CN103409448B - 一种模型小鼠制备方法及条件性细胞剔除重组载体 - Google Patents
一种模型小鼠制备方法及条件性细胞剔除重组载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103409448B CN103409448B CN201310390634.8A CN201310390634A CN103409448B CN 103409448 B CN103409448 B CN 103409448B CN 201310390634 A CN201310390634 A CN 201310390634A CN 103409448 B CN103409448 B CN 103409448B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant vector
- idtr
- fluorescent protein
- mice
- mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 31
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 18
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000411 inducer Substances 0.000 abstract description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009191 jumping Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 87
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 52
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 44
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 19
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 19
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 3
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 3
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000018710 Heparin-binding EGF-like Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 2
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- -1 Pro amino acid Chemical class 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 2
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000003683 cardiac damage Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 231100000409 cytocidal Toxicity 0.000 description 1
- 230000000445 cytocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于条件性细胞剔除的重组载体及其制备方法，其中，所述重组载体包含DNA片段结构iDTR-2A-FP；其中，iDTR为白喉毒素受体的编码基因，2A能够通过核糖体跳跃实现自剪切的一段多肽片段的编码核酸序列，FP为荧光蛋白的编码基因。本发明还提供了一种条件性细胞剔除模型小鼠的制备方法。本发明所提供方法制备的细胞剔除模型小鼠与Cre小鼠交配后获得的后代小鼠具备以下特点：（1）可以通过对荧光蛋白的表达情况对细胞剔除效率进行直接检测，确认细胞是否从体内敲除干净，从而能够获得更加准确直观的实验结果；（2）能通过控制诱导剂的给予时间，在时间上对靶基因的表达或缺失进行控制。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的涉及一种用于条件性细胞剔除的重组载体及其制备方法和条件性细胞剔除模型小鼠的建立方法
背景技术
条件性细胞剔除以染色体位点特异性重组酶系统为基础，目前常用的位点特异性重组酶系统为Cre-LoxP和Flp-FRT系统。例如在待敲入的一段条件致死基因的DNA序列的上游放置一对LoxP-Stop-LoxP序列，得到条件性细胞剔除模型小鼠。再将条件性细胞剔除模型小鼠与带有细胞特异性表达的Cre小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里将条件致死基因敲入的小鼠，即获得条件性基因敲入小鼠。而后再通过控制诱导剂的给予时间实现对特定细胞的敲除。
白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)是白喉棒状杆菌产生的细菌外毒素，它具有抑制蛋白质合成的作用，可以使机体产生严重的中毒反应。白喉毒素是由白喉毒素受体(Diphtheria toxin receptor，DTR)介导进入细胞的。通过在目标细胞中表达白喉毒素受体，可以使对白喉毒素先天不敏感的细胞转化为白喉毒素敏感，1～2个DT分子就可以杀灭一个细胞，DT的这一特点被用来构建敏感有效的细胞剔除系统。
目前国内外常用的几种细胞剔除模型小鼠有：Rosa-Stop-DTR（R26iDTR）小鼠、Rosa-Stop-DTA小鼠和Rosa-EGFP-Stop-DTA小鼠。
Rosa-Stop-DTR（R26iDTR）小鼠是目前最多用来做细胞剔除的工具小鼠。其载体结构为：SA-LoxP-pA-Frt-Neo-Frt-Stop-LoxP-iDTR-pA。Rosa-Stop-DTR（R26iDTR）小鼠与Cre小鼠交配之后，后代小鼠需要注射DT才能杀死表达iDTR的细胞，是一种诱导条件性细胞剔除。但因为没有EGFP这样的报告基因来追踪，不能观察这种小鼠体内表达Cre的细胞是否已经被敲除干净。
用于构建Rosa-Stop-DTA模型小鼠的重组载体的结构为：LoxP-Stop-LoxP-DTA；用于构建Rosa-EGFP-Stop-DTA模型小鼠的重组载体的结构为：SA-LoxP-EGFP-PGK-Neo-tpA-LoxP-DTA-bpA。这两种小鼠与Cre小鼠交配之后，所有表达Cre的细胞都会表达DTA（白喉毒素的A亚基），DTA可以直接杀死细胞，因此表达Cre的细胞在体内不能存活。Rosa-EGFP-Stop-DTA小鼠与Cre小鼠交配前，通过荧光蛋白EGFP的表达，可以较方便地验证模型的构建成功与否，但此时由于Stop序列的存在，DTA不表达；与Cre小鼠交配后，如果后代的细胞表达Cre，由于EGFP及Stop序列在两个LoxP位点之间，LoxP位点间的序列会被Cre重组酶识别而被切除，所以表达Cre的细胞中EGFP及Stop序列会被去掉，DTA得以表达，表达出来的DTA将细胞直接杀死。这两种模型小鼠的缺陷是：所有表达Cre的细胞均被杀死，不能通过荧光蛋白报告基因来追踪表达Cre的细胞是否被从体内敲除干净,也不能在时间上对靶基因的表达或缺失进行控制。
此外，目前多使用具有129遗传背景的小鼠胚胎干细胞制备模型小鼠，然后在C57BL/6等近交系小鼠上回交得到基因敲入模型小鼠。该方法的缺陷在于：一般需要进行超过10代的回交，才能够获得纯合子模型小鼠，回交往往需要2年的时间耗时长，科研精力和资金投入大；另一方面，因为回交次数不一样，也会造成实验结果重复性差，不利于科研和实际应用。这对开发制作标准模式动物也是一个很大的缺陷。而具有C57BL/6遗传背景的由C57BL/6胚胎干细胞制备的纯合子模型小鼠则不需要进行多次的回交过程即可以获得，能够为科学研究节省大量时间和金钱。
由于目前几种模型小鼠存在的上述缺陷，因此有必要开发一种用于条件性细胞剔除的重组载体，利用该载体制备的模型小鼠与Cre小鼠交配所产生的后代能够具备以下优点（1）能对细胞的剔除效率进行直接检测，确认细胞是否敲除干净，使实验数据更可信、更准确（只有表达荧光蛋白的细胞才会被剔除，不表达的不会被剔除）；（2）能通过控制诱导剂的给予时间，在时间上对靶基因的表达或缺失进行控制。此外，有必要开发一种具有C57BL/6遗传背景的由C57BL/6胚胎干细胞制备的纯合子条件性细胞剔除模型小鼠的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于条件性细胞剔除的重组载体及其制备方法和条件性细胞剔除模型小鼠的制备方法，从而获得在应用于细胞剔除操作中时可以对细胞剔除效率进行直接检测，并且能在时间上对靶基因的表达或缺失进行控制的细胞剔除模型小鼠。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于条件性细胞剔除的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含DNA片段结构iDTR-2A-FP；
其中，iDTR为白喉毒素受体的编码基因，2A为能够通过核糖体跳跃实现自剪切的一段多肽片段的编码核酸序列，FP为荧光蛋白的编码基因。
本发明还提供了一种可诱导的条件性细胞剔模型小鼠的制备方法，该方法包括将本发明所提供的重组载体转染进C57BL/6胚胎干细胞中并筛选获得阳性重组胚胎干细胞，用所述阳性重组胚胎干细胞获得F1代杂合子小鼠，使雌雄F1代杂合子小鼠交配获得F2代小鼠，并在F2代小鼠中筛选出携带有所述重组载体的纯合子条件性细胞剔除模型小鼠。
通过本发明所提供的方法所制备的细胞剔除模型小鼠具有C57BL/6遗传背景，小鼠模型的制备过程中不需要进行多次的回交，缩短了模型建立的时间。
此外，通过本发明所提供的模型小鼠的制备方法所获得的细胞剔除模型小鼠与Cre小鼠交配后所产生的后代小鼠具备以下优点：（1）可以通过对荧光蛋白的表达情况对细胞剔除效率进行直接检测，确认细胞是否从体内敲除干净，从而能够获得更加准确直观的实验结果；（2）能通过控制诱导剂的给予时间，在时间上对靶基因的表达或缺失进行控制。
利用本发明所提供方法制备的模型小鼠能够广泛的应用于各种细胞及组织类型及不同发育阶段的细胞。通过对各种特异性的细胞进行敲除，可以促进多个科学领域的研究。
在干细胞研究领域，通过敲除特定细胞，建立各种损伤模型，如肝损伤模型、胰岛损伤模型、心脏损伤模型、脑损伤模型等。再将具有再生潜能的细胞或组织移植入这些损伤模型体内，观察细胞或组织的再生分化能力，为细胞及组织的再生研究提供更可靠的模型工具。
在发育生物学领域，通过在不同发育阶段敲除某种细胞，研究体内干细胞及前体细胞的分化发育方向、细胞的功能、细胞与细胞间的相互关系等；
在人类医学研究领域，条件性细胞剔除动物体内特定细胞的凋亡，可以用来制备各种疾病模型，如神经退行性疾病模型、肝炎模型、I型糖尿病模型等，由于该细胞剔除模型能把目标细胞彻底敲除，为研究这些疾病的发病机制及治疗方法提供更直接、疗效更明确的工具。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为对根据本发明一种实施方式的重组载体进行酶切鉴定的结果图
图2为根据本发明一种实施方式的重组载体的质粒图谱
图3为对根据本发明一种实施方式获得的F1代杂合子小鼠的基因鉴定结果图
图4为根据本发明一种实施方式获得的F2代纯合子小鼠的基因鉴定结果图
图5为流式细胞仪对条件性细胞剔除pCAG-iDTR-2A-EGFP小鼠的鉴定
图6为流式细胞仪检测白喉毒素对CD19-Cre/pCAG-iDTR-2A-EGFP小鼠的细胞剔除效果
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种用于条件性细胞剔除的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含DNA片段结构iDTR-2A-FP；
其中，iDTR为白喉毒素受体的编码基因，2A为能够通过核糖体跳跃实现自剪切的一段多肽片段的编码核酸序列，FP为荧光蛋白的编码基因；
其中，所述白喉毒素受体能够与白喉毒素特异性结合并介导白喉毒素进入并杀死细胞，所述白喉毒素受体的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO:5所示。
在本发明所提供的方法中，在iDTR和荧光蛋白的编码序列之间包括能够通过核糖体跳跃实现自剪切的一段多肽片段的编码核酸序列2A，所述能够通过核糖体跳跃实现自剪切的一段多肽片段的作用为将iDTR与FP连接起来形成融合蛋白表达片段，并在细胞内核糖体介导的翻译过程中，当核糖体翻译到所述能够通过核糖体跳跃实现自剪切的一段多肽片段序列的C末端的Gly-Pro时，核糖体会自发跳跃，结果使得Gly和Pro氨基酸之间不能形成肽键，从而导致肽链断裂。因此可以使白喉毒素受体和荧光蛋白的编码氨基酸序列彼此分开从而在细胞内分别折叠形成白喉毒素受体和荧光蛋白，避免由于白喉毒素受体和荧光蛋白的融合表达所导致的荧光蛋白信号过弱的缺陷，进而提高荧光蛋白在细胞中的示踪效果。
其中，在本发明的一种实施方式中，2A的碱基序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子。
为了对条件性细胞剔除的效果进行直接的检测，本发明所提供的重组载体中包括荧光蛋白的编码基因FP，所述荧光蛋白可以选自荧光蛋白EGFP、mRFP、tdTomato和mCherry中的一种，优选的，所述FP为增强绿色荧光蛋白EGFP的编码基因。
在本发明中，所述重组载体是将所述DNA片段结构iDTR-2A-FP导入表达载体得到的；
其中，在本发明的一种实施方式中，所述表达载体的结构自上游至下游依次包括：
CAG promoter启动子序列，Flp酶识别位点FRT，Cre酶识别位点LoxP，转录终止序列Stop codons-3x SV40polyA，Cre酶识别位点LoxP，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件WPRE，转录终止序列bGH polyA，整合酶的识别位点AttB，启动子序列PGK promoter，Flp酶识别位点FRT，新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，转录终止序列PGK poly A以及整合酶的识别位点AttP。
其中，DNA片段结构iDTR-2A-FP插入位点位于Cre酶识别位点LoxP和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件WPRE之间。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为Ai3Rosa26表达载体（Madisen,L.,T.A.Zwingman,et al."A robust and high-throμghput Crereporting and characterization system for the whole mouse brain."Nat Neurosci.2010,13(1):133-40.）。
在本发明一种实施方式中，所述重组载体的插入靶位点为Rosa26基因第一外显子和第二外显子之间的内含子序列。
所述重组载体的两端还包括用于将重组载体插入靶位点的5’和3’的同源臂序列。
在本发明所提供的重组载体中，重组载体的3′同源臂序列的下游优选还具有负筛选标记基因DTA（白喉毒素A亚基的编码基因），其作用是减少非同源重组的胚胎干细胞克隆，提高胚胎干细胞的筛选效率。发生同源重组时，位于同源臂外侧的负筛选标记基因DTA不会整合入染色体；而发生非同源的重组时，位于同源臂外侧的负筛选标记基因DTA可能会整合入染色体。通过筛选不含负筛选标记基因的胚胎干细胞，就获得了发生预定的定点同源重组的胚胎干细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体具有SEQ ID NO:1所示的碱基序列。
本发明还提供了一种重组载体的制备方法，该方法包括将DNA片段结构iDTR-2A-FP导入表达载体Ai3Rosa26中。
具体的，所述重组载体的构建方法可以为，根据iDTR、2A、FP及表达载体中的多克隆位点设计引物，通过PCR方法进行扩增，而后，利用PCR法将iDTR、2A和FP连接，纯化回收连接获得的DNA片段结构iDTR-2A-FP，再利用双酶切方法将DNA片段结构iDTR-2A-FP插入表达载体中的多克隆位点，获得重组载体。
在本发明中，PCR反应所应用的试剂可以为本领域常规使用的PCR反应试剂。
在本发明中，可以利用本领域常用的DNA片段回收方法例如DNA片段回收试剂盒对PCR反应产物进行纯化回收。
在本发明所提供的方法中，可以利用本领域常规的质粒提取试剂盒或提取试剂获得重组载体质粒。
本发明还提供了一种条件性细胞剔除模型小鼠的制备方法，该方法包括将本发明所述的重组载体转染进C57BL/6胚胎干细胞中并筛选获得阳性重组胚胎干细胞，用所述阳性重组胚胎干细胞获得F1代杂合子小鼠，使雌雄F1代杂合子小鼠交配获得F2代小鼠，并在F2代小鼠中筛选出携带有所述重组载体的纯合子条件性细胞剔除模型小鼠。
出于简化回交步骤的目的，在本发明的优选实施方式中优选使用了具有C57BL/6（Cheng,J.,A.Dutra,et al.(2004)."Improved generation ofC57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media."Genesis39(2):100-4.）小鼠遗传背景的C57BL/6胚胎干细胞作为重组载体的转染细胞，但是，在不脱离本发明的构思的前提下，利用其他种类的胚胎干细胞制备模型小鼠的方法同样应当视作没有脱离本发明的保护范围，例如利用具有129小鼠遗传背景的小鼠的胚胎干细胞制备模型小鼠的方法。
在本发明所提供的方法中，将打靶载体质粒转染进入胚胎干细胞的方法没有特别的限制，可以为慢病毒转染法或电转染法，优选采用电转染的方式将打靶载体导入胚胎干细胞中，在本发明中，对胚胎干细胞的培养、转染以及阳性克隆的筛选条件没有特别的限制，可以按照本领域常规的方法进行。
在本发明所提供的方法中，可以通过囊胚显微注射的方式将所述打靶胚胎干细胞注射入小鼠的囊胚中，并将注射有打靶胚胎干细胞的囊胚移植入假孕小鼠的子宫中获得嵌合体小鼠，其中，所述显微注射、囊胚的获得方法、假孕小鼠的获得方法以及囊胚的移植方法均可以按照《小鼠胚胎操作实验手册（第三版）》中的方法进行。
在本发明中，可以通过以下步骤对条件性细胞剔除模型小鼠进行鉴定：
（1）将本发明所提供的模型小鼠与Cre小鼠交配获得同时表达Cre重组酶、白喉毒素受体和荧光蛋白的后代转基因小鼠。
（2）通过FACS（流式细胞仪）对后代转基因小鼠进行检测，检测是否存在荧光蛋白阳性的细胞群。
其中，当所述Cre小鼠可以为具有组织特异性的Cre小鼠时，白喉毒素受体以及荧光蛋白将仅在相应的组织中有表达。并且，通过给后代转基因小鼠注射白喉毒素，可以杀死小鼠体内表达白喉毒素受体的细胞，实现组织特异性的条件性细胞剔除。
以下通过实施例对本发明进行进一步的说明，在以下实施例中：
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
CD19-Cre小鼠购自Jackson lab，货号为：006785；
转染试剂盒LTX&Plus Reagent购自Invitrogen，货号为15338－100；
Top10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104－02；
HindIII酶购自NEB，货号为15630；
EcoRI酶购自NEB；货号为R0101L；
BglII酶购自NEB，货号为R0144M；
FseI酶购自NEB，货号为R0588S；
白喉毒素受体基因为从293细胞（购自ATCC,货号CRL-1573）中提取mRNA然后利用逆转录PCR得到；
EGFP基因为从pEGFP-N1质粒（购自Clonetech，货号VYC0086）中PCR得到。
序列SEQ ID NO：2所示的碱基序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
实施例1
本实施例用于说明本发明所提供的重组载体的制备方法。
一、重组载体的构建
1、以分别通过PCR反应扩增白喉毒素受体的编码基因iDTR、编码多肽片段2A的SEQ ID NO：2所示的碱基序列以及荧光蛋白的编码基因EGFP。
（1）、引物：
DTR-F：5’-cgatggccggccaccatgaagctgctgccgt-3’
DTR-R1(in)：5’-gtcaaaattcaaagtctgtttcaccgggtgggaattagtc atgcccaact-3’
DTR-F1(in)：5’-agttgggcatgactaattcccacccggtga aacagactttgaattttgac-3’
DTR-R2(in)：5’-tcctcgcccttgctcaccatgggccctgggttggactc-3’
DTR-F2(in)：5’-gagtccaacccagggcccatggtgagcaagggcgagga-3’
DTR-R(in)：5’-cgatggccggccacttacttgtacagctcgtccatgc-3’
其中，
引物对DTR-F和DTR-R1(in)用于扩增白喉毒素受体的编码基因；
引物对DTR-F1(in)和DTR-R2(in)用于扩增2A的编码碱基序列；
引物对DTR-F2(in)和DTR-R(in)用于扩增EGFP的编码基因。
（2）、反应体系
（3）、循环参数条件：
95℃5min；
95℃30sec，56℃30sec，72℃2min，共30个循环
72℃5min
2、用DNA片段回收试剂盒纯化回收PCR产物，获得iDTR片段、2A片段以及EGFP片段。用PCR方法连接iDTR片段、2A片段以及EGFP片段；
用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物通过PCR反应扩增DNA片段结构iDTR-2A-EGFP；纯化回收iDTR-2A-EGFP片段并与Ai3Rosa26表达载体在16℃条件下连接孵育2h获得重组载体。
3、重组载体的扩增
将重组载体转化入大肠杆菌TOP10中，涂平板并挑取单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时，8000×g离心10min收集菌体。使用Tiangen去内毒素大提试剂盒提取质粒。
4、重组载体的鉴定
用限制性内切酶HindIII、EcoRI和BglII对重组载体进行酶切，而后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，根据电泳结果图中条带的大小初步判断重组载体是否构建正确，再将酶切结果正确的质粒进行测序验证，结果表明获得了目的重组载体的质粒，将其命名为pCAG-iDTR-2A-EGFP，该质粒的谱图见图2。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的细胞剔除模型小鼠的制备方法：
（一）、胚胎干细胞的培养、转染以及阳性克隆筛选：
1、胚胎干细胞的培养
在铺有饲养细胞的培养皿中培养C57BL/6胚胎干细胞，并置于37℃、5%CO2、饱和湿度的孵育箱培养。所用培养基的成分如下表1：
表1
2、电穿孔转染
在转染前确认C57BL/6胚胎干细胞的生长处于良好状态。
将长满细胞的100mm培养皿从CO2培养箱中取出后，吸走100mm平皿的干细胞培养基。每皿沿壁加入5ml PBS，轻轻摇晃后吸出，清洗两遍。每皿沿壁加入1.5ml0.25%胰酶，铺匀后置37℃孵育箱消化3min。每皿沿壁加入3.5ml ES培养基终止消化，充分吹打15次/皿，使大部分细胞都处于单个悬浮状态。将细胞悬浮液加入50ml离心管，轻轻吹打混匀。计数细胞。（台盼蓝40μL，细胞悬液20μL，稀释倍数：3倍）取出1.2×107的细胞悬液加入50ml离心管中。1200rpm、4℃离心5min。吸走上清，轻轻拍散细胞，加入20ml冰浴的PBS后重悬混匀。1200rpm、4℃离心5min。将高速离心（12000rpm，5min）除菌的线性化DNA悬液转入1.5ml无菌EP管中，弃50ml离心管上清，用手轻轻拍散细胞，加入适量冰浴的无酚红RPMI，将细胞重悬混匀后转入含DNA的1.5ml无菌离心管中，轻轻混匀。冰水浴5min，转入冰浴的4mm电击杯中。280V，500μF进行电击，记录电击时间10ms。将电击杯冰水浴5min后常温静置5min。将电击杯内的细胞悬液转入含40ml胚胎干细胞培养基的50ml离心管中，轻轻吹打混匀，沿壁均分至4个含MMC饲养细胞的100mm平皿。“8”字水平轻摇平皿使细胞均匀分布于皿底上。标记后37℃、5%CO2孵育箱培养。20小时后更换G418培养基。
3、正负筛选
转染细胞培养20小时后，更换G418培养基进行正负筛选。当出现细胞集落时，将细胞集落挑出，转移到96孔板内。待细胞长满后依次转移到48孔、6孔及60mm平皿中，抽提细胞DNA，用PCR和Southern杂交检测外源基因的整合情况筛选出正确重组进重组载体的阳性克隆细胞。
4、囊胚的制备
打开C57BL/6小鼠腹腔，用精细的镊子在靠近子宫颈的部位抓住，用锋利的小剪刀在子宫颈的位置剪开，向上拉伸子宫牵引洗膜，用锋利的小剪刀将子宫角壁上的洗膜剥离，然后在输卵管和卵巢之间剪开，保证输卵管和子宫之间的连接完整；把子宫放到35mm的组织培养基上，滴一滴M2培养液；在靠近子宫输卵管连接部的子宫上端插入26号针头，朝子宫颈的方向冲洗子宫角，同样方法冲洗另一侧子宫角；将针头插入到子宫颈内朝子宫角方向冲洗一侧子宫角，同样方法冲洗另一侧子宫角；用移卵管收集胚胎并在几滴新鲜的M2培养液中洗涤几次，以去除杂质，然后将胚胎转移到平衡好的培养滴中，37℃、5%CO2下培养。
5、囊胚的显微注射
按照《小鼠胚胎操作实验手册（第三版）》中的方法进行胚胎的显微注射，并将注射后的囊胚移植入假孕小鼠的子宫中发育，获得14只F1代小鼠。
6、阳性小鼠的鉴定
对14只F1代小鼠的尾基因组DNA进行PCR分析，用琼脂糖凝胶电泳鉴定其是否为转基因阳性小鼠。基因型鉴定所用引物如表2所示。
表2
其中，
引物对Rosa-GT-F和Rosa-GT-R用于扩增野生型小鼠Rosa基因序列，用以验证重组载体是否正确插入基因组Rosa位点。如果重组载体插入正确，则无PCR条带；如果重组载体未插入，则有PCR条带。
循环参数条件为：
95℃5min；
95℃30sec，62℃30sec，72℃30sec，共35个循环；
72℃10min；
4℃10min；
引物对WPRE-F和WPRE-R用于扩增重组载体WPRE元件部分序列，用以验证插入小鼠基因组Rosa位点的载体序列是否完整。如果载体序列完整，则有PCR条带；如果载体序列不完整，则无PCR条带。
循环参数条件为
95℃5min；
95℃30sec，57.4℃30sec，72℃30sec，共35个循环；
72℃10min；
4℃10min；
14只小鼠中，共有3只PCR鉴定为阳性转基因小鼠。3只小鼠的PCR鉴定结果见图3。图3中，2、4和6为阳性杂合子小鼠。
（二）、获得条件性细胞剔除模型小鼠
使雌雄F1代阳性杂合子小鼠交配获得4只F2代小鼠，用PCR方法对F2代小鼠进行基因检测。PCR引物序列如表2所示。
由图4可见，转基因小鼠107和109已经携带纯合的外源敲入基因，108和110为杂合子小鼠。已获得了具有C57BL/6背景的条件性细胞剔除模型小鼠。
测试例1
本测试例用于说明条件性细胞剔除pCAG-iDTR-2A-EGFP模型小鼠的鉴定。
将实施例2获得的条件性细胞剔除pCAG-iDTR-2A-EGFP模型小鼠与B细胞特异性表达CD19-Cre小鼠交配获得同时表达白喉毒素受体、EGFP和Cre重组酶的CD19-Cre/pCAG-iDTR-2A-EGFP小鼠。
通过FACS（流式细胞仪）检测CD19-Cre/pCAG-iDTR-2A-EGFP小鼠的外周血细胞，发现有一群B细胞呈现EGFP阳性，如图5所示,说明CD19-Cre/pCAG-iDTR-2A-EGFP小鼠体内表达了白喉毒素受体和EGFP。
测试例2
本测试例用于验证白喉毒素是否可以将表达有EGFP的细胞从CD19-Cre/pCAG-iDTR-2A-EGFP小鼠体内清除。
将CD19-Cre/pCAG-iDTR-2A-EGFP小鼠的脾脏取出，制备单细胞悬液并分成4份，分别注射到4只野生C57BL/6小鼠的眼底静脉丛。
在注射后的第二天，取两只小鼠腹腔注射1μg白喉毒素，另外两只注射PBS。24小时后，取脾脏，制备单细胞悬液，用CD19-PE染色。FACS结果显示注射DT（白喉毒素）之后，如图6所示，小鼠脾脏内已经没有EGFP阳性B细胞而没有注射DT的小鼠脾脏内存在EGFP阳性的B细胞。
以上测试例的结果表明，按照本发明所提供方法制备的细胞剔除模型小鼠与Cre小鼠交配后获得的后代小鼠具备以下特点：（1）可以通过对荧光蛋白的表达情况对细胞剔除效率进行直接检测，确认细胞是否从体内敲除干净，从而能够获得更加准确直观的实验结果；（2）能通过控制诱导剂的给予时间，在时间上对靶基因的表达或缺失进行控制。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (9)
1.一种重组载体在转染具有C57BL/6小鼠遗传背景的C57BL/6胚胎干细胞中的应用，其特征在于，所述重组载体包含DNA片段结构iDTR-2A-FP；
其中，iDTR为白喉毒素受体的编码基因，2A为能够通过核糖体跳跃实现自剪切的一段多肽片段的编码核酸序列，FP为荧光蛋白的编码基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述重组载体是将所述DNA片段结构iDTR-2A-FP导入表达载体得到的。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述荧光蛋白为荧光蛋白EGFP、荧光蛋白mRFP、荧光蛋白tdTomato或荧光蛋白mCherry。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，FP为EGFP。
5.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的应用，其中，2A为SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
6.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的应用，其中，所述重组载体还包括负筛选标记基因DTA。
7.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的应用，其中，所述重组载体具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
8.权利要求1-2中任意一项所述的应用，其中重组载体的制备方法包括将DNA片段结构iDTR-2A-FP导入表达载体Ai3Rosa26中。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，该方法包括用SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示的引物通过PCR反应扩增DNA片段结构iDTR-2A-EGFP。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310390634.8A CN103409448B (zh) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | 一种模型小鼠制备方法及条件性细胞剔除重组载体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310390634.8A CN103409448B (zh) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | 一种模型小鼠制备方法及条件性细胞剔除重组载体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103409448A CN103409448A (zh) | 2013-11-27 |
| CN103409448B true CN103409448B (zh) | 2015-06-17 |
Family
ID=49602490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310390634.8A Active CN103409448B (zh) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | 一种模型小鼠制备方法及条件性细胞剔除重组载体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103409448B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106244520B (zh) * | 2016-08-03 | 2019-07-12 | 中国人民解放军总医院 | 后肾间充质细胞的制备方法 |
| KR102156089B1 (ko) * | 2018-10-31 | 2020-09-15 | 고려대학교 산학협력단 | 리포칼린-2의 선택적 과발현을 통한 염증형성 형질전환 동물모델 및 그의 제조방법 |
| WO2020091301A1 (ko) * | 2018-10-31 | 2020-05-07 | 고려대학교 산학협력단 | 리포칼린-2의 선택적 과발현을 통한 염증형성 형질전환 동물모델 및 그의 제조방법 |
| CN111197058A (zh) * | 2018-11-20 | 2020-05-26 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | 人源化cd73基因动物模型的制备方法及应用 |
| CN113272432B (zh) * | 2021-04-15 | 2023-06-20 | 深圳大学 | Glb1重组报告基因、分离的构建体以及制备转基因报告小鼠的方法 |
| CN113278651B (zh) * | 2021-05-28 | 2022-04-15 | 上海南方模式生物科技股份有限公司 | 一种可实现靶基因两种剂量表达的基因修饰模型构建方法 |
| CN113615643B (zh) * | 2021-10-13 | 2022-01-18 | 广东南模生物科技有限公司 | 一种可诱导b细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用 |
| CN114214347B (zh) * | 2021-11-05 | 2023-11-17 | 中国人民解放军海军军医大学第三附属医院 | 示踪肝前体细胞的质粒系统及应用 |
| CN114480457A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-05-13 | 浙江大学 | 一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法 |
| CN115299406B (zh) * | 2022-08-19 | 2023-06-16 | 中南大学湘雅二医院 | 动物模型的构建方法及消融脂肪细胞的方法 |
| CN116286976A (zh) * | 2023-03-03 | 2023-06-23 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法 |
-
2013
- 2013-08-30 CN CN201310390634.8A patent/CN103409448B/zh active Active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Benjamin B,et al.Ablation of Neurons Expressing Melanin-Concentrating Hormone (MCH) in Adult Mice Improves Glucose Tolerance Independent of MCH Signaling.《The Journal of Neuroscience》.2013,第33卷2009-2016. * |
| Cleavage of foot-and-mouth disease virus polyprotein is mediated byresidues located within a 19 amino acid sequence;Martin D. Ryan,等;《Journal of General Virology》;19911231;第72卷;2727-2732 * |
| Linda Madisen,等.A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.《Nat Neurosci》.2010,第13卷(第1期),133–140. * |
| The Cellular Code for Mammalian Thermosensation;Leah A. Pogorzala,et al;《The Journal of Neuroscience》;20130327;第33卷(第13期);5533–5541 * |
| 多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位;靳志平 等;《第三军医大学学报》;20120615;第34卷(第11期);1044－1047 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103409448A (zh) | 2013-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103409448B (zh) | 一种模型小鼠制备方法及条件性细胞剔除重组载体 | |
| US11317611B2 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric PD-L1 | |
| US10945418B2 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric PD-L1 | |
| US11279948B2 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40 | |
| US11470826B2 (en) | Method of conveniently producing genetically modified non-human mammal with high efficiency | |
| EP2262898B1 (en) | Es cell-derived mice from diploid host embryo injection | |
| WO2017104404A1 (ja) | 遺伝子改変非ヒト生物、卵細胞、受精卵、及び標的遺伝子の改変方法 | |
| US20120156771A1 (en) | Functional disruption of an immunoglobulin gene in an avian embryonic stem cell | |
| EP3507374A1 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric ox40 | |
| JP4087338B2 (ja) | キメラ非ヒト動物 | |
| CN103642828B (zh) | 一种基因敲入重组载体及其制备方法和小鼠模型制备方法 | |
| CA2835222A1 (en) | Transgenic chicken comprising an inactivated immunoglobulin gene | |
| WO2000072670A1 (fr) | Animaux rompant le gene lkb1 | |
| Giel‐Moloney et al. | Ubiquitous and uniform in vivo fluorescence in ROSA26‐EGFP BAC transgenic mice | |
| KR101863653B1 (ko) | 락토페린 발현용 넉-인 벡터 및 이를 이용한 넉인 방법 | |
| US11647737B2 (en) | Genetically modified rabbit expressing an exogenous protein in milk | |
| CN106978416B (zh) | 一种基因定位整合表达系统及其应用 | |
| JPWO2006078072A1 (ja) | キメラ非ヒト動物およびその使用 | |
| EP2363470A1 (en) | Method for introducing mutated gene, gene having mutation introduced therein, cassette for introducing mutation, vector for introducing mutation, and knock-in non-human mammal | |
| CN107779462A (zh) | 双同源重组谱系示踪技术 | |
| WO2015013575A2 (en) | Knockout mice derived from site specific recombinase | |
| US9999206B2 (en) | Model and method for a transgenic bovidae expressing cardiac fibrosis and associated pathology | |
| US7132282B2 (en) | Genetic modification of C57 mice | |
| CN118834914A (zh) | 一种条件性kras-g12c突变动物模型的构建方法 | |
| WO2004013299A2 (en) | Methods for the production of cells and mammals with desired genetic modifications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 102609 No.12 Baoshen South Street, Daxing biomedical industrial base, Zhongguancun Science and Technology Park, Daxing District, Beijing Patentee after: Baccetus (Beijing) Pharmaceutical Technology Co.,Ltd. Address before: 101111 12th floor, incubation center, 88 Kechuang 6th Street, Ludong District, Daxing District, Beijing Patentee before: BEIJING BIOCYTOGEN Co.,Ltd. |
|
| CP03 | Change of name, title or address |