JP4087338B2 - キメラ非ヒト動物 - Google Patents
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Description
本発明は、所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物の作製方法、ならびに所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物またはその子孫に関する。
本発明はまた、上記のキメラ非ヒト動物を用いて、その表現型を対応の野生型のものと比較することによって、所望の蛋白質または該蛋白質をコードする遺伝子の機能を解析する方法に関する。
背景技術
ヒトゲノム全塩基配列決定という歴史的な研究成果(International Human Genome Sequencing Consortium,Nature,409:860−921,2001)は、同時に膨大な数の新規遺伝子の機能解明という新たな研究課題をもたらした。例えば24本のヒト染色体中2番目に小さく、最初に全塩基配列が決定されたヒト22番染色体(Dunhamら、Nature,402:489−495,1999)を例にとれば、合計545個の遺伝子(偽遺伝子を除く)の存在が推定された。その内訳は、塩基配列およびアミノ酸配列が既知の遺伝子が247個、既知遺伝子と相同性を示す新規遺伝子が150個、Expressed Sequense Tag(EST)データベースに登録されている機能未知の配列と相同な新規遺伝子が148個であった。加えてゲノム配列から遺伝子を直接予測するソフトウェア(GENESCAN)による解析では、さらに325個の転写産物未確認の新規遺伝子が予測された(Dunhamら、前記)。遺伝子とその産物である蛋白質の生体内における機能を明らかにすることは、生命活動のプログラムを理解する上で重要なばかりでなく、様々なヒト疾患を克服するための新たな医薬品の開発につながる可能性がある。すなわち、新規遺伝子の効率的な機能解析のための技術開発は、ポストゲノム時代の生命科学、医学研究における大きな課題である。
哺乳動物遺伝子の生体内機能を調べる最も直接的な手法としては、外来遺伝子をマウス染色体に挿入し、過剰発現させるトランスジェニック(Tg)マウス(Gordonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:7380−7384,1980)や、内因性遺伝子を破壊するノックアウト(KO)マウス(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)などが広く利用されてきた。
Tgマウスは通常、発現させようとする遺伝子(以下、導入遺伝子と称する)のcDNAと適当なプロモーターおよびポリA付加部位からなる発現ユニットを含む精製DNAをマウス受精卵核に直接注入することにより作製される(Gordonら、前記)。ラット由来成長ホルモン遺伝子を導入したTgマウスは通常の2倍近い大きさになる(Palmiterら、Nature,300:611−615,1982)ことが示されて以来、数多くの遺伝子(およびその産物蛋白質)の生体内機能検討のためにTgマウスが利用されてきた。Tgマウスにおける導入遺伝子は、本来の発現制御系とは異なるプロモーター等の作用により、本来発現する部位とは異なる部位でより多量に発現する場合があり、これを一般に異所性の過剰発現と称することがある。導入遺伝子の異所性の過剰発現により引き起こされる個体レベルの反応は、当該蛋白質の生体内機能を推定する上で非常に重要な情報といえる。
さらに1980年代半ばより、分化全能性を持つマウス胚性幹細胞(ES細胞)の樹立、相同組換えによる標的遺伝子改変技術の開発などが達成され、1990年頃には特定の遺伝子が人為的に破壊されたマウス(KOマウス)の作製が可能になった(Capecchi,Trends Genet.,5:70−76,1989)。例えば、血球幹細胞および血管内皮で発現する転写因子GATA−2が破壊されたKOマウスのホモ接合体は、発生初期に貧血によって死亡することから、この転写因子の造血における重要性が示された(Tsaiら、Nature,371:221−226,1994)。これまでに多くの研究者によって多数のKOマウスが作製されてきたが、その解析結果は基礎生物学から臨床医学に至る広範な分野に重要な情報をもたらしてきただけでなく、多数のヒト疾患モデル動物を提供してきた。KOマウスは今日においても遺伝子の生体内機能解明のために最も広く用いられている手法である。
しかしながらTgマウスおよびKOマウスは共に1つの遺伝子を扱うだけでも多大な時間と労力を必要とする手法であり、この問題点は現在に至るまで解決されていない。よってこれらの手法を、前述したようなゲノム配列情報から導き出される多数の新規遺伝子の網羅的な機能検討に利用することは現実的ではないと考えられてきた。
遺伝子機能解明のためのさらに簡便な方法として、目的遺伝子の発現ユニットを含むウイルスベクターやプラスミドDNAを動物個体の適当な部位に投与して、その遺伝子発現によって引き起こされる表現型の検討も行われてきた(Cannizzoら,Nature Biotechnol.,15:570−573,1997;Ochiyaら,Nature Medicine,5:707−710,1999)。しかしながら現状では、導入効率、抗原性、発現の安定性など多くの問題があり、機能未知の新規遺伝子解析のための手法として満足できるものではない。
また液性因子や膜蛋白質の機能解析の場合、組換え体蛋白質や特異的抗体の実験動物への投与は機能解析の有効な手段だが、多種の機能未知遺伝子産物について精製蛋白質調製あるいは抗体取得を行うことは、前述のTgおよびKOマウス作製と同様、現実的な手段とは言えないであろう。
ホルモン、増殖因子、サイトカイン等の分泌性蛋白質、または膜蛋白質を分泌性に改変した蛋白質の機能を解析するためには、血中または局所的な有効濃度を人為的に高めて、その効果を検討することが有効な手段の一つである。有効濃度を高める方法としては、前述した通りTgマウスにおける異所性発現、組換え体蛋白質の投与、または個体への遺伝子導入などが従来利用されてきた。中でもTgマウスにおける過剰発現は最も広く用いられている方法であり、機能既知の遺伝子の過剰発現の影響検討(Palmiterら,前記)や、多くはないが新規遺伝子の機能同定に利用された例もある。Simonetら(Cell,18:309−319,1997)は、肝臓特異的に発現するApoE遺伝子プロモーターの制御のもとに機能未知な新規遺伝子cDNAを発現するTgマウスを作製して表現型を解析した結果、高発現により骨量増加の効果を示すオステオプロテグリン(OPG)を見い出した。
しかしながら、Tgマウス作製における大きな問題は、導入遺伝子の宿主染色体への挿入がランダムであり、その発現は挿入箇所の影響を受けてしまうことである。例えば構成的な強発現を示すハウスキーピング遺伝子のプロモーターを利用した場合でも、期待される高発現個体を得ることは容易ではない。一般的には、外来DNAを注入した受精卵から誕生する第一世代の個体(F0個体)が導入DNAを保持する効率は10%〜20%程度、さらに期待通りの発現を示す個体はDNA導入個体のさらに0〜20%程度とされている。また、導入遺伝子のコピー数のコントロールができない問題も、多コピー挿入による導入遺伝子不活化現象(Garrickら、Nature Genet.,18:56−59,1998)をもたらす可能性があり、発現個体取得の困難さの一因となっている。さらに導入遺伝子を発現するTgマウス系統を確立するために多数のマウスを長期間維持繁殖する必要があることも大きな問題である。前述したようにTgマウス作製において目的とする発現個体が得られる確率は通常数%以下であり、多数のF0マウスを作製する必要がある。また尻尾組織由来DNAの解析等により導入遺伝子の保持が確認されたF0マウスをそのまま発現解析または表現型解析に用いることは後述するように適当でなく、通常は野性型マウスと交配して得られるF1マウスを得て初めて詳細な解析を行うことができる。
前述したTgマウスにおける宿主染色体へのランダム挿入およびコピー数のコントロール不能という問題点は、マウスES細胞におけるジーンターゲティング(相沢慎一、前記;Capecchi、前記)の利用により解決することができると考えられた。すなわち、内因性遺伝子プロモーターの下流に目的遺伝子を挿入(ノックイン)し、その制御下に発現させれば、挿入位置による発現への影響を回避することができる。従来、ノックインは主として以下に示すような場合に利用されてきた。
(1)ターゲット遺伝子と外来遺伝子(マーカー遺伝子等)を置換する形で挿入する。この場合、ターゲット遺伝子は破壊され、代わりにマーカー遺伝子等がターゲット遺伝子同様の特異性で発現する。遺伝子破壊の表現型を検討すると同時にプロモーターの特異性を調べるような場合に用いられる。
(2)ターゲット遺伝子の正常型を変異型(あるいは類似の遺伝子)に置き換える。この手法は特定の遺伝子の変異型の発現による疾患モデルマウス作製や、遺伝子機能の互換性検討などに用いられる。
上記(1)に関する初期の報告として、Le Mouellicら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4712−4716,1990)は、Hox−3.1遺伝子座に大腸菌LacZ遺伝子を挿入したES細胞からキメラマウスを作製し、LacZ遺伝子産物がHox−3.1同様の特異性で発現することを示した。また、Jinら(BBRC.270:978−982,2000)は、大脳皮質特異的に発現するEmx1遺伝子に上記同様LacZ遺伝子を挿入するだけでなく、さらにその下流にインターナルリボソーマルエントリーサイト(IRES;Jangら、J.Virol.,62:2636−2643,1988)と連結したCre遺伝子を挿入して大脳皮質でCre蛋白質が発現していることを示した。
一方、上記(2)の例としては、抗体重鎖遺伝子の特定の領域に組換え済みの機能的な重鎖VDJ可変領域遺伝子断片を挿入することにより、共通の可変領域を持つ全てのクラスの抗体を産生するマウスを作製した報告がある。単独あるいは特定の軽鎖との組み合わせで自己抗原反応性を持つVDJ断片が重鎖定常領域上流に挿入されたマウスでは、正常なB細胞の発生および分化が起こり、単一の重鎖可変領域を発現する以外は、極めて生理的に近い抗体産生が認められた(Sonodaら、Immunity,6:225−233,1997)。
さらに上記(1)、(2)とも異なる例として、ヒツジ胎児由来線維芽細胞のα1(I)プロコラーゲン(COL1A1)遺伝子の下流非翻訳領域(COL1A1遺伝子の終止コドンとポリA付加部位の間)にIRESに連結したG418耐性遺伝子を挿入した最近の報告がある(McCreathら、Nature,405:1066−1069,2000)。ヒツジ個体は上記線維芽細胞クローン由来の細胞核をヒツジの未受精卵に移植することにより作製された。この場合、COL1A1遺伝子は正常に発現し、さらに同様の特異性でG418耐性遺伝子が発現する。
以上に述べたように、ノックインは、Tgマウス作製法の欠点を解消するために有効な手法と考えられたが、網羅的な遺伝子解析に利用する場合には依然としていくつかの問題があると考えられた。まず、マウスES細胞における相同組換えの頻度は通常数%以下であり、1種の遺伝子について適当なプロモーター下流にノックインされた相同組換えクローンを得るだけでも多大な労力を要する。また、後述するようにノックインES細胞株から作製されるキメラマウスにおいては、個体毎にキメラ率(ノックインES細胞の貢献率)が異なる。この場合、導入遺伝子を発現する細胞集団の割合は、各個体および各組織によって変化するが、その割合は毛色から判断されるキメラ率と一致しない場合もあるので表現型解析結果の解釈には困難が伴う。よって、上記ノックイン遺伝子座が子孫伝達したマウスの利用が望まれる。
以上に示したTgおよびノックインは共に、通常は導入遺伝子が子孫に伝達した後に個体の解析が望まれる。しかし、実験期間およびマウス飼育に必要な設備や労力を考慮すると、多種の遺伝子解析を効率的に行うためには第一世代(Tgの場合F0個体、ノックインの場合キメラ個体)で解析できることが望まれる。ランダム挿入に頼るTgのF0個体の場合、導入遺伝子が同じ部位に同じコピー数挿入された個体を再度得ることは不可能なので、第2世代であるF1個体の利用は必須である。一方、ノックインの場合、1種のESクローンから多数のキメラ個体を得ることは容易だが、前述したようにキメラ率は個体によって大きく異なるのが普通であり、導入遺伝子の高発現を保証するための高いキメラ率の個体を多数得ることは容易ではない。また、キメラ率は通常毛色で判断するが、導入遺伝子が発現する組織のキメラ率は必ずしもこれと一致しない場合がある。
キメラマウスにおいて、ある組織の細胞が全てES細胞に由来するようなシステムが近年考案された。これはブラストシストコンプリメンテーション(以後BC法と記載する)と呼ばれ、免疫系TまたはB細胞(Chenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,90:4528−4532,1993)やレンズ(Liegeoisら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93:1303−1307,1996)などにおいて成功例がある。例えばTまたはB細胞のBC法は、通常法でノックアウトすると致死となるような遺伝子の、TまたはB細胞における機能を検討することを目的として考案された。TまたはB細胞の発生初期に起こる部位特異的組換えに必須であるRAG2遺伝子のKOマウスは機能的なTまたはB細胞を産生できない。RAG2−KOマウス胚を宿主として野生型のES細胞とのキメラを作製すると、多くのキメラマウスにおいてはキメラ率に関わらず正常に近いレベルのTまたはB細胞(ES細胞由来)が観察される。すなわち、胚性致死の遺伝子を両アレル共にKOしたES細胞を用いれば、キメラマウスにおいてその遺伝子のTまたはB細胞における機能のみを検討することができる。
ヒトゲノム全塩基配列が決定した現在、望まれるのは、多数の新規遺伝子について網羅的な生体内機能解析を行うことができるようなシステムである。そのためには導入遺伝子を高レベルで発現する動物個体を確実、容易、かつ多種類同時に作製できることが必要である。一方、以上に述べたように、Tgマウス、ノックイン等の従来の方法ではこの要求に答えることができないため、ゲノム配列情報から得られた膨大な数の遺伝子機能解析について決定的な方法はないと考えられてきた。また個体そのものを多数の遺伝子機能のスクリーニングに利用するということは困難とされてきた。ヒトゲノム情報がもたらす新規遺伝子のうち、サイトカイン、増殖因子、ホルモンなどと相同性を持つ分泌性の蛋白質をコードするものは、そのものが医薬品となり得る点で非常に興味深い研究対象といえる。すなわち、分泌性蛋白質をコードする遺伝子とその産物の生体内機能解析のための新たな効率的手法の開発は、ヒト疾患治療のための医薬品開発を大きく進展させることができると想像される。
前述したように特定遺伝子がジーン・ターゲティングにより破壊された胚性幹(ES)細胞から作製される変異マウス(ノックアウト/KOマウス)は、遺伝子の機能解明における必須の手法として広く利用されている(相沢慎一、前記)。
一方、初めてのKOマウスが作製されてから10年以上を経た現在においても、KOマウス作製は非常に手間と時間のかかる作業と多くの研究者に認識されている。その大きな理由の一つにはES細胞における相同組換え体取得の困難さがあげられる。ノックアウト(KO)ベクターの構造は、一般的に一定の大きさ(5kb)以上の目的遺伝子ゲノムDNA断片の中に、薬剤耐性マーカーが目的遺伝子エクソンと置換あるいは同エクソンに挿入される形で存在している。通常のプロトコールで採用される電気パルス法においては、使用したES細胞の1万個から100万個に1個の割合で上記薬剤に耐性のコロニーが得られる。しかし耐性クローンのほとんどは、導入ベクターがマウス染色体にランダム挿入されたものであり、相同組換えはランダム挿入クローン1万個から100個に1個程度とされている。ランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を向上させるために、これまで様々な検討がなされてきた。例えばベクターに含まれる相同領域ゲノムDNAの長さが長いほど好ましいこと(Deng & Capecchi,Mol.Cell.Biol.,12:3365−71,1992)、あるいはターゲティングを行うマウスES細胞の系統と同じマウス系統のゲノムDNA(アイソジェニックDNA)を用いることが好ましいことなどが報告された(Deng & Capecchi、前記)。さらに現在最も広く用いられている方法は、上記選択マーカーに加えて、相同領域ゲノムDNAの外側にネガティブ選択マーカーを含むKOベクターを用いることである。この方法は、ランダム挿入体においては有毒なネガティブマーカーが発現して細胞が死ぬが、相同組換え体ではそれが起こらないという現象を利用している。ネガティブ選択マーカーとしてはMansourらにより報告(Nature,336:348−352,1988)されたHSV−tk遺伝子(培地中にガンシクロビル、FIAUなどのチミジンアナログを入れる必要がある)、またはYagiら(Anal.Biochem.,214:77−86,1993)により報告されたDT−A(ジフテリア毒素A鎖)などが知られている。このネガティブ選択法が理論通りに機能した場合、全てのコロニーが相同組換え体という結果が予想されるが、実際には報告により大きなばらつきがあり、その濃縮効果は一般的に数倍程度とされている。実際にノックアウト実験においてネガティブ選択法が常用されている現在においても千個〜百個のランダム挿入体を取得し、その中から相同組換え体を選抜することは日常的に行われている。
変異ES細胞からのマウス作製だけでなく、相同組換えにより遺伝子改変、破壊が施された哺乳動物細胞株は、それ自体が該遺伝子の機能を解明する上で重要な材料となる。さらに、相同組換えは遺伝子欠損や変異に起因する疾患(遺伝性疾患)の究極的な治療法と考えられてきた。しかし、哺乳動物細胞株または初代培養細胞における相同組換え体とランダム挿入体の比率は、マウスESにおける比率と同等か、さらに低いものであり、細胞レベルの遺伝子機能解析や遺伝子治療での応用は、上記比率の改善が望まれていた(Yanez & Poter,Gene Therapy,5:149−159,1998)。相同組換え体、ランダム挿入体の比率改善に関する前記以外の試みとしては、(1)DNA組換えや修復に関わる蛋白質(遺伝子)の高発現、不活化、阻害等、(2)ターゲット遺伝子への特異的なダメージ、などが検討されてきたが、染色体遺伝子における相同組換え比率の劇的な向上をもたらし、かつ簡便で再現性の高い方法は未だ知られていない(Yanez & Poter、前記;Vasquezら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:8403−8410,2001)。
発明の開示
本発明は、遺伝子機能を解析するための簡便かつ再現性の高い方法を提供することを目的とする。
本発明においては、相同組換えによるジーン・ターゲティングを利用して、キメラ非ヒト動物のいずれかの細胞および/または組織において発現する遺伝子座、例えばマウスIgκ遺伝子座へ所望の遺伝子を挿入する。ジーン・ターゲティングとは、相同組換えを利用して染色体中の特定遺伝子の改変を行うことを指して言うが、相同組換えを起こした細胞を効率良く取得することも、解決されるべき課題として重要である。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、今回、分泌性蛋白質をコードする構造遺伝子が免疫グロブリン軽鎖遺伝子の下流に挿入されたマウスのES細胞と、Bリンパ球欠損系統由来の宿主胚とのキメラマウスを作製し、該キメラマウスのB細胞において、前記分泌性蛋白質が高発現することを実証した。さらに哺乳動物細胞におけるターゲティングベクターのランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を改善するための簡便な方法を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の方法により作製されたキメラ動物においては、毛色のキメラ率にかかわらず、導入された構造遺伝子由来の産物の過剰発現効果が観察された。このシステムの利用により、従来法と比較して効率良くかつ確実に導入遺伝子を高発現するキメラ動物を得ることができる。従来法と比較した効率の高さは、主として、Bリンパ球欠損宿主胚の利用によって、キメラ動物のBリンパ球がキメラ率に関わらず全てES細胞に由来する点に基いている。また特に免疫グロブリン軽鎖遺伝子の制御領域を利用した場合の効率の高さは、以下の点に基づいている:
(1)Igκ遺伝子座における相同組換え効率が5%以上の効率で起こる。
(2)免疫グロブリンの発現系を利用している。
(3)免疫グロブリンの発現は発生初期には非常に少なく、離乳期以降に爆発的な増加を示すため、高発現が胚性致死をもたらすような遺伝子を導入する場合でも、成体におけるその遺伝子の機能を検討することができる。
すなわち、本発明は以下のとおり要約される。
本発明は、その第1の態様において、キメラ非ヒト動物の作製方法を提供するものであり、該方法には、
1)少なくとも特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する工程、
2)前記特定の細胞および/または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚に、前記工程1で作製した分化多能性を有する細胞を注入してキメラ胚を得る工程、
3)前記工程2で得たキメラ胚を同種の仮親非ヒト動物に移植する工程、ならびに
4)前記工程3で移植した後得られた仔動物の中から、少なくとも前記特定の細胞および/または組織において所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程、が含まれる。
本発明の一実施形態において、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置される。また別の実施形態においては、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンの下流に配置されたインターナルリボゾーマルエントリーサイトの下流に配置される。
さらに別の実施形態においては、インターナルリボゾーマルエントリーサイトと前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域との間に配置される。
また別の実施形態においては、ポリAシグナル領域、プロモーター配列および前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域との間に配置される。ここで前記プロモーター配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子に由来するものであることが好ましい。また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列と共に配置されるポリAシグナル領域は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域と同じものであってもよいし異なるものであってもよい。
さらにまた別の実施形態において、プロモーター配列、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列およびポリAシグナル領域を含む配列が、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域の下流に配置される。ここで前記プロモーター配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子に由来するものであることが好ましい。また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列と共に配置されるポリAシグナル領域は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域と同じものであってもよいし異なるものであってもよい。さらに前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域と、前記プロモーター配列との距離は、1Kbを超えないことが好ましい。
また本発明の一実施形態において、分化多能性を有する細胞は、少なくとも特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムと、前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の対立遺伝子が不活性化されているゲノムの両方を含むものである。
また本発明の一実施形態において、分化多能性を有する細胞は胚性幹細胞である。
さらに本発明の一実施形態において、キメラ非ヒト動物は、マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである。本発明の好ましい実施形態においては、キメラ非ヒト動物はマウスである。
本発明のさらなる実施形態において、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および/または組織との組み合わせは、以下の(1)〜(7)からなる群から選択されるものである:
(1)免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子と、Bリンパ球細胞、
(2)T細胞受容体遺伝子と、Tリンパ球細胞、
(3)ミオグロビン遺伝子と、筋肉細胞、
(4)クリスタリン遺伝子と、眼球の水晶体、
(5)レニン遺伝子と、腎臓組織、
(6)アルブミン遺伝子と、肝臓組織、および
(7)リパーゼ遺伝子と、膵臓組織。
本発明の好ましい実施形態においては、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および/または組織との組み合わせは、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子とBリンパ球細胞である。
本発明はその第2の態様において、前記キメラ非ヒト動物の作製方法により作製されたキメラ非ヒト動物から交配によって前記所望の蛋白質を発現することができるその子孫を得ることを含む、所望の蛋白質を発現する非ヒト動物の作製方法を提供する。
また本発明は、その第3の態様において、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞と、前記特定の細胞および/または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚とに由来するキメラ非ヒト動物であって、少なくとも前記特定の細胞および/または組織において前記所望の蛋白質を発現することができる、前記キメラ非ヒト動物を提供する。
本発明の一実施形態において、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置される。また別の実施形態においては、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンの下流に配置されたインターナルリボゾーマルエントリーサイトの下流に配置される。
さらに別の実施形態においては、インターナルリボゾーマルエントリーサイトと前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域との間に配置される。
また別の実施形態においては、ポリAシグナル領域、プロモーター配列および前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む配列が、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域との間に配置される。ここで前記プロモーター配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子に由来するものであることが好ましい。また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列と共に配置されるポリAシグナル領域は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域と同じものであってもよいし異なるものであってもよい。
さらにまた別の実施形態において、プロモーター配列、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列およびポリAシグナル領域を含む配列が、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域の下流に配置される。ここで前記プロモーター配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子に由来するものであることが好ましい。また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列と共に配置されるポリAシグナル領域は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域と同じものであってもよいし異なるものであってもよい。さらに前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域と、前記プロモーター配列との距離は、1Kbを超えないことが好ましい。
また本発明の一実施形態において、分化多能性を有する細胞は、少なくとも特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムと、前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の対立遺伝子が不活性化されているゲノムの両方を含むものである。
また本発明の一実施形態において、分化多能性を有する細胞は胚性幹細胞である。
さらに本発明の一実施形態において、キメラ非ヒト動物は、マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである。本発明の好ましい実施形態においては、該動物はマウスである。
本発明のさらなる実施形態において、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および/または組織との組み合わせは、以下の(1)〜(7)からなる群から選択されるものである:
(1)免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子と、Bリンパ球細胞、
(2)T細胞受容体遺伝子と、Tリンパ球細胞、
(3)ミオグロビン遺伝子と、筋肉細胞、
(4)クリスタリン遺伝子と、眼球の水晶体、
(5)レニン遺伝子と、腎臓組織、
(6)アルブミン遺伝子と、肝臓組織、および
(7)リパーゼ遺伝子と、膵臓組織。
本発明の好ましい実施形態においては、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損した特定の細胞および/または組織との組み合わせは、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子とBリンパ球細胞である。
また本発明は、その第4の態様において、前記キメラ非ヒト動物もしくは所望の蛋白質を発現することができる前記キメラ非ヒト動物の子孫の表現型を、所望の蛋白質をコードする遺伝子の核酸配列を含まない対応の野生型非ヒト動物の表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を解析する方法を提供する。
さらに本発明は、その第5の態様において、前記いずれかのキメラ非ヒト動物に由来する組織または細胞を提供するものであり、該細胞または組織は、該細胞または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含み、所望の蛋白質を発現することができるものである。
本発明の一実施形態において、前記組織または細胞は、Bリンパ球細胞、Tリンパ球細胞、筋肉細胞、眼球の水晶体、腎臓組織、肝臓組織および膵臓組織からなる群より選択される。
本発明はまた、その第6の態様において、前記組織または細胞に由来する細胞と、増殖可能な腫瘍細胞細胞との融合により作製されたハイブリドーマを提供する。
さらに、本発明は、その第7の態様において、前記キメラ非ヒト動物、前記組織または細胞、あるいは前記ハイブリドーマのいずれかを用いて所望の蛋白質を産生させた後、該蛋白質を回収することを含む、所望の蛋白質を製造する方法を提供する。
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中で使用される「非ヒト動物」という用語は、ヒトを含まない動物を意味し、一般に魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類からなる脊椎動物、好ましくは哺乳類から選ばれる。本発明ではキメラ非ヒト動物の作製において、分化多能性を有する細胞として胚性幹細胞を利用することが好ましいため、胚性幹細胞の樹立が可能な非ヒト動物(たとえばマウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、サル、ヤギ、ウサギ、ラットなど)、および将来的に胚性幹細胞の樹立が可能であろうその他の非ヒト動物のすべてが、本発明の意図する非ヒト動物に包含される。「キメラ非ヒト動物」とは、分化多能性を有する細胞(後述する)に由来する分化した細胞と、宿主胚に由来する分化した細胞の両者から成り立つ動物を意味する(Bradleyら,Nature,309:255−6,1984)。実験的には、すべての細胞が宿主胚に由来する動物(0%キメラ)や、すべての細胞が分化多能性を有する細胞に由来する動物(100%キメラ)も誕生しうるものであり、厳密にはこれらの動物は「キメラ」ではないが、便宜上「キメラ非ヒト動物」に包含されるものとする。
本明細書中で使用される「分化多能性を有する細胞」とは、上述したキメラ非ヒト動物を作製するにあたり、宿主胚への注入、あるいは集合胚形成によって、キメラ非ヒト動物の2種類以上の細胞または組織に分化可能な細胞を意味する。具体的には、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、胚性腫瘍細胞(EC細胞)などが挙げられる。
本明細書中で使用される「胚性幹細胞」とは、ES細胞(embryonic stem cell)とも称され、未分化性(全能性)を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を意味する。すなわち胚性幹細胞は、動物の初期胚中の胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。また「胚性生殖細胞」とは、EG細胞とも称され、上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。胚性生殖細胞は、受精後数日〜数週間、例えばマウスの場合には約8.5日経過した胚から得た始原生殖細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。
本明細書中で使用される「所望の蛋白質」とは、本発明の方法により作製されるキメラ非ヒト動物の少なくとも1種類の細胞および/または組織において発現させることが試みられる蛋白質であり、その機能については既知である場合も、未知である場合もある。前記所望の蛋白質は、哺乳動物由来の機能性分泌蛋白質、機能性膜蛋白質、機能性細胞内または核内蛋白質、分泌シグナルが付加された機能性膜蛋白質の可溶性部分などとすることができる。ここで「機能性」とは、生体内において特定の働き、作用または機能をもつことを意味する。
機能既知の蛋白質の場合は、当該蛋白質がキメラ非ヒト動物の少なくとも1種類の細胞および/または組織における高発現の影響を観察することによって、蛋白質の機能の相互的関連について新たな知見を得られる可能性がある。機能未知の蛋白質の場合は、同じく高発現の影響を観察することによって、当該蛋白質の機能解明につながる知見を得られる可能性がある。本発明において「所望の蛋白質」は、導入するキメラ非ヒト動物において発現するが、発現させる対象となる特定の細胞および/または組織においては発現しないかもしくはわずかにしか発現しないものあってもよいし、または異種動物由来のものであってもよく、関心のあるものであればその種類を問わないものとする。
本明細書中で使用される「所望の蛋白質をコードする核酸配列」は、内因性または外因性DNAのいずれでもよく、また外因性DNAにはヒト由来DNAが包含される。また本明細書においては、「所望の蛋白質をコードする構造遺伝子」という用語も同義として用いる。
本明細書中で使用される、蛋白質の「発現」とは、その蛋白質をコードする遺伝子の発現と同等の意味を有する。
本明細書中で使用される「制御領域」とは、「制御配列」、「調節配列」、「調節領域」などの総称を意味し、遺伝子発現(転写、翻訳または蛋白質合成)を制御または調節する機能を有する領域を指す。そのような制御領域としては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどが含まれる。また本発明において「制御領域」とは、1つの機能的なエレメント(例えば1つのプロモーター配列)を含むものであってもよいし、または複数のエレメントを含むもの(例えば、1つのプロモーター配列と1つのエンハンサー配列など)であってもよい。さらに「プロモーター配列」とは、当業者に周知の制御領域の1種であり、転写開始時にRNAポリメラーゼが結合する構造遺伝子上流の塩基配列を指す。
本明細書中で使用する「インターナルリボゾーマルエントリーサイト」とは、IRES(internal ribosomal entry site)と略称され、ポリシストロニックな発現を可能にするエレメントとして知られており、特殊なRNA二次構造を形成し、その下流にある開始コドンからのリボソームによる翻訳開始を可能にする部位を指す。哺乳動物の場合、IRESはリボゾームのデコードサブユニットに結合し、これにより隣接する蛋白質コード領域をデコード部位に引き込むような立体構造変化を起こして、翻訳および蛋白質合成を開始する事象に関わると推定されている(Spahnら,Science 291:1959,2001)。
本明細書中で使用する「ポリAシグナル領域」とは、転写領域の終わりの部分に位置し、転写後mRNA前駆体の3’非翻訳領域へポリアデニル酸(A)鎖付加を指令する塩基配列部分を指す。
本明細書中で使用する「上流」および「下流」とは、ゲノム、ポリヌクレオチドなどの核酸配列において、それぞれ5’末端及び3’末端への方向を指す。
本明細書中で使用する「bp(塩基対)」及び「Kb(キロ塩基対)」とは、核酸配列の長さ及び距離を指し、1bpが1つの塩基対を表し、1Kbは1000bpに相当する。
本明細書中で使用する「対立遺伝子」とは、倍数体のゲノムを有する生物において、相同染色体の相同な領域に位置し、機能的にも相同な遺伝子をいう。対立遺伝子は通常全てが発現される。また「対立遺伝子排除」とは、生物個体で考えた場合、対立遺伝子の両方に由来する形質が表現されているにもかかわらず、個々の細胞では対立遺伝子のどちらかのみがランダムに発現し、他方の発現が排除されていることをいう。例えば抗体やT細胞受容体の遺伝子に見られ、一方の可変領域遺伝子の組換えが信号となって完全な遺伝子が1つしか完成されないことによる。
本明細書中で使用する「分泌シグナルを付加された膜蛋白質の可溶性部分」という用語は、膜蛋白質分子のうち、分泌シグナル(またはシグナル配列)が結合した細胞外ドメインを意味する。
本明細書中で使用する「免疫グロブリン軽鎖遺伝子」という用語は、免疫グロブリン(Ig)分子の軽鎖(またはL鎖)をコードしている遺伝子を指す。軽鎖にはκ鎖とλ鎖が含まれており、可変(V)領域と定常(C)領域から構成されている。また軽鎖遺伝子は、1個のC領域遺伝子、複数のV領域遺伝子、および複数の結合(J)領域遺伝子から構成されている。
本明細書中で使用する「特定の細胞および/または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚」または「欠損宿主胚」という用語は、分化多能性を有する細胞を注入するための宿主非ヒト動物胚であって、当該細胞および/または組織を欠損する胚を意味する。
本明細書中で使用するキメラ非ヒト動物の「子孫」とは、本発明のキメラ非ヒト動物同士、あるいは本発明のキメラ非ヒト動物と同種の非ヒト動物との交配により得られ、少なくとも特定の細胞および/または組織において所望の蛋白質を発現する非ヒト動物を意味する。
本明細書中で使用する「表現型」とは、動物が本来持つ形質、または導入遺伝子の結果現れる動物の形質を指す。
本明細書中で使用する「増殖可能な腫瘍細胞」とは、腫瘍化することにより永続的な増殖能を有する細胞を意味し、例えば免疫グロブリンを産生する形質細胞腫細胞(ミエローマ細胞など)が挙げられる。
本明細書中で使用する「ハイブリドーマ」という用語は、本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫からの組織または細胞に由来する細胞と、上記増殖可能な腫瘍細胞とを融合させてできる雑種細胞を指す。
本明細書中で使用する「ノックインベクター」とは、相同組換えにより目的とする遺伝子座位に所望の蛋白質をコードする遺伝子を導入し、該所望の蛋白質を発現させるために用いるベクターを指す。また「ノックイン」もしくは「遺伝子ノックイン」とは、目的とする遺伝子座位に相同組換えにより所望の蛋白質をコードする核酸配列を導入し、該所望の蛋白質を発現させることを意味する。
本明細書中で使用する「ノックアウトベクター」とは、相同組換えにより非ヒト動物の目的とする遺伝子を破壊または不活性化するためのベクターを指す。また「ノックアウト」もしくは「遺伝子ノックアウト」とは、目的とする遺伝子座位に相同組換えにより当該遺伝子の発現を阻害する構造を導入し、該目的の遺伝子を破壊または不活性化することを意味する。
本明細書中で使用する「ターゲティングベクター」とは、相同組換えにより非ヒト動物のゲノムの目的とする位置に導入されうるベクターを指す。「ターゲティングベクター」という用語は、上記「ノックインベクター」および「ノックアウトベクター」を包含する。また「ターゲティング」もしくは「遺伝子ターゲティング」とは、相同組換えにより非ヒト動物のゲノムの目的とする位置に所望の遺伝子構造を導入することを意味する。
本明細書中で使用する「ポリアミン」とは、第一級アミノ基を2つ以上持つ直鎖の脂肪族炭化水素の総称である。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、2001年11月15日に出願された日本国特許出願第2001−350481号およびその優先権を主張して2002年2月19日に出願された日本国特許出願第2002−42321号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明者は、キメラ率に大きく影響されることなく、所望の蛋白質を少なくともある特定の細胞および/または組織において高発現するキメラ非ヒト動物を作製する方法を、前述したBC法を応用することにより考案した。すなわち、本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法は、
1)少なくとも特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する工程、
2)前記特定の細胞および/または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚に、前記工程1で作製した分化多能性を有する細胞を注入してキメラ胚を得る工程、
3)前記工程2で得たキメラ胚を同種の仮親非ヒト動物に移植する工程、ならびに
4)前記工程3で移植した後得られる仔動物の中から、少なくとも前記特定の細胞および/または組織において所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明の方法では、前述したブラストシスト・コンプリメンテーション(BC)により、宿主胚において欠損する細胞および/または組織が、分化多能性を有する細胞により補填される。すなわち、作製されたキメラ非ヒト動物個体全体のキメラ率に関わらず、当該細胞および/または組織のすべてが、分化多能性を有する細胞に由来するものとなる。その結果、該分化多能性を有する細胞が、上記細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御配列によって制御されるように所望の蛋白質をコードする遺伝子(核酸配列)を保持していれば、キメラ非ヒト動物の当該細胞および/または組織における所望の蛋白質の高発現が期待できる。
1.分化多能性を有する細胞の作製
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法では、まず、所望の蛋白質をコードする核酸配列(構造遺伝子)が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する。この核酸配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるように配置されたものである。
本発明において分化多能性を有する細胞としては、上記定義に挙げたものを利用することができるが、胚性幹細胞(ES細胞)が好ましく、特にマウスES細胞が好ましい。
また、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子は、組織特異的に発現するものであってもよいし、または構成的に発現するものであってもよい。例えば組織特異的に発現する遺伝子としては、免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子、T細胞受容体遺伝子、ミオグロビン遺伝子、クリスタリン遺伝子、レニン遺伝子、リパーゼ遺伝子、アルブミン遺伝子などが挙げられる。また構成的に発現する遺伝子としては、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子などが挙げられる。当該遺伝子がキメラ非ヒト動物において組織特異的に発現する遺伝子の場合には、後述する宿主胚として、当該遺伝子の発現する細胞および/または組織が欠損した系統の胚を採用する。当該遺伝子が構成的に発現する遺伝子の場合は、後述する宿主胚として、任意の細胞および/または組織が欠損した系統の胚を採用する。
所望の蛋白質をコードする核酸配列(構造遺伝子)の配置(連結または挿入)は、少なくとも特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるような形態である必要がある。従って、該核酸配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置される。
あるいは、該所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域をコードする配列の間に、インターナルリボゾーマルエントリーサイト(IRES)を配置し、そのIRESの下流に配置される。すなわち、該核酸配列は、ゲノム上において、IRESと機能的に連結された状態で、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域をコードする配列との間に存在する。ノックインベクターの構築に際して、ポリAシグナル領域は上記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域を用いることができるが、これに限定されるものではない。例えば、シミアンウイルス40(SV40)由来のポリAシグナル領域などの当技術分野で公知の他のポリA配列を用いることもできる。
また該所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域をコードする配列の間に、第2のポリAシグナル領域をコードする配列、そのポリAシグナル領域の下流にプロモーター配列を配置し、さらに該プロモーター配列の下流に配置される。すなわち、該核酸配列は、ゲノム上において、プロモーター配列およびポリAシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在し、かつもともとゲノム上に存在する特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子もまたそのプロモーター配列およびポリAシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在する。ノックインベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および/または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。またノックインベクターにプロモーターが2つ存在する場合には、その2つのプロモーターは、同じ細胞および/または組織において発現を制御するものであれば、同じものであってもよいし異なるものであってもよい。さらにノックインベクターの構築において使用されるポリAシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリAシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリAシグナル領域やシミアンウイルス40(SV40)由来のポリAシグナル領域などが挙げられる。またプロモーターの場合と同様に、ノックインベクターに2つのポリAシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その2つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。
さらにまた前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、上記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域の下流に、プロモーター配列、核酸配列、およびポリAシグナル領域をコードする配列の順に配置することもできる。すなわち、該核酸配列は、プロモーターおよびポリAシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態(カセット形式)で、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナルの下流に存在する。ノックインベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および/または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。さらにノックインベクターの構築においてポリAシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリAシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリAシグナル領域やシミアンウイルス40(SV40)由来のポリAシグナル領域などが挙げられる。またノックインベクターに2つのポリAシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その2つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリAシグナル領域の3’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の5’端の距離は、上記特定の細胞および/または組織において該核酸配列の発現が可能であれば特に限定されるものではないが、距離が離れるに従い、転写産物であるmRNAの安定性に好ましくない影響が生じる可能性があり、またターゲッティングベクターの構造が大きくなることからそのような構成のベクターの作製が困難になる。これらの理由からポリAシグナル領域の3’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の5’端の距離は1Kb以内であることが好ましい。
所望の蛋白質をコードする核酸配列(構造遺伝子)を前記制御領域の下流に配置する場合には、核酸配列を該制御領域の下流に挿入してもよいし、または、ES細胞の片側のアレルについて、単に当該細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御配列の直下に、本来の構造遺伝子を置換するような態様で配置することもできる。所望の蛋白質をコードする核酸配列に置換された本来の構造遺伝子は、もう片側のアレルによって発現されるので、細胞および/または組織は正常な状態を保ちうる。しかしながら、免疫グロブリン遺伝子のように、対立遺伝子排除が働くような遺伝子においては、ES細胞の両側のアレルにおいて、本来の構造遺伝子の終止コドンの後に、IRES配列を介在させた後、所望の蛋白質をコードする核酸配列を配置することができる。また、本来の構造遺伝子の片側のアレルをES細胞においてあらかじめ不活化しておき、不活化されていないアレルの本来の構造遺伝子の終止コドンの後に、IRES配列を介在させた後、所望の蛋白質をコードする核酸配列を配置することもできる。この場合、不活化されていないアレルが独占的に発現し、同時に所望の蛋白質をコードする核酸配列も高発現することが期待される。
免疫グロブリンκ鎖遺伝子の発現は、前述した通り多数のVおよびJ遺伝子断片が、組換えにより結合することより起こる。この結合の結果、各V遺伝子断片の上流近傍にあるプロモーター配列はJ断片下流に存在するエンハンサー配列の近傍に配置される。このような状況において、エンハンサー配列は初めて該プロモーターを活性化することができる(Picardら、Nature,307:80−2,1984)。すなわち、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、人為的に免疫グロブリンκ鎖遺伝子のプロモーター配列と連結した形で、前記エンハンサー配列の近傍に配置することもできる。免疫グロブリンκ鎖遺伝子座には前記エンハンサー配列以外にもさらに下流にエンハンサー配列が存在することが知られており(Meyerら、EMBO J.8:1959−64,1989)、該遺伝子はこのように複数のエンハンサーの影響のもとB細胞において高発現する。
上述したような所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を、以下ノックイン細胞またはノックインES細胞とも呼び、これらの細胞は、限定するものではないが、例えば以下に記載するように得ることができる。
(1)ターゲティングベクター(ノックインベクター)の構築
最初に、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の下流に、所望の蛋白質をコードする核酸配列が挿入されたノックインベクター、あるいは上記遺伝子の下流に配置されたインターナルリボゾーマルエントリーサイトの下流に、所望の蛋白質をコードする核酸配列が挿入されたノックインベクターを構築する。
導入する核酸配列は、開始コドンから終止コドンまでを含んでいればcDNAでもイントロンを含むゲノムDNAであってもよく、該核酸配列によってコードされる蛋白質の種類はいかなるものでもよい。本発明で使用される核酸配列は、それによってコードされる蛋白質の高発現・分泌のために使用されてもよいし、該蛋白質の機能を解明するために使用されてもよい。したがって、導入する核酸配列はその塩基配列が特定されるならば、いずれの種類のものでも使用可能である。核酸配列(構造遺伝子)の例としては、哺乳動物、好ましくはヒト、由来の機能性蛋白質をコードする遺伝子、たとえば分泌蛋白質をコードする遺伝子、膜蛋白質をコードする遺伝子、細胞内または核内蛋白質をコードする遺伝子、などが挙げられる。
本発明において利用可能なIRESとしては、限定されるものではないが、脳心筋炎ウイルス(Encephalomyocarditis Virus;EMCV)由来のIRES(Jangら、前記)、pIREShyg(米国クローンテック社)などが挙げられる。IRESおよび/または所望の蛋白質をコードする核酸配列をノックインベクターに挿入する場合、それらの挿入部位は、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリA付加部位の間が望ましく、またその数は複数でもよい。IRES配列が形成する二次構造が、上記遺伝子の翻訳に悪影響を与えないように、上記遺伝子の終止コドンからIRESの間は一定の間隔(例えば数bp〜数10bp)をあけるのが望ましい。
特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むように、あるいは上記遺伝子の下流にIRESを含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むように動物のゲノムを改変するために、ノックインベクターを準備し、このベクターDNAに該IRESおよび/または該所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入する。この目的のために使用可能なベクターの例は、プラスミド、ウイルスなどであり、当業者であればノックインベクターとして使用可能なベクターを容易に選択し、入手することができる。ベクターの具体例は、限定するものではないが、pKIκ(後述の実施例参照)である。ノックインベクターは、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリA付加部位の間(たとえば中間点付近)に、IRES配列および/または目的の核酸配列DNAの挿入部位として適当な制限酵素切断部位が挿入され、該制限酵素切断部位には、導入する核酸配列の開始コドンから終止コドンまでを含むDNA(cDNA、ゲノムDNA)が挿入される。また、好ましくは開始コドンの上流にコザック配列等の翻訳促進配列を配置することができる。更に、ベクターには、必要に応じて選択マーカー、たとえばピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、GFP遺伝子等を含むことができる。
(2)非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞へのノックインベクターの導入、および相同組換え体の選択
ノックインベクターによる非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞の形質転換は、当技術分野で公知の手法、例えば相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8ジーンターゲティング、羊土社、1995等に記載された方法によって行うことができる。例えば、上記作製したノックインベクターを、エレクトロポレーション、リポフェクション法などにより分化多能性を有する細胞に導入することができる。
ノックイン(ターゲティング)ベクターDNAの調製工程において、ターゲティングベクターDNAをポリアミン類もしくはその類似化合物で処理する、またはターゲティングベクターDNAとポリアミン類もしくはその類似化合物との複合体を形成させることにより、ランダム挿入に対する相同組換え比率を向上させることが可能である。そのようなポリアミン類もしくはその類似化合物による処理またはポリアミン類もしくはその類似化合物との複合体形成は、形質転換前に、ターゲティングベクターの線状化を行う前、間または後に該ベクターと少なくとも1種のポリアミンもしくはその類似化合物を接触させることにより行うことができる。例えば、ノックインベクターを線状化する際の反応バッファー中に、1mMスペルミジンを添加することにより、相同組換え比率の上昇が観察される。
ターゲティングベクターとポリアミン類もしくはその類似化合物と接触させるタイミングは、上述したように、ベクターを線状化させる前にベクターを含む溶液中にポリアミン類もしくはその類似化合物を添加する、ベクターを線状化させるための制限酵素バッファー(例えば、50mM Tris−HCl,10mM MgCl2,100mM NaCl,1mM Dithioerythritol)中にポリアミン類もしくはその類似化合物を添加する、ならびに/あるいは、制限酵素処理、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿、乾燥処理を行った後のDNAを溶解するためのHBSバッファー(例えば、25mM Hepes,137mM NaCl,5mM KCl,0.7mM Na2HPO4・2H2O,6mM Dextrose)にポリアミン類もしくはその類似化合物を添加する、のいずれでもよい。いずれにしても電気パルス実験において細胞に添加されるDNAがポリアミンもしくはその類似化合物と複合体を形成している状態であることが望ましい。ポリアミン類もしくはその類似化合物の添加濃度は0.1mM〜10mMが好ましく、さらに好ましくは1mMである。1mMという添加濃度は好ましい様態の一つであるが、より低い濃度、あるいはより高い濃度においても類似の効果を発揮し得る。
スペルミジン(トリアミン)以外の代表的なポリアミン類としては、プトレッシン(ジアミン)、カダベリン(ジアミン)、スペルミン(テトラアミン)などが知られている。これらのポリアミンは、スペルミジン同様の生理的作用、すなわち、1)核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化、2)種々の核酸合成系への促進作用、3)蛋白質合成の活性化、4)ヒストンのアセチル化、などを持つことが知られており、スペルミジンと類似の効果を発揮すると考えられる。ポリアミンの重要な性質として、DNAと複合体を形成すること、原核細胞由来の酵素を用いた試験管内組換え実験系における促進因子であることが知られている。さらには、外来DNAに添加することにより、当該DNAの哺乳動物細胞への導入効率を改善することも知られている。一方、ポリアミンが本発明での課題であるランダム挿入に対する相同組換え体の比率に対して影響を与えることは従来知られていなかった。上記ポリアミンは、市販されており、例えば米国シグマ(SIGMA)社製のスペルミジンなどを入手することができる。また、ポリアミン類の類似化合物としては、ポリアミン類と同様にDNAのリン酸とイオン結合可能な化合物であれば特に限定されるものではなく、例えばポリ−L−リジン、ポリ−L−アルギニンなどが知られている。これらの類似化合物もまたDNAのリン酸とイオン結合することによってDNAの安定化と構造変化をもたらし、ポリアミン類と同様の効果を発揮すると考えられる。上記類似化合物としては市販されているものを用いることができ、例えば米国シグマ(SIGMA)社製のポリ−L−リジン、ポリ−L−アルギニンなどを入手することができる。
上述したようにポリアミン類もしくはその類似化合物を利用することによりランダム挿入に対する相同組換え比率を向上させることが可能であるから、この利用は相同組換えによる遺伝子破壊(遺伝子ノックアウト)においても効果を示すと考えられる。すなわち、本発明は、ターゲティングベクター(ノックインベクター、ノックアウトベクター)にポリアミン類もしくはその類似化合物による処理を行うことを特徴とする、遺伝子ターゲティングの方法、あるいはターゲティングベクターとポリアミン類もしくはその類似化合物の複合体を形成させることを特徴とする、遺伝子ターゲティングの方法を提供する。
本発明はさらに、遺伝子ターゲティング方法に使用するための、少なくとも1種のポリアミンもしくはその類似化合物を含む試薬または組成物を提供する。そのようなポリアミンもしくはその類似化合物の例としては、スペルミジン、カダベリン、プトレッシン、スペルミン、ポリ−L−リジン、ポリ−L−アルギニンが挙げられ、好ましくはスペルミジンであるが、これらに限定されない。本発明により、上記のようにポリアミン類もしくはその類似化合物で処理されたターゲティングベクターまたはポリアミン類もしくはその類似化合物と複合体を形成するターゲティングベクターを用いて非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を形質転換する場合、ランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を従来のものより向上させることができる(実施例11参照)。
さらに、ターゲティングベクター(ノックインベクター、ノックアウトベクター)の構造に、相同組換えの効率を上げるための改変を施すことができる。すなわち、ゲノム中にターゲティングベクターがランダム挿入された細胞を排除するためのネガティブセレクションマーカーが、ターゲティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように操作することによって、相同組換えの効率を上げることができる。
具体的には、線状化されたターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとして機能する遺伝子構造の5’端および3’端が、ターゲティングベクターのそれぞれ5’および3’端から少なくとも1Kb、好ましくは2Kb以上離れるよう操作することが望ましい。通常、ネガティブセレクションマーカーの5’端または3’端の一方には、ゲノムとの相同組換えのための領域(相同組換え領域)が位置するため、ベクター端からの距離は3Kb以上となることがほとんどである。一方、ネガティブセレクションマーカーのもう一方の端は、ベクター端に近接している場合が多い。本発明では、ネガティブセレクションマーカーの、相同組換え領域と隣接していない端に、線状化ベクターの末端から少なくとも1kbの距離を設けるよう操作し、それにより相同組換えの効率を上昇させる。ベクター端からの距離を確保するための配列としては、ターゲティングベクター構築の際に使用するpUCなどのプラスミドの配列をそのまま残して(すなわち線状化する際に削除しない)利用することもできる(例えば図1〜7参照)し、また、目的とするターゲティング領域に非相同な任意の新たなノンコーディング配列をネガティブセレクションマーカーの隣に配置することも可能である。ベクターの線状化は、使用しているターゲティングベクターの制限酵素認識部位を精査し、ベクター端とネガティブセレクションマーカーの端とが距離を確保できるような適当な制限酵素部位を選択してベクターを線状化することによって、相同組換え効率を改善させるという効果を達成することができる。また、そのような適当な制限酵素部位が見つからない場合であっても、PCRを用いた手法(Akiyamaら、Nucleic Acids Research,2000,Vol.28,No.16,E77.)により、適当な制限酵素認識配列をターゲティングベクターの所望の位置に導入することができる。
上述したようなターゲティングベクター構造をとることにより、ネガティブセレクションマーカーが細胞中でヌクレアーゼの攻撃を受ける頻度が低下し、相同組換えの効率が上昇するものと考えられる。
すなわち、本発明は、ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとして機能する遺伝子構造の5’端および3’端が、線状化したターゲティングベクターのそれぞれ5’端および3’端から少なくとも1Kb、好ましくは3Kb以上離れていることを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター、ならびに該ターゲティングベクターを用いた遺伝子ターゲティング方法を提供する。前記ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとしては公知のものであればいずれのものも利用可能であるが、好ましくはジフテリアトキシンA遺伝子である。
相同組換え体を簡便に同定するために、外来遺伝子がノックインされる位置に薬剤耐性遺伝子マーカーをあらかじめ挿入しておくこともできる。例えば、本明細書中実施例で用いられているマウスES細胞TT2Fは、C57BL/6系統とCBA系統との間のF1個体由来の細胞である。先述したように(Deng & Capecchi,Mol.Cell.Biol.,12:3365−71,1992)、ノックインベクターに含まれるゲノム相同領域の配列がC57BL/6に由来する場合、TT2F細胞においてはC57BL/6由来のアレルにおいてより高率に相同組換えが起こると想像される。すなわち、あらかじめC57BL/6由来ゲノムDNAを含むターゲティングベクター(ノックインベクター)を用いてC57BL/6由来のアレルに例えばG418耐性マーカーを挿入することができる。次に得られたG418耐性株について、ピューロマイシン耐性マーカーを含み、かつC57BL/6由来ゲノムDNAを含むノックインベクターを導入してピューロマイシン耐性かつG418感受性株を取得することができる。この株においては、ノックインベクターと、前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子との相同組換えによりG418耐性遺伝子が除去され、代わりに所望の蛋白質をコードする構造遺伝子とピューロマイシン耐性マーカーが挿入されている。このような方法により、相同組み換え体同定におけるサザン解析等の手間を省くことができる。
本出願人によって出願されたPCT国際出願WO 00/10383号パンフレット(2000年3月2日国際公開)に記載された方法と同様に、ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、ゲノムDNAを調製し、サザン解析法により相同組換え体を同定することが可能である。ノックインベクター中のピューロマイシン耐性遺伝子は、WO 00/10383号パンフレットに記載されたLox−P Puroプラスミドに由来し、その両端に順方向にLox−P配列を含んでいる。よってWO 00/10383号パンフレットに記載された方法により、同耐性遺伝子をノックインされた分化多能性を有する細胞から除去することができる。
上述したノックインベクター、ならびに相同組換え効率を向上させる技術および手段は、遺伝子導入可能な細胞すべてに応用が可能であり、キメラ動物の作製に限定されない。例えば、ヒトおよびヒト細胞(例えば血液細胞や免疫細胞など)を対象とした遺伝子治療において、本明細書に記載のノックインベクターおよび相同組換え効率を向上させる技術を所望の遺伝子を破壊または導入するために使用することができる。
2.特定の細胞および/または組織が欠損した宿主胚
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法では、次に、前記特定の細胞および/または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚(以下、欠損宿主胚ともいう)を用意する。そのような欠損宿主胚としては、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を制御領域として利用する場合には、免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトによるB細胞欠損胚(Tomizukaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,18:722−727,2000)、T細胞受容体遺伝子を制御領域として利用する場合には、T細胞受容体β鎖欠損によるTリンパ球細胞欠損胚(Mombaertsら、Nature,360:225−227,1992)、ミオグロビン遺伝子を制御領域として利用する場合には、マイオゲニン遺伝子ノックアウトによる筋肉組織の欠損胚(Nabeshimaら、Nature,364:532−535,1993)、クリスタリン遺伝子を制御領域として用いる場合には、水晶体を欠損するマウスの突然変異体であるaphakia(ak)系統由来の胚(Liegeoisら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93:1303−1307,1996)、レニン遺伝子を制御領域として利用する場合には、Sall1遺伝子ノックアウトによる腎臓組織の欠損胚(Nishinakamuraら、Development,128:3105−3115,2001)、アルブミン遺伝子を制御領域として利用する場合には、c−Met遺伝子欠損による肝臓組織の欠損胚(Bladtら、Nature,376:768−770,1995)、リパーゼ遺伝子を制御領域として用いる場合には、Pdx1遺伝子ノックアウトによる膵臓組織欠損胚(Jonssonら、Nature,371:606−9,1994)などが挙げられる。好ましい欠損宿主胚を上記例示したが、本発明で使用可能な欠損宿主胚は上記のものに限定されない。
また、効率的なキメラ非ヒト動物作製を行うための宿主胚の発生時期、遺伝的背景等の選択については、それぞれのES細胞株について既に検討された条件を用いることが望ましい。例えばマウスの場合、CBA×C57BL/6 F1由来のTT2細胞またはTT2F細胞(野性色、Yagiら、Analytical Biochemistry,214:70−76,1993)からのキメラ作製については宿主胚がBalb/c(白色、日本国日本クレア社)、ICR(白色、日本国日本クレア社)、またはMCH(ICR)(白色、日本国日本クレア社)の遺伝的背景であることが望ましい。よって前記特定の細胞および/または組織が欠損した非ヒト動物系統とこれらの系統の戻し交配により得られる非ヒト動物の胚(例えば8細胞期胚)を欠損宿主胚として用いるのが望ましい。
宿主胚において欠損する細胞および/または組織は、ブラストシスト・コンプリメンテーション(BC)によって、分化多能性を有する細胞により補填されるため、前記宿主欠損胚は、キメラ動物を作製するための胚盤胞期まで発生しうるものであれば、胚性致死のものであってもかまわない。このような胚性致死胚は、遺伝子の欠損がヘテロである動物同士の交配によって原理的には4分の1の確率で生じるため、交配により得られた胚を複数取得して下記手順に従ってキメラ動物を作製し、その中から宿主胚が欠損胚であるものを選抜する。この選抜は、キメラ動物の体組織より抽出したDNAを用いたサザン解析、PCR解析等により行うことができる。
3.キメラ胚の作製および仮親への移植
上記「1.分化多能性を有する細胞の作製」の項目で得られたノックイン(ES)細胞株からのキメラ非ヒト動物の作製は、相沢慎一(前記)等に記載された方法で行うことができる。具体的に説明すると、作製したノックイン分化多能性細胞を、上記「2.特定の細胞および/または組織が欠損した宿主胚」の項目に記載の欠損宿主胚の胚胎盤胞または8細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚胎盤胞または8細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。
4.キメラ非ヒト動物における導入遺伝子の発現
上記「キメラ胚の作製および仮親への移植」の項目に従って作製されるノックイン分化多能性細胞注入胚に由来する仔動物における分化多能性細胞の貢献率は、その毛色により大まかに判定することができる。例えば、TT2F細胞(野生色)由来のノックイン細胞株をMCH(ICR)(白色)バックグラウンドの宿主マウス胚に注入した場合、野生色(濃茶)の割合が分化多能性細胞の貢献率を示している。ここで毛色における貢献率は、前記欠損する細胞および/または組織以外の細胞および/または組織におけるノックイン分化多能性細胞の貢献率と相関があるが、組織によっては毛色の貢献率と一致しない場合もある。一方、上記キメラ非ヒト動物においては、宿主胚由来の前記欠損する細胞および/または組織は存在せず、ノックイン分化多能性細胞由来のもののみ存在する。ノックイン分化多能性細胞の貢献による、キメラ非ヒト動物における欠損細胞および/または組織の回復は、FACS解析(Fluorescence−Activated Cell Sorter)、ELISA法(Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)等によって検出可能である。ノックイン分化多能性細胞由来の細胞および/または組織において挿入した核酸配列(構造遺伝子)が発現するかどうかは、当該細胞および/または組織由来のRNAを用いたRT−PCR法(Kawasakiら、P.N.A.S.,85:5698−5702,1988)、ノーザンブロット法(Ausubelら,Current protocols in molecular biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)などにより検出される。蛋白質レベルの発現は、導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法(ELISA;富山・安東、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィク、1987)、ウエスタンブロット法(Ausubelら,前記)等を利用して検出できる。また、導入される核酸配列(構造遺伝子)をコードするDNAを適当に改変し、抗体で検出可能なタグペプチドを付加しておけば、該タグペプチドに対する抗体等で導入した遺伝子の発現を検出できる(POD標識抗His6,日本国ロシュ・ダイアグノスティックス)。
上述のようにして作製されたキメラ非ヒト動物は、少なくとも特定の細胞および/または組織において、導入した核酸配列(構造遺伝子)が高発現する。発現した所望の蛋白質が、血液、乳などの分泌されるような系であれば、有用蛋白質の生産系として利用することができる。また、機能未知の蛋白質を高発現させた場合には、前記高発現に伴う所見から、当該蛋白質の機能を解明していくことができる。
さらに近年、体細胞核移植胚からの動物個体作製法と体細胞におけるジーンターゲティングとを組み合わせて、マウス以外の動物種(ウシ、ヒツジ、ブタ等)でもマウス同様の遺伝子改変が可能になった(McCreathら、Nature,405:1066−1069,2000)。例えば免疫グロブリン重鎖のノックアウトによりB細胞を欠損するウシを作製可能である。さらにマウス、ウシ、ヒツジ、ブタなどのIg遺伝子座下流に導入遺伝子を挿入し、線維芽細胞の核を移植した未受精卵を発生させ、胚盤胞期胚よりES細胞を調製可能である。このES細胞と上記B細胞欠損宿主胚との間でキメラ非ヒト動物が作製可能であり(Cibelliら,Nature Biotechnol.,16:642−646,1998)、マウスだけでなくその他の動物種においても同様の発現系を利用した分泌蛋白質の高発現が可能である。大動物の利用により、遺伝子機能解析だけでなく有用物質生産への適用も考えられる。
5.キメラ非ヒト動物の子孫の作出
本発明のキメラ非ヒト動物の作出方法は、さらに、それと同種の非ヒト動物と交配させて導入した核酸配列をヘテロにもつトランスジェニック(Tg)動物を選択して得、このTg動物の雄と雌を交配させて導入遺伝子をホモにもつTg動物子孫を得ることを含む。
6.キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞
本発明においては、前記いずれかのキメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞を得ることができる。該細胞または組織は、該細胞または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含み、所望の蛋白質を発現することができるものである。
前記組織および細胞には、キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来し、かつ所望の蛋白質を発現することができるものであればいずれの組織および細胞も含まれ、例えば、B細胞、脾臓、リンパ組織などが挙げられる。
前記組織および細胞は、当技術分野で公知の手法により採取・培養することができ、該組織および細胞が所望の蛋白質を発現しているかどうかも慣例的な手法に従って確認することができる。このような組織および細胞は、以下で記載するハイブリドーマの作製、蛋白質の製造などに有用である。
7.ハイブリドーマの作製
本発明においては、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列を発現するキメラ非ヒト動物の細胞、特にB細胞もしくはB細胞を含む脾臓、リンパ節などのリンパ組織からの細胞と、増殖可能な腫瘍細胞(たとえばミエローマ細胞)とを融合することによって、ハイブリドーマを得ることができる。ハイブリドーマの作製法は、たとえば安東・千葉(単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク、1991)に記載される手法に基くことができる。
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることができるが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)ミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3−U1)[Yelton,D.E.ら,Current Topics in Microbiology and Immunology,81:1−7(1978)]、P3/NSI/1−Ag4−1(NS−1)[Kohler,G.ら,European J.Immunology,6:511−519(1976)]、Sp2/0−Ag14(SP−2)[Shulman,M.ら,Nature,276:269−270(1978)]、P3X63Ag8.653(653)[Kearney,J.F.ら,J.Immunology,123:1548−1550(1979)]、P3X63Ag8(X63)[Horibata,K.and Harris,A.W.Nature,256:495−497(1975)]などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば8−アザグアニン培地[グルタミン、2−メルカプトエタノール、ゲンタマイシンおよびウシ胎児血清(以下「FCS」という)を加えたRPMI−1640培地に8−アザグアニンを加えた培地]、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium;以下「IMDM」という)、またはダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium;以下「DMEM」という)で継代培養するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地(例えば、10%FCSを含むDMEM培地)で継代培養し、融合当日に2×107以上の細胞数を確保しておく。
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する細胞として使用可能なものは、プラズマ細胞(すなわち、形質細胞)、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する脾細胞をミエローマと融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。具体的には次のように行うことができる。脾細胞とミエローマとを無血清培地(例えばDMEM)、またはリン酸緩衝生理食塩液(一般にPBSと呼ばれる)でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が通常約5:1〜約10:1になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら1mlの50%(w/v)ポリエチレングリコール(分子量1000〜4000)を含む無血清培地を滴下する。その後、10mlの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン液およびヒトインターロイキン−6を含む正常培地(一般にHAT培地と呼ばれる)中に懸濁して培養用プレートの各ウェルに分注し、5%炭酸ガス存在下、37℃で2週間程度培養する。培養途中に適宜HAT培地を補う。
ミエローマ細胞が8−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)欠損株である場合には、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、HAT含有培地中では生存できない。一方、脾臓細胞どうしの融合細胞、あるいは、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、脾臓細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、HAT含有培地中での培養を続けることによって、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残る。
得られたハイブリドーマは、前記の導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質に対して特異的な抗体によるELISAでスクリーニングすることにより、導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を産生するハイブリドーマを選択することができる。
8.蛋白質の製造方法
本発明はさらに、上記のキメラ非ヒト動物またはその子孫、あるいは上記の組織または細胞、あるいは上記のハイブリドーマのいずれかを用いて所望の蛋白質を産生させた後、該蛋白質を回収することを含む、所望の蛋白質を製造する方法を提供する。具体的に説明すると、キメラ非ヒト動物またはその子孫の個体を、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で飼育し、その後発現産物である蛋白質を動物の血液、腹水などから回収することができる。あるいはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞、あるいはそれを不死化したもの(例えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイブリドーマ)などを、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で培養し、その後発現産物である蛋白質を培養物、培養上清などから回収することができる。発現産物は、遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、さらに硫安分画、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー(例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなど)、分取薄層クロマトグラフィー、HPLCなどの公知の方法の1種または複数の組み合わせによって精製することができる。
9.生体内機能の解析方法
本発明はさらにまた、上記のキメラ非ヒト動物またはその子孫の表現型を、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型ES細胞より作製されたキメラ非ヒト動物などの表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を解析する方法を提供する。
本方法では、遺伝子導入に対応して生体内に現れる任意の形質を物理化学的方法によって検出し、これによって導入した核酸配列または蛋白質の生体内機能を同定することができる。たとえば、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むES細胞より作製されたキメラ非ヒト動物またはその子孫、および前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型のES細胞より作製されたキメラ非ヒト動物の血液を採取し、血球数測定機によって分析する。測定された白血球、赤血球、血小板などの血中濃度を前記2種のキメラ非ヒト動物間で比較することによって、導入した核酸配列によってコードされる該所望の蛋白質の血球系細胞の増殖・分化に対する作用を検討することができる。後述の実施例では、導入した核酸配列としてトロンボポエチン(TPO)をコードするDNAを用いたが、この場合、キメラマウスにおいて顕著な血小板増加(形質)が観察された。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の好ましい実施形態として、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用したシステムを例に挙げて記載する。
免疫グロブリン(Ig)は血清中に分泌される蛋白質の中でも最も大量に生産されるものの一つである。例えばヒトにおいては血清蛋白質の10〜20%を占め、その濃度は10〜100mg/mlに達する。IgはB細胞、主にその終末分化型であるプラズマ細胞において多量に生産されるが、Ig遺伝子座における高い転写活性、mRNAの安定性、蛋白質の分泌生産に特化したプラズマ細胞の機能など、様々な要因がそのIgの高レベルの発現に寄与している。さらに、成体において、B細胞は骨髄で発生し、成熟すると共に脾臓、小腸パイエル板、リンパ節など全身のリンパ組織に移行することから、B細胞のIg遺伝子の制御領域下で産生された導入遺伝子産物はIg同様に血中またはリンパ液中に放出され、全身に速やかに行き渡る。本発明においては、このような高発現をもたらすIgの発現系を利用して所望の蛋白質をコードする核酸配列(構造遺伝子)を発現させることに利点を有する。
導入遺伝子の効率的な発現のための導入遺伝子挿入箇所は、Ig軽鎖、好ましくはκ軽鎖が望ましいと考えられる。例えば、マウス免疫グロブリンの95%はκ軽鎖を含み、その定常領城遺伝子は1つしか存在しない。一方で、軽鎖λは5%であり、4種の異なる遺伝子が存在してそのいずれかが使用される。また、重鎖においても定常領域はμ、γ(4種)、αおよびεの計7種あり、通常、導入遺伝子の挿入は1箇所であることを考慮すると、κ鎖の利用が好ましい。
発現形態としては、機能的なIg軽鎖が産生される条件でさらに導入した核酸配列が発現することが望ましい。Ig遺伝子座では対立遺伝子排除の機構により、機能的なIg発現が他の対立遺伝子の発現を抑えられることが知られているが、組換えに失敗して終止コドンが本来の終止コドンより上流に現れるようなmRNAは不安定化すると考えられている。よって、導入した核酸配列の発現を最大化するためには、機能的なIg軽鎖と導入核酸配列(構造遺伝子)が1つのmRNAにあるような状態が望ましい。
本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列の終止コドンの下流にこのIRESが配置され、IRESの下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列(導入遺伝子)が配置されてなる遺伝子をゲノム上に含むことが好ましい。IRES+導入遺伝子の挿入部位は、Ig軽鎖の終止コドンとポリA付加部位の間が望ましく、またその数は複数でもよい。IRES配列が形成する二次構造が、Ig軽鎖遺伝子の翻訳に悪影響を与えないように、Ig軽鎖遺伝子の終止コドンからIRESの間は一定の間隔(例えば数bp〜数10bp)をあけるのが望ましい。
免疫グロブリン軽鎖遺伝子の下流にIRESを含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むように動物のゲノムを改変するために、ノックインベクターを準備し、このベクターDNAに該IRESと該所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入する。このベクターとしては、pKIκ(実施例1参照)が好ましい。ノックインベクターは、軽鎖の終止コドンとポリA付加部位の間(たとえば中間点付近)に、IRES配列および導入する核酸配列の挿入部位として適当な制限酵素切断部位が挿入され、該制限酵素切断部位には導入する核酸配列の開始コドンから終止コドンまでを含むDNA(cDNA、ゲノムDNA)が挿入される。また、好ましくは開始コドンの上流にコザック配列等の翻訳促進配列を配置することができる。さらに、相同組換え体を簡便に同定するために、外来遺伝子がノックインされる位置に薬剤耐性遺伝子マーカー、好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子をあらかじめ挿入しておくこともできる。このノックインベクターDNAの調製工程においては、スペルミジンなどのポリアミン類もしくはその類似化合物による処理を行うことが好ましい。
ノックインベクターによる非ヒト動物ES細胞の形質転換は、相沢慎一(前記)等に記載された方法によって行うことができる。本出願人によって出願されたPCT国際出願WO 00/10383号パンフレット(2000年3月2日国際公開)に記載された方法と同様に、ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、ゲノムDNAを調製し、サザン解析法により相同組換え体を同定する。ノックインベクター中のピューロマイシン耐性遺伝子はWO 00/10383号パンフレットに記載されたLox−P Puroプラスミドに由来し、その両端に順方向にLox−P配列を含んでいる。よってWO 00/10383号パンフレットに記載された方法で同耐性遺伝子をノックインされたES細胞から除去することができる。
本発明において、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用する場合、ES細胞注入のための欠損宿主胚としては、WO 00/10383号パンフレットに記載された免疫グロブリン重鎖遺伝子破壊についてホモである非ヒト動物系統を用いることが好ましい。
作製したノックインES細胞を、上記欠損宿主胚の胚胎盤胞または8細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚胎盤胞または8細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。
キメラ非ヒト動物においては、宿主胚由来の成熟Bリンパ球は存在せず、ノックインES細胞由来のもののみ存在する。これは、宿主胚として用いる免疫グロブリン重鎖ノックアウト非ヒト動物は、成熟Bリンパ球(B220陽性)を欠損し、血中に免疫グロブリンが検出されないことによる(Tomizukaら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:722−727,2000)。ノックインES細胞の貢献による、キメラ非ヒト動物における成熟Bリンパ球および抗体産生の回復は、FACS解析、ELISA法等によって検出可能である。ノックインES細胞由来B細胞において挿入した核酸配列が発現するかどうかは、挿入したアレル(対立遺伝子ともいう)のIg軽鎖遺伝子において、部位特異的組換え反応が起こるかどうかに依存している。すなわち挿入アレルのIg軽鎖遺伝子の組換えが成功し、そのmRNAが機能的な軽鎖をコードする場合、mRNA上に同時に存在する挿入核酸配列(構造遺伝子)もIRESの働きにより蛋白質に翻訳される。さらに、挿入アレルのκ鎖遺伝子の組換えが失敗し、もう一方のアレルのκ鎖あるいはλ鎖が機能的な軽鎖をコードする場合でも、非機能的なκ鎖および導入核酸配列をコードするmRNAの転写は起こるため、挿入核酸配列由来の蛋白質は発現する。挿入核酸配列の発現が起こらないのは、もう一つのアレルのκ鎖あるいはλ鎖が先に機能的な組換えに成功し、挿入アレルのIgκ鎖の組換えが対立遺伝子排除の機構によりシャットオフされる場合である。非ヒト動物においてB細胞は胎生12日目頃より胎児肝組織に出現するが、出生と共に発生の場は骨髄に移動する。胎児期においてはB細胞は発生の初期段階、すなわち膜型免疫グロブリン受容体を発現する細胞が主体である。成体と比較してB細胞自体の数が少ないことおよび膜型Igを主に発現する細胞では免疫グロブリンをコードするmRNA量自体が少ないことによって、挿入核酸配列の発現も成体と比較して非常に少ないと考えられる。抗体産生は離乳期(3週齢)より増加するが、終末分化段階であるプラズマ細胞の増加によるものと想像される。以後、B細胞は、脾臓、リンパ節、小腸パイエル板などのリンパ組織に移動して抗体および挿入核酸配列を発現する。挿入核酸配列がコードする所望の蛋白質は免疫グロブリン同様、血液やリンパ液中に分泌され、全身に行き渡る。
導入核酸配列のB細胞における発現は以下のようにして確認される。導入遺伝子を含むポリシストロニックmRNAの発現は例えば脾臓、末梢血有核細胞など、B細胞を含む組織や細胞集団由来RNAを用いたRT−PCR法、ノーザンブロット法などにより検出される。蛋白質レベルの発現は、導入核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法等を利用して検出できる。また、導入核酸配列をコードするDNAを適当に改変して抗体で検出可能なタグペプチドを付加すれば、該タグペプチドに対する抗体等で導入核酸配列の発現を検出できる。
上述のようにして得られたキメラ非ヒト動物は、効率よくかつ確実に導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列を高発現する。この効率の高さは、前述したが、主として以下の点に基づく:
(1)Bリンパ球欠損宿主胚の利用によって、キメラ動物のBリンパ球がキメラ率に関わらず全てES細胞に由来する。
(2)Igκ遺伝子座における相同組換え効率が5%以上の効率で起こる。
(3)免疫グロブリンの発現系を利用している。
(4)免疫グロブリンの発現は発生初期には非常に少なく、離乳期以降に爆発的な増加を示すため、高発現が胚性致死をもたらすような遺伝子を導入する場合でも、成体における機能を検討することができる。
実施例
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
〔実施例1〕ノックインベクターpKIκの作製
(1)クローニング部位近傍断片の作製
マウスイムノグロブリンカッパ鎖(Igκ)遺伝子の終止コドン部分とポリアデニレーションシグナル(PolyAシグナル)の間にインターナルリボゾーマルエントリーサイト(IRES)および導入対象の所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入するための制限酵素認識配列(SalI認識配列)を導入し、PolyAシグナル下流にピューロマイシン耐性遺伝子を導入したゲノム断片を作製した。以下にその方法を具体的に記す。
(1.1)クローニング部位上流の断片の調製
GenBank(米国NCBI)より取得したマウスIgGκ遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
5’側プライマーであるigkc1の末端にはXhoI認識配列を、3’側プライマーであるigkc2にはEcoRI認識配列を付加した。TakaLa LA−Taq(日本国宝酒造)の添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてIg軽鎖Cκ−Jκを含むλクローン由来DNA断片をpBluescript SK II(+)(日本国東洋紡)クローニングしたもの(WO 00/10383号パンフレット)25ngを添加し、94℃で1分保温したのち、94℃30秒および68℃3分を1サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した後、EcoRIおよびXhoIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いて目的の断片を回収して増幅断片Aを得た。EcoRIおよびXhoIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpBluescript2 KS−ベクター(米国ストラタジーン)に該増幅断片Aを挿入し、それを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドpIgCκAを取得した。
(1.2)クローニング部位下流の断片の調製
GenBank(米国NCBI)より取得したマウスIgGκ遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
5’側プライマーであるigkc3の末端にはEcoRI認識配列を、3’側プライマーであるigkc4にはプライマーの5’側からBamHI,XhoI,およびSalI認識配列を付加した。TakaLa LA−Taq(日本国宝酒造)の添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてIg軽鎖Cκ−Jκを含むλクローン由来DNA断片をpBluescript SKII(+)(日本国東洋紡)クローニングしたもの(WO 00/10383号パンフレット)25ngを添加し、94℃で1分保温したのち、94℃30秒、55℃30秒および72℃1分を1サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した後、EcoRIおよびBamHIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いて目的の断片を回収して増幅断片Bを得た。EcoRIおよびBamHIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpIgCκAベクターに得られた増幅断片Bを挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドpIgCκABを取得した。
(1.3)ピューロマイシン耐性遺伝子の導入
Lox−P Puroプラスミド(WO 00/10383号パンフレット)をEcoRIおよびXhoIで消化し、T4DNAポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いてloxP−ピューロマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を回収した。pIgCκABをSalIで消化して末端平滑化したプラスミドに、得られたloxP−ピューロマイシン耐性遺伝子断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドpIgCκABPを取得した。
(1.4)IRES遺伝子の導入
GenBank(米国NCBI)より取得したencephalomyocarditis virus(脳心筋炎ウイルス)由来のIRES遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
5’側プライマーであるeIRESFWの末端にはEcoRI認識配列を、3’側プライマーであるesIRESRVにはプライマーの5’側からEcoRIおよびSalI認識配列を付加した。TakaLa LA−Taq(日本国宝酒造)の添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてpIREShygプラスミド(米国クロンテック)150ngを添加し、94℃で1分保温したのち、94℃30秒、55℃30秒および72℃1分を1サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動にかけてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いて目的の断片を回収した。pGEM−Tベクター(米国プロメガ)に得られたDNA断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドIRES−Sal/pGEMを取得した。このプラスミドをEcoRIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いて目的の断片を回収した。pIgCκABPをEcoRIで消化したプラスミドに、得られたIRES遺伝子を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドpIgCκABPIRESを取得した。
(2)pΔCκSalプラスミドの作製
WO 00/10383号パンフレットに記載されている免疫グロブリン遺伝子軽鎖κノックアウト用ターゲティングベクタープラスミドをSacIIで消化した後、EcoRIを用いて部分消化した。0.8%アガロースゲル電気泳動にてLoxP−PGKPuro部分を切り出した残りの14.6KbのDNAを分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いて回収した。得られたDNAに以下の合成DNAを挿入することにより、SalI認識配列を導入した。
得られたプラスミドを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpΔCκSalを取得した。
(3)ノックインベクターpKIκの作製
上記(1.4)で得られたpIgCκABPIRESプラスミドをXhoIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いてCκ−IRES−loxP−ピューロマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を回収した。上記(2)で作製されたpCκSalをSalIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、前記DNA断片を挿入し、それを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、プラスミドpKIκを取得した。pKIκの構造を図1に示す。pKIκベクター構造の概略は以下のとおりである。
すなわち、5’側から、J断片下流に存在するエンハンサー配列およびIgκ軽鎖C領域を含むマウスIgκゲノムDNA(EcoRI〜EcoRI、約5.3Kb)、インターナルリボゾーマルエントリーサイト(約0.6Kb)、インターナルリボゾーマルエントリーサイト3’末端直下に位置するクローニングサイト(SalI)、マウスCκポリAシグナル領域(約0.3Kb)、ピューロマイシン耐性遺伝子カセット(約1.8Kb)、マウスCκポリAシグナル領域の下流に位置するマウスIgκゲノムDNA(約7.7Kb)、ジフテリアトキシンA(DT−A)遺伝子カセット(約1.0Kb)、PUC18 DNA(約2.7Kb)で構成される。上記ノックインベクターについて、後述する実施例2以降の操作を同様に行うことにより、ノックインES細胞を作製する。ノックインES細胞では、マウスIgκのCκ構造遺伝子の終止コドン直下の位置にインターナルリボゾーマルエントリーサイトが配置され、インターナルリボゾーマルエントリーサイト3’末端直下に位置するクローニングサイトに所望の構造遺伝子が配置される。さらにその直下の位置にマウスCκポリAシグナル領域が配置される。IRESを用いることにより、マウスIgκのCκ構造遺伝子の終止コドン下流に配置された構造遺伝子の翻訳効率は飛躍的に向上する(Mizuguchiら、Molecular Therapy Vol.1,No.4,2000,376−382.)。
〔実施例2〕pKIκへのTPO遺伝子の挿入
(1)pKIκ導入用マウストロンボポエチン(TPO)遺伝子の調製
マウスTPO遺伝子配列(国際公開WO 95/18858号パンフレット)より以下のDNAを合成した。
5’側プライマーであるtpoNの末端には5’側からXhoI認識配列およびKozak配列を、3’側プライマーであるtpoRの末端にはXhoI認識配列を付加した。
TaKaRa LA−Taq(日本国宝酒造)の添付文書に従って反応液を調製し、100μL反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてMarathon−Ready cDNA(Mouse Liver,米国クロンテック)100pgを添加し、94℃で30秒保温したのち、98℃1秒、50℃30秒および72℃1分を1サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動にかけてPCR増幅断片を分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用いて目的のDNA断片を回収した。得られたDNA断片をXhoIで37℃にて3時間処理後、QIAquick PCR Purification Kit(ドイツQIAGEN)で回収した。pBluescript II SK(−)(日本国東洋紡)をXhoI処理後にCIAP(日本国宝酒造)処理して得られたpBlueXhoICIAPプラスミド42ng、XhoI処理して得られたPCR増幅断片108ngおよびDNA Ligation Kit Ver.2,Solution I(日本国宝酒造)10μLを混合し、16℃で30分間インキュベーションした後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドDNA(pBlueTPO)を調製し、塩基配列を確認した。pBlueTPO9.6μgをXhoIで37℃にて4時間消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてTPO断片をQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用いて回収した。回収したTPO断片を再度0.8%アガロースゲルにて分離回収することでpKIκ導入用マウスTPO遺伝子を調製した。
(2)マウスTPO遺伝子導入ノックインベクターの調製
実施例1で調製したpKIκ21μgをSalIで37℃にて4時間消化後、エタノール沈殿でベクターを回収した。回収されたベクターを10μLのTEに溶解後、CIAP(日本国宝酒造)を用いて末端脱リン酸化したpKIκ−SalI−CIAPを調製した。このpKIκ−SalI−CIAP 40ng、上記(1)で調製したpKIκ導入用マウスTPO遺伝子4ng、およびDNA Ligation Kit Ver.2,Solution I(日本国宝酒造)1.8μLを混合し、16℃にて18時間インキュベーション後、大腸菌XL10−Gold Ultracompetent Cells(日本国東洋紡)に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認後、QIAfilter Plasmid Kit(ドイツQIAGEN)を用いてマウスTPO遺伝子導入ノックインベクターを調製した。
(3)Electroporation用マウスTPO遺伝子導入ノックインベクターの調製
上記(2)で調製したマウスTPO遺伝子導入ノックインベクター150μgをXhoIを用いて37℃にて6.5時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100%エタノールおよび0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、−20℃で16時間保存した。XhoIで一本鎖化させたベクターを遠心して回収後、70%エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70%エタノールを除き、1時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、1時間室温で保存して、Electroporation用マウスTPO遺伝子導入ノックインベクターの調製を行った。
〔実施例3〕TPOノックインES細胞株の取得
TPO−cDNAが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスES細胞株取得のため、実施例2で作製したTPOノックインベクターを制限酵素XhoI(日本国宝酒造)で線状化し、確立されている方法(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)に従ってマウスES細胞TT2F(Yagiら、Analytical Biochem.,214:70,1993)へ導入した。
TT2Fの培養法は、記載の方法(相沢慎一、前記)に従い、栄養細胞はマイトマイシンC(米国シグマ)処理したG418耐性初代培養細胞(日本国インビトロジェン社より購入)を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個/mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット(電極距離:0.4cm、米国バイオラッド)にてエレクトロポレーションを行った(容量:960μF、電圧:240V、室温)。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地(相沢慎一、前記)に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン、米国ベクトン.ディッキンソン)1枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン(米国シグマ)を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーのうち計124個をピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地(ES培地+10%DMSO、米国シグマ)に懸濁し、−80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits(米国Gentra System社)により調製した。これらのGピューロマイシン耐性TT2F細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI(日本国宝酒造)で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、WO 00/10383号パンフレット(実施例48参照)に記載の発明で使用された、Ig軽鎖Jκ−CκゲノムDNAの3’端のDNA断片(XhoI〜EcoRI、約1.4kb)をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、124株中2株(2%)が相同組換え体であるという結果を得た。野生型TT2F細胞ではEcoRI消化により、1本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される(WO 00/10383号パンフレット(実施例58参照))が、ピューロマイシン耐性株#6および#11においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にTPO−cDNAが挿入されたものである。
〔実施例4〕TPOノックインマウスES細胞株およびBリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なBリンパ球が欠損し、抗体が産生されない(Kitamuraら,Nature,350:423−426,1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なBリンパ球は、大部分が注入したES細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:722−7,2000)に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてMCH(ICR)(日本国日本クレア社)系統への戻し交配を3回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例3で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にTPO−cDNAが挿入されていることが確認されたピュローマイシン耐性TT2F細胞株#11を凍結ストックより立ち上げ、それを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた8細胞期胚に、胚1つあたり8〜10個注入した。ES培地(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後2.5日の仮親MCH(ICR)マウス(日本国日本クレア社)の子宮に、片側の子宮あたり約10個のインジェクション胚を移植した。計180個の注入胚を移植した結果、16匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にTT2F細胞由来の野生色(濃茶)が認められるかどうかによって判定される。誕生した16匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちES細胞の貢献の認められる個体は10匹であった。また、最高の貢献率は2個体における100%であった。この結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にTPO−cDNAが挿入されているピュローマイシン耐性TT2F細胞株#11はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
〔実施例5〕TPOノックインES細胞由来キメラマウスにおける血小板増加
上記実施例4で作製されたTPOノックインES細胞株#11由来のキメラマウス計10匹(キメラ率100〜5%)および非キメラマウス5匹より、6週齢の時点で眼窩採血し、血球測定装置(日本国シスメックス(株)製、F−820)を用いて末梢血血球数を測定した。キメラマウス群では、キメラ率にかかわらず非キメラマウスと比較して平均11.04倍の血小板数の増加が認められた。キメラマウス群では白血球数も同様に平均2.03倍の増加が認められたが、赤血球数は逆に平均0.76倍の減少が認められた。
従って、TPO遺伝子によってコードされる蛋白質は、血中の血小板数を調節する機能を持つと考えられた。この結果は、従来示されていたTPO遺伝子産物の機能(加藤ら、血液・腫瘍科、33:1−10、1996)と一致していた。すなわち、本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能解析に有用であることが示された。
〔実施例6〕TPOノックインES細胞由来キメラマウスからのTPO産生ハイブリドーマの取得
上記実施例5において血小板増加が観察されたキメラマウス個体TPO(113)(キメラ率70%)から生後10週目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの作製法は、確立されている方法(安東、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク、1991)に従い、ミエローマ細胞としてはSP2/0(RIKEN GENE BANK,RCB0209)を使用した。作製したハイブリドーマを96穴プレート3枚にまき、10日間培養後、培養上清をELISA法で解析した。ELISA法はNishiyamaらの報告(Thromb Haemost 85:152−159,2001)に記載された通り実施した。まず抗マウスTPOウサギIgG抗体を4℃にて一晩インキュベーションすることによりマイクロタイタープレート(Sumilon、日本国住友ベークライト)に固定化した後、洗浄した。次にハイブリドーマ上清をプレートに加え、4℃にて一晩インキュベーション後、洗浄した。マウスTPOは、最終的にはビオチン化抗マウスTPOトリIgG抗体、アルカリフォスファターゼラベルされたストレプトアビジン、およびLumigenPPD(日本国Wako)により検出した。その結果、HAT耐性ハイブリドーマの存在するウェルのうち約15%においてマウスTPOの発現が検出された。さらに、ELISA法によりIgκ鎖の発現を検討したところ、HAT耐性ウェルのうち約25%がIgκ鎖陽性であり、Igκ陽性ウェル中約60%がマウスTPO陽性であった。クローニングされたTPO陽性ハイブリドーマ上清におけるTPO濃度を、前述したELISA法により定量したところ、約10ng/mlであった。
〔実施例7〕TPOノックインES細胞由来キメラマウスからのTPOノックイン免疫グロブリンκ鎖遺伝子座の子孫伝達
上記実施例4で作製されたTPOノックインES細胞株#11由来キメラマウスのうち、100%のキメラ率を示しかつ雌である個体TPO(108)について、雄MCH(ICR)系統マウス(日本国日本クレア社)との交配によりES細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。この交配において、MCH(ICR)雄マウス(アルビノ、劣性)由来の精子と受精した、キメラマウス中のTT2F細胞(野生色、優性)由来の卵子からは野生色の仔マウスが、キメラマウス中のMCH(ICR)由来の卵子からは白色の仔マウスが誕生する。この交配によって得られた仔マウス計7匹の全てがES細胞由来の毛色である野生色を示し、TPOノックインES細胞の効率的な生殖系列への伝達が示された。3週齢の野生色仔マウス7匹について、上記実施例5と同様に血小板数の測定を行ったところ、7匹中3匹(43%)で血小板数の顕著な増加(5×106/μl以上)が観察された。ES細胞においては片側の免疫グロブリン遺伝子座にのみTPO−cDNAが挿入されており、野生色マウス中挿入されたTPO遺伝子を保持する確率は50%と推測される。上記の結果はこの推測とほぼ一致し、導入されたTPO遺伝子の子孫伝達が示された。以上の結果は、本明細書に記載の方法により所望の分泌蛋白質を本来発現される部位とは異なる細胞、組織において発現するマウス系統を確立できることを示している。
〔実施例8〕pKIκへのヒトCD20遺伝子の挿入
(1)pKIκ導入用ヒトCD20遺伝子の調製
ヒトCD20遺伝子配列(Genbank,M27394)より以下のDNAを合成した。
ヒトCD20遺伝子の増幅は、Quick Clone cDNA,human spleen(米国クローンテック社)を鋳型として、上記実施例2と同様に実施した。PCR反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動にかけてPCR増幅断片を分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用いて目的のDNA断片を回収した。得られたDNA断片をXhoIで37℃にて3時間処理後、QIAquick PCR Purification Kit(ドイツQIAGEN)で回収した。
pBluescript II SK(−)(日本国東洋紡)をXhoI処理後にCIAP(日本国宝酒造)処理して得られたpBlueXhoICIAPプラスミド42ng、上述のとおりXhoI処理して得られたPCR増幅断片108ngおよびDNA Ligation Kit Ver.2,Solution I(日本国宝酒造)10μLを混合し、16℃にて30分間インキュベーション後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドDNA(pBlueCD20)を調製し、塩基配列を確認した。pBlueCD20 9.6μgをXhoIで37℃にて4時間消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてCD20断片をQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用いて回収した。回収したCD20断片を再度0.8%アガロースゲルにて分離回収することでpKIκ導入用ヒトCD20遺伝子を調製した。
(2)ヒトCD20遺伝子導入ノックインベクターの調製
実施例1で調製したpKIκ21μgをSalIで37℃にて4時間消化後、エタノール沈殿でベクターを回収した。回収されたベクターを10μLのTEに溶解後、CIAP(日本国宝酒造)を用いて末端脱リン酸化したpKIκ−SalI−CIAPを調製した。
上記KI−SalI−CIAP 40ng、上記(1)で調製したノックインベクター導入用ヒトCD20遺伝子4ng、およびDNA Ligation Kit Ver.2,Solution I(日本国宝酒造)1.8μLを混合し、16℃にて18時間インキュベーション後、大腸菌XL10−Gold Ultracompetent Cells(日本国東洋紡)に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認後、QIAfilter Plasmid Kit(ドイツQIAGEN)を用いてヒトCD20遺伝子導入ノックインベクターを調製した。
(3)Electroporation用ヒトCD20遺伝子導入ノックインベクターの調製
(2)で調製したヒトCD20遺伝子導入ノックインベクター150μgを、スペルミジン添加(1mM,pH.7.0,米国シグマ)バッファー(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Hバッファー)およびスペルミジン無添加バッファー(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Hバッファー)を用いてそれぞれXhoI消化(37℃、6.5時間)し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100%エタノールおよび0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、−20℃で16時間保存した。XhoIで線状化されたベクターを遠心して回収後、70%エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70%エタノールを除き、1時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え1時間室温で保存し、Electroporation用ヒトCD20遺伝子導入ノックインベクターの調製を行った。
〔実施例9〕ヒトCD20ノックインES細胞株の取得
ヒトCD20−cDNAが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスES細胞株取得のため、上記実施例8で調製したヒトCD20ノックインベクター2種(スペルミジン添加および無添加)をそれぞれ、確立されている方法(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)に従って、マウスES細胞TT2F(Yagiら、Analytical Biochem.,214:70,1993)へ導入した。TT2Fの培養法は、記載された方法(相沢慎一、前記)に従い、栄養細胞はマイトマイシンC(米国シグマ)処理したG418耐性初代培養細胞(日本国インビトロジェン社より購入)を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個/mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット(電極距離:0.4cm、米国バイオラッド)にてエレクトロポレーションを行った(容量:960μF、電圧:240V、室温)。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン、米国ベクトン.ディッキンソン)1枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン(米国シグマ)を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーのうち、計80個(スペルミジン無添加)および56個(スペルミジン添加)をピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地(ES培地+10%DMSO、米国シグマ)に懸濁し、−80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して、106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits(米国Gentra System社)により調製した。これらのGピューロマイシン耐性TT2F細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI(日本国宝酒造)で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、上記実施例3に示したプローブで相同組換え体を検出した。その結果、スペルミジン無添加では80株中0株(0%)、スペルミジン添加の場合には56株中5株(9%)が相同組換え体であるという結果を得た。
〔実施例10〕ノックインベクターへのヒトFGF23遺伝子の挿入
ヒトFGF23(繊維芽細胞増殖因子23)遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
ヒトFGF23 cDNAの増幅はShimadaらの報告(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:6500−6505,2000)に記載された、全長FGF23 cDNAを含むpcDNAベクターを鋳型として、上記実施例2と同様に実施した。PCR反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動にかけてPCR増幅断片を分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用いて目的のDNA断片を回収した。得られたDNA断片をXhoIで37℃にて3時間処理後、QIAquick PCR Purification Kit(ドイツQIAGEN)で回収した。pBluescript II SK(−)(日本国東洋紡)をXhoI処理後にCIAP(日本国宝酒造)処理して得られたpBlueXhoICIAPプラスミド42ng、上述のようにXhoI処理して得られたFGF23 cDNA PCR増幅断片108ngおよびDNA Ligation Kit Ver.2,Solution I(日本国宝酒造)10μLを混合し、16℃にて30分間インキュベーション後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドDNA(pBlueFGF23)を調製し、塩基配列を確認した。pBlueFGF23 9.6μgをXhoIで37℃にて4時間消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてFGF23断片をQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用いて回収した。回収したFGF23断片を再度0.8%アガロースゲルにて分離回収することでpKIκ導入用ヒトFGF23遺伝子を調製した。
末端脱リン酸化したベクターpKIκ−SalI−CIAP(実施例2)40ng、上記ノックインベクター導入用ヒトFGF23遺伝子4ng、およびDNA Ligation Kit Ver.2,Solution I(日本国宝酒造)1.8μLを混合し、16℃にて18時間インキュベーション後、大腸菌XL10−Gold Ultracompetent Cells(日本国東洋紡)に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認後、QIAfilter Plasmid Kit(ドイツQIAGEN)を用いてヒトFGF23遺伝子導入ノックインベクターを調製した。ヒトFGF23遺伝子導入ノックインベクター150μgを、スペルミジン添加(1mM,pH.7.0,米国シグマ)バッファー(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Hバッファー)およびスペルミジン無添加バッファー(前記)を用いてそれぞれXhoI消化(37℃、6.5時間)し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100%エタノールおよび0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、−20℃で16時間保存した。XhoIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70%エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70%エタノールを除き、1時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、1時間室温で保存し、Electroporation用ヒトFGF23遺伝子導入ノックインベクターの調製を行った。
〔実施例11〕FGF23ノックインES細胞株の取得
ヒトFGF23−cDNAが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスES細胞株を取得するため、上記実施例10で調製したElectroporation用ヒトFGF23ノックインベクター2種(スペルミジン添加および無添加)をそれぞれ、確立されている方法(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)に従ってマウスES細胞TT2F(Yagiら、Analytical Biochem.,214:70,1993)へ導入した。TT2Fの培養法は、記載された方法(相沢慎一、前記)に従い、栄養細胞はマイトマイシンC(米国シグマ)処理したG418耐性初代培養細胞(日本国インビトロジェン社より購入)を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個/mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット(電極距離:0.4cm、米国バイオラッド)にてエレクトロポレーションを行った(容量:960μF、電圧:240V、室温)。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン、米国ベクトン.ディッキンソン)1枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン(米国シグマ)を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーのうち、計80個(スペルミジン無添加)および56個(スペルミジン添加)をピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地(ES培地+10%DMSO、米国シグマ)に懸濁し、−80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits(米国Gentra System社)により調製した。これらのピューロマイシン耐性TT2F細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI(日本国宝酒造)で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、上記実施例3に示したプローブで相同組換え体を検出した。その結果、スペルミジン無添加では80株中0株(0%)、スペルミジン添加の場合40株中3株(8%)が相同組換え体であるという結果を得た。以上の結果は、ベクターDNA調製時のスペルミジン添加が、ランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を上昇させる効果を持つことを示している。
〔実施例12〕Cκ鎖ノックアウトベクターpΔCκNeoの作製
pSTneoB(Katohら、Cell Struct.Funct.,12:575,1987;Japanese Collection of Research Biologicals(JCRB),Deposit Number:VE039)を制限酵素XhoIおよびSca Iで消化し、neo耐性遺伝子を含む断片を0.8%アガロースゲル電気泳動にて分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いて目的の断片を回収してneo断片とした。前記実施例1の(2)で作製したpΔCκSalをSalIで消化した後、大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、前記neo断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認してプラスミドpΔCκNeoを取得した。pΔCκNeoの構造を図2に示す。
〔実施例13〕ESΔΔκneo細胞株の取得
前記実施例2および実施例3に記載された方法と同様にして、pΔCκNeoベクター(実施例12)により内因性Igκ遺伝子の片側のアレルが破壊されたマウスES(TT2F)細胞を取得した。pΔCκNeoベクター内のIgκゲノム相同領域はC57BL/6系統に由来するので、TT2F細胞(C57BL/6とCBA系統のF1由来)においては、同ベクターがC57BL/6アレルに優先的に挿入される。このES細胞株(ESΔκneo)について、WO 00/10383号パンフレット(実施例76参照)に記載された抗体軽鎖ターゲティングベクターおよび同パンフレットに記載された方法を用いて、さらにもう一方(CBA)の内因性Igκ遺伝子アレルが破壊されたマウスES細胞(ESΔΔκneo/puro)を取得した。ESΔΔκneo/puro株について、さらにWO 00/10383号パンフレットに記載された方法(実施例78参照)に従ってpuro遺伝子のCre組換え酵素による除去を行った。最終的に得られるG418耐性、ピューロマイシン感受性かつ内因性のIgκ遺伝子が両アレルとも破壊されたES細胞株(ESΔΔκneo)を得た。前記実施例3に記載されたノックインES細胞株の取得において、TT2F細胞株の代わりにESΔΔκneoを用いてES細胞株を取得した。ノックインベクター内のIgκゲノム相同領域はC57BL/6系統に由来するので、得られる相同組換え体において、同ベクターはG418耐性遺伝子の存在するC57BL/6アレルにおいてG418耐性遺伝子と優先的に置換される。よって相同組換え体をG418感受性によって簡便にスクリーニングすることができた。また、得られる相同組換え体においては内因性Igκ遺伝子CBAアレルが既に破壊されているため、ノックインベクターにより外来遺伝子が挿入されたC57BL/6アレルのIgκ遺伝子が独占的に発現した。
〔実施例14〕I型ノックインベクターpKI−I−1およびpKI−I−2の作製
(1)クローニング部位近傍断片の作製
マウス免疫グロブリンカッパ鎖(Igκ)遺伝子の終止コドン部分とポリアデニレーションシグナル(PolyAシグナル)の間にSV40 PolyAシグナル、Igκプロモーター領域1ないし2および目的遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列マルチクローニング部位(MCS)を導入し、polyAシグナル下流にピューロマイシン耐性遺伝子を導入したDNA断片を作製した。以下にその方法を具体的に示す。
(1.1)クローニング部位上流の断片1の調製
GenBank(米国NCBI)より取得したSV40 polyAシグナル領域配列より以下のDNAを合成した。
5’側プライマーであるSVpoly5の末端にはEcoRI認識配列を、3’側プライマーであるSVpoly3の末端にはHindIII認識配列を付加した。Takara LA−Taq(日本国宝酒造)の添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてpSTneoBを10ng添加し、94℃で1分保温したのち、94℃30秒および68℃30秒を1サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール/クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿した後、EcoRIおよびHindIIIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離した。その後、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いて目的の断片を回収し増幅断片1とした。
(1.2)クローニング部位上流の断片2および3の調製
GenBank(米国NCBI)より取得したマウスIgκプロモーター領域遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
5’側プライマーであるCκprom1−5およびCκprom2−5にはHindIII認識配列を、3’側プライマーであるCκprom1−3およびCκprom2−3にはXbaI認識配列を付加した。マウスゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(Cκprom1−5、Cκprom1−3)、およびプライマーセット(Cκprom2−5、Cκprom2−3)を用いてTakara LA−Taq(日本国宝酒造)により増幅されたDNA断片2および3を取得した。
(1.3)マルチクローニング部位断片4の調製
XbaI,SalI,NotI,FseI,AscIおよびSpeIを含むようなマルチクローニング部位断片を調製するため以下のDNA断片を合成した。
上記2種のDNA断片をアニーリングして、DNA断片4とした。
(1.4)クローニング部位下流断片5の調製
GenBank(米国NCBI)より取得したマウスIgκ遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
5’側プライマーであるCκpolyP5の末端にはSpeI認識配列を、3’側プライマーであるCκpolyP3の末端にはBglII認識配列を付加した。マウスゲノムDNAを鋳型として、上記プライマーCκpolyP5およびCκpolyP3を用いてTakara LA−Taq(日本国宝酒造)により増幅されたDNA断片5を取得した。
(1.5)DNA断片1,2,4,5ないし1,3,4,5を含むDNA断片IないしIIの調製
上記各DNA断片の5’および3’側に付加した認識配列を切断する制限酵素で処理した後、フェノール/クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿したサンプルをTEに溶解した。DNA断片1,2,4,5ないし1,3,4,5を制限酵素処理した断片をLigation反応でそれぞれ結合した後、エタノール沈殿で回収し、DNA断片IないしIIを調製した。
(2)I型ノックインベクターpKI−I−1およびpKI−I−2の作製
(2.1)pIgCκΔIRESプラスミドの作製
前記実施例1に記載したpIgCκABP IRESを、制限酵素EcoRIおよびBglIIで処理し、loxP−ピューロマイシン耐性遺伝子断片がBglIIによって切断されていないDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離回収し、プラスミドpIgCκΔIRES断片を取得した。
(2.2)pIgCκΔIRES ProIないしpIgCκΔIRES ProIIの作製
pIgCκΔIRESにDNA断片Iを挿入してpIgCκΔIRES ProIを調製し、pIgCκΔIRESにDNA断片IIを挿入してpIgCκΔIRES ProIIを調製した。
(2.3)I型ノックインベクターpKI−I−1およびpKI−I−2の作製
pIgCκΔIRES ProIおよびpIgCκΔIRES ProIIを制限酵素XhoIで処理し、マルチクローニング部位を含むDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離回収し、得られたDNA断片を、pΔCκSal(実施例1)をSalIで消化した後大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認してプラスミドpKI−I−1およびpKI−I−2を取得した。pKI−I−1およびpKI−I−2の構造を図3および図4に示す。ベクター構造の概略は以下のとおりである。
すなわち、5’側から、J断片下流に存在するエンハンサー配列およびIgκ軽鎖C領域を含むマウスIgκゲノムDNA(EcoRI〜EcoRI、約5.3Kb)、SV40ポリAシグナル領域(約0.4Kb)、マウスIgκプロモーター1(pKI−I−1の場合。pKI−I−2ではマウスIgκプロモーター2)を含む領域(約0.2Kb)、マルチプルクローニングサイト(MCS)を含む領域(約0.02Kb)、マウスCκポリAシグナル領域(約0.4Kb)、ピューロマイシン耐性遺伝子カセット(約1.8Kb)、マウスCκポリAシグナル領域の下流に位置するマウスIgκゲノムDNA(約7.7Kb)、ジフテリアトキシンA(DT−A)遺伝子カセット(約1.0Kb)、pUC18 DNA(約2.7Kb)で構成される。上記ノックインベクターについて、前記実施例2以降の操作を同様に行うことにより、ノックインES細胞を作製する。ノックインES細胞では、マウスIgκのCκ構造遺伝子の終止コドン直下の位置にSV40ポリAシグナル領域が配置され、さらにその直下の位置にマウスIgκプロモーター1(または2)および所望の構造遺伝子が配置され、さらにその直下の位置にマウスCκポリAシグナル領域が配置される。マウスIgκプロモーター直下の位置に構造遺伝子が配置されることから、IRESを用いたベクターpKIκの場合と同等ないしそれ以上の、所望の遺伝子の高発現が予想される(Mizuguchiら、Molecular Therapy Vol.1,No.4,2000,376−382.)。以上により得られるノックインベクターを前記実施例1のpKIκの代わりに使用して前記実施例2以降の操作を同様に行うことにより、ノックインES細胞を作製した。
〔実施例15〕II型ノックインベクターpKI−II−1およびpKI−II−2の作製
(1)クローニング部位近傍断片の作製
マウス免疫グロブリンカッパ鎖(Igκ)遺伝子の終止コドン部分とCκポリアデニレーションシグナル(PolyAシグナル)の間にCκPolyAシグナル、Cκプロモーター領域1ないし2および目的遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列マルチクローニング部位(MCS)を導入し、CκpolyAシグナル下流にピューロマイシン耐性遺伝子を導入したゲノム断片を作製した。以下にその方法を具体的に示す。
(1.1)クローニング部位上流の断片6の調製
GenBank(米国NCBI)より取得したCκpolyAシグナル領域配列より以下のDNAを合成した。
5’側プライマーであるCκpolyT5の末端にはEcoRI認識配列を、3’側プライマーであるCκpolyT3の末端にはHindIII認識配列を付加した。Takara LA−Taq(日本国宝酒造)の添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてマウスゲノムDNAを10ng添加し、94℃で1分保温したのち、94℃30秒および68℃30秒を1サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール/クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿した。その後、EcoRIおよびHindIIIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離した後、ジーンクリーンII(米国Bio101)を用いて目的の断片を回収して増幅断片6とした。
(1.2)DNA断片6,2,4,5ないし6,3,4,5を含むDNA断片IIIないしIVの調製
上記各DNA断片の5’および3’側に付加した認識配列をおのおの切断する制限酵素で処理した後、フェノール/クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿したサンプルをTEに溶解した。DNA断片6,2,4,5ないし6,3,4,5を制限酵素処理した断片をLigation反応でそれぞれ結合した後、エタノール沈殿で回収し、DNA断片IIIないしIVを調製した。
(2)IIノックインベクターpKI−II−1およびpKI−II−2の作製 (2.1)pIgCκΔIRES ProIIIないしpIgCκΔIRES ProIVの作製
pIgCκΔIRESにDNA断片IIIを挿入してpIgCκΔIRES ProIIIを調製し、pIgCκΔIRESにDNA断片IVを挿入してpIgCκΔIRES ProIVを調製した。
(2.2)II型ノックインベクターpKI−II−1およびpKII−I−2の作製
pIgCκΔIRES ProIIIおよびpIgCκΔIRES ProIVを制限酵素XhoIで処理し、マルチクローニング部位を含むDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離回収した。得られたDNA断片を、pCκSalをSalIで消化した後大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入し、これを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認してプラスミドpKI−II−1およびpKI−II−2を取得した。pKI−II−1およびpKI−II−2の構造を図5および図6に示す。ベクター構造の概略は以下のとおりである。
すなわち、5’側から、J断片下流に存在するエンハンサー配列およびIgκ軽鎖C領域を含むマウスIgκゲノムDNA(EcoRI〜EcoRI、約5.3Kb)、マウスCκポリAを含む領域(約0.4Kb)、マウスIgκプロモーター1(pKI−II−1の場合。pKI−II−2ではマウスIgκプロモーター2)を含む領域(約0.2Kb)、マルチプルクローニングサイト(MCS)を含む領域(約0.02Kb)、マウスCκポリAを含む領域(約0.4Kb)、ピューロマイシン耐性遺伝子カセット(約1.8Kb)、マウスCκポリAの下流であるマウスIgκゲノムDNA(約7.7Kb)、ジフテリアトキシンA(DT−A)遺伝子カセット(約1.0Kb)、pUC18 DNA(約2.7Kb)で構成される。上記ノックインベクターについて、前記実施例2以降の操作を同様に行うことにより、ノックインES細胞を作製する。ノックインES細胞では、マウスIgκのCκ構造遺伝子の終止コドン直下の位置にマウスCκポリAシグナル領域が配置され、さらにその直下の位置にマウスIgκプロモーター1(または2)および所望の構造遺伝子が配置され、さらにその直下の位置にマウスCκポリAシグナル領域が配置される。マウスIgκプロモーター直下の位置に構造遺伝子が配置されることから、IRESを用いたベクターpKIκの場合と同等ないしそれ以上の、所望の遺伝子の高発現が予想される(Mizuguchiら、Molecular Therapy Vol.1,No.4,2000,376−382.)。以上により得られるノックインベクターを前記実施例1のpKIκの代わりに使用して前記実施例2以降の操作を同様に行うことにより、ノックインES細胞を作製した。
〔実施例16〕ミオグロビン遺伝子の制御配列を利用した外来遺伝子の筋肉組織における高発現
ミオグロビンは筋肉中に多量に存在する酸素結合性のヘムタンパク質であり、その発現は骨格筋や心臓などの筋肉組織に限定されている(Tomizukaら、Nature Genet.16:133−43,1997)。前述したように、ミオグロビン遺伝子制御配列の制御下に発現させるべく配置された外来遺伝子を含むマウスES細胞を、筋肉組織形成能を欠損するマウス系統由来(例えばミオゲニン遺伝子欠損ホモ接合体、Nabeshimaら、Nature 364:532−5,1993)の胚に注入することにより、キメラ個体およびその子孫において当該外来遺伝子を高レベルで発現させることができる。
例えばコザック配列を開始コドンの直前に配置した目的遺伝子断片は、相同組換えによりミオグロビン遺伝子の開始コドンを含むエクソンに挿入することができる。この場合、当該遺伝子が挿入されたアレルのミオグロビン遺伝子は正常に発現しないが、ミオグロビン遺伝子ノックアウトマウスは正常である(Garryら、Nature,39:5905−8,1998)ので、同遺伝子の一方のアレルが発現しないことは、キメラマウス個体の表現型に影響を及ぼさないと考えられる。また、ミオグロビン遺伝子の終止コドンの下流3’非翻訳配列内に、前記実施例1と同様にしてIRES+コザック配列+目的遺伝子を挿入することができる。この場合、目的遺伝子が挿入されたアレルのミオグロビン遺伝子もまた発現することができる。
上記のごとく改変されたES細胞を、ミオゲニン遺伝子が破壊されたマウス系統(Nabeshimaら、前記)のヘテロ接合体同士の交配により得られる8細胞期胚に注入することによりキメラマウスを作製することができる。胚は、25%の確率でホモ接合体(すなわち、筋肉組織形成能を欠損する)であるので、誕生したキメラマウスの25%において、筋肉組織は主としてノックインES細胞に由来する。また、当該個体においてはノックインES細胞より分化した筋肉細胞において、ミオグロビン遺伝子制御配列のコントロールのもと外来遺伝子が高発現する。
〔実施例17〕マウスFGF23ノックアウトベクター作製
(1)マウスFGF23ゲノム領域断片の取得
GenBank(米国NCBI)より取得したマウスFGF23(繊維芽細胞増殖因子23)遺伝子配列より以下のDNA(プライマー)を合成した。
Takara EX Taq(日本国宝酒造)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中に上記プライマー各10pmolおよび鋳型としてマウスTT2F細胞由来のゲノムDNA25ngを添加し、94℃2分保温したのち、94℃30秒、60℃30秒、および72℃20秒を1サイクルとして35サイクル増幅した。得られた反応液から2%アガロースゲル電気泳動で173merのPCR増幅断片を回収した。切り出されたゲルよりQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収し、FGF23ゲノム領域を含むBACクローン選択に用いるプローブFGF23Pを取得した。
(2)マウスFGF23ゲノム領域を含むBACクローンの選択
高密度フィルター:BACマウスC57/BL6(日本国倉敷紡績)を用い、取得したFGF23PをプローブとしてFGF23ゲノム領域を含むBACクローンをスクリーニングした。その結果3個のヒットクローンを得た。3種のクローンそれぞれのクローンID/アドレスは17d5、235I6、および211K15であった。これらヒットクローン番号の情報からBACクローンを入手した。
入手したBACクローンが目的とするFGF23ゲノム領域を含むかどうかの確認を行なった。簡単に説明すると、Takara EX Taq(日本国宝酒造)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中にプライマーP51およびP31各10pmolならびに鋳型としてBACクローンDNA100ngを添加し、94℃2分保温したのち、94℃30秒、60℃30秒、および72℃20秒を1サイクルとして30サイクル増幅した。得られた反応液を2%アガロースゲル電気泳動にて解析したところ173merのバンドがクローン番号235I6および211K15を鋳型とした場合検出された。この結果から、クローン番号235I6および211K15のBACクローンは目的とするFGF23ゲノム領域を含んでいることが確認された。
(3)BACクローンのpBluescript II SK(−)へのサブクローニング
クローン番号211K15のBACクローン由来のDNA2.5μgにSau3AI(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)0.05Uを加え、37℃にて20分インキュベートし、0.8%ゲルで分離後、分子量約15〜7Kb部分を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってDNA断片を回収した。
BamHIで消化した後大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpBluescript II SK(−)(日本国東洋紡)に、上記回収されたDNA断片を挿入し、それを大腸菌MAX Efficiency STBL2 Competent Cells(日本国ライフテックオリエンタル株式会社)に導入した。プラスミドにDNA断片が導入されたクローンを、IPTG/X−gal添加プレートを用い選択し、白色コロニー100個を回収した。
(4)FGF23ゲノム領域を含むクローンの選択
Takara EX Taq(日本国宝酒造)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中にプライマーP51およびP31各10pmolならびに鋳型としてプラスミドDNA25ngを添加し、94℃2分保温したのち、94℃30秒、60℃30秒、および72℃20秒を1サイクルとして35サイクル増幅した。2%アガロースゲル電気泳動を用い173merの増幅断片が検出されるクローンを選択し、クローン番号33および94を取得した。
(5)FGF23エクソン1領域の5’上流約5Kbの領域および3’下流約2Kbの領域を含むクローンの選択
GenBank(米国NCBI)より取得したマウスFGF23遺伝子配列よりKO53およびKO35を、pBluescript II SK(−)の遺伝子配列よりKO55およびKO33を合成した。
KOD−Plus−(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中に、目的とする5’領域を選択する場合はプライマーKO55およびKO53各10pmol、または目的とする3’領域を選択する場合はプライマーKO35およびKO33各10pmolと、鋳型としてクローン番号33ないし94由来のプラスミドDNA25ngを添加し、94℃2分保温したのち、94℃15秒、65℃20秒、および68℃10分を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた増幅断片のサイズを0.8%アガロースゲルで解析した。クローン番号33由来のDNAを鋳型として用いた場合、5’領域を選択するプライマーセットで約5KbのPCR増幅断片を、3’領域を選択するプライマーセットで約2KbのPCR増幅断片を検出した。この結果から、クローン番号33のクローンに目的とするゲノム領域断片がサブクローニングされていることが判明した。
(6)制限酵素サイトを5’ゲノム相同領域の両端に持つPCR増幅断片5’KOの作製
クローン番号33由来のDNAを用いて、サブクローニングされたFGF23エクソン1の5’上流領域の両端それぞれ700bp程度の塩基配列を決定した。得られた情報を基にFGF23エクソン1の5’上流約5Kbを増幅し、かつその増幅断片の5’側にNotIサイト、3’側にFseIサイトを付加するPCRプライマーセットNotI55およびFseI53を設計した。
KOD−Plus−(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としてクローン番号33のプラスミドDNA25ngを添加し、94℃2分保温したのち、94℃15秒および68℃10分を1サイクルとして25サイクル増幅し、得られた約5Kbの増幅断片を0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたPCR増幅断片をNotIおよびFseIで酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
(7)制限酵素サイトを3’ゲノム相同領域の両端に持つPCR増幅断片3’KOの作製
クローン番号33由来のDNAを用いて、サブクローニングされたFGF23エクソン1の3’下流領域の両端それぞれ700bp程度の塩基配列を決定した。得られた情報を基にFGF23エクソン1の3’下流約1.8Kbを増幅し、かつその増幅断片の5’側にAscIサイト、3’側にXhoIサイトを付加するPCRプライマーセットAscI55およびXhoI53を設計した。
KOD−Plus−(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調整し、50μL反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としてクローン番号33のプラスミドDNA25ngを添加し、94℃2分保温したのち、94℃15秒および68℃10分を1サイクルとして25サイクル増幅し、得られた約1.8Kbの増幅断片を0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたPCR増幅断片をAscIおよびXhoIで酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
(8)カセットベクターpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−Aの作製 ベクターに新たな制限酵素サイトを付加するため以下のDNAを合成した。
pBluescript II SK(−)(日本国東洋紡)を制限酵素SalIおよびXhoIで処理した反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイトNruI、SgrAIおよびAscIを付加するため、LinkA1およびLinkA2を合成した。この2つのオリゴDNAからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAを取得した。
続いて、PBlueLAを制限酵素NotIおよびEcoRIで処理した反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイトPacI、FseIおよびSalIを付加するため、LinkB1およびLinkB2を合成した。この2つのオリゴDNAからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLABを取得した。
WO 00/10383号パンフレット(前掲)に記載されたpLoxP−STneoプラスミドをXhoI消化し、両端にLoxP配列を持つNeo耐性遺伝子(LoxP−Neo)を取得した。LoxP−Neoの両末端をT4DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、LoxP−Neo−Bを取得した。
上記pBlueLABをEcoRV消化後、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、LoxP−Neo−Bを挿入した後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB−LoxP−Neoを取得した。
pMC1DT−A(日本国ライフテックオリエンタル株式会社)をXhoIおよびSalI消化後、0.8%アガロースゲルにアプライし、約1Kbのバンドを分離回収し、QIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってDT−Aフラグメントを回収した。
pBlueLAB−LoxP−NeoをXhoI消化後、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、DT−Aフラグメントを挿入した後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、ノックアウトベクター作製に用いられるカセットベクターpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−Aを取得した。
(9)FGF23ノックアウトベクターの取得
pBlueLAB−LoxP−Neo−DT−AをAscIおよびXhoIで消化後、得られる約7.3KbのDNA断片を0.8%アガロースゲルより分離精製した後に大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、(7)で作製したゲノム断片3’KOを挿入した後、大腸菌MAX Efficiency STBL2 Competent Cells(日本国ライフテックオリエンタル株式会社)に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、挿入したPCR増幅断片部分の塩基配列とクローン番号33を用いて得られた塩基配列情報とを比較し、PCR増幅による増幅エラーが含まれていないこと、および、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KOを取得した。
pBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KOをNotIおよびFseIで消化後、得られる約9.1KbのDNA断片を0.8%アガロースゲルより分離精製した後に大腸菌アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、(6)で作製したゲノム断片5’KOを挿入し、それを大腸菌MAX Efficiency STBL4 Competent Cells(日本国ライフテックオリエンタル株式会社)に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、挿入したPCR増幅断片部分の塩基配列とクローン番号33を用いて得られた塩基配列情報約3Kbの領域とを比較し、その範囲においてPCR増幅による増幅エラーが含まれていないこと、および、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KO−5’KOを取得した。マウスFGF23ノックアウトベクター:pBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KO−5’KOの構造を図7に示す。
(10)Electroporation用FGF23ノックアウトベクターの調製
pBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KO−5’KO150μgを、スペルミジン添加(1mM pH7.0米国シグマ)バッファー(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Hバッファー)を用い、NotIないしはXhoIを用いて37℃で5時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100%エタノール、および0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、−20℃で16時間保存した。NotIないしはXhoIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70%エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70%エタノールを除き、1時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、1時間室温で保存し、Electroporation用FGF23ノックアウトベクターFGF−KO−NotIおよびFGF−KO−XhoIの調製を行なった。FGF−KO−NotIおよびFGF−KO−XhoIはそれぞれ図7においてNot−IおよびXhoIで示す末端を有することとなる。
(11)ゲノムサザン解析用プローブの調製
クローン番号33由来DNAを用いた塩基配列情報を基に、3’KOの直下領域525merを含むオリゴDNAを取得するため以下のDNAを合成した。
Takara EX Taq(日本国宝酒造)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としてクローン番号211K15のBAC由来DNA25ngを添加し、94℃2分保温したのち、94℃30秒、60℃30秒、および72℃1分を1サイクルとして33サイクル増幅し、得られた544merの増幅断片を0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって3’側ゲノムサザン用プローブ、3’KO−probを回収した。
〔実施例18〕FGF23ノックアウトES細胞株の取得
相同組換えにより、マウスFGF23ノックアウトES細胞株取得のため、実施例17において作製したpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KO−5’KOを制限酵素NotIないしはXhoI(日本国宝酒造)で線状化し、確立されている方法(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)に従ってマウスES細胞TT2F(Yagiら、Analytical Biochem.,214:70,1993)へ導入した。
TT2Fの培養法は、記載の方法(相沢慎一、前記)に従い、栄養細胞はマイトマイシンC(米国シグマ)処理したG418耐性初代培養細胞(日本国インビトロジェン社より購入)を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個/mlとなるようにHBSに懸濁した。その後、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット(電極距離:0.4cm、米国バイオラッド)にてエレクトロポレーションを行った(容量:960μF、電圧:240V、室温)。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン、米国ベクトン.ディッキンソン)1枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン(米国シグマ)を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地(ES培地+10%DMSO、米国シグマ)に懸濁し、−80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits(米国Gentra System社)により調製した。これらのGピューロマイシン耐性TT2F細胞ゲノムDNAを制限酵素HindIII(日本国宝酒造)で消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ノックアウトベクター3’相同領域の直下流領域に位置するDNA断片(3’KO−prob、実施例17の(1)参照)をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2F細胞ではHindIII消化により、2本のバンド(約6Kbおよび約4.5Kb)が検出された。相同組換え体においては約6Kbバンドが消失して代わりに約2.5Kbの新たなバンドが出ることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約2.5Kbの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルのFGF23遺伝子開始コドン領域(開始メチオニンに対応するATGのAの位置を+1とし、その1塩基上流を−1とした場合−142から+59の範囲)にネオマイシン耐性遺伝子(両端にはノックアウトベクター由来の制限酵素サイト部位を含む)が挿入されたものである。サザン解析の結果、pBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KO−5’KOを制限酵素NotIで線状化した場合には90株中16株(18%)が相同組換え体であるという結果を、またpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KO−5’KOを制限酵素XhoIで線状化した場合には28株中1株(3.6%)が相同組換え体であるという結果を得た。これらの結果はターゲッティングベクターを線状化する場合、ネガティブセレクションマーカー遺伝子DT−Aがベクター構造の末端に位置していない場合のほうが、末端に位置する場合に比べ相同組換えに有利であることを示している(図7も参照されたい)。上記と同様のベクター構造をもち、それぞれ異なる遺伝子に対するノックアウトベクター6種を用いた場合においても、平均22.3%という通常報告されている相同組換え効率(数%程度)よりも高い相同組換え効率が得られた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明により、従来法と比較して効率よく確実に所望の蛋白質を高発現するキメラ非ヒト動物(たとえばキメラマウス)を得ることができる。本発明では、導入した所望の蛋白質をコードする遺伝子が発現される細胞および/または組織が欠損した胚を宿主胚として使用するため、作製されるキメラ非ヒト動物における該細胞および/または組織は全て、導入した核酸配列(構造遺伝子)を含む分化多能性を有する細胞に由来するものであり、その結果、高効率で所望蛋白質を発現させることができる。本発明では、好ましくは免疫グロブリン軽鎖、特に好ましくはκ鎖、の発現系を利用するものであるが、このIgκ遺伝座における相同組換え率は5%以上であり、従来法と比べて高い効率である。これによって、本発明は、所望の蛋白質をコードする遺伝子の高発現による該蛋白質の生産、あるいは、機能未知の遺伝子または蛋白質の生体内機能解析のために使用することができる。
配列フリーテキスト
配列番号1〜6:合成オリゴヌクレオチド
配列番号7および8:SalI認識配列
配列番号9〜20:合成オリゴヌクレオチド
配列番号21および22:マルチクローニング部位
配列番号23〜26:合成オリゴヌクレオチド
配列番号29:合成オリゴヌクレオチド
配列番号32〜40:合成オリゴヌクレオチド
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、ノックイン基本ベクターpKIκの構造を示す。Cκ:マウスIgκ遺伝子、IRES:インターナルリボゾーマルエントリーサイト、SalI:クローニング部位、Cκ polyA:マウスIgκ polyAシグナル、Puror:ピューロマイシン耐性遺伝子、DT−A:ジフテリアトキシンA鎖遺伝子、およびPUC18:クローニングベクター。
図2は、プラスミドpΔCκNeoの構造を示す。pSTneoB:ネオマイシン耐性遺伝子、DT−A:ジフテリアトキシンA鎖遺伝子、およびpUC18:クローニングベクター。
図3は、ノックインベクターpKI−I−1の構造を示す。Promoter1:マウスIgκプロモーター領域遺伝子1、MCS:マルチクローニング部位、Cκ:マウスIgκ遺伝子、SV40 polyA:SV40 PolyAシグナル、Cκ polyA:マウスIgκ polyAシグナル、Puro:ピューロマイシン耐性遺伝子、DT−A:ジフテリアトキシンA鎖遺伝子、およびpUC18:クローニングベクター。
図4は、ノックインベクターpKI−I−2の構造を示す。Promoter2:マウスIgκプロモーター領域遺伝子2、MCS:マルチクローニング部位、Cκ:マウスIgκ遺伝子、SV40 polyA:SV40 PolyAシグナル、Cκ polyA:マウスIgκ polyAシグナル、Puro:ピューロマイシン耐性遺伝子、DT−A:ジフテリアトキシンA鎖遺伝子、およびpUC18:クローニングベクター。
図5は、ノックインベクターpKI−II−1の構造を示す。Promoter1:マウスIgκプロモーター領域遺伝子1、MCS:マルチクローニング部位、Cκ:マウスIgκ遺伝子、Cκ polyA:マウスIgκ polyAシグナル、Puro:ピューロマイシン耐性遺伝子、DT−A:ジフテリアトキシンA鎖遺伝子、およびpUC18:クローニングベクター。
図6は、ノックインベクターpKI−II−2の構造を示す。Promoter2:マウスIgκプロモーター領域遺伝子2、MCS:マルチクローニング部位、Cκ:マウスIgκ遺伝子、Cκ polyA:マウスIgκ polyAシグナル、Puro:ピューロマイシン耐性遺伝子、DT−A:ジフテリアトキシンA鎖遺伝子、およびpUC18:クローニングベクター。
図7は、マウスFGF23ノックアウト用ベクターpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A−3’KO−5’KOの構造を示す。5’KO:FGF23ノックアウトベクター5’相同領域、Neor:ネオマイシン耐性遺伝子、EX1:FGF23エクソン1部分領域(+60〜+211)、3’KO:FGF23ノックアウトベクター3’相同領域、DT−A:ジフテリアトキシンA鎖遺伝子、およびpBluescript:クローニングベクター。
Claims (20)
- キメラ非ヒト動物の作製方法であって、
1)少なくともBリンパ球細胞において発現する免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する工程であって、前記核酸配列が、前記免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域との間に配置されている、前記工程、
2)前記Bリンパ球細胞が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚に、前記工程1で作製した分化多能性を有する細胞を注入してキメラ胚を得る工程、
3)前記工程2で得たキメラ胚を同種の仮親非ヒト動物に移植する工程、ならびに
4)前記工程3で移植した後得られた仔動物の中から、少なくとも前記Bリンパ球細胞において所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程、
を含むものである、前記方法。 - 前記免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子が、免疫グロブリン軽鎖遺伝子である、請求項1記載の方法。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子である、請求項2記載の方法。
- 前記制御領域が、プロモーター配列を含むものである、請求項1記載の方法。
- 前記プロモーター配列が、前記免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子に由来するものである、請求項4記載の方法。
- 前記分化多能性を有する細胞が、少なくともBリンパ球細胞において発現する免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムと、前記Bリンパ球細胞において発現する免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子の対立遺伝子が不活性化されているゲノムの両方を含むものである、請求項1記載の方法。
- 前記分化多能性を有する細胞が胚性幹細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記キメラ非ヒト動物が、マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラ非ヒト動物がマウスである、請求項8記載の方法。
- Bリンパ球細胞において発現する免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損したBリンパ球細胞との組み合わせが、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子とBリンパ球細胞である、請求項1記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法により作製されたキメラ非ヒト動物から交配によって所望の蛋白質を発現することができるその子孫を得ることを含む、所望の蛋白質を発現する非ヒト動物の作製方法。
- 少なくともBリンパ球細胞において発現する免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞と、前記Bリンパ球細胞が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚とに由来するキメラ非ヒト動物であって、前記核酸配列が、前記免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子の終止コドンとポリAシグナル領域との間に配置されており、かつ、少なくとも前記Bリンパ球細胞において前記所望の蛋白質を発現することができることを特徴とする、前記キメラ非ヒト動物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法によって作製されたものである、請求項12記載のキメラ非ヒト動物。
- 前記分化多能性を有する細胞が胚性幹細胞である、請求項12または13記載のキメラ非ヒト動物。
- マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである、請求項12〜14のいずれか1項に記載のキメラ非ヒト動物。
- マウスである、請求項15記載のキメラ非ヒト動物。
- Bリンパ球細胞において発現する免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子と、非ヒト動物系統において欠損したBリンパ球細胞との組み合わせが、免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子とBリンパ球細胞である、請求項12〜16のいずれか1項に記載のキメラ非ヒト動物。
- 請求項12〜17のいずれか1項に記載のキメラ非ヒト動物、もしくは所望の蛋白質を発現することができる前記キメラ非ヒト動物の子孫の表現型を、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型非ヒト動物の表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を解析する方法。
- 前記終止コドンとポリAシグナル領域との間に、インターナルリボゾーマルエントリーサイトが存在しない、請求項1〜11、18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記終止コドンとポリAシグナル領域との間に、インターナルリボゾーマルエントリーサイトが存在しない、請求項12〜17のいずれか1項に記載のキメラ非ヒト動物。
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