JP6868250B2 - ヒト抗体産生非ヒト動物及びそれを用いたヒト抗体作製法 - Google Patents
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Description
(1)ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(以下、「hIGHK-MAC」という。)を含む非ヒト動物。
(2)ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(以下、「hIGHL-MAC」という。)を含む非ヒト動物。
(3)ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体(以下、「hIGHK-MAC」という。)及びヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(以下、「hIGHL-MAC」という。)を含む非ヒト動物。
(4)ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(以下、「hIGHKL-MAC」という。)を含む非ヒト動物。
(5)哺乳動物である、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の非ヒト動物。
(6)哺乳動物がげっ歯類である、上記(5)に記載の非ヒト動物。
(7)げっ歯類がマウス又はラットである、上記(6)に記載の非ヒト動物。
(8)非ヒト動物の少なくとも2つの内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている、上記(1)〜(7)のいずれかに記載の非ヒト動物。
(9)上記(1)記載の非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた同種の非ヒト動物を交配し、hIGHK-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている非ヒト動物を選択することを含む、ヒト抗体を産生することができる非ヒト動物の作製方法。
(10)上記(2)記載の非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた同種の非ヒト動物を交配し、hIGHL-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている非ヒト動物を選択することを含む、ヒト抗体を産生することができる非ヒト動物の作製方法。
(11)上記(1)記載の非ヒト動物と上記(2)記載の非ヒト動物を交配し、hIGHK-MAC及びhIGHL-MACを含む非ヒト動物を作製するステップ、作製された非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた同種の非ヒト動物を交配し、hIGHK-MAC及びhIGHL-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている非ヒト動物を選択することを含む、ヒト抗体を産生することができる非ヒト動物の作製方法。
(12)ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHK-MAC)を含み、かつヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHL-MAC)を含み、かつヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている非ヒト動物を交配し、hIGHK-MAC及びhIGHL-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている非ヒト動物を選択することを含む、ヒト抗体を産生することができる非ヒト動物の作製方法。
(13) 上記(4)記載の非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子がノックアウトされた同種の非ヒト動物を交配し、hIGHKL-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている非ヒト動物を選択することを含む、ヒト抗体を産生することができる非ヒト動物の作製方法。
(14) 上記(1)〜(8)のいずれかに記載の非ヒト動物に抗原物質を投与するステップ、該ヒト動物から該抗原物質と結合する産生されたヒト抗体を回収するステップを含む、ヒト抗体を製造する方法。
(15)抗原物質は、細胞、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである、上記(14)に記載の方法。
(16) 上記(1)〜(8)のいずれかに記載の非ヒト動物に抗原物質を投与するステップ、該非ヒト動物から脾臓細胞を取り出すステップ、該脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマを作製するステップ、該ハイブリドーマから該抗原物質と結合する抗体を回収するステップを含む、ヒトモノクローナル抗体を製造する方法。
(17)抗原物質は、細胞、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである、上記(16)に記載の方法。
(18)ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座と、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座及び/又はヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座とを含むマウス人工染色体ベクター。
1.ヒト抗体産生非ヒト動物
1.1 マウス人工染色体(MAC)
本明細書におけるマウス人工染色体(「マウス人工染色体ベクター」ともいう。)は、トップダウンアプローチで構築された人工染色体であり、マウス染色体から遺伝子領域を染色体改変により完全もしくはほぼ完全に削除して得られる天然セントロメアの他に、両末端にテロメア配列を含み、さらにDNA配列挿入部位等の外来エレメントを含むことができる、人工染色体ベクターであるそのようなベクターの作製例としては、本発明者らにより開発されたマウス人工染色体ベクターの作製手順が例示される(再表2011/083870号公報及び特許第5557217号)。
(a)マウス染色体を保持する細胞を得る工程、
(b)内在遺伝子(数)の大部分(99.5%〜100%、好ましくは100%)を含まないようにマウス染色体の長腕遠位を削除する工程、及び
(c)長腕近位に1つ以上のDNA配列挿入部位を挿入する工程
を含む方法によって作製することができる。ここで、工程(b)及び(c)の順序は逆であってもよい。
本発明の人工染色体ベクターを作製するには、まず、マウス染色体を保持する細胞を作製する。例えば、薬剤耐性遺伝子(例えば、blasticidin S registance gene(BSr))で標識されたマウス染色体を保持するマウス線維芽細胞であるmouse embryonic fibroblast(mChr11-BSr)とG418耐性遺伝子であるneo遺伝子を導入したマウスA9細胞(ATCC VA20110-2209)であるmouse A9(neo)と細胞融合し、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を保持するマウスA9雑種細胞であるmouse A9x mouse embryonic fibroblast(neo;mChr11-BSr)から、その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。マウス繊維芽細胞は、文献記載の方法に基づいて入手することが可能であり、例えば、マウス繊維芽細胞は日本クレアより入手可能なC57B6系統のマウスより樹立可能である。相同組換え率の高い細胞としては、例えば、ニワトリDT40細胞(Dieken et al., Nature Genetics,12:174-182,1996)を利用できる。さらにまた、上記移入は、公知の染色体移入法、例えば、微小核細胞融合法(Koi et al., Jpn. J. Cancer Res.,80:413-418,1973)によって行うことができる。
マウス由来の単一の染色体を保持する細胞において、該マウス染色体の長腕遠位を削除する。このとき、重要なことは、長腕上に存在する内在遺伝子の大部分を削除(又は、除去もしくは欠失)し、マウスセントロメアを保持する人工染色体を構築することである。これは長腕上に存在する全内在遺伝子(数)の少なくとも99.5%、好ましくは少なくとも99.7%、より好ましくは少なくとも99.8%、最も好ましくは99.9〜100%を削除(又は、除去もしくは欠失)するように切断位置を決定することである。そうすることによって、人工染色体が導入された、哺乳動物由来の、好ましくはマウス、ラットなどのげっ歯類由来の、細胞、組織又は個体において安定かつ高保持率で保持され、目的遺伝子(群)の正確な解析、物質生産などに用いることができる。上記内在遺伝子の削除は、例えば、テロメアトランケーションにより行うことができる。具体的には、マウス染色体を保持する細胞において、人工テロメア配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に人工もしくは天然テロメア配列が挿入されたクローンを取得し、これによってテロメアトランケーションにより欠失変異体が得られる。すなわち、所望の位置(又は、部位)が削除すべき長腕遠位の切断位置であり、この位置に人工テロメア配列が相同組換えにより置換、挿入されて長腕遠位が削除される。この位置は、ターゲティングベクターを構築する際の標的配列の設計により、適宜設定できる。例えば、マウス染色体長腕のDNA配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側でテロメトランケーションが起こるように設定される。これにより、内在遺伝子の大部分が削除されたマウス11番染色体断片が得られる。他の染色体の場合にも同様にテロメアトランケーションを実施できる。
DNA配列挿入部位として、好ましくは部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入することができる。すなわち、ある種の酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でDNAの組換えを起こす現象が知られており、本発明におけるマウス人工染色体ベクターでは、このような酵素とその酵素の認識部位からなる系を利用して、目的とする遺伝子又はDNA配列を挿入、搭載できる。このような系として、例えば、バクテリオファージP1由来のCre酵素と、その認識部位であるloxP配列の系(Cre/loxP系;B.Sauer in Methods of Enzymology;1993,225:890-900)や、出芽酵母由来のFlp酵素と、その認識部位であるFRT(Flp Recombination Target)配列の系(Flp/FRT系)や、ストレプトミセスファージ由来のφC31インテグレースと、その認識部位であるφC31attB/attP配列の系、R4インテグレースと、その認識部位であるR4attB/attP配列の系、TP901-1インテグレースと、その認識部位であるTP901-1attB/attP配列の系、Bxb1インテグレースと、その認識部位であるBxb1attB/attP配列の系、などを挙げることができるが、DNA配列挿入部位として機能しうるのであれば、上記の系に限定されないものとする。
本発明のマウス人工染色体ベクターには、ヒト抗体遺伝子を導入することができる。
本明細書中で使用する「ヒト抗体遺伝子もしくは遺伝子座」は、特に断らない限り、ヒト14番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト2番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及び/又はヒト22番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を指す。具体的には、ヒト抗体遺伝子もしくは遺伝子座は、例えばヒト14番染色体のimmunoglobulin heavy locus (human) NC_000014.9((塩基番号105586437..106879844)あるいは(塩基番号105264221.. 107043718))、ヒト2番染色体のimmunoglobulin kappa locus (human) NC_000002.12((塩基番号88857361..90235368)あるいは(塩基番号88560086..90265666))、及びヒト22番染色体のimmunoglobulin lambda locus (human) NC_000022.11((塩基番号22026076..22922913)あるいは(塩基番号21620362.. 23823654))に記載される塩基配列よって表される。ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座は、約1,3Mbの塩基長であり、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座は、約1.4Mbの塩基長であり、ヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座は、約0.9Mbの塩基長である。
本発明の非ヒト動物は、上記のとおり、ヒト14番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト2番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター、ヒト14番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト22番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを保持する動物、あるいは、ヒト14番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト2番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及びヒト22番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを保持する動物である。
ラットのES細胞は、マウスES細胞の場合と同様に(M.J. Evans and M.H. Kaufman, Nature 1981; 292(5819): 154-156)、ラット胚盤胞期胚又は8細胞期胚の内部細胞塊から樹立される、多分化能と自己複製能をもつ細胞株である。例えば、卵透明帯を溶解したラット胚盤胞を、白血病抑制因子(LIF)を含有する培地を用いてマウス胚性線維芽細胞(MEFF)フィーダー上で培養し、7〜10日後に胚盤胞から形成されるアウトグロウス(outgrowth)を分散し、これをMEFフィーダー上に移して培養し、約7日後、ES細胞が出現する。ラットES細胞の作製については、例えばK. Kawaharada et al., World J Stem Cells 2015; 7(7): 1054-1063に記載されている。
微小核細胞融合法は、上記のとおり、例えば単一もしくは少数の染色体又はその断片などの約0.9Mb以上の巨大核酸(ここでは、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座又はヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含む染色体又はその断片)を供与細胞から受容細胞へ移入可能にする技術である。この方法は、供与細胞を微小核化する第1工程、微小核化細胞を脱核する第2工程、ミクロセルを単離する第3工程、ミクロセルと受容細胞を融合する第4工程、及び、生存するミクロセルハイブリッドクローンを選択する第5工程を包含する。
供与細胞の微小核化は、動物細胞を、コルセミドなどの微小核細胞誘導剤を含有する培地中で長時間培養することによって行うことができる。ここで微小核細胞誘導剤は、染色体の脱凝縮と核膜の再形成を誘起する能力をもつ。微小核細胞誘導剤の濃度は、微小核化が起こるならば制限されないが、例えばコルセミドの場合、受容細胞約5×106個あたり約0.01μg/ml〜約1μg/ml、好ましくは0.05〜0.5μg/mlである。微小核化によって、供与細胞から、少量の細胞質と1個又は少数の染色体を含む微小核を含有する細胞、すなわちミクロセルが形成される。培養は、供与細胞の培養条件を使用するものとし、培地として一般に動物細胞用培地が使用される。動物細胞用培地には、例えばイーグル培地(MEM)、イーグル最小必須培地(EMEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、ハムF12培地などが含まれる。培地には、牛胎仔血清(FBS)、代替血清(Stem Sure(R) Serum Replacement、等)などを添加してもよい。温度は、室温〜約37℃であり、また培養時間は、約40〜80時間が適当である。
ROSI(Round Spermatid Injection)法は、上記キメララット(雄)の精巣から取り出した精細管を切り刻み懸濁液を作製した中から円形精子細胞をピペット内に吸引し、ピペット内で核と細胞質をバラバラにしたのち、これをラット卵子に注入し顕微授精する方法である(C. Tsurumaki et al., J. Mamm. Ova Res. 2009; 26: 86-93 (Jp))。さらに、受精した卵子を仮親の子宮に移植し、キメララットを出産させたのち、上記のヒト抗体遺伝子もしくは遺伝子座を保持する雌ラット(もしくは雄ラット)を用いて純系又は雑種、好ましくは雑種の雄ラット(もしくは雌ラット)と交配し、ラットの各種組織内でヒト抗体遺伝子もしくは遺伝子座を保持するラットを得ることができる。
1)ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体(hIGHK-MAC)を含む非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた同種の非ヒト動物を交配し、hIGHK-MACを含み、かつヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされている非ヒト動物を選択することを含む、ヒト抗体を産生可能である非ヒト動物の作製方法。
本発明は、上記の非ヒト動物に抗原物質を投与し、該抗原物質と結合する産生されたヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体を製造する方法を提供する。
マウス人工染色体ベクター(MAC)にIGK、IGH領域を転座クローニングするため、ヒト2番染色体に組換え配列であるloxP配列、FRT配列を挿入する。(図2)
マウス人工染色体ベクターMACにヒト2番染色体上IGK領域をCre/LoxPシステムを用いた相互転座により転座クローニングするため、相同組換え頻度の高いニワトリDT40細胞内において、ヒト2番染色体にloxP配列を挿入する。
ヒト2番染色体を保持した細胞DT40 521D4(#2)にloxP配列を挿入するための基本プラスミドにはv901(Lexicon genetics)を用いた。loxP挿入部位であるヒト2番染色体のDNA配列はGenBankデータベース(NC_000002.12)より得た。
cos138-F6B:5’-TCGAGGATCCCACATAGACATTCAACCGCAAAGCAG-3’(配列番号1)
cos138-R6B:5’-TCGAGGATCCAGGCCCTACACATCAAAAAGTGAAGCA-3’(配列番号2)
ニワトリDT40細胞の培養は10%ウシ胎仔血清(ギブコ、以下FBSで記す)、1%ニワトリ血清(ギブコ)、10-4M 2-メルカプトエタノール(シグマ)を添加したRPMI1640培地(ギブコ)中で行った。DT40 (#2)の約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotI(NEB)で線状化したターゲティングベクターv901-cos138 hygloxP5’HPRTを25μg加え、エレクトロポレーション用のキュベット(バイオラッド)に移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサー(バイオラッド)にセットし、550V、25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、96穴培養プレート12枚に分注して24時間培養した。1.5mg/ml Hygromycin(Wako(大阪、日本国))を含む培地に交換し、約2週間の選択培養を行った。5回の反応で191の薬剤耐性株を獲得し、ランダムに選んだ44クローンを以降の解析に用いた。
Hygromycin耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト2番染色体上で部位特異的に組換えが起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
cos138 sp L:5’-CTGAGAAGAGTCATTGTTTATGGTAGACT-3’ (配列番号3)
cos138 sp R:5’- ATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGT-3’ (配列番号4)
x6.1cosRa L:5’-GGGGAATAAACACCCTTTCCAAATCCTC-3’(配列番号5)
x6.1cosRa R:5’- ACCAAGTAACCGATCAAACCAACCCTTG-3’ (配列番号6)
D2S177 F:5’-AGCTCAGAGACACCTCTCCA-3’ (配列番号7)
D2S177 R:5’-CTGTATTAGGATACTTGGCTATTGA-3’ (配列番号8)
FABP1-F:5’-TATCAAGGGGGTGTCGGAAATCGTG-3’ (配列番号9)
FABP1-R:5’-ACTGGGCCTGGGAGAACCTGAGACT-3’ (配列番号10)
EIF2AK3-F:5’-AGGTGCTGCTGGGTGGTCAAGT-3’ (配列番号11)
EIF2AK3-R:5’-GCTCCTGCAAATGTCTCCTGTCA-3’ (配列番号12)
RPIA-F:5’-CTTACCCAGGCTCCAGGCTCTATT-3’ (配列番号13)
RPIA-R:5’-CTCTACCTCCCTACCCCATCATCAC-3’ (配列番号14)
IGKC-F:5’-TGGAAGGTGGATAACGCCCT-3’ (配列番号15)
IGKC-R:5’-TCATTCTCCTCCAACATTAGCA-3’ (配列番号16)
IGKV-F:5’-AGTCAGGGCATTAGCAGTGC-3’ (配列番号17)
IGKV-R:5’-GCTGCTGATGGTGAGAGTGA-3’ (配列番号18)
Vk3-2 F:5’-CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA-3’ (配列番号19)
Vk3-2 R:5’-TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC-3’ (配列番号20)
D2S159_1 F:5’-CTCTAACTGAATCAAGGGAATGAAC-3’ (配列番号21)
D2S159_1 R:5’-AGCAGTTTGAGTTTAGGATGAAGG-3’ (配列番号22)
PCRの結果、3クローンが陽性であり、これらについて以降の解析を行った。
上記の結果から3クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に従い行った。Human cot-1 DNAおよびpX6.1をプローブにしてFISH解析を行ったところ、全3クローンにおいて100%でヒト2番染色体が1コピー保持され、さらにPGKhygloxP5’HPRT由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるPGKhygloxP5’HPRTを部位特異的挿入する前のヒト2番染色体上にはシグナルが検出されなかったことから、部位特異的にPGKhygloxP5’HPRTが挿入されたことが確かめられた(図4)。3クローンの内、521D4 loxP1-28, 521D4 loxP4-6の2クローンを選択し、以降の実験を行った。
MAC上にloxPでヒト2番染色体上IGK領域を、さらにヒト14番染色体上IGH領域を転座クローニングするために、loxPを挿入したヒト2番染色体へFRTサイトを挿入する。
DT40(#2)にFRT配列を挿入するための基本プラスミドにはpMA-RQ(Life technologies)を用いた。このベクターに人工遺伝子合成配列PGK5’HPRTFRT (Life technologies)をクローニングした(ベクター名:pMA-kD9FRT)。まず、pCMV/Bsd(Invitrogen)をXhoIとEcoRIで消化し、泳動後CMVBsd配列をゲル抽出したものを、pMA-kD9FRTをEcoRIとXhoI消化後にできた突出末端にライゲーションした(ベクター名:pMA-kD9FRTBsd)。
kD-R9La L:5’-TCGAGCGGCCGCAGGATCTTTGGGGGACTGAATGGGGTGTGCT-3’ (配列番号23)
kD-R9La R:5’-TCGAACGCGTTGGAACCCTCATACGTTGCTGGTGGAATGT-3’ (配列番号24)
KD-F9Ra L:5’-CGAGGATCCATTTCTCCACATCCTAGCCAACACTTGACATTTCCT-3’ (配列番号25)
KD-F9Ra R:5’-TCGAGGATCCGCCAGGGAGACAGATGCCAAGTACGGTTTAG-3’ (配列番号26)
ニワトリDT40細胞の培養は10%FBS、1%ニワトリ血清(ギブコ)、10-4M 2-メルカプトエタノール(シグマ)を添加したRPMI1640培地(ギブコ)中で行った。DT40 (#2)、521D4 loxP1-28および521D4 loxP4-6約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotI(NEB)で線状化したターゲティングベクターpMA-kD9FRTLRを25μg加え、エレクトロポレーション用のキュベット(バイオラッド)に移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサー(バイオラッド)にセットし、550V、25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、96穴培養プレート12枚に分注して24時間培養した。薬剤選択は15μg/mL Blasticidin(フナコシ)で行い、各3回の反応において、521D4 loxP1-28、521D4 loxP4-6から、86クローン、82クローンの薬剤耐性株を獲得し、それぞれランダムに24クローンを選択し、ゲノムDNAを抽出した。それを鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト2番染色体上で部位特異的に組換えが起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
kD9 tcLa L:5’-TGAGAACACAGGGGTCTCCATTCTGACT-3’ (配列番号27)
kD9 tcLa R:5’-ACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAG-3’ (配列番号28)
kD9 tcRa L:5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’ (配列番号29)
kD9 tcRa R:5’-TGGTCACTGAAGCTTTCCATCTGCTCTT-3’ (配列番号30)
ヒト2番染色体上loxP配列確認プライマー:
cos138 sp L (前出)
cos138 sp R (前出)
x6.1cosRa L (前出)
x6.1cosRa R (前出)
D2S177 F (前出)
D2S177 R (前出)
FABP1-F (前出)
FABP1-R (前出)
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
D2S159_1 F (前出)
D2S159_1 R (前出)
その結果、それぞれ521D4 loxP1-28, 521D4 loxP4-6から7および3クローンの陽性クローンを獲得した。
上記の結果から7クローンおよび3クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社(東京、日本国)、1994)に従い行った。Human cot-1 DNAおよびpMA-kD9FRTBsdをプローブにしてFISH解析を行ったところ、全クローンにおいて87%以上でヒト2番染色体が1コピー保持され、さらにPGK5’HPRTFRTBsd由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるPGK5’HPRTFRTBsdを部位特異的挿入する前のヒト2番染色体上にはシグナルが検出されなかったことから、部位特異的にPGK5’HPRTFRTBsdが挿入されたことが確かめられた(図6)。この内、521D4 loxP1-28 FRT1-23と521D4 loxP4-6 FRT1-15の2クローンを選択し、以降の実験を行った。
MACを保持するCHO細胞において、ヒト2番染色体上IGK領域をMACへ転座クローニングする。転座クローニングにはCre/loxPシステムを用い、ヒト2番染色体とMACを相互転座させることで、IGK領域をMACに搭載する。(図7)
CHO内でCre/LoxPシステムを用いて、ヒト2番染色体領域をMACに転座クローニングするため、MACを保持するCHO細胞へ改変ヒト2番染色体を移入する。
ドナー細胞であるDT40 521D4 loxP1-28 FRT1-23と521D4 loxP4-6 FRT1-15を用いて、MACベクターを保持するCHO hprt欠損細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218)であるCHO(HPRT-)に微小核細胞融合法を行った。
薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、それらを鋳型として、CHO MAC細胞に改変ヒト2番染色体が移入されたかPCRを行った。プライマーを以下に示す。
改変ヒト2番染色体上loxP配列確認プライマー:
cos138 sp L (前出)
cos138 sp R (前出)
x6.1cosRa L (前出)
x6.1cosRa R (前出)
ヒト2番染色体領域確認プライマー:
D2S177 F (前出)
D2S177 R (前出)
FABP1-F (前出)
FABP1-R (前出)
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
D2S159_1 F (前出)
D2S159_1 R (前出)
改変ヒト2番染色体上FRT配列確認プライマー:
kD9 tcLa L (前出)
kD9 tcLa R (前出)
kD9 tcRa L (前出)
kD9 tcRa R (前出)
結果、3クローンおよび4クローンの陽性細胞を獲得した。
3クローンおよび4クローンについてHuman cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、MACと改変ヒト2番染色体が独立して保持されている陽性細胞(図8)、CHO(MAC)hChr.2 LF1-15 #9 およびCHO(MAC)hChr.2 LF1-15 #16を獲得した。
Cre/LoxPシステムを用いてIGK領域を含むヒト2番染色体断片をMACへ転座させる。
MACにはloxPサイトが搭載されており、Cre組換え酵素存在下で改変ヒト2番染色体のloxPサイトと組換えが起こるようになっている。また、組換えが起こると副産物となるMACに載らないヒト2番染色体領域の5’HPRTと副産物となるMAC末端の3’HPRTが連結して、HPRT遺伝子の再構成が起こり、CHO(hprt-/-)はHAT耐性を獲得する。
得られたHAT耐性クローン各23、24クローンを以降の解析に用いた。
HAT耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト2番染色体断片とMAC上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
TRANS L1:5'-TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC-3'(配列番号31)
TRANS R1:5'-CCCCTTGACCCAGAAATTCCA-3'(配列番号32)
KJneo:5'-CATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3’(配列番号33)
PGKr-2:5'-ATCTGCACGAGACTAGTGAGACGTGCTA-3’(配列番号34)
ヒト2番染色体領域確認プライマー:
D2S177 F (前出)
D2S177 R (前出)
FABP1-F (前出)
FABP1-R (前出)
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
D2S159_1 F (前出)
D2S159_1 R (前出)
ヒト2番染色体上FRT配列確認プライマー:
kD9 tcLa L (前出)
kD9 tcLa R (前出)
kD9 tcRa L (前出)
kD9 tcRa R (前出)
その結果、23クローンおよび24クローンがPCR陽性であった。
ランダムに選択した各6クローンについてHuman cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、5クローンと1クローンについてMACと改変ヒト2番染色体が相互転座をおこしかつ、IGK領域がMACに搭載されたIGK-MAC、副産物が独立して保持されていることを確認した(図9)。CHO IGK-MAC #9-3、CHO IGK-MAC #16-1の2クローンを選択して以降の実験を行った。
ヒト14番染色体を改変し、IGK-MACにIGH領域を搭載するための宿主細胞であるCHO(hprt-/-)へ改変ヒト14番染色体を移入した(図10)。
転座クローニングにより、ヒト14番染色体IGH領域をIGK-MACに搭載するために、組換え配列であるFRT配列をヒト14番染色体に挿入した。
DT40(#14)にFRT配列を挿入するための基本プラスミドにはpMA-RQ(Life technologies)を用いた。このベクターに人工遺伝子合成配列FRTサイト (Life technologies)をクローニングした(ベクター名:pMA-14SC355)。まず、pX6.1ベクターをKpnIとClaIで消化し、泳動後PGKhyg配列をゲル抽出したものを、pMA-14SC355をKpnIとClaI消化後にできた突出末端にライゲーションした(ベクター名:pMA-14SC355hyg)。さらに、プラスミドv907(Lexicon genetics)にloxP配列および3’HPRTを挿入したプラスミド(ベクター名:pX3.1)をXbaIおよびAscIで消化し得られた3’HPRT配列を、pMA-SC355hygのNheI(NEB)およびMluI(NEB)サイト消化後にできた突出末端にライゲーションした(ベクター名:pMA-SC355hyg3’HPRT)。
NotISC355-F:5’-TCGAGCGGCCGCGTACAATCTTGGATCACTACAACCTCTGCCTA-3’(配列番号35)
AscISC355-R:5’-TCGAGGCGCGCCAGGATTATAGATGTGAGCCATCACTAAGACTCCT-3’(配列番号36)
SalISC355-F4:5’-TCGAGTCGACAGCACGTTGGGAGGCCAAGGCAGGAGAATA-3’(配列番号37)
BamHISC355-R4:5’-TCGAGGATCCTGGCTGACACAGCCAGTCCCGGATT-3’(配列番号38)
ニワトリDT40細胞の培養は10%FBS、1%ニワトリ血清(ギブコ)、10-4M 2-メルカプトエタノール(シグマ)を添加したRPMI1640培地(ギブコ)中で行った。DT40(#14)約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotI(NEB)で線状化したターゲティングベクターpMA-SC355hyg3’HPRTRLを25μg加え、エレクトロポレーション用のキュベット(バイオラッド)に移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサー(バイオラッド)にセットし、550V、25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、96穴培養プレート12枚に分注して24時間培養した。薬剤選択は1.5mg/mL Hygromycinで行い、3反応行った結果、73クローンの薬剤耐性株を獲得した。そのうちランダムに23クローンを選択し、ゲノムDNAを抽出した。それを鋳型としてヒト14番染色体上で部位特異的に組換えが起こっているかをPCRで確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
14TarC_La F:5’-AGCAATTAGGGCCTGTGCATCTCACTTT-3’(配列番号39)
14TarC_La R:5’-CCAGCTCATTCCTCCCACTCATGATCTA-3’(配列番号40)
14TarC_Ra F:5’-CATCTGGAGTCCTATTGACATCGCCAGT-3’(配列番号41)
14TarC_Ra R:5’-CTTATTCCTCCTTCTGCCCACCCTTCAT-3’(配列番号42)
MTA1-F3:5’-AGCACTTTACGCATCCCAGCATGT-3’(配列番号43)
MTA1-R3:5’-CCAAGAGAGTAGTCGTGCCCCTCA-3’(配列番号44)
ELK2P2-F:5’-CCCACTTTACCGTGCTCATT-3’(配列番号45)
ELK2P2-R:5’-ATGAAGGTCCGTGACTTTGG-3’(配列番号46)
g1(g2)-F:5’-ACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTC-3’(配列番号47)
g1(g2)-R:5’-CACTTGTACTCCTTGCCATTCAGC-3’(配列番号48)
VH3-F:5’-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3’(配列番号49)
VH3-R:5’-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3’(配列番号50)
CH3F3:5’-AGGCCAGCATCTGCGAGGAT-3’(配列番号51)
CH4R2:5’-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3’(配列番号52)
PCRの結果、10クローンが陽性であり、これらについて以降の解析を行った。
ランダムに選択した6クローンにおいて、Human cot-1 DNAおよびpMA-SC355hyg3’HPRTをプローブにしてFISH解析を行ったところ、全クローンにおいて90%以上でヒト14番染色体が1コピー保持され、さらにPGKhyg3’FRTHPRT由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるPGKhyg3’FRTHPRTを部位特異的挿入する前のヒト14番染色体上にはシグナルが検出されなかったことから、部位特異的にPGKhygFRT3’HPRTが挿入されたことが確かめられた(図12)。この内、14DT40#2-4_FRT 3-17と3-19の2クローンを選択し、以降の実験を行った。
CHO(hprt-/-)細胞株において14番染色体のIGH領域をIGK-MACに搭載するため、改変ヒト14番染色体をCHO(hprt-/-)細胞株へ移入した。
ドナー細胞である14DT40#2-4_FRT 3-17と3-19を用いて、CHO(HPRT-)に微小核細胞融合法を行った。
改変ヒト14番染色体がCHO(hprt-/-)細胞株に移入されたかを確認するため、PCR解析を行った。プライマーを以下に示す。
改変ヒト14番染色体上FRT配列確認プライマー:
14TarC_La F (前出)
14TarC_La R (前出)
14TarC_Ra F (前出)
14TarC_Ra R (前出)
ヒト14番染色体領域確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
結果、14クローンと2クローンのPCR陽性クローンを獲得した。
ランダムに選んだ6クローンおよび2クローンについて、Human cot-1 DNAおよびpMA-SC355hyg3’HPRTをプローブにしてFISH解析を行ったところ、PGKhygFRT3’HPRT由来のシグナルを示す14番染色体が1コピー保持されている陽性細胞を確認した(図13)。CHO hprt-/- 14FRT #3-17_8とCHO hprt-/- 14FRT #3-17_14を以降の実験に用いた。
作製したIGK-MACを、改変ヒト14番染色体を保持するCHO(hprt-/-)細胞株へ移入し、FRT/Flpシステムによる組換えを起こさせIGH領域をIGK-MACに搭載し、IGHK-MACを作製した(図14)。
[A.1] 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるCHO IGK-MAC #9-3を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行った。微小核(「ミクロセル」ともいう)を無血清DMEM培地に懸濁し、8μm, 5μm, 3μmフィルターにて精製した。精製後、ミクロセルをDMEMで調製した0.05mg/ml PHA-P(シグマ)溶液2mLに懸濁し、6cm細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるCHO hprt-/- 14FRT #3-17_8およびCHO hprt-/- 14FRT #3-17_14に、培養液を除いた後添加した。15分インキュベートして微小核をCHO細胞に張り付けた。その後、PEG1000 (Wako)溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地6mLに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を1mlで正確に1分融合した。 5mLの無血清DMEMでPEGを除去するために4回ウオッシュ操作を行った後、CHO培養液を添加した。24時間後、10cm細胞培養皿10枚に細胞を播種し、600μg/mL G418と6μg/mL Blasticidinを添加し、10日選択培養を行った。得られた薬剤耐性株18クローン、15クローンについて以降の解析を行った。
IGK-MACが改変ヒト14番染色体を保持するCHO(hprt-/-)株に移入されているか、改変ヒト14番染色体は維持されているかを確認するためにPCR解析を行った。以下に用いたプライマーを示す。
IGK-MACの確認プライマー
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
IGK-MAC上のFRT挿入部位確認プライマー:
kD9 tcLa L (前出)
kD9 tcLa R (前出)
kD9 tcRa L (前出)
kD9 tcRa R (前出)
ヒト2番染色体領域確認プライマー:
D2S177 F (前出)
D2S177 R (前出)
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
改変ヒト14番染色体上のFRT挿入部位確認プライマー:
14TarC_La F (前出)
14TarC_La R (前出)
14TarC_Ra F (前出)
14TarC_Ra R (前出)
ヒト14番染色体領域確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
その結果、12クローンと15クローンがPCR陽性であった。
ランダムに選択した6および5クローンについて、Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、IGK-MACと改変ヒト14番染色体が独立して、1コピーずつ維持されているクローンを確認した(図15)。CHO Igk-MAC #9-3 8-5とCHO Igk-MAC #9-3 14-9の2クローンを選択し以降の実験を行った。
IGK-MACと改変ヒト14番染色体をFRT/Flpシステムで相互転座させることで、IGK-MAC上にヒト14番染色体由来IGH領域を転座クローニングし、IGHK-MACを構築する。
IGK-MAC上のFRTサイトと改変ヒト14番染色体上のFRTサイトを用いて、FLP組換え酵素存在下で相互転座を起こさせる。また、組換えが起こるとIGHK-MAC上では、5’HPRTと3’HPRTが連結して、HPRT遺伝子の再構成が起こり、HAT耐性を獲得する。CHO Igk-MAC #9-3 8-5とCHO Igk-MAC #9-3 14-9について、10cm細胞培養皿においてコンフルエントになった時に18μgのFLP発現プラスミドをLipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)を用いてメーカーの手順を参照して加える。添加後6時間経過したら、培養液を交換し、24時間後に、10cm細胞培養皿10枚に播種し、1×HAT、6μg/mL Blasticidinで薬剤選択を行った。
得られたHAT耐性クローン各24クローンを以降の解析に用いた。
FRT/FLPシステムを用いて期待した相互転座が起こり、IGHK-MACが構築されているか確認するため、薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、鋳型としてPCR解析を行った。用いたプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位の確認プライマー:
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1:5’- CCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACG-3’(配列番号 53)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
ヒト2番染色体領域確認プライマー:
D2S177 F (前出)
D2S177 R (前出)
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ヒト14番染色体領域確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
それぞれ6クローンをランダムに選択し、Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、副産物であるMACに載らない14番染色体に、余分な2番染色体領域が転座して染色体が長くなっており、相互転座が起こったことが示唆され、IGHK-MACと考えられる染色体が1コピーで独立して存在していることが確認できた(図16)。結果、CHO IGHK-MAC 8-1とCHO IGHK-MAC 14-7の2クローンを選択し、以降の解析を行った。
IGHK-MACおよびIGHK-MAC構築のための相互転座の際に形成された副産物の両方にNeo耐性遺伝子がのっており、微小核細胞融合法で目的の細胞に移入した際、G418で薬剤選択するとIGHK-MACもしくは副産物がそれぞれあるいは両方移入された細胞を取得することになる。MAC上にはEGFPが搭載されているので、目的の細胞にIGHK-MACが移入されているか確認することが可能であるが、染色体導入が効率的に行えるドナー細胞でかつIGHK-MACのみを保持する細胞を作製するため、IGHK-MACをCHO K1細胞株に移入した。
染色体移入により、IGHK-MACのみを保持する細胞株を作製した。
ドナー細胞であるCHO IGHK-MAC 8-1とCHO IGHK-MAC 14-7を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行った。微小核(「ミクロセル」ともいう)を無血清DMEM培地に懸濁し、8μm, 5μm, 3μmフィルターにて精製した。精製後、ミクロセルをDMEMで調製した0.05mg/ml PHA-P(シグマ)溶液2mLに懸濁し、6cm細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるCHO K1細胞株に、培養液を除いた後添加した。15分インキュベートして微小核をCHO細胞に張り付けた。その後、PEG1000 (Wako)溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地6mLに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を1mlで正確に1分融合した。 5mLの無血清DMEMでPEGを除去するために4回ウオッシュ操作を行った後、CHO培養液を添加した。24時間後、10cm細胞培養皿10枚に細胞を播種し、800μg/mL G418を添加し、10日選択培養を行った。得られた薬剤耐性株20クローン、13クローンについて以降の解析を行った。得られたこれらのクローンについては、IGHK-MAC上GFPの蛍光タンパク発現を確認している。
IGHK-MACがCHO K1細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、それを鋳型としてPCR解析を行った。用いたプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー:
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
ヒト2番染色体領域確認プライマー:
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ヒト14番染色体領域確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
その結果、14クローンおよび10クローンの陽性クローンを確認した。
それぞれ6クローンをランダムに選択し、Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、各2クローンについて期待通りIGHK-MACのみを保持していることが確認できた(図19)。
[A]マウスES細胞へのIGHK-MACの移入
ヒト抗体産生マウスを作製するためにはIGHK-MACをマウスES細胞に移入し、受精卵8細胞期にインジェクションし、キメラマウスを作製し、IGHK-MACを子孫伝達させることが必要である。
ドナー細胞は、CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1、CHO K1 IGHK-MAC 14-7-9を用いた。ドナー細胞を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行った。微小核(「ミクロセル」ともいう)を無血清DMEM培地に懸濁し、8μm, 5μm, 3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心した。2000rpm,10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。さらに2000rpm,10分間遠心した。レシピエント細胞には、マウスES細胞HKD31 6TG-9(マウスのIghおよびIgk遺伝子が破壊されている。特許:国際公開番号WO98/37757に記載)およびXO ES9(抗体遺伝子は破壊されていない。)を用いた。培養には、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose:SIGMA)に、10%FCS、LIF(Murine Leukemia Inhibitory Factor)、1×10‐5M 2-ME(2-メルカプトエタノール:SIGMA)、L-グルタミン(3.5g/ml:GIBCO)、Sodium pyruvate溶液(3.5g/ml:GIBCO)、MEM 非必須アミノ酸 (0.125mM:GIBCO)を添加し、5% CO2、37℃にて培養をおこなった。10cm細胞培養皿でコンフルエントになったマウスES細胞をPBS(-)で細胞表面を2回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、DMEM培地に10%FBSを添加した培養液で回収し、1500rpmで遠心し、上清を除去し、無血清培養液5mlに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに1200rpmで遠心した。上清を除去し、PEG1000 (Wako)溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を0.5mlで正確に1分30秒間融合した。13mlの無血清培養液(DMEM)を静かに添加し、1200rpmで遠心した。上清を除去し、通常のマウスES細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したG418耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径10cm細胞培養皿2枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。G418を250μg/mLになるように加え、3〜4週間選択培養した。それぞれ、4、4、6、6反応行った結果、EGFP陽性かつ薬剤耐性株それぞれ、6、4、7、4クローンを取得し、以降の解析を行った。
IGHK-MACがマウスES細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、それを鋳型としてPCR解析を行った。用いたプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー:
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
ヒト2番染色体領域確認プライマー:
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ヒト14番染色体領域確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、HKD31 6TG-9について、CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1由来4クローン、CHO K1 IGHK-MAC 14-7-9由来1クローン、XO ES9について、CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1由来3クローン、CHO K1 IGHK-MAC 14-7-9由来1クローンについて期待通りIGHK-MACのみを保持しており、マウスESの正常核型を維持していることが確認できた(図22)。
[B] ラットES細胞へのIGHK-MACの移入
ヒト抗体産生ラットを作製するためにはIGHK-MACをラットES細胞に移入し、8細胞期胚にインジェクションし、キメララットを作製し、IGHK-MACを子孫伝達させることが必要である。
上記A.1に記載のようにマウスES細胞への微小核細胞融合法と同様の手法を用いてラットES細胞へのIGHK-MACの導入を行った。ドナー細胞は、CHO IGHK-MAC 8-1、CHO IGHK-MAC 14-7、CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1、CHO K1 IGHK-MAC 14-7-9を用いた。融合後、オーバーナイトでインキュベーションし、G418を150μg/mLになるように加え、3〜4週間選択培養した。各2反応、K1株については8反応ずつ行った結果、GFP陽性かつ薬剤耐性のクローン、CHO IGHK-MAC 8-1由来9クローン、CHO IGHK-MAC 14-7由来12クローン、CHO K1 IGHK-MAC 8-1 #1由来90クローン、CHO K1 IGHK-MAC 14-7 #9由来34クローンを獲得した。以降の解析についてはCHO IGHK-MAC 8-1由来9クローン、CHO IGHK-MAC 14-7由来12クローンについて行った。
IGHK-MACがラットES細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、それを鋳型としてPCR解析を行った。用いたプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー:
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
ヒト2番染色体領域確認プライマー:
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ヒト14番染色体領域確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、rES14-7 #4, #6およびrES8-1 #3、#8の4クローンについて期待通りIGHK-MACのみを保持しており、ラットESの正常核型(42本)を維持していることが確認できた(図23)。この4クローンを用いて以降の実験を行うこととした。
IGHK-MACを保持したES細胞を用いて、キメラマウスおよびキメララットを作製し、子孫伝達させる。
IGHK−MACを保持したマウスの作製および、解析を行った。過程で得られたキメラについても解析を行った。
得られたIGHK-MACを保持するマウスES細胞を用いて(ジーンターゲティング、実験医学、1995)の手法に従い、キメラマウスを作製する。宿主としてはMCH(ICR)(白色、日本クレア社より購入)の雌雄交配により得られる桑実胚及び8細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。
誕生後3週以上を経たキメラマウスから(勝木元也,発生工学実験マニュアル,講談社サイエンティフィク,1987)に記された方法に従い尻尾を取得し、Puregene DNA Isolation Kit (Qiagen)を用いてゲノムDNAを抽出する。実施例6記載のプライマー及びPCR条件により、PCR解析を行い、IGHK-MAC保持を確認した。
HKD31マウスES細胞はマウスIgh, Igk遺伝子が破壊されている。Bリンパ球の発生に必須な抗体μ鎖遺伝子ノックアウトマウスは体液性免疫を担う成熟Bリンパ球が欠損していることにより抗体を産生することができない。したがって、HKD31マウスES細胞は、キメラマウスにおいて成熟B細胞になれない。キメラマウス作製に用いるIGHK-MAC保持HKD31マウス細胞について、IGHK-MACからヒトIGMが発現すれば、この欠損を救済可能で、GFP陽性のB細胞を検出することができる。これにより、IGHK-MAC上のIGM遺伝子の機能的発現が間接的に検証できる。キメラマウスより血液を採取し、マウスCD45R(B220)に対する抗体染色を用い、マウスB細胞をフローサイトメーターにより検出する。CD45RとGFP共陽性の細胞が存在するか解析を行うことで、IGHK-MAC由来IGMの機能的発現を確認することができる。マウスCD45R(B220)に対する抗体を用いて、血液細胞を染色し、ヒトIGM、CD45R、GFP陽性の細胞を確認した。末梢血を採血し、ヘパリンPBSの入ったチューブに血液を移し、転倒混和して氷冷。遠心2000rpm、3分、4℃、の後、上清除去後、各種抗体を添加し、4℃で30分反応させ、5%牛胎仔血清を添加したPBS(5%FBS/PBS)により洗浄した。最後の遠心後、ペレットに1.2%Dextran/生理食塩水を加え、タッピング後、室温で45分静置し、赤血球を自然沈降させた。上清を新しいチューブに移し、2000rpm、3分、4℃で遠心後上清除去し、ペレットに室温の溶血剤(0.17M NH4Cl)を加え、5分静置した。2000rpm、3分、4℃で遠心し、5%FBS/PBSで洗浄した後500μlの5%FBS/PBSで懸濁したものを解析サンプルとし、フローサイトメーターにより解析した。HKD31 6TG-9 IGHK-MAC 14-7-9 #1由来のキメラマウスについて、末梢血リンパ球について上述の手段で解析を行った結果、GFPおよびB220共陽性の細胞が確認され、構築したIGHK-MACの機能性を示唆する結果を得た(図24)。
キメラマウスにおいて、ヒト抗体遺伝子軽鎖、重鎖、各種アイソタイプ発現確認を目的として、血清中のヒト抗体濃度をエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)を用いて測定する。ELISAは以下に記載されている方法に従う。富山・安東、単クローン抗体実験マニュアル、講談社、1987;安東・千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社、1991;石川、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター、1993:Ed Harlow and David Lane,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988;A.Doyle and J.B.Griffiths,Cell & Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley & Sons Ltd.,1996。これらの文献に記載の方法を参考にして、測定系によっては反応時間や温度を4℃で終夜行うなどの改良を行う。特定の抗体検出については、kitを用いて実施する。ヒト抗体(hγ、hμ、hκ、hγ1、hγ2、hγ3、hγ4、hα、hε、hδ)の発現および血清中の濃度を測定する。基本的な操作を以下に示す。
キメララット脾臓由来RNAからcDNAを合成し、ヒト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定を行う。方法は特許(国際公開番号WO98/37757)に記されている方法同様実施することで解析、評価できる。
キメラマウスについて、抗原特異的ヒト抗体価の増加が見られるかを評価する。方法は特許(国際公開番号WO98/37757)に記されている方法同様にヒト血清アルブミンで免疫し、抗体力価の上昇を解析する。
[B.1] IGHK-MAC子孫伝達
上記[A]で作製される雌キメラマウス(キメラ率約100%)をICR雄マウスと交配し、誕生した仔マウスについて、ES細胞由来のIGHK-MACの優性遺伝形質である、GFPの蛍光を観察した。GFPの蛍光が観察されれば、マウス個体においてIGHK-MACが子孫伝達し、安定に保持されていることが確認できる。IGHK-MACが子孫伝達されたマウス系統をmTC(IGHK-MAC)と呼ぶ。
mTC(IGHK-MAC)について(実施例7)[A.2]同様解析を行うことでIGHK-MACの子孫伝達を詳細に確認できる。XO ES9 IGHK-MAC 8-1-1 #1由来の子孫伝達個体について、尻尾のDNAを鋳型としたPCRおよび個体のGFP発現を確認した結果、共に陽性であり、IGHK-MACが子孫伝達し、安定に維持されていることが確認された。
(実施例7)[A.3]同様に解析を行うことで、HKD mTC(IGHK-MAC)におけるIGHK-MACの保持および機能性を間接的に評価できた。HKD31 6TG-9 IGHK-MAC 14-7-9 #1由来の子孫伝達個体HKD mTC(IGHK-MAC)について、尻尾のDNAを鋳型としたPCR解析で陽性が確認できた個体について、末梢血リンパ球についてGFP陽性およびB220/GFP共陽性細胞の存在を確認した結果、共に陽性であり、子孫伝達したIGHK-MACが安定に維持され、機能していることを示唆する結果を得た。フローサイトメトリー解析により評価した結果、末梢血リンパ球におけるGFP陽性細胞(MAC保持細胞)の割合は、98.45%と高頻度であり、B細胞の割合は7.9%であった。(図25)。また、XO ES9 IGHK-MAC8-1-1 #1由来の子孫伝達個体HKD mTC(IGHK-MAC)についても、尻尾のDNAを鋳型としたPCR解析で陽性が確認できた個体について、末梢血リンパ球についてGFP陽性およびB220/GFP共陽性細胞の存在を確認した。末梢血リンパ球におけるGFP陽性細胞(MAC保持細胞)の割合は、90.14%と高頻度であり、B細胞の割合は22.06%であった(図26)。
mTC(IGHK-MAC)について(実施例7)[A.4][A.5][A.6]同様に評価する。
IGHK−MACを保持したラットの作製および、解析を行う。過程で得られたキメラについても解析を行う。
上記実施例6で得られたIGHK-MAC保持ラットES細胞クローンを用いてHirabayashiらの方法(Mol Reprod Dev. 2010 Feb;77(2):94.doi:10. 1002/mrd.21123.)でキメララットを作製した。宿主としてはCrlj:WIラット(白色、日本チャールスリバー社より購入)の雌雄交配により得られる胚盤胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔ラットは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。
上記[A.2]同様に解析を行い、IGHK-MAC保持をより詳細に確認する。血液細胞についてHuman Cot-1およびMouse Cot-1 DNAをプローブとして用い、FISH解析を実施する。
キメララットについて(実施例7) [A.3][A.4][A.5][A.6]同様に評価する。
[D.1]IGHK-MACを保持するキメララットからのIGHK-MACの子孫伝達
上記[C]で作製されたキメララット(キメラ率約100%)とCrlj:WIラットを交配し、誕生した仔ラットについてES細胞由来のIGHK-MACの優性遺伝形質である、GFPの蛍光を観察した。GFPの蛍光が観察され、ラット個体においてIGHK-MACが子孫伝達し、安定に保持されていることが確認できた。IGHK-MACが子孫伝達されたラット系統をrTC(IGHK-MAC)と呼ぶ。rES8-1 #3由来、F1ラット3個体の末梢血リンパ球のGFP陽性率を評価した結果、98.23%、96.62%、95.79%と子孫伝達したIGHK-MACが高い保持率で維持されていることが確認された。
rTC(IGHK-MAC)について[C.2]同様解析を行うことでIGHK-MACの子孫伝達を詳細に確認できる。
rTC(IGHK-MAC)について(実施例7)[A.3][A.4][A.5][A.6]同様に評価する。
rTCについてヒト抗体IgMおよびIgGを検出するELISA解析を行った。野生型のラット血清を陰性コントロールにおいて解析を実施した結果、rTCの血清中にヒトIgMおよびIgGが存在していることが確認され、rTCがヒト抗体を産生していることが示された(図28)。
マウス人工染色体ベクターMACにIGL、IGH領域を転座クローニングするために、ヒト22番染色体にloxPサイト、FRTサイトを挿入する(図29)。
[A.1]ヒト22番染色体へのloxP挿入ベクター作製
ヒト22番染色体を保持した細胞DT40 52-18#22 (#22)にloxP配列を挿入するための基本プラスミドにはpX6.1(前出)を用いた。loxP挿入部位であるヒト22番染色体のDNA配列はGenBankデータベース(NC_000022.11)より得た。
HindIII553La L:5’-TGTAGCTGACTTTAGCCACCCACAAGTAC-3’(配列番号 54)
AscI553La R:5’-TCGAGGCGCGCCCTCAAACTCCTGGGTGTAAATGATCCTCCTGC-3’(配列番号 55)
KpnI553Ra L:5’-TGAGGGTACCGTGCAGTAAAGTATGATTGAGC-3’(配列番号 56)
SalI553Ra R:5’-TCGAGTCGACCTTGCTGATTATACCTCATCTCCTTCCCTC-3’(配列番号 57)
ニワトリDT40細胞の培養は10%ウシ胎仔血清(ギブコ、以下FBSで記す)、1%ニワトリ血清(ギブコ)、10-4M 2-メルカプトエタノール(シグマ)を添加したRPMI1640培地(ギブコ)中で行った。DT40 (#22)の約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotI(NEB)で線状化したターゲティングベクターpX6.1553LRを25μg加え、エレクトロポレーション用のキュベット(バイオラッド)に移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサー(バイオラッド)にセットし、550V、25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、96穴培養プレート12枚に分注して24時間培養した。1.0mg/ml Hygromycin(Wako)を含む培地に交換し、約2週間の選択培養を行い32クローンの薬剤耐性株を得た。
Hygromycin耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト22番染色体上で部位特異的に組換えが起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
22CeT La L:5’-CCTGCCTTCTTGTTTCAGCTCTCAACTG-3’(配列番号 58)
22CeT La R:5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’(配列番号 59)
22CeT Ra L:5’-ATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGT-3’(配列番号 60)
22CeT Ra R:5’-ACACTTTAGTCCCTGTCCCCTCAACGAG-3’(配列番号 61)
553P-F:5’-AGATCTCTTGAGCCCAGCAGTTTGA-3’(配列番号 62)
553P-R:5’-TGAAGTTAGCCGGGGATACAGACG-3’(配列番号 63)
PPM1F L:5’-AACGGCAGCCAAACCAAAGA-3’(配列番号 64)
PPM1F R:5’-ACCAGGACTGGCTGGGCATA-3’(配列番号 65)
IGLVI-70 L:5’-AGTCTGCGCTGACCCAGGAA-3’(配列番号 66)
IGLVI-70 R:5’-TTGAGCCAGAGAAGCGGTCA-3’(配列番号 67)
GNAZ L:5’-TCCACTTGGGGGTCTGCATT-3’(配列番号 68)
GNAZ R:5’-TGGTGCTGAGCAGCTGTGTG-3’(配列番号 69)
LIF L:5’-TGGGACTTAGGTGGGCCAGA-3’(配列番号 70)
LIF R:5’-GCCTCCCCAAGAGCCTGAAT-3’(配列番号 71)
hVpreB1-F:5’-TGTCCTGGGCTCCTGTCCTGCTCAT-3’(配列番号 72)
hVpreB1-Rm:5’-GGCGGCGACTCCACCCTCTT-3’(配列番号 73)
hVpreB3-F:5’-CACTGCCTGCCCGCTGCTGGTA-3’(配列番号 74)
hVpreB3-R:5’-GGGCGGGGAAGTGGGGGAGAG-3’(配列番号 75)
hL5-F:5’-AGCCCCAAGAACCCAGCCGATGTGA-3’(配列番号 76)
hL5-R:5’-GGCAGAGGGAGTGTGGGGTGTTGTG-3’(配列番号 77)
344-F:5’-ATCATCTGCTCGCTCTCTCC-3’(配列番号 78)
344-R:5’-CACATCTGTAGTGGCTGTGG-3’(配列番号 79)
350P-F:5’-ACCAGCGCGTCATCATCAAG-3’(配列番号 80)
350P-R:5’-ATCGCCAGCCTCACCATTTC-3’(配列番号 81)
IgL-F:5’-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3’(配列番号 82)
IgL-Rm:5’-GAGAGTTGGAGAAGGGGTGACT-3’(配列番号 83)
SERPIND1 L:5’-ACCTAGAGGGTCTCACCTCC-3’(配列番号 84)
SERPIND1 R:5’-CCCTGGACATCAAGAATGG-3’(配列番号 85)
その結果、17クローンがPCR陽性であった。
上記の結果からランダムに選んだ10クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に従い行った。Human cot-1 DNAおよびpX6.1をプローブにしてFISH解析を行ったところ、9クローンにおいて70%以上ヒト2番染色体が1コピー保持され、さらにPGKhygloxP5’HPRT由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるPGKhygloxP5’HPRTを部位特異的挿入する前のヒト22番染色体上にはシグナルが検出されなかったことから、部位特異的にPGKhygloxP5’HPRTが挿入されたことが確かめられた(図31)。以降の実験には、22DT40 KloxP3 1-5, 2-1の2クローンを用いた。
MAC上にloxPでヒト22番染色体上IGL領域を、そこへさらにヒト14番染色体上IGH領域を転座クローニングするために、loxPを挿入したヒト2番染色体へFRTサイトを挿入する。
DT40(#22)にFRT配列を挿入するための基本プラスミドにはpMA-kD9FRTBsdを用いた。FRT挿入部位であるヒト22番染色体のDNA配列はGenBankデータベース(NC_000022.11)より得た。DT40(#22)からゲノムDNAを抽出して鋳型とし、相同組換えの標的配列の増幅に用いたプライマーの配列を以下に示す。
BamHISL350La L:5’-TCGAGGATCCGGCCTCCCAAAGGATTATAGACGTGAGCCACTGT-3’(配列番号 86)
AscISL350La R:5’-TCGAGGCGCGCCGGCACCTCTCCTATTTTCTTCACAGCACTT-3’(配列番号 87)
AscISL350Ra L:5’-TCGAGGCGCGCCAGCATGGTGGCCCGCACGTATAGTCGCAGCTA-3’(配列番号 88)
NotISL350Ra R:5’-TCGAGCGGCCGCAAAGAAGGGGCCCGCCTCTGCCTCTAAATCCTGAC-3’(配列番号 89)
ニワトリDT40細胞の培養は10%ウシ胎仔血清(ギブコ、以下FBSで記す)、1%ニワトリ血清(ギブコ)、10-4M 2-メルカプトエタノール(シグマ)を添加したRPMI1640培地(ギブコ)中で行った。22DT40 KloxP3 1-5,および22DT40 KloxP3 2-1約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotI(NEB)で線状化したターゲティングベクターpMA-kD9FRTBsd22LRを25μg加え、エレクトロポレーション用のキュベット(バイオラッド)に移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサー(バイオラッド)にセットし、550V、25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、96穴培養プレート12枚に分注して24時間培養した。
22TeT La L:5’-TGCAGGTATCTGTTGGTGTCCCTGTTTT-3’(配列番号 90)
22TeT La R:5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’(配列番号 91)
22TeT Ra L:5’-AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGA-3’(配列番号 92)
22TeT Ra R:5’-CTGTCCTATCCTTGCAGCTGTCTTCCAG-3’(配列番号 93)
22CeT La L (前出)
22CeT La R (前出)
22CeT Ra L (前出)
22CeT Ra R (前出)
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
GNAZ L (前出)
GNAZ R (前出)
LIF L (前出)
LIF R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
SERPIND1 L (前出)
SERPIND1 R (前出)
Human cot-1 DNAおよびpMA-kD9FRTBsdをプローブにしてFISH解析を行う。高い割合で、ヒト22番染色体が1コピー保持され、さらにPGK5’HPRTFRTBsd由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるPGK5’HPRTFRTBsdを部位特異的挿入する前のヒト2番染色体上にはシグナルが検出されないことを確認し、部位特異的にPGK5’HPRTFRTBsdが挿入されたことを確認した(図33)。結果、22DT40 KL3F1-5#2-1、22DT40 KL3F2-1#1-2, #1-3の3クローンを以降の実験に用いた。
(MAC)への搭載(図34)
CHO内でCre/LoxPシステムを用いて、ヒト22番染色体領域をMACに転座クローニングする
ため、MACを保持するCHO細胞へ改変ヒト22番染色体を移入する。
ドナー細胞である改変ヒト22番染色体保持DT40を用いて、MACベクターを保持するCHO hprt欠損細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218)であるCHO(HPRT-)に微小核細胞融合法を行った。
薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、それらを鋳型として、CHO MAC細胞に改変ヒト22番染色体が移入されたかPCRを行った。
22CeT La L (前出)
22CeT La R (前出)
22CeT Ra L (前出)
22CeT Ra R (前出)
22TeT La L (前出)
22TeT La R (前出)
22TeT Ra L (前出)
22TeT Ra R (前出)
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
GNAZ L (前出)
GNAZ R (前出)
LIF L (前出)
LIF R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
SERPIND1 L (前出)
SERPIND1 R (前出)
PCR解析陽性クローンについて、Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行い、MACと改変ヒト22番染色体が独立して保持されている陽性細胞を選別した。解析の結果(図35)、CHO(MAC1)KL3F#2-2、CHO(MAC1)KL3F#3-1の2クローンを以降の実験に用いた。
Cre/LoxPシステムを用いてIGL領域を含むヒト22番染色体断片をMACへ転座させる。
MACにはloxPサイトが搭載されており、Cre組換え酵素存在下で改変ヒト22番染色体のloxPサイトと組換えが起こるようになっている。また、組換えが起こると副産物となるMACに載らないヒト22番染色体領域の5’HPRTと副産物となるMAC末端の3’HPRTが連結して、HPRT遺伝子の再構成が起こり、CHO(hprt-/-)はHAT耐性を獲得する。
HAT耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト22番染色体断片とMAC上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
22TeT La L (前出)
22TeT La R (前出)
22TeT Ra L (前出)
22TeT Ra R (前出)
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
GNAZ L (前出)
GNAZ R (前出)
LIF L (前出)
LIF R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
SERPIND1 L (前出)
SERPIND1 R (前出)
Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行い、MACと改変ヒト2番染色体が相互転座をおこしかつ、IGL領域がMACに搭載されたIGL-MAC、副産物が独立して保持されていることを確認した(図36)。結果、選別した2クローンの陽性細胞(CHO IGL-MACと命名する)について、以下の実験を行う。
作製したIGL-MACを、改変ヒト14番染色体を保持するCHO(hprt-/-)細胞株へ移入し、FRT/Flpシステムによる組換えを起こさせIGH領域をIGL-MACに搭載し、IGHL-MACを作製する(図37)。
[A.1] 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるCHO IGL-MACを細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行う。微小核(「ミクロセル」ともいう)を無血清DMEM培地に懸濁し、8μm, 5μm, 3μmフィルターにて精製する。精製後、ミクロセルをDMEMで調製した0.05mg/ml PHA-P(シグマ)溶液2mLに懸濁し、6cm細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるCHO hprt-/- 14FRT #3-17_8およびCHO hprt-/- 14FRT #3-17_14に、培養液を除いた後添加する。15分インキュベートして微小核をCHO細胞に張り付ける。その後、PEG1000 (Wako)溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地6mLに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を1mlで正確に1分融合する。 5mLの無血清DMEMでPEGを除去するために4回ウオッシュ操作を行った後、CHO培養液を添加する。24時間後、10cm細胞培養皿10枚に細胞を播種し、800μg/mL G418と8μg/mL Blasticidinを添加し、10日選択培養を行い、得られた薬剤耐性株について以降の解析を行う。
IGL-MACが改変ヒト14番染色体を保持するCHO(hprt-/-)株に移入されているか、改変ヒト14番染色体は維持されているかを確認するためにPCR解析を行う。以下に用いるプライマーを示す。
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
FRT挿入部位が維持されているか確認するためのプライマーを以下に示す。
22TeT La L (前出)
22TeT La R (前出)
22TeT Ra L (前出)
22TeT Ra R (前出)
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
GNAZ L (前出)
GNAZ R (前出)
LIF L (前出)
LIF R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
SERPIND1 L (前出)
SERPIND1 R (前出)
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
14TarC_La F (前出)
14TarC_La R (前出)
14TarC_Ra F (前出)
14TarC_Ra R (前出)
この結果を受けて、PCR陽性のクローンについて以降の実験を進める。
Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行い、IGL-MACと改変ヒト14番染色体が独立して、1コピーずつ維持されているクローンを確認する。陽性細胞(CHO #14 IGL-MACと命名)を選択し以降の実験を行う。
IGL-MACと改変ヒト14番染色体をFRT/Flpシステムで相互転座させることで、IGL-MAC上にヒト14番染色体由来IGH領域を転座クローニングし、IGHL-MACを構築する。
IGL-MAC上のFRTサイトと改変ヒト14番染色体上のFRTサイトを用いて、FLPo組換え酵素存在下で相互転座を起こさせる。また、組換えが起こるとIGHL-MAC上では、5’HPRTと3’HPRTが連結して、HPRT遺伝子の再構成が起こり、HAT耐性を獲得する。CHO #14 IGL-MACについて、10cm細胞培養皿においてコンフルエントになった時に18μgのFLP発現プラスミドをLipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)を用いてメーカーの手順を参照して加える。添加後6時間経過したら、培養液を交換し、24時間後に、10cm細胞培養皿10枚に播種し、1×HAT、8μg/mL Blasticidinで薬剤選択を行う。
得られたHAT耐性クローンを以降の解析に用いる。
FRT/FLPシステムを用いて期待した相互転座が起こり、IGHK-MACが構築されているか確認するため、薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、鋳型としてPCR解析を行った。用いたプライマーを以下に示す。
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
GNAZ L (前出)
GNAZ R (前出)
LIF L (前出)
LIF R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
ヒト14番染色体領域の確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
プローブとしてBACクローンCH17-95F2 (IGL領域)とCH17-262H11(IGH領域)およびCH17-424L4 (IGL領域)とCH17-212P11(IGH領域)の組み合わせを用いてtwo-color FISH解析を行い、実際IGHL-MACが構築されているか詳細に解析する。MAC上にそれぞれ、IGL領域とIGH領域の存在を示すシグナルが観察されたものを陽性とし、IGHL-MACが構築されていることを確認(CHO IGHL-MACと命名)しクローンを選別し以降の実験を行う。
IGHL-MACおよびIGHL-MAC構築のための相互転座の際に形成された副産物の両方にNeo耐性遺伝子がのっており、微小核細胞融合法で目的の細胞に移入した際、G418で薬剤選択するとIGHL-MACもしくは副産物がそれぞれあるいは両方移入された細胞を取得することになる。MAC上にはEGFPが搭載されているので、目的の細胞にIGHL-MACが移入されているか確認することが可能であるが、染色体導入が効率的に行えるドナー細胞でかつIGHL-MACのみを保持する細胞を作製するため。IGHL-MACをCHO K1細胞株に移入する。
染色体移入により、IGHL-MACのみを保持する細胞株を作製する。
ドナー細胞であるCHO IGHL-MACを細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20% FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行った。微小核(「ミクロセル」ともいう)を無血清DMEM培地に懸濁し、8μm, 5μm, 3μmフィルターにて精製する。精製後、ミクロセルをDMEMで調製した0.05mg/ml PHA-P(シグマ)溶液2mLに懸濁し、6cm細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるCHO K1細胞株に、培養液を除いた後添加する。15分インキュベートして微小核をCHO細胞に張り付ける。その後、PEG1000 (Wako)溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地6mLに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を1mlで正確に1分融合する。 5mLの無血清DMEMでPEGを除去するために4回ウオッシュ操作を行った後、CHO培養液を添加する。24時間後、10cm細胞培養皿10枚に細胞を播種し、800μg/mL G418を添加し、10日選択培養を行う。得られた薬剤耐性株について以降の解析を行う。
IGHL-MACがCHO K1細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、それを鋳型としてPCR解析を行った。用いたプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー:
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行い、IGHL-MACを1コピー独立して保持していることを確認する。
さらに、プローブとしてBACクローンCH17-95F2 (IGL領域)とCH17-262H11(IGH領域)およびCH17-424L4 (IGL領域)とCH17-212P11(IGH領域)の組み合わせを用いてtwo-color FISH解析を行い、IGHL-MACの構造を詳細に解析する。MAC上にそれぞれ、IGL領域とIGH領域の存在を示すシグナルが観察されたものを陽性(CHO K1 IGHL-MACと命名)として、以降の実験に用いる。
[A]マウスES細胞へのIGHL-MACの移入
ヒト抗体産生マウスを作製するためにはIGHL-MACをマウスES細胞に移入し、受精卵8細胞期にインジェクションし、キメラマウスを作製し、IGHL-MACを子孫伝達させることが必要である。
ドナー細胞は、CHO K1 IGHL-MACを用いる。実施例6[A.1]と同様の手法を用いて微小核細胞融合を行い、EGFP陽性かつ薬剤耐性株を取得し、以降の解析を行う。
IGHL-MACがマウスES細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、それを鋳型としてPCR解析を行う。用いるプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー:
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
ヒト14番染色体領域の確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行い、IGHL-MACのみを保持しており、マウスESの正常核型を維持していることを確認する。
ヒト抗体産生ラットを作製するためにはIGHL-MACをラットES細胞に移入し、受精卵8細胞期にインジェクションし、キメラマウスを作製し、IGHL-MACを子孫伝達させることが必要である。
実施例6[A.1]に記載のようにマウスES細胞への微小核細胞融合法と同様の手法を用いてラットES細胞へのIGHL-MACの導入を行う。ドナー細胞は、CHO K1 IGHL-MACを用いる。融合後、オーバーナイトでインキュベーションし、G418を150μg/mLになるように加え、3〜4週間選択培養する。結果GFP陽性かつ薬剤耐性のクローンを以降の解析に用いる。
IGHL-MACがラットES細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのDNAを抽出し、それを鋳型としてPCR解析を行う。用いたプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー:
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
ヒト14番染色体領域確認プライマー:
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
Human cot-1 DNAおよびMouse cot-1 DNAをプローブにしてFISH解析を行い、IGHL-MACを1コピー独立して保持しており、ラットESの正常核型(42本)を維持していることを確認する。プローブとしてBACクローンCH17-95F2 (IGL領域)とCH17-262H11(IGH領域)およびCH17-424L4 (IGL領域)とCH17-212P11(IGH領域)の組み合わせを用いてtwo-color FISH解析を行い、IGHL-MACの構造をさらに詳しく解析する。MAC上にそれぞれ、IGL領域とIGH領域の存在を示すシグナルが期待した位置に観察されたものを陽性細胞株(rESIGHL-MACと命名)とし、インジェクションに用いる。
IGHL-MACを保持するマウスおよびラットES細胞を用い、(実施例7)同様に操作を行うことで、IGHL-MACを保持した子孫伝達マウスおよび、ラットを作製することができる。子孫伝達マウス、ラットおよび過程で得られたキメラマウスについても、(実施例7)、(実施例12)同様に解析を行い、IGHL-MAC保持および抗体発現(hλも含む)を確認する。作製されたIGHL-MAC保持マウスおよびラット系統をそれぞれmTC(IGHL-MAC)、rTC(IGHL-MAC)と呼ぶ。
IGHK-MACおよびIGHL-MACを保持するマウスと、マウスIgh,およびIgk遺伝子が破壊されており、かつIgl変異を持つ(Iglの発現が低くなる変異を持つ)マウスを交配させ、ヒト抗体産生マウスを作製する。
ヒト抗体産生マウスを作製するため、マウス抗体遺伝子を欠損または低発現しているマウスを作製する。
HKD31(マウスIgh、Igkの遺伝子破壊が破壊されている)マウスESより得られたマウス系統と、マウスIgl低発現の変異を持つCD-1(ICR、チャールズリバーより購入)を交配して、IghおよびIgk遺伝子欠損、Igl低発現マウスを作製する。
CD-1由来のマウスIglc変異はPCR-RFLP解析により確認する。
mIglc1VnC L:5’-CCTCAGGTTGGGCAGGAAGA-3’(配列番号 94)
J3C1:5’-GACCTAGGAACAGTCAGCACGGG-3’(配列番号 95)
マウス抗体が発現消失およびほぼ発現していないことをフローサイトメトリー(FCM)解析およびELISAによって、評価する。
IGHK-MAC保持マウスもしくはIGHL-MAC保持マウスとマウスIghKO、IgkKO、Igl変異マウスを交配し、ヒト抗体産生マウスを作製する。
[B.1] FACS解析
IGHK-MACもしくはIGHL-MACを保持するB細胞の存在確認を目的としてフローサイトメトリー解析を行う。マウスCD45R(B220)に対する抗体を用いて、血液細胞を染色し、ヒトIGM、CD45R、GFP陽性の細胞を確認した。ヘパリンコートキャピラリ―を用いて、眼窩より採血し、ヘパリンPBSの入ったチューブに血液を移し、転倒混和して氷冷した。遠心2000rpm、3分、4℃、の後、上清除去後、各種抗体を添加し、4℃で30分反応させ、5%牛胎仔血清を添加したPBS(5%FBS/PBS)により洗浄した。最後の遠心後、ペレットに1.2%Dextran/生理食塩水を加え、タッピング後、室温で45分静置し、赤血球を自然沈降させた。上清を新しいチューブに移し、2000rpm、3分、4℃で遠心後上清除去し、ペレットに室温の溶血剤(0.17M NH4Cl)を加え、5分静置する。2000rpm、3分、4℃で遠心し、5%FBS/PBSで洗浄した後500μlの5%FBS/PBSで懸濁したものを解析サンプルとし、フローサイトメーターにより解析した。HKD mTC(IGHK-MAC)マウスについて、フローサイトメトリー解析を行った結果、末梢血リンパ球についてB220、GFP共陽性の細胞の存在が確認された。少なくともIGHK-MACが機能してヒトのIGH、特にIgMが発現していることが示唆された。
ヒト抗体遺伝子軽鎖、重鎖、各種アイソタイプ発現確認を目的として、ELISAにより測定する。(実施例7)[A.4]に記載した方法同様、マウスの抗体発現の有無確認も含め、マウス抗体(mγ、mμ、mκ、mλ)、ヒト抗体(hγ、hμ、hκ、hλ、hγ1、hγ2、hγ3、hγ4、hα、hε、hδ)の発現および血清中の濃度を測定する。
ヒト抗体産生マウス脾臓由来RNAからcDNAを合成し、ヒト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定を行う。(実施例7)[A.5]と同様に実施することで解析、評価できる。
ヒト抗体産生マウスについて、抗原特異的ヒト抗体産生応答が見られるかを評価する。
特許(国際公開番号WO98/37757)に記載されている方法同様にヒト抗体産生ハイブリドーマの取得ができる。
IGHK-MACおよびIGHL-MACを保持するラットと、ラットIgh, Igk, Iglが破壊されたKOラットを交配させ、ヒト抗体産生ラットを作製する。
[A.1]ヒト抗体産生ラットの作製
IGHK-MACもしくはIGHL-MACを保持したラット系統とラットIgh、Igκ、Igλ遺伝子が破壊されたラット系統を交配することで、ヒト抗体産生ラットを作製できる。
IGHK-MACもしくはIGHL-MACを保持するB細胞の確認を行う。(実施例14)[B.1]と同様の方法で実施し、抗体は抗ラットCD45R(B220)抗体を用い、溶血剤は0.15M NH4Clを用いる。
ELISAによるヒト抗体遺伝子軽鎖、重鎖、各種アイソタイプ発現確認を目的として、(実施例7)[A.4]]と同様に解析を行うことでヒト抗体産生を評価することができる。抗ラット免疫グロブリン抗体を用いてラット抗体(rγ、rμ、rκ、rλ)の発現も評価する。
上記の(実施例7)[A.5]と同様の方法を用いて、抗体遺伝子配列決定、解析、評価を行うことができる。
(実施例14)[A.6]の記載と同様に実施し、評価することができる。
(実施例14)[B.5]の記載と同様の方法で実施し、ヒト抗体産生ハイブリドーマの取得ができる。
Claims (14)
- ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHK-MAC)を含む非ヒト動物であって、該マウス人工染色体ベクターは、テロメア、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、第一のDNA配列挿入部位、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、第二のDNA配列挿入部位、及びセントロメアをこの順で含み、
該非ヒト動物はマウス又はラットであり、かつ、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ、非ヒト動物。 - ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHL-MAC)を含む非ヒト動物であって、該マウス人工染色体ベクターは、テロメア、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、第一のDNA配列挿入部位、ヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座、第二のDNA配列挿入部位、及びセントロメアをこの順で含み、
該非ヒト動物はマウス又はラットであり、かつ、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ、非ヒト動物。 - ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHK-MAC)と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHL-MAC)とを含む非ヒト動物であって、該マウス人工染色体ベクターは、テロメア、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、第一のDNA配列挿入部位、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座又はヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座、第二のDNA配列挿入部位、及びセントロメアをこの順で含み、
非ヒト動物はマウス又はラットであり、かつ、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ、非ヒト動物。 - ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHK-MAC)を含む非ヒト動物であって、該マウス人工染色体ベクターは、テロメア、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、第一のDNA配列挿入部位、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、第二のDNA配列挿入部位、及びセントロメアをこの順で含む、マウス又はラットである該非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ同種の非ヒト動物とを交配し、hIGHK-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ非ヒト動物を選択することを含む、請求項1に記載の非ヒト動物の作製方法。
- ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHL-MAC)を含む非ヒト動物であって、該マウス人工染色体ベクターは、テロメア、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、第一のDNA配列挿入部位、ヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座、第二のDNA配列挿入部位、及びセントロメアをこの順で含む、マウス又はラットである非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ同種の非ヒト動物とを交配し、hIGHL-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ非ヒト動物を選択することを含む、請求項2に記載の非ヒト動物の作製方法。
- ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHK-MAC)を含む非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター(hIGHL-MAC)を含む非ヒト動物を交配し、hIGHK-MAC及びhIGHL-MACを含む非ヒト動物を作製するステップであって、該マウス人工染色体ベクターは、テロメア、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、第一のDNA配列挿入部位、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座又はヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座、第二のDNA配列挿入部位、及びセントロメアをこの順で含むベクターであって、該非ヒト動物はマウス又はラットであるステップ、該作製された非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ遺伝子型である同種の非ヒト動物とを交配するステップ、並びに、hIGHK-MAC及びhIGHL-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ非ヒト動物を選択するステップを含む、請求項3に記載の非ヒト動物の作製方法。
- 請求項1記載の非ヒト動物と請求項2記載の非ヒト動物とを交配し、hIGHK-MAC及びhIGHL-MACを含み、かつ前記内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座が破壊もしくは欠損され、又は発現消失もしくは低発現の変異を持つ非ヒト動物を選択することを含む、請求項3に記載の非ヒト動物の作製方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の非ヒト動物に抗原物質を投与するステップ、該ヒト動物から該抗原物質と結合する産生されたヒト抗体を回収するステップを含む、ヒト抗体を製造する方法。
- 抗原物質は、細胞、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである、請求項8に記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の非ヒト動物に抗原物質を投与するステップ、該非ヒト動物から脾臓細胞を取り出すステップ、該脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマを作製するステップ、該ハイブリドーマから該抗原物質と結合する抗体を回収するステップを含む、ヒトモノクローナル抗体を製造する方法。
- 抗原物質は、細胞、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである、請求項10に記載の方法。
- ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座と、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座とを含むマウス人工染色体ベクター(hIGHK-MAC)であって、テロメア、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、第一のDNA配列挿入部位、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、第二のDNA配列挿入部位、及びセントロメアをこの順で含む、マウス人工染色体ベクター。
- ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座と、ヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座とを含むマウス人工染色体ベクター(hIGHL-MAC)であって、テロメア、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、第一のDNA配列挿入部位、ヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座、第二のDNA配列挿入部位、及びセントロメアをこの順で含む、マウス人工染色体ベクター。
- 請求項12及び13に記載のマウス人工染色体ベクターからなる群から選択される少なくとも1つのベクターを含む細胞。
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