JP2003501103A - 非同種スイッチ領域を介して、ヒト抗体の特定のアイソタイプを産生するためのトランスジェニック動物 - Google Patents

非同種スイッチ領域を介して、ヒト抗体の特定のアイソタイプを産生するためのトランスジェニック動物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、実質的に任意の所望の抗原での免疫化に応答して所望のアイソタイプのトランスジェニック動物における完全ヒト抗体を提供する。先の動物中のヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子は所望の重鎖アイソタイプをコードするエキソンを含むヒト定常領域遺伝子セグメントを含み、異なる重鎖アイソタイプの定常領域由来のスイッチ領域に作動可能に連結される。このさらなる定常領域セグメントはスイッチ領域およびヒト定常領域コードセグメントを含み、この定常領域コードセグメントは、スイッチ領域に作動可能に連結され、このスイッチ領域は、通常会合してしない。本発明の導入遺伝子において、非同種スイッチ領域は、定常領域コードセグメントとは異なる種由来のスイッチ領域であり得る。本発明のスイッチ領域および膜エキソンは、ヒトγ−２定常領域を含み得、そして分泌定常領域エキソンは、ヒトγ−１またはヒトγ−４定常領域由来であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発見［Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）］の四半世紀後
、それらの治療有用性は、最終的に現実化されつつある。モノクローナル抗体は
、いまや、移植、癌、感染性疾患、心血管疾患および炎症における治療薬として
認可されている。多くのモノクローナル抗体は、広い範囲の疾患徴候を処置する
ための後期段階の臨床試験中にある。結果として、ｍＡｂは、現在開発中の薬物
の最も大きなクラスのうちの１つを代表する。
【０００２】 ｍＡｂの有用性は、それらの複合体標的の特異的認識、続いてその標的への高
親和性結合から生じる。異なるＣHアイソタイプは異なるエフェクター機能を有
するので、ｍＡｂアイソタイプを所望のエフェクター機能に合わせることが望ま
しい。例えば、エフェクター機能を有する定常領域を有するｍＡｂ（例えば、ヒ
トＩｇＧ1）が、標的細胞に対して補体依存性細胞傷害性または抗体依存性細胞
傷害性を指向させるために使用され得る。あるいは、エフェクター機能を本質的
に欠損する定常領域を有するｍＡｂ（例えば、ヒトＩｇＧ2またはＩｇＧ4）が、
リガンドに結合し、そしてこのリガンドを中和することによるか、またはレセプ
ター結合部位をブロックすることによるかのいずれかにより、シグナル伝達をブ
ロックするために使用され得る。
【０００３】 モノクローナル抗体についての多くの治療適用は、慢性疾患（例えば、自己免
疫もしくは癌）については特に、繰り返し投与を必要とする。マウスは免疫化の
ために好都合であり、そしてほとんどのヒト抗原を異物として認識するので、治
療能を有するヒト標的に対するｍＡｂは、代表的には、マウス起源であった。し
かし、マウスｍＡｂは、ヒト治療薬として固有の欠点を有する。それらは、ｍＡ
ｂの治療レベルを維持するためにより頻繁な投薬を必要とする。なぜなら、これ
は、ヒトにおいてヒト抗体よりも短い循環半減期であるからである。より批判的
には、マウス免疫グロブリンの繰り返し投与により、ヒト免疫系がマウスタンパ
ク質を異物として認識し、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を生じる可能性が
生まれる。よくても、ＨＡＭＡ応答は、繰り返し投与の際にマウス抗体の迅速な
クリアランスを生じ、治療薬を無用のものとする。ＨＡＭＡ応答は、重篤なアレ
ルギー性反応を引き起こし得るとも、より考えられる。効力および安全性を減じ
るこの可能性により、マウスｍＡｂの免疫原性を減少させるための多数の技術の
開発に至った。
【０００４】 マウスで生成された抗体の免疫原性を減少させるために、ヒト化として今や公
知であるプロセスにおいてマウスタンパク質配列をヒトタンパク質と置換する種
々の試みがなされた。第一のヒト化試みは、組換え抗体を構築するために分子生
物学技術を利用した。例えば、ハプテンに特異的なマウス抗体由来の相補性決定
領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体フレームワークに移植されて、ＣＤＲ置換物を生じ
た。新規な抗体は、ＣＤＲ配列により運搬される結合特異性を保持した。［Ｐ．
Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）を参照
のこと］。ヒト化の次のレベルは、ヒト定常領域（例えば、γ１）とマウスＶＨ
領域全体（ＨｕＶｎｐ）とを組み合わせることを包含した。［Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１，ｐｐ．６８５１
−６８５５（１９８４）を参照のこと］。このようなキメラ抗体は、３０％より
多くの異種配列をなお含むが、これは、時には、全体的に異種の抗体と比べて、
わずかに免疫原性が低いだけである。［Ｍ．Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，１７０，ｐｐ．２１５３−２１５７（１９８９）］。
【０００５】 続いて、ヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスに導入し、これによりヒト配列を
有する抗体を用いて抗原に対して応答し得るトランスジェニックマウスを作出す
る試みが行われた。［Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６７０９−６７１３（１９８９）を参照のこと］。
これらの試みは、利用可能なクローニングビヒクルによって安定に維持され得る
ＤＮＡの量によって制限されると考えられた。結果として、多くの研究者らは、
限定数のＶ領域遺伝子を含むミニ遺伝子座を生成すること、および天然または生
殖細胞の配置に対して比較されるように遺伝子間で空間的間隔を変化させること
に集中した。［米国特許第５，５６９，８２５号（Ｌｏｎｂｅｒｇら）（１９９
６）を参照のこと］。これらの研究は、マウスにおいてヒト配列抗体を生成する
ことが可能であるが、しかし抗体治療薬についての要求の増大を満たすために、
これらのトランスジェニック動物から結合特異性およびエフェクター機能（アイ
ソタイプ）の十分な多様性を得ることに関して重大な障害が残ることを示した。 さらなる多様性を提供するために、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな生殖細胞フラグ
メントをトランスジェニック哺乳動物に付加する研究が、実施されている。例え
ば、ヒトゲノムの再配置されていない生殖細胞ならびにヒトＣμおよびＣδ定常
領域において見出される同じ間隔で配置されるヒトＶ、Ｄ、およびＪ領域遺伝子
の大部分が、酵母人工染色体（ＹＡＣ）クローニングベクターを用いてマウスに
導入された。［ＰＣＴ特許出願ＷＯ９４／０２６０２（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔ
ｉら）を参照のこと］。ヒトγ−２定常領域をコードする配列およびクラススイ
ッチ組換えに必要な上流配列を含む２２ｋｂのＤＮＡフラグメントが、前述の導
入遺伝子に対して後の方に付加された。さらに、ヒトゲノムの再配置されていな
い生殖細胞で見出される続けて同じ間隔でまた配置されるＶκ、Ｊκ、およびＣ κ 領域遺伝子を含むヒトκ遺伝子座の一部が、ＹＡＣを用いてマウスに導入され
た。遺伝子標的化が、マウスＩｇＨおよびκ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を不活
性化するために使用され、そしてこのようなノックアウト株が上記トランスジェ
ニック株と交配され、ヒトＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃμ、Ｃδ、およびＣγ２定常領域、な
らびに全てが不活性化マウス免疫グロブリンバックグラウンド上にあるヒトＶκ 、Ｊκ、およびＣκ領域遺伝子を有するマウスの系統を生成した。［ＰＣＴ特許
出願ＷＯ９４／０２６０２（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）を参照のこと；Ｍｅ
ｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９
７）もまた参照のこと］。
【０００６】 内因性遺伝子座の遺伝子標的化およびトランスジェニック株の交配と組み合わ
せたクローニングベクターとしての酵母人工染色体は、抗体多様性の問題に対す
る１つの解決を提供した。いくつかの利点が、このアプローチによって得られた
。１つの利点は、ＹＡＣが数百キロ塩基のＤＮＡを宿主細胞に移入するために使
用され得ることであった。従って、ＹＡＣクローニングビヒクルの使用は、ヒト
Ｉｇ重鎖領域および軽鎖領域全体の実質的な部分をトランスジェニック動物に含
ませ、これにより、ヒトにおいて利用可能な潜在的多様性のレベルを達成するこ
とを可能にする。このアプローチの別の利点は、多数のＶ遺伝子が、マウス免疫
グロブリン産生が不足したマウスにおいて全Ｂ細胞発達を回復することを示した
ことである。このことは、これらの再構成マウスが、任意の所定の免疫原に対す
るげっ歯類ヒト抗体応答を惹起させるために必須の細胞を提供されることを確実
にする。［ＰＣＴ特許出願ＷＯ９４／０２６０２（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら
）；Ｌ．ＧｒｅｅｎおよびＡ．Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと］。さらなる利点は、配列が、
酵母において高頻度の相同組換えを利用することにより欠失され得るか、または
ＹＡＣに挿入され得ることである。これは、ＹＡＣ導入遺伝子の容易な操作を提
供する。
【０００７】 上述のように、ヒト抗体を生成する哺乳動物の生成のために存在するいくつか
のストラテジーがある。特に、「ミニ遺伝子座」アプローチ（ＧｅｎＰｈａｒｍ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．およびＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌの研究によって代表される）、Ｉｇ遺伝子座の大きくかつ
実質的に生殖細胞のフラグメントのＹＡＣ導入（Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．（
旧Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ）の研究によって代表される）、ならびに微細胞（
ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）融合の使用を介する全体または実質的に全体の遺伝子座の
導入（キリンビール株式会社の研究によって代表されるような）がある。
【０００８】 最少座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）アプローチにおいて、内因性Ｉｇ座が、そのＩ
ｇ座由来の断片（個々の遺伝子）の封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を介して模倣さ
れる。従って、１つ以上のＶH遺伝子、１つ以上のＤH、１つ以上のＪH遺伝子、
ｍｕ定常領域、および第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物への挿
入のための構築物に形成される。このアプローチは、以下において記載され、以
下の研究に関連される：米国特許第５，５４５，８０７号（Ｓｕｒａｎｉら）、
ならびに米国特許第５，５４５，８０６５号、同第５，６２５，８２５号、同第
５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号
、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、および同第５，８１
４，３１８号（ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの各々）、米国特許第５，５９１，
６６９号（ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓ）、米国特許第５，６１２
，２０５号、同第５，７２１，３６７号、同第５，７８９，２１５号（Ｂｅｒｎ
ｓら）、ならびに米国特許第５，６４３，７６３号（ＣｈｏｉおよびＤｕｎｎ）
、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ米国特許出願番号０
７／５７４，７４８（１９９０年、８月２９日出願）、同０７／５７５，９６２
（１９９０年８月３１日出願）、同０７／８１０，２７９（１９９１年１２月１
７日出願）、同０７／８５３，４０８（１９９２年３月１８日出願）、同０７／
９０４，０６８（１９９２年６月２３日出願）、同０７／９９０，８６０（１９
９２年１２月１６日出願）、同０８／０５３，１３１（１９９３年４月２６日出
願）、０８／０９６，７６２（１９９３年７月２２日出願）、０８／１５５，３
０１（１９９３年１１月１８日出願）、０８／１６１，７３９（１９９３年１２
月３日出願）、０８／１６５，６９９（１９９３年１２月１０日出願）、０８／
２０９，７４１（１９９４年３月９日出願）（これらの開示が本明細書中により
参考として援用される）。また、欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１、国際特
許出願番号ＷＯ ９２／０３９１８、同ＷＯ ９２／２２６４５、同ＷＯ ９２
／２２６４７、同ＷＯ ９２／２２６７０、同ＷＯ ９３／１２２２７、同ＷＯ
９４／００５６９、同ＷＯ ９４／２５５８５、ＷＯ ９６／１４４３６、同
ＷＯ ９７／１３８５２、および同ＷＯ ９８／２４８８４を参照のこと（これ
らの開示は、その全体が本明細書により参考として援用される）。さらに、Ｔａ
ｙｌｏｒら、「Ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅ
ｓｓｅｓ ａ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈ
ｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ
」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５
（１９９２）、Ｃｈｅｎら、「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅ
ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｂ−ｃｅｌｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔ
ｈｅ ＪH ｌｏｃｕｓ」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
５：６４７−６５６（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ＤＪH ｒｅａｒｒａｎｇ
ｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｔｒａ
ｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４５３
−６４６５（１９９５）、Ｃｈｏｉら、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｃ
ｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏ
ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ａ ｙ
ｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ａｎｔ
ｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ
ｍｉｃｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｆｏｕｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅｔｉ
ｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６−８５９（
１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら、「Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｕｎｄｅｒｇｏ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ，ｓｏｍ
ａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｉｎ
ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ｌａｃｋ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＩｇＭ」Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６： ５７９−５９１（１９９４）
、Ｔｕａｉｌｌｏｎら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｉ
ｎｖｅｒｔｅｄ ＤＪF ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａ
ｎ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｎｉｌｏｃｕ
ｓ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４５３−６４６５（１９９５）、およびＦ
ｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａ
ｉｎ ｏｆ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ」Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：８４５−８５１（１９９６）を参照のこと（これ
らの開示は、それらの全体が本明細書により参考として援用される）。
【０００９】 ＹＡＣ導入と関連して、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７
：１３−２１（１９９４）は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の、それ
ぞれの２４５ｋｂおよび１９０ｋｂのサイズの生殖系列構造（ｃｏｎｆｉｇｕｒ
ａｔｉｏｎ）フラグメントを含むＹＡＣの生成（これはコア可変領域配列および
コア定常領域配列を含んでいた）を記載する（同上）。Ｇｒｅｅｎらの研究は、
メガべースの大きさの、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座のそれぞれの生
殖系列構造ＹＡＣフラグメントの導入を介して、およそ８０％を越えるヒト抗体
レパートリーの導入に及び、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅTMマウスを産生した。Ｍｅｎｄ
ｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）
ら、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４
８３−４９５（１９９８）、および米国特許出願番号０８／７５９，６２０（１
９９６年１２月３日出願）を参照のこと（この開示が参考として本明細書に参考
として援用される）。このようなアプローチは、さらに以下で議論され、そして
描写される（ｄｅｌｉｎｅａｔｅｄ）：米国特許出願番号０７／４６６，００８
（１９９０年１月１２日出願）、同０７／６１０，５１５（１９９０年１１月８
日出願）、同０７／９１９，２９７（１９９２年７月２４日出願）、同０７／９
２２，６４９（１９９２年７月３０日出願）、同０８／０３１，８０１（１９９
３年３月１５日出願）、同０８／１１２，８４８（１９９３年８月２７日出願）
、同０８／２３４，１４５（１９９４年４月２８日出願）、同０８／３７６，２
７９（１９９５年１月２０日出願）、同０８／４３０，９３８（１９９５年４月
２７日出願）、同０８／４６４，５８４（１９９５年６月５日出願）、同０８／
４６４，５８２（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６３，１９１（１９９
５年６月５日出願）、同０８／４６２，８３７（１９９５年６月５日出願）、０
８／４８６，８５３（１９９５年６月５日出願）、同０８／４８６，８５７（１
９９５年６月５日出願）、同０８／４８６，８５９（１９９５年６月５日出願）
、同０８／４６２，５１３（１９９５年６月５日出願）、同０８／７２４，７５
２（１９９６年１０月２日出願）、および同０８／７５９，６２０（１９９６年
１２月３日出願）。また、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１５：１４６−１５６（１９９７）ならびにＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉ
ｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと
。また、欧州特許第ＥＰ ０ ４６３ １５１ Ｂ１（１９９６年６月１２日特
許公報公開）、国際特許出願番号ＷＯ ９４／０２６０２（１９９４年２月３日
公開）、国際特許出願番号ＷＯ ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公
開）、およびＷＯ ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）も参照のこ
と。上記引用される特許、出願、および参考文献の各々の開示は、それらの全体
が本明細書に参考として援用される。
【００１０】 微小核体融合アプローチと関連して、ヒト染色体の一部または全体が、欧州特
許出願番号ＥＰ ０ ８４３ ９６１ Ａ１（この開示が本明細書に参考として
援用される）に記載されるように、マウスに導入され得る。このアプローチを使
用して、かつヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含むマウスは、一般に、１つより多く、か
つ潜在的に全てのヒト定常領域遺伝子を保有する。従って、このようなマウスは
、多数の異なる定常領域を有する特定の抗原に結合する抗体を産生する。従って
、特定のエフェクター機能について所望の定常領域を予め選択する方法は存在し
ない。
【００１１】 また、トランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）は、有糸分裂およ
び無糸分裂で不安定である。結果として、ヒトＩｇＨ、ヒトＩｇΚまたは両方の
トランス染色体のいずれかは、８０％に近い頻度で失われる。これは、マウスＩ
ｇλ ｍＡｂおよびハイブリドーマ不安定性の異常に高い回復を生じる。
【００１２】 抗体の、インビトロでのアイソタイプスイッチについての技術が存在する。Ｉ
ｇＧ１アイソタイプのみを産生するトランスジェニックマウスから産生される抗
体、複数のＩｇＧアイソタイプを産生するトランスジェニックマウスから産生さ
れる抗体、またはファージディスプレイ技術から産生される抗体が、所望の抗原
特異性および親和性を有し得るが、所望のエフェクター機能を有し得ない。この
場合において、少なくとも、重鎖の可変領域、および最もあり得るのが抗体の軽
鎖全体が、クローン化されなければならない。
【００１３】 クローニングのための方法は、ライブラリーからのゲノムＤＮＡの回復、ライ
ブラリーからのｃＤＮＡの回復、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用
したゲノムＤＮＡの回復、ならびに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよ
び鋳型としてｃＤＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用するＰＣＲを含む。各方法（特に
、ＰＣＲに基づく方法）は、クローンが、抗体コード配列の信頼できる複製を確
認するために配列決定されることを要する。次いで、重鎖の可変領域は、ＤＮＡ
連結を介して、所望の定常領域遺伝子に作動可能に連結されなければならない。
次いで、操作されたＶＨ−ＣＨ遺伝子は、発現制御領域（例えば、プロモーター
エンハンサーおよびポリアデニル化部位）に作動可能に連結されなければならな
い。このような発現構築物はまた、抗体のＩｇ軽鎖のために必要とされ得る。
【００１４】 発現構築物は、操作されたｍＡｂの分泌形態を産生するために、転写および翻
訳のために適切な宿主細胞中に安定にトランスフェクトされなければならない。
代表的に、少なくとも、広範なスクリーニングが、さらなる実験および後の製造
のために、十分なレベルのｍＡｂを発現する細胞株のクローンを見出すために、
実施されなければならない。おそらく、ＤＮＡ増幅のような方法論は、上昇され
た、抗体発現構築物のコピー数、およびその結果の、ｍＡｂの発現レベルに対し
て使用されなければならない。
【００１５】 最終的に、再操作されたｍＡｂは、それが、所望の質を保持し、そして所望の
機能（特異性、親和性、およびエフェクター機能の存在または非存在を含む）を
有することを確認するために試験されなければならない。アイソタイプの切り換
えのための他の技術が存在するが、ｍＡｂアイソタイプを再操作するためのこの
ような全てのプログラムは、分子生物学および組織培養における実験法および専
門知識を必要とし、そして労働集約型で、遅く、高価であり、そして発行され、
係属する知的所有権により包含され、たとえライセンスが利用可能でも、追加の
費用を必要とする。従って、あるアイソタイプから別のアイソタイプへのｍＡｂ
の再操作は、専門知識、過度の金銭の出費を必要とし、そして前臨床および臨床
試験のためのモノクローナル抗体の開発を遅らせる。
【００１６】 所望のＣγアイソタイプを有するｍＡｂを産生する技術を有することは、抗体
を再操作するための必要性を経験的に取り除く。３つの異なるＸｅｎｏＭｏｕｓ
ｅ系統（各々は、Ｃγ２、Ｃγ４、またはＣγ１のみを作製し得る）を有するこ
とによって、トランスジェニックマウスは、棚（ｓｈｅｌｆ）から引き抜かれ得
、次いで、所望の親和性、抗原特異性および所望のアイソタイプを有するｍＡｂ
ならびに所望のエフェクター機能を先験的に有するｍＡｂを産生するために免疫
化され得る。これは、モノクローナル抗体ベースの治療の開発のための効率およ
びユーザー親睦を増加させる。分子生物学または抗体操作における専門知識は必
要とされない。抗原特異的ｍＡｂは、莫大なお金と時間の出費を伴わずに、予備
臨床研究に直接必要とされ得、これは、開発コストを減少させ、そして治療ｍＡ
ｂの開発のためのタイムライン（ｔｉｍｅ ｌｉｎｅ）を加速させる。
【００１７】 本発明は、所望の特異性に加えて、抗体を使用する治療目的に適合するトラン
スジェニックマウスから、予め選択されたヒト抗体アイソタイプを入手する問題
を解決することに関する。
【００１８】 （発明の要旨） 本発明は、本発明の１つの局面において、任意の実質的に所望される抗原を用
いる免疫化に応じて所望のアイソタイプの高い親和性の完全なヒト抗体を産生し
得るトランスジェニック非ヒト動物を提供することによって、上記に言及される
問題を解決する。上述のトランスジェニック非ヒト動物は、それらの体細胞およ
び生殖細胞系列において、再配列の際に、所望のアイソタイプの完全なヒト免疫
グロブリン重鎖をコードする再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖導入遺
伝子を有する。
【００１９】 上述の動物におけるヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子は、所望の重鎖アイソ
タイプをコードするエキソンを含むヒト定常領域遺伝子セグメントを含み、異な
る重鎖アイソタイプ（すなわち、非同種スイッチ領域）の定常領域に由来するス
イッチセグメントに作動可能に連結される。
【００２０】 上述のトランスジェニック非ヒト動物はまた、その体細胞および生殖細胞系列
において、ヒト免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子を有する。好ましい実施形態にお
いて、トランスジェニック非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺
伝子座は、非活性化され、その結果、その動物は、内因性の重鎖または軽鎖を産
生し得ない。特に好ましい実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は
マウスである。
【００２１】 別の局面において、本発明は、再配列の際に、所望のアイソタイプのヒト重鎖
をコードする、再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子を提供す
る。本発明の導入遺伝子は、少なくとも、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第
１のＤセグメント遺伝子から始まり、Ｊセグメント遺伝子およびその遺伝子座の
Ｃμを通って定常領域遺伝子までずっと続くヒト第１４染色体のＤＮＡ配列と同
一であるＤＮＡ配列を含む。本発明の導入遺伝子において、上述のＤＮＡフラグ
メントは、さらなる定常領域セグメントに作動可能に連結されて、そしてさらな
る定常領域セグメントへのアイソタイプスイッチを可能にする。このさらなる定
常領域セグメントは、スイッチ領域コードセグメントおよびヒト定常領域コード
セグメントを含み、ここで、この定常領域コードセグメントは、それが正常に結
合されないスイッチ領域（すなわち、非同種スイッチ領域）に作動可能に連結さ
れる。本発明の導入遺伝子において、上述のＤＮＡフラグメントおよび定常領域
セグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子と作動可能に連結され
る。本発明の１つの実施形態において、導入遺伝子は、酵母人工染色体（ＹＡＣ
）である。
【００２２】 本発明の導入遺伝子において、非同種スイッチ領域は、その定常領域コードセ
グメントとは異なる種に由来するスイッチ領域であり得る。１つの実施形態にお
いて、非同種スイッチ領域は、ヒトγ、αまたはε定常領域をコードするヒト定
常領域コードセグメントに作動可能に連結されたマウススイッチ領域である。好
ましい実施形態において、このスイッチ領域は、マウスγ−１スイッチ領域であ
る。より好ましい実施形態において、このスイッチ領域は、マウスγ−１スイッ
チ領域であり、そしてヒト定常領域コードセグメントは、γ−１またはγ−４定
常領域をコードする。特に好ましい実施形態において、この導入遺伝子は、ｙＨ
２Ｂｍ酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはｙＨ２ＣｍＹＡＣである。
【００２３】 別の実施形態において、その非同種スイッチ領域および定常領域コードセグメ
ントの両方は、ヒト配列であり、非同種スイッチ領域は、定常領域コードセグメ
ントとは異なるアイソタイプのヒト定常領域に由来する。好ましい実施形態にお
いて、スイッチ領域は、ヒトγ−２スイッチ領域および定常領域コードセグメン
トは、γ−２以外のアイソタイプである。より好ましい実施形態において、本発
明の導入遺伝子は、ヒトγ−２スイッチ領域およびヒトγ−１またはヒトγ−４
定常領域コードセグメントを含む。特に好ましい実施形態において、その導入遺
伝子は、ｙＨＧ１ ＹＡＣまたはｙＨＧ４ ＹＡＣである。
【００２４】 さらなる別の実施形態において、本発明の導入遺伝子は、ヒト非同種スイッチ
領域およびヒト定常領域コードセグメントを含み、ここで、そのスイッチ領域お
よび定常領域コードセグメントの膜エキソンは、同じヒト定常領域アイソタイプ
に由来し、そして分泌された定常領域エキソンは、異なるアイソタイプに由来す
る。本発明の導入遺伝子はまた、ヒト非同種スイッチ領域およびヒト定常領域コ
ードセグメントを含み得、ここでそのスイッチ領域は、１つのアイソタイプに由
来し、分泌された定常領域エキソンは、第２のアイソタイプに由来し、そして膜
定常領域エキソンは、さらに第３のアイソタイプに由来する。
【００２５】 好ましい実施形態において、このスイッチ領域および膜エキソンは、ヒトγ−
２定常領域に由来する。特に好ましい実施形態において、スイッチ領域および膜
エキソンは、ヒトγ−２定常領域に由来し、そして分泌された定常領域エキソン
は、ヒトγ−１またはヒトγー４定常領域に由来する。好ましい実施形態におい
て、この導入遺伝子は、ｙＨＧ１／２ＹＡＣまたはｙＨＧ４／２ＹＡＣである。
【００２６】 別の実施形態において、本発明の任意の前述の導入遺伝子は、複数の異なるヒ
トＶＨ遺伝子を含む。好ましい実施形態において、導入遺伝子は、少なくとも５
０％のヒト生殖系列ＶＨ遺伝子を含む。別の実施形態において、この導入遺伝子
は、少なくとも４０の異なるヒトＶＨ遺伝子を含む。好ましくは、この導入遺伝
子は、少なくとも６６の異なるヒトＶＨ遺伝子を含む。最も好ましくは、この導
入遺伝子は、ヒト重鎖遺伝子座のヒトＶＨ領域全体を含む。別の実施形態におい
て、導入遺伝子は、十分な数の異なるヒトＶＨ遺伝子を含み、その結果、その導
入遺伝子は、接合部の多様性または体細胞変異事象を考慮せずに、少なくとも１
×１０5の異なる機能的ヒト免疫グロブリン重鎖配列の組み合わせをコードし得
る。さらなる別の実施形態において、その導入遺伝子におけるヒトＶＨ遺伝子の
数は、この導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおける野生型マウスの
Ｂ細胞集団の少なくとも５０％を産生するのに十分である。
【００２７】 本発明の導入遺伝子は、マウス３’エンハンサー（非同種スイッチ領域を含む
定常領域の３’に位置する）をさらに含む。１つの実施形態において、このマウ
ス３’エンハンサーは、およそ０．９ｋｂコア領域のネイティブエンハンサーで
ある。代替的実施形態において、その３’エンハンサーは、そのコア領域を含む
およそ４ｋｂ領域のマウスエンハンサーである。さらなる別の実施形態において
、その導入遺伝子は、マウス主要エンハンサー遺伝子座を含む。
【００２８】 別の局面において、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を作製
するための方法を提供する。その方法に従って、再配列されていないヒト免疫グ
ロブリン重鎖導入遺伝子は、その体細胞および生殖細胞系列に導入遺伝子を有す
るトランスジェニック非ヒト動物を作製するために、非ヒト動物の生殖系列に導
入される。ヒト重鎖トランスジェニック動物をヒト免疫グロブリン軽鎖導入遺伝
子を含むトランスジェニック非ヒト動物と交配することは、本発明のヒト重鎖導
入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物を産生
する。上述のトランスジェニック非ヒト動物のいずれかが、完全なヒト抗体を産
生し、そして内因性抗体を産生し得ないトランスジェニック非ヒト動物を作製す
るために、不活性化された重鎖遺伝子座および／または軽鎖遺伝子座を有する動
物と交配され得る。
【００２９】 １つの実施形態において、本発明の導入遺伝子が、胚性幹（ＥＳ）細胞内に導
入され、次いで胚盤胞に挿入される。次いで、本発明の導入遺伝子を含むＥＳ細
胞を有する胚盤胞が、キメラ非ヒト動物を作製するために非ヒト動物の子宮内に
外科的に挿入される。キメラ動物を交配させて、本発明の導入遺伝子の生殖系列
伝達を達成させ、本発明の導入遺伝子を含む体細胞および生殖細胞系列を有する
トランスジェニック、非ヒト動物を作製する。従って、本発明のさらなる局面は
、本発明の導入遺伝子を含むＥＳ細胞およびその細胞のいくつかまたは全てにお
いて導入遺伝子を有する非ヒト動物である。
【００３０】 さらなる別の局面において、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動
物における目的の抗原に特異的な高い親和性の完全なヒト抗体の所望のアイソタ
イプを産生するための方法を提供する。本発明に従って、本発明のトランスジェ
ニック非ヒト動物を、その動物のＢ細胞による抗体の産生を誘導する条件下にお
いて、目的の抗原と接触させる。所望のアイソタイプの高い親和性の完全なヒト
抗原特異的抗体は、トランスジェニック非ヒト動物の血流から収集され得る。
【００３１】 あるいは、本発明の方法に従って、抗体産生Ｂ細胞が、動物から収集され得、
そして抗体の連続的産生のために当該分野で公知の任意の手段によって不死化さ
れ得る。１つの実施形態において、Ｂ細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合して、抗
体分泌ハイブリドーマを作製する。そのようなハイブリドーマをスクリーニング
し、高い親和性の完全なヒト抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマを選択し
得る。
【００３２】 さらなる局面において、本発明は、本発明のトランスジェニック動物から収集
された抗体産生Ｂ細胞に由来するハイブリドーマを提供する。
【００３３】 本発明の抗体はまた、所望の抗体を発現するＢ細胞の発現によるもの、クロー
ン化されたヒト免疫グロブリン遺伝子によるもの、ファージディスプレイによる
もの、または当該分野において公知の任意の他の方法によるものであり得る。
【００３４】 （発明の詳細な説明） 本発明は、所望のアイソタイプのヒト免疫グロブリン重鎖の産生のための新規
な導入遺伝子、および胚性幹（ＥＳ）細胞ならびに導入遺伝子を含むトランスジ
ェニック非ヒト動物に関する。本発明はまた、そのようなトランスジェニック非
ヒト動物を作製するための方法および本発明のトランスジェニック動物において
目的の抗原に応じて所望のアイソタイプの完全ヒト抗原を産生するための方法に
関する。
【００３５】 本発明の導入遺伝子およびトランスジェニック非ヒト動物は、種々のアイソタ
イプまたはクラスの完全ヒト抗体の産生の際に有用である。そのような抗体の治
療的使用のために、個々の抗体アイソタイプの異なるエフェクター機能は、特定
のアイソタイプの使用が所望の治療効果を達成することを可能にする。従って、
目的の抗原で免疫化した後に、単一アイソタイプの抗体を産生するトランスジェ
ニック非ヒト動物の系統を作製することが所望される。
【００３６】 本明細書中に記載される本発明がより完全に理解され得るために、以下の詳細
な説明が示される。その説明において、以下の用語が使用される： （遺伝子領域）−特定のポリペプチド鎖を産生するか、または選択する際に関
与するＤＮＡ；プロモーター、エンハンサー、定常遺伝子の前にある任意のスイ
ッチ領域ならびに前述のコード領域および後述のコード領域の上流および下流、
および介在配列（例えば、コードセグメントまたはエキソン間のイントロン）を
含む。
【００３７】 （遺伝子セグメント）−多エキソン遺伝子（例えば、免疫グロブリン重鎖定常
領域）におけるコードセグメント。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖γ定常領域
の分泌化形態についての遺伝子は、４遺伝子セグメント：ＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、
およびＣＨ３を含む。
【００３８】 （生殖系列構造）−任意の体細胞遺伝子再配置が生じる前の、免疫グロブリン
遺伝子セグメントの配列および間隔。
【００３９】 （クレノウフラグメント）−酵素ポリメラーゼＩの大きなフラグメント（通常
、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する）。このフラグメントは、いずれの５’〜３’エキソ
ヌクレアーゼ活性も含まず、そしてポリメラーゼ活性のみを有する。それは、平
滑末端を生成するために、ＤＮＡ分子の末端充填のために使用され得る。
【００４０】 （ライブラリー）−ＤＮＡベースのベクター（例えば、細菌におけるプラスミ
ド、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるλバクテリオファージ、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰ１バ
クテリオファージ、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細菌人工染色体、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける酵母人工染色体、培養細胞における哺
乳動物人工染色体、体細胞ハイブリッドにおける哺乳動物染色体フラグメント）
上で通常に増殖されるクローン化されたＤＮＡフラグメントの混合物。
【００４１】 （リンカー）−制限部位およびより大きなＤＮＡ分子に付加され得る他の特性
（例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントのクローニング
を促進させることおよび／または所望のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグ
メントの部分の戻し組込み（ｂｕｉｌｄ ｂａｃｋ）をすること）を含むように
設計される合成ＤＮＡフラグメント。
【００４２】 （ライブラリーのスクリーニング）−ライブラリーにおいて、クローン化され
たＤＮＡの特定の配列について検索するプロセス。
【００４３】 （無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）の転写物）−必要とされる体細胞遺伝子セグメント
再配置またはクラススイッチ組換えに翻訳されないと考えられるＩｇ遺伝子座か
ら産生される転写物。ＩｇＭを産生するＢ細胞またはプレＢ細胞において、例え
ば、細胞がどのアイソタイプにスイッチ、そして産生するかを潜在的に示唆する
ＣＨ遺伝子に対応する生殖系列ｍＲＮＡ転写物が存在し得る。
【００４４】 （ベクター）−外来ＤＮＡを宿主に輸送するために使用されるＤＮＡ分子およ
びその宿主内で複製されるＤＮＡ分子、その宿主を形質転換するために使用され
るＤＮＡ分子。入手可能なベクターとしては、ウイルス（原核生物および真核生
物）、細菌プラスミドまたは人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない
。
【００４５】 （酵母人工染色体（ＹＡＣＳ））−酵母染色体のエレメントから構成されるク
ローニングビヒクルであり、これは、ベクターがインビボで酵母細胞において複
製されて、そして維持されることを可能にする。酵母エレメントとしては、動原
体、自律増殖（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）配列、一対の
末端小粒、酵母選択マーカー、および通常の細菌複製起点ならびに細菌における
ＹＡＣベクターアームの複製および選択のための選択マーカーが挙げられる。少
なくとも２０００ｋｂまでのＤＮＡインサートが、ＹＡＣを使用して、クローン
化され、そして維持され得る。
【００４６】 （ＸＥＮＯＭＯＵＳＥの発生） ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、マウスＩｇＨ遺伝子座およびＩｇκ遺伝子座を不活性
化しており、そして機能的メガベースサイズのヒトＩｇＨおよびＩｇκ導入遺伝
子について遺伝子組換えされたマウスである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの作製および
特徴付けが記載されている［Ｍｅｎｄｅｚら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６：２９４
−３０７（１９９５）；Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１
５、１４６−１５６頁（１９９７）；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）；国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２、Ｋ
ｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、１９９４年２月３日公開を参照のこと］。より詳細
には、マウス胚性幹細胞における相同組換え、次に、変異の生殖系列伝達そして
引続く両方の不活性化された遺伝子座についてホモ接合性であるマウス（ＤＩマ
ウス）を作製するための交配によって、マウスＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座の重
要なエレメントの欠失が存在している。そのようなマウスは、マウスＩｇＨ鎖お
よびＩｇκ鎖を作製し得ず、そして骨髄におけるＢ細胞発生をｐｒｏＢ／ｐｒｅ
Ｂ−Ｉ段階にて停止させることを示す。[Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、７、１３−２１頁（１９９４）；ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖ
ｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：４８３（１９８８）]。ヒトＩｇＨお
よびＩｇκ遺伝子座（酵母人工染色体上にクローン化されている）を、酵母スフ
ェロプラスト−ＥＳ細胞融合を介してＥＳ細胞内に導入した[Ｊａｋｏｂｏｖｉ
ｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）]。生殖系列伝達
そして引続くＤＩバックグランドへの交配後、ヒトＩｇＨおよびＩｇκ ＹＡＣ
導入遺伝子（ｙＨ１ＣおよびｙＫ２）は、それらのマウス対応物の代わりに機能
的に用いられ得、そしてＢ細胞発生を支持し得た。さらに、これらのマウスは、
完全なヒトＩｇＭκ抗体およびＩｇＧ２κ抗体を産生し、そして最終的には、治
療的可能性を有する抗原特異的な、高い親和性である、完全ヒトＩｇＧ２κモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成した。
【００４７】 （ｙＨ１Ｃ導入遺伝子） ヒトＩｇＨ導入遺伝子、ｙＨ１Ｃは、６６ＶＨ、全てのＤエレメント、全ての
Ｊエレメント、ＣμおよびＣδ、全ての調節エレメントから、全てが生殖細胞系
列の構成で、構成される。酵母における相同組換えを使用することによって、ｙ
Ｈ１Ｃの３’末端は、ヒトγ２遺伝子（そのスイッチ調節エレメントを含む）お
よびマウス３’エンハンサーエレメントを含む４ｋｂのフラグメントを含む２２
ｋｂのフラグメントを添付されている（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｉｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）（この開示は、本明細書中で参
考として援用される）を参照のこと）。ＹＡＣの左側のアームは、酵母選択マー
カー（ＡＤＥ２）、哺乳動物選択マーカーについての発現カセットを保有し、そ
してＹＡＣの右側のアームは、薬剤（Ｇ４１８）に対する耐性をコードする、酵
母選択マーカー（ＬＹＳ２）および哺乳動物選択マーカー（Ｎｅｏ）についての
発現カセットを保有する。後者は、そのポリモーター（ＭＭＴ（マウスメタロチ
オニン））が、おそらく、ＥＳ細胞において非機能的であるので、ＥＳ細胞にお
いて非機能的である。他の細胞型において、まれではあるが、通常の生理学的条
件下で、ＭＭＴプロモーターは、非常に低レベルでのみ転写を駆動し、そしてよ
り高いレベルの転写のために重金属（例えば、Ｃｄ）を必要とする。実際、この
構築物でトランスフェクトされたＥＳ細胞は、低レベルのＧ４１８にでさえ、決
して、耐性とはならなかった。
【００４８】 （Ｂ細胞発生） Ｂ細胞の発生は、骨髄において、Ｄ遺伝子とＪ遺伝子との間の欠失組換えとと
もに、開始する。その結果、Ｖ遺伝子は、スプライスされたＶＤＪＣμ転写物を
産生するＶＤＪ（これは、転写された）を作製するために、ＤＪと再結合する。
その転写物が、インフレームである場合、μ鎖は、翻訳の際に合成される。同様
に、かつ一般に、ＶHＤＪHの組換えおよびμ鎖と代理軽鎖との成功した対形成の
後、Ｉｇ軽鎖遺伝子座は、それらのＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメン
トを再編成する。骨髄における成功したＢ細胞の発生は、細胞表面上に、ＩｇＭ
κまたはＩｇＭλを発現するＢ細胞を生じる。マウスにおいて、Ｂ細胞の９５％
は、ＩｇＭκを発現し；ヒトにおいて、Ｂ細胞の約６０％がＩｇＭκを発現する
。
【００４９】 Ｂ細胞を産生するこれらのＩｇＭは、初期免疫レパートリーを形成し、そして
外来抗原の認識についての免疫監視機構を機能させる。マウスまたはヒトにおい
て、Ｂ細胞を生成するこれらのＩｇＭは、結果的に、ＩｇＭからＩｇＧまたはＩ
ｇＡ、あるいはＩｇＥアイソタイプへのアイソタイプクラススイッチを受け得る
。クラススイッチの頻度は、免疫応答の間に増加する。マウスおよびヒトは、各
々、ＩｇＧの４つの異なるアイソタイプに対する遺伝子を有する。それらは、マ
ウスにおける、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３であり、そ
してヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。ヒトは、２
つのＩｇＡアイソタイプ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）および１つのＩｇＥアイソ
タイプを有する。マウスにおいて、平均して、それぞれ、６５００、４２００お
よび１２００μｇ／ｍｌのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２Ｂ、ならびに２
６０μｇ／ｍｌのＩｇＡが存在する。ヒトにおいて、全ＩｇＧの中で、約７０％
はＩｇＧ１であり、１８％はＩｇＧ２であり、８％はＩｇＧ３であり、そして３
％はＩｇＧ４である。ヒトにおける全ＩｇＡにおいて、約８０％はＩｇＡ１であ
り、そして２０％はＩｇＡ２である。
【００５０】 （抗体のエフェクター機能） 異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。機能におけるこの
ような差異は、種々の免疫グロブリンアイソタイプについての個別の３次元構造
に反映される（Ｐ．Ｍ．Ａｌｚａｒｉら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：５５５−５８０（１９８８））。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３
アイソタイプは、補体媒介溶解または抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）に
関連し、そしてＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、既知のエフェクター機能をほとんど
有さないか、または有さない。（ＳｎａｐｐｅｒおよびＦ．Ｄ．Ｆｉｎｋｅｌｍ
ａｎ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、８３７−８６
３頁）。異なるエフェクター機能は、異なるＩｇＧアイソタイプに関連するので
、従って、最適な医療的利点を作り出すために、ｍＡｂのアイソタイプおよびそ
の結合特異性を選択することが可能であることが所望される。例えば、ｍＡｂが
、サイトカイン応答を中和するか、またはレセプターの活性をブロックすること
が所望される場合、フェクター機能を欠如するｍＡｂ（例えば、ＩｇＧ２または
ＩｇＧ４）が、所望され得る。一方、ｍＡｂの細胞表面上の抗原への結合を介す
る細胞の死滅が、所望される場合、その特定のエフェクター機能（ＡＤＣＣまた
はＣＭＬのいずれか）を有するｍＡｂ（例えば、ＩｇＧ１）が、所望される。従
って、完全なヒトモノクローナル抗体の産生のために操作されたトランスジェニ
ックマウスが、得られるモノクローナル抗体のアイソタイプを制御するために、
所望される。この場合において、所望のヒト抗体アイソタイプのみを産生する特
定のトランスジェニックマウス系統を免疫化することによって、特定の抗体アイ
ソタイプを選択し得る。このようなマウスは、任意の得られた抗原特異的ＩｇＧ
ｍＡｂが、所望のエフェクター機能を有することを確実にする。このことは、
定常領域を変化させるために、抗体遺伝子の引く続く再操作を不可能にし、可変
領域の単離（クローニング）およびＶＨ領域の所望のＣＨ遺伝子への連結を含む
。
【００５１】 本発明の１つの実施形態において、ｙＨ１ＣヒトＩｇＨ ＹＡＣ上の単独のＣ
γ遺伝子（Ｃγ２）は、別のＣＨ遺伝子によって置き換えられる。例えば、完全
なヒトＣγ２遺伝子を保有する２２ｋｂのグラグメントの代わりに、ヒトＣＨ遺
伝子を保有する他の挿入物が、Ｍｅｎｄｅｚらの標的化ベクターにクローニング
され得る（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−
１５６（１９９７）を参照のこと）。ヒトＣγ１〜４遺伝子は配列決定されてお
り、そしてヒトゲノムＤＮＡのバクテリオファージλライブラリ−から単離され
得、そしてその後、約２０〜２５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント上に回収され得
る（Ｊ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３
：４０７１−４０７９（１９８２）；Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：１９８４−１９８５（１９８２）；Ｓ．
Ｈｕｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：１７７９−１７８
９（１９８６）；Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎら、ＤＮＡ、１：１１−１８（１９８１）
（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。同様
に、マウスＣγ１、Ｃγ２ａ、Ｃγ２ｂ、およびＣγ３についての配列は、すべ
て公知である（Ｈ．Ｈａｙａｓｈｉｄａら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、３：２
０４７−２０５３（１９８４）（この開示は、本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと）。
【００５２】 （クラススイッチ） ＩｇＭからのＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥへのクラススイッチ組換え（ＣＳＲ
）は、Ｃδを除く全てのＩｇＨ定常領域遺伝子の５’を提供する、縦列の直接反
復スイッチ領域の間で起こる欠失組換え事象を介して、媒介される。スイッチ領
域は、Ｉプロモーター、Ｉエキソンおよび逆方向反復配列に隣接する一連の直接
反復から構成されることが知られている。エンハンサーおよびサイトカイン応答
配列は、Ｉプロモーターの付近の領域にあることが知られている。マウスＣγ１
遺伝子における、下流の逆方向反復の３’のすぐ後に位置する、少なくとも１つ
の転写エンハンサーが、仮定されている（Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１８８：１４２１−１４３１（１９９８））。ｉＥｍ（ＪＨとＣｍとの
間に位置するエンハンサー）もまた、必要とされる。転写は、Ｉプロモーターで
開始し、そしてＩエキソンを介して、Ｃ遺伝子に末端まで進行する。この転写物
は処理されて、ＣＨ遺伝子にスプライスされたＩエキソンを有する非コード無菌
転写物を得る。スイッチ領域を介する転写は、クラススイッチ組換えを必要とす
る。ヒトおよびマウスＳμおよびＳγ領域は配列決定されており、これらの配列
は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから公的に利用可能である。
【００５３】 マウスにおいて、リンフォカインと活性化因子との異なる組み合わせは、Ｉｇ
Ｍから個々のＣＨ遺伝子へのクラススイッチに対する大いに異なる効果を有する
。例えば、インビトロにおけるＬＰＳおよびインターロイキン−４の組み合わせ
は、ＩｇＧ１およびＩｇＥへのクラススイッチを誘導し、そしてＩｇＧ２ｂおよ
びＩｇＧ３へのスイッチを抑制する。ＣＳＲに影響する他のリンフォカインには
、ＩＬ−５、ＴＧＦ−β、インターフェロン−γが挙げられるが、これらに限定
されない。これらのリンフォカインは、例えば、二次リンパ組織の胚中心中の、
抗原提示Ｔ細胞および抗原提示小胞樹状細胞のようなヘルパー細胞によって、イ
ンビボで分泌される。これらのリンフォカインは、ＣＳＲの前に、それらの対応
するＣＨ遺伝子の転写を、おそらく対応するＩプロモーターの活性化を介して調
節する。例えば、マウスＣγ１ ＩプロモーターにおけるＩＬ−４応答エレメン
トは、マッピングされている（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２
、６２１−６２７頁（１９９０））。ヒトスイッチ領域のリンフォカイン応答性
は、未だ、マウスの応答性と同じ程度に、十分に特徴付けされいない。しかし、
異なるヒトスイッチ（Ｓ）領域はまた、異なるリンフォカインおよび活性化因子
に対する異なる応答を有し得る。このことは、部分的に、ヒト血清におけるＩｇ
Ｇサブクラスの異なるレベルの原因であり得る。
【００５４】 （非同種スイッチ） リンフォカインおよび他の活性化因子に対するマウスおよびヒトのＳ領域それ
ぞれの実際かつ可能な示差的な応答性の観点において、ヒト抗体産生トランスジ
ェニックマウスにおけるＣＳＲを制御する異種スイッチ領域を有することが所望
される。例えば、Ｉｇγ１は、マウスにおけるＩｇＧの最も豊富なクラスである
。ＣＳＲは、ヒトＳμ領域からマウスＳγ１領域に起こり得ることもまた知られ
ている（Ｔａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，６，５７９−５９１頁）。
分子生物学の標準的なツールおよび十分に特徴付けられたクローニングされたマ
ウスＳγ１配列（ＭｏｗａｔｔおよびＤｕｎｎｉｃｋ、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏ．，１
３６；２６７４−２６８３頁（１９８６）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 Ｍ１２３
８９）を使用して、ヒトＣＨコード配列（例えば、ヒトＣγ１）に機能的に連結
された、マウスＳγ１を有するＤＮＡベクターを操作することが可能である。ヒ
トＣＨコード配列の下流には、マウス３’エンハンサーを包含する配列が含まれ
る。ｍ３’Ｅ配列は、４ｋｂのＸｂａｌフラグメントであり得るか、または９０
０ｂｐのＳｔｕ Ｉフラグメントであり得、これらの両方は、コアＤＮＡｓｅ
Ｉ高感受性部位（ＨＳ１、２）を包含する（Ｄａｒｉａｖａｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，１４９９−１５０４頁（１９９１）；Ｐｅｔｔｅｒｓ
ｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，１８９，２３６−２４８頁（１９９７））。
ｙＨ１Ｃに相同性である５’および３’隣接領域および適切な選択マーカーを有
することによって、このようなベクターは、酵母においてインビボで組換えられ
、ｙＨ１Ｃ上のヒトＣγ２遺伝子を置き換え得る。この様式で操作されるＹＡＣ
は、ｙＨ１ＣのＶＨ、ＤH、ＪH、Ｃμ、およびＣδの全てをインタクトに保持す
るが、キメラＣＨ遺伝子を有する：マウスＳγ１エレメントは、ヒトＩｇＭから
下流ヒトＣＨコード配列へのスイッチを制御する。
【００５５】 別の実施形態において、ヒトＣγ２コード配列（ＣH遺伝子の分泌形態および
膜結合形態についてのエキソンの全てを含む）は、別のヒトＣH遺伝子によって
置き換えられる。このようにして、ヒトＳγ２配列は、Ｃμから下流ＣH遺伝子
へのＣＳＲを制御する。ｈＳｇ２配列は、ｙＨ１Ｃにおいて安定であるが、他の
ヒトＳ配列（それらのいくつかは、Ｓ反復のより長いタンデムアレイを有する）
は、安定性が低くあり得ることが知られている。ヒトＣγ２遺伝子を有するトラ
ンスジェニックマウスにおけるＣＳＲは、効率的であり、そしてヒトＩｇＧ２の
高い血清レベルを生成し、そして完全ヒトＩｇＧ２ｍＡｂの効率的な産生を生じ
ることもまた知られている。従って、それらの有利な安定性および抗原チャレン
ジに対するインビボ応答を有するヒトＳγ２を保持するが、ＣＳＲが別のアイソ
タイプ（例えば、Ｃγ１またはＣγ４のいずれか）について起こるように操作す
ることは、好ましくあり得る。このことを達成するために、以下のエレメントを
有するベクターが、構築される：例えば、ヒトＳγ２とヒトＣγ２コードエキソ
ン１との間に位置する５’側の相同性領域（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、Ｃγ２以外の
ヒトＣＨ遺伝子、マウス３’エンハンサー、酵母選択マーカー、およびＹＡＣア
ームにおける３’標的化相同性領域。このようなベクターはｙＨ１Ｃを保有する
酵母に導入され、そして標的組換え体が選択され、そしてスクリーニングされる
。これらの例において、多くのバリエーションが、当業者によって作製され得、
そしてこれらの例は、これらが、異種Ｓ領域によって駆動されるＣＳＲを有する
トランスジェニックマウスの末端に達するためのみの手段であることを示すこと
を意味しないことが、理解されるべきである。
【００５６】 （エンハンサーの役割） Ｓ領域に加えて、他のシス調節エレメントは、ＣＳＲに対して必要とされるか
、または必要とされ得ることが知られている。ｉＥｍについての要求が、言及さ
れている。また、ＩｇＧの通常のレベルの発現のために必要とされるエンハンサ
ーが、マウスＳγ１の３’逆方向反復とＣH１エキソンとの間に存在すると仮定
されている。このエンハンサーは、マウスおよびヒトにおける他のＣH遺伝子に
おいて保存され得、そしてこの間隔は、異種スイッチ配列を介して、ＣＳＲにつ
いて設計された任意のベクターにおいて保持されるべきである。（Ｅｌｅｎｉｃ
ｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，１７６−１８２（１９９６）；Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，１０２７−１０３７頁（１９
９８））。マウスおよびヒトにおけるＣα遺伝子のエンハンサー３’のクラスタ
ーもま、重要である。マウスにおいて、Ｃαの下流の４０ｋｂの領域には、４つ
のエンハンサーエレメンが含まれ、これらの顕著な特徴は、Ｄｎａｓｅ Ｉ高感
受性部位（ＨＳ）である。これらのエンハンサーは、５’から３’への順序であ
る：ＨＳ３ａ、４ｋｂ、Ｃαの下流；ＨＳ１、２（文献および本明細書中でｍ３
’Ｅとして公知）、１５ｋｂ、Ｃαの３’；ＨＳ３ｂ、２５ｋｂ、Ｃαの３’；
およびＨＳ４、約３０ｋｂ、Ｃαの３’；ＨＳ１、２、ＨＳ３ａ、およびＨＳ３
ｂは、活性化されたＢ細胞および形質細胞における発現を高める。ＨＳ４は、Ｂ
細胞発生の過程にわたって活性であるが、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣがＨＳ４を欠き、そ
してなおマウスにおける効率的なＢ細胞発生を支持するならば、明らかに不必要
である。従って、これらのエレメントは、転写を増加させるために相乗的に作用
し得、そしてマウスおよびヒトにおけるＩｇＨ遺伝子座のための遺伝子座制御領
域（ＬＣＲ）を形成すると仮定されている。個々のＨＳユニットの機能のいくら
かの重複性が存在するという仮説が立てられている。これらのエレメントの損な
われていない活性は、ＣＳＲのために必要とされ得るが、ＨＳ１、２およびＨＳ
３ａは、別々に、不要なＣＳＲである（Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１８８：１４２１−１４３１（１９９８）を参照のこと）。
【００５７】 ＨＳ１、２（３’Ｅ）は、このセットの最初に発見されたエンハンサーであっ
た。ＨＳ１、２部位および転写因子（例えば、ＡＰ−１）についてのコンセンサ
ス結合ドメインに相同な配列は、９００ｂｐのＳｔｕ−Ｉフラグメント上で分離
され得る。（Ｄａｒｉａｖｉｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，１
４９９−１５０４頁（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６２７７８）。マ
ウスにおける３’Ｅは、ラットの３’Ｅとは逆方向に配向され、このことは、他
のエンハンサーと同様に、その機能は、配向非依存性であることを示唆する。し
かし、３’Ｅは、プロモーターから離れて配置される場合、位置依存活性を有し
、そして転写をより有効的に増加させることが示されている。Ｇｅｎｅ，１３６
，３４９−３５３頁（１９９３）。ヒトＣｇ２遺伝子の３’に位置するＨＳ１、
２を有する９００ｂｐのＳｔｕＩフラグメントを包含する４ｋｂのＸｂａＩフラ
グメントは、トランスジェニックマウスにおけるＣＳＲおよび高レベルの発現を
支持しうる（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６
−１５６（１９９７）を参照のこと）。
【００５８】 強力なプロモーター（ＰＧＫ）のマウスＩｇＨ３’ＬＣＲへの挿入は、いくつ
かのＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ｂ）へのクラススイ
ッチおよび他のもの（ＩｇＧ１、ＩｇＡ）のより低い発現を抑止し得る。不思議
なことだが、プロモーターおよびその発現遺伝子はまた、ＬＣＲの制御下に入る
：ＰＧＫ駆動発現構築物は、下方制御され、そして活性化Ｂ細胞に上方制御され
得る（Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１４２１−１４３
１（１９９８））。従って、構築物３’を有し、そしてマウス３’Ｅコア構築物
（９００ｂｐのＳｔｕＩ）に隣接した強力な構成的プロモーター（ＰＧＫ）によ
って駆動されるβ−ｇａｌ発現構築物を保有するＹＡＣ遺伝子において、ＰＧＫ
−β−ｇａｌ構築物の夾雑物の欠失を有するＥＳ細胞ゲノムに組み込まれている
ＹＡＣについてスクリーニングすることは有利であり得る。これは、β−ｇａｌ
についてのプライマーを使用するＰＣＲによって達成され得るか、またはβ−ｇ
ａｌ遺伝子を用いてプローブされるサザンブロットによって達成される。
【００５９】 （免疫グロブリン膜エキソン） 各ＩｇＨアイソタイプおよびクラスの２つの形態、分泌形態（ｓ）および膜形
態（ｍ）は、Ｂ細胞によって作製され得る。Ｉｇ（ｓ）およびＩｇ（ｍ）は、Ｉ
ｇＨ転写物の代替のスプライシングを介して合成される。２つの膜エキソンは、
各ヒトＩｇＧ遺伝子のＣＨ３エキソンの２ｋｂの下流にある。膜エキソンによっ
てコードされるものは、疎水性膜貫通配列および短い、およそ３アミノ酸の細胞
質テールである。ＣＨ３からの第一の膜エキソンへの代替のスプライシングは、
膜結合ＩｇＧを生じる。膜結合Ｉｇは、Ｂ細胞中の他のタンパク質（例えば、と
りわけ、Ｉｇα、ＩｇβおよびＣＤ４５）と相互作用して、シグナル伝達し得る
Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）と呼ばれる複合体を形成する。細胞外環境（例えば
、可溶性または抗原提示細胞）中にあるＩｇＧのＶ領域による、抗原の結合は、
シグナル伝達に導き得る。ＢＣＲによるこのシグナル伝達は、Ｂ細胞の活性化な
らびに最終的に、二次免疫応答における効率的な親和性変異および胚中心形成に
導く。
【００６０】 さらに、ＢＣＲのＩｇによる抗原の結合は、ヘルパー細胞への提示のための、
ＭＨＣ分子による抗原フラグメントの内在化、操作、および提示に導き得る。明
らかに、機能的ＢＣＲの効率的なアセンブリは、効率的な一次および二次免疫応
答のために必要とされる。
【００６１】 ヒトＩｇＧ１膜エキソンは、ＢＣＲＰの他の成分と十分に複合体化するわけで
はなく、マウスのキメラＢＣＲと同程度には、シグナル伝達するわけではないキ
メラＢＣＲを生じる。Ｇ．Ｐｌｕｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ，２１５，２７−３７頁（１９９８）。ＩｇＧ１の分泌形態および膜
形態をコードする全てのヒトエキソンを有するヒトＩｇＧ１構築物は、マウスＩ
ｇＧ２ａ遺伝子座に挿入され、その結果、マウスＣγ２ａエキソンが、置き換え
られ、そしてヒトコードエキソンに対するＣＳＲは、マウスＳγ２ａ領域の制御
下にあった。キメラヒトＩｇＧ１（マウスＶＤＪ−ヒトＩｇＧ１）は、マウスＩ
ｇＧ２ａよりも１００倍低いレベルで発現され、そして抗原特異的ｍＡｂは、回
収されなかった。従って、マウスＳγ２ａによって駆動されるクラススイッチが
生じるが、正常な免疫応答は、妥協された。あるいは、分泌ヒトＩｇＧ１をコー
ドするエキソンは、マウスＩｇＧ１の分泌形態をコードするエキソンのみを置き
換えるために、使用されてきている。この構築物は、キメラＩｇＧ１重鎖遺伝子
を生成し、このキメラＩｇＧ１重鎖遺伝子は、分泌ＩｇＧ１についての全てのヒ
トエキソンを含むが、インタクトな下流のマウス膜エキソンを有する。クラスス
イッチは、マウスＳγ１領域によって駆動されている。膜結合Ｉｇは、マウスＶ
−ヒトγ１ ＣＨ１−ＣＨ３−マウスＣγ１（ｍｅｍ）である。このトランスジ
ェニックマウスにおいて、ヒトＩｇＧ１の血清レベルは、正常な未処理のマウス
におけるマウスＩｇＧ１と同じである。従って、マウスＳγ１は、効率的なクラ
ススイッチを駆動し得、そしてマウスＩｇＧ１膜エキソンは、少なくともヒトγ
１ ＣＨ１−ＣＨ３エキソンとともに機能し得る。本発明者らは、抗原特異的ｍ
Ａｂの産生についてマウスを試験しなかった。先の構築物におけるように、得ら
れたＩｇＧ１ ｍＡｂは、キメラである：マウスＶＤＪは、機能的に、ヒトＣγ
１の分泌形態に連結された。
【００６２】 これらの結果が与えられると、ヒトＣγ１エキソンのインタクトなセット（こ
れらは、Ｃγ１の分泌形態および膜形態の両方をコードし、そしてヒトＩｇＨ遺
伝子座（ＶH、ＤH、ＪH、ＣδおよびＳγ領域）に機能的に連結される）は、完
全に機能的なＢＣＲをもたらすわけではない膜結合ヒトＩｇＧ１の非効率的なア
センブルのために、最適以下で機能し得る。従って、ヒトＣγ１膜エキソンを、
機能的ＢＣＲに効率的にアセンブルすることが知られている別のアイソタイプ由
来のものと置き換えることは、好ましくあり得る。このようなエキソンは、マウ
スＣγ１エキソンまたは他のマウスＣ膜領エキソンを含み得る。あるいは、ヒト
Ｃγ２膜エキソンは、マウスのＢＣＲにおいて十分に機能することが期待される
。なぜなら、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ２は、高レベルの分泌ＩｇＧ２を有し、そ
して高い親和性の抗原特異的ｍＡｂを効率的に産生するからである。従って、ヒ
トＣγ２膜エキソンは、ヒトＣγ１ ＣＨ１−ＣＨ３エキソンに機能的に連結さ
れ得る。膜エキソンについての配列は、公知である（ｈγ１については、Ｘ５２
８４７；ｈγ２については、ＡＢ００６７７５）。
【００６３】 （ベクター構築） １つの実施形態では、ＣＨ１−ＣＨ３エキソンのみをｙＨ１Ｃ ＹＡＣ中に導
入するための標的化ベクターが生成される。ヒトＣＨ１−ＣＨ３ならびにイント
ロンおよび隣接するＤＮＡの全ての配列が利用可能であり［Ｊ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓ
ｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４０７１−４０７９（
１９８２）；Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７９：１９８４−１９８５（１９８２）；Ｓ．Ｈｕｃｋら，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：１７７９−１７８９（１９８６）；Ｊ．Ｅ
ｌｌｉｓｏｎら，ＤＮＡ，１：１１−１８（１９８１）を参照のこと（これらの
開示は、本明細書中に参考として援用される）］、全ての制限部位が電子的にマ
ッピングされることおよび標的化ベクターが構築されることを可能にする。１つ
のこのようなベクターは、ヒトＣγ２ ＣＨ１エキソンの上流の５’相同性、酵
母におけるポジティブ／ネガティブ選択マーカー（ＵＲＡ３）についての発現構
築物、５’標的化相同性の直接反復、ヒトＣγ１エキソンＣＨ１−ＣＨ３を含む
配列、および３’標的化相同性を含む。このベクターは、ｙＨ１Ｃを保有する酵
母中にトランスフェクトされ、そして相同な組換え体は、ウラシルを欠くプレー
ト上でポジティブに選択され、次いで、サザンブロットハイブリダイゼーション
によってスクリーニングされるかまたはＰＣＲによってヒトＣγ２ ＣＨ１−Ｃ
Ｈ３エキソンの喪失およびヒトＣγ１ ＣＨ１−ＣＨ３の付随した獲得について
試験される。一旦同定されると、ＵＲＡ３遺伝子の欠失は、５’−フルオロウラ
シルを用いて選択され得る。このような喪失は、酵母中の直接的な反復配列の間
での効率的な染色体内組換えに起因して高い頻度（１０-4〜１０-5）で生じると
予想される。ＵＲＡ３遺伝子の欠失は、クラススイッチ組換えについておよび抗
体の発現について機能的な配置で完全にヒトＩｇＨを回復させる。このような操
作を達成するための他のストラテジーが存在することが明らかである。また、他
のヒトＣγ遺伝子（例えば、ヒトＣγ４）をヒトＣγ２遺伝子座中に操作する動
機付けが存在し得る。
【００６４】 （ＣＲＥ−ＬＯＸ媒介クラススイッチ） ＣＲＥ−ｌｏｘ系は、予め規定された部位への、ＤＮＡの標的化された挿入を
可能にする。Ｐ１バクテリオファージから誘導されると、ＣＲＥレコンビナーゼ
は、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡ内またはＤＮＡ間の組換えを駆動する［Ｂ．Ｓａｕ
ｅｒら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２：４４１−４４９（１９９０）；Ｓ．
Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９
：７９０５−７９０９（１９９２）；Ｙ．−Ｒ．Ｚｏｕら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂ
ｉｏｌ．，４：１０９９−１１０３（１９９４）］。ｌｏｘ Ｐ部位（配列：Ｔ
Ａ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡ
Ｇ ＴＴＡ ＴＡ（配列番号１））は、ｙＨ ＹＡＣのＤＮＡ中に導入される。
この配列は、Ｓ領域（例えば、Ｓｇ２）の下流の３’逆方向反復の３’側に、そ
して下流のＣｇ遺伝子（例えば、Ｃｇ１）のＣＨ１エキソンのスプライスアクセ
プター配列の５’側に配置される。ｌｏｘ Ｐ部位は、酵母中で相同組換えを介
してＹＡＣ中に直接挿入され得る。またはｌｏｘ Ｐ部位は、より大きな標的化
ベクター（例えば、本明細書に上記で記載される標的化ベクター）中に組み込ま
れ得る。この部位をこのようなＹＡＣ標的化ベクター中に組み込んだ場合、ｌｏ
ｘＰ部位は、標的化相同性（例えば、５’標的化相同性）を増幅するために用い
られるＰＣＲプライマーに導入され得るか、または連結されたオリゴヌクレオチ
ドとしてインビトロで挿入され得る。２つのｌｏｘＰ部位の間の相同組換えは方
向依存性であるので、第１のｌｏｘＰ部位をＹＡＣ中に挿入する方向に注意する
ことが重要である。
【００６５】 第２の段階では、代替的Ｃγ遺伝子の挿入のためのプラスミドベクターが生成
される。このベクターのコアでは、導入されるＣｇ遺伝子および導入を可能にす
るｌｏｘＰ部位を保有するカセットである：このカセットは、ＹＡＣ中でと同じ
５’−３’方向のｌｏｘ Ｐ部位で始まり、ＹＡＣ上のＣｇの上流のｌｏｘ Ｐ
挿入部位に対応するＣＨ１の上流のＤＮＡが続き、そして生殖系列配置に続き、
ＣＨ１を通り（ＣＨ１エキソンスプライスアクセプターはインタクトなままであ
る）、第２の膜エキソンの３’側のポリアデニル化部位の下流を通る。例えば、
約７ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントは、全てのヒトＣｇ遺伝子について必
要とされるＤＮＡの全てを捕捉する。あるいは、転写および翻訳（非翻訳領域、
ポリアデニル化部位）について適切な３’シグナルを含むＣＨ１−ＣＨ３エキソ
ンのみを用いて、分泌形態のｍＡｂのみを作製し得る。あり得る読み過し転写を
なくすために、真核生物転写ターミネーター配列は、ベクターにおいてＣＨ遺伝
子の下流に付加され得る。形質転換体の選択を容易にするために、選択マーカー
（例えば、ピューロマイシンまたはハイグロマイシン）についての発現カセット
が、ＣＨ遺伝子の下流に付加され得る。
【００６６】 一旦ハイブリドーマが、ｌｘｏＰ部位を用いて操作されたｙＨトランスジーン
を保有するトランスジェニックマウスから生成されると、ＣＲＥ−ｌｏｘ媒介ク
ラススイッチは、環化された挿入ベクターと精製されたＣＲＥレコンビナーゼま
たはＣＲＥ発現ベクターのいずれかとを、例えば、エレクトロポレーションまた
はリポフェクションによって、同時トランスフェクトすることによって誘導され
得る。同時トランスフェクトされた細胞では、ＣＲＥは、遺伝子座への新規のＣ
Ｈ遺伝子の挿入を媒介し、ここで、ＣＲＥは、所望のｍＡｂ特異性をコードする
上流のＶＨＤＪＨに対してシスで転写およびスプライシングされる。転写ターミ
ネーターは、下流のＣＨ遺伝子へと転写し続けるのを妨げる。ベクターが選択マ
ーカーを有するならば、トランスフェクトされたハイブリドーマは、適切な薬物
を用いて選択され得、次いで、プールされ得るかまたは個々のクローンが所望の
新規のアイソタイプのｍＡｂについてのＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ
得る。ベクターが選択マーカーを欠くならば、トランスフェクトされたハイブリ
ドーマのプールは、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ得、そして所望のア
イソタイプを産生するハイブリドーマは、プールからサブクローニングされ得る
。置換ＣＨ遺伝子が膜結合型ＩｇＨをコードするならばまた、ハイブリドーマは
、フローサイトメトリーによってスクリーニングおよび選別され得る。
【００６７】 いくつかの例では、一方のアイソタイプが１つの活性（例えば、ＡＤＣＣまた
はＣＭＬ）を有し、そして他方のアイソタイプがエフェクター機能を欠くが、同
一の抗原結合特徴（例えば、エピトープ特異性および親和性）を有して、単一抗
原特異的ｍＡｂの２つの異なるアイソタイプを保有することが好適であり得る。
この目的は、重鎖および軽鎖の可変領域の分子クローニング、次いで、適切な定
常領域に対するこれらの機能的連結、続いてｍＡｂの産生のための細胞内へのト
ランスフェクションによって達成され得る。しかし、このプロセスは、労力およ
び時間がかかり得る。あるいは、上記のＣＲＥ−ｌｏｘプロセスを用いて、モノ
クローナル抗体は、ハイブリドーマ中でインビボで効率的にクラススイッチされ
得る。
【００６８】 （マウス系統） 以下のマウス系統は、本明細書中に記載および／または利用される： （二重不活化（ＤＩ）系統） ＤＩ系統のマウスは、機能的内因性マウスＩｇを産生しないマウスである。好
ましい実施形態では、ＤＩマウスは、不活化されたマウスＪH領域および不活化
されたマウスＣκ領域を保有する。この系統の構築は、他の箇所で広範囲に議論
されている。例えば、ＤＩ系統の作製のために利用される技術は、１９９０年１
月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１
月８日に出願された同第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願
された同第０７／９１９，２９７号、１９９３年３月１５日に出願された同第０
８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された同第０８／１１２，
８４８号、１９９４年４月２８日に出願された同第０８／２３４，１４５号、１
９９６年１０月２日に出願された同第０８／７２４，７５２号に詳細に記載され
る。１９９６年６月１２日に特許許可公開された欧州特許第ＥＰ ０ ４６３
１５１ Ｂ１号、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願第ＷＯ ９４／
０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願第ＷＯ ９６
／３４０９６号および１９９６年４月２９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／
ＵＳ９６／０５９２８号もまた参照のこと。上記の引用された特許および特許出
願の各々の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。ＤＩマウス
は、非常に未成熟なＢ細胞発達を保有する。このマウスは、成熟Ｂ細胞を産生せ
ず、プロＢ細胞しか産生しない［ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８，４８３−４９５頁（１９９８）］。
【００６９】 （ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｉ系統） ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｉ系統の設計、構築および分析は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３−２１（１９９４）において詳細に考察
された。このようなマウスは、ＤＩバックグラウンドに対してヒトＩｇＭκ抗体
を産生した。このマウスは、ほとんどまたは全くＢ細胞の発達を有さないＤＩ系
統のマウスと比較した場合に、改善されたＢ細胞機能を示した。ＸｅｎｏＭｏｕ
ｓｅ Ｉ系統のマウスは、抗原投与に対してかなり大きい免疫応答を上昇させた
（ｍｏｕｎｔ）とはいえ、Ｂ細胞のそれらの産生は、野生型マウスのほんの２０
％〜２５％のみであり、そしてこれらは抗原に対する制限された応答を有した。
両方の特徴は、それらの制限されたＶ遺伝子レパートリーに関連するようである
。
【００７０】 （Ｌ６系統） Ｌ６系統は、内因性マウスＩｇのＤＩバックグラウンドに対するヒトＩｇＭκ
抗体を産生するマウスである。Ｌ６マウスは、挿入されたヒト重鎖および挿入さ
れたヒトκ軽鎖を含む。Ｌ６系統は、二重不活化バックグラウンドに対して重鎖
挿入物を含むマウス（Ｌ６Ｈ）と、二重不活化バックグラウンドに対してκ軽鎖
挿入物を有するマウス（Ｌ６Ｌ）との交配を通して作製される。重鎖挿入物は、
ＶH６−１で始まり、そしてＶH３−６５で終わり、そして主なＤ遺伝子クラスタ
ー（約３２）、ＪH遺伝子（６）、介在性エンハンサー（Ｅｍ）、Ｃμおよび約
２５ｋｂ過ぎたＣδを通って含めて約６６個のＶHセグメントを含む、生殖系列
の配置にある、ＹＡＣ由来のインタクトな約９７０ｋｂのヒトＤＮＡ挿入物を含
む。軽鎖挿入物ｙＫ２は、Ｖκ-B3で始まり、そしてＶκ-Op11で終わる、約３２
個のＶκ遺伝子を含む、ＹＡＣ由来のインタクトな約８００ｋｂのヒトＤＮＡ挿
入物を含む。この８００ｋｂの挿入物は、Ｖκ-Lp-13で始まり、そしてＶκ-Lp- 5 で終わる、約１００ｋｂの欠失を含む。しかし、このＤＮＡは、Ｖκ-Lp-13か
ら１００ｋｂの過ぎたＶκ-Op-1までの生殖系列配置にあり、そしてまたＪκ遺
伝子、イントロンおよび３’エンハンサー、定常Ｃκ遺伝子およびＫｄｅを含む
［Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５，１４６−１５６頁
（１９９７）］。さらに、Ｌ６マウスは、ヒトκ軽鎖の優勢な発現、成熟Ｂ細胞
の大きな集団および正常なレベルのＩｇＭκヒト抗体を示す［Ｇｒｅｅｎおよび
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８，４８３−４９５頁（１
９９８）］。
【００７１】 （ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩａ系統：） ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩａマウスは、ＤＩバックグラウンドに対して生殖系
列配置のメガ塩基サイズのヒトＩｇ遺伝子座を備え、その結果、このマウスは、
機能的内因性Ｉｇを産生しない、第２世代のＸｅｎｏＭｏｕｓｅTM系統を表す。
本質的に、このマウスは、Ｌ６系統に対して構築が等価であるが、そのスイッチ
配列および調節配列の全体、ならびにマウス３’エンハンサーをシスにおいて有
するヒトＣγ２遺伝子をさらに含む。このマウスは、約１０２０ｋｂの重鎖遺伝
子座および約８００ｋｂのκ軽鎖遺伝子座を含み、これらは、重鎖遺伝子（約６
６ＶH）およびκ軽鎖遺伝子（約３２Ｖκ）、ヒト重鎖定常領域遺伝子（μ、δ
およびγ）およびκ定常領域遺伝子（Ｃκ）、ならびに主な同定された調節エレ
メントの全てを含む、大多数のヒト可変領域遺伝子を含む。これらのマウスは、
そのゲノムに含まれた全ての範囲の可変遺伝子を利用し得ることが示されている
。さらに、これらのマウスは、効率的なクラススイッチおよび体細胞性高変異（
ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）、ヒトκ軽鎖の優勢な発現、成熟Ｂ細胞の大きな
集団、ならびに正常レベルのＩｇＭκおよびＩｇＧκヒト抗体を示す。このよう
なマウスは、ヒトＩＬ−８、ヒトＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）およびヒト腫瘍
壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を含めた複数の免疫原に対する種々のヒト抗体応答
を上昇させ、最終的に、ナノモル未満の親和性を有する抗原特異的で完全にヒト
のｍＡｂを生じる。この最後の結果は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅTMを、任意の所望の
特異性で広範な範囲の抗原に対する高い親和性の、完全にヒトの治療的ｍＡｂの
迅速な単離のための優れた供給源として決定的に実証する。
【００７２】 上記の序論から理解されるように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩ系統は、成熟Ｂ
細胞発達を受け、そして強力な成体ヒト様免疫応答を抗原投与に対して上昇させ
るようである。Ｌ６系統はまた、成熟Ｂ細胞発達を受けるようである。Ｘｅｎｏ
Ｍｏｕｓｅ ＩＩ系統の場合、著しく異なったＢ細胞発達プロフィールが観察さ
れる。この相違に起因して、動物に導入される可変領域配列の量および複雑さは
、Ｂ細胞成熟および発達の誘導、ならびに成体ヒト様免疫応答の生成に必須であ
るようである。従って、ヒト抗体を産生する系統の有用性に加えて、この系統は
、正常な免疫応答におけるヒト抗体の産生および機能、ならびに自己免疫疾患お
よび他の障害に特有な異常な応答を研究する際の貴重なツールを提供する。
【００７３】 （可変領域−定量的多様性） 抗体の特異性（すなわち、広範な範囲の抗原に対して、そして実際に抗原上の
広範な範囲の独立したエピトープに対する抗体を産生する能力）は、重鎖（ＶH
）およびκ軽鎖（Ｖκ）ゲノム上の可変領域遺伝子に依存すると予測される。ヒ
ト重鎖ゲノムは、約９５個のＶＨ遺伝子を含み、そのうちの４１個は、免疫グロ
ブリン分子のヒト重鎖の可変領域をコードする機能的遺伝子である。さらに、ヒ
ト軽鎖ゲノムは、約４０個のＶκ遺伝子をその近位末端に含み、そのうちの２５
個は、免疫グロブリン分子のヒトκ軽鎖の可変領域をコードする機能的なもので
ある。本発明者らは、抗体の特異性が、可変軽鎖および可変重鎖をコードする複
数の遺伝子を含めることによって増強され得ることを実証した。
【００７４】 本発明に従って提供されるのは、ヒトＩｇ遺伝子座のかなりの部分を有する、
好ましくはヒト重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座の両方を含む、トランス
ジェニックマウスである。それゆえ、好ましい実施形態では、１０％を超えるヒ
トＶH遺伝子およびＶκ遺伝子が利用される。より好ましくは、約２０％、３０
％、４０％、５０％、６０％を超える、またはさらに７０％以上のＶHおよびＶ
κ遺伝子が利用される。好ましい実施形態では、それぞれ、ヒトＶκ軽鎖ゲノム
の近位領域由来の３２個の遺伝子および／またはヒトＩｇＨ遺伝子座のＶH部分
由来の６６個の遺伝子を含む重鎖構築物および軽鎖構築物が利用される。認識さ
れるように、遺伝子は、順序通りに、すなわち、ヒトゲノム中で見出される順序
で、もしくは順序が狂って、すなわち、ヒトゲノム中に見出される順序以外の順
序で、またはそれらの組み合わせでのいずれかで含まれ得る。従って、例証とし
て、この遺伝子座のヒトＶH領域またはヒトＶκ領域のいずれかの完全に順序通
りの部分が利用され得るか、またはＶHゲノムもしくはＶκゲノムのいずれかに
おける種々のＶ遺伝子が、全体的な順序通りの配置は保持しながらもスキップさ
れ得るか、またはＶHゲノムもしくはＶκゲノムのいずれかの内のＶ遺伝子が並
べ換えられ得るなどである。好ましい実施形態では、ヒト遺伝子座全体は、ヒト
において見出されるような、実質的に生殖系列配置でマウスゲノム中に挿入され
る。いずれにせよ、ＶHゲノムおよびＶκゲノム由来の多様な配置の遺伝子を含
むことによって、増強された抗体特異性、そして最終的には増強された抗体親和
性をもたらすことが予想され、そして本明細書中に記載される結果は、そのこと
を実証する。
【００７５】 このようなマウスは好ましくは、ヒトＤH領域全体、ヒトＪH領域全体およびヒ
トμ定常領域をさらに含み、そしてさらなるアイソタイプの抗体のコーディング
および生成のための他のヒト定常領域をさらに備え得る。このようなアイソタイ
プは、γ1、γ2、γ3、γ4、α、εおよびδをコードする遺伝子、ならびに他の
定常領域コード遺伝子を適切なスイッチ配列および調節配列とともに含み得る。
認識され、そして以下でより詳細に考察されるように、種々のスイッチ配列およ
び調節配列は、任意の特定の定常領域選択に関連して利用され得る。
【００７６】 以下の表は、Ｎ付加、欠失または体細胞性変異事象を考慮することなく、ラン
ダムなＶ−Ｄ−Ｊの連結およびκ軽鎖との組み合わせに厳密に基づく、ヒトにお
いて可能である抗体組み合わせの多様性を示す。これらの考慮に基づいて、ヒト
において任意の特定のアイソタイプについての７×１０5を超える可能な抗体の
組み合わせが存在する。
【００７７】
【表１】
【００７８】 本発明の好ましい実施形態に関連して、約３４個の機能的ＶH遺伝子および１
８個の機能的Ｖκ遺伝子をＤH遺伝子、ＪH遺伝子およびＪκ遺伝子の完全な相補
体を有するマウス中に含むことによって、抗体産生の可能な多様性は、４．２×
１０5個の異なる抗体の桁である。上記のように、このような算出は、Ｎ付加も
体細胞性変異事象も考慮しない。それゆえ、本発明によるマウス（例えば、Ｌ６
系統およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＩＩ系統）が、かなりの抗体多様性を提供する
ことが認識される。好ましい実施形態では、マウスは、Ｎ付加または体細胞性変
異事象を計上することなく、２×１０5を超える異なる重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊの組み合
わせおよびκ軽鎖Ｖ−Ｊの組み合わせを生じる能力を有するように設計される。
【００７９】 （可変領域−定性的多様性） 定量的多様性に加えて、Ｖ−遺伝子の定量的選択（すなわち、多数の多様なＶ
−遺伝子）および／またはＶ−遺伝子の定性的選択（すなわち、特定のＶ−遺伝
子の選択）は、本明細書中で本発明者らが「定性的多様性」と呼ぶものにおいて
役割を果たすようである。「定性的多様性」とは、本明細書中で使用される場合
、Ｖ−Ｄ−Ｊ再編成における多様性をいい、ここで結合部の多様性および／また
は体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｎｕｔａｔｉｏｎ）事象が導入される。重
鎖再編成の間、特定の酵素（ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２、およびおそらく他の酵素
）は、抗体遺伝子のコード領域を表すＤＮＡの切断についての原因である。末端
のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）活性（これは、Ｖ−Ｄ
遺伝子エキソンとＤ−Ｊ遺伝子エキソンとの間のヌクレオチドのＮ末端付加の原
因である）は、アップレギュレートされる。類似の酵素および他の酵素（ＳＣＩ
Ｄおよび他のＤＮＡ修復酵素）は、これらのコードセグメントの結合部で起こる
欠失の原因である。結合部の多様性は、Ｎ付加事象および相補性決定領域３（Ｃ
ＤＲ３）の形成の両方をいう。理解されるように、ＣＤＲ３は、Ｄ領域にわたっ
て位置し、そしてＶ−ＤおよびＶ−Ｊ結合部事象を含む。従って、Ｄ−Ｊ再編成
およびＶ−Ｄ再編成の両方の間のＮ付加および欠失は、ＣＤＲ３多様性の原因で
ある。
【００８０】 Ｎ付加およびＣＤＲ３付加によって作製される結合部の多様性は、抗体の特異
性を発生するという明確な役割を果たす。
【００８１】 本発明に従って、再編成されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列は、予想された成人ヒト
Ｎ付加長に匹敵するＮ付加長を示す。さらに、ＣＤＲ３配列に対応するオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）にわたるアミノ酸配列は、予想された成人ヒト
ＣＤＲ３長に匹敵するＣＤＲ３長を示す。このようなデータは、定量的可変領域
多様性および／または定性的可変領域多様性が、ヒト様結合部多様性を生じるこ
とを示す。このような結合部多様性は、よりいっそうのヒト様抗体特異性をもた
らすことが予想される。
【００８２】 （可変領域−親和性） 本発明者らは、可変領域の包含の増大と抗体の特異性との間の直接的な因果関
係を結論的に実証したわけでないが、このような多様性を提供することを通して
、広範な多数の抗原に対する免疫応答を上昇させるマウスの能力が可能でありか
つ増強されるということがありそうであり、そしてこのことが予想される。さら
に、このようなマウスは、個々の抗原または免疫原上の広範な多数のエピトープ
に対する免疫応答を上昇させるために、より備えができているようである。本発
明者らのデータから、本発明に従って産生される抗体はまた、増強された親和性
を有するようである。このようなデータは、本発明に従うマウスとＸｅｎｏＭｏ
ｕｓｅ Ｉ株との間の比較、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌおよびＭＲＣの公開された結果の考慮を包含する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ
Ｉ株に関連して、上述のように、このようなマウスは、サブノーマルなＢ細胞産
生および抗原に対する限られた応答のみを有する。このような結果は、部分的に
、限定されたＶ−遺伝子のレパートリーに関連するようである。同様に、Ｇｅｎ
Ｐｈａｒｍ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌおよびＭＲＣによって報告された結果
は、多様な抗原に対する限定された応答を示す。
【００８３】 特定の理論または本発明の操作の様式に束縛されることを望まないが、増強さ
れた親和性は、Ｖ−領域の多数および複雑さの供給から生じるように見えるよう
である。本発明者らのデータから、より多くの数の供給および／またはＶ−遺伝
子配列の性質の選択は、結合部の多様性（Ｎ付加および領域３（「ＣＤＲ３」多
様性）を決定する相補性の形成）を増強し、これは、成人ヒト様免疫応答に代表
的であり、そして抗体の親和性の成熟において実質的な役割を果たしている。こ
のような抗体は、親和性の増強をもたらす体細胞突然変異事象においてより有効
でありかつより効率的であることもまた、可能性がある。結合部の多様性および
体細胞突然変異事象の各々は、以下でさらに詳細に議論される。
【００８４】 親和性に関して、複数のＶH遺伝子およびＶκ遺伝子の使用（すなわち、Ｖκ
軽鎖ゲノムの近位領域上の３２の遺伝子およびゲノムのＶH部分上の６６遺伝子
の使用）を通して誘導された抗体親和性速度および定数は、約０．５０×１０-6 よりも大きな結合速度（Ｍ-1Ｓ-1でのｋａ）、好ましくは２．００×１０-6より
も大きな結合速度、そしてより好ましくは、約４．００×１０-6よりも大きな結
合速度；約１．００×１０-4より大きな解離速度（Ｓ-1でのｋｄ）、好ましくは
約２．００×１０-4よりも大きく、そしてより好ましくは約４．００×１０-4よ
りも大きく；そして約１．００×１０-10より大きな解離定数（Ｍで）、好まし
くは約２．００×１０-10よりも大きく、そしてより好ましくは約４．００×１
０-10よりも大きい。
【００８５】 好ましくは、このようなマウスはさらに、機能的に内因性の免疫グロブリンを
産生しない。このことは、内因性の重鎖および軽鎖の遺伝子座の不活化（すなわ
ち、ノックアウト）を通して好ましい実施形態において達成される。例えば、好
ましい実施形態において、マウス重鎖Ｊ領域およびマウスκ軽鎖Ｊ領域ならびに
Ｃκ領域が、この領域を置換または欠失させる相同組換えベクターの使用を通し
て不活化される。
【００８６】 （可変領域−Ｂ細胞発生） Ｂ細胞発生は、Ｋｌａｕｓ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９０））およびＴ．Ｈｏｎｊｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ
ｅｎｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
（１９９８））の第１章〜第３章に概説されている。一般的には、哺乳動物にお
いて、血球（Ｂ細胞およびＴ細胞を含む）発生は、共通の多能性幹細胞から生じ
る。次いで、リンパ球は、共通のリンパ球前駆細胞から進化する。初期の妊娠期
間に続いて、Ｂ細胞の開始は、肝臓から骨髄にシフトする。Ｂ細胞の開始は、哺
乳動物の生涯を通じて骨髄に残る。
【００８７】 Ｂ細胞のライフサイクルにおいて第１の一般的に認識可能な細胞は、プロプレ
Ｂ細胞であり、これは骨髄において見出される。このような細胞は、重鎖のＶ−
Ｄ−Ｊ再編成を開始するが、まだタンパク質を作らない。次いでこの細胞は、大
きく、迅速に分裂する、プレＢ細胞Ｉに進化する。この細胞は、細胞質性のμ細
胞である。次いで、このプレＢＩ細胞は分裂を停止し、縮み、そして軽鎖Ｖ−Ｊ
再編成を受け、プレＢ細胞ＩＩになる。この細胞は、髄を未成熟なＢ細胞のまま
にする表面ＩｇＭを発現する。出現する未成熟のＢ細胞の大部分は、表面のＩｇ
Ｄを発生および産生することを継続する。このことは、脾臓に主に存在する、完
全に成熟した免疫応答性末梢Ｂ細胞としての分化および発生の完了を示す（Ｈａ
ｒｄｙおよびＲｏｌｉｎｋ、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７６４、１９
〜２４頁（１９９５）；ＲｏｌｉｎｋおよびＭｅｌｃｈｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｌｅｔｔ．、５４、１５７〜１６１頁、（１９９６））。しかし、デルタ定常
領域を除去し、そしてなお、免疫応答性細胞を得ることが可能である。
【００８８】 Ｂ細胞分化および発生は、表面マーカーの使用を通してモニタリングおよび／
または追跡され得る。例えば、Ｂ２２０抗原は、プレＢ細胞ＩまたはＩＩに対す
る比較において成熟Ｂ細胞上で比較的な量で発現され得る。従って、Ｂ２２０+
でありかつ表面ＩｇＭ+（μ+）である細胞は、成熟Ｂ細胞の存在を決定するため
に使用され得る。さらに、細胞は、表面ＩｇＤ発現（δ+）についてスクリーニ
ングされ得る。別の抗原である、熱安定性抗原は、プレＢ細胞Ｉによって、そし
て後の発生段階において発現され得る。
【００８９】
【表２】
【００９０】 ＊導入遺伝子上にδ遺伝子の機能的コピーの存在を仮定している。
【００９１】 Ｂ細胞マーカー（例えば、上記で言及したようなマーカー）の使用を通して、
Ｂ細胞の発生および分化がモニタリングおよび評価され得る。
【００９２】 本発明者らは、ＤＩマウス（重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊ再編成または軽鎖Ｖ−Ｊ再編成を
受けないマウス）が、成熟Ｂ細胞を産生しないことを以前に実証した。実際、こ
のようなマウスは、プロプレＢ細胞の産生で停止しており、そしてＢ細胞は骨髄
から末梢組織（脾臓を含む）に移動しない。従って、Ｂ細胞発生および抗体産生
の両方は、完全に停止する。同じ結果が、重鎖のみが不活化されたマウスにおい
ても見られた。Ｂ細胞発生および分化が、骨髄において停止した。
【００９３】 本発明者らのＸｅｎｏＭｏｕｓｅＩ株は、機能的で、いくぶん成熟したＢ細胞
を生成した。しかし、骨髄および末梢組織の両方におけるＢ細胞の数は、野生型
マウスと比較して有意に減少した。
【００９４】 対照的に、本発明者らのＸｅｎｏＭｏｕｓｅＩＩ株およびＬ６株は、予想に反
して、ほぼ完全なＢ細胞再構築物を保有する。従って、本発明に従って、本発明
者らは、可変領域遺伝子の定量的包含および定性的包含を通して、Ｂ細胞分化お
よび発生が非常に再構築され得ることを実証した。Ｂ細胞分化および発生の再構
築は、免疫系の再構築を示す。一般的に、Ｂ細胞再構築は、野生型コントロール
に対して比較される。従って、本発明の好ましい実施形態において、挿入された
ヒト可変領域を有するマウスの集団は、野生型マウスの集団と比較した場合、約
５０％よりも高い再構築を保有する。
【００９５】 （ＸｅｎｏＭｏｕｓｅによるアイソタイプスイッチ） 本明細書中で詳細に議論されるように、予想されるように、ＸｅｎｏＭｏｕｓ
ｅＩＩマウスは、ヒト導入遺伝子によってコードされるｍｕアイソタイプから、
その導入遺伝子によってコードされるγ−２アイソタイプへの、効率的かつ有効
なアイソタイプスイッチを受ける。上述のように、本発明に従うマウスはさらに
、さらなるアイソタイプの生成のために他のヒト定常領域を備え得る。このよう
なアイソタイプには、γ１、γ２、γ３、γ４、α、β、ε、δ、および他の定
常領域をコードする遺伝子が含まれ得る。代替的な定常領域は、同じ導入遺伝子
（すなわち、ヒトｍｕ定常領域から下流）上に含まれ得るか、または代替的に、
このような他の定常領域は、別の染色体上に含まれ得る。このような他の定常領
域が、導入遺伝子をコードするヒトｍｕ定常領域を含む染色体と同じ染色体上に
含まれる場合、他のアイソタイプ（単数および複数）へのシススイッチが達成さ
れ得ることが理解される。他方、このような他の定常領域が、導入遺伝子をコー
ドするｍｕ定常領域を含む染色体とは異なる染色体上に含まれる場合、他のアイ
ソタイプ（単数および複数）へのトランススイッチが達成され得る。このような
再編成は、広範な多数の抗原に対する抗体の産生のためのマウスの設計および構
築における途方もなく大きな可撓性を可能にする。
【００９６】 定常領域は、公知のスイッチおよびそれらに付随する調節配列を有することが
理解される。マウスおよびヒトの定常領域遺伝子のすべては、１９８９年までに
配列決定および公開された。Ｈｏｎｊｏら、「Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ
Ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃ
ｈａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ
Ｃｌａｓｓ Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ」、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ
ｓ（Ｈｏｎｊｏら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照のこ
と、この開示は、本明細書によって参考として援用される。例えば、米国特許出
願番号０７／５７４，７４８（この開示は、本明細書によって参考として援用さ
れる）において、ヒトγ−１定常領域のクローニングは、先行技術からの既知の
配列情報に基づいて予測された。再編成されていない、スイッチされていない遺
伝子において、全体のスイッチ領域は、第１のγ−１定常エキソンの５’末端か
らの５ｋｂ未満で開始する配列中に含まれることが示された。従って、スイッチ
領域はまた、Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：
４０７１−４０７９（１９８２）において開示された５’５．３ｋｂ Ｈｉｎｆ
ＩＩＩフラグメント中に含まれた。同様に、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ
２９：６７１−６７９（１９８２）もまた、Ｅｌｌｉｓｏｎにおいて開示された
フラグメントがスイッチ配列を含み、そしてこのフラグメントは、７．７ｋｂの
ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩフラグメントとともに、重鎖アイソタイプスイッチ
導入遺伝子構築に必要であるすべての配列を含むに違いないことを報告した。
【００９７】 従って、選択するいかなるヒトの定常領域も、過度の実験なしに本発明に従っ
てマウスに容易に組込み得ることが理解され得る。このような定常領域は、ナイ
ティブなスイッチ配列（すなわち、それぞれ、ヒトのγ1、γ2、γ3、またはγ4 のスイッチを伴うヒトのγ1、γ2、γ3、またはγ4定常領域）に付随し得るか、
または他のスイッチ配列（すなわち、ヒトγ2スイッチを伴うヒトγ4定常領域）
に付随し得る。種々の３’エンハンサー配列（いくつか例を挙げれば、例えば、
マウス、ヒト、またはラット）もまた、使用され得る。同様に、他の調節配列も
また、含まれ得る。
【００９８】 インビボでのアイソタイプスイッチの１つの代替として、および／またはそれ
に加えて、Ｂ細胞が「キメラ」抗体の分泌についてスクリーニングされ得る。例
えば、Ｌ６マウスは、完全なヒトＩｇＭ抗体を産生することに加えて、マウス定
常領域（例えば、種々のγ（すなわち、マウスＩｇＧ１、２、３、４）など）に
結合された完全ヒト重鎖Ｖ、Ｄ、Ｊ領域を有する抗体を産生する。このような抗
体は、それら自体の的確さにおいて非常に有用である。例えば、ヒト定常領域は
、当該分野で周知のインビトロアイソタイプスイッチ技術を通して、抗体上に含
まれ得る。あるいは、および／または、さらに、マウス定常領域をほとんど含ま
ないかまたは全く含まない、このような抗体のフラグメント（すなわち、Ｆ（ａ
ｂ）およびＦ（ａｂ’）2フラグメント）が調製され得る。
【００９９】 上記に議論したように、抗体産生に対する最も重要な因子は、所望の抗原また
は抗原上のエピトープに対する特異性である。その後、抗体のクラスが、治療的
な必要性に従って重要になる。換言すれば、抗体の治療的指標は、特定のアイソ
タイプまたはクラスを提供することによって増強されるのであろうか。この疑問
の考慮は、補体結合の問題などを惹起し、次いで、抗体の特定のクラスまたはア
イソタイプの選択をさせる。γ定常領域は、抗体の親和性成熟を補助する。しか
し、導入遺伝子上のヒトγ定常領域の包含は、このような成熟を達成するために
必要ではない。むしろ、このプロセスは、ｍｕコードされた導入遺伝子上でトラ
ンススイッチされるマウスγ定常領域と共に、同様に進行するようである。
【０１００】 （実施例１：マウスγ１−ヒト γ４またはマウスγ１−ヒト γ１のための
ＹＡＣベクター） ヒトγ２スイッチエレメントおよびヒトＣＨ γ２エキソンを、マウスγ１ス
イッチエレメントおよびヒトＣγ１エキソンまたはヒトＣγ４エキソンのいずれ
かで置換するために、親のＹＡＣ ｙＨ１Ｃを標的化するための置換ベクターを
調製した（図１）。このベクターを、ｐＭｕＳｈｕ１およびｐＭｕＳｈｕ４とし
て設計した（図５）。このベクターを、ｐＡＣＹＣ１７７として公知の低コピー
数クローニングベクターを使用して構築した。このベクターｐＡＣＹＣ１７７は
、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ
から利用可能であり、そしてその配列は、配列登録番号Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＃Ｘ
０６４０２の下で、Ｇｅｎｂａｎｋ配列データベースにおいて見出され得る。複
製の低コピー数起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増殖させた場合に、プラスミドＤＮＡ
の望ましくない再編成または欠失を妨害するために有用である。
【０１０１】 第１の工程は、標的化するベクターについて必要とされるエレメントを適応さ
せるために、ｐＡＣＹＣ１７７中にリンカーを導入することであった。このリン
カーは、以下の制限部位を含んだ：ＮｈｅＩ−ＳａｌＩ−ＳｍａＩ−ＮｏｔＩ−
ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ。
【０１０２】 このリンカーのヌクレオチド配列（配列番号２）を以下に示す： ５’−ｃｔａ ｇｔｃ ｇａｃ ａａａ ｔａｔ ｔｃｃ ｃｃｇ ｇｇｃ ｇ
ｇｃ ｃｇｃ ｔｔａ ｃｇｔ ａｔｇ ａａｔ ｔｃａ ｇｃｇ ｃｇｃ ｔ
ｔｃ ｔａｇ ａａｃ ｔｃｇ ａｇｔ ｇａｇ ｃｔｃ。
【０１０３】 このリンカーの相補鎖のヌクレオチド配列（配列番号３）を以下に示す： ５’−ｇａｔ ｃｇａ ｇｃｔ ｃａｃ ｔｃｇ ａｇｔ ｔｃｔ ａｇａ ａ
ｇｃ ｇｃｇ ｃｔｇ ａａｔ ｔｃａ ｔａｃ ｇｔａ ａｇｃ ｇｇｃ ｃ
ｇｃ ｃｃｇ ｇｇｇ ａａｔ ａｔｔ ｔｇｔ ｃｇａ。
【０１０４】 （制限酵素） もし他に記述がなければ、全ての制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入された。さらに、全て
の制限消化条件は、以下の条件に従って、標準化された：１μｇのＤＮＡを、２
０μｌの適切な制限緩衝液中で、５ユニットの制限酵素を１時間かけて使用する
ことで消化した。制限緩衝液は、特定の酵素について製造業者によって特定化さ
れ、そしてこの組成物は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．
（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の商品カタログで提供される。
【０１０５】 リンカーを導入するために、ｐＡＣＹＣ１７７を、製造業者の指示に従って制
限酵素ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで消化した。上に示されるようなリンカーは、アガ
ロースゲルで単離され、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１）
（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使用して精製したｐＡＣＹＣ１７７の２２０８ｂｐフ
ラグメントで連結される。この工程により、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位
を含むベクターの必須でない領域のみを除去した。
【０１０６】 次の工程は、酵母ＵＲＡ３遺伝子を、プロモータおよびＹＡＣを含む酵母細胞
の選択のための標的といてコード配列を用いて導入し得る。プロモータおよびコ
ード配列を含むＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡ １９７１ｂｐフラグメントは、ｐＴＡ
Ｃ４から得られた。これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）カタログ番号６７３７９（Ｍａｎａｓｓａｓ，
ＶＡ）から利用可能であり、そしてこの配列は、寄託番号＃ＵＯ１０８６を使用
してＧｅｎｅｂａｎｋから得られ得る。ＵＲＡ３フラグメントはまた、標的化の
ために十分な３’相同体を提供する。このプラスミドｐＹＡＣ４を、製造業者の
指示に従って、制限酵素（ＳａｌＩおよびＭｓｃＩ）で消化した。同様にベクタ
ーとリンカーの組合せ（ｐＡＣＹＣＩ７７／リンカー）を、製造業者の指示に従
ってＳａｌＩおよびＳｍａＩで消化した。続いて、この２つの制限酵素ヌクレオ
チドで消化したＤＮＡ ｐＡＣＹＣ１７７およびＵＲＡ３を、共に連結しさせ、
Ｉｎｔ２を生成した。
【０１０７】 次の工程により、製造業者の指示に従って、ＸｂａＩおよびＳａｃＩでＩｎｔ
２をまず消化することでβガラクトシダーゼ遺伝子（βＧａｌ）を導入し得た。
このβＧａｌ遺伝子を、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能なベクターｐＧＫ β Ｇａｌからクローニング
した。このＤＮＡ ｐＧＫ β Ｇａｌを、制限酵素（ＸｂａＩおよびＳａｃＩ
）で消化した。ｐＧＫ β Ｇａｌ由来の線状化Ｉｎｔ２および２５５３ｋｂフ
ラグメントを共に連結させ、Ｉｎｔ３と呼ばれる次の中間体を産生した。
【０１０８】 上のβＧａｌ発現構築物は、不完全である。βＧａｌの欠損部位は、ｐＧＫβ
Ｇａｌプラスミドを制限酵素（ＳａｃＩおよびＮｃｏＩ）で消化することによっ
て得られる。ｐＧＫβｇａｌ消化由来の１１６５ｋｂフラグメントを、アガロー
スゲル電気泳動によって単離した。ここで、このフラグメントを、エチジウムブ
ロミド染色ゲルから切除し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０
１）（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を上記のように精製した。同様に、Ｉｎｔ３を、製造
業者の指示に従って、制限酵素ＳａｃＩで消化した。この線状化Ｉｎｔ３を、ア
ガロースゲル電気泳動により単離した。ｐＧＫβｇａｌ由来の１１６５ｂｐフラ
グメントおよびこの線状化Ｉｎｔ３を、酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から市販）を使用して共に連結させた。
このＤＮＡフラグメントを再単離し、次いで、末端を平滑末端化するためにＫｌ
ｅｎｏｗフラグメントで処理した。ＳａｃＩ平滑末端に平滑末端化連結する、線
状化ＤＮＡを、酵素（ＮｃｏＩ）を使用して環状にし、Ｉｎｔ４を産生する。
【０１０９】 （５’相同体の導入） 標的化組換えのための５’ホモログの領域を、３’末端の助けによりＡ−２８
７−Ｃ１０ ＹＡＣの配列から単離し、そしてプラスミドｐｐＫＭｌｃへ優先的
にクローン化した（Ｍｅｎｄｅｚら，ＮａＬｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：
１４６−１５６（１９９７）を参照のこと）。Ａ２８７−Ｃ１０ ＹＭＣを、ヒ
トＶＨ6遺伝子のＰＣＲプライマーを使用する、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ ｈｕｍａｎ ＹＡＣ ｌｉｂｒａｒｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＤＮＡプールをスク
リーニングすることによって単離した。Ａ２８７−Ｃ１０ ＹＭＣの単離および
特徴付けを、１９９４年２月３日に刊行された国際特許出願ＷＯ９４／０２６０
２（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）に詳細に記載した。この開示は、本明細書中
で参考として援用されている。
【０１１０】 Ｉｎｔ４を、制限酵素（ＮｏｔＩおよびＳｎａＢＩ）で消化し、次いで以下の
ようなＣａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼで処理した：制限消化反応
２０μｌ中のＤＮＡ１μｇ、５ユニットのＣａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホスフ
ァターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ
）。酵素およびＤＮＡを、３０℃で３０分間インキュベートし、次いで、さらに
３０分間６５℃で加熱し、ホスファターゼを変性させた。このベクターｐｐＫＭ
ｌｃを、制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で消化し、次いでＫｌｅｎｏｗフラグメントで
処理して、ＥｃｏＲＩ部位を除去するために平滑末端を作製した。線状化ｐｐＫ
Ｍｌｃを、製造業者の指示に従って、制限酵素ＮｏｔＩで単離および消化した。
約１ｋｂ５’相同体のフラグメントを、単離した。次に、１ｋｂフラグメントを
、ＮｏｔＩおよびＳｎａＢＩで消化したＩｎｔ４と共に連結した。このＤＮＡ調
製物を、Ｉｎｔ５と呼ぶ。
【０１１１】 γ１およびγ４ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ２およびＣＨ３コードエ
キソン、膜貫通エキソンおよび下流の配列の約３ｋｂ（それぞれ約７ｋｂ）を、
ｐＢＲ３２２由来の２つの中間体ＤＮＡを介して、組換えベクターに導入した。
【０１１２】 第１に、ｐＢＲ３２２を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔ
ｉｎｅホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、そしてＰ１クローン♯１７３７（Ｇ
１）由来のγ１配列を含む、約７ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと連結した。
Ｐ１ファージクローンをＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。この結果、中間体プラスミドｐＣＧ１２を得た。
【０１１３】 第２中間体を、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ）でｐＢＲ３２２
を消化することによって構築した。この３９８６ｋｂフラグメントを、Ｃａｌｆ
Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼで処理し、そしてＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入したＢＡＣクローン＃１
７６Ｅ１０由来のヒトγ４配列を含む約７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフ
ラグメントで連結した。この中間体プラスミドをｐＣＧ４３を呼ぶ。
【０１１４】 標的化ベクターの構築物を完成させるために、新規なリンカーを、Ｉｎｔ５の
ＸｂａＩ制限部位にクローン化した。このリンカーは、以下の制限部位を有した
：ＸｂａＩ・ｋｉｌｌ−Ｍｆｅｌ−ＳｓｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｎａＢＩ−Ｂ
ｃｌＩ−ＸｈｏＩ−ＭｌｕＩ−Ｘｂａ・ｋｉｌｌ。その部位にクローン化された
リンカーを有するＩｎｔ５を、Ｉｎｔ６と呼ぶ。このリンカー配列番号４を、以
下に示す： ５’ｃｔａ ｇｇｃ ａａｔ ｔｇａ ｔａａ ｔａｔ ｔａａ ｇｃｔ ｔｔ
ａ ｃｇｔ ａｔｃ ｔｇａ ｔｃａ ｔｃｃ ｔｃｇ ａｇａ ｃｇｃ ｇｔ
ｇ相補鎖配列（配列番号５）： ５’ｃｇｔ ｔａａ ｃｔａ ｔｔａ ｔａａ ｔｔｃ ｇａａ ａｔｇ ｃａ
ｔ ａｇａ ｃｔａ ｇｔａ ｇｇａ ｇｃｔ ｃｔｇ ｃｇｃ ａｃｇ ａｔ
ｃ。
【０１１５】 このリンカーは、以下のＩｎｔ６において得られた： Ａ２８７−ＳｎａＢＩ（ｅｘ）−ＥｃｏＲＩ−ＢｓｓＨＩＩ−ＸｂａＩ（ｅｘ）
−ＭｆｅＩ−ＨｉｎｇＩＩＩ−Ｂｃ１Ｉ−ＸｈｏＩ−Ｍ１ｕＩ−ｐＧＫ−β Ｇ
ａｌ。
【０１１６】 制限部位ＸｂａＩ・ｋｉｌｌは、特定のＸｂａＩ部位を、大きなＤＮＡへの連
結の際に排除されることを示す。このリンカーは、容易に消化されるので、その
結果、このリンカーは、ＸｂａＩ部位に連結し得るが、この部位は、連結を切り
抜けられない。リンカーを含む特定のＸｂａＩ部位を、リンカーを第１にクロー
ン化することによって決定し、次いで、以下の組みの制限酵素の各々でＤＮＡを
消化した：ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ；ＸｂａＩおよびＳｐｈＩ；ならびに
ＭｌｕｌおよびＳｐｈＩ。このリンカーの導入により、１つのＸｂａＩ部位を除
去する。Ｉｎｔ６のリンカーの位置を、新しく誘導したＨｉｎｄＩＩＩ部位とＩ
ｎｔ５に存在したＮｏｔＩ部位との間の距離によって決定した。
【０１１７】 （マウスγ１スイッチ領域のクローン化） プラスミドＥＨ１０は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎから
得られ、そしてこれは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント上のマウスの
γ１スイッチ領域を含む、ＢＲ３２２２ベースのプラスミドである（Ｍ．Ｒ．
Ｍｏｗａｔｔら，Ｊ．Ｉｎｎｕｎｏｌ．１３６：２６４７−２６８３（１９８３
））。このプラスミドを、制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で消化
し、そしてマウスγ１スイッチを含む１０ｋｂのフラグメントを、上記のように
単離し、そして精製した。
【０１１８】 （ｐＭＳＬ４の構築物） ｐＭＳＬ１の構築物は、３つの方法の連結を含む。第１のエレメントは、上記
のようにＥＨ１０を消化するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩから単離したマウ
スγ１スイッチを含む１０ｋｂのフラグメントであった。第２のエレメントは、
ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＢＲ３２２であった。最終のエレメ
ントは、約７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩフラグメント上のヒトγ４
を含む、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド（ｐＣＧ４３）であった。３つの全て
は、ｐＭＳＬ４を生成するために共に連結される。
【０１１９】 （ｐＭＳＬ１の構築） ｐＭＳＬ１の構築物はまた、３つの方法の連結を含む。第１のエレメントは、
上記のようにＥＨ１０を消化するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩから単離した
マウスγ１スイッチを含む１０ｋｂのフラグメントであった。第２のエレメント
は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＢＲ３２２であった。最終のエ
レメントは、ヒトγ１の約７ｋｂフラグメントを含むｐＢＲ３２２ベースのプラ
スミドｐＣＧ１２であり、これは、ＨｉｎｄＩＩＩ ｋｉｌｌ−ＨａｍＨＩリン
カーを７ｋｂフラグメントの３’末端上のＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入することに
よって改変された。このようにして、改変したプラスミドは、ＢａｍＨＩおよび
Ｈｉｎｄ ＩＩＩと共に２重で消化した後、７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨ
Ｉフラグメントを放出する。続いて、フラグメントを３ピースの連結に使用する
。
【０１２０】 （マウスの３’エンハンサー） 本発明者らは、ｐＩＢにクローン化したマウス３’エンハンサー（ＨＳＩｇ２
）を含むｐＩＢγ２の４ｋｂ標的化ベクターのＭＩｕＩフラグメント由来のＳｔ
ｕＩ制限消化により、エンハンサーの０．９ｋｂのコア部分を単離した（Ｍ．Ｊ
．Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（
１９９７））。
【０１２１】 本発明者らは、Ｉｎｔ６を、制限酵素ＸｈｏＩで消化し、続いて、Ｋｌｅｎｏ
ｗフラグメントで処理し、平滑末端を作製した。本発明者らは、得られた線状化
Ｉｎｔ６をマウス３’エンハンサーの０．９ｋｂのＳｔｕＩフラグメントで連結
し、Ｉｎｔ７を作製した。本発明者らは、ＥｃｏＲＩを使用してサンプルクロー
ンで制限消化を実施することによってクローン化反応を確認した。さらに、本研
究者らは、ＮｃｏＩ；ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ；ならびにＨｉｎｄＩＩＩ
およびＰｖｕＩＩおよび０．９ｂｐ ＳｔｕＩフラグメントの公知の制限地図で
消化することによるフラグメントの所望の起点を確認した。
【０１２２】 本発明者は、別のリンカーをプラスミドＩｎｔ７に導入した。本発明者らは、
ＭｆｅＩおよびＳｎａＢＩ（２重消化）でＩｎｔ７を消化し、続いて、Ｃａｌｆ
Ｉｎｓｔｅｓｔｉｎｅホスファターゼで処理した。次に、本発明者らは、連結
反応を実施し、そして中間体Ｉｎｔ８を作製することによって以下のリンカーを
導入した。リンカーＩｎｔ７によって挿入される制限部位は、以下のようであっ
た：ＭｆｅＩ・ｋｉｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｎａＢＩ−ＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ
−Ｂａｍ ＨＩ−Ｂｇ１ＩＩ−ＮｈｅＩ・ｋｉｌｌ。さらに、ＭｆｅＩ・ｋｉｌ
ｌは、ＭｆｅＩ部位が、大きなＤＮＡへの連結で排除されたことを示した。
【０１２３】 このリンカーのヌクレオチド配列（配列番号６）： ５’ａａｔ ｔａａ ｇｃｔ ｔｇｔ ａｃｇ ｔａｃ ｔｇａ ｔｃａ ａｇ
ａ ｔｃｔ ｇｇａ ｔｃｃ ａｇａ ｔｃｔ。
【０１２４】 相補鎖のヌクレオチド配列（配列番号７）： ５’ａｇａ ｔｃｔ ｇｇａ ｔｃｃ ａｇａ ｔｃｔ ｔｇａ ｔｃａ ｇｔ
ａ ｃｇｔ ａｃａ ａｇｔｔ。
【０１２５】 （標的化ベクター） 完全標的化ベクターを、制限酵素（ＳｃｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）でＩｎｔ
８を消化することによって構築し、続いて、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅホス
ファターゼで処理した。このプラスミドｐＭＳＬ１およびｐＭＳＬ４を、制限酵
素（ＳｃｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で部分的に消化した。１７ｋｂのフラグメ
ントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。精製した１７ｋｂフ
ラグメントを、Ｉｎｔ８で連結し、図５に示されるような最終標的化ベクターを
作製した。
【０１２６】 （実施例２） （ｙＨ１Ｃ ＹＡＣのγ１またはγ４構築物の標的化） ＴＶ１またはＴＶ４ベクター（５μｇＤＮＡ）を、制限酵素（ＮｏｔＩ）で消
化することによって線状化した（図５）。このＤＮＡをフェノール抽出によって
精製し、続いてフェノール／クロロホルム抽出によって精製した。次いで、ＤＮ
Ａをエタノールで沈殿させ、次いで、ＬｉＡｃ形質転換プロトコールを使用して
ｙＨＩｃ ＹＡＣを含む酵母クローンの形質転換に使用した（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ
，Ｒ．Ｈ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６，３３９−３４６（１９８９）を参
照のこと）。形質転換物をＳＣ−ＵＲＡ寒天培地プレート上にプレート化し、そ
してコロニーが現れてくるまで（すなわち、約５〜６日間）、２２℃でインキュ
ベートした。ＳＣ−ＵＲＡプレートは、酵母の増殖のための培地を含み、この酵
母は、ウラシルを含まないので、ウラシル自体を産生し得る酵母コロニーのため
に選択する。同様に、ＳＣ−ＬＹＳプレートは、酵母の増殖のための培地を含み
、この酵母は、リジンを含まず、リジン自体を産生し得る酵母コロニーのために
選択する。得られたコロニーをＳＣ−ＵＲＡプレートおよびＳＣ−ＬＹＳプレー
ト上に再び収集し（遺伝子試験のため）、ＬＹＳマーカーの欠損について調べた
。ＳＣ−ＵＲＡ上で増殖しそしてＳＣ−ＬＹＳ上で増殖しない唯一のクローンを
、ＹＰＤＡ培地中、２２℃で４８時間かけて増殖させた。ＹＡＣ ＤＮＡを、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離および分析し、所望のアイソタイプ
置換が予想通りに生じるかどうかを評価した。この場合、ヒトγ１またはγ４Ｃ
Ｈエキソンが、ヒトγ２ＣＨコードエキソンで置換されるべきである（図１）。
ここで使用される酵母培地は、ＢＩＯ １０１（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）から得られ
る捕捉物から調製された。
【０１２７】 このアッセイに使用するためのＰＣＲプライマーは、以下の通りであった： ＨＧＩ：５’ｃａｃ ａｃｃ ｇｃｇ ｇｔｃ ａｃａ ｔｇｇ ｃ （配列番
号８） ＨＧ３：５’ｃｔａ ｃｔｃ ｔａｇ ｇｇｃ ａｃｃ ｔｇｔ ｃｃ （配列
番号９）。
【０１２８】 ＰＣＲ反応は、以下の３５サイクルからなる：１サイクルにおき、９４℃で１
５秒間、続いて６０℃で４５秒間、次いで７２℃で９０秒間。ＨＧ１プライマー
は、コンセンサスヒトＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ４アライメント上のヌクレオチド１
８１に配置された。そしてプライマーＨＧ３は、このアライメントのヌクレオチ
ド９９４に配置された。これらのプライマーは、Ｃγ１、Ｃγ２、およびＣγ４
アイソタイプ由来のＤＮＡを増幅する。
【０１２９】 ヒトＣγ遺伝子において制限部位多型に起因して、テンプレートＤＮＡの特定
のアイソタイプは、ＤＮＡフラグメントの独特のセットを得るために、ＰＣＲ産
物の制限消化により決定され得る。例えば、この制限酵素ＰｖｕＩＩは、Ｃγ２
ＤＮＡがＰＣＲ産物のテンプレートである場合、ＰＣＲ産物を６２１ｂｐおよび
１９６ｂｐの２つのフラグメントに制限するが、Ｃγ１またはＣγ４がテンプレ
ートである場合、この産物を切断しない。同様に、この制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩ
Ｉは、Ｃγ１が得られる場合、ＰＣＲ産物を４３８ｂｐおよび３７９ｂｐの２つ
のフラグメントへ制限する。最後に、この制限酵素Ｂｇ１ＩＩは、Ｃγ４が得ら
れる場合、ＰＣＲ産物を６８６ｂｐおよび１２５ｂｐの２つのフラグメントへ制
限する。この方法において、ＩｇＧの全３種類のイソタイプが識別され得る。
【０１３０】 特徴付けの次のレベルにおいて、正確な遺伝子および所望のＩｇＧイソタイプ
を示す全ての酵母クローンを、サザンブロットアッセイによってさらにスクリー
ニングした（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第９章，３１−４５頁，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９
））。各クローンについてＤＮＡの５μｇの試料を、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ
、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ ＨＩ）で一晩消化した。置換ベクター上で起点標的
として役立つｙＨＩＣ ＹＡＣ ＤＮＡをプロトコールとして使用した。この消
化したＤＮＡを、０．８％のアガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイド
で染色し、撮影し、次いでナイロン膜上で移動させた（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）。次に、ＹＡＣ候補物を、以下のＩｇ遺伝子由来のハイブリダイゼ
ーションプローブを使用するサザンブロットでチェックした：Ｄ，ｍｕ，Ｊ，Δ
，マウス３’エンハンサー，Ｃｇｌ，４，Ｖ１−６（Ｍ．Ｊ．Ｍｅｎｄｅｚら，
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６，２９４−３０７（１９９５）；Ｍ．Ｊ Ｍｅｎｄｅｚ
ら，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ第１５巻，１４６〜１５６ （１９９７）
（Ｖ３プローブ）を参照のこと）。
【０１３１】 以下のプローブを、サザンブロットに使用した： ＨＧ１：ＣＡＣ ＡＣＣ ＧＣＧ ＧＴＣ ＡＣＡ ＴＧＧ Ｃ （配列番号８
）； ＨＧ３：ＣＴＡ ＣＴＣ ＴＡＧ ＧＧＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＣＣ （配列番号
９）。 これらのプライマーは、γ１，２，および４に対して約８２０ｂｐフラグメント
を増幅する。いずれも、非常に相同性である場合にプローブとして使用され得る
。
【０１３２】 ＶＨ５を増幅するために、以下のプライマーを使用した： ＶＨ５Ａ：５’ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＴＣ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＧＴ Ｔ
ＴＣ ＴＣＴ（配列番号１０） ＶＨ５Ｂ：５’ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＴＴ ＴＧＴ Ｇ
ＴＣ ＴＣＣ（配列番号１１）。
【０１３３】 ＨＰＲＴのために以下のプライマーを使用した： ＲＥＰ３：５’ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＣＣ ＴＡＴ ＴＧＡ ＣＡＴ ＣＧＣ Ｃ
（配列番号１２） ＲＥＰ４：５’ＧＧＴ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＧＧ （
配列番号１３）。
【０１３４】 そして最後にＣｍｕを増幅するために以下のプライマーを使用した： Ｊｍ１：５’ＧＣＴ ＧＡＣ ＡＣＧ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＧＣ （配
列番号１４） Ｊｍ４：５’ＣＣＣ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＧＧ （配
列番号１５）。
【０１３５】 最後に、本発明者らは、ＣＨＥＦゲルパルス−フィールドゲル電気泳動を使用
するＹＡＣの一般構造の完全な状態を確認した（ＣＨＥＦ ＤＲ−ＩＩ，Ｂｉｏ
Ｒａｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
【０１３６】 本発明者らは、ｙＨ２ＢｍとしてＹＡＣコードＣγ１およびｙＨ２Ｃｍとして
ＹＡＣコードヒトＣγ４を消化した。
【０１３７】 （実施例３） （ｙＨＩＣ ＹＡＣをγ１（ＴＶ Ｇ１）およびｙ４（ＴＶ Ｇ４）にレトロ
フィッティングするためのベクターの構築） ｙＨ１Ｃ ＹＡＣをｙＨＧ１およびｙＨＧ４にレトロフィット（ｒｅｔｒｏｆ
ｉｔ）する標的化ベクターを調製するためのベクター構築は、図６に概略的に示
される。この標的化ベクターは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉ
ｎｃ．（Ｖｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手可能なｐＡＣＹＣ１７７（Ｇｅｎｅｂ
ａｎｋ ＃Ｘ０６４０２）の骨格上に構築した。本発明者らは、リンカーをｐＡ
ＣＹＣ１７７に導入して、マウス３’エンハンサーのクローニングを促進した。
本発明者らは、このリンカーを含むｐＡＣＹＣ１７７をＩｎｔ９と称した。この
リンカー中の制限酵素クローニング部位の配置は、以下の通りである：Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＭｌｕＩ−ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ。リンカー
ヌクレオチド配列（配列番号１６）を以下に示す。
【０１３８】 ５’ａｇｃ ｔｔｇ ｔｃｇ ａｃａ ｃｇｃ ｇｔｔ ｔａａ ｔｔａ ａ
ｇｇ ｃｃｇ ｇｃｃ ａ 相補鎖のヌクレオチド配列（配列番号１７）： ５’ ａｇｃ ｔｔｇ ｇｃｃ ｇｇｃ ｃｔｔ ａａｔ ｔａａ ａｃｇ
ｃｇｔ ｇｔｃ ｇａｃ ａ 本発明者らは、ｙＨＩＣ標的化ベクターからマウス３’エンハンサーを約４ｋ
ｂ ＭｌｕＩフラグメントとしてクローン化した。４ｋｂ エンハンサーフラグ
メントは、上で示されるリンカーで修飾されたｐＡＣＹＣ１７７のＭｌｕＩにク
ローン化され、そしてＤＮＡは、Ｉｎｔ １０と称される。マウス３’エンハン
サーの適切な配置は、制限酵素ＮｇｏＭＩおよびＥａｇＩで予測クローンを消化
することにより決定した。
【０１３９】 （５’相同性領域の増幅） ５’相同性の領域は、ｐＩＢγ２標的化ベクターの関連部分のＰＣＲ増幅によ
り得られた［Ｍ．Ｒ．Ｍｏｗａｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２６４７
〜２６８３（１９８３）］。５’相同性領域を増幅するために使用されるプライ
マーのヌクレオチド配列は、以下である（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｍ１２３８
９を参照のこと）： プライマー１：５’ｔｇｇ ｔｇｇ ｃｃｇ ａｇａ ａｇｇ ｃａｇ ｇｃｃ
ａ（配列番号１８） プライマー２：５’ｃｃｇ ｃｇｇ ｇｃａ ｔｇｃ ａａｃ ｔｔｃ ｇｔａ
ｔａａ ｔｇｔ ａｔｇ ｃｔａ ｔａｃ ｇａａ ｇｔｔ ａｔｔ ｇｔｇ
ｇｇａ ｃａｇ ａｇｃ ｔｇｇ ｇｃｃ ｃａｇ ｇ（配列番号１９） プライマー２は、ＳａｃＩＩおよびＳｐｈＩ部位、ならびにｌｏｘ ｐエレメ
ントを含む。５’相同性領域を、以下のＰＣＲ条件を使用して、ＰＣＲ増幅した
：９４℃で３秒間、続いて５５℃で３０秒、次いで７２℃で６０秒を２０サイク
ル。次いで、この領域を、ＴＡ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした後、配列
決定した。ＴＡ−ＴＯＰＯは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ，ＣＡ）から入手可能である。
【０１４０】 ５’相同性配列決定のためのプライマーを以下に示す： 配列１：ｇｔｃ ｔｇｇ ｃｃｃ ｃｔｃ ｔｇｃ ｔｇｃ（配列番号２０） 配列２：ｃａｃ ｃｃａ ｔａａ ａａｇ ｇｃｔ ｇｇａ（配列番号２１） 逆配列１：ａｃｇ ｇｃｔ ｃａｔ ｇｃｃ ｃａｔ ｔｇｇ（配列番号２２）
逆配列２：ｔａｇ ｔｇａ ｇｔｇ ｇｇｃ ｃｔｇ ａｃｔ（配列番号２３）
。
【０１４１】 本発明者らは、得られた配列を、ヒトスイッチγ２配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ
＃Ｕ３９９３４）と比較して、これが同一であることを決定した。
【０１４２】 （γ４コード領域および３’相同性領域のクローニング） 本発明者らは、制限酵素ＳａｃＩＩを使用して、プラスミドｐＣＧ４３の部分
酵素消化を行うことにより、ヒトγ４コードエキソンおよび３’相同性領域を得
た。次いで、本発明者らは、制限酵素ＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＧＳ４３
を消化し、そして本発明者らは、精製した約７ｋｂのフラグメントを、５’相同
性を含むＴＡベクターにクローン化した。本発明者らは、この中間体組換えＤＮ
Ａ分子を、ＩｎｔＩ Ｇ４と称した。
【０１４３】 ＩｎｔＩ Ｇ４を、ＢａｍＨＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理し、
次いでベクターをアガロースゲル電気泳動を使用して単離した。この単離したベ
クターを、前に記載されるように、ｐＩＢ γ２由来の３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ
フラグメントに連結した。挿入物の配置は、二重消化物のＮｏｔＩ／ｈｉｎｄＩ
ＩＩにより決定した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、消化後のフラグメントのサイズに
より決定されるように、３．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントの５’末端にある
ことが決定された。
【０１４４】 次に、本発明者らは、ｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサープラスミド中のリンカ
ーの配向を決定する必要があった。これは、ＳｍａＩ、および以下の二次酵素、
ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＰａｃＩおよびＦｓｅＩの各々のうちの１つを使用して、
ｐＡＣＹＣ１７７／リンカーの二重消化のパネルを調製することにより、行った
。リンカーの配向は、得られたフラグメントのサイズにより決定した。
【０１４５】 ｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサープラスミド中の制限部位の位置は、以下のと
おりである：ＣｌａＩ／ＳｍａＩ（ｐＡＣＹＣ１７７）−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆｓ
ｅＩ−ＰａｃＩ−ＭｌｕＩ−（（エンハンサー：ＰｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ−ＮｃｏＩ−ＮｈｅＩ−ＡｐａＩ））−ＭｌｕＩ−ＳａｌＩ）−ＰｆｍｌＩ
（ｐＡＣＹＣ１７７）。
【０１４６】 次の工程は、ＵＲＡ３遺伝子をｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサープラスミドに
クローン化することであった。この目的は、標的化ベクターを、選択可能な酵母
マーカー、ならびに相同組換えを誘導する３’相同性とレトロフィットすること
である。ＵＲＡ３遺伝子をクローン化するために、Ｉｎｔ２（実施例１に記載さ
れる、本来のＴＶ１およびＴＶ４について構築される）を、ＳａｃＩＩ／Ｓａｌ
Ｉを使用して消化した。同様に、ｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサープラスミドを
、ＳａｃＩＩ／ＳａｌＩで消化した。Ｉｎｔ２の消化による３．８ｋｂフラグメ
ント、およびｐＡＣＹＣ１７７／エンハンサー由来の５ｋｂフラグメントを、ア
ガロースゲル電気泳動で単離し、そして一緒に連結した。得られたプラスミドは
、ｐＡＣＹＣ１７７骨格中に、エンハンサーおよびＵＲＡ３遺伝子を含む。次に
工程は、２つ以上のリンカーを、クローン化された３．４ｋｂ Ｍａｂ ＨＩフ
ラグメントを有するＩｎｔ１ Ｇ４に導入することであった。得られた中間体を
、Ｉｎｔ２ Ｇ４と称した。
【０１４７】 リンカーは、以下のとおりである：ＮｏｔＩｋｉｌｌ−ＦｓｅＩ−ＮｏｔＩｋ
ｉｌｌ、およびリンカー配列： ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴ（配列番号２４） ＴＡＣＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧ（配列番号２５） 第２のリンカーは、以下の制限部位を有した： ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶ−ＭｆｅＩ−ＦｓｅＩ−ＳｆｉＩ−ＢａｍＨ
Ｉｋｉｌｌ：
【０１４８】
【化１】
【０１４９】 リンカー１を導入する目的は、最後のクローニング工程のためのＦｓｅＩを提
供することならびにＮｏｔＩ部位の１つのを排除することであった。さらに、こ
れは特有のＮｏｔＩ部位を有する最終標的化ベクターを残し、これは、形質転換
前にこの標的化ベクターを線状化するために使用した。第２のリンカーを使用し
て、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣの完全下流領域を回復するために必要な最後のフラグメン
ト、１．５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをクローン化した。
【０１５０】 リンカー２を、Ｂａｍ ＨＩを用いる部分消化により導入した。ＩｎｔＩ Ｇ
４（クローン化された３．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントを有する）を、Ｂａ
ｍＨＩで部分的に消化し、そして部分消化物を１３ｋｂフラグメントとしてアガ
ロースゲルで単離した。この１３ｋｂフラグメントを、子ウシ腸ホスファターゼ
で処理し、そしてリンカーに連結した。このリンカーの位置およびその配向（こ
れが３．４ＢａｍＨＩフラグメントの３’末端においてＢａｍＨＩを修正したか
否か）は、ＭｆｅＩおよびＮｏｔＩでクローンを消化（二重消化）することによ
り決定した。ＭｆｅＩ部位は、リンカーと共に導入され、そしてＮｏｔＩ部位は
ベクター中に存在する。相対的なフラグメントのサイズにより、リンカーの位置
および配向を同定し得る。リンカーとレトロフィッティングされたプラスミドは
、ここでは、Ｉｎｔ３ Ｇ１およびＩｎｔ３ Ｇ４である。
【０１５１】 次の工程は、ｐＩＢγ２プラスミドのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ二重消化により
得た１．５ｋｂ フラグメントをＩｎｔ３ Ｇ４プラスミドにクローン化するこ
とである。この１．５ｋｂフラグメントを、Ｉｎｔ３ Ｇ４のＢａｍＨＩ部分消
化物／ＭｆｅＩ消化物にクローン化した。これは指向性クローニングであったた
め、配向決定はこの工程で必要なかった。得られたプラスミドをＩｎｔ４ Ｇ４
と称した。
【０１５２】 次の工程は、制限部位ＮｏｔＩｋｉｌｌ−ＦｓｅＩ−ＮｏｔＩＫｉｌｌでリン
カーを導入することであった。Ｉｎｔ４ Ｇ４をＮｏｔＩで消化し、子ウシ腸ホ
スファターゼで処理し、アガロースゲルで単離し、そしてリンカーと連結した。
得られたプラスミドをＩｎｔ５ Ｇ４と称した。また、この工程でリンカーの配
向を決定する必要はなかった。結果として、特有のＮｏｔＩ部位は排除され、そ
して１つのＦｓｅＩ部位が加わった。ＦｓｅＩ部位の導入の目的は、５’相同性
領域から１．５ｋｂフラグメントにわたるフラグメントのｐＡＣＹＣ１７７／エ
ンハンサー／ＵＲＡ３プラスミドへのクローニングを可能にすることである。
【０１５３】 最終のクローニング工程は、Ｉｎｔ５ Ｇ４のＦｓｅＩでの部分消化、続いて
アガロースゲルによる１３ｋｂフラグメントの単離、およびｐＡＣＹＣ１７７／
エンハンサー／ＵＲＡ３の特有のＦｓｅＩ部位への連結であった。この挿入物の
配向は、ＮｏｔＩ／ＦｓｅＩを用いる二重制限消化により決定した。最終の標的
化ベクターをＴＶ Ｇ４と称した。
【０１５４】 ヒトＣγ１コードエキソンおよび３’相同性領域とｙＨ１Ｃ ＹＡＣをレトロ
フィッティングするＴＶＧ１標的化ベクターを構築するために、本発明者らは、
ＴＶ Ｇ４の構築のための上記の手順を使用した。本発明者らは、プラスミドｐ
ＣＴ１２からＣγ１コードエキソンおよび３’相同性領域を得た。
【０１５５】 （実施例４） （非同種スイッチのためのｙＨ１Ｃ ＹＡＣを標的化するための標的化ベクタ
ーＴＶ Ｇ１／２およびＴＶ Ｇ４／２の構築） 次に、本発明者らはベクター、ＴＶ Ｇ１／２を構築し、これは５ｋｂのヒト
スイッチγ２領域ＤＮＡの下流に結合したヒトγ１ＣＨコードエキソンのキメラ
構築物を有する（図３）。さらに、このベクターは、γ１ＣＨコードエキソンの
３’に位置するヒトγ２膜貫通エキソンを含む（図３）。このベクターはｐＡＣ
ＹＣ１７７ベクターに基づき、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手可能である。本発明者らは、以下の手順を使用して
、このベクターを構築し、これをＴＢ Ｇ１／２と称した： １． 第１に、５μｇのｐＩＢγ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、そして６．５ｋｂフラグメントをアガロースゲルで単離した。湖の
ベクターＰＩＢγ２は、２つのＥｃｏＲＩ制限酵素部位に隣接したγ２を有する
ヒトゲノムＤＮＡを含み、以前はにｙＨ１Ｃを生成するために使用された。次い
で、６．５ｋｂフラグメントをｐＣＲTM２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に連結した。ｐＣＲ２．１は、１μｇ
のプラスミドをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして子ウシ腸ホスホタ
ーゼで処理し、そしてアガロースゲルで単離することによって調製した。
【０１５６】 ２． 得られたプラスミド（６．５ｋｂフラグメント＋ｐＣＲTM２．１ベクタ
ー）を、制限酵素ＸｍｎＩを用いる部分消化に供し、次いで制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩを用いる消化に供した。ＸｍｎＩを用いる消化はγ２終止コドンの７５ｂｐ
上流で起こる。従って、γ１／γ２キメラ遺伝子の４番目のエキソンは、初期に
、２つの３’γ２膜エキソンに加えて、γ２の７５ｂｐを含む。γ１およびγ２
のコード領域は、この７５ｂｐ領域にわたって同一であり、効果はない。
【０１５７】 ３． 次に、５μｇのｐＣＧ１２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍｎＩで
消化し、そして１．７ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離し
た。ベクターｐＣＧ１２（これは実施例１に記載される）は、約７ｋｂのヒトγ
１を含む。
【０１５８】 ４． ｐＣＧ１２から得られるγ１のコード配列のほとんどを含む１．７ｋｂ
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｍｎＩフラグメントを、工程２に記載されるＨｉｎｄＩＩ
Ｉ／ＸｍｎＩで部分消化したベクター（６．５ｋｂフラグメント＋ｐＣＲTM２．
１ベクター）に連結した。
【０１５９】 ５． 得られるプラスミドは、膜貫通エキソンを含むγ２の下流領域に結合し
たγ１のコード領域のキメラ配列を含む。本発明者らは、Ｅｃｏ４７ＩＩＩを用
いて制限消化することによって、プラスミドの組成を確証した。
【０１６０】 ６． 実施例３に記載されるクローン化された５’相同性を有するｐＣＲTM２
．１ベクターを、ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。同様に、本発明者ら
は、工程５に記載されるプラスミドを、ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化（二
重消化）し、そして約５ｋｂフラグメントをこのプラスミドから５’相同性を有
するｐＣＲ２．１ベクターにクローン化した。次いで、本発明者らは、得られた
ベクターをＳａｃＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、そして実施例５に記載される
ベクターから得られたこの部位のフラグメントにクローン化した。本発明者らは
、ＳｐｈＩ消化物によって、このＳａｃＩＩ挿入物の配向を決定した。得られた
プラスミドは、ｐＣＲ２．１ベクターの５’相同性の領域から下流にキメラγ１
／γ２ＣHエキソンを含んだ。本発明者らはこのベクターをＴＡ Ｇ１／２と称
し、このベクターはＴＡクローニングベクターとして公知の、ｐＣＲ２．１から
誘導され、そしてキメラγ１／γ２ＣHエキソンを含むことを示す。
【０１６１】 ７． 本発明者らは、工程６に記載されるクローン化された５’相同性を有す
るｐＣＲＴＭ２．１ベクターを、以下のように、酵母選択性マーカー遺伝子、Ｕ
ＲＡ３にレトロフィッティングした： ａ． 本発明者らは、Ｉｎｔ２（実施例１に記載される）をＳａｌＩで消化す
ることによってＵＲＡ３遺伝子を得た。ＳａｌＩ消化の産物を、Ｋｌｅｎｏｗフ
ラグメントとのさらなる反応に供し、平滑末端を作製する。これらの産物を、Ｓ
ａｃＩで連続して消化する。
【０１６２】 ｂ． 工程６で産生したｐＣＲTM２．１ベクターを、ＢａｍＨＩで消化し、次
いでＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化し、そしてさらにＳａｃＩで消化し
た。
【０１６３】 ｃ． ７（ａ）で得られたＵＲＡ３遺伝子を、７（ｂ）のように、調製された
ｐＣＲＴＭ２．１ベクターに連結した。得られたベクターは、ＮｏｔＩ部位（一
方はＩｎｔ２におけるリンカー由来であり、他方はｐＣＲ２．１中に本来存在す
る）が隣接したＵＲＡ３遺伝子の下流を有する５’相同性領域を含む。
【０１６４】 ８． 本発明者らはＮｏｔＩフラグメントを工程７で産生したプラスミドから
切除し、そしてこれをＩｎｔ１（ＴＶ１および４のクローニングのためにも使用
される）のＮｏｔＩ部位にクローン化した。本発明者らは、このＮｏｔＩフラグ
メントの正確な配向を、ＥｃｏＲＩ消化物を使用することによって決定した。得
られたプラスミド（本発明者らはＩｎｔ３を消化した）は、低コピー起源バック
グランド（ｐＡＣＹＣ１７７）中にＵＲＡ３遺伝子の下流を有する５’相同性領
域を有する。
【０１６５】 ９． Ｇ１／２キメラＹＡＣに対する最終標的化ベクターの構築を終了するた
め、本発明者らは、ｐＣＲ２．１バックグラウンド（工程６で産生される）内に
クローン化された５’相同性およびＧ１／２キメラＩｇＧ定常領域を有するベク
ターを、ＥｃｏＲＩ制限酵素で部分消化し、続いてＳａｃＩ制限酵素で再切断し
た。本発明者らは、５’相同性領域およびキメラｇ１／２ ＩｇＧ定常領域を含
む８Ｋｂフラグメントを単離し、それをＩｎｔ３のＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ部
位にクローン化し、これによりＴＶ Ｇ１／２標的化ベクターが生じた。本発明
者らは指向性クローニングによりフラグメントを導入したため、挿入物の配向を
決定する必要はなかった。
【０１６６】 あるいは、工程７の後、本発明者らは、５’相同性およびＵＲＡ３遺伝子を、
ＸｂａＩで消化することによって、工程７で記載されるプラスミドから除去した
。次いで、本発明者らは、５’相同性およびＵＲＡ３遺伝子を、工程６に記載さ
れるプラスミドのＸｂａＩ部位にクローン化し、図７に示されるＴＶ Ｇ１／２
ベクターを産生した。
【０１６７】 本発明者らは、いくらか改変した上記の手順を使用してＴＶ Ｇ４／２標的化
ベクターを構築し、これは、５ｋｂのヒトスイッチγ２領域ＤＮＡおよびヒトγ
２ＣＨコードエキソンの上流に連結したヒトγ４コードエキソンを有するキメラ
構築物を有する。
【０１６８】 工程１で産生されたプラスミドを、制限酵素ＸｍｎＩを用いる部分消化に供し
、続いて制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＸｍｎＩによる消化はγ２終止コ
ドンの７５ｂｐ上流で起こる。従って、γ４／γ２キメラ遺伝子の４番目のエキ
ソンは、初期に７５ｂｐのγ２を、２つの３’γ２膜エキソンに加えて含む。こ
の領域において、γ４とγ２との間の単一の塩基対の差違が存在し、これは単一
のアミノ酸の変化を生じる。これを修正するために、本発明者らはＣｌｏｎｔｅ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）製の
Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して、ヒトγ２遺伝
子において、ＣからＴの特定部位の突然変異誘発を行う。
【０１６９】 本発明者らは、以下の２つの合成オリゴヌクレオチドを使用して修復を行う：
一方は、配列をγ２からγ４にスイッチするために必要なヌクレオチドを置換し
、そしてｐＣＲ２．１ベクター中のＮｏｔＩ部位を排除する補助的なオリゴヌク
レオチドは、キメラＧ４／２ ７ｋｂフラグメントをクローン化する。
【０１７０】 ＣをＴで置換するために、本発明者らは以下のオリゴヌクレオチドを使用する
：
【０１７１】
【化２】
【０１７２】 太字のＴ残基は、もとのプラスミドにおいてＣを置換する。
【０１７３】 第２のオリゴヌクレオチド（ＮｏｔＩ部位を排除する）は、以下である：
【０１７４】
【化３】
【０１７５】 このオリゴは、ＮｏｔＩ部位（太字で示される）を含み、ここでＧは、Ａで置換
され、この部位を切断する。本発明者らは、プラスミドの対を配列決定して、正
確なヌクレオチドが置換されたことを確認する。
【０１７６】 （実施例５） （標的化ストラテジー） 本発明者らは、上記ベクターＴＶ１、ＴＶ４、ＴＶ Ｇ１、ＴＶ Ｇ４、ＴＶ
Ｇ １／２およびＴＶ Ｇ４／２を線状化し、そしてこれらを使用して、ｙＨ１
Ｃ ＹＡＣを有する酵母細胞培養物を、酢酸リチウム形質転換によって、形質転
換した。本発明者らは、引き続いて、これらの線状化したベクターを使用して、
上記のようにｙＨ１Ｃ上の標的化遺伝子を置換して、新たなＹＡＣであるｙＨ２
Ｂｍ、ｙＨ２Ｃｍ、ｙＨＧ１、ｙＨＧ４、ｙＨＧ１／２およびｙＨＧ４／２を、
それぞれ産生した（図１〜４）。本発明者らは、形質転換後に酵母細胞をＳＣ−
ＵＲＡ培地上でプレートし、ＵＲＡ３マーカーの取り込みについて選択した。本
発明者らは、パルスフィールドゲル電気泳動を使用して、全ての得られたクロー
ンを、ＹＡＣ完全性について検査した。さらに、本発明者らは、サザンブロット
によってクローンを分析し、構造および同一性を確認した。
【０１７７】 ｙＨＧ１／２の場合には、得られるＹＡＣにおけるＵＲＡ３遺伝子は、５’相
同配列に隣接し、本発明者らは、この遺伝子を、以下のように除去した。
【０１７８】 本発明者らは、ｙＨＧ１／２ Ｙａｃを含む酵母培養物を、５ＦＯＡ（ＵＲＡ
に対するネガティブ選択）を含む寒天プレート上にプレートした。本発明者らは
、得られる５ＦＯＡ耐性クローンを、上に概説するように、パルスフィールドゲ
ルおよびサザンブロットによって、完全性について検査した。
【０１７９】 本発明者らは、上記ストラテジーに従って、ＴＶＧ１ベクターおよびＴＶ Ｇ
４／２ベクターを使用して、それぞれｙＨＧ１ ＹＡＣおよびｙＨＧ４／２ Ｙ
ＡＣを産生する。
【０１８０】 （実施例６） （ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣのＥＳ細胞への導入） 本発明者らは、ＹＡＣであるｙＨ２ＢＭを、以下に詳細に記載するように、酵
母スフェロプラスト融合を介して、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入した。［Ｂ
．Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、第３巻、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、「Ｃｈａｐｔｅ
ｒ ５： Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＹＡＣｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａ
ｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ」、５４
８−５５０頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹを参照のこと］。ｙＨ２ＢＭ含有酵母
細胞を、０．１５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ） ２０Ｔを
使用して、スフェロプラストした。ｙＨ２ＢＭスフェロプラストを、ＨＰＲＴ欠
損Ｅ １４．ＴＧ３Ｂ１マウスＥＳ細胞と融合させ、これを以下に記載するよう
に培養した［Ｔｓｕｄａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４２：４１３−４２１（１９９
７）を参照のこと］。ＨＡＴ選択を、融合の４８時間後に開始した。ＨＰＲＴポ
ジティブＥＳ細胞クローンを、１クローン／１５〜２０×１０6融合細胞の頻度
で選択した。２１のＨＡＴ耐性コロニーを、ゲノム分析のために増殖させ、そし
てサザンブロット分析およびＣＨＥＦブロット分析によって、ＹＡＣ完全性につ
いて分析した。ＥＳ細胞単独と酵母スフェロプラスト単独とを融合させるコント
ロール実験においては、コロニーが検出されなかった。
【０１８１】 詳細な手順は、以下の通りである。
【０１８２】 （酵母スフェロプラストの産生） 過剰の酵母細胞を調製した。なぜなら、５０％までが、スフェロプラスト手順
の間に失われるからである。５×１０7のＥＳ細胞を融合するためには、約５×
１０9の酵母細胞が必要である。
【０１８３】 本発明者らは、選択培地（ＳＣ−）にフリーザーストックを接種し、約５×１
０6細胞／ｍｌの出発接種物を得た。本発明者らは、培養物中の細胞密度を、血
球計を使用して決定した。本発明者らは、２５０ｒｐｍで振盪しながら２３℃で
一晩、細胞を増殖させた。インキュベーションもまた、１４℃または１８℃で実
施して、ＹＡＣの安定性を増加させ得る。３０℃での培養は、ＹＡＣにおけるい
くらかのＩｇ遺伝子セグメントの欠失を生じ得る。午前中に、培養物密度は２×
１０7細胞／ｍｌであった。本発明者らは、ＹＰＤＡ（リッチ）培地で１×１０7 細胞／ｍｌに希釈し、そして２〜３時間インキュベートした。この段階における
培養物密度は、２×１０7細胞／ｍｌを超えるべきではない。なぜなら、指数関
数的に増殖する酵母が、効率的かつ完全なスフェロプラストのために必要である
からである。
【０１８４】 本発明者らは、所望の量の培養物（５×１０9細胞を提供するため）を、滅菌
した５０ｍｌ試験管に注ぎ、１０００〜１２００ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２
遠心機で２３００〜２５００ｒｐｍ）で室温で５〜１０分間遠心分離し、そして
上清を処分した。あるいは、大量の細胞を、大型のコニカル遠心管内でペレット
化し得る。
【０１８５】 本発明者らは、２０ｍｌの滅菌Ｈ2Ｏを、酵母細胞の各試験管に添加し、ボル
テックスによって（またはピペットで）これらの細胞を再懸濁させ、上記のよう
の遠心分離し、そして上清を処分した。次いで、本発明者らは、２０ｍｌの１Ｍ
ソルビトールを酵母細胞の各試験管に添加し、ボルテックスによって（またはピ
ペットで）これらの細胞を再懸濁させ、上記のように遠心分離し、そして上清を
処分した。本発明者らは、これらの細胞を、１：５００の希釈の新たに追加した
２−メルカプトエタノールを含むＳＰＥ緩衝液（１Ｍソルビトール、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させて、最終細胞濃度を５×１
０8細胞／ｍｌとした。
【０１８６】 本発明者らは、１０μｌの先の細胞懸濁物を、９０μｌの５％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓと混合し、そして別の１０μｌの細胞懸濁物を、９０μｌの１Ｍソルビトール
と混合した。本発明者らは、各混合物の細胞濃度を、血球計で決定した。前段落
からの酵母細胞懸濁物を、３０℃に暖める。酵母細胞懸濁物の各１ｍｌに対して
、１．５μｌの１００ｍｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ（ＩＣＮ）のス
トックを添加する。本発明者らは、３０℃で静置してインキュベートした。５分
間の間隔で、１０μｌの細胞懸濁物を、９０μｌの５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと混合
し、そして細胞濃度を血球計で決定する。本発明者らは、ＳＤＳ処理の存在下に
おいて残る細胞の数の減少をモニタリングした（ソルビトールの存在下での初期
細胞濃度と比較した）。
【０１８７】 細胞の９５％がＳＤＳに溶解するとすぐに、サンプルを２００〜３００ｇ（Ｊ
ｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１０００〜１２００ｒｐｍ）で室温で５分間遠
心分離し、そして上清を注意深く注いで除去した（ペレットは非常に緩く、そし
ていくらかの細胞は失われる）。スフェロプラスト（ザイモリアーゼを添加した
後の工程）のための全時間は、代表的に、５〜２０分間である。
【０１８８】 本発明者らは、スフェロプラストを、反転または注意深いピペット採取によっ
て、２０ｍｌのＳＴＣ緩衝液（０．９８Ｍソルビトール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１０ｍＭ ＣａＣｌ2）に穏やかに再懸濁させ、このサンプルを２００〜３００
ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１０００〜１２００ｒｐｍ）で室温で５
分間遠心分離し、そして上清を注意深く注いで除去した。本発明者らは、この手
順を１回繰り返した。本発明者らは、スフェロプラストを、２．５×１０8細胞
／ｍｌでＳＴＣに再懸濁させ、これを工程１４で使用するまで、室温（または氷
上）で維持した。
【０１８９】 （ＥＳ細胞との融合） 本発明者らは、２．５×１０8のスフェロプラストを含む１ｍｌのスフェロプ
ラスト懸濁物を、１５ｍｌの試験管に移し、そして１ｍｌを２００〜３００ｇ（
Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１０００〜１２００ｒｐｍ）で室温で５分間
、遠心分離した。本発明者らは、長いガラスピペットでゆっくりと吸引すること
によって、全ての上清を除去した。試験管を半水平位置にして、本発明者らは、
１ｍｌのＥＳ細胞（５×１０6細胞／ｍｌ）を、スフェロプラストペレットを乱
すことなく、穏やかに添加した。スフェロプラスト：ＥＳ細胞の比は、２５：１
〜５０：１で変動し得る。
【０１９０】 本発明者らは、以下のような手順で、ＥＳ細胞を調製した：本発明者らは、１
００ｍｍのプレートあたり６×１０6ＥＳ細胞の出発密度、および標準ＥＤ培地
（ＤＭＥＭ高グルコース、１００ユニット／ペニシリンのｍｌ、１００μｇ／ス
トレプトマイシンのｍｌ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｍの２−メルカプ
トエタノール、１０００ユニット／マウス白血病阻害因子［ＥＳＧＲＯTM］、お
よび熱で不活化した１５％のウシ胎仔血清）を用いて、マウス一次フィーダーで
コーティングしたプレートで、ＥＳの培養を開始した。４８時間の標準的な増殖
条件の後に、本発明者らは、この培養物をトリプシン処理し、そして得られた細
胞を使用して、１００ｍｍプレートあたり１０7ＥＳ細胞でのゼラチンコーティ
ングしたプレート上での培養を開始した。本発明者らは、１６〜２４時間、増殖
を続けさせた。融合の４時間前に、本発明者らは、ＥＳプレート上の培地を新た
な培地に交換した。融合の直前に、本発明者らは、これらの細胞をトリプシン処
理し、室温で無血清ＥＳ培地で３回洗浄し、そして５×１０6細胞／ｍｌで無血
清ＥＳ培地中に再懸濁させた。
【０１９１】 本発明者らは、混合したスフェロプラスト／ＥＳ細胞サンプルを、３００ｇ（
Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１２００ｒｐｍ）で室温で３分間、遠心分離
し、そして長いガラスピペットで、全ての培地を注意深く吸引して除去した。
【０１９２】 本発明者らは、試験管を穏やかに叩いて、細胞ペレットを緩め、そしてＰ１０
００チップを使用して、１０ｍＭのＣａＣｌ2を含む０．５ｍｌの５０％（ｗ／
ｖ）ＰＥＧ １５００（ｐＨ ８．０；例えば、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ ７８３６４１）（３７℃に予め暖めた）をゆっくりと添加した。この
溶液を添加する間に、本発明者らは、これらの細胞を、ピペットチップで穏やか
に混合した。一旦、全ての溶液を添加したら、本発明者らは、この細胞懸濁物を
一回、ゆっくりとピペットで吸い上げ、そして下げた。本発明者らは、この細胞
懸濁物を、室温で９０秒間インキュベートした。本発明者らは、５ｍｌの無血清
ＥＳ培地を、試験管の底部からピペットで吸い上げることによって、ゆっくりと
添加した。本発明者らは、細胞を室温で３０分間インキュベートし、そして３０
分後に、この細胞懸濁物を、３００ｇ（Ｊｏｕａｎ ＧＲ４−２２遠心機で１２
００ｒｐｍ）で室温で３分間遠心分離し、そして長いガラスピペットを用いて、
全ての培地を注意深く吸引除去した。
【０１９３】 本発明者らは、これらの細胞を、１０ｍｌの標準ＥＳ培地に再懸濁させ、そし
てサンプル全体（約５×１０6ＥＳ細胞）を、１００ｍｍのマウス一次フィーダ
ーで被覆したプレート上で、プレートした。最初の試みが、多すぎるコロニーの
発生を生じる場合には、各１００ｍｍのプレートにプレートするサンプルの量を
下げるよう調節する必要があり得る。
【０１９４】 本発明者らは、これらのプレートを、標準的なＥＳ細胞増殖条件下で一晩イン
キュベートし、次いで培地を新たなＥＳ培地と交換した。
【０１９５】 ４８時間の培養に続いて（スフェロプラスト融合の後）、本発明者らは、適切
な選択条件下（すなわち、ＹＡＣに存在する特定の哺乳動物選択マーカーにより
指図される）で増殖を開始させた。本発明者らは、培地を２日ごとに交換した。
本発明者らは、標準的な手順による増殖のために、ＥＳコロニーを拾い、そして
マウス一次フィーダーでコーティングしたプレート上でプレートした。本発明者
らは、代表的に、スフェロプラスト融合後１０〜１５日間、ＥＳコロニーを観察
した。
【０１９６】 ここで、ｙＨ２Ｂｍ含有酵母と融合したＥＳ細胞由来の７つのＥＳ細胞クロー
ン（表３において１〜７と呼ばれる）は、インサート全体にまたがるプローブに
より検出される、予測された全てのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ ｙＨ２フラグ
メントを含むことがわかった。表３に示すように、以下のヒト遺伝子が、トラン
スジェニックマウス発生の前に、ＥＳ細胞ゲノムにおいて、ＥＳ細胞ＤＮＡの特
徴付けの一部として、検出された：全ての異なるＶHファミリーＶH１、ＶH２、
ＶH３、ＶH４、ＶH５、およびＶH６が、検出可能であった；ヒトＤH、およびＪH ；ヒトＣμおよびＣδ定常領域；マウススイッチγ１（ｍＳγ１）およびヒトＣ
γ１ ＣHエキソン。
【０１９７】
【表３】
【０１９８】 （実施例７） （ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣを含むＥＳ細胞の、マウスへの導入） ＹＡＣ ｙＨ２ＢＭ ＤＮＡを含むＥＳ細胞からキメラマウスを作製するため
に、本発明者らは、胚盤胞をミクロインジェクションし、続いて交配させた。本
発明者らは、ＹＡＣ ｙＨ２ＢＭ ＤＮＡを含むＥＳ細胞を、実施例５に記載す
るように単離し、そしてキメラマウスの作製のために増殖させた。次いで、本発
明者らは、ｙＨ２ＢＭ保有ＥＳ細胞クローンを、マウスＣ５７Ｂ１／６胚盤胞に
ミクロインジェクションした［Ｂ．Ｈｏｇａｎら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ
ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ」、Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ
ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」１８８−１９６頁（１９８６）（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと］。キメラの子を
、皮膚の色により同定した。
【０１９９】
【表４】
【０２００】 表４は、７種の異なるｙＨ２ＢＭ含有ＥＳ細胞株を使用してのトランスジェニ
ックマウスの作製に関するデータを要約する。７のクローンのうちの５つを、マ
ウス生殖細胞系に伝達させた。
【０２０１】 （実施例８） （ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣ ＤＮＡを含むマウスとｙＫ２：ＤＩマウスとの交配） 内因性抗体の非存在下でヒト抗体を産生するマウスを作製するために、本発明
者らは、ｙＫ２トランスジェニックマウスを、二重に不活化した（ＤＩ）マウス
株と交配させた。ＤＩマウス株は、遺伝子標的化した不活化したマウスの重鎖お
よびκ軽鎖の遺伝子座に関して同型接合であり、従って、抗体産生を欠く［Ｊａ
ｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇ
ｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を
参照のこと］。本発明者らは、ｙＫ２トランスジェニック株の１つであるＪ２３
．１を、ＤＩマウスと交配させて、同型接合の不活化したマウスの重鎖およびκ
鎖のバックグラウンドでｙＫ２ ＹＡＣに対して半接合または同種接合のマウス
を作製した（ｙＫ２；ＤＩ）。ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣに対して半接合の新たなＸｅ
ｎｏＭｏｕｓｅを発生させるための交配スキームを、以下に示す。ＸｅｎｏＭｏ
ｕｓｅの雄性とＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雌性との引き続く交配は、ｙＨ２ＢＭおよ
び／またはｙＫ２に対して半接合または同種接合のいずれかである、ＸｅｎｏＭ
ｏｕｓｅ子孫を与える。これらの子孫から、いずれもｙＨ２ＢＭとｙＫ２との両
方に対して同種接合である雄性および雌性を交配させて、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ
ｙＨ２ＢＭの真の交配株を得る。
【０２０２】
【表５】
【０２０３】 本発明者らは、サザンブロット分析によって、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭ
株におけるヒト重鎖およびκ鎖ＹＡＣの完全性を確認した。分析した全てのＸｅ
ｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭ株において、ｙＨ２ＢＭは、複数の世代にわたって、
明らかな欠失も再配列もなしに、変化せずに伝達された。
【０２０４】 （実施例９） （フローサイトメトリー分析） Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭトランスジェニックマウスをさらに特徴付ける
ために、末梢血液および脾臓リンパ球を、８〜１０週齢のマウスおよびコントロ
ールから単離した。これらの細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｍ（Ａｃｃｕｒａ
ｔｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で精製し、そして精製した抗マウスＣＤ３
２／ＣＤ１６ Ｆｃレセプター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０１２４１Ｄ）（Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理して、Ｆｃレセプターへの非特異的結合をブロッ
クした。次いで、これらの細胞を、種々の抗体で染色し、そしてＦＡＣＳｔａｒ PLUS （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア）
で分析した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭ細胞を染色するために使用した抗体
のパネルは、以下を含んだ：シトクロム（Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）（Ｃｙｃ）抗Ｂ２
２０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０１１２８Ａ）；フルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）抗ヒトＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、３４１５４Ｘ）；ＦＩ
ＴＣ抗マウスＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０２２０４Ｄ）。
【０２０５】 ３つの異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭ株からの４匹の動物由来のリンパ
球を評価し、そして以下の表５に示すように、フローサイトメトリーを使用して
野生型Ｂ６／１２９マウスと比較した。
【０２０６】 株ＸＭ−２ＢＭ−１、ＸＭ−２ＢＭ−２およびＸＭ−２ＢＭ−６は、野生型マ
ウスと比較して、Ｂ細胞区画において、約６０〜８０％の再構成を示した（表５
）。ｙＨ２ＢＭ ＹＡＣ ＤＮＡを有するトランスジェニックマウスは、ヒト抗
体および免疫系の有意な発達を示す。
【０２０７】
【表６】
【０２０８】 （実施例１０） （非免疫マウスにおけるヒト抗体の血清レベル） 非免疫マウス血清中のヒト抗体の測定のためのＥＬＩＳＡを実行した。免疫ア
ッセイにおけるより詳細な情報および手順について、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第１４章，「Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，５５３−６１４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。ヒト免疫グロブリンの濃
度を、以下の捕捉抗体：マウス抗ヒトＩｇＭ（ＣＧＩ／ＡＴＣＣ，ＨＢ−５７）
（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用して、測定した。ＥＬＩＳＡ実験において使
用された検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧｌ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０５０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、
マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，９０２０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）であった。ヒトＩｇの定量
のために使用される標準は、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）（Ｃｏ
ｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）およびヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４００
１２６）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であった。
【０２０９】 表６において示されるように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＢＭマウスは、免疫
の非存在下において、ヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧの両方の有意なベースライン
レベルを生成した。
【０２１０】
【表７】
【０２１１】 （実施例１１） （免疫およびハイブリドーマ生成） ６匹の８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｉｃｅＨ２ＢＭの群を、１０μｇの組換えヒ
トＩＬ−８、５μｇ ＴＮＦ−αまたはＣＥＭ細胞（ＣＤ１４７について）のい
ずれかを用いて、尾の根元の皮下に（または他の投与の経路（腹腔内、フットパ
ッドなど））免疫した。この抗原を、一次免疫のためにフロイント完全アジュバ
ントにおいて、およびさらなる免疫のためにフロイント不完全アジュバントにお
いて、乳化する。動物免疫に関するより詳細な情報および手順について、以下を
参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第５章，「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ」５３−１３８
頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。
免疫を、３〜４週間の間隔で、少なくとも３回のブースター免疫（ブースト）の
ために実施した。
【０２１２】 モノクローナル抗体を作製する場合、マウスは、融合の４日前に、ＰＢＳ中の
抗原または細胞の最終注射を受ける。モノクローナル抗体を作製する詳細な情報
および手順については、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第６章，「Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，１３９−２４４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫マウス由来のリンパ節
のリンパ球を、非分泌骨髄腫ＮＳＯ細胞株［Ｓ．Ｒａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５５４８−５５５１（１９９４）］または
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞を用いて融合し、そして以前に記載さ
れたように［Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３
−４６（１９８１）］ＨＡＴ選択に供する。
【０２１３】 表７は、上記実施例６〜８に従って産生され、かつ組換えヒトＩＬ−８細胞、
５μｇＴＮＦ−α細胞またはＣＥＭ細胞（ＣＤ１４７について）を用いて免疫さ
れたトランスジェニックは、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を生成したことを
示す。
【０２１４】 （実施例１２） （抗体特異性およびアイソタイプの評価） 本発明者らは、トランスジェニックマウスが、抗原特異的抗体を産生している
か否かの決定のために、ＥＬＩＳＡを実施した（表７）。本発明者らは、記載さ
れるように［Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｕｎｉｔ ２．１，「Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋ
ｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）］、抗原特異的抗体を捕
捉するために組換えヒトＩＬ−８、ＣＤ１４７およびＴＮＦ−αを使用して、マ
ウス血清およびハイブリドーマ上清から単離される抗体の、抗原特異性ならびに
アイソタイプを決定した。本発明者らは、以下の捕捉抗体：ウサギ抗ヒトＩｇＧ
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６１４５−０１）を使用し
て、ヒト免疫グロブリンの濃度を測定した。ＥＬＩＳＡ実験において使用される
検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ，ＭＨ１０１５）（
Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０２０−０５）、およびヤギ抗ヒトκ−ビオ
チン（Ｖｅｃｔｏｒ，ＢＡ−３０６０）であった。ヒトおよびマウスＩｇの定量
のために使用される標準は、ヒトＩｇＧ1（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２
２）、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）、ヒトＩｇＧ2κ（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、マウスＩｇＧK（Ｃａｐｐｅｌ ５５９３９）
、マウスＩｇＭκ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−３７９５）、およびマウスＩｇＧ4λ（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｍ−９０１９）である。
【０２１５】 表７はさらに、上記実施例６〜８に従って産生され、かつ組換えヒトＩＬ−８
、５μｇのＴＮＦ−αまたはＣＥＭ細胞（ＣＤ１４７について）を用いて免疫さ
れたトランスジェニックマウスが、抗原特異的であり、かつ予測されたアイソタ
イプを有する、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を産生した。
【０２１６】
【表８】
【０２１７】 （実施例１３） （ＥＳ細胞へのｙＨ２ＣＭ ＹＡＣの導入） 本発明者らは、実施例６に詳細に記載されるような酵母スフェロプラスト融合
によるマウス胚性幹（ＥＳ）細胞へ、ＹＡＣ、ｙＨ２ＣＭを導入した［Ｂ．Ｂｉ
ｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，第３巻，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，第５章：「Ｉｎｔｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＹＡＣｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ
ｂｙ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ」，５４８−５５０頁，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａ
ｉｎｖｉｅｗ，ＮＹを参照のこと］。一般に、１．５ｍｇ／ｍｌのジモラーゼ（
ｚｙｍｏｌａｓｅ）２０Ｔを使用して、スフェロプラスト化した。ｙＨ２ＣＭス
フェロプラストを、以下に記載されるように、培養されたＨＰＲＴ欠損Ｅ１４．
ＴＧ３Ｂ１マウスＥＳ細胞と融合した［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ
３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）；Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｉｎ Ｔ
ｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃ
ｅｌｌｓ，７１−１１２頁，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）を参照のこと］
。ＨＡＴ選択を、融合４８時間後に開始した。ＨＰＲＴ−陽性ＥＳ細胞クローン
を、１クローン／１５〜２０×１０6融合細胞の頻度で選択した。ＨＡＴ耐性コ
ロニーを、ゲノム分析のために増殖し、そしてサザンブロット分析およびＣＨＥ
Ｆブロット分析により、ＹＡＣの完全性について分析した。ＥＳ細胞および酵母
スフェロプラストの偽（ｍｏｃｋ）融合によるコントロール実験において、コロ
ニーを検出しなかった。
【０２１８】 ｙＨ２ＣＭ含有酵母を用いたＥＳ細胞融合由来のＥＳ細胞クローン（表８にお
いてクローン１〜１０として言及さる）は、挿入物全体にわたるプローブにより
検出される全ての予測されるＥｃｏＲＩフラグメントおよびＢａｍＨＩ ｙＨ２
フラグメントを含んだ。表８に示されるように、本発明者らは、トランスジェニ
ックマウス産生の前にＥＳ細胞ＤＮＡの特徴付けの一部としてＥＳ細胞ゲノムに
おいて以下のヒト遺伝子を検出した：全ての異なるＶHファミリーを検出し得る
：ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、ＶH５、およびＶH６；ヒトＤH、およびＪH；ヒ
トＣμ、およびＣδ定常領域；マウススイッチγ１（ｍＳγ１）エキソンおよび
ヒトＣγ４ ＣHエキソン。
【０２１９】
【表９】
【０２２０】 （実施例１４） （マウスへのｙＨ２ＣＭ ＹＡＣを含むＥＳ細胞の導入） ＹＡＣ ｙＨ２ＣＭ ＤＮＡを含むＥＳ細胞由来のキメラマウスを産生するた
めに、胚盤胞の微量注入を実施し、次に交配した。ＹＡＣ ｙＨ２ＣＭ ＤＮＡ
を含むＥＳ細胞を、実施例１６に記載されるように単離し、そしてキメラマウス
の産生のために増殖した。次に、ｙＨ２ＣＭ保有ＥＳ細胞クローンを、マウスＣ
５７Ｂ１／６胚盤胞へ微量注入した［Ｂ．Ｈｏｇａｎら，「Ｍａｎｉｐｕｌａｔ
ｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ」、Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅ
ｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」１８８−１９６頁，（１９
８６）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと］。キメ
ラの子孫を、毛色より同定した。
【０２２１】
【表１０】
【０２２２】 表９は、９つの異なるｙＨ２ＣＭを含むＥＳ細胞株を使用して、トランスジェ
ニックマウスを産生するためのデータを要約した。９つのクローンのうち２つを
、マウスの生殖細胞系列を介して伝達した。
【０２２３】 （実施例１５） （ｙＫ２：ＤＩマウスを用いてｙＨ２ＣＭ ＹＡＣ ＤＮＡを含むマウスを交
配する） 内因性抗体の非存在下においてヒト抗体を生成したマウスを産生するために、
ｙＫ２トランスジェニックマウスを、二重不活性化（ＤＩ）マウス系統を用いて
以前に交配した。ＤＩマウス系統は、遺伝子標的化−不活性化された（ｔａｒｇ
ｅｔｅｄ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）マウス重鎖およびκ鎖の遺伝子座がについ
てホモ接合性であり、従って、抗体産生において欠損があった［Ｊａｋｏｂｏｖ
ｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら
，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと
］。ｙＫ２トランスジェニックマウス系統の１つ（Ｊ２３．１）は、ＤＩマウス
を用いて交配され、ホモ接合性の不活性化マウス重鎖およびκ鎖のバックグラウ
ンド（ｙＫ２；ＤＩ）において、ｙＫ２ ＹＡＣについてヘミ接合性またはホモ
接性マウスを産生した。ｙＨ２ＣＭ ＹＡＣについてヘミ接合性である、新しい
Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅを産生するための交配スキームを、以下に示す。ＸｅｎｏＭ
ｏｕｓｅの雌とのＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雄の引き続く交配は、ｙＨ２ＣＭおよび
／またはｙＫ２についてのヘミ接合性またはホモ接合性のいずれかのＸｅｎｏＭ
ｏｕｓｅの子孫を産生する。これらの子孫から、雄および雌（これらの両方が、
ｙＨ２ＣＭおよびｙＫ２についてホモ接合性である）の交配は、ＸｅｎｏＭｏｕ
ｓｅのＨ２ＣＭの真の交配系統を産生する。
【０２２４】 （ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＨ２ＣＭ交配スキーム）
【０２２５】
【表１１】
【０２２６】 ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＨ２ＣＭ系統におけるヒト重鎖およびκ鎖ＹＡＣの完全
性を、サザンブロット分析により確認した。分析された全てのＸｅｎｏＭｏｕｓ
ｅ Ｈ２ＣＭ系統において、ｙＨ２ＣＭを、明らかな欠失または再配置を有さず
、複数の世代を介して変更せず伝達した。
【０２２７】 （実施例１６） （フローサイトメトリー分析） ＸｅｎｏｍｏｕｓｅのＨ２ＣＭトランスジェニックマウスをさらに特徴付ける
ため、末梢血および脾臓リンパ球を８〜１０週齢のマウスおよびコントロールか
ら単離した。細胞を、リンパ球Ｍ（Ａｃｃｕｒａｔｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）において精製し、そして精製された抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６ Ｆｃレ
セプター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０１２４１Ｄ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
）を用いて処理して、Ｆｃレセプターに対する非特異的結合をブロックした。次
に、細胞を、種々の抗体を用いて染色し、そしてＦＡＣＳｔａｒPLUS（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）において
分析した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＨ２ＣＭ細胞を染色するために使用される抗体の
表としては、以下が挙げられる：Ｃｙｃｈｒｏｍｅ（Ｃｙｃ）抗−Ｂ２２０（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０１１２８Ａ）；蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗
ヒトＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，３４１５４Ｘ）；ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＭ
（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０２２０４Ｄ）。
【０２２８】 ２つの異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅＨ２ＣＭ系統からの二つの動物由来のリンパ
球を、以下の表１０に示されるようなフローサイトメトリーを用いて評価し、そ
して野生型Ｂ６／１２９マウスと比較した。
【０２２９】 系統ＸＭ２Ｃｍ−２ホモは、Ｂ細胞画分において８０〜１００％の再構築につ
いて示した（表１０）。ｙＨ２ＣＭ ＹＡＣ ＤＮＡを有するトランスジェニッ
クマウスは、有意なヒト抗体および免疫系の発生を示す。コントロール１２９×
Ｂ６、ＤＩ、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ ２ａヘテロ接合性およびホモ接合性を、ｙＨ
２ＣＭ ＹＡＣについてヘテロ接合性およびホモ接合性のマウスと比較した。
【０２３０】
【表１２】
【０２３１】 （実施例１７） （非免疫マウス中のヒト抗体の血清レベル） 非免疫マウス血清中のヒト抗体の測定のためにＥＬＩＳＡを行った。イムノア
ッセイについてのより詳細な情報および手段については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら、
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１４章、
「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、５５３−６１４頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。ヒト免疫グロブリン
の濃度を、以下の捕捉抗体を使用して測定した：マウス抗ヒトＩｇＭ（ＣＧＩ／
ＡＴＣＣ、ＨＢ−５７）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）。ＥＬＩＳＡ実験において
使用した検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ4−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０５０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、
マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、９０２０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）であった。ヒトＩｇの定量
のために使用したスタンダードは、以下であった：ヒトＩｇＭＫκ（Ｃａｐｐｅ
ｌ、１３０００）（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）およびヒトＩｇＧ１（Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ ４００１２６）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【０２３２】 表１１に示されるように、１５〜３０行のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ Ｈ２ＣＭは、
免疫不在下で有意な基線レベルのヒトＩｇＭおよびＩｇＧ４の両方を産生した。
【０２３３】
【表１３】
【０２３４】 （実施例１８） （免疫およびハイブリドーマ生成） ６匹の８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＣＭのグループを、１０μｇ
の組換えヒトＩＬ−６またはＩＬ−８のいずれかを用いて、尾の基部で皮下的に
免疫した。抗原は、一次免疫については完全フロイントアジュバント中に、そし
てさらなる免疫については不完全フロイントアジュバント中に乳化する。動物免
疫についてのより詳細な情報および手段については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第５章、「Ｉｍ
ｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」、５３−１３８頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。免疫は、少なくとも３回の
追加免疫（ブースト）について３〜４週間隔で行う。
【０２３５】 モノクローナル抗体を作製する場合、これらのマウスは、融合の４日前に、Ｐ
ＢＳ中の抗原または細胞の最終注射を受ける。モノクローナル抗体の作製につい
てのより詳細な情報および手段については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第６章、「Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１３９−２４４頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。免疫したマウ
ス由来のリンパ節リンパ球を、非分泌性骨髄腫ＮＳＯ細胞株［Ｓ．Ｒａｙら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：５５４８−５５５１（１
９９４）］またはＰ３−Ｘ６３−Ｗｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合し、そして以
前の記載［Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−
４６（１９８１）］のようにＨＡＴ選択に供した。
【０２３６】 表１２は、上記実施例１４〜１６に従って作製しそして組換えヒトＩＬ−６ま
たはＩＬ−８で免疫したトランスジェニックマウスが、ヒトＩｇＧ４モノクロー
ナル抗体を産生したことを示す。
【０２３７】 （実施例１９） （抗体特異性およびアイソタイプの評価） 本発明者らは、ＥＬＩＳＡを行い、トランスジェニックマウスが、抗原特異的
抗体を産生しているか否かを決定した（表１２）。本発明者らはまた、産生され
るヒト抗体アイソタイプを決定した（表１２）。抗原特異性およびアイソタイプ
の決定を、その抗原特異的抗体を捕捉するために組換えヒトＩＬ−６またはＩＬ
−８を使用して、記載［Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｕｎｉｔ２．１、「Ｅｎｚｙｍｅ−
ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）］のようにマ
ウス血清およびハイブリドーマ上清から単離した抗体に対して行った。ヒトおよ
びマウス免疫グロブリンの濃度を、以下の捕捉抗体を使用して測定した：ウサギ
抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６１４５−０
１）。ＥＬＩＳＡ実験で使用した検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（
Ｃａｌｔａｇ、ＭＨ１０１５）（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、マウス抗ヒト
ＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０２０−
０５）、およびヤギ抗ヒトκビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ、ＢＡ−３０６０）であっ
た。ヒトＩｇおよびマウスＩｇの定量に使用したスタンダードは、以下であった
：ヒトＩｇＧ1（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、４００１２２）、ヒトＩｇＭκ（Ｃａ
ｐｐｅｌ、１３０００）、ヒトＩｇＧ2K（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、４００１２２
）、マウスＩｇＧκ（Ｃａｐｐｅｌ ５５９３９）、マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ
、Ｍ−３７９５）、およびマウスＩｇＧ4λ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ−９０１９）。
【０２３８】 表１２はさらに、上記実施例１４〜１６に従って作製しそして組換えヒトＩＬ
−６またはＩＬ−８で免疫したトランスジェニックマウスが、抗原特異的かつ予
測されたアイソタイプのヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を産生したことを示す
。
【０２３９】
【表１４】
【０２４０】 （実施例２０） （ｙＨＧ１／２ ＹＡＣのＥＳ細胞への導入） 本発明者らは、実施例６に記載のような酵母スフェロプラスト融合によって、
マウス胚性幹（ＥＳ）細胞にＹＡＣ、ｙＨＧ１／２を導入した［Ｂ．Ｂｉｒｒｅ
ｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ、第３巻、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第５章：「Ｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｏｆ ＹＡＣｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂ
ｙ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ」、５４８−５５０頁、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎ
ｖｉｅｗ、ＮＹを参照のこと］。一般的に、ｙＨＧ１／２含有酵母細胞を、０．
１５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ２０Ｔを使用してスフェロプラスト化した。こ
のｙＨＧ１／２スフェロプラストを、ＨＰＲＴ欠損Ｅ１４．ＴＧ３Ｂ１マウスＥ
Ｓ細胞と融合し、この細胞を、記載のように培養した［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら
、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）；Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ
ｏｎ ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、７１−１１２頁、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）
を参照のこと］。ＨＡＴ選択を、融合後４８時間で開始した。ＨＰＲＴ陽性ＥＳ
細胞クローンを選択した。ＨＡＴ耐性コロニーを、ゲノム分析のために拡大し、
そしてサザンブロット分析およびＣＨＥＦブロット分析によってＹＡＣ完全性に
ついて分析した。コントロール実験は、ＥＳ細胞のみおよび酵母スフェロプラス
トのみの「偽」融合体であった。
【０２４１】 本発明者らは、ｙＨＧ１／２含有酵母細胞とのＥＳ細胞融合体由来の４つのＥ
Ｓ細胞コロニーを、その挿入物全体にわたるプローブを使用するサザンブロット
を使用して試験し、これらのクローンが、予期されるＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＢａｍＨＩ ｙＨ２フラグメントを全て含むか否かを決定した。本発明
者らは、４つ全てのＥＳ細胞クローンが、インタクトなＹＡＣを含むことを見い
出した。本発明者らは、トランスジェニックマウス生成前に、ＥＳ細胞ＤＮＡの
特徴付けの部分としてこのＥＳ細胞ゲノム中の以下のヒト遺伝子を検出した：全
ての異なるＶHファミリー（ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、ＶH５、およびＶH６
）；ヒトＤHおよびＪH；ヒトＣμおよびＣδ定常領域；ヒトスイッチγ２（ｈＳ
γ２）およびヒトＣγ１Ｃnエキソン（図８および表１３を参照のこと）。
【０２４２】
【表１５】
【０２４３】 （実施例２１） （ｙＨＧ１／２ ＹＡＣを含有するＥＳ細胞のマウスへの導入） ＹＡＣ ｙＨＧ１／２ ＤＮＡを含有するＥＳ細胞からキメラマウスを生成す
るために、本発明者らは、胚盤胞マイクロインジェンクション（微量注入）を使
用し、その後、育種させた。本発明者らは、実施例６に記載のようなＹＡＣ ｙ
ＨＧ１／２ ＤＮＡを含有するＥＳ細胞を単離し、そしてキメラマウスの生成の
ために拡大した。次に、本発明者らは、ｙＨＧ１／２保有ＥＳ細胞クローンを、
マウスＣ５７Ｂ１／６胚盤胞に微量注入した［Ｂ．Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第Ｄ節、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ
ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」、１８８−１９６頁、（１９８６）
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと］。
【０２４４】 （実施例２２） （ｙＨＧ１／２ ＹＡＣ ＤＮＡを含有するマウスのｙＫ２：ＤＩマウスとの
交配（ｂｒｅｅｄｉｎｇ）） 内因性抗体の非存在下でヒト抗体を産生するマウスを生成するために、ｙＫ２
トランスジェニックマウスを、二重不活化（ｄｏｕｂｌｅ‐ｉｎａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ）（ＤＩ）マウス系統と先ず交配させる。このＤＩマウス系統は、遺伝子標
的化−不活化されたマウス重鎖およびκ鎖の遺伝子座についてホモ接合性であり
、従って、抗体産生において欠損性である［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと］。ｙＫ２トランス
ジェニックマウス系統の１つである、Ｊ２３．１を、ＤＩマウスと交配し、ホモ
接合性の不活化したマウス重鎖およびκ鎖のバックグラウンド上にｙＫ２ ＹＡ
Ｃについて半接合性またはホモ接合性のマウスを生成する（ｙＫ２：ＤＩ）。ｙ
ＨＧ１／２ ＹＡＣについて半接合性である新しいＸｅｎｏｍｏｕｓｅを生成す
るための交配スキームを、以下に示す。その後の雄性ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雌性
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅに対する交配は、ｙＨＧ１／２および／またはｙＫ２につい
て半接合性またはホモ接合性のいずれかである、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ子孫を産生
する。これらの子孫から、ｙＨＧ１／２およびｙＫ２の両方について両方がホモ
接合性である雄および雌の交配は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＨＧ１／２の真の交配
系統を産生する。
【０２４５】 （ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｙＨＧ１／２育種スキーム）
【０２４６】
【表１６】
【０２４７】 ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２ＣＭ系統中のヒト重鎖およびκ鎖ＹＡＣの完全性を
、サザンブロット分析によって確かめる。分析した全てのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ
ＨＧ１／２Ｍ系統において、ｙＨＧ１／２は、明らかな欠失または再編成を伴わ
ずに、複数の世代を通して変化されずに遺伝されている。
【０２４８】 （実施例２３） （フローサイトメトリー分析） Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ ＨＧ１／２トランスジェニックマウスをさらに特徴付け
るために、末梢血および脾臓リンパ球を、８〜１０週齢のマウスおよびコントロ
ールから単離する。これらの細胞は、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｍ（Ａｃｃｕｒａ
ｔｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）上で精製し、そして精製抗マウスＣＤ３２
／ＣＤ１６Ｆｃレセプター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０１２４１Ｄ）（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理し、Ｆｃレセプターへの非特異的結合をブロックする
。次に、これらの細胞を種々の抗体で染色し、そしてＦＡＣＳｔａｒPLUS（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）上で
分析する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ＨＧ１／２Ｍ細胞を染色するために使用した抗
体のパネルは、以下を含む：シトクロム（Ｃｙｃ）抗Ｂ２２０（Ｐｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎ、０１１２８Ａ）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ヒ
トＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、２４１５４Ｘ）；ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＭ（
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、０２２０４Ｄ）。
【０２４９】 異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｈ２Ｇ１／２Ｍ系統由来の４匹の動物由来のリン
パ球を、フローサイトメトリーを使用して、評価しそして野生型Ｂ６／１２９マ
ウスと比較する。
【０２５０】 ｙＨＧ１／２ ＹＡＣ ＤＮＡを有するトランスジェニックマウスは、有意な
ヒト抗体および免疫系の発生を示す。ヘテロ接合性およびホモ接合性のコントロ
ール１２９×Ｂ６、ＤＩ、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ２ａを、ｙＨＧ１／２ ＹＡＣ
に対してヘテロ接合性およびホモ接合性のマウスと比較する。
【０２５１】 （実施例２４） （非免疫マウス中のヒト抗体の血清レベル） 非免疫マウス血清中のヒト抗体の測定のためにＥＬＩＳＡを行う。イムノアッ
セイについてのより詳細な情報および手段については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら、Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１４章、「
Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、５５３−６１４頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。ヒト免疫グロブリンの
濃度を、以下の捕捉抗体を使用して測定する：マウス抗ヒトＩｇＭ（ＣＧＩ／Ａ
ＴＣＣ、ＨＢ−５７）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）。ＥＬＩＳＡ実験において使
用した検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０５０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、マ
ウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
９０２０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）である。ヒトＩｇの定量のた
めに使用したスタンダードは、以下である：ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ、１３
０００）（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）およびヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ ４００１２６）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【０２５２】 （実施例２５） （免疫およびハイブリドーマ生成） ６匹の８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｙＨＧ１／２の群を、１０μｇの
選り抜きの抗原を用いて、尾の根元の皮下に（または他の投与の経路（腹腔内、
フットパッドなど））免疫する。この抗原を、一次免疫のためにフロイント完全
アジュバントにおいて、およびさらなる免疫のためにフロイント不完全アジュバ
ントにおいて、乳化する。動物免疫に関するより詳細な情報および手順について
、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第５章，「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ」５３
−１３８頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８８）。免疫を、３〜４週間の間隔で、少なくとも３回のブースター免疫（ブー
スト）のために実施した。
【０２５３】 モノクローナル抗体を作製する場合、マウスは、融合の４日前に、ＰＢＳ中の
抗原または細胞の最終注射を受ける。モノクローナル抗体を作製する詳細な情報
および手順については、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第６章，「Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，１３９−２４４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫マウス由来のリンパ節
のリンパ球を、非分泌骨髄腫ＮＳＯ細胞株［Ｓ．Ｒａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５５４８−５５５１（１９９４）］または
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞を用いて融合し、そして以前に記載さ
れたように［Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３
−４６（１９８１）］ＨＡＴ選択に供する。
【０２５４】 （実施例２６） （抗体特異性およびアイソタイプの評価） 本発明者らは、トランスジェニックマウスが、抗原特異的抗体を産生している
か否かを決定するために、ＥＬＩＳＡを実施した。本発明者らはまた、産生され
たヒト抗体アイソタイプを決定する。本発明者らは、抗原特異的抗体を捕捉する
ために抗原を使用して、記載されるように［Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｕｎｉｔ ２．
１，「Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ
ｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９
９４）］、マウス血清およびハイブリドーマ上清から単離される抗体における、
抗原特異性ならびにアイソタイプの決定を実施した。ヒトおよびマウスの免疫グ
ロブリンの濃度は、以下の捕捉抗体：ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６１４５−０１）を使用して、測定する。ＥＬＩ
ＳＡ実験において使用される検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｃａ
ｌｔａｇ，ＭＨ１０１５）（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、マウス抗ヒトＩＧ
Ｍ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０２０−０５
）、およびヤギ抗ヒトκ−ビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ，ＢＡ−３０６０）である。
ヒトおよびマウスＩｇの定量のために使用される標準は、ヒトＩｇＧ1（Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、ヒトＩｇＭK（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）
、ヒトＩｇＧ2K（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、マウスＩｇＧK（Ｃ
ａｐｐｅｌ ５５９３９）、マウスＩｇＭK（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−３７９５）、お
よびマウスＩｇＧ4λ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−９０１９）である。
【０２５５】 上記実施例２０〜２２に従って産生され、かつ抗原を用いて免疫されたトラン
スジェニックマウスは、抗原特異的であり、かつ予測されたアイソタイプを有す
る、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体を産生する。
【０２５６】 （実施例２７） （ＥＳ細胞へのｙＨＧ４ ＹＡＣの導入） 本発明者らは、実施例６に詳細に記載されるような酵母スフェロプラスト融合
によるマウス胚性幹（ＥＳ）細胞へ、ＹＡＣ、ｙＨＧ４を導入した［Ｂ．Ｂｉｒ
ｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第３巻，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，第５章：「Ｉｎｔｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＹＡＣｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ
ｂｙ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ」，５４８−５５０頁，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉ
ｎｖｉｅｗ，ＮＹを参照のこと］。一般に、酵母細胞を含むｙＨＧ４を、１．５
ｍｇ／ｍｌのジモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）２０Ｔを使用して、スフェロプラ
スト化した。ｙＨＧ４スフェロプラストを、以下に記載されるように培養された
ＨＰＲＴ欠損Ｅ１４．ＴＧ３Ｂ１マウスＥＳ細胞と融合した［Ｊａｋｏｂｏｖｉ
ｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎら，
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）；Ｅ．Ｒｏｂｅ
ｒｔｓｏｎ ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，７１−１１２頁，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９
８７）を参照のこと］。ＨＡＴ選択を、融合４８時間後に開始した。ＨＰＲＴ−
陽性ＥＳ細胞クローンを、選択した。ＨＡＴ耐性コロニーを、ゲノム分析のため
に増殖し、そしてサザンブロット分析およびＣＨＥＦブロット分析により、ＹＡ
Ｃの完全性について分析した。コントロール実験は、ＥＳ細胞単独および酵母ス
フェロプラスト単独の偽（ｍｏｃｋ）融合を含んだ。
【０２５７】 本発明者らは、クローンが全ての予測されたＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ ｙ
Ｈ２フラグメントを含むか否かを測定するために、挿入物全体にわたるプローブ
を用いたサザンブロットを使用して、ｙＨＧ４含有酵母とのＥＳ細胞融合に由来
する８個のＥＳ細胞クローンを調べた。本発明者らは、ｙＨＧ４ ＹＡＣが、全
ての８個のクローンにおいてインタクトであるいことを見出した。本発明者らは
、トランスジェニックマウス産生の前にＥＳ細胞ＤＮＡの特徴付けの一部として
ＥＳ細胞ゲノムにおいて以下のヒト遺伝子を検出した：全ての異なるＶHファミ
リー（ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、ＶH５、およびＶH６）；ヒトＤH、および
ＪH；ヒトＣμ、およびＣδ定常領域；ヒトスイッチγ２（ｈＳγ２）およびヒ
トＣγ４ ＣHエキソン。
【０２５８】 （実施例２８） （マウスへのｙＨＧ４ ＹＡＣを含むＥＳ細胞の導入） ＹＡＣ ｙＨＧ４ ＤＮＡを含むＥＳ細胞由来のキメラマウスを産生するため
に、胚盤胞の微量注入を使用し、次に交配した。本発明らは、実施例６に記載す
るような、ＹＡＣ ｙＨＧ４ ＤＮＡを含むＥＳ細胞を単離し、そしてキメラマ
ウスの産生のために増殖した。次に、本発明者らは、ｙＨＧ４保有ＥＳ細胞クロ
ーンを、マウスＣ５７Ｂ１／６胚盤胞へ微量注入した［Ｂ．Ｈｏｇａｎら，「Ｍ
ａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，「Ｉｎｊｅｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」１８８−
１９６頁，（１９８６）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参
照のこと］。本発明者らは、キメラの子孫を、毛色より同定した。
【０２５９】 生殖細胞系列の伝達を得た。本発明者らは、ヒトＶ６に対して特異的なプライ
マーを使用したＰＣＲにより、ｙＨＧ４トランスジェニックマウスを同定した。
【０２６０】 （実施例２９） （ｙＫ２：ＤＩマウスを用いてｙＨＧ４ ＹＡＣ ＤＮＡを含むキメラマウス
またはトランスジェニックマウスを交配する） 内因性抗体の非存在下においてヒト抗体を生成したマウスを産生するために、
ｙＫ２トランスジェニックマウスを、二重不活性化（ＤＩ）マウス系統を用いて
以前に交配した。ＤＩマウス系統は、遺伝子標的化−不活性化されたマウス重鎖
およびκ鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、従って、抗体産生において欠損
がある［Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１
９９３）；Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（
１９９４）を参照のこと］。ｙＫ２トランスジェニックマウス系統の１つ（Ｊ２
３．１）は、ＤＩマウスを用いて交配され、ホモ接合性の不活性化マウス重鎖お
よびκ鎖のバックグラウンド（ｙＫ２；ＤＩ）において、ｙＫ２ ＹＡＣについ
てヘミ接合性またはホモ接性のマウスを産生した。ｙＨＧ４ ＹＡＣについてヘ
ミ接合性である、新しいＸｅｎｏＭｏｕｓｅを産生するために使用される交配ス
キームを、以下に示す。ヘミ接合性ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの雌とのヘミ接合性Ｘｅ
ｎｏＭｏｕｓｅの雄の引き続く交配は、ｙＨＧ４および／またはｙＫ２について
ホモ接合性であるＸｅｎｏＭｏｕｓｅの子孫を産生する。これらの子孫から、雄
および雌（これらの両方が、ｙＨＧ４およびｙＫ２についてホモ接合性である）
の交配は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ４の真の交配系統を産生する。
【０２６１】 （ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＧ４交配スキーム）
【０２６２】
【表１７】
【０２６３】 ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＧ４系統におけるヒト重鎖およびκ鎖ＹＡＣの完全性を
、サザンブロット分析により確認した。分析された全てのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ
Ｇ４系統において、ｙＨＧ４を、明らかな欠失または再配置を有さず、複数の世
代を介して変更せず伝達した。
【０２６４】 （実施例３０） （フローサイトメトリー分析） ＸｅｎｏＭｏｕｓｅのＧ４トランスジェニックマウスをさらに特徴付けるため
、末梢血および脾臓リンパ球を、８〜１０週齢のマウスおよびコントロールから
単離する。細胞を、リンパ球Ｍ（Ａｃｃｕｒａｔｅ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ）において精製し、そして精製された抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６ Ｆｃレセ
プター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０１２４１Ｄ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
を用いて処理して、Ｆｃレセプターに対する非特異的結合をブロックする。次に
、細胞を、種々の抗体を用いて染色し、そしてＦＡＣＳｔａｒPLUS（Ｂｅｃｔｏ
ｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）において分
析する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ４細胞を染色するために使用される抗体の表と
しては、以下が挙げられる：Ｃｙｃｈｒｏｍｅ（Ｃｙｃ）抗−Ｂ２２０（Ｐｈａ
ｒｍｉｎｇｅｎ，０１１２８Ａ）；蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ヒト
ＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，３４１５４Ｘ）；ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＭ（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ，０２２０４Ｄ）。
【０２６５】 ３つの異なるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ Ｇ４系統からの４つの動物由来のリンパ球
を、フローサイトメトリーを用いて評価し、そして野生型Ｂ６／１２９マウスと
比較した。
【０２６６】 Ｇ４ ＹＡＣ ＤＮＡを有するトランスジェニックマウスは、有意なヒト抗体
および免疫系の発生を示す。コントロール１２９×Ｂ６、ＤＩ、ＸｅｎｏＭｏｕ
ｓｅ ２ａヘテロ接合性およびホモ接合性を、Ｇ４ ＹＡＣについてヘテロ接合
性およびホモ接合性のマウスと比較する。
【０２６７】 （実施例３１） （非免疫マウスにおけるヒト抗体の血清レベル） 非免疫マウス血清中のヒト抗体の測定のためのＥＬＩＳＡを実行する。免疫ア
ッセイにおけるより詳細な情報および手順について、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第１４章，「Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，５５３−６１４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。ヒト免疫グロブリンの濃
度を、以下の捕捉抗体：マウス抗ヒトＩｇＭ（ＣＧＩ／ＡＴＣＣ，ＨＢ−５７）
（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用して、測定した。ＥＬＩＳＡ実験において使
用された検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧｌ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０５０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、
マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，９０２０−０５）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）である。ヒトＩｇの定量の
ために使用される標準は、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）（Ｃｏｓ
ｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）およびヒトＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４００１
２６）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）である。
【０２６８】 （実施例３２） （免疫およびハイブリドーマ生成） ６匹の８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｉｃｅ ｙＨＧ４の群を、１０μｇの抗原を
用いて、尾の根元の皮下に（または他の投与の経路（腹腔内、フットパッドなど
））免疫した。この抗原を、一次免疫のためにフロイント完全アジュバントにお
いて、およびさらなる免疫のためにフロイント不完全アジュバントにおいて、乳
化する。動物免疫に関するより詳細な情報および手順について、以下を参照のこ
と：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第５章，「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ」５３−１３８頁，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫を、
３〜４週間の間隔で、少なくとも３回のブースター免疫（ブースト）のために実
施した。
【０２６９】 モノクローナル抗体を作製する場合、マウスは、融合の４日前、ＰＢＳ中の抗
原または細胞の最終注射を受ける。モノクローナル抗体を作製する詳細な情報お
よび手順については、以下を参照のこと：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第６章，「Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，１３９−２４４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）。免疫マウス由来のリンパ節の
リンパ球を、非分泌骨髄腫ＮＳＯ株［Ｓ．Ｒａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５５４８−５５５１（１９９４）］またはＰ３−
Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫を用いて融合し、そして以前に記載されたように
［Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１
９８１）］ＨＡＴ選択に供する。
【０２７０】 （実施例３３） （抗体特異性およびアイソタイプの評価） トランスジェニックマウスが、抗原特異的抗体を産生しているか否かの決定の
ために、ＥＬＩＳＡを実施する。産生されたヒト抗体アイソタイプを確認するこ
とがさらに所望される。抗原特異性およびアイソタイプの決定を、抗原特異的抗
体を捕捉するための組換え抗原を使用して、記載されるように［Ｃｏｌｉｇａｎ
ら，Ｕｎｉｔ ２．１，「Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ
ｅｎｔ ａｓｓａｙｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ（１９９４）］、マウス血清およびハイブリドーマ上清から単離さ
れる抗体において実施した。以下の捕捉抗体：ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６１４５−０１）を使用して、ヒトおよ
びマウスの免疫グロブリンの濃度を測定した。ＥＬＩＳＡ実験において使用され
る検出抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ，ＭＨ１０１５）
（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）マウス抗ヒトＩＧＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９０２０−０５）、およびヤギ抗ヒトκ−ビ
オチン（Ｖｅｃｔｏｒ，ＢＡ−３０６０）であった。ヒトおよびマウスＩｇの定
量のために使用される標準は、ヒトＩｇＧ1（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４００１
２２）、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｐｐｅｌ，１３０００）、ヒトＩｇＧ2κ（Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ，４００１２２）、マウスＩｇＧκ（Ｃａｐｐｅｌ ５５９３９
）、マウスＩｇＭκ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−３７９５）、およびマウスＩｇＧ4λ（
Ｓｉｇｍａ，Ｍ−９０１９）である。
【０２７１】 上記実施例２７〜２９に従って産生され、かつ抗原を用いて免疫されるトラン
スジェニックマウスは、抗原特異的でかつ予測されるアイソタイプを有するヒト
ＩｇＧ４モノクローナル抗体を産生する。
【０２７２】 （生物学的材料） 以下の生物学的材料を、上記実施例と関連して開示および議論し、そして本発
明に従って利用され得かつ調製され得る材料の例示である。 ・ｐｐＫＭ１Ｃ（ｙＨ１Ｃ標的ベクター） ・ｐ１Ｂ（標的ベクター） ・ＴＶ１（ｙＨ２Ｂｍを作製する、ｙＨ１Ｃを標的化するためのｍＳｇ１−ｈＣ
ｇ１プラスミドＤＮＡベクター） ・ＴＶ４（ｙＨ２Ｃｍを作製する、ｙＨ１Ｃを標的化するためのｍＳｇ１−ｈＣ
ｇ４プラスミドＤＮＡベクター） ・ＴＶ Ｇ１（ｙＨＧ１を作製する、ｙＨ１Ｃを標的化するためのｈＣｇ１プラ
スミドＤＮＡベクター） ・ＴＶ Ｇ４（ｙＨＧ４を作製する、ｙＨ１Ｃを標的化するためのｈＣｇ１プラ
スミドＤＮＡベクター） ・ｙＨ２Ｃｍ（ｍＳｇ１−ｈＣｇ４ ＹＡＣ）（＿においてＡＴＣＣに寄託され
、そして登録番号＿を有する） ・ｙＨ２Ｂｍ（ｍＳｇ１−ｈＣｇ１ ＹＡＣ）（＿においてＡＴＣＣに寄託され
、そして登録番号＿を有する） ・ｙＨＧ１（ｈＳｇ２−ｈＣｇ１ ＹＡＣ） ・ｙＨＧ４（また、ｙＨ３Ｃとして言及される）（ｈＳｇ２−ｈＣｇ４ ＹＡＣ
）（＿においてＡＴＣＣに寄託され、そして登録番号＿を有する） ・ｙＨ３Ｂ（また、ｙＨＧ１／２として言及される）（ｈＳｇ２−ｈＣｇ１−ｈ
Ｃｇ２（ＴＭ） ＹＡＣ）（＿においてＡＴＣＣに寄託され、そして登録番号＿
を有する） ・ＥＳ−ｙＨ２Ｃｍクローン１ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｃｍクローン２ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン１ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン２ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン３ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン４ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン５ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン６ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン７ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン８ ・ＥＳ−ｙＨ２Ｂｍクローン９ （参考としての援用） 本明細書中に列挙される全ての参考文献（特許、特許出願、学術論文、教科書
など）、および本明細書中に列挙された参考文献（それらが、すでに、その全体
が参考として援用されてはいない程度の）は、その全体が、参考として援用され
る。さらに、以下の参考文献（このような参考文献に列挙される参考文献を含む
）もまた、その全体が、参考として援用される。
【０２７３】
【表１８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｙＨ１ＣおよびｙＨ２Ｂｍ（またはｙＨ２Ｃｍ）酵母人工染色体（Ｙ
ＡＣ）の概略図である。
【図２】 図２は、ｙＨ１ＣおよびｙＨＧ１酵母人工染色体（ＹＡＣ）の概略図である。
【図３】 図３は、ｙＨ１ＣおよびｙＨＧ１／２酵母人工染色体（ＹＡＣ）の概略図であ
る。
【図４】 図４は、ｙＨ１ＣおよびｙＨＧ４／２酵母人工染色体（ＹＡＣ）の概略図であ
る。
【図５】 図５は、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣをｙＨＧ１ ＹＡＣおよびｙＨＧ４ ＹＡＣに更新
（ｒｅｔｒｏｆｉｔｔｉｎｇ）するための標的化ベクター（ＴＶ１およびＴＶ４
）の概略図である。
【図６】 図６は、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣをｙＨＧ１／２ＹＡＣおよびｙＨＧ４／２ＹＡＣに
更新するための標的化ベクターの構築物を例示する。
【図７】 図７は、ｙＨ１Ｃ ＹＡＣをｙＨＧ１／２ＹＡＣおよびｙＨＧ４／２ＹＡＣに
更新するための標的化ベクター（ＴＶ Ｇ１／２およびＴＶ Ｇ４／２）の概略
図である。
【図８】 図８は、ｙＨ３Ｂ ＹＡＣ（クローン Ｚ ７０．１７．１）と融合されたＥ
Ｓクローンのサザンブロット分析を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デイビス， シー． ジェフリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， バーリンゲイム， ヴァンクーバー ア ベニュー 1132 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA61 CA02 DA02 GA03 GA11 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 4B065 AA72Y AA91X AA92X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA25 CA44 4H045 AA11 CA40 DA75 DA76 EA20 FA72 FA74

Claims (67)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、Ｄセグメント遺伝子
    由来の、ヒト第１４染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の近接領域のＤＮＡ
    配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座の
    定常領域遺伝子Ｃμを介して連続しており、ここで、該ＤＮＡフラグメントは、
    少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子の作動可能に連結され、そしてここで
    、該ＤＮＡフラグメントは、さらに、さらなる定常領域遺伝子に作動可能連結さ
    れ、該さらなる定常領域遺伝子は、非同種スイッチ領域に作動可能に連結された
    ヒト定常領域コードエキソンを含む、導入遺伝子。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト定
    常領域コードエキソンは、以下からなる群から選択されるヒト定常領域をコード
    する、導入遺伝子：ヒトγ定常領域、ヒトα定常領域、およびヒトε定常領域。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト定
    常領域コードエキソンは、ヒトγ定常領域をコードする、導入遺伝子。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトγ
    定常領域が、γ−１定常領域である、導入遺伝子。
  5. 【請求項５】 ｙＨ２Ｂｍ酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項４に記
    載の導入遺伝子。
  6. 【請求項６】 請求項３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトγ
    定常領域が、γ−２定常領域である、導入遺伝子。
  7. 【請求項７】 請求項３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトγ
    定常領域が、γ−３定常領域である、導入遺伝子。
  8. 【請求項８】 請求項３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトγ
    定常領域が、γ−４定常領域である、導入遺伝子。
  9. 【請求項９】 ｙＨ２Ｃｍ酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項８に記
    載の導入遺伝子。
  10. 【請求項１０】 請求項２に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト
    定常領域コードエキソンが、ヒトα定常領域をコードする、導入遺伝子。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒ
    トα定常領域が、α−１定常領域である、導入遺伝子。
  12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒ
    トα定常領域が、α−２定常領域である、導入遺伝子。
  13. 【請求項１３】 請求項２に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒト
    定常領域コードエキソンが、ヒトε定常領域をコードする、導入遺伝子。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ＤＮ
    Ａフラグメントが、複数のヒトＶＨ遺伝子に、作動可能に連結される、導入遺伝
    子。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントは、少なくとも５０％のヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子に作動可
    能に連結される、導入遺伝子。
  16. 【請求項１６】 請求項１４に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントが、少なくとも４０の異なるヒトＶＨ遺伝子に作動可能に連結
    される、導入遺伝子。
  17. 【請求項１７】 請求項１４に記載の導入遺伝子であって、前記ＤＮＡフラ
    グメントが、十分な数の異なるヒトＶＨ遺伝子と作動可能に連結されて、その結
    果、該導入遺伝子が、接合部多様性または体細胞変異事象を考慮することなく、
    Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを介して、少なくとも１×１０5の異なる機能的ヒト免疫グロ
    ブリン重鎖配列をコードし得る、導入遺伝子。
  18. 【請求項１８】 請求項１４に記載の導入遺伝子であって、ここで、ヒトＶ
    Ｈ遺伝子の数が、該導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおける野生型
    マウスのＢ細胞集団の少なくとも５０％を産生するのに十分である、導入遺伝子
    。
  19. 【請求項１９】 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、Ｄセグメント遺伝
    子由来の、ヒト第１４染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の連続領域のＤＮ
    Ａ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座
    の定常領域Ｃμを介して連続しており、ここで、該ＤＮＡセグメントは、少なく
    とも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、該Ｄ
    ＮＡセグメントは、さらに、さらなる定常領域遺伝子に作動可能に連結され、該
    さらなる定常領域遺伝子は、ヒトスイッチ領域およびヒト定常領域コードエキソ
    ンを含み、ここで、該ヒトスイッチ領域および該ヒト定常領域コードエキソンは
    、異なるアイソタイプ由来である、導入遺伝子。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒ
    トスイッチ領域が、ヒトＣγ２スイッチ領域である、導入遺伝子。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の導入遺伝子であって、ここで、該前記
    ヒト定常領域コードエキソンは、以下からなる群から選択されるヒト定常領域を
    コードする、導入遺伝子：ヒトγ−１定常領域、ヒトγ−３定常領域、ヒトγ−
    ４定常領域、ヒトα−１定常領域、ヒトα−２定常領域およびヒトε定常領域。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒ
    ト定常領域コードエキソンは、ヒトγ−１定常領域をコードする、導入遺伝子。
  23. 【請求項２３】 ｙＨＧ１酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項２２に
    記載の導入遺伝子。
  24. 【請求項２４】 請求項２１に記載の導入遺伝子であって、ここで、該ヒト
    定常領域コードエキソンが、ヒトγ−４定常領域をコードする、導入遺伝子。
  25. 【請求項２５】ｙＨＧ４酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項２４に記
    載の導入遺伝子。
  26. 【請求項２６】 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントが、複数のヒトＶＨ遺伝子に、作動可能に連結される、導入遺
    伝子。
  27. 【請求項２７】 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントは、少なくとも５０％のヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子に作動可
    能に連結される、導入遺伝子。
  28. 【請求項２８】 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントが、少なくとも４０の異なるヒトＶＨ遺伝子に作動可能に連結
    される、導入遺伝子。
  29. 【請求項２９】 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントが、十分な数の異なるヒトＶＨ遺伝子と作動可能に連結されて
    、その結果、該導入遺伝子が、接合部多様性または体細胞変異事象を考慮するこ
    となく、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを介して、少なくとも１×１０5の異なる機能的ヒト
    免疫グロブリン重鎖配列をコードし得る、導入遺伝子。
  30. 【請求項３０】 請求項１９に記載の導入遺伝子であって、ここで、ヒトＶ
    Ｈ遺伝子の数が、該導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおける野生型
    マウスのＢ細胞集団の少なくとも５０％を産生するのに十分である、導入遺伝子
    。
  31. 【請求項３１】 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、Ｄセグメント遺伝
    子由来の、ヒト第１４染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の連続領域のＤＮ
    Ａ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および該遺伝子座
    の定常領域Ｃμを介して連続しており、ここで、該ＤＮＡセグメントは、少なく
    とも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、該Ｄ
    ＮＡセグメントは、さらに、さらなる定常領域遺伝子に作動可能に連結され、該
    さらなる定常領域遺伝子は、ヒトスイッチ領域、ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２
    およびＣＨ３エキソンおよびヒト膜エキソンを含み、ここで、該ヒトスイッチ領
    域および該ヒト膜エキソンは、同じアイソタイプ由来であり、そして該ヒトＣＨ
    １、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンは、該ヒトスイッチ領域および該ヒ
    ト膜エキソンとは異なるアイソタイプである、導入遺伝子。
  32. 【請求項３２】 請求項３１の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒトスイ
    ッチ領域および前記ヒト膜エキソンは、ヒトγ−２配列である、導入遺伝子。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒ
    トＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンは、以下からなる群から選択
    されるヒト定常領域をコードする、導入遺伝子：ヒトγ−１定常領域、ヒトγ−
    ３定常領域、ヒトγ−４定常領域、ヒトα−１定常領域、ヒトα−２定常領域お
    よびヒトε定常領域。
  34. 【請求項３４】 請求項３３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記ヒ
    トＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンが、ヒトγ−１定常領域をコ
    ードする、導入遺伝子。
  35. 【請求項３５】 ｙＨＧ１／２酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項３
    ４に記載の導入遺伝子。
  36. 【請求項３６】 請求項３１に記載の導入遺伝子であて、ここで、前記ヒト
    ＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンが、ヒトγ−４定常領域をコー
    ドする、導入遺伝子。
  37. 【請求項３７】 ｙＨＧ４／２酵母人工染色体（ＹＡＣ）である、請求項３
    ６に記載の導入遺伝子。
  38. 【請求項３８】 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントが、複数のヒトＶＨ遺伝子に、作動可能に連結される、導入遺
    伝子。
  39. 【請求項３９】 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントは、少なくとも５０％のヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子に作動可
    能に連結される、導入遺伝子。
  40. 【請求項４０】 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントが、少なくとも４０の異なるヒトＶＨ遺伝子に作動可能に連結
    される、導入遺伝子。
  41. 【請求項４１】 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記Ｄ
    ＮＡフラグメントが、十分な数の異なるヒトＶＨ遺伝子と作動可能に連結されて
    、その結果、該導入遺伝子が、接合部多様性または体細胞変異事象を考慮するこ
    となく、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを介して、少なくとも１×１０5の異なる機能的ヒト
    免疫グロブリン重鎖配列をコードし得る、導入遺伝子。
  42. 【請求項４２】 請求項３１に記載の導入遺伝子であって、ここで、ヒトＶ
    Ｈ遺伝子の数が、該導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおける野生型
    マウスのＢ細胞集団の少なくとも５０％を産生するのに十分である、導入遺伝子
    。
  43. 【請求項４３】 請求項１、１９および３１のいずれか１項に記載の導入遺
    伝子であって、さらに、マウス３’エンハンサーを含む、導入遺伝子。
  44. 【請求項４４】 請求項４３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記３
    ’エンハンサーが、マウス生殖細胞系列３’エンハンサーの約０．９ｋｂのコア
    フラグメントである、導入遺伝子。
  45. 【請求項４５】 請求項４３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記３
    ’エンハンサーが、マウス生殖細胞系列３’エンハンサーの約４ｋｂのフラグメ
    ントである、導入遺伝子。
  46. 【請求項４６】 請求項４３に記載の導入遺伝子であって、ここで、前記３
    ’エンハンサーが、遺伝子座制御領域である、導入遺伝子。
  47. 【請求項４７】 請求項１〜４６にいずれか１項に記載の導入遺伝子を含む
    、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞。
  48. 【請求項４８】 請求項４７に記載の胚性幹（ＥＳ）細胞であって、該胚性
    幹細胞が、マウスＥＳ細胞である、胚性幹細胞。
  49. 【請求項４９】 トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫であって、
    ここで、体細胞および生殖細胞が、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の導入
    遺伝子を含む、トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫。
  50. 【請求項５０】 ヒト免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子を、さらに含む、請求
    項４９に記載のトランスジェニック非ヒト動物およびその子孫。
  51. 【請求項５１】 前記動物が、マウスである、請求項４９または５０に記載
    のトランスジェニック非ヒト動物およびその子孫。
  52. 【請求項５２】 不活性化内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺
    伝子座をさらに含む、請求項４９または５０に記載のトランスジェニック非ヒト
    動物および子孫。
  53. 【請求項５３】 前記動物が、マウスである、請求項５２に記載のトランス
    ジェニック非ヒト動物。
  54. 【請求項５４】 トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫を作製する
    ための方法であって、該トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫の体細胞
    および生殖細胞は、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の導入遺伝子を含み、
    そして該トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫は、目的の抗原での免疫
    化に続いて、該目的の抗原に特異的な所望のアイソタイプの高い親和性の、完全
    ヒト抗体を産生する方法であり、該方法は、以下： （ａ）該導入遺伝子を、胚性幹細胞に導入する工程； （ｂ）該胚性幹細胞から、該導入遺伝子を含む生殖細胞を含む、トランスジェ
    ニック非ヒト動物を作製する工程；および （ｃ）トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫を作製するために必要と
    される場合に、該トランスジェニック非ヒト動物を交配する工程であって、ここ
    で、該トランスジェニック非ヒト動物およびその子孫は、目的の抗原での免疫化
    の後に、該目的の抗原に特異的な所望のアイソタイプの高い親和性の、完全ヒト
    抗体を産生する、工程、 を包含する、方法。
  55. 【請求項５５】 請求項５４に記載の方法であって、ここで、前記トランス
    ジェニック非ヒト動物が、マウスである、方法。
  56. 【請求項５６】 所望のアイソタイプの高い親和性の、完全ヒト抗体を産生
    するための方法であって、ここで、該抗体は、目的の抗原に特異的であって、該
    方法は、請求項４９〜５３に記載のいずれか１項に記載のトランスジェニック非
    ヒト動物を、目的の抗体に接触させて、該動物のＢ細胞における抗体産生を誘導
    する工程、および該抗体を回収する工程を、包含する、方法。
  57. 【請求項５７】 目的の抗原で免疫化された、請求項４９〜５３にいずれか
    １項に記載のトランスジェニック非ヒト動物から収集された、抗体産生Ｂ細胞。
  58. 【請求項５８】 不死化されている、請求項５７に記載のＢ細胞。
  59. 【請求項５９】 請求項５６に記載の方法であって、ここで、前記抗体は、
    前記トランスジェニック非ヒト動物の血流から収集される、方法。
  60. 【請求項６０】 請求項５６に記載の方法であって、ここで、前記抗体が、
    請求項５８に記載の不死化されたＢ細胞から収集される、方法。
  61. 【請求項６１】 請求項５６に記載の方法であって、ここで、前記抗体が、
    請求項５７に記載のＢ細胞から単離されたＤＮＡでトランスフェクトされた宿主
    細胞から収集される、方法。
  62. 【請求項６２】 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、ヒト免疫グロブリ
    ン重鎖遺伝子座のＤセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体のＤＮＡ配列と
    同一のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および
    該遺伝子座のＣμを介する定常領域遺伝子を介して連続しており、ここで、該Ｄ
    ＮＡフラグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連
    結され、そしてここで、該ＤＮＡフラグメントは、さらに、さらなる定常領域に
    作動可能に連結され、該さらなる定常領域は、以下： （１）ヒトスイッチ領域； （２）ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンを含む領域；およ
    び （３）ヒト膜エキソン を含み、ここで、該ヒトスイッチ領域、該ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２および
    ＣＨ３エキソンを含む領域、および該ヒト膜領域エキソンは、異なるアイソタイ
    プ由来である、導入遺伝子。
  63. 【請求項６３】 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、ヒト免疫グロブリ
    ン重鎖遺伝子座のＤセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体のＤＮＡ配列と
    同一のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および
    該遺伝子座のＣμを介する定常領域遺伝子を介して連続しており、ここで、該Ｄ
    ＮＡフラグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連
    結され、そしてここで、該ＤＮＡフラグメントは、さらに、さらなる定常領域に
    作動可能に連結され、該さらなる定常領域は、ヒトスイッチ領域、ヒトＣＨ１、
    Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソン、および非ヒト膜エキソンを含み、ここ
    で、該ヒトスイッチ領域、該ヒトＣＨ１、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソ
    ンを含む領域、および該非ヒト膜領域エキソンは、同じアイソタイプ由来である
    か、または異なるアイソタイプ由来である、導入遺伝子。
  64. 【請求項６４】 導入遺伝子であって、該導入遺伝子は、ヒト免疫グロブリ
    ン重鎖遺伝子座のＤセグメント遺伝子由来の、ヒト第１４染色体のＤＮＡ配列と
    同一のＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントを含み、Ｊセグメント遺伝子および
    該遺伝子座のＣμを介する定常領域遺伝子を介して連続しており、ここで、該Ｄ
    ＮＡフラグメントは、少なくとも１つのヒトＶセグメント遺伝子に作動可能に連
    結され、そしてここで、該ＤＮＡフラグメントは、さらに、さらなる定常領域に
    作動可能に連結され、該さらなる定常領域は、非ヒトスイッチ領域、ヒトＣＨ１
    、Ｃヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソン、および非ヒト膜エキソンを含み、こ
    こで、該非ヒトスイッチ領域および該非ヒト膜領域エキソンは、同じ種由来であ
    る、導入遺伝子。
  65. 【請求項６５】 請求項１〜６４のいずれか１項に記載の導入遺伝子であっ
    て、ここで、ｌｏｘＰ部位が、スイッチ領域の３’およびＣＨ１エキソンの５’
    に挿入される、導入遺伝子。
  66. 【請求項６６】 インビトロで、クラス−スイッチを受けるハイブリドーマ
    の産生のための、ｌｏｘＰ部位および定常領域をコードするＤＮＡからなる、Ｄ
    ＮＡベクター。
  67. 【請求項６７】 インビトロで、クラス−スイッチを受けるハイブリドーマ
    を産生のための方法であって、該方法は、請求項６５に記載の導入遺伝子、請求
    項６６に記載のベクター、およびＣＲＥリコンビナーゼをハイブリドーマに導入
    する工程、を包含する、方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI255853B (en) * 1998-08-21 2006-06-01 Kirin Brewery Method for modifying chromosomes
US6833268B1 (en) * 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
CA2425506A1 (en) 2000-10-18 2002-08-01 Immunex Corporation Methods for treating rheumatoid arthritis using il-17 antagonists
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU3942202A (en) * 2000-11-30 2002-06-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
GB0110029D0 (en) * 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
DK1390389T3 (da) 2001-04-26 2009-04-20 Biogen Idec Inc Cripto-blokerende antistoffer og anvendelser deraf
EP1632571B1 (en) 2001-05-11 2012-11-28 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Human artificial chromosome containing human antibody Lambda light chain and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of genetic transmission
FR2827302B1 (fr) * 2001-07-13 2003-10-10 Genoway Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations
EP1298207B2 (de) * 2001-10-01 2015-12-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Verfahren zur Herstellung von Protein-Bibliotheken und zur Selektion von Proteinen daraus
US7435871B2 (en) * 2001-11-30 2008-10-14 Amgen Fremont Inc. Transgenic animals bearing human Igλ light chain genes
EP1470146B8 (en) * 2001-12-28 2007-09-12 Amgen Fremont Inc. Antibodies against the muc18 antigen
EP1467757B1 (en) 2001-12-28 2008-05-07 Amgen Fremont Inc. Use of antibodies against the muc18 antigen
EP1467756A4 (en) * 2001-12-28 2007-03-21 Abgenix Inc METHODS OF USING ANTI-MUC18 ANTIBODIES
US7687505B2 (en) * 2002-01-14 2010-03-30 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of modified pyrimidine compounds to promote stem cell migration and proliferation
DK2314629T4 (da) 2002-07-18 2023-02-06 Merus Nv Rekombinant produktion af blandinger af antistoffer
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
PL218992B1 (pl) * 2002-07-19 2015-02-27 Abbott Biotech Ltd Neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-TNFα, zastosowanie tego przeciwciała, kryształ zawierający ludzkie przeciwciało anty-TNFα i preparat zawierający ten kryształ
JP4754219B2 (ja) 2002-12-02 2011-08-24 アムジエン・フレモント・インコーポレイテツド 腫瘍壊死因子を対象とする抗体、およびそれらの使用
EP1578947A4 (en) * 2002-12-02 2006-12-06 Abgenix Inc ANTIBODIES AGAINST A2 PHOSPHOLIPASE AND USES
US8067544B2 (en) 2003-03-19 2011-11-29 Curagen Corporation Antibodies against T cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (TIM-1) antigen and uses thereof
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
AU2004242614B2 (en) 2003-05-30 2011-09-22 Merus N.V. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
CN102675462A (zh) 2003-06-27 2012-09-19 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
EP1659918B1 (en) 2003-08-08 2009-01-14 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to parathyroid hormone (pth) and uses thereof
FR2861255B1 (fr) * 2003-10-24 2006-02-17 Centre Nat Rech Scient Mammifere non-humain transgenique pour la region constante de la chaine lourde des immunoglobulines humaines de classe a et ses applications.
ES2646560T3 (es) 2004-01-20 2017-12-14 Merus N.V. Mezclas de proteínas de unión
CA2564989C (en) 2004-03-19 2014-05-27 Amgen, Inc. Reducing the risk of human and anti-human antibodies through v gene manipulation
US7625549B2 (en) 2004-03-19 2009-12-01 Amgen Fremont Inc. Determining the risk of human anti-human antibodies in transgenic mice
EP1824886B1 (en) 2004-11-17 2010-12-22 Amgen Inc. Fully human monoclonal antibodies to il-13
TW200635946A (en) 2004-12-20 2006-10-16 Abgenix Inc Binding proteins specific for human matriptase
KR101017301B1 (ko) 2004-12-21 2011-02-28 메드임뮨 리미티드 앤지오포이에틴-2에 대한 항체 및 그의 용도
ES2395953T3 (es) 2005-01-26 2013-02-18 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos frente a interleucina-1 beta
WO2006105021A2 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Tolerrx, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor
AU2006236417B2 (en) 2005-04-20 2011-02-03 Amgen Fremont Inc. High affinity fully human monoclonal antibodies to interleukin-8 and epitopes for such antibodies
EP1874817A2 (en) * 2005-04-29 2008-01-09 Innate Pharma Transgenic animals and methods of making recombinant antibodies
EP2548583A3 (en) 2005-11-10 2013-02-27 Curagen Corporation Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
ATE552853T1 (de) 2005-12-13 2012-04-15 Medimmune Ltd Proteine die spezifisch insulin-ähnliche wachstumsfaktoren binden, und deren anwendungen
EP3168234A1 (en) 2005-12-15 2017-05-17 Medimmune Limited Combination of angiopoietin-2 antagonist and of vegf-a, kdr and/or fltl antagonist for treating cancer
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
WO2007111661A2 (en) 2006-03-20 2007-10-04 Xoma Technology Ltd. Human antibodies specific for gastrin materials and methods
TW200813091A (en) 2006-04-10 2008-03-16 Amgen Fremont Inc Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof
JP2009536818A (ja) 2006-04-20 2009-10-22 ザ ヘンリー エム． ジャクソン ファウンデーション フォー ザ アドヴァンスメント オブ ミリタリー メディシン インコーポレイテッド 志賀毒性１型タンパク質に基づく方法および組成物
RU2009107277A (ru) 2006-08-03 2010-09-10 Астразенека Аб (Se) АНТИТЕЛА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА αVβ6, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CL2007002225A1 (es) 2006-08-03 2008-04-18 Astrazeneca Ab Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un
US7833527B2 (en) * 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
WO2008042436A2 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Biogen Idec Ma Inc. Biomarkers and assays for the treatment of cancer
US7695718B2 (en) 2006-12-20 2010-04-13 Xoma Technology Ltd. Methods for the treatment of IL-1β related diseases
US7537551B2 (en) * 2007-01-22 2009-05-26 Brunswick Corporation Bidirectional resistance apparatus for exercise equipment
CA2680549A1 (en) 2007-03-12 2008-09-18 Alan D. D'andrea Prognostic, diagnostic, and cancer therapeutic uses of fanci and fanci modulating agents
DK2602323T3 (en) * 2007-06-01 2018-04-16 Open Monoclonal Tech Inc Compositions and Methods for Inhibiting Endogenous Immunoglobin Genes and Producing Transgenic Human Idiotypic Antibodies
CL2008001887A1 (es) 2007-06-29 2008-10-03 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno que se unen al receptor activado por proteasas 2 (par-2); acido nucleico que las codifica; vector y celula huesped; metodo de produccion; y composicion que las comprende.
ES2591281T3 (es) 2007-07-12 2016-11-25 Gitr, Inc. Terapias de combinación que emplean moléculas de enlazamiento a GITR
JP5624884B2 (ja) 2007-08-02 2014-11-12 ノビミューンエスアー 抗ｒａｎｔｅｓ抗体およびその使用の方法
EP3255144A1 (en) * 2007-08-10 2017-12-13 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Recombineering construct for preparing transgenic mice capable of producing human immunoglobulin
EP4248976A3 (en) 2007-08-23 2024-04-10 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
US7982016B2 (en) 2007-09-10 2011-07-19 Amgen Inc. Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin
SG187477A1 (en) 2007-09-26 2013-02-28 U3 Pharma Gmbh Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor antigen binding proteins
AU2008323206B2 (en) 2007-11-12 2014-08-14 U3 Pharma Gmbh AXL antibodies
CA2710252C (en) 2007-12-20 2017-03-28 Xoma Technology Ltd. Methods for the treatment of gout
FR2926438B1 (fr) * 2008-01-22 2013-01-11 Univ Limoges Mammifere non-humain transgenique pour la region constante de la chaine lourde des immunoglobulines humaines de classe g et ses applications
EP2344536A1 (en) 2008-09-19 2011-07-20 MedImmune, LLC Antibodies directed to dll4 and uses thereof
KR102362774B1 (ko) 2008-09-30 2022-02-15 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
US20120114667A1 (en) 2008-12-23 2012-05-10 Medimmune Limited TARGETED BINDING AGENTS DIRECTED TO a5BETA1 AND USES THEREOF
US20120121591A1 (en) 2009-03-20 2012-05-17 Amgen Inc. SELECTIVE AND POTENT PEPTIDE INHIBITORS OF Kv1.3
JP6053517B2 (ja) 2009-05-05 2016-12-27 ノヴィミュンヌ エスア 抗ｉｌ−１７ｆ抗体およびそれらの使用法
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK3622813T3 (da) 2009-07-08 2021-05-03 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
WO2011019844A1 (en) 2009-08-13 2011-02-17 Crystal Bioscience Inc. Transgenic animal for production of antibodies having minimal cdrs
CA2772945A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Xoma Technology Ltd. Screening methods
US8926976B2 (en) 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
TW201117824A (en) 2009-10-12 2011-06-01 Amgen Inc Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins
CN105999263B (zh) 2009-11-13 2021-06-29 第一三共欧洲有限公司 用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(her-3)相关疾病的材料和方法
BR122021025338B1 (pt) 2009-11-24 2023-03-14 Medimmune Limited Anticorpo isolado ou fragmento de ligação do mesmo contra b7-h1, composição farmacêutica e seus usos
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
SG10201604093XA (en) 2010-01-15 2016-07-28 Kirin Amgen Inc Antibody formulation and therapeutic regimens
US8865462B2 (en) 2010-01-20 2014-10-21 Crystal Bioscience Inc. Sustained culture of avian gonocytes
KR20210010942A (ko) 2010-03-31 2021-01-28 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작
JP2013523184A (ja) 2010-04-15 2013-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
WO2012018404A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
AU2011288412A1 (en) 2010-08-13 2013-02-21 Medimmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant Fc regions and methods of use
WO2012022734A2 (en) 2010-08-16 2012-02-23 Medimmune Limited Anti-icam-1 antibodies and methods of use
WO2012075333A2 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Prometheus Laboratories Inc. Her2delta16 peptides
SG10201600531TA (en) 2011-01-24 2016-02-26 Univ Singapore Pathogenic mycobacteria-derived mannose-capped lipoarabinomannan antigen binding proteins
CN103619881B (zh) 2011-04-07 2017-07-28 安姆根有限公司 新的egfr结合蛋白
JOP20200043A1 (ar) 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
CN107903325B (zh) 2011-05-16 2021-10-29 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
ES2894398T3 (es) 2011-06-03 2022-02-14 Xoma Technology Ltd Anticuerpos específicos para TGF-beta
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
WO2013016220A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
WO2013015821A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 The Research Foundation Of State University Of New York Antibodies to the b12-transcobalamin receptor
US9120858B2 (en) 2011-07-22 2015-09-01 The Research Foundation Of State University Of New York Antibodies to the B12-transcobalamin receptor
ES2612935T3 (es) 2011-09-19 2017-05-19 Kymab Limited Anticuerpos, dominios variables y cadenas adaptados para su uso en seres humanos
ES2806146T3 (es) 2011-09-22 2021-02-16 Amgen Inc Proteínas de unión al antígeno CD27L
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
PE20141937A1 (es) 2011-11-16 2014-12-18 Amgen Inc Metodos para tratar trastornos relacionados con mutante viii de eliminacion de factor de crecimiento epidermico
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN104220460A (zh) 2011-12-08 2014-12-17 安姆根有限公司 激动人lcat抗原结合蛋白和它们在疗法中的用途
WO2013096516A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 Xoma Technology Ltd. Methods for treating acne
PL2812443T3 (pl) 2012-02-06 2020-01-31 Inhibrx, Inc. Przeciwciała CD47 i sposoby ich zastosowania
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
CN114163530A (zh) 2012-04-20 2022-03-11 美勒斯公司 用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段
EA039663B1 (ru) 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
EP2847219A1 (en) 2012-05-07 2015-03-18 Amgen Inc. Anti-erythropoietin antibodies
AR091069A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno dirigidas contra el receptor st2
PE20150643A1 (es) 2012-06-22 2015-05-29 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos de reaccion cruzada anti-jagged 1/jagged 2 anticuerpos anti-jagged activables y metodos de uso de los mismos
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
WO2014018375A1 (en) 2012-07-23 2014-01-30 Xenon Pharmaceuticals Inc. Cyp8b1 and uses thereof in therapeutic and diagnostic methods
CN104755493B (zh) 2012-08-03 2020-12-25 Sab有限责任公司 用于在转基因动物中生产人类抗体的复杂的染色体工程
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
ES2728936T3 (es) 2013-01-25 2019-10-29 Amgen Inc Anticuerpos dirigidos contra CDH19 para melanoma
JO3519B1 (ar) 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
ES2944477T3 (es) 2013-02-06 2023-06-21 Inhibrx Inc Anticuerpos CD47 no reductores de plaquetas y no reductores de glóbulos rojos y métodos de uso de los mismos
CN105051211B (zh) * 2013-02-27 2017-11-10 中央研究院 抗体的原位亲和力成熟作用
ES2858472T3 (es) 2013-03-11 2021-09-30 Amgen Inc Formulaciones proteínicas
AU2014244444A1 (en) 2013-03-14 2015-09-24 Amgen Inc. CHRDL-1 antigen binding proteins and methods of treatment
AU2014236867A1 (en) 2013-03-15 2015-09-24 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-CCR7 antigen binding proteins
HUE045859T2 (hu) 2013-03-15 2020-01-28 Amgen Res Munich Gmbh N-terminális ABP-t tartalmazó, egyláncú kötõmolekulák
EP2970446A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Amgen Research (Munich) GmbH Antibody constructs for influenza m2 and cd3
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
CN110511279B (zh) 2013-05-30 2024-03-29 基尼克萨制药有限公司 制瘤素m受体抗原结合蛋白
CA2916259C (en) 2013-06-28 2024-02-20 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
CA2921398C (en) 2013-08-14 2021-12-14 The Governing Council Of The University Of Toronto Antibodies for inhibiting frizzled receptors and pharmaceutical compositions containing antibodies for inhibiting frizzled receptors
WO2015050959A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Yale University Anti-kit antibodies and methods of use thereof
CA2925723A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9067998B1 (en) 2014-07-15 2015-06-30 Kymab Limited Targeting PD-1 variants for treatment of cancer
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8992927B1 (en) 2014-07-15 2015-03-31 Kymab Limited Targeting human NAV1.7 variants for treatment of pain
US8883157B1 (en) 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9023359B1 (en) 2014-07-15 2015-05-05 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
US9045548B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9034332B1 (en) 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US9914769B2 (en) 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
US8986694B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Targeting human nav1.7 variants for treatment of pain
US9051378B1 (en) 2014-07-15 2015-06-09 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
EP3888690A3 (en) 2014-05-16 2021-10-20 MedImmune, LLC Molecules with altered neonate fc receptor binding having enhanced therapeutic and diagnostic properties
TWI695011B (zh) 2014-06-18 2020-06-01 美商梅爾莎納醫療公司 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法
US9150660B1 (en) 2014-07-15 2015-10-06 Kymab Limited Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
AU2015295242B2 (en) 2014-07-31 2020-10-22 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific single chain antibody construct with enhanced tissue distribution
AR101669A1 (es) 2014-07-31 2017-01-04 Amgen Res (Munich) Gmbh Constructos de anticuerpos para cdh19 y cd3
JP6749312B2 (ja) 2014-07-31 2020-09-02 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 最適化された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクト
WO2016040767A2 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Amgen Inc. Chrdl-1 epitopes and antibodies
JP6857603B2 (ja) 2014-11-18 2021-04-14 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． 抗ｃｄ１４７抗体、方法及び使用
WO2016141111A1 (en) 2015-03-03 2016-09-09 Xoma (Us) Llc Treatment of post-prandial hyperinsulinemia and hypoglycemia after bariatric surgery
JP6901400B2 (ja) 2015-04-03 2021-07-14 ゾーマ テクノロジー リミテッド ＴＧＦ−β及びＰＤ−１の阻害物質を使用する癌の治療法
PT3283524T (pt) 2015-04-17 2023-06-05 Amgen Res Munich Gmbh Construções de anticorpos biespecíficos para cdh3 e cd3
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
US10253101B2 (en) 2015-08-06 2019-04-09 Xoma (Us) Llc Antibody fragments against the insulin receptor and uses thereof to treat hypoglycemia
JP2018535655A (ja) 2015-09-29 2018-12-06 アムジエン・インコーポレーテツド Ａｓｇｒ阻害剤
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
PE20181327A1 (es) 2015-12-23 2018-08-20 Amgen Inc Metodo para tratar o mejorar trastornos metabolicos con proteinas de union para el receptor peptidico inhibidor gastrico (gipr) en combinacion con agonistas de glp-1
KR20180101623A (ko) 2016-02-03 2018-09-12 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Psma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
MA43955B1 (fr) 2016-02-03 2022-02-28 Amgen Inc Anticorps anti-bcma et anti-cd3 bispécifiques de format bite
US10870701B2 (en) 2016-03-15 2020-12-22 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific fab fusion proteins and use thereof
KR102413037B1 (ko) 2016-03-15 2022-06-23 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 Napi2b 표적화된 항체-약물 접합체 및 이의 사용 방법
JOP20170091B1 (ar) 2016-04-19 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh إعطاء تركيبة ثنائية النوعية ترتبط بـ cd33 وcd3 للاستخدام في طريقة لعلاج اللوكيميا النخاعية
EP3490600A1 (en) 2016-08-01 2019-06-05 Xoma (Us) Llc Parathyroid hormone receptor 1 (pth1r) antibodies and uses thereof
TW201825674A (zh) 2016-09-09 2018-07-16 美商艾斯合顧問有限公司 表現雙特異性接合分子的溶瘤病毒
JP2019534710A (ja) 2016-09-28 2019-12-05 ゾーマ （ユーエス） リミテッド ライアビリティ カンパニー インターロイキン２に結合する抗体およびその使用
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
US20200024347A1 (en) 2016-11-10 2020-01-23 Iomx Therapeutics Ag Or10h1 antigen binding proteins and uses thereof
JOP20190177A1 (ar) 2017-01-17 2019-07-16 Amgen Inc طريقة لعلاج أو تحسين اضطرابات أيضية باستخدام مساعدات مستقبل glp-1 مقترنة بمناهضات لمستقبل ببتيد مثبط معوي (gipr)
JOP20190189A1 (ar) 2017-02-02 2019-08-01 Amgen Res Munich Gmbh تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t
SG11201908280SA (en) 2017-03-30 2019-10-30 Univ Queensland "chimeric molecules and uses thereof"
SG11201909547TA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Amgen Inc Pharmaceutical composition comprising bispecific antibody constructs for improved storage and administration
CN109321570A (zh) * 2017-07-31 2019-02-12 中国科学院上海生命科学研究院 用于体外抗体类型转换的方法及试剂盒
WO2019028316A1 (en) 2017-08-03 2019-02-07 Amgen Inc. INTERLEUKIN-21 MUTÉINS AND METHODS OF TREATMENT
AR112797A1 (es) 2017-09-08 2019-12-11 Amgen Inc Inhibidores de kras g12c y métodos para utilizarlos
BR112020011627A2 (pt) 2017-12-11 2020-11-17 Amgen Inc. processo de fabricação contínuo para produtos de anticorpos biespecíficos
TW201940518A (zh) 2017-12-29 2019-10-16 美商安進公司 針對ｍｕｃ１７和ｃｄ３之雙特異性抗體構建體
EP3508499A1 (en) 2018-01-08 2019-07-10 iOmx Therapeutics AG Antibodies targeting, and other modulators of, an immunoglobulin gene associated with resistance against anti-tumour immune responses, and uses thereof
JP7339262B2 (ja) 2018-01-12 2023-09-05 アムジェン インコーポレイテッド Ｐａｃ１抗体及びその使用
MX2020007291A (es) 2018-01-12 2020-09-10 Amgen Inc Anticuerpos anti-pd-1 y metodos de tratamiento.
MX2020011385A (es) 2018-05-31 2021-04-13 Glyconex Inc Anticuerpos terapeuticos que se unen antigenos de lewis b y lewis y biantenarios.
MX2021000268A (es) 2018-07-17 2021-06-08 Humabs Biomed Sa Anticuerpos contra especies de campylobacter.
US20210301020A1 (en) 2018-07-24 2021-09-30 Amgen Inc. Combination of lilrb1/2 pathway inhibitors and pd-1 pathway inhibitors
US20210301017A1 (en) 2018-07-30 2021-09-30 Amgen Research (Munich) Gmbh Prolonged administration of a bispecific antibody construct binding to cd33 and cd3
AU2019314999A1 (en) 2018-08-03 2021-02-11 Amgen Inc. Antibody constructs for CLDN18.2 and CD3
BR112021003436A2 (pt) 2018-08-27 2021-05-18 Affimed Gmbh células nk criopreservadas pré-carregadas com uma construção de anticorpo
SG11202103275YA (en) 2018-10-11 2021-04-29 Amgen Inc Downstream processing of bispecific antibody constructs
AU2019363713A1 (en) 2018-10-24 2021-05-27 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Vaccination and antibody generation platform
US20220259329A1 (en) 2019-06-07 2022-08-18 Amgen Inc. Bispecific binding constructs
US20220259547A1 (en) 2019-06-13 2022-08-18 Amgeng Inc. Automated biomass-based perfusion control in the manufacturing of biologics
US20220363770A1 (en) 2019-06-28 2022-11-17 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
CN114401992A (zh) 2019-07-05 2022-04-26 艾欧麦克斯治疗股份公司 结合igsf11（vsig3）的igc2的抗体及其用途
EP3763737A1 (en) 2019-07-12 2021-01-13 Eberhard Karls Universität Tübingen Binding compounds of penicillin binding protein 2 a
US20220281966A1 (en) 2019-07-26 2022-09-08 Amgen Inc. Anti-il13 antigen binding proteins
EP4028416A1 (en) 2019-09-10 2022-07-20 Amgen Inc. Purification method for bispecific antigen-binding polypeptides with enhanced protein l capture dynamic binding capacity
WO2021097344A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Amgen Inc. Method for reduced aggregate formation in downstream processing of bispecific antigen-binding molecules
EP3822288A1 (en) 2019-11-18 2021-05-19 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof
CA3164129A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Amgen Inc. Mesothelin-targeted cd40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
AU2020414409A1 (en) 2019-12-27 2022-06-16 Affimed Gmbh Method for the production of bispecific FcyRIIl x CD30 antibody construct
EP4093771A1 (en) 2020-01-22 2022-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof
WO2021158521A1 (en) 2020-02-03 2021-08-12 Vir Biotechnology, Inc. Antibodies against sars-cov-2 and methods of using the same
BR112022017048A2 (pt) 2020-02-26 2022-11-16 Vir Biotechnology Inc Anticorpos contra sars-cov-2 e métodos para usar os mesmos
EP4118113A1 (en) 2020-03-12 2023-01-18 Amgen Inc. Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecifc antibodies binding to cds x cancer cell and tnfalpha or il-6 inhibitor
WO2021188851A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Amgen Inc. Antibodies against mucin 17 and uses thereof
WO2021203053A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Vir Biotechnology, Inc. Immunotherapy targeting a conserved region in sars coronaviruses
WO2021211775A1 (en) 2020-04-14 2021-10-21 Vir Biotechnology, Inc. Antibodies against sars-cov-2 and methods of using the same
CA3177169A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Vir Biotechnology, Inc. Antibodies against sars-cov-2
AU2021275049A1 (en) 2020-05-19 2022-12-22 Amgen Inc. MAGEB2 binding constructs
MX2022014902A (es) 2020-05-29 2023-01-04 Amgen Inc Administracion mitigadora de efectos adversos de un constructo biespecifico que se une a cd33 y cd3.
WO2021247925A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Vir Biotechnology, Inc. Structure-guided immunotherapy against sars-cov-2
US20230203198A1 (en) 2020-06-04 2023-06-29 Amgen Inc. Bispecific binding constructs
CA3180477A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Elizabeth Alexander Antibody therapies for sars-cov-2 infection
CN116209459A (zh) 2020-06-26 2023-06-02 美国安进公司 Il-10突变蛋白及其融合蛋白
US20240010720A1 (en) 2020-07-06 2024-01-11 Iomx Therapeutics Ag Antibodies binding igv of igsf11 (vsig3) and uses thereof
TW202216778A (zh) 2020-07-15 2022-05-01 美商安進公司 Ｔｉｇｉｔ及ｃｄ１１２ｒ阻斷
CA3194162A1 (en) 2020-09-28 2022-03-31 Humabs Biomed Sa Antibodies against sars-cov-2
US20230365709A1 (en) 2020-10-08 2023-11-16 Affimed Gmbh Trispecific binders
WO2022096536A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Target-cell restricted, costimulatory, bispecific and bivalent anti-cd28 antibodies
EP3992205A1 (en) 2020-11-03 2022-05-04 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Sars coronavirus-2 spike protein binding compounds
WO2022096698A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Amgen Inc. Polypeptide constructs binding to cd3
IL302599A (en) 2020-11-06 2023-07-01 Amgen Inc Bispecific molecules bind multi-target antigens of increased selectivity
TW202233678A (zh) 2020-11-06 2022-09-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 具有增強的剪切特徵的多肽
CA3199976A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Amgen Research (Munich) Gmbh Polypeptide constructs selectively binding to cldn6 and cd3
WO2022106205A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Corona virus spike protein binding compounds
EP4247844A1 (en) 2020-11-23 2023-09-27 VIR Biotechnology, Inc. Antibodies against influenza a viruses
TW202229329A (zh) 2020-11-23 2022-08-01 美商維爾生物科技股份有限公司 針對流感神經胺酸酶的廣泛中和抗體
JP2023551667A (ja) 2020-11-23 2023-12-12 ヴィア・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド 抗－インフルエンザ抗体及びその組合せ
WO2022115486A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Vir Biotechnology, Inc. Antibodies that bind to multiple betacoronaviruses
CN116783217A (zh) 2020-12-03 2023-09-19 安进公司 具有多个结合结构域的免疫球蛋白构建体
JP2023554382A (ja) 2020-12-16 2023-12-27 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド タウ結合化合物
WO2022159842A1 (en) 2021-01-25 2022-07-28 Vir Biotechnology, Inc. Antibody combination therapies for sars-cov-2 infection
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
CA3206395A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Hassan JUMAA-WEINACHT Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
JP2024506321A (ja) 2021-02-09 2024-02-13 ヒューマブス・バイオメッド・ソシエテ・アノニム 呼吸器合胞体ウイルスおよび他のパラミクソウイルスに対する抗体およびその使用方法
WO2022204202A1 (en) 2021-03-23 2022-09-29 Vir Biotechnology, Inc. Antibodies that bind to multiple sarbecoviruses
AR125290A1 (es) 2021-04-02 2023-07-05 Amgen Inc Construcciones de unión a mageb2
EP4330281A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 Amgen Inc. Methods for reducing low molecular weight species of recombinantly-produced proteins
WO2022234102A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases
AU2022280767A1 (en) 2021-05-24 2024-01-18 Humabs Biomed Sa Engineered polypeptides
WO2022272018A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Amgen Inc. Treatment of cardiovascular disease with trem-1 antigen binding proteins
EP4376958A1 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Affimed GmbH Duplexbodies
WO2023034871A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 Vir Biotechnology, Inc. High concentration antibody therapies for sars-cov-2 infection
CA3230613A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 Daren J. AUSTIN Antibody therapies for sars-cov-2 infection in pediatric subjects
WO2023039442A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Vir Biotechnology, Inc. Broadly neutralizing antibody combination therapies for sars-cov-2 infection
TW202334221A (zh) 2021-11-03 2023-09-01 德商安富美德有限公司 雙特異性cd16a結合劑
WO2023079493A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Affimed Gmbh Bispecific cd16a binders
WO2023137161A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Amgen Inc. Triple blockade of tigit, cd112r, and pd-l1
WO2023201256A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Vir Biotechnology, Inc. High dose antibody therapies for sars-cov-2 infection
TW202346368A (zh) 2022-05-12 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 具有增加的選擇性的多鏈多靶向性雙特異性抗原結合分子
WO2023230448A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Vir Biotechnology, Inc. Combination immunotherapy for influenza
WO2023230445A2 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Humabs Biomed Sa Broadly neutralizing antibodies against influenza neuraminidase
WO2023245078A1 (en) 2022-06-15 2023-12-21 Humabs Biomed Sa Anti-parvovirus antibodies and uses thereof
WO2023250388A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2024006472A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Vir Biotechnology, Inc. Antibodies that bind to multiple sarbecoviruses
WO2024026411A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Humabs Biomed Sa Broadly neutralizing antibodies against rsv and mpv paramyxoviruses
WO2024059675A2 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Amgen Inc. Bispecific molecule stabilizing composition

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993012227A1 (en) * 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1998024893A2 (en) * 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
CA2090473A1 (en) 1990-08-29 1992-03-01 Robert M. Kay Homologous recombinatin in mammalian cells
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
NZ253943A (en) 1992-06-18 1997-01-29 Genpharm Int Transfering polynucleotides into eukaryotic cells using co-lipofection complexes of a cationic lipid and the polynucleotide
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6130364A (en) * 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2230759C (en) 1995-08-29 2012-02-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric animal and method for producing the same
US6833268B1 (en) * 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
US8359965B2 (en) 2007-09-17 2013-01-29 Oxford J Craig Apparatus and method for broad spectrum radiation attenuation
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993012227A1 (en) * 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1998024893A2 (en) * 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017537653A (ja) * 2014-10-22 2017-12-21 クレシェンド・バイオロジックス・リミテッド トランスジェニックマウス
US11547099B2 (en) 2014-10-22 2023-01-10 Crescendo Biologies Limited Transgenic mice

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