CN104498481A - 猪h11位点的dna片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了猪H11位点的DNA片段及其应用。上述的猪H11位点的DNA片段的序列如序列表中的序列1所示，该位点可用于构建猪定点突变库。在该位点插入基因安全性高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。在猪的基因组中定位H11这样安全有效的基因修饰位点，通过在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以构建猪H11基因突变库,可为培育优良品系的猪提供前期技术支持。

Description

猪H11位点的DNA片段及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及能被定点插入的猪H11位点的DNA片段及其应用。

背景技术

基因修饰主要是指利用生物化学方法修改DNA序列，将目的基因片段导入宿主细胞内，或者将特定基因片段从基因组中删除，从而达到改变宿主细胞基因型或者使得原有基因型得到加强的作用。基因修饰目前已经广泛应用于人类生活的各个领域，例如，在医学上，可以利用基因修饰的方法抑制某些病毒类宿主细胞内的病毒复制，从而达到治疗的目的；在农业上，利用基因修饰的方法，人们已经成功地改变了农作物和畜禽的生产特性，从而达到改良以及传播优良品种的目的。

在基因修饰的过程中，通常需要进行目标基因的表达，那么就需要有一个载体去容纳你要的目标基因。而DNA编码密码子是3个一个。外源目标基因不能随便插入，否则不能正确表达，还会把原有的顺序弄乱，造成基因重排。插入位点就是可以插入基因的位点，在它那里插入外源基因，不会改变原有质粒的复制及表达，还能使自身有正常表达的机会。目前，使用较多的插入位点是Ros26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，因此需寻求一种更适宜的插入位点。

2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。此外，H11位点由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术不足提供一个供基因插入的猪H11位点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列1所示。

进一步的，上述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列2所示。

可进一步的，上述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列3所示。

本发明的另一个目的是将上述基因位点用于构建猪定点突变库上。

本发明的再一个目的是提供一种含有上述猪H11位点序列的试剂盒。

本发明提供的猪H11基因位点由于位于两个基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的完成目的基因的定点插入。此外，在该位点插入基因安全性高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。在猪的基因组中定位H11这样安全有效的基因修饰位点，通过在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以构建猪H11基因突变库,为培育优良品系的猪提供前期技术支持。

附图说明

图1为测序检测分析酶切载体结果图；

图2为利用CRISPR/cas9靶向切割系统构建的绿色荧光蛋白定点插入猪H11位点后细胞PCR扩增鉴定结果图；以及

图3A和图3B为阳性克隆的荧光激发图；其中图3A为可见光下的细胞显微观察图，图3B为紫外光下的细胞显微观察图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

如背景技术中所提到的，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的方式使外源基因随机插入猪基因组中，为后续分析带来了麻烦，为了克服上述缺陷，本发明提供了一种能定点插入的位点序列，利用该位点可构建该位点的切割系统以及定点插入的打靶载体系统，该方法操作简单，同时能让外源基因稳定在H11表达，为转基因搭建了稳定的平台。

下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益效果。

实施例1CRISPR/Cas9靶向定点切割系统的构建

1、根据我们提供的猪H11位点序列，设计用于基因敲除的多肽靶点，如下：5’-TACTGAAATGTGACCTACTTTCTTATGTTCCTGGAAGTTTAGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG-3’，

sgRNA靶位点位置1(命名为H11-sg1):5’-GTTCCTGGAAGTTTAGATCAGGG-3’，相对应的sgRNA序列中识别该靶点的核苷酸序列为5’-UGAUCUAAACUUCCAGGAAC-3’。

sgRNA靶位点位置2(命名为H11-sg2):5’-AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG-3’，相对应的sgRNA序列中识别该靶点核苷酸序列为5’-AGAGCUGCCCACCCUGAUAU-3’。

2、sgRNA表达质粒构建

使用唯尚力德公司的cas9/gRNA构建试剂盒(Catalog.No.VK001-01)完成构建，构建过程如下：

(1)根据前面所述的两个靶点序列，设计相应的引物序列，由北京天一辉远公司合成，具体序列见表1：

表1两个sgRNA靶点引物序列

核苷酸名称	序列(5’-3’)
		H11-sg1-F	AAACACCGGTTCCTGGAAGTTTAGATCA
H11-sg1-R	CTCTAAAACTGATCTAAACTTCCAGGAAC
		H11-sg2-F	AAACACCGAGATCAGGGTGGGCAGCTCT
H11-sg2-R	CTCTAAAACAGAGCTGCCCACCCTGATCT

(2)寡核苷酸二聚体(oligoduplex)的形成

将合成的oligo分别稀释成10μM，分别按如下比例混合

分别混匀后，按照如下程序处理：95℃3min；将样品管放在95℃水中使上述混合物由95℃到25℃缓慢冷却；再在16℃下处理5min，最终获得寡核苷酸二聚体-1。

分别混匀后，按照如下程序处理：95℃3min；将样品管放在95℃水中使上述混合物由95℃到25℃缓慢冷却；再在16℃下处理5min，最终获得寡核苷酸二聚体-2。

(3)寡核苷酸二聚体分别插入到载体中

在以下反应体系中进行反应：

充分混合后，室温(25℃)静置5min，获得载体Cas9/gRNA-H11-sg1。

充分混合后，室温(25℃)静置5min，获得载体Cas9/gRNA-H11-sg2。

(4)转化

分别取步骤(3)的最终产物(载体Cas9/gRNA-H11-sg1、Cas9/gRNA-H11-sg2)5μL加入到刚解冻的50μL DH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟后，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，直接涂于氨苄抗性的平板。

(5)验证

挑5个白色菌落摇菌，提取质粒DNA进行测序。测序引物为：5’-TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3’，得到Cas9/gRNA-H11-sg1与Cas9/gRNA-H11-sg2的测序结果，上述测序结果见序列表中的序列4和序列5。该结果表明，通过上述操作能顺利将编码sgRNA的DNA序列(即靶位点1和靶位点2的序列)插入到Cas9/gRNA载体骨架中。

实施例2定点插入绿色荧光蛋白的方法

借助实施例1中所述的根据靶位点1构建的CRISPR/Cas9靶向定点切割系统系统对猪H11位点定点插入绿色荧光蛋白的方法，包括如下步骤：

1、打靶载体构建

(1)合成片段

依据猪H11位点的DNA序列设计3’端同源臂(序列6所示)、相应的通用引物(序列7所示)以及在两端分别加酶切位点：MluI(ACGCGT)与FseI(GGCCGGCC)加入，合成片段如下：

5’-ACGCGTttcccgaggctGagttagttgGtccagccagtgattgagttgcgtgcggagggcttcttatcttagTTTTATAGGCTACACTGTTAACACTCAGGCTGTTTTCTACCGTTTAGTCAAAATATAGTCACCTTGCCTGCTTCACCTGTCCATCAGAGAATGGCCTCATTAATTGACTCTCTAGTATGAAGTCAAAGTAGCTTTGGTGGCCCTAAATGGACAAGTATCAAGAGACTGGGTGAATTGAGGAGCTTGAGACTGTCACCTCAGATCGAAAAGACTGAAAAATCACCTCAGATCAAAAAGACTGAAAAATCTTCAGTCTGGAAAGGGGACTCAAAACCATAATTAGAGTATTCTGGTAGAATCCTTTTCTCCACTGTTATTCATACAGTTAAGGTGAATAACTAAAAGTAATTGTGAGCTGAGGAGTAAGATACAACACACAAGGAATCAGTTAACAGAGTCTCGAGTGAAATTATAAATGGAAAGAATTATGACTTGAATCATAACTCTGAGGCCCCATTTTCCCTAACAACTTTTGTCCCAATAAACGTGGGTATTTGTTTGGGAGAAACTATCATATACATGATTACCCAGTAAACAGACTGTTTACTAAGTGGGTTTAATTTTAGAAATTGCGCGCTGCAATCTGGTATTAACCATACAACTACCTACCTATAGGGTCAGCCCAGCCTGAACTATCCCATTGGGGTCTTTATTAAGGCTCAAGAAACGGCCATAGCTTCTTCCTTTAAAATGAGTGTTTATTTCTATGAGCTTTAAAGAAAAAAACAGATAATTTCCCTCAACCTACTGAAGAGGAAGGGATTCAGGAAGAAATAAACACAACAATGCCATTCACTTCAGGCCGGCC-3’

(2)用MluI(ACGCGT)与FseI(GGCCGGCC)酶切连入载体pLHG-4(回收9kb左右大小片段，pLHG-4序列见序列表中序列10所示)中(pLHG4构建步骤参见李和刚博士学位论文)，得载体命名为pLHG-H11-AR，序列如下：5’-CTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTACTTAAGGGCGCGCCATGAGATGAACTGCTCTGGGATGCCTAGGTAAATTTCTCTGCATTTCAGTTTCTTTTTAGGAAAGTCAGAACTGTTCCTTGCAAGATGAGTTCTGAGAACAGAATGTGTTGCAGAAAGTACTGGAGTCTTTCTAAAAATTTATCCTATGATATTTCCAAGAGACATGGTCACCCTTAAGCAAAGTTATACAAGTATTCATGGTCAATTAATACCATTTGGGGGGGTGTCTTTTTTCTAGGGCTGCACCCATAGCATAAGGAGGTTCCCAGGAGGTGTGGCCGTCAGCTTATGCCACAACCACAGAAACACCAGATCCAAGCGGCATCTGTGACCTATACCACAGCTCATAGCAACGCCAGATCCTTAGCCCCCTTGATTAAAGCCAGGGATCAAACCTGCCTCCTCAAGGATGCTAGTCAGACTCGTTTACTCTGAGCCACGACAGGAACTCCAAGTAATACCATTTTTAATCTGGAAAAAAATCTAAATATCATTAAATCCAACCTTGTTATTATAAAAGAAGGTACCCCATAGCAAAGGTAGCTAATTCATTCAACTAATGTGCAGCTCATTAAGGGTGGAGCTGGGAAGTGAGATCTCCTACTTAGCGTCACATGCCACCTTGCCTAATAATGATGTATTTGTCTATCAAATGCCTACAAAGACATACAGAGTCTCTCCCTGGACAGTTTTCATTTTATTATGTGATCGTTACTACCCCAAAGATTTCTTTCTTGATTTTATTTTGTCCCTCATATTCTGTCTGTCATCCCTACATTCAGATATCAGAGGTGGGGGTATTGGGGAGGGGGAGATGAGGAGAGGAAAAGGATTGGTTGGTGCATGGCCAGTCAAGTTGAAGATGACTGCAACAATCACGAGAAATCTCTGCAAAACTATAAAAGCTTCCTGGGGTGCCTTCTGAAAAAGTCTGATCCAAGTTGCTTTATTAGGGCCTGGACCATTTCTAGAAGTAGATGAATGCATTCCTTTCATTGGCTAGGAGGTGGGGATGGGGCAGAGAGCATACTTCTGTTTCTGCAGCTGAGACCTGGACATGGTGAACCTGGAGTAGCTACCCATATGGCATGGACAGGTCCAACTGCTGCCCCCTCCTTTGTCCCCCAAGAAGCCAGCAGGGGCAGGATGAAGGCCACCTTGGGGCTGCCCTGAGCCTCCTGCAGTATGCCTGGCAACTACTTTCTTAGCCATCTTTAAGGCCCAATCTTGGGTAAAATACTACTCAACCCATTCTTTAGCCACCTTCTCCAAATGCTTCTAGAAAGCGGCCCCCACAAGTAGGTTCTCTGCAGCAGCACAGTGCAAATGGAGGAACACGACCTCAGTAATTATTTTGTCACTGCAAAGTATCTACAACCTTTGCTATAAAAATTAACACCTTGCTTTCCCTGAAAAATAGCCCAGTCATATCCAGCATTTTCCAGCATCCAGGGCAGAGTGCTTGCTCCTCCCCCAGTCAACAGGACTGTTCATACCGAGGAAATGATTTGAGGGTTCTTTAAGCATTTACGCTGTTAATGCTAAAGCTTTCACGACTTCTACCTGAGGGGGGCTTGAGGGAGGGGGGAGGTTTATGTCCCTGCACCGCCAGGAGCCTGGTCTTTGGTAGGAACGCAGAGGCAGCCGGCGACCTTCCACCCTCAGTGTGTCCTTCCCCAGGAGTTTAGGGAAGTGAATCCCTAGATCCAGCCAACATTTCCACTCCCATTTTCAAGAGATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAAGCATCGGCAGGTCAGCAAACCAGCAGTTCTCCATCCTTGGGATCTTAGCAGCCGACGACCTTAATTAAACGCGGTGGCGGCCGCATTACCCTGTTATCCCTAGAATTCGATGCTGAAGTTCCTATAGTTTCTAGAGTATAGGAACTTCGGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCCGGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGT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(3)合成片段

依据猪H11位点的DNA序列设计5’同源臂(序列8所示)、相应的通用引物(序列9所示)加入RFP编码序列、polyA序列以及在两端分别加入酶切位点：AscⅠ(GGCGCGCC)、PacⅠ(TTAATTAA)，合成片段如下：

5’-GGCGCGCCCATTGAGCCACGAACAGAACTCCCTCTTACCAACTTATTACTACTAACTTCCCAAGTACTGGCTGCTCAGCTGCTTCCTTGGGCATGGGGGAGGGAGCACTATTTTTTCCTCTCCTGACTTCATCCTCTTCCTTTTAATTTCCATAAGGTTCCCTGTGGCCCTGTGCTTTTTTATTTTGAGGCCTTGCACATCCTTCTGGCCCTGATTGCTTCTCAACTCATCTTGTGCCTGCTGGACTTCCACCGTTGTTTCATGTATCTCGTTAGCTGAGATAGCACTTCCTCCTGCCCTTACCCTTTATCTGGCTCTTAGCTCCTGAAAACTGCATTATTAGCTTCCTCTTTTGCCTCTACTCTTACTCAACCAAAATTGTTTTAAGATCTGTGGATCTAGCTTCTGCTGTGCTATTCTTAGGAACACTTTTATTTCCTCTTAGCTCCATCTCACCAGTTATTGGCTAATGGCTTTGCTTGGTACCTACATCTGTACATTTCTTTCGTACTAGCTTCTAGACTGAAAAAGGACTGTTGGTTCAACATGAAAGGGAAGGAGGTAAAAGAGGACACACAGGAAAGATGGATTGGGATTCAGGTCTCTGCTGTTGTTACTTGAGATTGCTTTCTAGATTCTACTTGTGGAAACAAAAAGCCTTTGCGAGAATTCTAAACTGGAGTATTTCTGTAATTGAGGAGTCTTGCTCAGCAAATCCCACTTAGGGGACTAATGAAGTACCAGGAAGAGACAGACCATGCTCAATCCACAAAGCCAGGTTTTACTGAAATGTGACCTACTTTCTTATGCGATCGCCTgccgaaagagtaatgTtggCCgagataggagaagacGatgatatcacgctacgacggaaacAGTACTATGGCCTCCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCCGAGGTCAAGACCACCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAAGACCGACATCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGCCTAAGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA TTAATTAA-3’

(4)用AscⅠ(GGCGCGCC)、PacⅠ(TTAATTAA)双酶切上载体与pLHG-H11-AR(回收8kb大小片段)，并连接，得终载体pLHG-H11，(用BclI(TGATCA)进行线性化酶切)序列如序列表中的序列11所示：

2、载体效率验证

(1)分离猪胎儿成纤维细胞。

从流产的猪胎儿中分离得到PEF细胞，具体分离方法参见文献：李红，魏红江，许成盛，汪霞，卿玉波，曾养志；版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特征。

(2)线性化

利用BclI(NEB,R0160S)对pLHG-H11酶切线性化，利用天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)，回收片段用于下一步实验，具体操作方法参见试剂盒说明书。

(3)核转染

将重组质粒Cas9/gRNA-H11-g1与线性化的pLHG-H11各2.5μg通过电转化的方式分别转染PEF细胞，得到重组细胞。转染的具体步骤是：使用核转仪(Amaxa，型号：AAD-1001S)及配套的哺乳动物成纤维细胞转染试剂盒(Amaxa，货号：VPI-1002)进行转染。首先使用0.1％胰蛋白酶(Gibco，货号：610-5300AG)消化贴壁细胞，用胎牛血清(Gibco，货号：16000-044)终止消化，磷酸盐缓冲液(Gibco，货号：10010-023)洗涤细胞两次，添加转染试剂，使用程序T-016转染细胞。

(4)细胞筛选

电转后，将得到的重组细胞30℃培养72小时，然后收集细胞。对细胞进行稀释，每个10cm培养皿铺一定数量的细胞，每2-3天换一次培养基。

铺板约10天后，细胞单克隆开始形成，收集每个单克隆一半的细胞量用于基因组提取，剩下的细胞继续培养。一共收集克隆132个。

5)细胞阳性鉴定

利用下列通用引物进行PCR扩增，扩增序列为：

表2：PCR扩增所使用的引物

使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，电泳检测结果见图2，图2中P1表示引物H11-L-F1与H11-L-R1扩增出片段，大小为1.2kb，P2表示H11-L-F2与H11-L-R2扩增片段，P3表示H11-R-F3与H11-R-R3扩增片段。

通过经PCR鉴定可得出，132个克隆中得到阳性克隆31个(3对引物均扩出)，所得阳性率为23％，将筛选出的阳性克隆置于紫外光下激发，结果见图3A和图3B，从图3A和图3B中可见筛选出的阳性克隆均能激发绿色荧光，由此可见利用该位点能够有效的实现欲插入基因的定点敲入。

Claims (5)

1.猪H11位点的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示。

3.根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序列3所示。

4.权利要求1所述的H11位点在构建猪定点突变库上的应用。

5.含有权利要求1所述的猪H11位点序列的试剂盒。