms a highly stable，EDTA-resistantcomplex with its principal receptor，integrin alphavbeta6：implications for infectiousness，J Virol.，2008，82(3)：1537-1546.

3.Duque H，LaRocco M，Golde WT，et al.Interactions of foot-and-mouth disease virus with soluble bovinealphaVbeta3 and alphaVbeta6 integrins，J Virol.，2004，78(18)：9773-9781.

4.Duque H and Baxt B.Foot-and-mouth disease virus receptors：comparison of bovine alpha(V)integrinutilization by type A and O viruses，J Virol.，2003，77(4)：2500-2511.

5.Ferris NP，Grazioli S，Hutchings GH，et al.Validation of a recombinant integrin αvβ6/monoclonal antibodybased antigen ELISA for the diagnosis of foot-and-mouth disease.J Virol Methods.，2011，175(2)：253-260.

6.Hauschild J，Petersen B，Santiago Y，Queisser AL，Carnwath JW，Lucas-Hahn A，Zhang L，Meng X，Gregory PD，Schwinzer R，Cost GJ，Niemann H.233 gender-unspecific knockout of the ggtal gene in pigsusing zinc finger nucleases.Reprod Fertil Dev.2011 Dec；24(1)：229.

7.Jackson T，Sheppard D，Denyer M，et al.The epithelial integrin alphav beta6 is a receptor for foot-and-mouthdisease virus，J Virol.，2000，74(11)：4949-4956.

8.Moreno C，Hoffman M，Stodola TJ，Didier DN，Lazar J，Geurts AM，North PE，Jacob HJ，Greene AS.Creation and characterization of a renin knockout rat.Hypertension.2011 Mar；57(3)：614-9.

9.O′Donnell V，Pacheco JM，Gregg D，et al.Analysis of foot-and-mouth disease virus integrin receptorexpression in tissues from

and infected cattle，J Comp Pathol.，2009，141(2-3)：98-112.

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种利用锌指核酸酶敲除牛整合素β6亚基基因的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用锌指核酸酶(ZFNs)敲除牛整合素β6亚基基因的方法，其是根据牛整合素β6基因序列，设计可特异性识别该基因的锌指核酸酶ZFNs，构建表达载体并转染牛的细胞，如成纤维细胞，获得整合素β6亚基基因敲除的细胞，其中，所设计的可特异性识别并剪切整合素β6亚基基因的ZFNs可特异性识别并剪切整合素β6亚基基因，其识别(大写字母)及剪切(小写字母)的β6亚基基因序列如下：TGT TCT TTC TAT GTC tag gaa GGA ATG ATC ACGTAC。

所述的可特异识别并切割整合素β6亚基基因的ZFN重组表达载体为pBeta6-ko-ZFNP1和pBeta6-ko-ZFNP2，其ZFN编码序列分别如序列表中的序列1和序列2所示，由可特异结合染色体的锌指蛋白结合域和非限制性内切核酸酶Fok I切割域两部分组成，结合域和切割域以整合蛋白形式表达。pBeta6-ko-ZFNP1及pBeta6-ko-ZFNP2分别识别整合素β6亚基基因的TGT TCT TTC TAT GTC和GGA ATG ATC ACG TAC序列，当二者同时表达且有锌离子存在时，ZFNs形成二聚体，其Fok I切割域发挥作用，在taggaa处使整合素β6亚基DNA双链断裂，然后细胞利用其自身的修复机制，通过移码突变的方式敲除整合素β6亚基基因。

所述转染牛的细胞，获得整合素β6亚基基因敲除的细胞具体是：将pBeta6-ko-ZFNP1及pBeta6-ko-ZFNP2共转染牛的细胞后，如成纤维细胞，通过PCR产物测序方法鉴定并筛选整合素β6亚基基因被敲除的细胞克隆。其中，PCR检测使用的引物为P1：5’-CCT GTC CAG GTAGCT TCT G-3’，P2：5’-GTT TCT GAG CTG CAT GAC A-3’。

本发明还提供通过上述方法获得的整合素β6亚基基因敲除的细胞。

本发明还提供通过一种制备整合素β6亚基基因敲除的转基因牛克隆胚胎的方法，其以上述的基因敲除细胞为核供体细胞，以去核的成熟卵母细胞为核移植受体细胞，利用核移植技术获得的牛克隆胚胎。

本发明还提供一种利用ZFN制备转基因牛的方法，其是将上述的克隆胚胎通过胚胎移植技术获得转基因牛。

本发明首次利用ZFNs成功敲除牛成纤维细胞中的整合素β6亚基基因，进而获得该基因敲除的转基因克隆牛。ZFNs介导的基因敲除在单细胞克隆中的效率为12.5～18.3％，与传统的基因打靶技术比较，效率提高了10⁴～10⁵，大大地提高了基因敲除核供体细胞系的制备效率。

本发明利用ZFNs介导的基因敲除技术，设计合成了可特异性识别并切割整合素β6亚基基因的一对ZFNs，并成功获得整合素β6亚基双等位基因敲除的转基因克隆牛。利用一次转染，得到双等位基因敲除的细胞克隆，省去了药物筛选过程，促进了细胞单克隆的形成，提高了后续转基因胚胎的发育率。在转基因动物体内不含有外源基因，减少了对外源基因生物安全评价的环节。

附图说明

图1A为pBeta6-ko-ZFNP1表达载体结构示意图。

图1B为pBeta6-ko-ZFNP2表达载体结构示意图。

图2为锌指核酸酶在293T细胞中的瞬时表达的WB检测结果，其中，1：pAVX对照；2：pBeta6-ko-ZFNP 1；3：pBeta6-ko-ZFNP2。

图3为转染重组ZFN总细胞的PCR产物测序峰图，测序峰图在ZFN切割位点附近出现双峰。

图4为整合素β6亚基双等位基因敲除的细胞克隆的PCR产物测序峰图，双等位基因在ZFN切割位点附近同时发生碱基缺失。

图5为发生移码突变的整合素β6亚基基因双敲除的不同细胞克隆的基因缺失及插入的分析比较结果示意图。

图6为7d时显微镜下观察到的高质量的囊胚。

图7为转基因牛整合素β6亚基基因ZFN作用位点附近的基因测序比对结果，WT：野生型序列，T1、T2及T3：3头转基因克隆牛。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的保护范围。

下述实施例中无特别说明均为常规方法，所用试剂及药品如无特别说明均购自Sigma公司。

实施例1：ZFN表达载体的构建及其基因敲除功能的检验

1 ZFN表达载体的构建

根据整合素β6亚基基因(NM174698)序列信息，ZFNs的设计由Sigma公司完成。设计的一对ZFNs所识别(大写字母)及剪切(小写字母)的β6亚基基因序列如下：TGT TCTTTC TAT GTC tag gaa GGA ATG ATC ACG TAC AAG，如序列表中的序列3所示。

可识别并剪切整合素β6亚基基因的ZFN重组表达载体pBeta6-ko-ZFNP1及pBeta6-ko-ZFNP2的结构如图1A、图1B所示，载体骨架为pAVX，含有pUC ori、CMV启动子、BGH pA及kanR基因。根据推测的可与整合素特异结合锌指蛋白的编码序列，体外化学合成了EcoRI-Flag-NLS-ZFNP1-BamHI及EcoRI-Flag-NLS-ZFNP2-BamHI基因，其序列分别如序列表中的序列1(1-576bp)和序列2(1-657bp)所示，同时化学合成了其各自的BamHI-FokI-XhoI基因，序列分别如序列表中的的序列1(571-1182bp)和序列2(652-1257bp)所示。利用EcoRI、BamHI及XhoI酶切位点，将锌指蛋白及FokI克隆到pAVX载体上，构建成可识别并剪切整合素β6亚基基因的ZFN重组表达载体。其中，NLS为核定位信号，可引导重组ZFN进入核区；Flag-tag用于重组蛋白表达的WB检测中。

2 锌指核酸酶在293T细胞中的瞬时表达

293T细胞在37℃、5％CO₂的条件下培养，培养液为含10％FBS的DMEM。在脂质体Lipfectamine^TM2000的介导下，将8μg pBeta6-ko-ZFNP1及pBeta6-ko-ZFNP2分别转染293T细胞，pAVX质粒做对照。转染48小时后，收取细胞并用RIPA裂解液裂解，取含20μg总蛋白的细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳，然后经电转移至PVDF膜上。用含10％BSA封闭液封闭后，用1∶1000的酶标小鼠抗FLAG的一抗和酶偶联的羊抗鼠IgG(PIERCE)稀释的二抗进行免疫标记，用化学发光底物显色，检测重组蛋白表达产物。检测结果见图2，2个重组质粒均表达了目的蛋白。

3 ZFN基因敲除功能的检验

3.1牛胎儿成纤维细胞系的建立

选用2月龄的荷斯坦奶牛胎儿(购自山东奥克斯生物技术有限公司)，用70％酒精清洗包被奶牛胎儿的羊膜数次后，刺穿羊膜，取出奶牛胚胎，于PBS液中洗数遍，取胎儿组织，剪碎成小块(体积小于1mm³)，再用PBS洗2遍后，加入10mL的胶原酶和胰蛋白酶混合液37℃消化20-40min后，加入20mL含10％胎牛血清的DMEM:F12营养液分散，1000rpm 10min，再加入10％胎牛血清的DMEM:F12营养液重新悬浮，细胞计数，按3.0×10⁵的细胞量接种于100mm的培养皿中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养2-3d，待细胞生长至单层后，用0.25％胰蛋白酶消化传代1次，液氮保存(冻存液成分为：80％DMEM:F12，10％FBS和10％DMSO)，获得牛胎儿皮肤成纤维细胞系。

3.2ZFN基因敲除作用的检验

将pBeta6-ko-ZFNP1及pBeta6-ko-ZFNP2重组质粒线性化后，浓缩浓度不低于1μg/μL，经脂质体LTX转染处于对数生长期的牛胎儿成纤维细胞(DNA∶脂质体LTX＝1∶3；pBeta6-ko-ZFNP1∶pBeta6-ko-ZFNP2＝1∶1)，24h后提取总细胞DNA并进行PCR扩增，PCR检测使用的引物为P1：5’-CCT GTC CAG GTA GCT TCT G-3’，P2：5’-GTT TCT GAG CTGCAT GAC A-3’，如序列表中的序列4、5所示。引物P1和P2分别位于ZFN作用位点的上游和下游，当转染的pBeta6-ko-ZFNP1/pBeta6-ko-ZFNP2在部分细胞内发挥ZFN功能时，纯化的PCR产物测序后，其峰图将是杂合峰图。对上述实验重复3次，均获得了杂合峰图，见图3，表明pBeta6-ko-ZFNP1/pBeta6-ko-ZFNP2对牛整合素β6亚基基因具有特异的敲除作用。

3.3ZFN敲除效率的检测

线性化的pBeta6-ko-ZFNP1及pBeta6-ko-ZFNP2重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞，24h后提取总细胞DNA并进行PCR扩增，引物为P1/P2。纯化回收PCR产物并与T3载体连接，转化大肠杆菌后，挑取不同克隆测序，经序列比对分析，计算突变型与总有效测序数(突变型与野生型克隆的总和)的比值，该值为敲除效率。对上述实验重复3次，pBeta6-ko-ZFNP1/pBeta6-ko-ZFNP2的敲除效率为12.5～18.3％。

实施例2：整合素β6亚基基因敲除单克隆细胞的获得

1转染pBeta6-ko-ZFNP1/pBeta6-ko-ZFNP2细胞的单克隆培养

线性化的pBeta6-ko-ZFNP1及pBeta6-ko-ZFNP2重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞，24h后细胞计数，按照每皿500个细胞的量将细胞接种于10cm培养皿中，使用含15％FBS的DMEM培养基，于37℃、5％CO₂条件下培养1周后，在显微镜下观察并用记号笔标记细胞生长状态好的单克隆细胞，利用克隆环及胰蛋白酶消化的方法，将单克隆细胞扩繁到48孔板培养。待细胞铺满单层后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，取出10％的细胞进行PCR扩增，引物为P1/P2，鉴定其是否发生基因敲除。另外，90％的细胞接种于6孔板，长满单层后冻存，阳性克隆细胞用于后续转基因胚胎及克隆牛的生产。

2基因敲除单克隆细胞的鉴定

将实施例2方法1中所取出的10％细胞进行PCR扩增，引物为P1/P2，PCR产物回收纯化后，分成两份，一份直接进行测序，若测序峰图在ZFN切割位点附近出现双峰，表明该克隆发生了基因敲除且其为杂合子；另外，也会出现野生型及双等位基因敲除的突变型克隆，见图4。将基因敲除为杂合子的克隆的另一份PCR产物与T3载体连接，通过TA克隆测序方法获得突变细胞克隆的整合素β6亚基的基因序列。筛选发生移码突变的整合素β6亚基基因敲除的细胞，用于后续转基因胚胎及牛的生产。

实施例3：整合素β6亚基基因敲除转基因胚胎及牛的制备

1 基因敲除单克隆细胞的获得

利用实施例2方法2，获得发生移码突变的整合素β6亚基基因双敲除的细胞克隆，其基因缺失及插入的分析结果如图5，将其作为核供体细胞，用于转基因胚胎及牛的生产。

2 卵母细胞的成熟培养

将取自周边地区屠宰场的成年奶牛和黄牛的卵巢，用PBS液清洗3遍后，用直径为0.7mm的针头抽取卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体，将其用成熟液(M199培养液中添加10％FBS，0.01U/mL bFSH，0.01U/mL bLH和1μg/mL雌二醇)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体按50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养约20h，将成熟的卵母细胞放入含0.1％透明质酸酶的管内振荡2-3min后，用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞和卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀，并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体。

3核移植和克隆胚胎的体外培养

将步骤2获得的第一极体的卵母细胞移入操作液(M199培养液中添加10％FBS，7.5μg/mL细胞松弛素B)中，在显微镜下用玻璃针于极体上方的透明带切一小口，再用玻璃管将第一极体及其下方的卵母细胞的染色体一并吸除，再用含20％的FBS的M199液体培养基洗3遍，置于38.5℃、5％CO₂的培养箱中备用。将步骤1获得的转基因细胞活化至长满单层，用胰蛋白酶消化，悬浮细胞离心，再加微量的营养液悬浮，用玻璃针选择直径为10-12μm的转基因成纤维细胞的细胞核，用玻璃管将其移入去核的卵母细胞的透明带内，然后将其放入0.3M甘露醇、0.15mmol/L Ca²⁺和0.15mmol/LM^g2+的溶液中，3-5min后放入融合槽内，转动卵母细胞使供体细胞核与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5KV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入添加10％FBS的M199培养液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步的激活处理，将重构胚放入5μmol/L离子霉素液中，4min后移至1.9mmol/L的6-DMAP液中，4h后再移入含5％FBS的CRIaa液中，在38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养，于7d时观察胚胎的发育状况，挑选出高质量的囊胚(见图6)，共获得好的转基因囊胚148枚，玻璃化冻存于液氮中，每管2枚，需要移植时直接解冻即可用。

4 胚胎移植与妊娠检测

将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并在移植后的第60d进行直肠检测以确定妊娠率。已累计使用受体牛74头，怀孕2个月以上的受体牛25头，怀孕率33.8％。目前，已出生转基因牛3头。

5 转基因克隆牛的分子生物学鉴定

取3头转基因牛耳部组织少许，消化并提取基因组DNA，进行PCR扩增并测序，基因敲除鉴定的具体方法同实施例2中基因敲除单细胞克隆的鉴定。基因测序结果见图7，与野生型(WT)比较，转基因牛T1和T2的整合素β6亚基基因分别缺失4bp和10bp，转基因牛T3则插入4bp，3头牛均为移码突变导致的整合素β6亚基双等位基因敲除的转基因克隆牛。

尽管上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，本领域技术人员可以较容易地进行一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种利用锌指核酸酶敲除牛整合素β6亚基基因的方法，其特征在于：其是根据牛整合素β6基因序列，设计可特异性识别该基因的锌指核酸酶，构建ZFN重组表达载体并转染牛的细胞，将pBeta6-ko-ZFNP1及pBeta6-ko-ZFNP2共转染牛的细胞，通过PCR产物测序方法检测整合素β6亚基基因是否被敲除，筛选并获得整合素β6亚基基因敲除的细胞；

所设计的一对ZFNs可特异性识别并剪切整合素β6亚基基因，其识别及剪切的β6亚基基因序列如下：

TGTTCTTTCTATGTCtaggaaGGAATGATCACGTACAAG；

其中，大写字母表示的序列为识别的序列，小写字母表示的序列为剪切的序列；

所述可特异识别并剪切整合素β6亚基基因的ZFN重组表达载体为pBeta6-ko-ZFNP1和pBeta6-ko-ZFNP2，载体骨架为pAVX，含有pUC ori、CMV启动子、BGH pA及kanR基因，构建方法为：

体外化学合成了EcoRI-Flag-NLS-ZFNP1-BamHI及EcoRI-Flag-NLS-ZFNP2-BamHI基因，其序列分别如序列表中的序列1中1-576bp和序列2中1-657bp所示，同时化学合成了其各自的BamHI-FokI-XhoI基因，序列分别如序列表中的的序列1中571-1182bp和序列2中652-1257bp所示；利用EcoRI、BamHI及XhoI酶切位点，将锌指蛋白及FokI克隆到pAVX载体上，构建成可识别并剪切整合素β6亚基基因的ZFN重组表达载体，其中，NLS为核定位信号，可引导重组ZFN进入核区；Flag-tag用于重组蛋白表达的WB检测中。

2.根据权利要求1所述的利用锌指核酸酶敲除牛整合素β6亚基基因的方法，其特征在于：

所述PCR检测使用的引物为：

P1：5’-CCT GTC CAG GTA GCT TCT G-3’，

P2：5’-GTT TCT GAG CTG CAT GAC A-3’。

3.根据权利要求1所述的利用锌指核酸酶敲除牛整合素β6亚基基因的方法，其特征在于：所述牛的细胞为成纤维细胞。

4.权利要求1所述的利用锌指核酸酶敲除牛整合素β6亚基基因的方法获得的基因敲除细胞。

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