JP2018535655A - Asgr阻害剤 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
Description
電子フォーマットの配列リストおよび表の参照
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された、その全体を参照により本明細書に組み込む、配列リストを含有する。2016年9月28日に作成された前記ASCIIコピーは、APMOL017WOSEQUENCE.txtと命名され、14,772,812バイトのサイズである。
本発明の分野は、抗ASGR、抗ASGR−1および/または抗ASGR−2抗原結合性タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない、ASGR阻害剤に関係する組成物および方法に関する。
一部の態様では、本発明は、ヒトASGRに結合し、ASGR機能を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒトASGRに結合し、リガンドへのASGR結合を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質を含む。別の実施形態では、本発明は、ヒトASGR−1に結合し、リガンドへのASGR−1結合および/またはASGR−2とのASGR−1相互作用を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質を含む。別の実施形態では、本発明は、ヒトASGR−2に結合し、リガンドへのASGR−2結合および/またはASGR−1とのASGR−2相互作用を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、ヒトASGR−1およびヒトASGR−2に結合し、リガンドへのASGR−1および/またはASGR−2結合を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、単離された結合タンパク質は、ヒトASGR、ASGR−1および/またはASGR−2に特異的に結合する。
Q ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、N209、R237、Q240、D242、W244、E253、H257、T259、N265、D266、D267、Y273、D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、N209、R237、P238、E239、P241、D243、Y245、G246、H247、G252、C255、H257、T259、D260、V268、R271、Y273、R237、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、N209、P238、E239、P241、D243、Y245、G246、H247、G252、C255、H257、T259、V268、R271、Y273、N209、R237、Q240、D242、W244、E253、H257、T259、N265、D266、D267、またはY273(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、N209、R237、Q240、D242、W244、E253、H257、T259、N265、D266、D267、またはY273(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、H215、K222、T231、G232、R237、P238、H247、G248、E253、C255、D266、V268、C269、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、Q198、Q202、P207、V208、F233、W236、D243、E253、F258、G262、W264、D266、H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260、W264、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277、T279、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259、W264、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262、W264、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262、またはW264、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、:H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263、W264、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F258、T259、D261、D266、V268、C269、W275、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269、W275、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、H215、K222、T231、G232、R237、P238、H247、G248、E253、C255、D266、V268、C269、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、Q198、Q202、P207、V208、F233、W236、D243、E253、F258、G262、W264、D266、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F
258、T259、D261、D266、V268、C269、W275、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260、W264、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277、T279、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259、W264、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262、W264、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262、W264、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263、W264、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR1に結合する:W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277またはT279(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232
、F233、K234、N235、P238、D261またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、:H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239またはG252(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、H215、K222、T231、G232、R237、P238、H247、G248、E253、C255、D266、V268またはC269(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254またはQ270(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、Q198、Q202、P207、V208、F233、W236、D243、E253、F258、G262、W264またはD266(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271またはY273(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F258、T259、D261、D266、V268、C269またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。
ンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F258、T259、D261、D266、V268、C269またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、H215、K222、T231、G232、R237、P238、H247、G248、E253、C255、D266、V268、C269、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、Q198、Q202、P207、V208、F233、W236、D243、E253、F258、G262、W264、D266、H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260、W264、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277、T279、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259、W264、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262、W264、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262、またはW264、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263、W264、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F258、T259、D261、D266、V268、C269、W275、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269、W275、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、ヒトASGR−1(SEQ ID NO:5)の次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260、W264、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277、T279、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201
、T210、R237、E239、Q240、F258、T259、W264、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262、W264、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262、またはW264、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263、W264、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、ヒトASGR−1(SEQ ID NO:5)の次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277またはT279(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、:H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239またはG252(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に
結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。
ASGR
いくつかの種のASGR−1およびASGR−2のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が知られている。表1は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌおよびカニクイザルの配列を示す。図1A、図1Bおよび図2は、様々な種のASGR−1およびASGR−2の配列アラインメントを示し、図3は、ヒトASGR−1およびヒトASGR−2の間の配列アラインメントを示す。
一部の実施形態では、本発明は、ヒト、カニクイザル、ブタ、イヌ、マウスおよびラットが挙げられるがこれらに限定されない、異なる種のASGR、ASGR−1および/またはASGR−2に結合する抗原結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ヒト、カニクイザル、ブタ、イヌおよびマウスおよびラットが挙げられるがこれらに限定されない、異なる種のASGR、ASGR−1および/またはASGR−2に特異的に結合する。ヒト、カニクイザル、イヌ、ブタ、ラットおよびマウスASGR−1およびASGR−2の例示的なアミノ酸配列は、図1−図3に提示されている。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2がリガンドに結合することをさらに阻害する。
27482のN31、Y50、V51、Q54からなる群から選択される少なくとも1、2、3もしくは全アミノ酸残基を含む;および/または重鎖可変領域は、SEQ ID NO:31488のN30、S31、Y32、S52、Y54、N55、K59、R98、D100、F101、W102、S103、G104、Y105、K107、D110、V2、Y27、T28、F29、G33、W50、A53、G56、N57、H99、Y106もしくはG108からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27もしくは全アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体は、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:31488のN30、S31、Y32、S52、Y54、N55、K59、R98、D100、F101、W102、S103、G104、Y105、K107およびD110からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または全アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体は、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:27780のY33、Y50、D51、N53、K54、S57、V34、S52、R55、P56、G58およびG65からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは全アミノ酸残基を含み、および/または重鎖可変領域は、SEQ ID NO:31786のQ1、V2、F27、S30、S31、Y32、Y53、D54、W99、Y100、Y101、Y102、G26、T28、F29、G33、W52、G55、R72、N74、N98、Y103、Y104、D107およびV108からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくは全アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:27780のY33、Y50、D51、N53、K54およびS57からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5もしくは全アミノ酸残基を含み、および/または重鎖可変領域は、SEQ ID NO:31786のQ1、V2、F27、S30、S31、Y32、Y53、D54、W99、Y100、Y101およびY102からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは全アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体は、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:26536のH31、G32、D33、G34、K35、Y37、I97、Q98、I99、I2、Q27、S28、L29、L30、T36、E55、Q95、S96、P100およびW101からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは全アミノ酸残基を含み、および/または重鎖可変領域は、SEQ ID NO:30542のS31、W52、Y53、D54、Y57、Y59、D102、F103、W104、T28、S30、Y32、G33、W47、I50、I51、S56、K58、Y60、K65、D99、H101、S105およびG106からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23もしくは全アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:26536のH31、G32、D33、G34、K35、Y37、I97、Q98およびI99からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8もしくは全アミノ酸残基を含み、および/または重鎖可変領域は、SEQ ID NO:30542のS31、W52、Y53、D54、Y57、Y59、D102、F103およびW104からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8もしくは全アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体は、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:26826のN30、S31、Y33、F50、S54、S68、Y92、E93、W97、S28、V29、G32、L47、G51、A52、S53、R55、A56、G69、Q90、Q91、S94およびS95からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは全アミノ酸残基を含み、および/または重鎖可変領域は、SEQ ID NO:30832のR30、Y31、Y33、E50、S54、S56、N58、D98、Y99、G100、S28、Y32、W34、S35、W47、G49、I51、S52、H53、G55、T57、R97、A101、F102およびD103からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは全アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:26826のN30、S31、Y33、F50、S54、S68、Y92、E93およびW97からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8もしくは全アミノ酸残基を含み、および/または重鎖可変領域は、SEQ ID NO:30832のR30、Y31、Y33、E50、S54、S56、N58、D98、Y99およびG100からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは全アミノ酸残基を含む。
3、N265、D266、D267、N209、R237、P238、E239、P241、D243、Y245、G246、H247、G252、C255、H257、T259、D260、V268、R271、Y273、F258、R263またはW264のうち少なくとも20との結合または相互作用を遮断または低下させる。
ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、N209、R237、Q240、D242、W244、E253、H257、T259、N265、D266、D267、Y273、D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、N209、R237、P238、E239、P241、D243、Y245、G246、H247、G252、C255、H257、T259、D260、V268、R271、Y273、R237、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、N209、P238、E239、P241、D243、Y245、G246、H247、G252、C255、H257、T259、V268、R271、Y273、N209、R237、Q240、D242、W244、E253、H257、T259、N265、D266、D267、またはY273(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、N209、R237、Q240、D242、W244、E253、H257、T259、N265、D266、D267、またはY273(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、H215、K222、T231、G232、R237、P238、H247、G248、E253、C255、D266、V268、C269、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、Q198、Q202、P207、V208、F233、W236、D243、E253、F258、G262、W264、D266、H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260、W264、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277、T279、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259、W264、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262、W264、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262、またはW264、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、:H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263、W264、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F258、T259、D261、D266、V268、C269、W275、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269、W275、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、H215、K222、T231、G232、R237、P238、H247、G248、E253、C255、D266、V268、C269、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、Q198、Q202、P207、V208、F233、W236、D243、E253、F258、G262、W264、D266、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F25
8、T259、D261、D266、V268、C269、W275、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260、W264、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277、T279、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259、W264、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262、W264、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262、W264、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263、W264、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR1に結合する:W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277またはT279(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F
233、K234、N235、P238、D261またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、:H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239またはG252(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、H215、K222、T231、G232、R237、P238、H247、G248、E253、C255、D266、V268またはC269(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254またはQ270(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、Q198、Q202、P207、V208、F233、W236、D243、E253、F258、G262、W264またはD266(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271またはY273(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F258、T259、D261、D266、V268、C269またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含むエピトープにおいて、ヒトASGR−1に結合する:R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。
ンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F258、T259、D261、D266、V268、C269またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、H215、K222、T231、G232、R237、P238、H247、G248、E253、C255、D266、V268、C269、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、Q198、Q202、P207、V208、F233、W236、D243、E253、F258、G262、W264、D266、H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260、W264、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277、T279、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259、W264、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262、W264、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262、またはW264、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263、W264、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、W167、F168、S169、K173、W175、D177、Y181、Q202、H203、T210、W211、R237、F258、T259、D261、D266、V268、C269、W275、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、S169、W175、A176、A178、T210、W211、W236、P238、E239、D242、Y245、G250、G251、F258、D261、G262、R263、W264、D266、V268、C269、W275、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、ヒトASGR−1(SEQ ID NO:5)の次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、N235、R237、P238、E239、Q240、D242、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、R170、S171、G172、A174、H204、I205、G206、P207、V208、N209、H257、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、R170、S171、G172、K173、A174、D177、P207、V208、N209、R237、Q240、W244、G246、H247、G248、L249、E253、H257、T259、D260、N265、D267、Q270、R271、P272、Y273、R274、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260、W264、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277、T279、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201
、T210、R237、E239、Q240、F258、T259、W264、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262、W264、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262、またはW264、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263、W264、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270、またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262、R263、V159、E160、R163、T193、S194、E197、V201、I205、G206、P207、Y229、E230、T231、E239、F258、T259、D260またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、ヒトASGR−1(SEQ ID NO:5)の次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:H161、E162、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、D261、G262またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272、W275、P155、N157、W158、F168、S169、R170、W175、A178、D179、C182、A187、W211、C269、R271、Y273、R274、C277またはT279(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、Q270、P272またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263、R274、N157、V159、F168、S169、S171、S194、Q198、F200、V201、T210、R237、E239、Q240、F258、T259またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:R170、W195、E196、K199、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、F233、K234、N235、W236、P238、D260、D261、G262、R263またはR274(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238、R263、E160、E162、V192、T193、E197、V201、H204、Y229、E230、T231、G232、E239、Q240、P241、D261、G262またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:H161、S194、W195、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、F233、K234、N235、W236、R237、P238またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261、R263、R163、V192、E197、Q198、H203、P207、D228、E230、W236、R237、D260、G262またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:H161、E162、T193、S194、W195、E196、K199、Q202、T231、G232、F233、K234、N235、P238、D261またはR263(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239、G252、:H161、E162、V191、V192、E197、Q198、D216、G219、K222、W223、D225、R263またはW264(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:T193、S194、W195、E196、P220、W221、G226、T227、D228、Y229、E230、T231、G232、F233、K234、N235、W236、R237、P238、E239またはG252(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから8オングストローム以内に位置する:N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273、R274、V156、W158、V159、H161、W167、F168、S169、K173、K199、F200、V201、W211、R237、H257、F258、T259、D261、D267、V268、Q270またはW275(SEQ ID NO:5)。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープが、ヒトASGR−1に
結合されるときに、抗原結合性タンパク質または抗体または抗体中のパラトープは、次の残基のうち少なくとも1つから5オングストローム以内に位置する:N157、R170、S171、G172、Q202、H203、H204、I205、G206、P207、V208、N209、T210、D260、R271、P272、Y273またはR274(SEQ ID NO:5)。
例示的な抗原結合性タンパク質(抗体)の軽鎖CDRおよび例示的な抗原結合性タンパク質(抗体)の重鎖CDRのアミノ酸配列は、コンセンサス軽鎖CDRおよび/またはコンセンサス重鎖CDR(図55の表19BおよびCならびに表20BおよびCを参照)として上に記載されている例示的な抗原結合性タンパク質に加えて、表2−7に示されている。CDRのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列も示されている(表2)。表3−7ならびに表A、BおよびCは、コンセンサス可変軽鎖配列および/またはコンセンサス可変重鎖配列(図55の表19Aおよび表20Aならびに図56および図57の表を参照)として上に記載されている例示的 抗原結合性タンパク質に加えて、例示的な抗原結合性タンパク質(例えば、抗体)のVHおよびVLのアミノ酸配列をさらに提供する。表3は、例示的な抗体の可変軽および可変重ドメインのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド(DNA)配列をさらに提供する。
本発明の抗体は、当業者に周知の技法によって調製することができる。例えば、これは、動物(例えば、マウスまたはラットまたはウサギ)を免疫化し、次いで免疫化スケジュールの完了後にこの動物から収集された脾臓細胞を不死化することにより為される。脾臓細胞は、本技術分野で公知の任意の技法を使用して、例えば、これを骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを産生することにより、不死化することができる。例えば、Antibodies;HarlowおよびLane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第1版、例えば1988年からまたは第2版、例えば、2014年から)を参照されたい。
本発明の抗体の対応するアミノ酸配列をコードする本発明の抗原結合性タンパク質のヌクレオチド配列は、例えば、ランダム突然変異誘発または部位指定突然変異誘発(例えば、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発)によって変更されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して1個以上の特定のヌクレオチド置換、欠失または挿入を含む、変更されたポリヌクレオチドを作製することができる。このような変更を作製するための技法の例は、Walderら、1986、Gene 42:133頁;Bauerら、1985、Gene 37:73頁;Craik, BioTechniques、1985年1月、12−19頁;Smithら、1981、Genetic Engineering: Principles and Methods、Plenum Press;ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号に記載されている。上述および他の方法は、例えば、所望の特性、例えば、誘導体化されていない抗体と比較して、所望の標的に対する増加された親和性、アビディティーまたは特異性、インビボもしくはインビトロでの増加された活性もしくは安定性、または低下されたインビボ副作用を有する、抗原結合性タンパク質の誘導体の作製に使用され得る。
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗原結合性タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。加えて、核酸を含むベクター、核酸を含む細胞、および本発明の抗原結合性タンパク質を作製する方法が提供される。核酸は、例えば、抗原結合性タンパク質の全体または一部、例えば、本発明の抗体の一方または両方の鎖、またはその断片、誘導体、ムテインもしくはバリアントをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、解析、突然変異または増幅するための、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマーまたは配列決定プライマーとしての使用に十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述の相補的配列を含む。核酸は、所望の使用または機能の必要に応じていかなる長さであってもよく、1つ以上の追加的な配列、例えば、調節配列を含むことができる、および/またはより大型の核酸、例えば、ベクターの一部であってもよい。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、RNAおよび/またはDNAヌクレオチドならびにこれらの人工バリアント(例えば、ペプチド核酸)を含むことができる。
本発明の抗原結合性タンパク質は、タンパク質(例えば、抗体)の合成のための本技術分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、または好ましくは組換え発現技法によって、産生することができる。
一部の実施形態では、本発明は、変更されたエフェクター機能(例えば、減少または増加するエフェクター機能)を有する抗原結合性タンパク質(例えば、抗体)を提供する。エフェクター機能を増加させるための方法の非限定例は、米国特許第5,624,821号、同第6,602,684号、同第7,029,872号、米国特許出願公開第2006/0067930A1号、同第2005/0272128A1号、同第2005/0079605A1号、同第2005/0123546A1号、同第2004/0072290A1号、同第2006/0257399A1号、同第2004/0261148A1号、同第2007/0092521号、同第2006/0040325A1号および同第2006/0039904A1号ならびに国際特許出願公開番号WO04/029207、WO03011878、WO05044859、WO06071856およびWO06071280に見出すことができる。
一部の実施形態では、本発明は、インビボで延長された半減期を有する抗原結合性タンパク質(例えば、抗体)を提供する。特に、本発明は、3日間超、7日間超、10日間超、15日間超、25日間超、30日間超、35日間超、40日間超、45日間超、2ヶ月間超、3ヶ月間超、4ヶ月間超または5ヶ月間超の、哺乳動物(例えば、ヒトが挙げられるがこれらに限定されない)における半減期を有する抗原結合性タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。適用可能であれば、抗原結合性タンパク質の化学合成または酵素もしくは化学的切断によって、これを作製することができる。抗原結合性タンパク質の他の種類の共有結合修飾は、抗体の標的とするアミノ酸残基を、選択された側鎖またはNもしくはC末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入される。
一部の実施形態では、本発明は、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2発現に関連する疾患における処置、治療法および予防法のための方法に有用である、ASGR−1および/またはASGR−2を標的とするポリヌクレオチド組成物を提供し、これらの方法においては、選択された標的ポリヌクレオチド配列の発現または機能の低下または阻害が望まれる。ASGR−1および/またはASGR−2配列の標的化、ならびにASGR−1および/またはASGR−2発現の低下に使用することができるポリヌクレオチドの例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに低分子または小分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)およびマイクロRNA(miRNA)を含むRNA干渉(RNAi)剤が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第6,506,559号;同第8,394,628号;同第7,056,704号;同第7,078,196号;同第6,107,094号;同第5,898,031号;同第6,573,099号;および欧州特許第1,144,623号を参照されたい。例えば、米国特許出願公開第2015/0259689号;同第2015/0197746号;同第2011/0092565号;米国特許第8,877,917号;同第8,507,455号;および同第7,579,451号も参照されたい。
およびアンチセンス鎖の3’端に平滑断端を含む。他の実施形態では、二本鎖RNA分子は、アンチセンス鎖の3’端にヌクレオチドオーバーハングならびにアンチセンス鎖の5’端およびセンス鎖の3’端に平滑断端を含む。ある特定の実施形態では、二本鎖RNA分子は、二本鎖RNA分子の両端に平滑断端を含む。このような実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、二重鎖領域は、センスおよびアンチセンス鎖と同じ長さである(すなわち、分子は、その長さ全体にわたって二本鎖である)。
干渉RNA化合物は、DNAワクチンまたは遺伝子療法ベクターのような核酸剤の投与に適した任意の方法によって投与することができる。これらの方法は、遺伝子銃、バイオインジェクターおよび皮膚パッチ、ならびに米国特許第6,194,389号に開示されている微粒子DNAワクチン技術のような無針方法、および米国特許第6,168,587号に開示されている粉末形態のワクチンによる哺乳動物経皮無針ワクチン接種を含む。その上、とりわけ、Hamajimaら(1998)Clin.Immunol.Immunopathol.、88(2)、205−10頁に記載されている通り、鼻腔内送達が可能である。リポソーム(例えば、米国特許第6,472,375号に記載)およびマイクロカプセル化が使用されてもよい。生分解性標的化可能微粒子送達系が使用されてもよい(例えば、米国特許第6,471,996号に記載)。
ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2が、肝臓細胞(例えば、肝細胞)の表面において発現されるということを考慮すると、ある特定の実施形態では、干渉効果が肝臓細胞内で特異的に発揮できるように、このような肝臓細胞に干渉RNA分子を送達することが望ましい。したがって、ある特定の実施形態では、干渉RNA分子は、本技術分野で公知であり本明細書に記載されている様々な方法論を使用して、肝臓細胞に特異的に標的化される。例えば、ある特定の実施形態では、肝細胞の表面に発現される様々な異なる受容体を使用して、後述する本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質(例えば、抗体)または他の標的化部分を使用して、干渉RNA分子を肝細胞へと特異的に標的とすることができる。ある特定の実施形態では、干渉RNA分子は、表面発現されるASGR、ASGR−1および/またはASGR−2を使用して、肝臓細胞に標的化される。これらの実施形態では、標的化された干渉RNAの効果により、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の発現が低下するにつれて、これが、肝臓細胞に送達されるRNAi剤の量を低下させる自己調節系をもたらし得ることが想定される。
本発明の方法において用いることができる干渉RNA分子は、本技術分野で公知の技法を使用して、例えば、従来のRNA固相合成を使用して直ちに作製することができる。例えば、米国特許第8,877,917号を参照されたい。二本鎖RNA分子のポリヌクレオチドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体(例えば、ホスホラミダイト)を利用した好適な核酸合成機においてアセンブルさせることができる。自動核酸合成機は、いくつかのベンダーによって商業販売されており、Applied Biosystems(Foster City、CA)製のDNA/RNA合成機、BioAutomation(Irving、TX)製のMerMade合成機およびGE Healthcare Life Sciences(Pittsburgh、PA)製のOligoPilot合成機を含む。
本発明のさらなる実施形態では、ヒト対象を処置する方法であって、本発明の抗原結合性タンパク質または抗体または干渉RNA(例えば、siRNAまたはshRNA)の治療投薬量を投与するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ヒト抗体である。別の実施形態では、抗原結合性タンパク質または抗体は、ヒト化抗体である。別の実施形態では、干渉RNA(例えば、siRNAまたはshRNA)が投与される。本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒトを含む哺乳動物を指し、用語「患者」と互換的に使用することができる。
本発明の方法および組成物の特定の実施形態は、少なくとも1種の抗原結合性タンパク質および/または干渉RNA、ならびに例えば心血管疾患の処置または予防に有用な1種以上の他の治療薬の使用が関与する。一実施形態では、抗原結合性タンパク質および/または干渉RNAは、単独で、または患者が患う状態の処置に有用な他の薬剤と組み合わせて投与される。このような薬剤の例として、タンパク質性および非タンパク質性薬物の両方が挙げられる。複数の治療薬が同時投与される場合、関連技術分野で認識される通りに、適宜投薬量が調整されてもよい。「同時投与」および併用療法は、同時投与に限定されないが、抗原結合性タンパク質が、患者への少なくとも1種の他の治療剤の投与が関与する処置の経過において少なくとも1回投与される処置レジメンも含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質または干渉RNAは、少なくとも1種の他の治療剤の投与に先立ち投与される。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質または干渉RNAは、少なくとも1種の他の治療剤の投与と同時に投与される。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質または干渉RNAは、少なくとも1種の他の治療剤の投与の後に投与される。
一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、生体試料におけるASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の存在の検出に有用である。用語「検出」は、本明細書で使用される場合、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生体試料は、細胞または組織を含む。ある特定の実施形態では、このような組織は、他の組織と比べてより高いレベルでASGR、ASGR−1および/またはASGR−2を発現する組織を含む。
ASGR−1機能を破壊し、非HDLコレステロールを低下させ、冠動脈疾患を防ぐ希少配列バリアントの同定
循環非高密度リポタンパク質(非HDL)コレステロールのレベルは遺伝性であり、冠動脈疾患(CAD)および心筋梗塞(MI)のリスクと強く相関する。全ゲノム配列決定は、血清脂質レベルに対して大きな影響を及ぼし、したがって、CADおよびMIのような心血管疾患のリスクを有する希少配列バリアントを探し出す可能性を与える。
研究参加者:
様々な脂質特性(非HDLコレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロールおよびトリグリセリド)、アルカリホスファターゼ(ALP)、フェリチンおよびビタミンB12を測定するために使用される、アイスランド、デンマークおよびオランダからの集団試料セットの詳細を表1.2にまとめる。フェリチンについてのデータセットは示していない。研究の一部であった冠動脈疾患症例対照試料セットを表1.1にまとめる。
研究参加者をdeCODEにおいて様々な遺伝的プログラムの一部として登録した。血中脂質レベル(総コレステロール、非高密度リポタンパク質コレステロール(非HDL−C)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL−C)、高密度リポタンパク質コレステロール(HDL−C)およびトリグリセリド)、アルカリホスファターゼおよびビタミンB12レベルをアイスランドにおける最大の研究所のうちの3つから得た:1)Landspitali−The National University Hospital of Iceland(LUH)、Reykjavik(1993年から2012年の間に実施した測定、入院および外来患者)、2)Mjoddにおける研究所(RAM)、Reykjavik(2004年から2012年の間に実施した測定、外来患者)および3)Akureyri Hospital、The Regional Hospital in North Iceland、Akureyri(2004年から2010年の間に実施した、入院および外来患者)。参加者に関する情報を表1.2にまとめる。脂質レベルを、性別、生年および測定時の年齢、脂質低下薬および測定部位について、個体の複数回測定の平均を使用して調整し、次いで分位数正規化を使用して標準正規分布に正規化した。効果推定値をmmol/Lにおいて得るために、回帰解析からの推定値に集団における脂質レベルの推定標準偏差を掛けた。それらのおおよその対数正規分布を考慮して、トリグリセリドレベルを調整前に対数変換し、対応する効果推定値をmmol/Lの単位の代わりに変化パーセンテージとして提示する。アイスランドにおける非HDLコレステロール、LDLコレステロール、HDLコレステロールおよびトリグリセリドを有する個体の総数を以下の表1.3に示す。各脂質について、チップ分類し(chip−typed)かつ直接インピュートした個体ならびに家族性インピュテーションを有する個体の数も示す。
アイスランド人でない試料セットの特徴を表1.1および表1.2にまとめる。表1.1および1.2にまとめた研究の全ては、適切な生命倫理および/またはデータ保護機関によって承認された。Nijmegen Biomedical Study、オランダからの試料に関して、脂質値(すなわち、総コレステロール、HDL−コレステロールおよびトリグリセリド)は全て非空腹値であった。デンマーク人Inter99およびAddition研究からの試料に関して、脂質値は全て空腹値であった。生体試料を提供した全ての参加対象は、インフォームドコンセントに署名している。表現型および生体試料の個人識別は、Icelandic Data Protection Authorityによって提供された第三者システムによって暗号化した。
全ゲノム配列決定、SNP呼び出しおよびインピュテーション
アイスランド人の試料を、Illuminaマイクロアレイを使用して遺伝子型を決定した(Samani NJら、Genomewide association analysis of coronary artery disease.The New England journal of medicine 2007年;357:443−53頁)。2,636人のアイスランド人の全ゲノムを、標準的なTruSeq法(Illumina)を使用して少なくとも10倍(中央値20倍)の平均深度まで配列決定した(Samani NJら、Genomewide association analysis of coronary artery disease.The New England journal of medicine 2007年;357:443−53頁)。ASGR−1遺伝子におけるGCリッチイントロン4の改善された配列決定カバレッジに関して、738人のアイスランド人について作成した全ゲノム配列データを、Illumina製のTruSeq PCRフリー法(30倍の平均深度)を使用して解析した。ASGR−1のイントロン4におけるdel12バリアントをこのデータセットにおいて検出した。
本発明者らは、Centaurus(Nanogen)プラットフォーム(Gretarsdottir Sら、Genome−wide association study identifies a sequence variant within the DAB2IP gene conferring susceptibility to abdominal aortic aneurysm.Nature genetics 2010年;42:692頁)を使用してrs186021206の単一SNP遺伝子型決定を実施した。del12バリアントを、以下のプライマー:フォワード(forwrd)プライマー(NED標識化)5’−TTCATCTTTCTTCCCACATTGC−3’(SEQ ID NO:32600)、リバース(reverse)プライマー5’−GGGCCTGAGAGAGACGTTCA−3’(SEQ ID NO:32601)を用いてPCRベースの方法を使用して遺伝子決定した。内部サイズ標準を得られたPCR産物に加え、断片を分離し、社内のAllele Callerソフトウェアを使用してApplied Biosystemsモデル3730シーケンサーにおいて検出した。
アイスランド人のデータセットにおけるインピュートした遺伝子型と、血清脂質(非HDLコレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロールおよびトリグリセリド)、ALP、フェリチンおよびビタミンB12レベルとの間の関連性を、追加の遺伝モデルを仮定して、一般化線形回帰を使用して試験した(Samani NJら、Genomewide association analysis of coronary artery disease.The New England journal of medicine 2007年;357:443−53頁;およびOlsen MHら、N−terminal pro−brain natriuretic peptide,but not high sensitivity C−reactive protein,improves cardiovascular risk prediction in the general population.European heart journal 2007年;28:1374−81頁)。アイスランド人のデータセットに関して、ロジスティック回帰を使用して、疾患状態を応答として、個体が保有するdel12のコピー数を説明変数として取り扱って、del12バリアントと冠動脈疾患および心筋梗塞との間の関連性を試験した。アイスランド人でない試料セットについての冠動脈疾患症例対照関連性解析を、乗法リスクモデルを仮定するNEMOソフトウェア(Jorgensen ABら、Loss−of−function mutations in APOC3 and risk of ischemic vascular disease.The New England journal of medicine 2014年;371:32−41頁)を使用して行った。アイスランド人およびアイスランド人でない試料セットについての結果を、Mantel−Haenszel固定効果モデルを使用して組み合わせた。心筋梗塞のない生存に対するdel12バリアントの効果を推定するために、対応するカイ二乗検定を、非HDLコレステロールについて1.36、HDLコレステロールについて1.57、トリグリセリドについて1.40、ALPについて1.53、ビタミンB12について1.30、冠動脈疾患について1.71および心筋梗塞について1.48で割ることによって、カプランマイヤー曲線によりヘテロ接合体保因者および非保因者における最初の心筋梗塞に対する生存を推定した(Hoogendoorn EHら、Thyroid function and prevalence of anti−thyroperoxidase antibodies in a population with borderline sufficient iodine intake:influences of age and sex.Clinical chemistry 2006年;52:104−11頁)。
cDNA調製、増幅、サンガー配列決定および次世代配列決定:
RNAをdel12の保因者および非保因者由来の血液試料から単離した。cDNA生成後、ASGR−1におけるエクソン3と5の間の領域をPCR増幅し、同定したPCR産物(del12保因者について2つおよび非保因者について1つ)を、標準的な方法を使用してサンガー配列決定して、同定したcDNA産物間の配列の相違を決定した。2つの増幅したcDNA PCR産物間の比を定量するために、これらを、MiSeq v2試薬キットと連結したIllumina MiSeq機器を使用して配列決定した。
野性型ASGR−1 cDNAおよび22bpを欠失しているASGR−1 cDNAを、22bpを欠失しているASGR−1転写産物が、ウェスタンブロット解析によって評価されるように安定な切断型ASGR−1タンパク質を生成するか否かを決定するためにHeLa細胞内で一時的に過剰発現させた。
野性型および突然変異ASGR−1 cDNAの生成およびクローニング:
ASGR−1のcDNAを、ヒト肝臓marathon ready(BD biosciences Clontech)cDNAでのPCRによって得た。使用したプライマーは、フォワード5’GCCAGCCCTATCATGACCAA’3(SEQ ID NO:32604)およびリバース5’GCAGGTCGAGGCATTGAAGA’3(SEQ ID NO:32605)であった。得られたcDNAは、ASGR−1の開始および終止コドンを含む全てのエクソンを含有した。PCR産物を1.6%アガロースゲル上に流し、正確なサイズのバンドを切り出し、製造業者のプロトコールに従ってQIAquickゲル抽出キット(QIAGEN 28704)を使用して精製した。pcDNA3.1/V5−His TOPOベクター(Invitrogen K4800−01)内へのASGR−1 cDNAのクローニングのために、2μlのゲル抽出産物を使用し、製造業者のプロトコールに従って、pcDNA3.1_ASGR−1_WTを得た。形質転換したTOP10化学的コンピテント細胞(Invitrogen C4040−10)を、50μg/mlのアンピシリンを含有するLBプレート上にプレーティングした。コロニーを、50μg/mlのアンピシリンを含有する3mLのLB培地中で増殖させた。プラスミドを、製造業者のプロトコールに従ってQIAGENプラスミドミニキット(QIAGEN 12125)を使用して精製した。プラスミド配列を、以下の配列決定プライマー:T7:5‘TAATACGACTCACTATAGGG’3(SEQ ID NO:32606)、BGH:5’TAGAAGGCACAGTCGAGG’3(SEQ ID NO:32607)およびASGR−1:5’GAGGCAATGTGGGAAGAAAGATG’3(SEQ ID NO:32608)を使用してサンガー配列決定によって確認した。
del12保有mRNAを代表するcDNAを生成するために、標的化突然変異誘発を実施した。Q5部位特異的突然変異誘発キット(New England BioLabs E0554S)およびpcDNA3.1_ASGR−1_WTプラスミドを鋳型として使用した。手短に述べると、PCR反応を、以下のプライマー5’GAGGCAATGTGGGAAGAAAGATGAAGTCG‘3(SEQ ID NO:32609)および5’CTGGGCCTCCGTGCTCGC’3(SEQ ID NO:32610)を使用して実施し、エクソン4の末端において22bpを欠失している全pcDNA3.1_ASGR−1_WTプラスミドを表す二本鎖DNA断片を得た。製造業者の推奨に従って、1uLのPCR反応を、PCR断片をリン酸化し、再環状化し、非突然変異鋳型プラスミドを除去する、KLD反応(New England BioLabs E0554S)において使用した。突然変異プラスミドをNEB5−アルファコンピテント細胞(New England BioLabs C2987H)内に形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含有するLBプレート上にプレーティングした。コロニーを、50μg/mlのアンピシリンを含有する3mlのLB培地中で増殖させた。プラスミドを、製造業者のプロトコールに従ってQIAGENプラスミドミニキット(QIAGEN 12125)を使用して精製した。ASGR−1_22bp_del配列をサンガー配列決定によって確認した。
トランスフェクションの2日前に、100,000個のHeLa細胞(Public Health England 93021013)を、10%のウシ胎仔血清(ThermoFisher 10500−064)および50単位/mLのペニシリンおよび50ug/mLのストレプトマイシン(ThermoFisher 15070−063)を補足した3mLのDMEM培地(11995−065、ThermoFisher)入りの6ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を加湿インキュベーター内で37℃および5%CO2にてインキュベートした。
RNAを、製造業者の推奨に従ってRNeasy Mini Kit(Qiagen 74106)を使用して細胞から単離し、濃度および質をNanodrop 1000分光光度計(Thermo Scientific)により決定した。cDNAを、高容量cDNA逆転写酵素キット(ThermoFisher)を使用して合成した。DNAを、製造業者の推奨に従ってMasterPure DNA Purification Kit(Epicentre MCD85201)を使用して細胞から単離した。
6ウェルプレートの2つのウェルに対応する細胞を、1:100のHaltプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む200μlのRIPA緩衝液(Thermo Scientific 78442)を使用して溶解させた。溶解物を氷上に10分間撹拌しながら維持し、続いて20秒間超音波処理し(Branson 2510)、氷上で10分間さらに撹拌した。溶解物を4℃にて15分間、14,000×gにて遠心沈殿した。溶解物の総タンパク質量を、Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific 23227)を使用して推定した。試料を、Novex Bolt LDS試料緩衝液(4×)(Life technologies B0007)およびNovex Bolt試料還元剤(10×)(Life technologies B0009)を使用して調製し、Novex Nupage 4−12%Bis−Trisゲル(Life technologies NP0335BOX)上に流した。1つのレーン当たりの総タンパク質量は24μgであり、PageRuler(Thermo scientific 26616)を使用してタンパク質サイズを推定した。ゲルを50分間200Vに一定して流した。タンパク質を、iBlot2(Life technologies)を使用してニトロセルロース膜(Life technologies IB23002)に移した。膜を乾燥させ、次いでMQ水により水和し、その後、ブロットした。膜を、Odyssey遮断(blocking)緩衝液PBS(Li−Cor 927−40000)を使用して室温にて1時間遮断した。使用した一次抗体は、室温にて3時間、0.1%Tweenを添加した遮断緩衝液中でインキュベートしたα−ASGR−1(Sigma−Aldrich HPA011954)1:500(アミノ酸1−41を認識する)およびα−ベータ−アクチン(Abcam ab6276)1:5000であった。使用した二次抗体は、室温にて1時間、PBST+0.01%SDS中の両方1:20,000であるα−ウサギ680RD(Li−Cor 926−68073)およびα−マウス800CW(Li−Cor 926−32212)であった。膜を洗浄した後、これを乾燥させ、次いでOdyssey赤外線イメージングシステム(Li−Cor Biosciences)を使用して走査した。
deCODE Genetics表現型データベースは、各分野における専門家との協力よって得られた疾患および特性に関する医療情報を含有する。これは、心血管疾患(例えば、心筋梗塞、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、心房細動、洞不全症候群および脳卒中)、代謝障害(例えば、肥満、糖尿病およびメタボリックシンドローム)、精神障害(例えば、統合失調症、双極性障害、不安症および鬱病)、依存症(例えば、ニコチン、アルコール)、炎症性疾患(例えば、関節リウマチ、狼瘡および喘息)、筋骨格障害(例えば、変形性関節症、骨粗鬆症)、眼疾患(例えば、緑内障)、腎疾患(例えば、腎臓結石、腎不全)および29種類のがんに関する情報を含む。身体測定もまた、これらのプロジェクトのいくつかを通じて収集されている。患者の精密検査から定期的に測定された特性(例えば、ナトリウム、カリウム、重炭酸塩、カルシウム、リン酸塩、クレアチニン、血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、免疫グロブリン、鉄、ビタミン、脂質、肝機能検査など)は、Landspitali University Hospital、ReykjavikおよびMjoddにおけるIcelandic Medical Center Laboratory(Laeknasetrid)、Reykjavikから得た。del12との関連性について試験した、独立し、相関のない二次特性の数は合計で400に達する。
非HDLコレステロールレベルとの配列バリアントの関連性
配列バリアントを、20倍の中央深度までの2,636人のアイスランド人の全ゲノム配列決定(「WSG」)によって最初に同定した。これらのバリアントは、Illumina一塩基多型(SNP)アレイを使用して遺伝子型を決定した104,220人のアイスランド人のゲノムに(広域相解析したハプロタイプによる補助によって)インピュートした。さらに、アイスランド人の遺伝学的情報を使用して、遺伝子型を決定された人に対する294,212人の近親者についての遺伝子型確率を算出した。これらのデータを使用して、本発明者らは、非HDLコレステロールレベル(n=119,146)と関連する新規の希少バリアントをスクリーニングした。染色体17p13.1上の7つの相関した(ペアワイズr2>0.7)希少非コードSNPのセットは非HDLコレステロールレベルと関連していた。7つのバリアントは、アシアロ糖タンパク質受容体1および2(ASGR−1およびASGR−2)遺伝子を含む、80kbに及ぶ。最も強い関連性は、非HDLコレステロールの8.9±1.5mg/dlの低下と関連するASGR−1の下流に位置するrs186021206(マイナーアレル頻度(MAF)=0.43%)によって表された(P=1.4×10−9)(表1.4B)。
del12はASGR−1のイントロン4に位置するので、本発明者らは、エクソン4と5の間のスプライシングに対するその効果を調べた。del12の12人の非保因者および12人のヘテロ接合体保因者からの血液試料から生成したcDNAにおけるエクソン3と5の間の領域をPCR増幅した(図4)。PCR産物をゲル電気泳動によって分離し、非保因者において239bpのバンドを実証した。しかしながら、del12保因者において、予測された239bpのPCR産物に加えて、より小さな217bpバンドが示された(図4B)。cDNA産物のサンガー配列決定時に、本発明者らは、217bpのcDNA断片においてエクソン4の末端に22bpの欠失を同定した(図4C)。ASGR−1転写産物からのこれらの22bpの欠失は、エクソン4における疑似5‘−スプライス部位によって駆動されるように見える(図4D)。これは、翻訳された場合、得られたタンパク質がオリゴマー化ドメインおよび炭水化物認識ドメインの両方を欠くように、保因者においてフレームシフトを引き起こす。このスプライシング欠損を定量するために、本発明者らは、del12保因者に見出された2つのcDNA産物の配列決定によって作成した、配列決定読み取りの直接デジタル計数のためのIllumina TruSeq法を、使用した。平均すると、全ASGR−1転写産物の32±13%が、不正確にスプライシングされたアイソフォームによって占められていた(図4E)。この形態は非保因者において検出できなかった(図4E)。まとめると、これらのデータは、ASGR−1を、この遺伝子座における非HDL関連性についての標的遺伝子と同定し、ASGR−1タンパク質の機能を破壊する、関連した突然変異であるdel12と整合性がとれている。ASGR−1は、これらのN結合型炭水化物鎖上の末端ガラクトース(Gal)またはN−アセチルガラクトサミン(Gal−NAc)残基を含有する多種多様の脱シアル化糖タンパク質のエンドサイトーシスおよび分解を認識し、媒介することが知られている肝臓アシアロ糖タンパク質(asioaloglycoprotein)受容体(ASGR)の主要なサブユニットである(Morell AG、Gregoriadis G、Scheinberg IH、Hickman J、Ashwell G. The role of sialic acid in determining the survival of glycoproteins in the circulation. The Journal of biological chemistry 1971年;246:1461−7頁;Van Den Hamer CJ、Morell AG、Scheinberg IH、Hickman J、Ashwell G. Physical and chemical studies on ceruloplasmin.IX. The role of galactosyl residues in the clearance of ceruloplasmin from the circulation. The Journal of biological chemistry 1970年;245:4397−402頁;Ashwell G、Harford J. Carbohydrate−specific receptors of the liver. Annual review of biochemistry 1982年;51:531−54頁;Weigel PH. Galactosyl and N−acetylgalactosaminyl homeostasis:a function for mammalian asialoglycoprotein receptors. BioEssays:news and reviews in molecular,cellular and developmental biology 1994年;16:519−24頁)。
非HDLコレステロールレベルに対するdel12の効果を考慮して、アイスランドからの33,090人の症例および236,254人の対照ならびにUSA、UK、ニュージーランドおよびデンマークからの8,558人の症例および11,120人の対照のCADのリスクに対するこの影響を評価した。del12の保因者は、非保因者よりCADの低いリスクを有することが見出された(オッズ比0.66;95%信頼区間[CI]0.55から0.79;P=6.3×10−6)(図5A)。8つの研究集団にわたって異質性の証拠はなかった(Phet=0.96)。del12はまた、アイスランドにおいてMIのリスクを減少させる(ハザード比0.64;95%CI、0.64から0.80;P=8.5×10−5)(図5B)。さらに、del12保因者は非保因者より1.5年長い寿命を有する(95%CI、0.2から2.8年;P=0.020)。
ASGR−1におけるdel12の全体的な効果を決定するために、アイスランド人のデータセットにおける様々なヒト疾患および他の特性に対するこの効果をスクリーニングした。より高いレベルの循環アルカリホスファターゼ(ALP)(33.6±2.8U/L増加、P=3.6×10−63)およびビタミンB12(58.4±8.3pmol/L増加、P=3.1×10−12)との、del12の極めて有意な関連性を観察した(表8Aおよび8Bならびに表18)。ALPレベルの増加は肝疾患を反映し得るが、del12保因者において、血清ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼまたは一般に肝疾患においてALPの変化と並行する肝機能の他の尺度の増加はなかった(表1.6)。
ASGR−1ノックアウトマウスからのALPデータ
ASGR−1 KOマウス(系統B6.129S4−ASGR−1tm1Sau/SaubJxmJ)をJackson Labsから得、食餌により維持した。血清を4時間の絶食後にオスおよびメスの動物から採取し、Olympus AU640 Clinical Chemistry Analyzerにおいて試験した。野性型マウスと比較して、血清ALPはASGR−1ノックアウトマウスにおいて上昇する(*、p<0.05;****、p<0.0001、ダネット検定による一元配置分散解析)。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)のレベルは群間で有意に異ならなかった。これらのデータを本明細書において図7にまとめる。WT=野性型;HE=ヘテロ接合体;HO=ホモ接合体。
RNAi
材料および方法
siRNA構築物(Constuct)
RNAを、Qiacubeおよび標準的なQiagen RNA単離プロトコールを使用して、スクランブルsiRNA、マッチした対照siRNAまたはhASGR−1、hASGR−2、mASGR−1もしくはASGR−2に対するsiRNAにより処理したHepG2、CHO安定細胞株または肝組織から単離した。RNAを、RQ1 DNaseキット(Promega)を使用してDNase処理した。定量的PCRを、Applied Biosystems製の示したプライマープローブセット(hASGR−1:Hs01005019_m1;hASGR−2:Hs00910102_m1;mASGR−1:Mm01245581_m1、mASGR−2:Mm00431863_m1)を使用してQuantstudio 7において製造業者のプロトコールに従って実施した。50ngのRNA/ウェルを使用し、18S内部対照により正規化した。
製造業者のRNAiリバーストランスフェクションプロトコールに従ってLipofectamine RNAMAX(Thermo Scientific)を使用して、3−4日間、細胞に、10nMの示したスクランブルsiRNA、マッチした対照siRNA、またはhASGR−1、hASGR−2、mASGR−1もしくはmASGR−2 siRNAに対するsiRNAを、トランスフェクトした。トランスフェクションは、内部移行アッセイのために96ウェルScreenstarマイクロプレート(Greiner bio−one)ならびにQPCRおよびウェスタンブロッティングのための96ウェル透明組織培養プレート(Corning)において行った。
細胞を、siRNAトランスフェクションの3−4日後、阻害剤を含有するRIPA緩衝液中に溶解した。細胞溶解物を21ゲージシリンジに5回通し、次いで4Cにて15分間13000rpmにて遠心分離した。上清を回収し、タンパク質濃度を決定した。必要に応じて、30ugのタンパク質を、脱グリコシル化キット(Genzyme)を使用して脱グリコシル化した。10ug−30ugの総タンパク質を各ウェルに充填した。ゲルをニトロセルロース膜上に移し、膜を、室温にて1時間、5%の遮断緩衝液により遮断した。次いで膜を、4Cにてo/n、抗mASGR−1(1:1000、R&D)、hASGR−1(1:1000、ProteinTech)、hASGR−2(1:1000、Abcam)、抗flag(1:5000、Sigma)、抗his(1:1000、Cell signaling)およびマウス抗β−アクチン(1:5000、Thermo FisherまたはCell signaling)によりプローブした。膜を、示したバンドを検出するために抗マウスおよび抗ラット二次抗体によりさらにプローブした。
CHO安定細胞株を、3−4日間、スクランブルsiRNA、マッチした対照siRNAまたはhASGR−1、hASGR−2、mASGR−1もしくはmASGR−2 siRNAに対するsiRNAにより処理し、96ウェルプレートにプレーティングした。ビオチン−GalNAc−PAAをインキュベートし、ストレプトアビジン−Alexa 488を細胞にさらに加えた。Draq5を使用して、細胞を、(細胞質および核の両方について)対比染色した。細胞をOperetta Image Systemにより走査し、データをColumbusによって解析した。
全ての動物収容条件および研究プロトコールは、Amgen Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって承認された。マウスを、換気したマイクロアイソレーターにおける、特定病原体を含まない、AAALAC、Intlにより認可されている施設に収容した。処置および収容室を正に加圧し、12:12の暗:明サイクルに調節した。自動散水システムにより全ての動物に逆浸透精製水を自由に取らせた。10−12週齢のC57BL/6J動物(The Jackson Laboratory)を単独で収容し、標準的な食餌(2020×Teklad global soy protein−free extruded rodent diet;Harlan)を供給した。
これらの研究からのデータを本明細書の図8−17に提供する。
Y272C突然変異データ
C末端FLAGエピトープタグ化ネズミ野性型またはY272C ASGR−1を発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の安定なプールを、ピューロマイシン選択を使用した確立された方法によって生成した。ASGR−1の細胞表面発現を、選択プロセスの間および実験の時の両方で抗FLAG抗体を使用してFACSによって確認した。リガンド結合を、β−GalNAc−PAA−ビオチン(Glycotech Corporation)およびストレプトアビジン−フィコエリスリン(PE)を使用してFACSによって評価した。簡潔に述べると、リガンドを、フェノールレッドと2%のウシ血清アルブミン(BSA)を有さないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の100ulの細胞(1×106個の細胞)に加え、60分間氷上でインキュベートした。次いで細胞を、フェノールレッドと2%BSAを有さないDMEMにより3回洗浄した。次いでストレプトアビジン−PEを氷上で1μg/mlにて20分間加え、続いてフェノールレッドと2%BSAを有さないDMEM中でさらに3回洗浄し、この時点で細胞を、フェノールレッドと2%BSAを有さない0.5mlのDMEMおよび5ulの0.1mM SyTOx Blue生存染色剤中に再懸濁し、BD LSR II(BD Biosciences)において解析した。データは、以下の表4.1に示すように中央蛍光強度として提示する。
抗体の生成
ASGR−1およびASGR−2配列の分子クローニング
組換えASGR−1およびASGR−2ベクターの産生のために、cDNA配列を、合成するか、商業的供給源から得るか、またはRNA配列決定データ(Amgen)からコンパイルすることによって得た。ヒト、マウスおよびラットASGR cDNAクローンを、商業的に得た(OriGene Technologies,Inc.)。他の全てのASGR cDNAを、合成した(Integrated DNA Technologies,Inc.)。GenBank受託番号は以下の通りである:ヒトASGR−1(NM_001671.4)、ヒトASGR−2(NM_080913.3)、マウスASGR−1(BC022106.1)、マウスASGR−2(BC011197.1)、ラットASGR−1(NM_012503)、ラットASGR−2(NM_017189)、ブタASGR−1(NM_001244458)、ブタASGR−2(XM_005669199)、イヌASGR−1(XM_546579)、イヌASGR−2(XM_003434599)、カニクイザル(cynomologus monkey)ASGR−1(XP_005582755)。カニクイザルASGR−2についてのNCBI登録は部分的なアミノ酸配列(NCBIタンパク質受託番号EHH57653)であるので、完全なヌクレオチド配列を、カニクイザルゲノム(ゲノムはMacaca_fascicularis_5.0を構築した;GenBank受託番号GCA_000364345.1;Washington University)ならびにカニクイザルの肝臓、心臓および皮膚組織からのRNA配列決定データ(Amgen)の解析によってコンパイルした。一時的または安定な哺乳動物発現のために、cDNAを、pTT5(National Research Council of Canada)、pSLX235a(SureTech)またはpJiF1(Boyce Lab、Massachusetts General Hospital、米国特許第7,192,933号)内にクローニングした。哺乳動物細胞における個々の組換えタンパク質産生のために、ほぼ全ての配列を、6×His精製タグによりこれらのC末端においてタグ化した。huASGR−1およびhuASGR−2の複合化のために、huASGR−2を、6×Hisタグを用いずに発現させた。E.コリ(E.coli)における組換え発現のために、配列をpET21a(Novagen、EMD Millipore)内にクローニングした。得られたASGRタンパク質のアミノ酸配列を表1に示す。
組換えタンパク質発現のための安定なCHO−S細胞プールの生成
CHO−S(Invitrogen、Carlsbad、California)細胞に、製造業者の推奨(ThermoFisher Scientific)に従ってLipfectamine LTXを使用してASGR−1またはASGR−2をコードするpSLX235aベクターをトランスフェクトした。安定なプールを、10ug/mlピューロマイシン(単一選択)または10ug/mlピューロマイシンおよび400ug/mlハイグロマイシン(二重選択)を使用して、2日毎に新鮮な培地中で細胞を培養することによって選択した。次いで安定なプールを組換えタンパク質産生のために使用した。
選択した安定なプールからの細胞を成長培地中で増殖させた。十分な細胞数が得られたら、培養物を、8×105個の細胞/mlの生存細胞密度にて1Lの体積の成長培地入りの2Lの三角フラスコに播種した。次いで細胞を、37℃、5%CO2において3日間、懸濁液中で培養し、その後、温度を産生の最後の7日間で31℃に低下させた。遠心分離を使用して細胞をペレット化し、得られた上清を濾過して馴化培地を生成した。
E.コリのコドン最適化配列を、pET21a発現プラスミド内にクローニングした。プラスミドをE.コリ株BL21(DE3)Star(ThermoFisher Scientific Inc.)内に形質転換し、個々のクローンを、カルビニシリン(carbinicillin)を使用して選択した。発現のために、細胞を、37℃にて撹拌しながら4Lのフラスコ内の1LのTB成長培地(カルビニシリンを補足した)中で成長させた。2の光学密度に達したら、タンパク質発現を1mM IPTG(最終濃度)の添加によって誘導した。37℃での誘導の4時間後、細胞ペーストを遠心分離によって採取した(7から14gの間の細胞ペースト/L培養物を回収した)。不溶性フラクション内へのタンパク質局在化をSDS−PAGEによって確認した。
マウス株
ヒトASGRに対する完全なヒト抗体を、XENOMOUSE(登録商標)トランスジェニックマウスを免疫化することによって生成した(米国特許第6,114,598号;同第6,162,963号;同第6,833,268号;同第7,049,426号;同第7,064,244号、これらの全体を参照により本明細書に組み込む;Greenら、1994年、Nature Genetics 7:13−21頁;Mendezら、1997年、Nature Genetics 15:146−156頁;GreenおよびJakobovitis、1998年、J.Ex.Med、188:483−495頁;KellermanおよびGreen、Current Opinion in Biotechnology 13、593−597頁、2002年)。全ての免疫化のために、XMG2−K、XMG2−KL、XMG4−KおよびXMG4−KL XENOMOUSE(登録商標)系統由来の動物を使用した。
複数の免疫原および免疫化の経路を使用して、抗ヒトASGR免疫反応を生成した。遺伝子免疫化のために、マウスを、製造業者の指示書(BioRad、Hercules、California)に従ってHelios Gene Gunシステムを使用して6から8週にわたって12から14回免疫化した。簡潔に述べると、野性型ヒトまたはマウスASGR−1(またはhuASGR−1+huASGR−2、muASGR−1+muASGR−2の両方)をコードする発現ベクターを金のビーズ(BioRad、Hercules、California)上にコーティングし、剃毛したマウスの表皮またはラット腹部に送達した。細胞ベースの免疫化のために、マウスおよびラットを、ヒトまたはマウスASGR−1(またはhuASGR−1+huASGR−2、muASGR−1+muASGR−2の両方)をコードする発現ベクターにより一時的にトランスフェクトしたCHO細胞(Invitrogen、Carlsbad、California)または293−6E細胞(National Resource Council of Canada)により免疫化した。動物を、皮下と腹腔内注射との間で交互に行ったプロトコールを使用して6週にわたって10回、硫酸アルミニウムカリウム(EMD Chemicals Inc.、Gibbstown、NJ)から調製したミョウバンおよびCpG−ODN(Eurofins MWG Operon LLC、Huntsville、AL)と混合した細胞により免疫化した。最初の追加免疫は4×106個の細胞からなっていたのに対して、後の追加免疫は2×106個の細胞を含んでいた。可溶性タンパク質免疫化のために、マウスを、完全な細胞外ドメイン(ECD)、炭水化物結合ドメイン(CBD)またはASGR−1およびASGR−2 ECDの複合体を表す様々なヒトASGR組換えタンパク質により免疫化した(表5.1)。動物を、皮下注射を使用して4−6週にわたって10回、ミョウバンおよびCpG−ODNと混合した組換えタンパク質(または標準的な方法を使用してKLHにコンジュゲートした組換えタンパク質)、完全フロイントアジュバント(Sigma)またはMPL+アジュバント(Sigma)により免疫化した。最初の追加免疫は10μgからなっていたのに対して、後の追加免疫は5−10μgを含んでいた。ヒトASGR−1特異的血清力価を、Accuriフローサイトメーター(BD Biosciences)において生細胞FACS解析によってモニタリングした。最も高い抗原特異的血清力価を有する動物を屠殺し、ハイブリドーマ生成(KohlerおよびMilstein、1975年)のために使用した。
ハイブリドーマ生成
好適な血清力価を示す動物を同定し、リンパ球を脾臓および/または排出リンパ節から得た。プールしたリンパ球(各々の免疫化コホート由来)を、適切な培地(例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM);Invitrogen、Carlsbad、CA)中で粉砕することによってリンパ系組織から解離させた。B細胞を、標準的な方法を使用して選択しおよび/または増殖させ、当該技術分野において公知の技術を使用して適切な融合パートナーと融合させた。
各々の免疫組織採取物からの融合したハイブリドーマプールを、様々なプローブを使用してFACSベースの濃縮のための材料源として使用した。ネイティブ(全長、細胞上)ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、イヌまたはブタASGR−1(およびネイティブヒトASGR−2)に特異的な抗体を発現するハイブリドーマを濃縮するために、膜を、関連ASGR cDNA構築物を一時的に発現する293T細胞から調製した。293−Fectin(ThermoFisher Scientific Inc.)を使用したトランスフェクションの24時間後、細胞を、製造業者の推奨(ThermoFisher Scientific Inc.)に従ってE−Z link NHS−LC−LC−ビオチンによりビオチン化した。ビオチン化後、細胞をニードルおよびシリンジにより均質化して膜断片を形成し、「膜調製物(membrane prep)」と名付けた。次いでビオチン化膜調製物を使用して、標準的なビオチン−ストレプトアビジン化学により目的の標的に特異的な表面抗体を発現するハイブリドーマを検出した。組換えASGR−1 ECDまたはCBDに結合できるハイブリドーマを濃縮するために、可溶性、6xHisタグ化ASGR−1タンパク質を使用した(Amgen)。
ASGR−1特異的抗原の同定
以下の表6.1は、アッセイされる抗体のおおよその数をまとめる:
ASGR−1特異的結合抗体の最初の選択
ハイブリドーマ上清(モノクローナル抗体)を、Cell Insight(商標)High Content Imaging Platform(ThermoFisher Scientific)を使用してヒト胚腎臓(HEK)293細胞上で一時的に発現したヒトASGR−1との結合についてスクリーニングした。ヒトASGR−1は、製造業者によって設定されたプロトコールに従ってヒトASGR−1 DNA、Gibco(商標)Opti−MEM(登録商標)培地および293Fectin(商標)試薬を使用したトランスフェクションによって宿主HEK293細胞上で一時的に発現した。ヒトASGR−1を発現するトランスフェクトしたHEK293細胞、ハイブリドーマ上清または対照試料、Alexa Fluor(登録商標)488 IgG断片特異的検出抗体およびHoechst 33342株を混合し、室温にて3時間インキュベートした。次いで試料を洗浄し、CellInsight(商標)システムにより解析した。上清を、空親ベクター(偽(mock)と称される)をトランスフェクトしたHEK293細胞に対してカウンタースクリーニングした。解析を、無関係のIgG抗体上清試料シグナルを使用して行い;無関係のIgG抗体試料より2倍またはそれより多いシグナルを示すハイブリドーマ上清試料を、ASGR−1特異的結合プロファイルを示すとみなし、さらなる特徴付けのために選択した。表6.1を参照。
ASGR−1受容体−リガンド遮断抗体の同定
ASGR−1結合ハイブリドーマ上清を、ASGR−1がリガンドに結合することを阻止するこれらの能力について試験した。競合的結合アッセイを、以下のようにヒトASGR−1を一時的に発現するHEK293細胞またはヒトASGR−1を安定に発現するCHO−S細胞のいずれかでFACSを使用して抗原特異的ハイブリドーマ上清試料において実施した。ヒトASGR−1を発現するHEK293細胞またはCHO−S細胞を抗体試料(ASGR−1に特異的なハイブリドーマ上清)と混合し、4℃にて1時間インキュベートし、次いで2回洗浄した。次いで結合試料を有する細胞を、予め複合体化したβ−GalNAc−PAA−ビオチン(GlycoTech、Gaithersburg、Maryland)/Alexa Fluor(登録商標)647−ストレプトアビジンと4℃にて45分間インキュベートした。β−GalNAc−PAA−ビオチンの濃度は特異的細胞株において結合EC50濃度にて使用した。Alexa Fluor(登録商標)647ストレプトアビジンの濃度はβ−GalNAc−PAA−ビオチンに対して2:1のモル比にて使用した。次いで7−AAD細胞生存株を加え、細胞を4℃にてさらに15分間インキュベートし、2回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁した。細胞の生存が耐えられる場合、1mMの塩化カルシウムを補足したFACS緩衝液を全てのステップにおいて使用した。試料は、BD Accuri(商標)フローサイトメーターおよびIntellicyt HyperCytオートサンプラーを使用して解析した。解析は、偽トランスフェクトHEK293細胞およびヒトASGR−1トランスフェクトHEK 293細胞の両方において無関係(非ASGR−1特異的)のIgG抗体上清対照シグナルを使用して行って、最大および最小β−GalNAc−PAA−ビオチン結合シグナルを決定した。これらの最大および最小結合シグナルを使用して、β−GalNAc−PAA−ビオチン結合阻害%を決定した。リガンド結合を60%以上低減させる能力を有するASGR−1抗体を同定し(表6.1)、当業者に利用可能な方法を使用して配列決定した。特有のASGR−1特異的、リガンド遮断抗体の配列を本明細書の表2−7に示す。
抗体特徴付け(antibody characterization)アッセイ
A.ASGR−1種交差反応、ASGR−2選択アッセイおよび肝がん(HEPG2)結合アッセイ
ヒトASGR−1特異的なリガンド競合抗体試料を、正規化した抗体濃度でのFACS結合アッセイにおいて他の種(カニクイザルASGR−1、マウスASGR−1、ラットASGR−1、イヌASGR−1およびブタASGR−1)由来のASGR−1およびヒトASGR−2との結合について試験した。細胞ベースのアッセイに関して、目的の適切な抗原を発現するHEK293細胞を抗体試料または対照と混合し、4℃にて1時間インキュベートし、次いで2回洗浄した。次いで結合した抗体を有する細胞を、4℃にて15分間、Alexa Fluor(登録商標)647 IgG Fc断片特異的検出抗体および7−AAD生存染色剤とインキュベートし、1回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁した。試料は、BD Accuri(商標)フローサイトメーターおよびIntellicyt HyperCytオートサンプラーを使用して解析した。陰性対照として、上清および対照もまた、空親ベクターをトランスフェクトしたHEK 293細胞に対してスクリーニングした。解析は、無関係(非ASGR−1特異的)のIgG抗体上清試料シグナルを使用して行い;無関係のIgG抗体試料に対して少なくとも2倍のシグナルを示すハイブリドーマ上清試料を、ASGR−1種特異的結合プロファイルを示すとみなした。膜調製物結合アッセイに関して、ASGR−1種特異的膜調製物を使用してLumAvidin(登録商標)ミクロスフェア(ビーズ)をコーティングし、選択したハイブリドーマ上清または対照との結合について試験した。簡潔に述べると、ASGR−1種特異的膜調製物を、室温にて暗所で45分間、ストレプトアビジンをコーティングしたLumAvidin(登録商標)ビーズと共にインキュベートし、2回洗浄した。ビーズを、Stabilguard(登録商標)を含有するFACS緩衝液中に再懸濁した。次いで抗原結合ビーズを、室温にて暗所で1時間、正規化した抗体試料と共にインキュベートし、2回洗浄し、室温にて暗所で15分間、Alexa Fluor(登録商標)488 IgG Fc断片特異的検出抗体と共にインキュベートし、1回洗浄し、最後にFACS緩衝液中に再懸濁した。試料を、Intellicyt iQue(商標)Screener Platformを使用して解析した。1mMの塩化カルシウムを補足したFACS緩衝液を全てのステップにおいて使用した。陰性対照として、上清および対照もまた、LumAvidin(登録商標)ビーズ上にコーティングした非ASGR−1抗原膜調製物に対してスクリーニングした。解析を、無関係(非ASGR−1特異的)のIgG抗体上清試料シグナルを使用して行い;無関係のIgG抗体試料に対して少なくとも2倍のシグナルを示すハイブリドーマ上清試料を、特異的結合プロファイルを示すとみなした。表7.1を参照。
抗体および抗原相互作用強度(相対的結合親和性)を評価するために、ASGR−1特異的、リガンド競合抗体ハイブリドーマ上清を、制限的な抗原結合アッセイにおいて試験した。組換え、可溶性ASGR−1ビオチン化タンパク質の滴定量を、室温にて暗所で45分間、ストレプトアビジンでコーティングしたLumAvidin Beads(登録商標)と共にインキュベートし、2回洗浄した。ビーズを、Stabilguard(登録商標)および0.05%のアジ化ナトリウムを含有するFACS緩衝液中に再懸濁した。次いで抗原結合ビーズを、室温にて暗所で18時間、正規化したハイブリドーマ上清試料または対照と共にインキュベートし、2回洗浄し、室温にて暗所で15分間、Alexa Fluor(登録商標)488 IgG断片特異的検出抗体と共にインキュベートし、1回洗浄し、最後にFACS緩衝液中に再懸濁した。試料を、Intellicyt iQue(商標)Screener Platformを使用して解析した。1mMの塩化カルシウムを補足したFACS緩衝液を全てのステップにおいて使用した。解析は、無関係(非ASGR−1特異的)のIgG抗体上清試料シグナルを使用して行い;無関係のIgG抗体試料に対して少なくとも2倍またはそれより多いシグナルを示すハイブリドーマ上清試料を、ASGR−1特異的結合プロファイルを示すとみなした。このアッセイ法において、抗体結合シグナルは抗体親和性と相関する。機器シグナル検出の線形範囲内に入る代表的な抗原コーティング濃度についての抗体結合データを表7.2に示す。標的(ASGR−1)との抗体結合の程度は測定した蛍光強度と相関し、それによりパネルにわたる親和性の相対比較が可能となる。
この実施例は、標的に結合するこれらの能力に対するpHおよび/またはカルシウムの効果に基づいてASGR−1抗体を特徴付ける。この実施例に関して、無標識の動的な抗体−ASGR−1結合アッセイを利用して、pHおよびカルシウムの変化に対する抗体の感受性を評価した。簡潔に述べると、ASGR−1特異的、リガンド競合抗体を最初に固定し、次いで生理的条件下(すなわちpH7.4、1mMのCaCl2)で組換え、可溶性huASGR−1に結合させた。結合の量を決定し、100%に設定した。抗体−ASGR−1相互作用がpHまたはCaの変化に対して感受性であるか否かを決定するために、次いでアッセイ緩衝液を、カルシウム欠失、低減させたpH(pH5.6)またはカルシウム欠失および低減させたpH(pH5.6)の両方の条件に変化させ、mAbからのASGR−1の解離をモニタリングした。各条件下で結合したままのASGR−1の量を評価し、開始シグナルのパーセントとして表した。ASGR−1結合シグナルの10%超の差を(生理的条件下で測定したものと比較して)算出した場合、特定の抗体を、この条件に対して感受性があると分類した。この方法を使用して、選択した抗体を5つのカテゴリーに分類した:
1.カルシウムの除去によって影響を受ける
2.カルシウムの除去またはpHの低下によって影響を受けない
3.カルシウムが除去され、pHが低下する両方の場合、影響を受ける
4.カルシウム除去、pH低下および両方の組合せによって影響を受ける
5.pHの低下によって影響を受ける
エピトープを特徴付ける一般的な手段は競合実験による。互いに競合する抗体は標的上の同じまたは重複する部位との結合と考えられ得る。この実施例は、hASGR−1との結合に対する競合を決定する方法および本明細書に記載されている複数の抗体に適用した場合のこの方法の結果を記載する。
この実施例は、標的に結合するこれらの能力に対するASGR−1の突然変異誘発の効果に基づいてASGR−1抗体を特徴付ける。以前のデータにより、ASGR−1 CBDが抗体のパネルに対する抗体結合に主に関与していることが示された。このように、ASGR−1 CBDのみが突然変異部位の設計における全長ASGR−1の前後関係において構造的に考慮された。
ASGR内部移行アッセイ
抗体が結合し、ASGR−1を発現する細胞内へのASGR−1の内部移行も阻止するか否かを決定するために、インビトロ内部移行アッセイを様々な抗体試料について実施する。
試薬:
U2OS(ヒト骨肉腫)細胞株
McCoy’s 5A培地:Gibco、#16600−082
MEM NEAA(100X):Gibco、#11140−050
ペニシリン−ストレプトマイシン(10,000U/ml、100X)Gibco、#15140−122
L−グルタミン(100X):Gibco、#25030−081
ウシ胎仔血清:Gibco、#16000−044
DPBS(CaおよびMgを有さない):Gibco、#14190−136
DPBS(CaおよびMgを有する):Gibco、#14040−133
細胞解離緩衝液:Gibco、#13151−014
1リットルフィルター:Corning、#430517
Hepes緩衝液(1M):Gibco、#15630−080
BacMamウイルス−huASGR−1:GS:SNAP26f
β−GalNAc−PAA−ビオチン:GlycoTech、#01−011
SNAP−Surface Alexa Fluor 546:New England Biolabs、#S9132S
ストレプトアビジン−Alexa Fluor 633:Life Technologies、#S21375
Hoechst 33342:Invitrogen、#H3570
Pitstop2:abcam Biochemical、#ab120687
Pitstop2−陰性対照:abcam Biochemical、#ab120688
パラホルムアルデヒド(8%水溶液):Electron Microscopy Sciences、#157−8−100
イメージングプレート−96ウェルOptical Bottom:Thermo Scientific Nunc、#165305
Operetta High Content Imager:Perkin Elmer
10%FBS、1XMEM NEAA、1XL−グルタミンおよび1Xペニシリン−ストレプトマイシンを有するMcCoy’s 5A
培地は細胞に使用する前に濾過した。
U2OS細胞プレーティングおよび培養:
U2OS細胞を、96ウェルプレートにプレーティングする前にT175において75−85%コンフルエンスまで成長させた。
1. T175フラスコにおいてU2OS培養培地を吸引して、細胞から除去した
2. 細胞を10mlのDPBSにより洗浄し、洗浄液を吸引して除去した
3. 3mlの細胞解離緩衝液を細胞に加え、細胞インキュベーター(37℃、5%CO2)内で5分間インキュベートして、T175フラスコから細胞を分離した。
4. 分離した細胞を7mlの成長培地により希釈した
5. 1mlの細胞を使用してプレートに利用可能な細胞の数を数えた
6. 細胞を成長培地中で希釈して28,000個の細胞/ウェルの最終濃度を得、BacMamウイルス(huASGR−1:GS:SNAP26f)もこの時に所望の濃度(MOI)にて細胞に加えた。
7. 細胞をBacMamウイルスと一緒に1−2分間混合し、次いで100ul/ウェルの体積にて96ウェルイメージングプレートにプレーティングした。
8. プレートを処理前に16−20時間インキュベーター(37℃、5%CO2)内に置いた。
細胞の処理(16−20時間インキュベーション)
1. 翌日、96ウェルプレート上の培地を捨て去り、DPBSにより1回洗浄した。
2. McCoy’s 5A培地+10mMのHepes緩衝液(アッセイ緩衝液)をインキュベーター内で1時間細胞(100ul)に加えた。
3. 1時間のインキュベーション後、培地を捨て去り、CaおよびMgを含有するDPBSにより1回洗浄した。
4. Pitstop2およびPitstop2陰性対照を20uMにてアッセイ緩衝液中で調製した。
5. 100ul/ウェルの体積の阻害剤をインキュベーター内で15分間U2OS細胞に加えた。
6. GalNAc−ビオチン(100nM)およびストレプトアビジン−Alexa 633(100nM)をアッセイ緩衝液中に予混合し、室温にて10分間インキュベートした。
7. SNAP−Surface Alexa Fluor 546(2.5uM)をアッセイ緩衝液中で調製した。
8. 15分のインキュベーション後、GalNAc−ビオチン−ストレプトアビジン−Alexa 633およびSNAP−Surface Alexa Fluor 546の両方を、インキュベーター内で30分間、Pitstop2阻害剤を含有する培地に直接加えた(10ul)。
9. 30分のインキュベーション後、培地を捨て去り、細胞をDPBSにより1回洗浄した。
10. 細胞を、室温にて10分間、Hoechst染料(1:5000希釈)を含有する50ulの4%パラホルムアルデヒド(8%パラホルムアルデヒドをDPBSにより希釈した)を細胞に加えることによって固定した。
11. 10分のインキュベーション後、細胞をDPBSにより2回洗浄し、100ulのDPBSを各細胞に加えた。
12. プレートを、異なる蛍光染料を測定する3つのチャネルを備えるOperetta機器により撮像した。
1) Hoechstを、励起:360−400nmおよび発光:410−480nmの範囲においてフィルターを使用して測定した
2) GalNAc−ビオチン−ストレプトアビジン−Alexa 633を、励起:600−630nmおよび発光:640−680nmの範囲においてフィルターを使用して測定した
3) SNAP−Surface Alexa Fluor 546を、励起:520−550nmおよび発光:560−630の範囲においてフィルターを使用して測定した
13. Harmony 3.5ソフトウェア(Perkin Elmer)を使用して、アッセイにおいて加えた蛍光染料について内部移行したスポットを同定し、定量した。
この内部移行アッセイは、本発明の抗原結合性タンパク質をアッセイすることにより、それがASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の内部移行をどのくらい低減させるかまたは阻害するかを決定するために、実施することができる。
さらなるリガンド遮断アッセイ
脱シアル化タンパク質リガンド(アシアロフェツインおよびオロソムコイド)の調製
ウシオロソムコイド(AGP)を商業的(Sigma)に得、サイズ排除クロマトグラフィーによってHBS(pH7.9)中で平衡化したSuperDex200樹脂上で精製した。個別の3回の試行からの主なAGPピークの前部を合わせて高グリコシル化AGPを生成し、主なピークの残り(3回の合わせた試行から)により低グリコシル化(hypoglycosylated)AGPを生成した。ビオチン化のために、精製したAGPを5mg/mlに濃縮し、記載されているようにInnolinkビオチン 354Sとインキュベートした。次いでビオチン化タンパク質をゲル濾過によって脱塩し、濃縮した。
リガンドとASGR−1との間および抗体とASGR−1との間の相互作用の結晶構造解析
A.リガンドが結合したASGR−1炭水化物結合ドメインの結晶構造
リガンドを含まないASGR−1 CBD(炭水化物結合ドメイン)の結晶構造は、既に公表されている(1)。ASGR−1 CBD(SEQ ID NO:5)のタンパク質発現、精製および結晶化を、公表された方法と同様に実施したが、本明細書に記載されている構造は公表された結晶構造とは異なる。これらの構造の解析は、公表された構造と比較して余分なN末端およびC末端のアミノ酸、様々なリガンドがASGR−1炭水化物結合ドメインと相互作用する様式、ならびに様々な糖についてのASGR−1/ASGR−2間の可能な選択性決定因子を、示す。
ラクトースはASGR−1の炭水化物結合ポケットにおいて結合する
ASGR−1/ラクトース複合体のタンパク質結晶を成長させ、結晶構造を2.05Åにおいて決定した。公開された構造の方法と同様の方法に従ったが、炭水化物結合ポケットにおけるラクトース二糖について、明確な電子密度が存在する。図18Aおよび18Bを参照。この構造において、ラクトース二糖のガラクトース環は炭水化物結合ドメインにおけるカルシウムイオンの上部に位置し、ASGR−1タンパク質との多数の接点を形成する。水素結合が、ラクトースと、ASGR−1アミノ酸Q240、D242、E253およびN265との間に形成される。さらに、フェンデルワールス相互作用が少なくともW244(SEQ ID NO:5)により形成される。図18Cを参照。
結合したラクトース分子まで4.5Å以下の少なくとも1つの非水素原子を有するアミノ酸を同定した。これらには、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267(SEQ ID NO:5)が含まれる。
ASGR−1/ガラクトース複合体のタンパク質結晶を成長させ、結晶構造を2.4Åにおいて決定した。公開された構造の方法と同様の方法に従ったが、炭水化物結合ドメインにおけるガラクトース単糖について、明確な電子密度が存在する。図19Aおよび19Bを参照。
結合したガラクトース分子まで4.5Å以下の少なくとも1つの非水素原子を有するアミノ酸を同定した。これらには、R237、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267(SEQ ID NO:5)が含まれる。結合したラクトース分子まで5Å以下の少なくとも1つの非水素原子を有するアミノ酸を同定した。これらには、R237、Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267(SEQ ID NO:5)が含まれる。
ASGR−1/GalNAc複合体のタンパク質結晶を成長させ、結晶構造を2.2Åにおいて決定した。公開された構造の方法と類似した方法に従ったが、明確な電子密度が炭水化物結合ポケットにおいてGalNAc糖について存在する。図21Aおよび図21Bを参照。
結晶構造の解析により、ASGR−1とGalNAcとの間の相互作用に関与する特定のアミノ酸を同定する。代替の分子によるこれらのアミノ酸の少なくとも1つとの相互作用は、ASGR−1とGalNAcとの間の相互作用を、完全または部分的に阻害し得る。
ASGR−1発現および精製
実施例12における全ての結晶学(chrystallography)実験に関して、ヒトASGR−1 CBDタンパク質(SEQ ID NO:5)を、E.コリにおいて発現させ、リフォールディングし、精製した。
精製したヒトASGR−1 CBD(148−291)タンパク質を、8−12mg/mlに濃縮した。ASGR−1/炭水化物複合体結晶を、20mMリガンド(ラクトース、ガラクトースまたはGalNAc)の存在下で0.1Mカコジル酸ナトリウム pH6.8、0.08M硫酸アンモニウム、21−23%PEG 8000中で成長させる。
ASGR−1 CBD複合体についてのデータセットを、Rigaku FR−E X線源(ASGR−1/ラクトースおよびASGR−1/ガラクトース)またはBerkeley Advanced Light Sourceビームライン5.0.2(ASGR−1/GalNAc)において収集した。全てのデータセットをiMosflm(2)により処理し、CCP4プログラムスイート(4)からAIMLESS(3)によりスケーリングした。
本実施例は、5E5のFab断片に結合したASGR−1 CBDの結晶構造を提示し、1.95Å分解能まで決定した(これらについての条件は以下に記載している)。図22AおよびBに示したこの構造は、5E5がASGR−1と結合/相互作用する場合、炭水化物結合ループの立体構造再編成が起こり、炭水化物結合ループのリガンド(すなわち炭水化物)との結合/相互作用を損なうことを示す。これは、5E5 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を間接的に阻害することを実証する。
タンパク質試料の発現および精製
5E5 Fab断片を、カスパーゼ3により5E5 mAbを切断することによって生成した。カスパーゼ切断後、FabをMonoSイオン交換カラム上での精製によって単離した。次いでNi Sepharose Excel減算を実施して、Fcドメインが試料から除去されることを確実にした。
ASGR−1 CBD/5E5 Fab複合体を、モル過剰のASGR−1 CBDを5E5 Fabと混合することによって作製した。複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーカラム上での精製によって過剰のASGR−1から分離した。ASGR−1 CBD/5E5 Fab複合体を10mg/mlに濃縮し、0.1M Tris pH8.5、12%PEG 4000中で結晶化する。
ASGR−1 CBD/5E5 Fab複合体結晶についてのデータセットを、Berkeleyシンクロトロンのビームライン5.0.2において収集し、Mosflm1/Aimless2により処理した。
本実施例は、22G5のFab断片に結合し、2.1Å分解能(これらの条件は上記のBに記載している)まで決定した、ASGR−1 CBDの結晶構造を提示する。図23AおよびBに示したこの構造は、22G5がASGR−1と結合/相互作用する場合、炭水化物結合ループの立体構造再編成が起こり、炭水化物結合ループのリガンド(すなわち炭水化物)との結合/相互作用を損なうことを示す。これは、22G5 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を間接的に阻害することを実証する。
以下の変更を除いて、上記の実施例10Bに記載されているものと同じ方法に従った:
本実施例は、4A2のFab断片に結合し、2.15Å分解能(これらの条件はこの実施例の上記の段落Bに記載している)まで決定したASGR−1 CBDの結晶構造を提示する。図24、25および26に示したこの構造は、4A2がASGR−1と結合/相互作用する場合、炭水化物結合ループの立体構造再編成が起こり、炭水化物結合ループのリガンド(すなわち炭水化物)との結合/相互作用を損なうことを示す。これは、4A2 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を間接的に阻害することを実証する。
以下の変更を除いて、この実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
以下の変更を除いて、この実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
7E11 Fab断片を、カスパーゼ3により7E11 mAbを切断することによって生成した:
本実施例は、4H6のFab断片に結合したASGR−1 CBDの結晶構造を提示し、2.6Å分解能まで決定した(これらの条件はこの実施例の上記の段落Bに記載されている)。図29および30に示したこの構造は、4H6がASGR−1と結合/相互作用する場合、炭水化物結合ループの立体構造再編成が起こり、炭水化物結合ループのリガンド(すなわち炭水化物)との結合/相互作用を損なうことを示す。これは、4H6 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を間接的に阻害することを実証する。
以下の変更を除いて、この実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
1. 4H6 Fab断片を、カスパーゼ3により4H6 mAbを切断することによって生成した。
本実施例は、72G9のFab断片に結合したASGR−1 CBDの結晶構造を提示し、2.55Å分解能まで決定した(これらの条件はこの実施例の上記の段落Bに記載されている)。図31ならびに32Aおよび32Bに示したこの構造は、72G9がASGR−1と結合/相互作用する場合、Fab断片のCDR H2ループが、ASGR−1 CBDとのリガンド(すなわち炭水化物)結合/相互作用を直接遮断するように見える。これは、72G9 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を直接的に阻害することを実証する。
以下の変更を除いて、この実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
本実施例は、194A4のFab断片に結合したASGR−1 CBDの結晶構造を提示し、2.6Å分解能まで決定した(これらの条件はこの実施例の上記の段落Bに記載されている)。図33および34に示したこの構造は、194A4がASGR−1と結合/相互作用する場合、炭水化物結合ループの立体構造再編成が起こり、炭水化物結合ループのリガンド(すなわち炭水化物)との結合/相互作用を損なうことを示す。これは、194A4 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を間接的に阻害することを実証する。
以下の変更を除いて、この実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
本実施例は、54E9のFab断片に結合したASGR−1 CBDの結晶構造を提示し、2.6Å分解能まで決定した(これらの条件はこの実施例の上記の段落Bに記載されている)。図35ならびに図36Aおよび図36Bに示したこの構造は、54E9がASGR−1と結合/相互作用する場合、Fab断片のCDR H3ループが、ASGR−1 CBDとの結合/相互作用からリガンド(すなわち炭水化物)を直接的に遮断するように見える。これは、54E9 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を直接的に阻害することを実証する。
以下の変更を除いて、この実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
本実施例は、218G4のFab断片に結合したASGR−1 CBDの結晶構造を提示し、2.4Å分解能まで決定した(これらの条件はこの実施例の上記の段落Bに記載されている)。図37および38に示したこの構造は、218G4がASGR−1と結合/相互作用する場合、これがリガンド(例えば炭水化物)と結合するその能力を損なうことを示す。これは、218G4 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を直接的に阻害することを実証する。
以下の変更を除いて、この実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
本実施例は、176H5のFab断片に結合したASGR−1 CBDの結晶構造を提示し、2.3Å分解能まで決定した(これらの条件はこの実施例の上記の段落Bに記載されている)。図39および図40に示したこの構造は、176H4がASGR−1と結合/相互作用する場合、これがASGR−1 CBDによってリガンド(例えば炭水化物)結合を遮断するように見え、176H4抗体のパラトープは炭水化物結合ポケットの上部に直接位置する。これは、174H4 FabがASGR−1 CBD/リガンド結合を直接的に阻害することを実証する。
以下の変更を除いてこの実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
本実施例は、194C10のFab断片に結合したASGR−1 CBDの結晶構造を提示し、2.6Å分解能まで決定した(これらの条件はこの実施例の上記の段落Bに記載されている)。図41および図42に示したこの構造は、194C10がASGR−1と結合/相互作用する場合、これが炭水化物結合ループの立体構造再編成を誘導する可能性があり、それによりASGR−1 CBDのリガンド(例えば炭水化物)との結合を損ない、そして、194C10 Fabのパラトープを有するASGR−1 CBDによるリガンド(例えば炭水化物)結合を遮断する可能性が高い。これらのデータは、174H4 Fabが直接的および/または間接的にASGR−1 CBD/リガンド結合を阻害し得ることを示す。
以下の変更を除いて、この実施例の上記の部分Bに記載されているものと同じ方法に従った:
72G9/ASGR−1複合体の構造(上記の項目G)を、ASGR−1/リガンド(GalNac)構造(上記の項目A)上に重ねた。この組合せの結果を図31Bに示す。また、54E9/ASGR−1複合体の構造(上記の項目I)をも、ASGR−1/リガンド(GalNac)構造(上記の項目A)上に重ねた。この組合せの結果を図35Bに示す。218G4/ASGR−1複合体の構造(上記の項目J)を、ASGR−1/リガンド(GalNac)構造(上記の項目A)上に重ねた。この組合せの結果を図38に示す。176H4/ASGR−1複合体の構造(上記の項目K)を、ASGR−1/リガンド(GalNac)構造(上記の項目A)上に重ねた。この組合せの結果を図40に示す。これらの図は、リガンド、例えばGalNacとのASGR−1相互作用を阻害するように有益に標的化され得るASGR−1上の領域を実証する。これらの図は、72G9、54E9、218G4および176H4が、リガンド(例えばGalNAc)との結合に特異的に関与するアミノ酸残基のサブセットと直接相互作用することを示す。
ASGR−1特異的抗体の結合親和性の決定
ASGR−1に対する特異的抗体(ハイブリドーマ上清から精製したまたは組換えにより作製した)の結合親和性を定量するために、会合および解離速度を、ForteBio Octet機器を使用して測定することができる。抗体は、2nmに近接するレベルを負荷するためにAR2Gチップに共有結合しており、次いで典型的には、3点または6点希釈系列のいずれかにより30nMにて開始する3倍段階希釈系列において、可溶性ヒトASGR−1炭水化物結合ドメイン(CBD;アミノ酸残基154−281;N末端6xHisタグ)に結合した。実験的速度論の結果を、会合および解離速度定数ならびに平衡解離定数を決定するために、1:1結合モデルに全体的に適合した。会合および解離時間を、曲率が会合曲線の間に存在することを確実にするように選択し、開始レベルから少なくとも5%低下した解離レベルを測定した。全てのOctet緩衝液は、10mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、1mM CaCl2、0.10mg/ml BSAおよび0.13%Triton X−100を含有した。Octetアッセイを、27℃にて実施した。このアッセイは、ASGR−1 CBDとの結合を測定するだけであるので、CBDの外側で部分的もしくは完全にエピトープを認識するおよび/またはネイティブASGR複合体の構造においてASGR−1を認識する抗体は、例えば細胞膜上に生じ得るので、このアッセイにおいて陽性と記録することはできない。表11.1において、代表的な抗体について提供されたデータ。
CHO−S:huASGR−1細胞結合アッセイ
CHO−S安定高発現細胞株を、ヒトASGR−1およびマウスASGR−1の両方について開発した。典型的な384ウェルプレートマルチプレックスフローサイトメトリーベースの細胞結合法を、以下のように記載する:親CHO−S細胞およびCHO−S:huASGR−1細胞のそれぞれを、CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit(ThermoFisherカタログ番号C34554)およびCellTrace Violet Cell Proliferation Kit(ThermoFisherカタログ番号C34557)を使用して標識化した。CHO−S:muASGR−1については、標識化しなかった。4Cにて20ulの細胞を384ウェルプレートの2連のウェルに加えた。3つ全ての細胞株(30K細胞/ウェル)由来の細胞を、等しく混合した。次いで20ulのASGR−1抗体(ハイブリドーマ上清から精製したまたは組換えにより作製した)を、100nMにて開始する1:2倍段階希釈を使用して11点用量反応において加えた。細胞および抗体を4Cにて30分間インキュベートし、次いで沈降させ、1mM CaCl2を含有するFACS緩衝液により2回洗浄した。次いで30ulの抗huIgG−APC二次抗体を、4Cにて30分間、1:1000希釈)にて加え、次いで同じ緩衝液により1回洗浄した。60ulのPI(1:1000)を加え、次いで細胞をコアフローサイトメトリー機器により読み取った。細胞をまず生細胞についてゲートし、次いで単一細胞についてゲートし、最後に細胞染料についてゲートして、混合細胞を3つの異なる細胞集団に分けた。各抗体濃度にて各抗体の結合プロファイルを表すシグナル対計数のヒストグラムを、結合シグナルの中央値について自動的に解析し、次いで結合グラフを、Y軸上の2連のウェルからの中央値シグナルの標準偏差と共にX軸上のnMにおけるlog10抗体濃度により作製した。結合曲線を、標準的な4パラメーターS字状結合曲線に適合し、EC50を全てのグラフについて全曲線により報告した。表12.1において代表的な抗体について提供されたデータ。
CHO−S:huASGR−1リガンド遮断アッセイ
次いでヒトまたはマウスASGR−1安定CHO−S細胞のいずれかに結合した全てのASGR−1抗体を、タンパク質リガンドおよび合成糖リガンドの両方を使用してリガンド遮断について試験した。簡潔に述べるとこの方法は以下の通りである:第1に、20ulのCHO−ShumanまたはマウスASGR−1細胞のいずれかを384ウェルプレートのウェル(30k細胞/ウェル)に加え、続いて回転させ、上清を捨てた。第2に、10ulの抗体(ハイブリドーマ上清から精製したまたは組換えにより作製した)を希釈系列(200nMの最大濃度、1:2段階希釈、11点曲線)において細胞に2連で加え、4Cにて30分間インキュベートした。第3に、10ulの最小限のビオチン化リガンドを2倍のこれらの結合EC05にて加え、それによりウェルは、100nmにて開始したAbおよびこれらのEC50におけるリガンドと共に最終20ul体積を含有した。4Cにて30分のインキュベーション後、プレートを回転させ、FACS緩衝液+1mM CaCl2により2回洗浄し、続いて1:1000希釈にてストレプトアビジン−AF647を検出した。4Cにて30分後、細胞を回転させ、1回洗浄し、次いで60ulのPIを1:1000希釈にて加え、プレートをコアフローサイトメトリー機器に送達した。プレートを読み取り、シグナルがここで阻害曲線を表しかつ典型的に増加した抗体濃度の機能を減少させることを除いて、細胞結合法と同様にプレートを処理した。IC50nM効力および阻害%を報告した。脱シアル化、ビオチン化アシアロフェツイン(実施例9Aを参照)およびビオチン化GALNAc−PAA(Fisher#NC9024754)を、10.7および5.4nMの測定した結合EC50を有するリガンドとして使用した。これらの2つのリガンドを遮断する抗体の能力の差は、例えば、各リガンドのASGR結合末端糖残基の数および/もしくは配向の差から生じる親和性、抗体と各リガンドとの間の立体障害の差ならびに/または各リガンドの結合を選択的に変化させる抗体結合によって誘導されるASGRの立体構造の変化の結果として、起こり得る。表13.1において代表的な抗体について提供されたデータ。
ASGR−1特異的抗体最適化(化学的分解部位遺伝子操作):
側鎖分解の高いリスクを有する可変ドメイン配列モチーフをASGR−1特異的抗体から遺伝子操作した。例えば、表6および7におけるASGR−1特異的抗体配列を参照。
ペプチドアレイを使用したエピトープマッピング
カスタムペプチドマイクロアレイを、商業的に得た(PEPperPRINT GmbH)。線形アレイを使用したエピトープマッピングのために、抗原(ASGR−1)を二重に印刷した291個の異なる重複する15アミノ酸(aa)ペプチドに変換した(1つのアレイコピー当たり582個のペプチドスポット)。環化アレイを使用したエピトープマッピングのために、抗原(ASGR−1)を二重に印刷した888個の異なる重複する7aa、10aaおよび13aaペプチドに変換した(1つのアレイコピー当たり1,776個のペプチドスポット)。ペプチド環化を、立体構造制限を変化させるためにさらなる足場を有するおよび有さないN末端からC末端チオエーテル形成を使用して達成した。各々のPEPperCHIP(登録商標)ペプチドアレイをFlag(DYKDDDDKAS)およびHA(YPYDVPDYAG)対照ペプチドによって構成する。アッセイ緩衝液はPBS−T(PBS、pH7.4、0.05% Tween 20)であり、遮断緩衝液はRockland Blocking Buffer(Rockland Immunochemicals)であり、染色緩衝液はアッセイ緩衝液+10% Rockland Blocking bufferであった。二次抗体はヤギ抗ヒトIRDye680LT(Li−Cor)であった。対照抗体は、抗FLAG M2 DyLight800、抗HA DyLight680であった。アレイを、0.65mm、21um分解能のオフセットを用いてLi−Cor Odyssey上で走査した。
インビボ研究
ASGR−1および/もしくはASGR−2の発現を低減させるRNAi構築物ならびに/またはインビトロでASGR、ASGR−1および/もしくはASGR−2とのリガンド結合を阻害するモノクローナル抗体のような抗原結合性タンパク質を、関連動物モデルにインビボで投与することができ、アルカリホスファターゼのような内因性血中タンパク質のレベルおよび/または活性を測定した。さらに、体外から投与したASGRリガンド(例えばアシアロ糖タンパク質、特定の非シアル化されていない(non−asialylated)タンパク質、合成リガンドなど)のクリアランスは、RNAiによる前処理または同時もしくは前投与した抗体よって阻害され得る。
正常および肥満カニクイザルにおける血清LDLコレステロールおよびアルカリホスファターゼに対するASGR−1抗体4A2の効果
この研究の目的は、抗ASGR阻害剤のLDLコレステロール(LDL−C)低下活性を評価することであった。一般に、カニクイザルは、高レベルの総コレステロール、HDL−CまたはLDL−Cを有さない。したがって、正常および脂質異常症モデルの両方をこの実施例に利用した。脂質異常症モデルにおいて、サルを、これらのLDLレベルが少なくとも100mg/dL(正常は40−60mg/dLである)である場合およびボディマス指数が41kg/m2超(正常は35kg/m2未満である)である場合、選択した。標準的な食餌によりこれらの基準(criterea)を満たした動物を自然発生的な肥満脂質異常症(dylipidemic)と分類した。他の動物には、この研究に含める前に高脂肪食(HFD;4.15kcal/gm、32%脂肪)を供給し、HFD肥満脂質異常症と分類した。
種:カニクイザル(Macaca fascicularis)
体重範囲:>7.0kg
BMI範囲:>41kg/m2
年齢範囲:12−17歳
HFDの期間:6カ月
供給源:KBI monkey colony
数および性別:3匹のオスの自然発生的な肥満サルおよび3匹のオスのHFD誘導肥満サル(BMI>41、LDL>80mg/dL))。動物は類似したベースラインLDLおよびALPレベルに基づいてより大きなプールから選択した
正常モデル:
種:カニクイザル
体重範囲:2.6−4.2kg
年齢範囲:2.5−4歳
数および性別:通常の実験食を供給した2匹のオスおよび1匹のメス
この研究についてのデータを図44(脂質異常症モデル)および図45(正常モデル)に提供する。
ヒトASGR1保因者および対照由来の血清試料のプロテオームプロファイリング
導入
上記の実施例1に記載されているように、ASGR1機能喪失(LOF)が、ヒトにおいて有益な表現型(冠動脈疾患からの保護、より低いLDLコレステロールおよびより長い生存期間)と関連することが見出された1。この関連性の基本的な作用機構を理解し、潜在的なバイオマーカーを見出すために、ヒト血清試料のプロテオソーム測定を実施し、ASGR1 LOFバリアント保因者と対照との間の循環タンパク質レベルの変化と比較した。
試料採取およびプロテオソームプロファイリング
合計で333個のヒト血清試料を、100人のASGR1 del12ヘテロ接合体保因者(症例群)および233人の非保因者(対照群)を含む、deCODEアイスランド人集団研究から取得した。症例/対照群は、性別、年齢および採取時間/フリーザー保存時間により十分にマッチングした。150ulの血清試料を、SomaLogic Incに輸送し、そこで1310個のタンパク質をSOMAscan Assay 1.3kによって測定した。1310個のタンパク質は、ヒトタンパク質に対して生成されたSOMAmer(登録商標)試薬であり、試験タンパク質の完全なリストはSOMAscan Assay 1.3K Content、Rev1(発効:9/21/2015)にまとめられている。これはその全体を参照により本明細書に組み込む。
2個の試料を少量によりSomascan要件を満たさなかったため除去し、13個の試料をEDTAにより処理されたために除去した。各々の測定タンパク質のRFUデータを対数変換し、次いでセンタリングし、スケーリングして、このタンパク質についての標準化したRFU値を算出した。主要構成要素(PC)は、主要構成要素解析による1310の標準化したRFU値から導出した。PC1およびPC2のHotellings T2分布に基づいた異常値除去を適用し、別の8個の試料をさらなる解析から除外した。
式中、Yiは特定のタンパク質についてのi番目の試料の標準化したRFU値であり、Giはi番目の試料のDel12遺伝子型であり、β1はDel12を有するおよびDel12を有さないヒト試料間の平均差の推定値を捕捉する。1310の試験をSomascanプラットフォーム上のタンパク質について実施したので、本発明者らは、独立した試験が存在すると仮定して、Bonferroni法(0.05/1310=3.82×10−5)によって有意な閾値を算出した。しかしながら、Bonferroni補正は非常にストリンジェントである可能性がある。なぜならタンパク質は多くの場合互いに相関するので、これらの試験は独立していないからである。したがって有意性の現実的な閾値(5.19×10−5)を、ShamおよびPurcell 20143による方法を使用して、100,000回の並べ替えを実施することによって得た。
並べ替え閾値を使用して、41個のタンパク質を、ヒトASGR1 del12保因者と非保因者との間で有意な血清レベルを有すると同定した(P<5.19×10−5)。これらのうちで、26個は保因者において有意な増加を示し(表18.1)、15個は保因者において有意に減少する(表18.2)。これらの変化はdel12保因者に見られるASGR1機能喪失を生じる有益な効果を伝えている可能性がある。血液中のこれらのタンパク質のレベルはASGR1機能喪失についてのバイオマーカーとして役立つことができ、薬物開発の間のASGR1標的化療法を評価するために使用することができる。
ASGR1カニクイザルPK−PD研究からの血清試料のプロテオソームプロファイリング
上記の実施例1に記載されているように、ASGR1機能喪失(LOF)が、ヒトにおいて有益な表現型(冠動脈疾患からの保護、より低いLDLコレステロールおよびより長い生存期間)と関連することが見出された1。本明細書に開示される特定のASGR−1抗原結合性タンパク質は、LOF効果を模倣することが見出されており、かつ冠動脈疾患の治療に有用であり得る。簡潔に述べると、カニクイザルを、これらの抗体のPK−PDプロファイルを研究するために、特定のASGR−1特異的、リガンド遮断抗体により処理した。さらに、アルカリホスファターゼ(ALP)レベルの用量依存的上昇を、Ab処理したカニクイザルにおいて観察した。これはヒトASGR1 LOF保因者に見られるALP上昇と似ている。ALPに加えて、ヒト血清中のプロテオソームプロファイリングにより、上記の実施例18に記載されているようにASGR1 LOFによって引き起こされる有益な効果の基礎となる可能性がある41個のタンパク質を同定した。ヒトASGR1 LOFによる抗ASGR1抗体処理の効果を比較し、カニクイザルにおける同等な特徴を同定するために、この研究からの血清試料のプロテオソーム測定を行った。抗体処理した動物における変化したレベルを有するタンパク質のリストを、ヒトLOF保因者において同定したものと比較する。
試料選択およびプロテオソームプロファイリング
各群において3匹の動物を含む6つの動物群をプロテオソームプロファイリングのために選択した。6つの群は5つの抗体処理した群(mAb1/25A4、mAb2/4A2、mAb3/7E11、mAb4/5E5およびmAb8/4H6)およびビヒクル対照群(mAb6)を含む。100mg/kgにて、動物に1回投与した。0、168、336、504、672および1176時間の時点での血清試料を、各動物について採取した(表19.1および19.2)。唯一の例外は群mAb8/4H6であり、これについては1008時間の時点を1176時間の代わりに使用した。120ulの血清試料をSomaLogic Incに輸送し、そこで1310個のタンパク質(表18.0を参照)を、SOMAscan Assay 1.3kによって測定した。
SOMAscanアッセイはヒトのために開発されたので、カニクイザルにおけるいくつかのタンパク質は、SOMAmer試薬によって認識することはできない。結果として、これらのタンパク質のSOMAscan測定は低い信頼性を有し、真のタンパク質レベルを反映することはできない。所与のタンパク質の血清レベルがヒトおよびカニクイザルにおいて比較的近い範囲にあると仮定して、簡単な基準を測定の信頼性を決定するために定義した。ヒトにおける各タンパク質レベルの平均および範囲を、実施例18に記載されているヒトプロテオソーム研究からの217個のヒト対照試料に基づいて算出する。カニクイザルにおける各タンパク質レベルの平均および範囲は、SEFL−2対照群についての全ての時点の測定ならびに全ての他の群の処理前(D0)および洗浄期間(D50)測定を含む、合計で48個の試料に基づいて算出する。タンパク質測定は、(1)カニクイザルにおけるその範囲がヒトと重複しない場合ならびに(2)ヒトおよびカニクイザルにおけるこのタンパク質の平均レベルの間で5倍の差がある場合、低い信頼性を割り当てられる。合計で162個のタンパク質をこれらの基準によって低い信頼性と決定し、排除した(カニクイザルにおけるタンパク質測定の信頼性の概要を示す図58)。図58において、2つの種における平均タンパク質レベルのlog10 RFUをプロットし、低い信頼性(明るい陰影)および高い信頼性(黒)を有するものに印をつけている。
33個のタンパク質が、ASGR1抗体処置後、有意な血清レベル変化を有すると同定された(表19.3;P<5×10−5)。興味深いことに33個のタンパク質全てが、ASGR1抗体処置後、増加したレベルを示す(1.36−10.18倍)。
心疾患のリスクを低減させる方法
心疾患のリスクのある対象を同定する。本明細書に提供される1つ以上の抗体(実施例7ならびに表A、BおよびCを参照)ならびに/またはASGR−1および/もしくはASGR−2の発現を低減させるRNAi構築物(実施例3において概説されている)を、心疾患のリスクのある対象に投与する。抗体および/またはRNAi構築物はASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の発現のレベルを低減させる。後のラウンドの抗体および/またはRNAiを、対象に投与する。実施例19におけるマーカーの1つ以上(例えば、段階1)をモニタリングして、適切な量の抗体および/またはRNAi構築物を投与し、所望のように機能することを確かめる。対象が心血管疾患を経験するリスクは、減少する。
心筋梗塞または冠動脈疾患のリスクを低減させる方法
心筋梗塞または冠動脈疾患のリスクのある対象を同定する。本明細書に提供される1つ以上の抗体(実施例7ならびに表A、BおよびCを参照)ならびに/またはASGR−1および/もしくはASGR−2の発現を低減させるRNAi構築物(実施例3において概説されている)を、心筋梗塞または冠動脈疾患のリスクのある対象に投与する。抗体および/またはRNAi構築物は、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の発現のレベルを低減させる。後のラウンドの抗体および/またはRNAiを対象に投与する。実施例19におけるマーカーの1つ以上(例えば、段階1)をモニタリングして、適切な量の抗体および/またはRNAi構築物が投与され、所望のように機能することを確かめる。対象が心筋梗塞または冠動脈疾患を経験するリスクは減少する。
LDLコレステロールを低減させる方法
LDLコレステロールレベルが低下する対象を同定する。本明細書に提供される1つ以上の抗体(実施例7ならびに表A、BおよびCを参照)ならびに/またはASGR−1および/もしくはASGR−2の発現を低減させるRNAi構築物(実施例3において概説されている)を、対象に投与する。抗体および/またはRNAi構築物は、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の発現のレベルを低減させる。抗体および/またはRNAiの後のラウンドを、対象に投与する。実施例19におけるマーカーの1つ以上(例えば、段階1)をモニタリングして、適切な量の抗体および/またはRNAi構築物が投与され、所望のように機能することを確かめる。これにより対象におけるLDLコレステロールのレベルは低減する。
非HDLコレステロールを低減させる方法
非HDLコレステロールレベルが低下する対象を同定する。本明細書に提供される1つ以上の抗体(実施例7ならびに表A、BおよびCを参照)ならびに/またはASGR−1および/もしくはASGR−2の発現を低減させるRNAi構築物(実施例3において概説されている)を、対象に投与する。抗体および/またはRNAi構築物はASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の発現のレベルを低減させる。後のラウンドの抗体および/またはRNAiを対象に投与する。実施例19におけるマーカーの1つ以上(例えば、段階1)をモニタリングして、適切な量の抗体および/またはRNAi構築物を投与し、所望のように機能することを確かめる。これにより対象における非HDLコレステロールのレベルは低減する。
ALPレベルを増加させる方法
本明細書に提供される1つ以上の抗体(実施例7ならびに表A、BおよびCを参照)ならびに/またはASGR−1および/もしくはASGR−2の発現を低減させるRNAi構築物(実施例3において概説されている)を、対象に投与する。抗体および/またはRNAi構築物は、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の発現のレベルを低減させる。後のラウンドの抗体および/またはRNAiを、対象に投与する。実施例19におけるマーカーの1つ以上(例えば、段階1)をモニタリングして、適切な量の抗体および/またはRNAi構築物を投与し、所望のように機能することを確かめる。これにより対象におけるALPのレベルは、増加する。
ASGR−1療法の有効性をモニタリングする方法
本明細書に提供される1つ以上の抗体(実施例7ならびに表A、BおよびCを参照)ならびに/またはASGR−1および/もしくはASGR−2の発現を低減させるRNAi構築物(実施例3において概説されている)を、対象に投与する。実施例19におけるマーカーの1つ以上をモニタリングして、適切な量の抗体および/またはRNAi構築物を投与し、所望のように機能することを確かめる。マーカーレベルが実施例19に示されたこれらの変化(例えば段階1)と同様に変化する場合、1つ以上の抗体および/またはRNAiの量が、有効であると証明される。さらに、さらなる選択肢として、この生化学的変化の有効性を、抗体および/またはRNAiからのその生理的効果によって観察でき、この生理的効果は、血圧、一次および二次止血、心機能および形態、内皮機能、LDLコレステロールレベル、非HDLコレステロールレベル、炎症および/またはアテローム性動脈硬化症を含む、読み出しを使用して評価することができる。
Claims (43)
- SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むヒトASGR−1に結合する、単離された抗原結合性タンパク質であって、リガンドへのASGR−1結合を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質。
- ヒトASGR−1の炭水化物認識ドメインに結合する、請求項1に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- ASGRの内部移行を阻害する、請求項1または2に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- ASGR−2にさらに結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- モノクローナル抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- ヒトASGR−2に結合する、単離された抗原結合性タンパク質であって、リガンドへのASGR−2結合を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質。
- ASGRの内部移行を阻害する、請求項6に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- モノクローナル抗体である、請求項6または7のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- ヒトASGRに結合し、リガンドへのヒトASGR結合を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質。
- ASGRの内部移行を阻害する、請求項9に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- モノクローナル抗体である、請求項9または10のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- ヒトASGR−1およびヒトASGR−2に結合し、リガンドへのヒトASGR−1および/またはヒトASGR−2結合を阻害する、単離された抗原結合性タンパク質。
- ヒトASGR−1またはヒトASGR−2の内部移行を阻害する、請求項12に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- モノクローナル抗体である、請求項13または12のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
- ヒトASGR−1に特異的に結合し、表3−7に記されている配列の任意の抗体VHと同一のアミノ酸配列またはこれと比べて各CDRに1、2もしくは3個のアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体。
- 表3−7に記されている配列の任意の抗体VLと同一のアミノ酸配列またはこれと比べて各CDRに1、2もしくは3個のアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3をさらに含む、請求項15に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- VH CDRおよびVL CDRが、表2に記されている対応するVH CDRとVL CDRとの対である、請求項16に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- ヒトASGR−1に特異的に結合し、表3−7に記されているVHドメインアミノ酸配列のいずれかに対し少なくとも90%同一性を有する重鎖可変ドメインを含む、単離されたモノクローナル抗体。
- 表3−7に記されているVLドメインアミノ酸配列のいずれかに対し少なくとも90%同一性を有する軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項18に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- 軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインが、表3−7に記されている対応するVLとVHとの対である、請求項19に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- 結合に関して、請求項1から20のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体と競合する、単離されたモノクローナル抗体。
- SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むヒトASGR−1に結合する、単離された中和モノクローナル抗体であって、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1個を含むエピトープにおいてヒトASGR−1に結合する、単離された中和モノクローナル抗体:D216、Q217、N218、G219、P220、W221、Y229、E230、K234、W236、E239、Q240、P241、D242、D243、W244、Y245、G246、L249、G250、G251、G252、D254、Q270、W195、N209、R237、P238、H257、T259、D260、D261、R263、N265、D267、R271、Y273、H161、E162、E196、Q198、K199、F200、Q202、H203、H204、G232、F233、N235、G262、W167、S171、G172、K173、A174、A176、D177、N180、Y181、R183、L184、E185、D186、P272、W275、R170、I205、G206、P207、V208、R274、S194、T193、T231、G226、T227またはD228(SEQ ID NO:5)。
- SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むヒトASGR−1に結合する、単離された中和モノクローナル抗体であって、次のアミノ酸残基のうち少なくとも1個を含むエピトープにおいてヒトASGR−1に結合する、単離された中和モノクローナル抗体:Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、N209、H257、T259またはY273(SEQ ID NO:5)。
- SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むヒトASGR−1に結合するが、バリアントヒトASGR−1に結合しない、単離された中和モノクローナル抗体であって、バリアントヒトASGR−1が、SEQ ID NO:5に示すR170、S171、G172、R183、L184、W195、E196、K199、H203、H204、P207、V208、N209、H215、D216、P220、D225、D228、R237、P238、E239、P241、D242、D243、Y245、G246、H247、G248、L249、G251、E253、T259、D260、R263、N265、Q270、R271、P272、R274およびE280からなる群から選択される残基の単一突然変異を含む、単離された中和モノクローナル抗体。
- 単一突然変異が、SEQ ID NO:5に示すW195、E196、K199、H203、H204、P207、P220、G251およびR263からなる群から選択される、請求項24に記載の単離された中和モノクローナル抗体。
- キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項1から25のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質または抗体。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質または抗体、および医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質または抗体をコードする、単離された核酸。
- 請求項28に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項29に記載のベクターまたは請求項28に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 抗原結合性タンパク質または抗体を産生するための方法であって、好適な条件下で請求項30に記載の宿主細胞を培養するステップおよび抗原結合性タンパク質または抗体を回収するステップを含む方法。
- 心血管疾患を処置または予防する方法であって、心血管疾患の処置または予防を必要とする患者に、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の阻害剤の治療有効用量を投与するステップを含む方法。
- 心血管疾患が、冠動脈疾患または心筋梗塞である、請求項32に記載の方法。
- 患者におけるLDLコレステロールレベルを低下させる方法であって、LDLコレステロールレベルの低下を必要とする患者に、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の阻害剤の治療有効用量を投与するステップを含む方法。
- 患者における非HDLコレステロールレベルを低下させる方法であって、非HDLコレステロールレベルの低下を必要とする患者に、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の阻害剤の治療有効用量を投与するステップを含む方法。
- 患者におけるALPレベルを増加させる方法であって、ALPレベルの増加を必要とする患者に、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の阻害剤の治療有効用量を投与するステップを含む方法。
- 患者におけるASGR−1をアンタゴナイズする方法であって、ASGR−1のアンタゴナイズを必要とする患者に、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の阻害剤の治療有効用量を投与するステップを含む方法。
- 患者におけるASGR−2をアンタゴナイズする方法であって、ASGR−2のアンタゴナイズを必要とする患者に、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の阻害剤の治療有効用量を投与するステップを含む方法。
- 阻害剤が、ASGR、ASGR−1および/またはASGR−2の発現を低下させる干渉RNA(例えば、siRNAまたはshRNA)である、請求項32から38のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害剤が、ヒトASGR、ASGR−1および/またはASGR−2に結合する単離された中和抗原結合性タンパク質である、請求項32から38のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害剤が、コレステロールを低減させる少なくとも1種の薬剤と同時にまたは逐次に投与される、請求項40に記載の方法。
- 少なくとも1種の薬剤が、スタチン、抗PCSK9阻害剤またはそれらの組合せである、請求項41に記載の方法。
- 少なくとも1種の薬剤が、エボロクマブ、アリロクマブ、ボコシズマブ、ALN−PCS、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンおよびそれらの何らかの組合せからなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
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