CN117177995A - 抗vista抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了针对T细胞活化V结构域含Ig抑制因子(VISTA)的抗体以及包含此类抗体的组合物。还提供了使用与VISTA特异性结合的抗体来治疗疾病例如治疗癌症的方法。

Description

抗VISTA抗体及其用途
相关申请
本申请要求2021年2月18日提交的美国临时申请号63/150,995的优先权。上述申请的全部内容通过引用明确并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且据此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2022年2月1日，被命名为136589-00120_SL.txt，并且大小为784,935字节。
技术领域
本公开提供了针对T细胞活化V结构域含Ig抑制因子(V-domain Ig-containingSuppressor of T cell Activation；VISTA)的抗体以及包含此类抗体的组合物。还提供了使用与VISTA特异性结合的抗体来治疗疾病(例如治疗癌症、自身免疫性疾病和感染，例如细菌和真菌感染)的方法。
背景技术
VISTA是B7家族的一种免疫抑制性细胞表面蛋白，与程序性死亡配体1(PD-L1)呈现出相似性。VISTA既作为抗原呈递细胞的配体又作为T细胞的受体起作用(等人,Oncoimmunology.2017；6(4):e1293215(2017))。VISTA主要在造血组织(例如，脾脏、胸腺和骨髓)以及在骨髓细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞和调节性T细胞(Treg)上表达(Wang等人,J.Exp.Med.第208卷,第3期,577-592)。
特别地，VISTA在其介导免疫抑制的肿瘤微环境中在骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)和Treg上高度表达。特别地，VISTA通过抑制T细胞受体活化来抑制T细胞应答，导致细胞周期停滞，但不会导致细胞凋亡(Wang等人,J.Exp.Med.第208卷,第3期,577-592)。VISTA在“冷肿瘤”(未被T细胞浸润的肿瘤)中高度表达，并且高VISTA表达与癌症患者(例如，胰腺癌)的生存率低相关(Blando等人,2019,Proc Nat Acad Sci.116(5):1692-97)。VISTA表达已被证明在用检查点抑制剂疗法治疗后会在前列腺癌和黑素瘤中增加，表明存在潜在的耐药机制(Kakavand等人,2017,Modern Pathology 30:1666-1676；Gao等人,2017年5月,NatMed.；23(5):551-555)。
对于抗体工程化，不同的同种型和亚类对于抗体优化和功能是很重要的，因为序列变异发生在决定新生儿Fc受体(FcRn)、Fcα受体、Fcγ受体和补体蛋白C1q的亲和力和特异性的位点(Woof,J.M.和Burton,D.R.Nat.Rev.Immunol.4(2004)89-99)。有5种Fcγ受体(FcγR)在与IgG结合时活化效应细胞。在活化受体中，有FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb(Nimmerjahn,F.和Revetch,J.V.Nat.Rev.Immunol.8(2008)34-47)。有一种抑制性Fcγ受体FcγRIIb。FcγR是多态性的，其中某些等位基因比其他等位基因对Fc表现出更高的亲和力。与这些受体结合的抗体可以促进效应细胞募集到受调理的靶细胞或受调理的病原体以进行清除(Nimmerjahn,F.和Revetch,J.V.Nat.Rev.Immunol.8(2008)34-47)。因此，抗体的Fc和铰链区的序列变化和翻译后修饰允许人们操纵给定抗体或抗体样蛋白的效应子功能和循环(Presta,L.G.Curr.Opin.Immunol.20(2008)460-470)。除了序列变异之外，Fc区还在残基297处含有N连接的糖基化位点，所述残基对于Fc结构和功能是很重要的(Dwek,R.R.等人,J.Anat.187(1995)279-292)。已经描述了与Fcγ受体的结合减少并且Fcγ受体介导的活性降低的突变Fc区(美国专利号10,053,513B2)。
抗体消除主要通过胞饮作用或受体介导的内吞作用过程摄取后溶酶体降解为氨基酸的胞内分解代谢发生(Waldmann,T.A.和Strober,W.Prog.Allergy13(1969)1-110)。
抗体的受体介导的内吞作用由细胞表面受体与抗体的Fc结构域或Fab结合结构域中的一个相互作用产生。这种结合事件会触发抗体内吞内化到囊泡中，随后发生溶酶体降解。当结合发生在抗体Fab与其抗原之间时，产生的内吞作用和消除被称为靶介导的药物处置(TMDD)(Mager,D.E.和Jusko,W.J.J.Pharmacokinet.Pharmacodyn.28(2001)507-5320)。
通过TMDD消除抗体的速率取决于抗原受体靶标的表达、mAb对抗原的亲和力、mAb的剂量、受体-抗体复合物内化和再循环的速率以及靶细胞内分解代谢的速率。主要通过TMDD清除的抗体将具有剂量依赖性非线性消除。对于具有浆膜表达的靶标如VISTA的抗体，TMDD是主要的消除途径，特别是在低剂量和浓度的治疗性抗体下(Ryman,J.T.和Meibohm,B.CPT Pharmacometrics Syst.Pharmacol.6(2017)576-588)。
浆膜上的抗体-受体复合物内化到与内体区室融合的囊泡中。复合物可以在溶酶体中降解或完整地再循环到细胞表面和细胞外介质。有证据表明，这种分选决定的结果与抗体-受体结合亲和力有关，其中保持结合的复合物通常被降解，而解离的复合物被再循环(Chimalakonda,A.P.等人,AAPS J.15(2013)717-727)。一般来讲，内体中复合物的解离会增强抗体再循环。内体和溶酶体中抗体-受体复合物的解离可以通过pH敏感性相互作用来调节。
对于大多数研究的pH敏感性相互作用，pH依赖性结合依赖于可电离组氨酸(“组氨酸开关”)的存在，它们介导相互作用蛋白的结合或折叠中的结构转变(Kulkarni,M.V.等人,J.Biol.Chem.285(2010)38524-38533；Maeda,K.等人,J.Control.Release 82(2002)71-82；Yamamoto,T.等人,Biochemistry 47(2008)11647-11652)。在较低pH值下组氨酸质子化时诱导的静电相互作用的改变可能导致结合亲和力降低，并且将pH敏感性结合到蛋白质中的蛋白质工程化方法通常使用组氨酸取代策略。
以下是成功工程化治疗性蛋白质中的组氨酸开关以降低代谢和改善半衰期的实例。
Igawa T.等人Nat.Biotechnol.28(2010)1203-1207描述了一种针对IL-6受体(IL-6R)的工程化抗体，该抗体在内体的酸性环境(pH6.0)内快速与IL-6R解离，同时在血浆(pH7.4)中保持其对IL-6R的结合亲和力。
WO2011/111007公开了具有pH依赖性抗原结合的抗体，这些抗体优选地在内体中与抗原解离。
Rother等人Nat.Biotechnol.25(2007)1256-1264描述了补体抑制剂依库丽单抗的发现和开发，该抗体具有介导内体逃逸的组氨酸开关，用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿症。
WO2015/134894A1描述了与C5结合的抗体，这些抗体被工程化以在内体pH下快速与其靶标解离，从而增加其半衰期。
US 9,540,449 B2描述了具有改善的血清半衰期的PCSK9抗体，这些抗体在中性pH下与细胞表面受体结合，但在酸性pH下容易与靶标解离。
Fallon等人J.Biol.Chem.275(1999)6790-6797描述了白介素2的突变体，这些突变体由于增强的配体再循环而显示出降低的内吞降解。突变体IL-2与其受体的结合亲和力在中性pH下比在酸性pH下更高，从而允许配体受体复合物的内体分选和再循环。
Sarkar,C.S.等人,Nat.Biotech.20(2002)908-913描述了使用“组氨酸开关”来改善粒细胞集落刺激因子的细胞运输。
已经描述了抗VISTA抗体(参见例如美国专利号8,231,872、8,236,304、8,501,915和10,766,959，以及美国专利申请公开号US2020/0407449 A1，以及国际专利申请公开号WO2016/207717 A8、WO 2014/197849 A9、WO 2018/169993A1、WO 2018/237287 A1、WO2019/152810A1、WO 2019/185879A1和WO 2020/016459 A1)。然而，尽管有上述所有情况，本领域仍然需要有效的治疗性抗体。
本公开中对参考文献的引用不应被解释为承认这样的参考文献是现有技术。
发明内容
在本公开之前已知的抗VISTA抗体表现出许多缺点，包括未能解决多个配体与VISTA受体结合这一事实、表达VISTA的免疫细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和毒性细胞因子释放的潜力、抗药物抗体或免疫原性、VISTA上具有不同功效和毒性的多个结合表位以及未优化的Fc结合。本申请的发明人利用这些缺点的知识来设计新的抗VISTA抗体及其抗原结合片段，从而克服了这些问题。下面更详细地描述这些方面中的每一个。
首先，大多数已知的抗VISTA抗体与VISTA细胞外结构域上的两个显性表位中的一个结合。第一表位R54/F62/Q63与抗肿瘤功效相关，但也与显著的细胞因子释放和炎症相关，从而给治疗性治疗带来严重的安全问题。第二表位H121/H122/H123转化pH敏感性结合和增加的PK，但消除大部分抗肿瘤活性。本申请的发明人已经鉴定了本文所公开的抗VISTA抗体及其抗原结合片段，它们与第三专有表位结合，并且在肿瘤模型中表现出改进的安全性和优异的单药剂功效(参见本文的实施例)。
其次，先前已知的抗VISTA抗体已被证明在pH 6.0或pH 7.4下仅阻断已知VISTA配体中的一种、两种或(至多)三种。相比之下，本文所述的抗VISTA抗体和抗原结合片段能够在6.0至7.4的pH范围内阻断所有五种已知配体与VISTA的结合，从而提供增加的功效。
另外，本文所述的抗VISTA抗体及其抗原结合片段已被Fc优化以提供减少的Fcγ受体结合，并且因此提供减少的ADCC、CDC(补体依赖性细胞毒性)和促炎细胞因子释放，从而为治疗性施用提供增加的安全性。本文所述的若干抗VISTA抗体已被进一步Fc优化以增加FcRn结合，并且因此增加抗体再循环和延长暴露。最后，本文所述的抗VISTA抗体和抗原结合片段是使用遗传工程化人源化小鼠模型开发的，从而赋予与在人中免疫原性降低相关的进一步优势。因此，本文所述的抗VISTA抗体及其抗原结合片段相对于本公开之前已知的抗VISTA抗体及其用途表现出惊人和改进的特性。
因此，在一个方面，本文公开了一种人抗VISTA抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段(i)在pH 6.0和/或pH 7.4下阻断所有五种已知配体与VISTA(VSIG-3(V-set和含免疫球蛋白结构域3(V-set and immunoglobulin domain containing 3))、VSIG-8(V-set和含免疫球蛋白结构域8(V-set and immunoglobulin domain containing 8))、PSGL-1(P选择素糖蛋白配体-1)、LRIG1(富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域1(leucine rich repeats and immunoglobulin like domains 1))和VISTA)的结合；和/或(ii)与包括VISTA-ECD(细胞外结构域)的氨基酸酪氨酸37、精氨酸54、缬氨酸117和精氨酸127的独特表位结合。
在一个方面，本文公开了一种与T细胞活化V结构域含Ig抑制因子(VISTA)结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在pH 6.0和pH 7.4下阻断所有五种配体与VISTA的结合，其中所述五种已知的VISTA配体是VSIG-3(V-set和含免疫球蛋白结构域3)、VSIG-8(V-set和含免疫球蛋白结构域8)、PSGL-1(P选择素糖蛋白配体-1)、LRIG1(富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域1)和VISTA；并且其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在另一方面，本文公开了一种与T细胞活化V结构域含Ig抑制因子(VISTA)结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个或者由SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个组成，并且其中所述VL包含与SEQ ID NO:84-110中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84-110中的任一个或者由SEQ ID NO:84-110中的任一个组成。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段在pH 6.0和pH 7.4下阻断所有五种配体与VISTA的结合，其中所述五种已知的VISTA配体是VSIG-3(V-set和含免疫球蛋白结构域3)、VSIG-8(V-set和含免疫球蛋白结构域8)、PSGL-1(P选择素糖蛋白配体-1)、LRIG1(富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域1)和VISTA。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：以下的VH CDR1：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:247-253中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:284-291中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:318-325中的任一个；以下的VH CDR2：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:254-265中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:292-298中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:326-339中的任一个；以下的VH CDR3：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:266-283中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:299-317中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:340-359中的任一个；以下的VL CDR1：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:111-122中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:152-162中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:188-196或576-578中的任一个；以下的VL CDR2：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:123-131和575中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:163-167中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ IDNO:197-206中的任一个；以下的VL CDR3：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:132-151中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:168-186中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:207-226中的任一个。
在一个方面，本文公开了一种与VISTA结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH包含：以下的VH CDR1：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:247-253中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:284-291中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:318-325中的任一个；以下的VH CDR2：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:254-265中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ IDNO:292-298中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:326-339中的任一个；以下的VH CDR3：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:266-283中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:299-317中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:340-359中的任一个，并且其中VL包含：以下的VL CDR1：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:111-122中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:152-162中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:188-196或576-578中的任一个；以下的VL CDR2：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:123-131和575中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:163-167中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ IDNO:197-206中的任一个；以及以下的VL CDR3：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:132-151中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:168-186中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ ID NO:207-226中的任一个。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段在pH 6.0和pH 7.4下阻断所有五种配体与VISTA的结合，其中所述五种已知的VISTA配体是VSIG-3(V-set和含免疫球蛋白结构域3)、VSIG-8(V-set和含免疫球蛋白结构域8)、PSGL-1(P选择素糖蛋白配体-1)、LRIG1(富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域1)和VISTA。
在一个实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个或者由SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个组成，并且VL包含与SEQ ID NO:84-110中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84-110中的任一个或者由SEQ ID NO:84-110中的任一个组成。
在另一个实施方案中，VH CDR1包含SEQ ID NO:247，VH CDR2包含SEQ ID NO:254，VH CDR3包含SEQ ID NO:266，VL CDR1包含SEQ ID NO:111，VL CDR2包含SEQ ID NO:123，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:132；VH CDR1包含SEQ ID NO:284，VH CDR2包含SEQ ID NO:292，VH CDR3包含SEQ ID NO:299，VL CDR1包含SEQ ID NO:152，VL CDR2包含SEQ ID NO:163，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:168；VH CDR1包含SEQ ID NO:318，VH CDR2包含SEQ ID NO:326，VH CDR3包含SEQ ID NO:340，VL CDR1包含SEQ ID NO:188，VL CDR2包含SEQ ID NO:197，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:207；VH CDR1包含SEQ ID NO:248，VH CDR2包含SEQ ID NO:255，VH CDR3包含SEQ ID NO:267，VL CDR1包含SEQ ID NO:112，VL CDR2包含SEQ ID NO:124，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:133；VH CDR1包含SEQ ID NO:285，VH CDR2包含SEQ ID NO:293，VH CDR3包含SEQ ID NO:300，并且VL CDR1包含SEQ ID NO:153，VL CDR2包含SEQ ID NO:164，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:169；VH CDR1包含SEQ ID NO:319，VH CDR2包含SEQ IDNO:327，VH CDR3包含SEQ ID NO:341，并且VL CDR1包含SEQ ID NO:189，VL CDR2包含SEQID NO:198，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:208；VH CDR1包含SEQ ID NO:249，VH CDR2包含SEQ ID NO:256，VH CDR3包含SEQ ID NO:268，VL CDR1包含SEQ ID NO:113，VL CDR2包含SEQ ID NO:125，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:134；VH CDR1包含SEQ ID NO:286，VH CDR2包含SEQ ID NO:294，VH CDR3包含SEQ ID NO:301，VL CDR1包含SEQ ID NO:154，VL CDR2包含SEQ ID NO:165，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:170；VH CDR1包含SEQ ID NO:320，VH CDR2包含SEQ ID NO:328，VH CDR3包含SEQ ID NO:342，VL CDR1包含SEQ ID NO:190，VL CDR2包含SEQ ID NO:199，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:209；VH CDR1包含SEQ ID NO:250，VH CDR2包含SEQ ID NO:257，VH CDR3包含SEQ ID NO:269，VL CDR1包含SEQ ID NO:114，VL CDR2包含SEQ ID NO:126，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:135；VH CDR1包含SEQ ID NO:287，VH CDR2包含SEQ ID NO:295，VH CDR3包含SEQ ID NO:302，VL CDR1包含SEQ ID NO:155，VL CDR2包含SEQ ID NO:165，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:171；VH CDR1包含SEQ ID NO:321，VH CDR2包含SEQ ID NO:329，VH CDR3包含SEQ ID NO:343，VL CDR1包含SEQ ID NO:191，VL CDR2包含SEQ ID NO:200，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:210；VH CDR1包含SEQ ID NO:251，VH CDR2包含SEQ ID NO:258，VH CDR3包含SEQ ID NO:270，VL CDR1包含SEQ ID NO:115，VL CDR2包含SEQ ID NO:127，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:136；VH CDR1包含SEQ ID NO:288，VH CDR2包含SEQ ID NO:295，VH CDR3包含SEQ ID NO:303，VL CDR1包含SEQ ID NO:156，VL CDR2包含SEQ ID NO:166，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:172；VH CDR1包含SEQ ID NO:322，VH CDR2包含SEQ ID NO:330，VH CDR3包含SEQ ID NO:344，VL CDR1包含SEQ ID NO:192，VL CDR2包含SEQ ID NO:201，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:211；VH CDR1包含SEQ ID NO:248，VH CDR2包含SEQ ID NO:259，VH CDR3包含SEQ ID NO:271，VL CDR1包含SEQ ID NO:116，VL CDR2包含SEQ ID NO:126，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:137；VH CDR1包含SEQ ID NO:285，VH CDR2包含SEQ ID NO:296，VH CDR3包含SEQ ID NO:304，VL CDR1包含SEQ ID NO:157，VL CDR2包含SEQ ID NO:165，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:173；或者VH CDR1包含SEQ ID NO:319，VHCDR2包含SEQ ID NO:331，VH CDR3包含SEQ ID NO:345，VL CDR1包含SEQ ID NO:193，VLCDR2包含SEQ ID NO:200，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:212。
在另一个实施方案中，VH CDR1包含SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:318，VH CDR2包含SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:292或SEQ ID NO:326，VH CDR3包含SEQ IDNO:266、SEQ ID NO:299或SEQ ID NO:340，VL CDR1包含SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:152或SEQ ID NO 188，VL CDR2包含SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:163或SEQ ID NO:197，并且VLCDR3包含SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:207；VH CDR1包含SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:285或SEQ ID NO:319，VH CDR2包含SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:293或SEQ IDNO:327，VH CDR3包含SEQ ID NO:267、SEQ ID NO:300或SEQ ID NO:341，VL CDR1包含SEQID NO:112、SEQ ID NO:153或SEQ ID NO:189，VL CDR2包含SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:198，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:169或SEQ ID NO:208；VHCDR1包含SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:286或SEQ ID NO:320，VH CDR2包含SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:294或SEQ ID NO:328，VH CDR3包含SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:301或SEQ IDNO:342，VL CDR1包含SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:154或SEQ ID NO:190，VL CDR2包含SEQID NO:125、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:199，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:170或SEQ ID NO:209；VH1 CDR1包含SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:287或SEQ ID NO:321，VH CDR2包含SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:295或SEQ ID NO:332，VH CDR3包含SEQ ID NO:269、SEQ ID NO 302或SEQ ID NO:346，195，VL CDR1包含SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:191，VL CDR2包含SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:200，并且VLCDR3包含SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:210；VH CDR1包含SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:288或SEQ ID NO:322，VH CDR2包含SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:295或SEQ IDNO:333，VH CDR3包含SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:303或SEQ ID NO:344，VL CDR1包含SEQID NO:115、SEQ ID NO:156或SEQ ID NO:192，VL CDR2包含SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:201，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:211；或者VH CDR1包含SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:185或SEQ ID NO:319，VH CDR2包含SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:296或SEQ ID NO:331，VH CDR3包含SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:304或SEQID NO:345，VL CDR1包含SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:157或SEQ ID NO:193，VL CDR2包含SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:200，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:137、SEQID NO:173或SEQ ID NO:212。
在另一个实施方案中，(i)VH包含与SEQ ID NO:592具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:592或者由SEQ IDNO:592组成，并且VL包含与SEQ ID NO:86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:86或者由SEQ ID NO:86组成；(ii)VH包含与SEQ ID NO:584具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:584或者由SEQ ID NO:584组成，并且VL包含与SEQ IDNO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84或者由SEQ ID NO:84组成；(iii)VH包含与SEQ ID NO:585具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:585或者由SEQ ID NO:585组成，并且VL包含与SEQ ID NO:85具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:85或者由SEQ IDNO:85组成；(iv)VH包含与SEQ ID NO:586具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:586或者由SEQ ID NO:586组成，并且VL包含与SEQ ID NO:86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:86或者由SEQ ID NO:86组成；(v)VH包含与SEQ ID NO:587具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:587或者由SEQ ID NO:587组成，并且VL包含与SEQ ID NO:87具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:87或者由SEQ ID NO:87组成；(vi)VH包含与SEQ ID NO:588具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:588或者由SEQ ID NO:588组成，并且VL包含与SEQ ID NO:88具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:88或者由SEQ ID NO:88组成；(vii)VH包含与SEQ ID NO:589具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:589或者由SEQ ID NO:589组成，并且VL包含与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:89或者由SEQ ID NO:89组成；(viii)VH包含与SEQ ID NO:238具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:238或者由SEQ ID NO:238组成，并且VL包含与SEQ ID NO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84或者由SEQ ID NO:84组成；(ix)VH包含与SEQ ID NO:590具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:590或者由SEQ ID NO:590组成，并且VL包含与SEQ ID NO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84或者由SEQ ID NO:84组成；(x)VH包含与SEQ ID NO:591238具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:591238或者由SEQ ID NO:591238组成，并且VL包含与SEQ ID NO:85具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:85或者由SEQ ID NO:85组成；(xi)VH包含与SEQ ID NO:593具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:593或者由SEQ IDNO:593组成，并且VL包含与SEQ ID NO:86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:86或者由SEQ ID NO:86组成；(xii)VH包含与SEQ ID NO:593238具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ IDNO:593238或者由SEQ ID NO:593238组成，并且VL包含与SEQ ID NO:87具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:87或者由SEQ ID NO:87组成；(xiii)VH包含与SEQ ID NO:594具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ IDNO:594或者由SEQ ID NO:594组成，并且VL包含与SEQ ID NO:884具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:884或者由SEQ ID NO:884组成；或者(xiv)VH包含与SEQ ID NO:595具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:595或者由SEQ ID NO:595组成，并且VL包含与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:89或者由SEQ ID NO:89组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:407-477、572-574和604-609中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链(HC)序列，包含SEQ ID NO:407-477、572-574和604-609中的任一个或者由SEQ ID NO:407-477、572-574和604-609中的任一个组成，以及与SEQ ID NO:387-406、569-571和598-603中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链(LC)序列，包含SEQ ID NO:387-406、569-571和598-603中的任一个或者由SEQ ID NO:387-406、569-571和598-603中的任一个组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与人VISTA(SEQ ID NO:377的氨基酸33-311)结合。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与人VISTA(SEQ ID NO:377的氨基酸33-311)特异性结合。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与人VISTA的包含氨基酸序列HLHHG(SEQ ID NO:377的氨基酸98-102)或VVEIRHHHSEHR(SEQ ID NO:377的氨基酸148-159)的表位结合。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与人VISTA的包含SEQID NO:377的酪氨酸37、精氨酸54、缬氨酸117和精氨酸127的表位结合。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含Fc区。在一个实施方案中，Fc区是人Fc区或相对于天然人Fc区在Fc区中具有一至七个氨基酸突变的人Fc区变体。在一个实施方案中，人Fc区属于人IgG1、人IgG2或人IgG4。在另一个实施方案中，抗体包含人IgG1或人IgG4的恒定区或者相对于天然恒定区在恒定区中具有一至七个氨基酸突变的恒定区变体。
在一个实施方案中，(a)Fc区属于人IgG1，其中突变选自由以下组成的组：C220D、D221C、E233P、L234A、L234E、L234Y、L235A、L235E、L235F、G236A、G236W、G236R、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、A330L、A330S、P331A、P331S、I332E、E333A、E333S、K334A、A378V、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号；(b)Fc区属于人IgG2，并且其中突变选自由以下组成的组：C220D、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、V309L、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、A330L、A330S、P331A、P331S、I332E、E333A、E333S、K334A、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号；或者(c)Fc区属于人IgG4，并且其中突变选自由以下组成的组：S228P、E233P、F234A、L235A、L235E、L235F、G236A、G236W、G236R、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、V309L、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、I332E、E333A、E333S、K334A、A378V、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体或多特异性抗体。在一个实施方案中，抗原结合片段是Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段或单链Fv(scFv)。
在一个方面，本文公开了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与本文所述的抗体或其抗原结合片段中的任一种竞争结合人VISTA(SEQ ID NO:377)。在一个方面，本文公开了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段防止本文所述的抗体或其抗原结合片段中的任一种与人VISTA(SEQ ID NO:377)结合。在一个实施方案中，结合通过ELISA测定法、表面等离子共振或BLI(例如，Octet Red 96(ForteBioSystem)上的BLI)来测量。
在另一方面，本文公开了一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含本文所公开的抗体或其抗原结合片段以及治疗剂。在另一方面，本文公开了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含本文所公开的scFv。
在另一方面，本文公开了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所公开的抗体或抗原结合片段的VH的核苷酸序列。在另一方面，本文公开了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所公开的抗体或抗原结合片段的VL的核苷酸序列。在另一方面，本文公开了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所公开的抗体或抗原结合片段的VH和VL的核苷酸序列。
在一个方面，本文公开了一种细胞，所述细胞包含一种或多种编码本文所公开的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
在一个方面，本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所公开的抗体或其抗原结合片段、抗体-药物缀合物或CAR以及药学上可接受的载剂。
在一个方面，本文公开了一种产生本文所公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在使得所述一种或多种多核苷酸由细胞表达以产生由多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述细胞。
在一个方面，本文公开了一种治疗有需要的受试者的癌症、自身免疫性疾病和/或感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所公开的药物组合物。在一个实施方案中，方法用于治疗癌症。在一个实施方案中，方法用于治疗自身免疫性疾病。在一个实施方案中，方法用于治疗感染。在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、口腔癌、甲状腺癌、乳腺癌、肉瘤、胰腺癌、结肠癌、胃癌、绒毛膜癌、睾丸癌、间皮瘤、皮肤癌、肾细胞癌、膀胱癌、血液癌或宫颈癌。在一个实施方案中，癌症是转移性癌症。在一个实施方案中，癌症是血癌、急性髓性白血病或骨髓增生异常综合征。在一个实施方案中，方法还包括向受试者施用附加疗法，任选地其中附加疗法是放射疗法、化学治疗剂、靶向疗法、酪氨酸激酶抑制剂、激素疗法和/或免疫检查点抑制剂。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是程序性死亡-1(PD-1)或程序性死亡-配体1(PDL1)或细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抑制剂。
在一个方面，本文提供了一种与VISTA结合(例如，特异性结合)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)。在一个实施方案中，VH包含(i)SEQ ID NO:247的VH互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:254的VH CDR2和SEQ ID NO:266的VHCDR3；(ii)SEQ ID NO:284的VH CDR 1、SEQ ID NO:292的VH CDR2和SEQ ID NO:299的VHCDR3；或者(iii)SEQ ID NO:318的VH CDR1、SEQ ID NO:326的VH CDR2和SEQ ID NO:340的VH CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含(i)SEQ ID NO:248的VH CDR1、SEQ ID NO:255的VH CDR2和SEQ ID NO:267的VH CDR3；(ii)SEQ ID NO:285的VH CDR1、SEQ ID NO:293的VH CDR2和SEQID NO:300的VH CDR3；或者(iii)SEQ ID NO:319的VH CDR1、SEQ ID NO:327的VH CDR2和SEQ ID NO:341的VH CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含(i)SEQ ID NO:249的VH CDR1、SEQ ID NO:256的VH CDR2和SEQ ID NO:268的VH CDR3；(ii)SEQ ID NO:286的VH CDR 1、SEQ ID NO:294的VH CDR2和SEQ ID NO:301的VH CDR3；或者(iii)SEQ ID NO:320的VH CDR 1、SEQ ID NO:328的VHCDR2和SEQ ID NO:342的VH CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含(i)SEQ ID NO:250的VH CDR1、SEQ ID NO:257的VH CDR2和SEQ ID NO:269的VH CDR3；(ii)SEQ ID NO:287的VH CDR1、SEQ ID NO:295的VH CDR2和SEQID NO:302的VH CDR3；或者(iii)SEQ ID NO:321的VH CDR1、SEQ ID NO:329的VH CDR2和SEQ ID NO:343的VH CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含(i)SEQ ID NO:251的VH CDR1、SEQ ID NO:258的VH CDR2和SEQ ID NO:270的VH CDR3；(ii)SEQ ID NO:288的VH CDR1、SEQ ID NO:295的VH CDR2和SEQID NO:303的VH CDR3；或者(iii)SEQ ID NO:322的VH CDR1、SEQ ID NO:330的VH CDR2和SEQ ID NO:344的VH CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含(i)SEQ ID NO:248的VH CDR1、SEQ ID NO:259的VH CDR2和SEQ ID NO:271的VH CDR3；(ii)SEQ ID NO:285的VH CDR1、SEQ ID NO:296的VH CDR2和SEQID NO:304的VH CDR3；或者(iii)SEQ ID NO:319的VH CDR1、SEQ ID NO:331的VH CDR2和SEQ ID NO:345的VH CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含(i)SEQ ID NO:247的VH CDR1、SEQ ID NO:254的VH CDR2和SEQ ID NO:277的VH CDR3；(ii)SEQ ID NO:284的VH CDR1、SEQ ID NO:292的VH CDR2和SEQID NO:310的VH CDR3；或者(iii)SEQ ID NO:318的CDR1、SEQ ID NO:326的CDR2和SEQ IDNO:352的CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含SEQ ID NO:247的VH CDR1、SEQ ID NO:254的VH CDR2和SEQ ID NO:266的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:111的VL CDR1、SEQ ID NO:123的VLCDR2和SEQ ID NO:132的VL CDR3；(ii)VH包含SEQ ID NO:284的VH CDR1、SEQ ID NO:292的VH CDR2和SEQ ID NO:299的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:152的VL CDR1、SEQ ID NO:163的VL CDR2和SEQ ID NO:168的VL CDR3；或者(iii)VH包含SEQ ID NO:318的VH CDR1、SEQ ID NO:326的VH CDR2和SEQ ID NO:340的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:188的VLCDR1、SEQ ID NO:197的VL CDR2和SEQ ID NO:207的VL CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含SEQ ID NO:248的VH CDR1、SEQ ID NO:255的VH CDR2和SEQ ID NO:267的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:112的VL CDR 1、SEQ ID NO:124的VLCDR2和SEQ ID NO:133的VL CDR3；(ii)VH包含SEQ ID NO:285的VH CDR1、SEQ ID NO:293的VH CDR2和SEQ ID NO:300的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:153的VL CDR 1、SEQ ID NO:164的VL CDR2和SEQ ID NO:169的VL CDR3；或者(iii)VH包含SEQ ID NO:319的VH CDR1、SEQ ID NO:327的VH CDR2和SEQ ID NO:341的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:189的VLCDR 1、SEQ ID NO:198的VL CDR2和SEQ ID NO:208的VL CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含SEQ ID NO:249的VH CDR1、SEQ ID NO:256的VH CDR2和SEQ ID NO:268的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:113的VL CDR1、SEQ ID NO:125的VLCDR2和SEQ ID NO:134的VL CDR3；(ii)VH包含SEQ ID NO:286的VH CDR1、SEQ ID NO:294的VH CDR2和SEQ ID NO:301的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:154的VL CDR1、SEQ ID NO:165的VL CDR2和SEQ ID NO:170的VL CDR3；或者(iii)VH包含SEQ ID NO:320的VH CDR1、SEQ ID NO:328的VH CDR2和SEQ ID NO:342的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:190的VLCDR1、SEQ ID NO:199的VL CDR2和SEQ ID NO:209的VL CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含SEQ ID NO:250的VH CDR1、SEQ ID NO:257的VH CDR2和SEQ ID NO:269的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:114的VL CDR1、SEQ ID NO:126的VLCDR2和SEQ ID NO:135的VL CDR3；(ii)VH包含SEQ ID NO:287的VH CDR1、SEQ ID NO:295的VH CDR2和SEQ ID NO:302的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:155的VL CDR1、SEQ ID NO:165的VL CDR2和SEQ ID NO:171的VL CDR3；或者(iii)VH包含SEQ ID NO:321的VH CDR1、SEQ ID NO:329的VH CDR2和SEQ ID NO:343的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:191的VLCDR1、SEQ ID NO:200的VL CDR2和SEQ ID NO:210的VL CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含SEQ ID NO:251的VH CDR1、SEQ ID NO:258的VH CDR2和SEQ ID NO:270的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:115的VL CDR1、SEQ ID NO:127的VLCDR2和SEQ ID NO:136的VL CDR3；(ii)VH包含SEQ ID NO:288的VH CDR1、SEQ ID NO:295的VH CDR2和SEQ ID NO:303的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:156的VL CDR1、SEQ ID NO:166的VL CDR2和SEQ ID NO:172的VL CDR3；或者(iii)VH包含SEQ ID NO:322的VH CDR1、SEQ ID NO:330的VH CDR2和SEQ ID NO:344的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:192的VLCDR1、SEQ ID NO:201的VL CDR2和SEQ ID NO:211的VL CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含SEQ ID NO:248的VH CDR1、SEQ ID NO:259的VH CDR2和SEQ ID NO:271的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:116的VL CDR1、SEQ ID NO:126的VLCDR2和SEQ ID NO:137的VL CDR3；(ii)VH包含SEQ ID NO:285的VH CDR1、SEQ ID NO:296的VH CDR2和SEQ ID NO:304的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:157的VL CDR1、SEQ ID NO:165的VL CDR2和SEQ ID NO:173的VL CDR3；或者(iii)VH包含SEQ ID NO:319的VH CDR1、SEQ ID NO:331的VH CDR2和SEQ ID NO:345的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:193的VLCDR1、SEQ ID NO:200的VL CDR2和SEQ ID NO:212的VL CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含SEQ ID NO:247的VH CDR1、SEQ ID NO:254的VH CDR2和SEQ ID NO:277的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:111的VL CDR1、SEQ ID NO:123的VLCDR2和SEQ ID NO:132的VL CDR3；(ii)VH包含SEQ ID NO:284的VH CDR1、SEQ ID NO:292的VH CDR2和SEQ ID NO:310的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:152的VL CDR1、SEQ ID NO:163的VL CDR2和SEQ ID NO:168的VL CDR3；或者(iii)VH包含SEQ ID NO:318的VH CDR1、SEQ ID NO:326的VH CDR2和SEQ ID NO:352的VH CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:168的VLCDR1、SEQ ID NO:197的VL CDR2和SEQ ID NO:207的VL CDR3。
在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:584的序列。在具体实施方案中，VL包含SEQID NO:84的序列。在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:584的序列，并且VL包含SEQ IDNO:84的序列。
在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:585的序列。在具体实施方案中，VL包含SEQID NO:85的序列。在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:585的序列，并且VL包含SEQ IDNO:85的序列。
在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:586的序列。在具体实施方案中，VL包含SEQID NO:86的序列。在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:586的序列，并且VL包含SEQ IDNO:86的序列。
在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:587的序列。在具体实施方案中，VL包含SEQID NO:87的序列。在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:587的序列，并且VL包含SEQ IDNO:87的序列。
在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:588的序列。在具体实施方案中，VH包含SEQID NO:588的序列，并且VL包含SEQ ID NO:88的序列。
在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:589的序列。在具体实施方案中，VL包含SEQID NO:89的序列。在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:589的序列，并且VL包含SEQ IDNO:89的序列。
在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:592的序列。在具体实施方案中，VL包含SEQID NO:86的序列。在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:592的序列，并且VL包含SEQ IDNO:86的序列。
在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:238的序列。在具体实施方案中，VL包含SEQID NO:84的序列。在具体实施方案中，VH包含SEQ ID NO:238的序列，并且VL包含SEQ IDNO:84的序列。
在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:584的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:84的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:584的序列具有至少95％同一性的序列，并且VL包含与SEQID NO:84的序列具有至少95％同一性的序列。
在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:585的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:85的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:585的序列具有至少95％同一性的序列，并且VL包含与SEQID NO:85的序列具有至少95％同一性的序列。
在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:586的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:86的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:586的序列具有至少95％同一性的序列，并且VL包含与SEQID NO:86的序列具有至少95％同一性的序列。
在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:587的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:87的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:587的序列具有至少95％同一性的序列，并且VL包含与SEQID NO:87的序列具有至少95％同一性的序列。
在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:588的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:88的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:588的序列具有至少95％同一性的序列，并且VL包含与SEQID NO:88的序列具有至少95％同一性的序列。
在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:589的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:89的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:589的序列具有至少95％同一性的序列，并且VL包含与SEQID NO:89的序列具有至少95％同一性的序列。
在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:592的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:86的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:592的序列具有至少95％同一性的序列，并且VL包含与SEQID NO:86的序列具有至少95％同一性的序列。
在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:238的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:84的序列具有至少95％同一性的序列。在具体实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:238的序列具有至少95％同一性的序列，并且VL包含与SEQID NO:84的序列具有至少95％同一性的序列。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表1中示出的SEQ ID NO:作为表1中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表1中示出的SEQID NO:作为抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表1中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VHCDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表2中示出的SEQ ID NO:作为表2中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表2中示出的SEQID NO:作为抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表2中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VHCDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表3中示出的SEQ ID NO:作为表3中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表3中示出的SEQID NO:作为抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表3中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VHCDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表1中示出的SEQ ID NO:作为表1中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表1中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表1中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VHCDR3，并且(ii)VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且其中VL CDR1具有表4中示出的SEQID NO:作为抗体的VL CDR1，并且VL CDR2具有表4中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VLCDR2，并且VL CDR3具有表4中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VL CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表2中示出的SEQ ID NO:作为表2中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表2中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表2中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VHCDR3，并且(ii)VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且其中VL CDR1具有表5中示出的SEQID NO:作为抗体的VL CDR1，并且VL CDR2具有表5中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VLCDR2，并且VL CDR3具有表5中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VL CDR3。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含VH和VL，其中(i)VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表3中示出的SEQ ID NO:作为表3中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表3中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表3中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VHCDR3，并且(ii)VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且其中VL CDR1具有表6中示出的SEQID NO:作为抗体的VL CDR1，并且VL CDR2具有表6中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VLCDR2，并且VL CDR3具有表6中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VL CDR3。
在具体实施方案中，VH包含表7中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VH。在具体实施方案中，VH包含表7中示出的SEQ ID NO:作为抗体的VH，并且VL包含表8中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含重链和轻链，并且其中轻链具有表9中示出的SEQ ID NO:作为表9中列出的抗体编号的轻链，并且重链具有表9中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的重链。
在具体实施方案中，抗体或抗原结合片段与人VISTA(SEQ ID NO:377的氨基酸33-311)特异性结合。
在另一方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体识别人VISTA的包含氨基酸序列HLHHG(SEQ ID NO:377的氨基酸98-102，编号从信号序列(信号序列以粗体加下划线，表11)后的第一个氨基酸开始)或VVEIRHHH SEHR(SEQID NO:377的氨基酸148-159，编号从信号序列(以粗体加下划线，表11)后的第一个氨基酸开始)的表位。在另一个实施方案中，抗体识别人VISTA的包含SEQ ID NO:377的酪氨酸37、精氨酸54、缬氨酸117和精氨酸127(编号从信号序列(以粗体加下划线，表11)后的第一个氨基酸开始)的表位。
在另一方面，本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的参考抗体竞争结合VISTA：(a)第一免疫球蛋白，所述第一免疫球蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:584的序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO:84的序列的VL；(b)第二免疫球蛋白，所述第二免疫球蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:585的序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO:85的序列的VL；(c)第三免疫球蛋白，所述第三免疫球蛋白包含(i)包含SEQ IDNO:586的序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO:86的序列的VL；(d)第四免疫球蛋白，所述第四免疫球蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:587的序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO:87的序列的VL；(e)第五免疫球蛋白，所述第五免疫球蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:588的序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO:88的序列的VL；(f)第六免疫球蛋白，所述第六免疫球蛋白包含(i)包含SEQID NO:589的序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO:89的序列的VL；(g)第七免疫球蛋白，所述第七免疫球蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:238的序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO:84的序列的VL；以及(h)第八免疫球蛋白，所述第八免疫球蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:592的序列的VH和(ii)包含SEQ ID NO:86的序列的VL。
在具体实施方案中，抗体是单克隆抗体。在具体实施方案中，抗体是人抗体。在具体实施方案中，抗体是免疫球蛋白。
在具体实施方案中，抗体包含Fc区或Fc区的变体；任选地其中Fc区是人Fc区或相对于天然人Fc区在Fc区中具有一至七个氨基酸突变的人Fc区变体，和/或任选地其中人Fc区属于人IgG1、人IgG2或人IgG4，进一步任选地其中抗体包含人IgG1或人IgG4的恒定区或者相对于天然恒定区在恒定区中具有一至七个氨基酸突变的恒定区变体。
在具体实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在具体实施方案中，抗体介导补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)。在具体实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
在具体实施方案中，抗体包含人Fc区的变体。在具体实施方案中，(a)Fc区属于人IgG1，其中突变选自由以下组成的组：C220D、D221C、E233P、L234A、L234E、L234Y、L235A、L235E、L235F、G236A、G236W、G236R、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、A330L、A330S、P331A、P331S、I332E、E333A、E333S、K334A、A378V、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号；(b)Fc区属于人IgG2，并且其中突变选自由以下组成的组：C220D、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、V309L、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、A330L、A330S、P331A、P331S、I332E、E333A、E333S、K334A、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号；或者(c)Fc区属于人IgG4，并且其中突变选自由以下组成的组：S228P、E233P、F234A、L235A、L235E、L235F、G236A、G236W、G236R、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、V309L、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、I332E、E333A、E333S、K334A、A378V、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，Fc区(a)是人IgG1，其中突变包含L234A和L235A，以及任选地P329G，其中残基使用EU编号系统编号；或者(b)是人IgG4，并且其中突变包含F234A和L235A，以及任选地P329G，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，Fc区属于人IgG1、IgG2或IgG4，其中突变包含M252Y、S254T和T256E，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，Fc区属于人IgG1、IgG2或IgG4，其中突变包含M428L和N434S，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，Fc区属于人IgG4，其中突变包含S228P和L235E，其中残基使用EU编号系统编号。
在一个实施方案中，Fc区是人IgG4，并且突变包含S228P、M252Y、S254T和T256E，其中残基使用EU编号系统编号。
在一个实施方案中，Fc区属于人IgG4，其中突变包含S228P、M428L和N434S，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或三特异性抗体。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是BiTE或TriKE。
在具体实施方案中，抗原结合片段是Fv片段、Fab片段或F(ab')2片段。
在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段是纯化的。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是分离的。
在另一方面，本文提供了一种单链Fv(scFv)，所述scFv包含被接头序列分开的VH和VL，其中VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VH CDR1具有选自由表1-3组成的组的表中示出的SEQ ID NO:作为所述表中列出的抗体编号的VH CDR1，并且所述VH CDR2具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR2，并且所述VH CDR3具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3。在具体实施方案中，VL包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，并且其中VL CDR1具有选自由表4-6组成的组的表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR1，所述VL CDR2具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR2，并且所述VL CDR3具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR3，其中所述VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3均由相同的CDR编号系统定义。在具体实施方案中，VH包含表7中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH。在具体实施方案中，VL包含表8中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL。
在另一方面，本文提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含本文提供的scFv。
在另一方面，本文提供了一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与治疗剂结合(任选地共价结合)的前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段、scFv或融合蛋白。
在另一方面，本文提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含前述实施方案中任一项的scFv。本文还提供了一种细胞，所述细胞表达CAR。
在另一方面，本文提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段、scFv、融合蛋白或CAR的核苷酸序列。
在另一方面，本文提供了一种含有一种或多种多核苷酸的离体细胞，所述多核苷酸各自包含编码前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段、scFv、融合蛋白或CAR的核苷酸序列。本文还提供了一种产生抗体或抗原结合片段或scFv或融合蛋白或CAR的方法，所述方法包括在使得所述一种或多种多核苷酸由细胞表达以产生由多核苷酸编码的抗体或抗原结合片段或scFv或融合蛋白或CAR的条件下培养所述细胞。
在另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)治疗有效量的前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段、scFv、融合蛋白、CAR、抗体-药物缀合物或细胞；以及(b)药学上可接受的载剂。本文还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述药物组合物。在具体实施方案中，癌症是非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、血癌、肝细胞癌、卵巢癌、间皮瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、甲状腺癌、乳腺癌、肉瘤、胰腺癌、结肠癌、胃癌、绒毛膜癌、睾丸癌、皮肤癌、肾细胞癌、膀胱癌、血液癌(例如，急性髓性白血病)或宫颈癌。在一个实施方案中，癌症是骨髓增生异常综合征。在具体实施方案中，癌症是转移性癌症。在具体实施方案中，癌症是急性髓性白血病，并且其中所述药物组合物包含治疗有效量的所述抗体-药物缀合物，其中所述治疗剂任选地是细胞毒性剂。
在具体实施方案中，治疗癌症的方法还包括向所述受试者施用附加疗法。在具体实施方案中，附加疗法用于治疗所述癌症。在具体实施方案中，治疗癌症的方法还包括向所述受试者施用化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或免疫检查点抑制剂。在具体实施方案中，治疗癌症的方法还包括向受试者施用免疫检查点抑制剂，其中免疫检查点抑制剂是程序性死亡-1(PD-1)或程序性死亡-配体1(PDL1)或细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抑制剂。在具体实施方案中，所述受试者是人。在一个实施方案中，附加疗法是放射疗法。
附图说明
图1A-1N.测量抗VISTA抗体编号269.1(图1A)、编号321.1(图1B)、编号245.1(图1C)、编号465.1(图1D)、编号457.1(图1E)、编号173.1(图1F)、编号833.1(图1G)、编号150.1(图1H)、编号474.1(图1I)、编号80(图1J)、编号85(图1K)、编号87(图1L)、编号91(图1M)和编号92(图1N)对人VISTA的亲和力的Octet传感图。使用生物层干涉测量法在Octet Red 96(ForteBio)系统上测量抗体亲和力。示出生物传感器(抗人IgG Fc捕获浸入和读取传感器)固定的抗VISTA抗体上的抗原(his标记的人VISTA Met 1至Ala194)缔合和解离的传感图。
图2A-2G.测量抗VISTA抗体编号269.1(图2A)、编号321.1(图2B)、编号245.1(图2C)、编号465.1(图2D)、编号457.1(图2E)、编号173.1(图2F)和编号833.1(图2G)对猴VISTA的亲和力的Octet传感图。使用生物层干涉测量法在Octet Red 96(ForteBio)系统上测量抗体亲和力。示出生物传感器(抗人IgG Fc捕获浸入和读取传感器)固定的抗VISTA抗体上的抗原(his标记的食蟹猴VISTA Met 1至Ala 194)缔合和解离的传感图。
图3A-3G.测量抗VISTA抗体编号269.1(图3A)、编号321.1(图3B)、编号245.1(图3C)、编号465.1(图3D)、编号457.1(图3E)、编号173.1(图3F)和编号833.1(图3G)对小鼠VISTA的亲和力的Octet传感图。使用生物层干涉测量法在Octet Red 96(ForteBio)系统上测量抗体亲和力。示出生物传感器(抗人IgG Fc捕获浸入和读取传感器)固定的抗VISTA抗体上的抗原(his标记的小鼠VISTA Met 1至Ala 194)缔合和解离的传感图。
图4A-4G.与人VISTA结合的抗VISTA抗体编号321.1(图4A)、编号245.1(图4B)、编号465.1(图4C)、编号457.1(图4D)、编号173.1(图4E)、编号150.1(图4F)和编号474.1(图4G)的全动力学表征。使用生物层干涉测量法在Octet Red 96(ForteBio)系统上在一系列抗原浓度下测量抗体亲和力。示出生物传感器(抗人IgG Fc捕获浸入和读取传感器)固定的抗VISTA抗体上的抗原(his标记的人VISTA Met 1-Ala 194)缔合和解离的传感图。在分析中使用产生0.1-0.5nm应答的抗原浓度。
图5A-5F.与人VISTA结合的抗VISTA抗体的剂量反应ELISA分析。使用ELISA测定法在0.003-10μg/mL的浓度范围内测量微量滴定板上的固定抗原(his标记的VISTA细胞外结构域)与抗VISTA抗体之间的结合。使用显色测定法测量抗原-抗体复合物，并将数据绘制为450nm处的吸光度与对数转换的抗体浓度的关系。通过非线性回归拟合曲线并计算EC50值。每个图代表1-3种抗体的剂量反应数据(所测试的抗体在x轴上显示)。
图5G-5I.在多种pH下与人VISTA结合的抗VISTA抗体的剂量反应ELISA分析。使用ELISA测定法在pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0和pH 7.4下在0.16-1000ng/mL的浓度范围内测量微量滴定板固定的抗原(his标记的VISTA细胞外结构域)与抗VISTA抗体之间的结合。使用显色测定法测量抗原-抗体复合物，并将数据绘制为450nm处的吸光度与对数转换的抗体浓度的关系。通过非线性回归拟合曲线并计算EC50值。每个图代表单个抗体在每个测试pH下的剂量反应数据。使用Maxisorb ELISA板进行该测定。
图6A-6H.抗VISTA抗体对VISTA特异。筛选抗VISTA抗体与其他B7家族成员的结合。所有抗体都对VISTA特异，不与其他相关人蛋白结合。所测试的抗体在x轴上显示。
图7A、7B、7C.与在CHO K1细胞上稳定表达的VISTA结合的抗VISTA抗体。评价抗体结合在CHO K1细胞上稳定表达的人、小鼠和食蟹猴VISTA的能力。将细胞与0.05、1或150nM的每种抗VISTA抗体一起孵育。用PE缀合的二抗检测与细胞结合的抗体，并通过FACS分析测量结合的平均荧光强度(MFI)。将数据绘制为对数转换的MFI。针对表达人(“Hs”)、食蟹猴(“Mf”)和小鼠(“Mm”)VISTA的CHO细胞评价每种抗体。圆形，150nM抗体浓度下的MFI；正方形，1nM抗体浓度下的MFI；三角形，0.05nM抗体浓度下的MFI。所测试的抗体在x轴上显示。
图8A-8R.在细胞表面上表达的VISTA的多点剂量反应结合数据。评价人IgG1(图8A)和IgG4(图8O)对照以及抗VISTA抗体编号269.1(图8B)、编号321.1(图8C)、编号245.1(图8D)、编号465.1(图8E)、编号457.1(图8F)、编号173.1(图8G),VSTB174(图8H)、编号474.1(Fig 8I)、编号150.1(图8J)、编号80(图8K)、编号92(图8L)、编号87(图8M)、编号91(图8N)、编号245.4(图8P)、编号465.4(图8Q)和编号173.4(图8R)在0.006、0.024、0.098、0.391、1.563、6.25、25和100nM或者在0.003、0.012、0.049、0.195、0.781、3.125、12.5和50nM下结合在CHO K1细胞上稳定表达的人、小鼠和食蟹猴VISTA的能力。将数据绘制为对数转换的MFI与对数转换的抗体浓度的关系。通过具有可变斜率的非线性回归拟合曲线并计算EC50值。
图8S.评价突变体VISTA-ECD-Fc与抗体No.474.1的结合。使用人VISTA-ECD突变体测试Ab No.474.1的结合。在用3ug/mL的突变体VISTA-ECD包被的96孔板上捕获以100ug/mL-0.003ug/mL滴定的Ab No.474.1。使用生物素化抗人Ig轻链κ，然后使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测Ab No.474.1。使用CLARIOstar读板器测定450nm光密度。
图8T.评价突变体VISTA-ECD-Fc与抗体No.150.1的结合。使用人VISTA-ECD突变体测试Ab No.150.1的结合。在用3ug/mL的突变体VISTA-ECD包被的96孔板上捕获以100ug/mL-0.003ug/mL滴定的Ab No.150.1。使用生物素化抗人Ig轻链κ，然后使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测Ab No.150.1。使用CLARIOstar读板器测定450nm光密度。
图8U.评价突变体VISTA-ECD-Fc与抗体编号85的结合。使用人VISTA-ECD突变体测试Ab No.85的结合。在用3ug/mL的突变体VISTA-ECD包被的96孔板上捕获以100ug/mL-0.003ug/mL滴定的Ab No.85。使用生物素化抗人Ig轻链κ，然后使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测Ab No.85。使用CLARIOstar读板器测定450nm光密度。
图8V.评价突变体VISTA-ECD-Fc与抗体编号87的结合。使用人VISTA-ECD突变体测试Ab No.87的结合。在用3ug/mL的突变体VISTA-ECD包被的96孔板上捕获以100ug/mL-0.003ug/mL滴定的Ab No.87。使用生物素化抗人Ig轻链κ，然后使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测Ab No.87。使用CLARIOstar读板器测定450nm光密度。
图8W.评价突变体VISTA-ECD-Fc与抗体编号91的结合。使用人VISTA-ECD突变体测试Ab No.91的结合。在用3ug/mL的突变体VISTA-ECD包被的96孔板上捕获以100ug/mL-0.003ug/mL滴定的Ab No.91。使用生物素化抗人Ig轻链κ，然后使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测Ab No.91。使用CLARIOstar读板器测定450nm光密度。
图8X.评价突变体VISTA-ECD-Fc与抗体编号92的结合。使用人VISTA-ECD突变体测试Ab No.92的结合。在用3ug/mL的突变体VISTA-ECD包被的96孔板上捕获以100ug/mL-0.003ug/mL滴定的Ab No.92。使用生物素化抗人Ig轻链κ，然后使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测Ab No.92。使用CLARIOstar读板器测定450nm光密度。
图8Y.评价突变体VISTA-ECD-Fc与抗体VSTB174的结合。使用人VISTA-ECD突变体测试VSTB174的结合。在用3ug/mL的突变体VISTA-ECD包被的96孔板上捕获以100ug/mL-0.003ug/mL滴定的VSTB174。使用生物素化抗人Ig轻链κ，然后使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测VSTB174。使用CLARIOstar读板器测定450nm光密度。
图9A和9B：在第4天抗体编号269.1(图9A)和抗体编号833.1(图9B)对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在3、0.3或0.03μg/ml的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。
图9C：与VSTB174相比，第4天抗体编号474.1(WT)、编号150.1(YTE)和编号246.4对SEB诱导的对NK细胞耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在以30、3、0.3和0.03ug/ml测试的抗VISTA Ab或对照Ab以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将耗尽的人PBMC NK细胞铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。
图10：在第4天抗体编号321.1对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在以3、0.3或0.03μg/ml测试的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。
图11：在第4天抗体编号245.1对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在3、0.3或0.03μg/ml的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。
图12：在第4天抗体编号465.1对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在3、0.3或0.03μg/ml的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。
图13：在第4天抗体编号457.1对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在以3、0.3或0.03μg/ml测试的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。
图14：在第4天抗体编号173.1对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在3、0.3或0.03μg/ml的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。
图15：在第4天抗体编号245.1和抗体编号245.4对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在图中列出(3μg/ml)的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。所测试的抗体在x轴上显示。
图16：在第4天抗体编号465.1和抗体编号465.4对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在图中列出(3μg/ml)的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。所测试的抗体在x轴上显示。
图17：在第4天抗体编号173.1和抗体编号173.4对SEB诱导的对NK耗尽的人PBMC的刺激的影响。在37℃下，在图中列出(3μg/ml)的抗VISTA抗体或对照抗体以及5ng/ml的SEB存在下以2x105个细胞/孔将人NK细胞耗尽的PBMC铺板4天。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7316-88)对第4天的IFN-γ产生进行定量。所测试的抗体编号在x轴上显示。
图18A和18B.抗VISTA抗体编号269.1对逆转VISTA介导的T细胞活化抑制的影响。在VISTA包被的珠(珠与细胞的比率为2:1)以及100μg/ml的抗体编号269.1或对照Ab存在下，将2x105个Cell Trace Violet标记的人泛T细胞在用CD3的抗体(“Ab”)包被的板中培养24小时。通过流式细胞术对T细胞增殖进行定量，并通过ELISA(R&D Systems，目录号DY285B-05)对IFNγ进行定量。
图19A和19B.抗VISTA抗体编号321.1对逆转VISTA介导的T细胞活化抑制的影响。在VISTA包被的珠(珠与细胞的比率为2:1)以及100μg/ml的抗体编号321.1或对照Ab存在下，将2x105个Cell Trace Violet标记的人泛T细胞在抗CD3 Ab包被的板中培养24小时。通过流式细胞术对T细胞增殖进行定量，并通过ELISA(R&D Systems，目录号DY285B-05)对IFNγ进行定量。
图20A和20B.抗VISTA抗体编号245.1对逆转VISTA介导的T细胞活化抑制的影响。在VISTA包被的珠(珠与细胞的比率为2:1)以及100μg/ml的抗体编号245.1或对照Ab存在下，将2x105个Cell Trace Violet标记的人泛T细胞在抗CD3 Ab包被的板中培养24小时。通过流式细胞术对T细胞增殖进行定量，并通过ELISA(R&D Systems，目录号DY285B-05)对IFNγ进行定量。
图21A和21B.抗VISTA抗体编号457.1对逆转VISTA介导的T细胞活化抑制的影响。在VISTA包被的珠(珠与细胞的比率为2:1)以及100μg/ml的抗体编号457.1或对照Ab存在下，将2x105个Cell Trace Violet标记的人泛T细胞在抗CD3 Ab包被的板中培养24小时。通过流式细胞术对T细胞增殖进行定量，并通过ELISA(R&D Systems，目录号DY285B-05)对IFNγ进行定量。
图22A和22B.抗VISTA抗体编号173.1对逆转VISTA介导的T细胞活化抑制的影响。在VISTA包被的珠以及100μg/ml的抗体编号173.1或对照Ab存在下，将2x105个Cell TraceViolet标记的人泛T细胞在抗CD3 Ab包被的板中培养24小时。通过流式细胞术对T细胞增殖进行定量，并通过ELISA(R&D Systems，目录号DY285B-05)对IFNγ进行定量。
图23A-23D.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号269.1对CD14+单核细胞上的活化标记CD80、CD86和HLA-DR上调以及对CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号269.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80、CD86和HLA-DR的表达进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图24A-24C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号833.1对CD14+单核细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调以及CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号833.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80和HLA-DR的表达进行定量。通过ELISA(R&DSystems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图25A-25D.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号321.1对CD14+单核细胞上的活化标记CD80、CD86和HLA-DR上调以及CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号321.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80、CD86和HLA-DR的表达进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图26A-26C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号245.1对CD14+单核细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调以及CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号245.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80和HLA-DR的表达进行定量。通过ELISA(R&DSystems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图27A-27C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号465.1对CD14+单核细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调以及CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号465.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80和HLA-DR的表达进行定量。通过ELISA(R&DSystems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图28A-28D.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号457.1对CD14+单核细胞上的活化标记CD80、CD86和HLA-DR上调以及CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号457.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80、CD86和HLA-DR的表达进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图29A-29D.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号173.1对CD14+单核细胞上的活化标记CD80、CD86和HLA-DR上调以及CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号173.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80、CD86和HLA-DR的表达进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图30A-30C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号269.1对CD14+单核细胞上的活化标记HLA-DR和CD80上调的剂量反应效应以及对抗VISTA抗体对CXCL10分泌的剂量反应效应。在30、3、0.3、0.03或0.003μg/ml的抗体编号269.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-15)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图31A-31C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号833.1对CD14+单核细胞上的活化标记HLA-DR和CD80上调的剂量反应效应以及对抗VISTA抗体对CXCL10分泌的剂量反应效应。在30、3、0.3、0.03或0.003μg/ml的抗体编号833.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-15)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图32A-32C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号321.1对CD14+单核细胞上的活化标记HLA-DR和CD80上调的剂量反应效应以及对抗VISTA抗体对CXCL10分泌的剂量反应效应。在30、3、0.3、0.03或0.003μg/ml的抗体编号321.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-15)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图33A-33C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号245.1对CD14+单核细胞上的活化标记HLA-DR和CD80上调的剂量反应效应以及对抗VISTA抗体对CXCL10分泌的剂量反应效应。在30、3、0.3、0.03或0.003μg/ml的抗体编号245.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-15)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图34A-34C.24小时的培养物中抗VISTA抗体编号465.1对CD14+单核细胞上的活化标记HLA-DR和CD80上调的剂量反应效应以及对抗VISTA抗体对CXCL10分泌的剂量反应效应。在30、3、0.3、0.03或0.003μg/ml的抗体编号465.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-15)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图35A-35C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号457.1对CD14+单核细胞上的活化标记HLA-DR和CD80上调的剂量反应效应以及对抗VISTA抗体对CXCL10分泌的剂量反应效应。在30、3、0.3、0.03或0.003μg/ml的抗体编号457.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-15)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图36A-36C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号173.1对CD14+单核细胞上的活化标记HLA-DR和CD80上调的剂量反应效应以及对抗VISTA抗体对CXCL10分泌的剂量反应效应。在30、3、0.3、0.03或0.003μg/ml的抗体编号173.1或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-15)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。
图36D-36I.Ab No.474.1和Ab No.150.1(对照是VSTB174)在24小时诱导CD14+单核细胞上的活化标记CD80、HLA-DR上调以及CXCL10分泌的剂量反应效应。在以3、0.3、0.03ug/ml测试的抗VISTA Ab或同种型对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80和HLA-DR的表达进行定量。通过R&D Systems DuoSet ELISA Human CXCL10试剂盒(R&D Systems，产品号DY266)对CXCL10趋化因子的分泌进行定量。
图37A-37C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体对CD14+单核细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调的影响，以及抗VISTA抗体对CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号245.1和抗体编号245.4或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&DSystems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。所测试的抗体在x轴上显示。
图37D-37F.Ab N0.474.1和Ab No.246.4及其IgG4对应物在24小时诱导CD14+单核细胞上的活化标记CD80、HLA-DR上调以及CXCL10分泌的影响。在3ug/ml的抗VISTA Ab或同种型对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对CD14+细胞上CD80和HLA-DR的表达进行定量。通过R&D Systems DuoSet ELISA Human CXCL10试剂盒(R&D Systems，产品号DY266)对CXCL10趋化因子的分泌进行定量。
图38A-38C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体对CD14+单核细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调的影响，以及抗VISTA抗体对CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号465.1和抗体编号465.4或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&DSystems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。所测试的抗体在x轴上显示。
图39A-39C.24小时的共培养物中抗VISTA抗体对CD14+单核细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调的影响，以及抗VISTA抗体对CXCL10分泌的影响。在10μg/ml的抗体编号173.1和抗体编号173.4或对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&DSystems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中的CXCL10分泌进行定量。所测试的抗体在x轴上显示。
图40A-40F.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号269.1的剂量滴定效应以及NK细胞关于CD14+单核细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调的作用、抗VISTA抗体对CXCL10分泌的影响。在3、0.3或0.03μg/ml的抗体编号269.1、IgG1对照或阴性对照抗体编号18.1存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人总PBMC(图40A-40C)或NK耗尽的人PBMC(图40D-40F)共培养24小时。如通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术所确定，通过MFI对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中CXCL10趋化因子的分泌进行定量。
图41A-41F.24小时的共培养物中抗VISTA抗体编号173.1的剂量滴定效应以及NK细胞关于CD14+单核细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调的作用、抗VISTA抗体的影响以及NK关于CXCL10分泌的作用。在以3、0.3、0.03μg/ml测试的抗体编号173.1Ab、IGG1对照或阴性对照抗体编号18.1Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个来自同一供体的人总PBMC(图41A-41C)或NK耗尽的人PBMC(图41D-41F)共培养24小时。如通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术所确定，通过MFI对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过ELISA(R&D Systems，目录号DY266-05)对24小时的共培养物中CXCL10趋化因子的分泌进行定量。
图41G-41I.Ab No.474.1和Ab No.150.1的剂量反应效应以及NK在24小时诱导CD14+单核细胞上的活化标记CD80、HLA-DR上调以及CXCL10分泌的贡献。在以3、0.3、0.03ug/ml测试的抗VISTA Ab或同种型对照Ab存在下，将0.5x105个富含CD14+的人PBMC与2x105个人PBMC或2x105个来自同一供体的NK耗尽的人PBMC共培养24小时。通过对门控的CD14+活细胞进行流式细胞术对24小时的CD14+细胞上的活化标记CD80和HLA-DR上调进行定量。通过平均荧光强度(MFI)对在总人PBMC(左侧)或NK耗尽的人PBMC(右侧)存在下CD14+细胞上CD80和HLA-DR的表达进行定量。通过R&D Systems DuoSet ELISA Human CXCL10试剂盒(R&DSystems，产品号DY266)对CXCL10趋化因子的分泌进行定量。
图42A和42B.抗VISTA抗体编号321.1对细胞因子诱导的MDSC的抑制活性的影响。在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(10ng/ml)和IL6(10ng/ml)存在下，将来自健康供体的人PBMC培养7天。7天后，测量CD11b+细胞(MDSC)在抗体编号321.1或同型对照Ab存在下抑制抗CD3 Ab诱导的PBMC增殖的能力。将PBMC(2x105个细胞/孔)用5mM CellTraceViolet标记，然后在抗CD3 Ab(2μg/ml)存在下添加到MDSC(2x105个细胞/孔)中。孵育4天后，通过流式细胞仪分析(Attune Nxt)确定T细胞增殖，并通过ELISA(ProQuantum)确定IFNγ产生。条形图是单份的。
图43A和43B.抗VISTA抗体编号245.1和编号245.4对细胞因子诱导的MDSC的抑制活性的影响。在GM-CSF(10ng/ml)和IL6(10ng/ml)存在下，将来自健康供体的人PBMC培养7天。7天后，测量CD11b+细胞(MDSC)在抗体编号245.1和抗体编号245.4或同型对照Ab存在下抑制抗CD3 Ab诱导的PBMC增殖的能力。将PBMC(2x105个细胞/孔)用5mM CellTrace Violet标记，然后在抗CD3 Ab(2μg/ml)存在下添加到MDSC(2x105个细胞/孔)中。孵育4天后，通过流式细胞仪分析(Attune Nxt)确定T细胞增殖，并通过ELISA(ProQuantum)确定IFNγ产生。条形图是单份的。所测试的抗体在x轴上显示。
图44A和44B.抗VISTA抗体编号465.1对细胞因子诱导的MDSC的抑制活性的影响。在GM-CSF(10ng/ml)和IL6(10ng/ml)存在下，将来自健康供体的人PBMC或CD11b+细胞培养7天。7天后，测量CD11b+细胞(MDSC)在抗体编号465.1或同型对照Ab存在下抑制抗CD3 Ab诱导的PBMC增殖的能力。将PBMC(2x105个细胞/孔)用5mM CellTrace Violet标记，然后在抗CD3 Ab(2μg/ml)存在下添加到MDSC(2x105个细胞/孔)中。孵育4天后，通过流式细胞仪分析(Attune Nxt)确定T细胞增殖，并通过ELISA(ProQuantum)确定IFNγ产生。条形图是单份的。
图45A和45B.抗VISTA抗体编号457.1对细胞因子诱导的MDSC的抑制活性的影响。在GM-CSF(10ng/ml)和IL6(10ng/ml)存在下，将来自健康供体的人PBMC或CD11b+细胞培养7天。7天后，测量CD11b+细胞(MDSC)在抗体编号457.1或同型对照Ab存在下抑制抗CD3 Ab诱导的PBMC增殖的能力。将PBMC(2x105个细胞/孔)用5mM CellTrace Violet标记，然后在抗CD3 Ab(2μg/ml)存在下添加到MDSC(2x105个细胞/孔)中。孵育4天后，通过流式细胞仪分析(Attune Nxt)确定T细胞增殖，并通过ELISA(ProQuantum)确定IFNγ产生。条形图是单份的。
图46A和46B.抗VISTA抗体编号173.1对细胞因子诱导的MDSC的抑制活性的影响。在GM-CSF(10ng/ml)和IL6(10ng/ml)存在下，将来自健康供体的人PBMC或CD11b+细胞培养7天。7天后，测量CD11b+细胞(MDSC)在抗体编号173.1或同型对照Ab存在下抑制抗CD3 Ab诱导的PBMC增殖的能力。将PBMC(2x105个细胞/孔)用5mM CellTrace Violet标记，然后在抗CD3 Ab(2μg/ml)存在下添加到MDSC(2x105个细胞/孔)中。孵育4天后，通过流式细胞仪分析(Attune Nxt)确定T细胞增殖，并通过ELISA(ProQuantum)确定IFNγ产生。条形图是单份的。
图47A.在FcRn结合测定中评价Fc突变体。使用AlphaLisa结合试剂盒(PerkinElmer#AL3095C)测试IgG1或IgG4主链上的抗体No.173野生型(WT)以及相应的LS突变AbNo.289(根据EU编号的M428L和N434S取代)和YTE突变Ab No.420(根据EU编号的M252Y、S254T和T256E取代)与FcRn受体结合的能力。制备浓度为1.2mg/ml(最终浓度的4倍)的抗VISTA抗体，然后进行半对数连续稀释。制备浓度为800ng/ml(最终浓度的4倍)的FcRn，并且制备浓度为20mg/ml(最终浓度的2倍)的链霉亲和素供体和huIgG缀合的受体珠，然后在黑暗中孵育90分钟。在CLARIOstar光谱仪中在615nm处读取发光。所测试的抗体在图例中显示。
图47B.在FcRn结合测定中评价Fc突变体。使用AlphaLisa结合试剂盒(PerkinElmer#AL3095C)测试IgG1或IgG4 S228P主链(Ab No.246.4)上的AbNo.474.1(WT)抗体以及IgG1主链(Ab No.150.1)上的YTE突变在FcRn受体上结合的能力。制备1mg/ml(4倍)的抗VISTA抗体，然后进行半对数连续稀释。制备800ng/ml(4倍)的FcRn，并且制备40mg/ml(2倍)的链霉亲和素供体和huIgG缀合的受体珠，然后在黑暗中孵育90分钟。在CLARIOstar光谱仪中在680nm/615nm(激发/发射)处读取发光。
图48A.在免疫球蛋白γFc受体1(FcγR1)结合测定中评价Fc突变体。使用AlphaLisa结合试剂盒(Perkin Elmer#AL3081C)测试IgG1或IgG4主链上的抗体No.173WT以及相应的LS(Ab No.289)和YTE(Ab No.420)突变与FcγR1受体结合的能力。制备浓度为1.2mg/ml(最终浓度的4倍)的抗VISTA抗体，然后进行半对数连续稀释。制备浓度为200ng/ml(最终浓度的4倍)的FcγR1，并且制备浓度为40mg/ml(最终浓度的2倍)的链霉亲和素供体和huIgG缀合的受体珠，然后在黑暗中孵育90分钟。在CLARIOstar光谱仪中在615nm处读取发光。所测试的抗体在图例中显示。
图48B.在FcγR1结合测定中评价Fc突变体。使用AlphaLisa结合试剂盒(PerkinElmer#AL3081C)测试IgG1或IgG4 S228P主链(Ab No.246.4)上的Ab No.474.1(WT)抗体以及IgG1主链(Ab No.150.1)上的YTE突变在FcγR1受体上结合的能力。制备1mg/ml(4倍)的抗VISTA抗体，然后进行半对数连续稀释。制备200ng/ml(4倍)的FcγR1，并且制备40μg/ml(2倍)的链霉亲和素供体和huIgG缀合的受体珠，然后在黑暗中孵育90分钟。在CLARIOstar光谱仪中在680nm/615nm(激发/发射)处读取发光。
图49A和49B.在免疫球蛋白γFc受体IIa(FcγR2a)(等位基因167H和167R)结合测定中评价Fc突变体。使用AlphaLisa结合试剂盒(Perkin Elmer#AL3086C和#AL3087C)测试IgG1或IgG4主链上的抗体No.173WT以及它们相应的LS(Ab No.289)和YTE(Ab No.420)突变与FcγR2a受体(等位基因167H或167R)结合的能力。制备浓度为1.2mg/ml(最终浓度的4倍)的抗VISTA抗体，然后进行半对数连续稀释。制备120ng/ml(最终浓度的4倍)的FcγR2a(167H)，同时制备浓度为200ng/ml(最终浓度的4倍)的FcγR2a(167R)，并且制备浓度为20mg/ml(最终浓度的2倍)的链霉亲和素供体和huIgG缀合的受体珠，然后在黑暗中孵育90分钟。在CLARIOstar光谱仪中在615nm处读取发光。所测试的抗体在图例中显示。
图49C和49D.在FcγR2a(167H和167R)结合测定中评价Fc突变体。使用AlphaLisa结合试剂盒(Perkin Elmer#AL3086C和#AL3087C)测试IgG1或IgG4 S228P主链(AbNo.246.4)上的Ab No.474.1(WT)抗体以及IgG1主链(AbNo.150.1)上的YTE突变在FcγR2a受体(等位基因167H或167R)上结合的能力。制备1mg/ml(4倍)的抗VISTA抗体，然后进行半对数连续稀释。制备120ng/ml(4倍)的FcγR2a(167H)，同时制备200ng/ml(4倍)的FcγR2a(167R)，并且制备20μg/ml(2倍)的链霉亲和素供体和huIgG缀合的受体珠，然后在黑暗中孵育90分钟。在CLARIOstar光谱仪中在680nm/615nm(激发/发射)处读取发光。
图50A和50B.在免疫球蛋白γFc受体IIIa(FcγR3a)(176F和176V等位基因)结合测定中评价Fc突变体。使用AlphaLisa结合试剂盒(Perkin Elmer#AL347HV和#AL348HV)测试IgG1或IgG4主链上的抗体No.173WT以及它们相应的LS(Ab No.289)和YTE(Ab No.420)突变与FcγR3a受体(等位基因176F或176V)结合的能力。制备浓度为1.2mg/ml(最终浓度的4倍)的抗VISTA抗体，然后进行半对数连续稀释。制备浓度为8nM(最终浓度的4倍)的FcγR3a(176F)，同时制备浓度为1.2nM(最终浓度的4倍)的FcγR3a(176V)，并且制备浓度为40mg/ml(最终浓度的2倍)的链霉亲和素供体和huIgG缀合的受体珠，然后在黑暗中孵育90分钟。在CLARIOstar光谱仪中在615nm处读取发光。所测试的抗体在图例中显示。
图50C和50D.在FcγR3a(176F和176V)结合测定中评价Fc突变体。使用AlphaLisa结合试剂盒(Perkin Elmer#AL347HV和#AL348HV)测试IgG1或IgG4 S228P主链(AbNo.246.4)上的Ab No.474.1(WT)抗体以及IgG1主链(AbNo.150.1)上的YTE突变在FcγR3a受体(等位基因176F或176V)上结合的能力。制备1mg/ml(4倍)的抗VISTA抗体，然后进行半对数连续稀释。制备8nM(4倍)的FcγR3a(176F)，同时制备1.2nM(4倍)的FcγR3a(176V)，并且制备40μg/ml(2倍)的链霉亲和素供体和huIgG缀合的受体珠，然后在黑暗中孵育90分钟。在CLARIOstar光谱仪中在680nm/615nm(激发/发射)处读取发光。
图50E-50G.FcRn与在Octet K2系统上与FAB2G生物传感器结合的VISTA mAb结合的动力学。将1ug/ml浓度的Ab No.150.1、No.474.1和VSTB174加载(加载步骤)到抗人Fab-CH1(FAB2G)浸液和读取生物传感器(ForteBio)上120秒。将加载后的生物传感器浸入(缔合步骤)0、50、200和800纳摩尔浓度的FcRn(R&D systems)中240秒。将缔合的生物传感器浸入磷酸盐测定缓冲液(PAB)溶液中360秒(解离步骤)。包括基线、缔合和解离在内的所有步骤均在PAB(pH 6.0)中进行以复制FcRn-Fc活性的细胞内生物学。进行1:1全局曲线拟合分析以确定所有浓度的FcRn分析物的ka、kdis和KD。仅分析前10秒的双相解离曲线。动力学实验在ForteBio Octet K2系统上进行，并使用ForteBio数据分析HT软件版本12.0.2.59进行分析。
图51.抗VISTA抗体编号421.1与效应PBMC在3小时对针对表达人VISTA的靶Raji细胞(Raji-hVISTA细胞)的ADCC活性的剂量反应效应。在100、30、10、3.0、1.0或0.3ng/ml的抗体编号421.1或对照Ab存在下，将效应细胞(5x105个人PBMC)与靶细胞(1x104个用BATDA标记的Raji-hVISTA细胞)共培养3小时。在CLARIOstar Plus上通过EuTDA细胞毒试剂的短期时间分辨荧光测定法检测对诱导的ADCC活性进行定量。
图52.抗VISTA抗体编号245.1和编号475.1与效应PBMC在3小时对针对表达人VISTA的靶Raji细胞(Raji-hVISTA细胞)的ADCC活性的剂量反应效应。在100、30、10、3.0、1.0或0.3ng/ml的抗体编号245.1(WT)、抗体编号475.1(LS)或对照Ab存在下，将效应细胞(5x105个人PBMC)与靶细胞(1x104个用BATDA标记的Raji-hVISTA细胞)共培养3小时。在CLARIOstar Plus上通过EuTDA细胞毒试剂的短期时间分辨荧光测定法检测对诱导的ADCC活性进行定量。所测试的抗体在图例中显示。
图53.抗VISTA抗体编号465.1与效应PBMC在3小时对针对表达人VISTA的靶Raji细胞(Raji-hVISTA细胞)的ADCC活性的剂量反应效应。在100、30、10、3.0、1.0或0.3ng/ml的抗体编号465.1或对照Ab存在下，将效应细胞(5x105个人PBMC)与靶细胞(1x104个用BATDA标记的Raji-hVISTA细胞)共培养3小时。在CLARIOstar Plus上通过EuTDA细胞毒试剂的短期时间分辨荧光测定法检测对诱导的ADCC活性进行定量。
图54.抗VISTA抗体编号457.1与效应PBMC在3小时对针对表达人VISTA的靶Raji细胞(Raji-hVISTA细胞)的ADCC活性的剂量反应效应。在100、30、10、3.0、1.0或0.3ng/ml的抗体编号457.1或对照Ab存在下，将效应细胞(5x105个人PBMC)与靶细胞(1x104个用BATDA标记的Raji-hVISTA细胞)共培养3小时。在CLARIOstar Plus上通过EuTDA细胞毒试剂的短期时间分辨荧光测定法检测对诱导的ADCC活性进行定量。
图55A.抗VISTA抗体编号173.1、编号173.4和编号420.1与效应PBMC在3小时对针对表达人VISTA的靶Raji细胞(Raji-hVISTA细胞)的ADCC活性的剂量反应效应。在100、30、10、3.0、1.0或0.3ng/ml的抗体编号173.1(WT,IgG1)、抗体编号420.1(YTE)、抗体编号173.4(WT，IgG4)或对照Ab存在下，将效应细胞(5x105个人PBMC)与靶细胞(1x104个用BATDA标记的Raji-hVISTA细胞)共培养3小时。在CLARIOstar Plus上通过EuTDA细胞毒试剂的短期时间分辨荧光测定法检测对诱导的ADCC活性进行定量。所测试的抗体在图例中显示。
图55B-55C.在CytoTox-Glo试剂存在下通过发光测量细胞死亡。将5x105个/孔PBMC与200u/mL IL-2在96孔板中的X-VIVO-15培养基中一起O/N孵育。将抗体和4x104个/孔hVISTA-Raji细胞添加到96孔板中，混合并使用12:1的效应物:靶标(E:T)比率孵育4小时(n＝2)。数据来自代表6个健康供体的一个供体。
图55D.CDC测定。在CytoTox-Glo试剂存在下通过发光测量细胞死亡。将1x105个/孔Raji+hVISTA细胞铺板在96孔板中的X-VIVO-15培养基中。将抗体和25％人血清添加到96孔板中，混合并孵育6小时。
图56A.抗VISTA抗体编号245.2在人VISTA敲入(KI)小鼠的MC38肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。向VISTA KI小鼠皮下注射1x106个MC38细胞，并在肿瘤体积达到大约70-100mm3后将其随机分配。然后，通过腹膜内(IP)注射媒介物对照、用10mg/kg的抗体编号245.2(一周3次)或用5mg/kg的抗PD1抗体(一周两次)或者用抗体编号245.2和抗PD1抗体的组合(各自具有相应的单一疗法剂量频率和量)处理小鼠。使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：“V＝(L x W x W)/2”，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤大小)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤大小)。
图56B.Ab No.474.1和Ab No.150.1在VISTA KI小鼠的MB49肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。向VISTA KI小鼠皮下注射5x105个MB49细胞，并在肿瘤体积达到大约70-100mm3后将其随机分配。从第5天开始，通过一周两次腹膜内(IP)注射20mg/kg的Ab No.474.1、AbNo.150.1或人IgG1处理小鼠，持续三周。使用卡尺在两个维度上每周三次测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：V＝(L x W x W)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤大小)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤大小)。误差条代表SEM。
图56C.Ab No.150.1在VISTA KI小鼠的MB49肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。向VISTA KI小鼠皮下注射5x105个MB49细胞，并在肿瘤体积达到大约70-100mm3后将其随机分配。从第5天开始，通过一周两次腹膜内(IP)注射20mg/kg的Ab No.150.1、5mg/kg抗mPD1或组合疗法处理小鼠，持续三周。使用卡尺在两个维度上每周三次测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：V＝(L x W x W)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤大小)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤大小)。误差条代表SEM。
图56D-56L.在第12天第3个剂量后24小时，从用hIgG(20mg/kg)、Ab No.150.1(20mg/kg)、mPD1(5mg/kg)处理以及用Ab No.150.1与mPD1组合处理的hVISTA KI C57B/6小鼠中收获肿瘤样品(n＝3)。将肿瘤解离成单细胞悬浮液并用淋巴样小组染色，然后用Biolegend RBC裂解缓冲液裂解RBC。用BD cytofix固定细胞并经由流式细胞术(AttuneNxt)分析。gMDSC，粒状骨髓衍生的抑制细胞；M1 TAM，M1型肿瘤相关巨噬细胞；M2 TAM，M2型肿瘤相关巨噬细胞。
图57A和57B.在人VISTA KI小鼠中单次腹膜内(IP)给药后血清中抗VISTA抗体随时间的各个浓度。(样品一式两份)。所测试的抗体在图例中显示。
图57C.在雌性人VISTA KI小鼠中单次IP给药后血清中抗VISTA Ab的各个浓度与时间的关系(样品一式两份)。
图57D-57E.在雌性人VISTA KI小鼠中单次或重复IP给药后血清中抗VISTA Ab的各个浓度与时间的关系(样品一式两份)。
图57F-57N.在食蟹猴中，在10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg的单次(实心符号)或四次每周IV给药(空心符号)后，血清中Ab No.150.1的抗体浓度(ug/mL，灰色)和受体占有率(％，黑色)与时间的关系。示出了组平均值、分配给相应组的雄性(M)和雌性(F)动物的数据。10mg/kg：图例：A.组平均值，D.动物2001(M)，G.动物2601(F)。30mg/kg：B.组平均值，E.动物3001(M)，H.动物3501(G)。100mg/kg：C.组平均值，F.动物4001(M)，I.动物4501(F)。虚线＝100％受体占有率。
图58A-58X：非人灵长类动物(NHP)体内暴露于抗VISTA抗体期间骨髓树突细胞(mDC)和CD14+单核细胞活化标记的变化。活化标记平均荧光强度(MFI)相对于给药前的％变化的图，如通过离体流式细胞仪分析所鉴定的。将来自所有时间点(0h(给药前)、72h、168h(第2个剂量前)、240h和336h)的样品解冻，染色，并在同一天分析以确定骨髓群体大小和活化标记。针对CD14+单核细胞或者CD14-HLA-DR+CD1c+或CD11c+CD123-骨髓树突细胞(mDC)对CD45+CD66-CD3-CD8-CD20-即侧向散射中间骨髓群体进行门控。在技术重复上获得CD14+单核细胞和mDC的CD80、CD86和HLA-DR的MFI，并减去来自相应荧光减一(FMO)样品的MFI。(荧光减一(FMO)对照是其中将细胞用除了实验中使用的一种荧光染料之外的所有荧光染料染色的样品，每种荧光染料都有一个FMO对照，以确定背景荧光与阳性群体之间的截止点。)将MFI相对于给药前水平的百分比变化计算为％变化＝100*(MFI第x天-MFI第0天)/MFI第0天。呈现了抗体编号173.1(WT)、抗体编号173.4(WT)、抗体编号289.1(LS)和抗体编号420.1(YTE)的体内给药动物的样品的结果。图示出了活化标记CD80(图58A、58D、58G、58J、58M、58P、58S和58V)、CD86(图58B、58E、58H、58K、58N、58Q、58T和58W)和HLA-DR(图58C、58F、58I、58L、58O、58R、58U和58X)的表达水平的变化。箭头指示在0和168小时的10mg/kgiv给药。所测试的抗体在x轴上显示。
图59A-59D.抗VISTA抗体编号245.2在人VISTA KI小鼠的MB49肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。向VISTA KI小鼠皮下注射5x105个MB49细胞，并在肿瘤体积达到大约70mm3后将其随机分配。通过每周两次腹膜内(IP)注射30mg/kg小鼠IgG2a对照抗体、30mg/kg抗体编号245.2或30mg/kg根据EU编号具有L234A和L235A取代(“LALA”)的抗体编号245.2，总共六个剂量。使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：“V＝(L x W x W)/2”，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤大小)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤大小)。图59A示出了IgG2a对照(正方形)、245.2(空心圆)和245.2LALA(实心圆)的平均肿瘤体积±SEM。图59B-59D示出了每只动物和每个组随时间的各个肿瘤测量值。
图59E-59H.肿瘤浸润淋巴细胞-淋巴样小组。最后剂量(剂量#6)后第3天即在第24天从用mIgG 2a(30mg/kg)、Ab No.245.2-LALA(30mg/kg)和AbNo.245.2(30mg/kg)(n＝3)处理的hVISTA KI C57B/6小鼠收获肿瘤。使用Miltenyi肿瘤解离试剂盒(目录号130-096-730)和octoMACS解离肿瘤。然后将细胞用淋巴样小组染色，然后用Biolegend RBS裂解缓冲液(目录号420301)裂解RBC，并在Attune Nxt仪器上经由流式细胞术进行分析。
图60A-60D.抗VISTA抗体编号245.2在人VISTA KI小鼠的E.G7-OVA肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。向VISTA KI小鼠皮下注射1x106个E.G7-OVA细胞，并在肿瘤体积达到大约70mm3后将其随机分配。通过每周两次腹膜内(IP)注射30mg/kg对照抗体(小鼠IgG2a)、30mg/kg的抗体编号245.2或30mg/kg的抗体编号245.2LALA处理小鼠，总共六个剂量。使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：“V＝(L x Wx W)/2”，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤大小)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤大小)。图60A示出了IgG2a对照(正方形)、245.2(空心圆)和245.2LALA(实心圆)的平均肿瘤体积±SEM。图60B-60D示出了每只动物和每个组随时间的各个肿瘤测量值。
具体实施方式
本文提供了与VISTA特异性结合的抗体及其抗原结合片段，所述抗体和片段在本文中也分别称为“抗VISTA抗体”和“抗VISTA抗原结合片段”。如本文所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体及其抗原结合片段的上下文中可互换使用，是指抗体和抗原结合片段经由抗体的抗原结合位点与抗原结合，如本领域技术人员将理解的，并且不排除抗体或抗原结合片段与其他抗原的交叉反应性。例如，本文提供的抗体或其抗原结合片段可与人VISTA和食蟹猴VISTA两者免疫特异性结合，但不与小鼠VISTA免疫特异性结合。本领域已知的任何方法都可以用于确定是否发生与VISTA的免疫特异性结合。
本文所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选地是单克隆抗体。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是免疫球蛋白、包含两条重链和两条轻链的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体、单链Fv(scFv)或二硫键连接的Fv。出于本公开的目的，scFv应被认为是抗原结合片段，因为scFv包含VH和VL结构域(通过接头连接)。
在某些实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是二价的。在某些实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是多特异性的或双特异性的。在某些实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是双特异性单克隆抗体。在某些实施方案中，本文所述的抗体是单价的。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是二价的。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是单特异性的。在某些实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是重组产生的。在某些实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是纯化的。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是合成抗体。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是人抗体。在某些实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是鼠抗体。
在本发明的抗体的一个具体实施方案中，抗体是免疫球蛋白。本文所述的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgW或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)。在某些实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是IgG抗体或其类别或亚类。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是单克隆抗体。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是IgG抗体。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是IgG1抗体。在另一个具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是IgG2抗体。在另一个具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是IgG3抗体。在另一个具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体是IgG4抗体。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是通过重链和轻链的缔合或通过重链可变区和轻链可变区的缔合形成的。
抗原结合片段与抗原结合并且包含抗体分子的被框架区包围的部分，所述部分包含赋予抗体分子对抗原的特异性的氨基酸残基(例如，互补决定区(CDR))。CDR可以来源于任何动物物种，诸如例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)、鸡、牛、骆驼和人。通过实例的方式，抗原结合片段包括Fab片段、F(ab′)2片段和本文所述的任何抗体的其他抗原结合片段。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用并且是本领域常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般是轻链或重链的一部分，所述部分在抗体之间的序列上有很大不同，并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中在CDR中，而可变结构域中更高度保守的区域称为构架区。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。
CDR在本领域中以各种方式定义，包括Kabat、Chothia、AbM、contact、IMGT和Paratome编号系统。本领域已知的任何CDR编号系统都可以用于定义本文所公开的抗VISTA抗体的CDR。Kabat编号系统基于序列可变性并且是预测CDR区最常用的定义(Kabat,ElvinA.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest.Bethesda:NationalInstitutes of Health,1983)。Chothia编号系统基于结构环区域的位置(Chothia等人,(1987)J Mol Biol 196:901-917)。AbM编号系统是Kabat与Chothia编号系统之间的折衷方案，是Oxford Molecular Group开发的一套完整的抗体结构建模程序(Martin ACR等人,(1989)PNAS 86:9268-9272)。contact编号系统基于对可用的复杂晶体结构的分析(bioinf.org.uk/abs)(参见MacCallum RM等人,(1996)J Mol Biol 5:732-745)。IMGT编号系统来自IMGT(“the international ImMunoGeneTics information/>网站imgt.org，创始人兼董事：Marie-Paule Lefranc,Montpellier,France)。Paratome编号系统基于一组共有区域预测抗体的抗原结合区域，这些共有区域来源于一组非冗余的所有已知抗体-抗原复合物的结构比对。该算法基于以下前提：绝大多数抗原结合残基位于抗体之间的结构共有区域中，这些区域在抗体序列中形成六个大致对应于六个CDR的序列段(参见Kunit等人,Nucleic Acids Research,2012,第40卷,Web Server issue W521-W524)。
本公开不仅提供了包含本文所公开的序列的抗体和抗原结合片段和其他主题(例如，scFv、CDR、可变区等)，而且提供了由本文所公开的序列组成或基本上由本文所公开的序列组成的抗体和抗原结合片段和其他主题。
在另一方面，本文提供了多特异性抗体和异源缀合抗体。在具体实施方案中，本文提供了一种包含两个不同的抗原结合区的双特异性抗体，其中结合区中的一个结合VISTA，并且包含本文所述的抗体的可变重链区、可变轻链区或两者，并且另一个结合区与不同的感兴趣的抗原结合。在具体方面，本文提供了一种包含两个不同抗原结合区的双特异性抗体，其中结合区中的一个与VISTA特异性结合，并且另一个结合区与另一个感兴趣的抗原结合，并且其中与VISTA特异性结合的结合区是本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在具体方面，本文提供了一种包含第一可变区和第二可变区的双特异性抗体，所述第一可变区含有与VISTA特异性结合的两个抗原结合位点(即，其是二价的)，并且所述第二可变区含有与不同抗原特异性结合的两个结合位点(即，其是二价的)，其中第一和第二可变区通过Fc片段连接；在该方面的一个具体实施方案中，可变区各自是Fab区。
在特定实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体或三特异性抗体。在具体实施方案中，本文提供了一种包含两个不同抗原结合区的双特异性抗体，其中结合区中的一个与VISTA特异性结合，并且另一个结合区与另一个感兴趣的抗原结合，并且其中与VISTA特异性结合的结合区包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的可变重链区。在具体实施方案中，本文提供了一种包含两个不同抗原结合区的双特异性抗体，其中结合区中的一个与VISTA特异性结合，并且另一个结合区与另一个感兴趣的抗原结合，并且其中与VISTA特异性结合的结合区包含表7中示出的抗体的VH和任选的VL。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种包含两个不同抗原结合区的双特异性抗体，其中结合区中的一个与VISTA特异性结合，并且另一个结合区与另一个感兴趣的抗原结合，并且其中与VISTA特异性结合的结合区包含表7中示出的抗体的VH和表8中示出的相同抗体的VL。在一个实施方案中，与VISTA特异性结合的结合区是scFv。在某些实施方案中，本文所述的双特异性抗体的其他结合区所结合的感兴趣的抗原是存在于免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或树突细胞)上的抗原。在具体实施方案中，本文提供的抗体是双特异性T细胞接合物(BiTE)。已经描述了若干不同形式的多特异性抗体，参见例如Brinkman和Kontermann,MABS2017,9(2):182-212。
本文还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段。在具体实施方案中，融合蛋白包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段的VH和VL。本文还提供了包含scFv的融合蛋白，所述scFv包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段。在具体实施方案中，scFv包含被接头序列分开的VH和VL，其中VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，VH CDR1具有选自由表1-3组成的组的表中示出的SEQ ID NO:作为所述表中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3。在具体实施方案中，scFv包含被接头序列分开的VH和VL，其中(i)VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，VH CDR1具有选自由表1-3组成的组的表中示出的SEQ ID NO:作为所述表中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3，并且(ii)VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且其中VL CDR1具有选自由表4-6组成的组的表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR1，并且VL CDR2具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR2，并且VL CDR3具有所述表中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR3，其中VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3均由相同的CDR编号系统定义。在特定实施方案中，scFv包含VH和VL，其中VH包含表7中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH。在特定实施方案中，scFv包含VH和VL，其中(i)VH包含表7中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH，并且(ii)VL包含表8中示出的SEQ IDNO:作为所述抗体的VL。
本文还提供了一种包含scFv的嵌合抗原受体(CAR)，所述scFv包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段；以及一种含有编码CAR的核酸的细胞，包括表达CAR的细胞。在具体实施方案中，细胞含有编码CAR的重组核酸，使得细胞表达CAR。在具体实施方案中，细胞是离体的。
已经在本领域中描述了“第一代”、“第二代”和“第三代”CAR的结构(参见例如Jensen等人,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe等人,Dis.Model Mech.8(4):337-350(2015)；Brentjens等人,Clin.Cancer Res.13:5426-5435(2007)；Gade等人,CancerRes.65:9080-9088(2005)；Maher等人,Nat.Biotechnol.20:70-75(2002)；Kershaw等人,J.Immunol.173:2143-2150(2004)；Sadelain等人,Curr.Opin.Immunol.21(2):215-223(2009)；Hollyman等人,J.Immunother.32:169-180(2009))。
在具体实施方案中，CAR是“第一代”CAR，其包含与跨膜结构域融合的本文所述的与VISTA特异性结合的细胞外抗原结合片段(例如，本文所述的与VISTA特异性结合的scFv)，所述跨膜结构域与T细胞受体复合链的细胞质/细胞内结构域融合。在具体实施方案中，细胞质结构域是CD3ζ链的细胞内结构域。
在具体实施方案中，CAR是“第二代”CAR，其包含与跨膜结构域融合的本文所述的与VISTA特异性结合的抗原结合片段(例如，本文所述的与VISTA特异性结合的scFv)，所述跨膜结构域与共刺激结构域融合以增强免疫细胞(例如，T细胞)的效力和持久性，所述共刺激结构域与可以活化免疫细胞的细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ链的细胞内结构域)融合(参见Sadelain等人,Cancer Discov.3:388-398(2013))。“第二代”CAR的共刺激结构域可以是来自各种共刺激分子中的任一种的细胞内结构域，例如CD28、4-IBB、ICOS或OX40的共刺激结构域。因此，“第二代”CAR提供共刺激(例如，通过CD28或4-IBB细胞内结构域)和活化(例如，通过CD3ζ信号传导结构域)两者。
“第三代”CAR包含第二代CAR的结构，但具有多个(例如，两个)共刺激结构域。因此，第三代CAR提供多重共刺激(例如，通过包含CD28和4-1BB细胞内结构域两者)和活化(例如，通过包含CD3ζ活化结构域)。
在具体实施方案中，本发明的CAR包含如上所述的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域是包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段的scFv。在具体实施方案中，细胞内结构域是CD3ζ信号传导结构域。
在具体实施方案中，包含CAR的细胞是T细胞。在其他具体实施方案中，包含CAR的细胞是自然杀伤(NK)细胞。在其他具体实施方案中，包含CAR的细胞是巨噬细胞。已经描述了可表达CAR的细胞的实例，参见例如Basar等人,Hematology 2020ASH EducationProgram第570-578页；Villanueva 2020,Nat.Rev.Drug Discov.第20卷:300；Mukhopadhyay 2020；Nat.Methods第17卷:561；Anderson等人,2017,Cancer Res(2020年11月17日在线发布)；Cortez-Selva等人,2021,Trends in Pharmacological Sciences 42(1):45-59；Klichinsky等人,2020,Nat.Biotech.38:947-959；Vacca等人,2020,Front.Immunol.10:3013doi:10.3389/fimmu.2019.03013；以及Xie等人,2020,EBioMedicine 59:102975。
本文还提供了一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与治疗剂结合(例如，共价结合)的本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段或scFv。在具体实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂。在具体实施方案中，本文提供了一种包含融合蛋白的抗体-药物缀合物，所述融合蛋白包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段。
在另一个具体实施方案中，提供了抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与标记或显像剂结合的本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段或scFv，用于通过接触离体细胞样品(例如，活检肿瘤样品)或向患者施用抗体并经由标记或显像剂检测结合来检测和/或测量和/或定位体内或离体(例如，来自患者的活检肿瘤样品中)VISTA水平。在具体实施方案中，这种方法用于通过确定患者的癌症呈VISTA阳性或以期望水平表达VISTA来确定患者是否适合用本发明的抗VISTA抗体和抗原结合片段和抗体-药物缀合物(与治疗剂结合)进行癌症治疗。
1.1抗体
对于本公开中用于鉴定特定抗体的每个抗体编号(每个相应的“抗体[或Ab]编号”)，抗体编号中句号后的数字表示抗体的IgG类别。因此，例如，AbNo.173.1是IgG1抗体，而Ab No.173.4是IgG4抗体。
序列和变体
下表1-表6中提供了如使用不同编号系统(Kabat、IMGT和Paratome)定义的于VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VH CDR和VL CDR。下表1-表3提供了如使用可与表4-表6中的VL CDR组合的不同系统定义的VH CDR。在具体实施方案中，表1中一种抗体(例如，抗体编号269.1)的VH CDR与表4中相同抗体(例如，269.1)的VL CDR组合。在具体实施方案中，表2中一种抗体(例如，抗体编号269.1)的VH CDR与表5中相同抗体(例如，抗体编号269.1)的VL CDR组合。在具体实施方案中，表3中一种抗体(例如，抗体编号269.1)的VHCDR与表6中相同抗体(例如，抗体编号269.1)的VL CDR组合。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表1中示出的SEQ ID NO:作为表1中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表1中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表1中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3。在特定实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中(i)VH包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表1中示出的SEQ ID NO:作为表1中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表1中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表1中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3，并且(ii)VL包含VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且其中VL CDR1具有表4中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR1，并且VL CDR2具有表4中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR2，并且VL CDR3具有表4中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表2中示出的SEQ ID NO:作为表2中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表2中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表2中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3。在特定实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中(i)VH包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表2中示出的SEQ ID NO:作为表2中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表2中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表2中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3，并且(ii)VL包含VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且其中VL CDR1具有表5中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR1，并且VL CDR2具有表5中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR2，并且VL CDR3具有表5中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR3。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中(i)VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，并且其中VH CDR1具有表3中示出的SEQ ID NO:作为表3中列出的抗体编号的VH CDR1，并且VH CDR2具有表3中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR2，并且VH CDR3具有表3中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH CDR3，并且(ii)VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，并且其中VL CDR1具有表6中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR1，并且VL CDR2具有表6中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VLCDR2，并且VL CDR3具有表6中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL CDR3。
表1：如Kabat编号系统所定义的VH CDR。
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表2：如IMGT编号系统所定义的VH CDR。
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表3：如Paratome编号系统所定义的VH CDR。
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表4：如Kabat编号系统所定义的VL CDR。
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表5：如IMGT编号系统所定义的VL CDR。
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表6：如Paratome编号系统所定义的VL CDR。
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本文还提供了一种包含VH和VL的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段，其中VH包含表7中示出的SEQ ID NO:中的任一个的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3作为抗体的VH。在具体实施方案中，VH CDR由Kabat编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由Chothia编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由AbM编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由IMGT编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由Paratome编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由Contact编号系统定义。
在特定实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其中VH包含表7中示出的SEQ ID NO:中的任一个的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3作为抗体的VH，并且VL包含表8中示出的SEQ ID NO:的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3作为所述抗体的VL。在具体实施方案中，VH CDR由Kabat编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由Chothia编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由AbM编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由IMGT编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由Paratome编号系统定义。在具体实施方案中，VH CDR由Contact编号系统定义。
本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段的CDR可例如通过在一个或多个CDR中引入一个或多个突变来修饰。此类突变可例如改变抗体或其抗原结合片段在一定pH值下的结合亲和力，并因此影响抗体的生物半衰期。因此，重新设计在内化后与内体中的VISTA的结合亲和力降低的抗体可以减少抗体耗尽并增加半衰期。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在中性pH下比在酸性pH下以更高的亲和力(即，在酸性pH下结合亲和力降低)与VISTA结合。与在酸性pH下不表现出降低的结合亲和力的抗体相比，在酸性pH下结合亲和力降低的抗VISTA抗体可以具有各种改善/增强的生物学特性。例如，在具体实施方案中，与在酸性pH下不表现出降低的结合亲和力的抗VISTA抗体相比，在酸性pH下结合亲和力降低的本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段可以在循环中具有更长的半衰期。在具体实施方案中，在酸性pH下具有降低的结合亲和力的本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段可以比缺乏pH依赖性结合的抗VISTA抗体更慢地从循环中清除。较慢的抗体清除(即，较长的循环半衰期)应与延长的生物活性相关。因此，在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段可以较低频率地和/或以较低剂量施用于受试者，并且仍然将表现出与在酸性pH下不具有降低的结合亲和力的抗体等同(或更好)的功效。
不希望受理论或机制的束缚，据信与中性pH相比，在酸性pH下结合亲和力较低的抗VISTA抗体在内体的酸性环境中从抗原解离并且再循环至血浆，在血浆中它们经历额外轮次的治疗性抗原结合。对在抗体的Fc区中结合的新生儿Fc受体(FcRn)进行修饰(例如，修饰，例如下文所述的那些)连同在抗原结合区中引入组氨酸开关可以产生在细胞表面以高亲和力与VISTA结合、在运输至酸性内体环境时从VISTA解离并且被FcRn受体捕获并再循环至细胞外空间的抗体。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在轻链CDR或重链CDR中出现的任何Y、D、E、N或Q氨基酸中包含一个或多个组氨酸取代。在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在轻链CDR或重链CDR中出现的Y、D、E、N或Q氨基酸中包含一个组氨酸取代。在特定实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含如表1、表2或表3中示出的抗体编号474.1的VH CDR和如表4、表5或表6中示出的抗体编号474.1的VL CDR，除了在VL CDR中具有一个或多个组氨酸取代，所述组氨酸取代可选自Y31H(例如，如存在于抗体编号373.1中)、Y32H(例如，如存在于抗体编号467.1中)、D50H(例如，如存在于抗体编号908.1中)、N53H(例如，如存在于抗体编号386.1中)、Q89H(例如，如存在于抗体编号268.1中)、Q90H(例如，如存在于抗体编号342.1中)和N93H(例如，如存在于抗体编号259.1中)，它们各自根据Kabat编号系统编号。
在特定实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含如表1、表2或表3中示出的抗体编号474.1的VH CDR和如表4、表5或表6中示出的抗体编号474.1的VL CDR，除了在VH CDR中具有一个或多个组氨酸取代，所述组氨酸取代可选自Y32H(例如，如存在于抗体编号338.1中)、Y33H(例如，如存在于抗体编号419.1中)、Y50H(例如，如存在于抗体编号277.1中)、Y52H(例如，如存在于抗体编号946.1中)、Y53H(例如，如存在于抗体编号322.1中)、N58H(例如，如存在于抗体编号346.1中)、Y59H(例如，如存在于抗体编号304.1中)、N60H(例如，如存在于抗体编号814.1中)、D95H(例如，如存在于抗体编号210.1中)和D101H(例如，如存在于抗体编号460.1中)，它们各自根据Kabat编号系统编号。
在特定实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含如表1、表2或表3中示出的抗体编号173.1的VH CDR和如表4、表5或表6中示出的抗体编号173.1的VL CDR，除了在VL CDR中具有一个或多个组氨酸取代，所述组氨酸取代可选自D47H(例如，如存在于抗体编号374.1中)、D69H(例如，如存在于抗体编号394.1中)、D111H(例如，如存在于抗体编号213.1中)和E74H(例如，如存在于抗体编号219.1中)，它们各自根据Kabat编号系统编号。
在某些方面，本文所述的抗体可通过指定其单独的VH结构域或其单独的VL结构域或者VH或VL的三个CDR的集合来描述。参见例如Clackson T等人,(1991)Nature 352:624-628(其通过引用整体并入本文)描述了通过使用特异性VH结构域(或VL结构域)产生结合特异性抗原的抗体并筛选互补可变结构域的文库的方法。还可参见Kim SJ&Hong HJ,(2007)JMicrobiol45:572-577(其通过引用整体并入本文)描述了通过使用特异性VH结构域产生结合特异性抗原的抗体并筛选互补VL结构域的文库(例如，人VL文库)的方法；所选择的VL结构域又可以用于指导另外的互补(例如，人)VH结构域的选择。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH，其中VH包含表7中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VL，其中VL包含表8中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH，其中VH包含表7中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH以及VL。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中(i)VH包含表7中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VH，并且(ii)VL包含表8中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体的VL。
在某些实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH与表7中示出的VH的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在某些实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH与表7中示出的VH的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在某些实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VL与表8中示出的VL的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在某些实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL与表8中示出的VL的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
在某些实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中(i)VL与表7中示出的抗体的VH的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，并且(ii)VL与表8中示出的所述抗体的VL的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在某些实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH与表7中示出的抗体的VH的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，并且(ii)VL与表8中示出的所述抗体的VL具有至少95％序列同一性。
表7：抗体可变重链序列
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表8：可变轻链序列
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在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中轻链具有表9中示出的SEQ ID NO:作为表9中列出的抗体编号的轻链，并且重链具有表9中示出的SEQ ID NO:作为所述抗体(例如，抗体编号269.1、抗体编号321.1、抗体编号245.1、抗体编号465.1、抗体编号457.1、抗体编号173.1、抗体编号833.1、抗体编号245.4、抗体编号465.4、抗体编号173.4、抗体编号245.2、抗体编号289.1或抗体编号420.1)的重链。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链与作为表9中列出的抗体编号的重链的表9中示出的SEQ ID NO:具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中轻链与作为表9中列出的抗体编号的轻链的表9中示出的SEQ ID NO:具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，并且重链与作为所述抗体的重链的表9中示出的SEQ ID NO:具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链与作为表9中列出的抗体编号的重链的表9中示出的SEQ ID NO:具有至少95％序列同一性。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中轻链与作为表9中列出的抗体编号的轻链的表9中示出的SEQ ID NO:具有至少95％序列同一性，并且重链与作为所述抗体的重链的表9中示出的SEQ ID NO:具有至少95％序列同一性。
两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比的确定可以使用本领域已知的数学算法来完成。两个序列之间的同一性百分比可以在允许或不允许缺口的情况下来确定。在计算同一性百分比时，通常只对完全匹配进行计数。用于比较两个序列的数学算法的具体非限制性实例是Karlin S&Altschul SF(1990)PNAS 87:2264-2268的算法，如在Karlin S&Altsc hul SF(1993)PNAS 90:5873-5877中进行修改。这种算法被结合到Altschu l SF等人,(1990)J Mol Biol 215:403的NBLAST和XBLAST程序中。BL AST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序进行，并且蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用Gapped BLAST和/或PSI BLAST，如Altschul SF等人,(1997)Nuc Acids Res 25:3389 3402中所述。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如万维网上的国家生物技术信息中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。
表9：抗体重链和轻链序列
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在具体方面，本文提供了一种与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含抗体重链和/或轻链，例如单独的重链、单独的轻链或者重链和轻链两者。关于轻链，在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的轻链是κ轻链。在另一个具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的轻链是λ轻链。在又一个具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的轻链是人κ轻链或人λ轻链。
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”是可互换的并且具有它们在本领域中常见的含义。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合但可以表现出各种效应子功能(诸如例如在重链的情况下与Fc受体相互作用)的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。免疫球蛋白分子的恒定区相对于免疫球蛋白可变结构域具有更保守的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链包含VL和人κ或λ轻链恒定区，其中VL包含表8中示出的序列。已经在本领域中描述了人恒定区序列的非限制性实例，例如参见Kabat EA等人,(1991)。
关于重链，在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的重链可以是人α、δ、ε、γ或μ重链。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含重链和可变重链区(VH)，其中重链包含本文所述或本领域已知的恒定区或其部分(例如，CH1、CH2或CH3或它们的组合)，其中VH包含表7中示出的序列。在具体实施方案中，恒定区是人γ重链。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含含有本文所述的任何氨基酸序列的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中恒定区包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgW或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段包含IgG恒定区，例如表10中示出的IgG1、IgG2或IgG4恒定区。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgW或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的恒定区。
表10：示例性恒定区
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在一个实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中重链包含(a)表7中示出的抗体的VH和(b)包含人IgG的恒定结构域的氨基酸序列的恒定重链结构域。
在另一个特定实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中(i)重链包含(a)表7中示出的抗体的VH和(b)包含人IgG的恒定结构域的氨基酸序列的恒定重链结构域；并且(ii)轻链包含表8中示出的相同抗体的VL和(b)包含人κ轻链的恒定结构域的氨基酸序列的恒定轻链结构域。
Fc区和变体Fc区
在具体实施方案中，本文所述的抗体包含Fc区。在具体实施方案中，本文所述的抗体包含人IgG1的Fc区。在具体实施方案中，Fc区是人Fc区。在另一个具体实施方案中，人Fc区属于人IgG1或人IgG2或人IgG4。在另一个具体实施方案中，Fc区是相对于天然人Fc区在Fc区中包含一个或多个突变(例如，一个、两个、三个、四个或五个氨基酸突变)的变体人Fc区。在具体实施方案中，一个或多个突变是插入、取代和/或缺失。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在其恒定区中仅具有本公开中指定的相对于野生型恒定区的特定氨基酸突变或氨基酸突变的特定组合中的一种，并且相对于野生型恒定区不含有其他氨基酸突变。在另一个具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在其恒定区中包含本公开中指定的相对于野生型恒定区的特定氨基酸突变或氨基酸突变的特定组合，并且相对于野生型恒定区具有不超过总共七个(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个)氨基酸突变。
因此，在其中Fc区相对于天然人Fc区在Fc区中包含一个、两个、三个、四个或五个氨基酸突变的一个具体实施方案中，突变独立地选自由一个氨基酸的缺失、一个氨基酸的取代或一个氨基酸的插入组成的组，并且在具体实施方案中可以是本文所述的任何突变。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型/类别的重链恒定区。在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型/类别的人Fc区。在特定实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或抗原结合片段的恒定区相对于天然恒定区包含一个、两个、三个、四个或五个氨基酸突变。在本发明的抗VISTA抗体和抗原结合片段的具体实施方案中，抗体包含Fc区或Fc区的变体；任选地其中Fc区是人Fc区或相对于天然人Fc区在Fc区中具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸突变的人Fc区变体，和/或任选地其中人Fc区属于人IgG1、人IgG2或人IgG4，进一步任选地其中抗体包含人IgG1或人IgG4的恒定区或者相对于天然恒定区在恒定区中具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸突变的恒定区变体。
在某些实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸取代)引入本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的Fc区中以改变抗体的一种或多种功能特性。
在具体实施方案中，将一个、两个或更多个突变(例如，氨基酸取代)引入本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的Fc区和/或铰链区中。与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的Fc区中的突变可改变抗体对Fc受体和/或补体受体的亲和力。用于将此类突变引入Fc受体或其片段中的技术是本领域技术人员已知的。在例如SmithP等人,(2012)Proc.Natl.Acad.Sci 109:6181-6186、美国专利号6,737,056以及国际公开号WO 02/060919、WO 98/23289和WO 97/34631中描述了与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的Fc受体中的突变的实例，可以进行这些突变以改变抗体或其抗原结合片段对Fc受体的亲和力。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含表10中示出的恒定区。不希望受理论的束缚，抗体的恒定区有助于重链的序列变异。重链的可变区与重链恒定区重组以产生全长重链(Dreyer,W.J.和J.C.Bennett Proc.Natl.Acad.Sci.USA 54(1965)864-869)。抗体的同种型可以不同，这取决于α、μ、γ、ε或δ恒定区基因片段是否与可变区重组(Kataoka,T.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)919-923)。在人γ基因片段中，有4个不同的亚类，命名为γ1、2、3和4，它们彼此大约90％相同。这些不同的同种型或亚类中的任一种可与本文所述的抗体的可变区连接以产生全长重链，所述全长重链然后可以与互补轻链配对以产生本发明的抗体。
对于本文提供的抗体的抗体工程化，抗体的Fc和铰链区的序列变化和/或翻译后修饰允许人们操纵给定抗体或抗体样蛋白的效应子功能和循环(Presta,L.G.Curr.Opin.Immunol.20(2008)460-470)。除了序列变异之外，Fc区还在残基297(EU编号系统)处含有N连接的糖基化位点，所述残基对于Fc结构和功能是很重要的(Dwek,R.R.等人,J.Anat.187(1995)279-292)，并且可以突变为例如丙氨酸或甘氨酸或谷氨酸，以破坏糖基化位点，从而影响抗体的特性。
N297处存在的聚糖通常由两个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、三个甘露糖和另外两个与甘露糖连接形成双触角复合聚糖的GlcNAc组成(Liu,L.J.Pharm Sci.104(2015)1866-84)。两个GlcNAc通过与甘露糖的α-3或α-6的β1,2键与甘露糖连接。因此，聚糖的每个臂可以被区分为α1,3或α1,6臂，这取决于甘露糖和GlcNAc2的连接方式(Liu,L.J.Pharm Sci.104(2015)1866-84)。可以将另外的岩藻糖、半乳糖、唾液酸和GlcNAc添加到核心聚糖结构中，并且聚糖组合物对FcγR结合具有直接影响。
例如，当表达IgG时，表达β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III会产生在N297处糖基化的抗体，所述抗体具有双触角聚糖并且具有更好的ADCC活性(Umana,P.等人,Nat.Biotech.17(1999)176-180)。据报道，岩藻糖含量降低的抗体对Fc受体(诸如例如，FcγRIIIa)具有增加的亲和力。已经显示岩藻糖缺陷的抗体与FcγRIIIa的结合高50倍且ADCC活性增强(Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740)。N297的半乳糖基化增强C1q结合和CDC活性(Dekkers,G.等人,Front.Immunol.8(2017)877)。可以对本发明的抗体进行N297糖基化的任何这些操纵。
在具体实施方案中，本文所述的抗体介导ADCC、ADCP和/或CDC。抗体的Fc区中的突变可增强效应子功能，诸如例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)(Saunders,K.O.Front.Immunol.10(2019)1-20)。
突变的某些组合增加对FcγRIIIa、FcγRIIa和/或FcγRIa的亲和力并增强ADCC和/或ADCP，并且可以存在于本文提供的抗VISTA抗体和抗原结合片段中。可以存在于本文提供的抗VISTA抗体和抗原结合片段中的增加对FcγRIIIa和/或FcγRIIa的亲和力并增强ADCC和/或ADCP的突变的组合的实例包括以下中的任一种：(1)S298A、E333A和K334A的组合；(2)S239D、A330L和I332E的组合；(3)S239D和I332E的组合；(4)G236A、S239D、A330L和I332E的组合；(5)S239D、I332E和G236A的组合；以及(6)L234Y、G236W和S298A的组合；其中残基使用EU编号系统编号。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”，也称为“EU索引”(即，在Kabat等人,1991,National Institutes of Health(U.S.)Office of the Director,Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版,DIANE Publishing:Collingdale,PA1991)中报告的EU索引)。
某些突变或突变的组合增加C1q结合和CDC，并且可以存在于本文提供的抗VISTA抗体和抗原结合片段中。可以存在于本文提供的抗VISTA抗体和抗原结合片段中的增加C1q结合和CDC的突变或突变的组合的实例包括以下中的任一种：(1)K326A和E333A的组合；(2)K326M和E333S的组合；(3)C221D和D222C的组合；(4)S267E、H268F和S324T的组合；(5)H268F和S324T的组合；以及(6)E345R；其中残基使用EU编号系统编号。
体内IgG分解代谢通过IgG与新生儿Fc受体(FcRn)的相互作用来调节(SockoloskyJ.T.等人,Adv.Drug Deliv.Rev.91(2015)109-124)。IgG被细胞内吞，在细胞中它可以穿梭到溶酶体或再循环回细胞表面(Roopenian,D.C.和Akilesh,S.Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725)。在内体中的低pH(pH<6.5)下IgG与FcRn的结合允许抗体与FcRn一起运输回细胞表面。在pH<6.5下与FcRn的结合不良会导致抗体被运输至溶酶体并被降解。在细胞外环境的生理pH下，IgG对FcRn的亲和力较弱，这会导致其从FcRn释放回到循环中。因此，可以存在于本文提供的抗VISTA抗体和抗原结合片段中的突变可在pH<6.5下增加FcRn结合并因此增加抗体再循环并改善PK。
可以存在于本文提供的抗VISTA抗体和抗原结合片段中的增加FcRn结合并因此增加抗体半衰期的突变和突变的组合的实例包括以下中的任一种：(1)R435H；(2)N434A；(3)M252Y、S254T和T256E的组合；(4)M428L和N434S的组合；(5)E294缺失、T307P和N434Y的组合；(6)T256N、A378V、S383N和N434Y的组合；以及(7)E294的缺失，其中残基使用EU编号系统编号。
减少Fc受体结合、补体受体结合或抗体效应子功能的突变也可能是期望的并且可存在于本文提供的抗VISTA抗体和抗原结合片段中。此类突变可减少由抗体或抗原结合片段介导的炎症和细胞杀伤。可以存在于本文提供的抗VISTA抗体和抗原结合片段中的减少与FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或C1q的结合、从而减少ADCC、ADCP和/或CDC的突变和突变的组合的实例包括以下中的任一种：(1)L235E；(2)L234A和L235A的组合；(3)S228P和L235E的组合(该组合称为SPLE突变，其中S228P突变避免类别转换为IgG4；参见Schlothauer等人,Protein Eng Des Sel(2016)29:457-466)；(4)L234A、L235A和P329G的组合；(5)P331S、L234E和L235F的组合；(6)D265A；(7)G237A；(8)E318A；(9)E233P；(10)G236R和L328R的组合；(11)H268Q、V309L、A330S和P331S的组合；(12)L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S和P331S的组合；(13)L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S和P331S中的任一个、两个、三个、四个、五个或六个；(14)A330L；(15)D270A；(16)K322A；(17)P329A；(18)P331A；(19)V264A；(20)F241A、N297A、N297G、N297E；以及(21)S228P、F234A和L235A的组合；其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1，其中Fc区相对于天然人Fc区在Fc区中具有一个或多个氨基酸突变，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸突变，所述氨基酸突变选自由以下组成的组：C220D、D221C、E233P、L234A、L234E、L234Y、L235A、L235E、L235F、G236A、G236W、G236R、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、A330L、A330S、P331A、P331S、I332E、E333A、E333S、K334A、A378V、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG2，其中Fc区相对于天然人Fc区在Fc区中具有一个或多个氨基酸突变，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸突变，所述氨基酸突变选自由以下组成的组：C220D、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、V309L、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、A330L、A330S、P331A、P331S、I332E、E333A、E333S、K334A、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区在Fc区中具有一个或多个氨基酸突变，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸突变，所述氨基酸突变选自由以下组成的组：S228P、E233P、F234A、L235A、L235E、L235F、G236A、G236W、G236R、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、V309L、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、I332E、E333A、E333S、K334A、A378V、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1，其中Fc区相对于天然人Fc区具有一个或多个氨基酸突变，并且其中突变是L234A和L235A，以及任选地P329G，其中残基使用EU编号系统编号。在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1，其中Fc区相对于天然人Fc区具有一个或多个氨基酸突变，并且其中突变是F234A和L235A，以及任选地P329G，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1、IgG2或IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有一个或多个氨基酸突变，并且其中突变是M252Y、S254T和T256E，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1、IgG2或IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有一个或多个氨基酸突变，并且其中突变是M428L和N434S，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有一个或多个氨基酸突变，并且其中突变是S228P和L235E，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有一个或多个氨基酸突变，并且其中突变是S228P、M252Y、S254T和T256E，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有一个或多个氨基酸突变，并且其中突变是S228P、M428L和N434S，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1，其中Fc区相对于天然人Fc区具有1-10个氨基酸突变，并且其中突变包含L234A和L235A，以及任选地P329G，其中残基使用EU编号系统编号。在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1，其中Fc区相对于天然人Fc区具有1-10个氨基酸突变，并且其中突变包含F234A和L235A，以及任选地P329G，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1、IgG2或IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有1-10个氨基酸突变，并且其中突变包含M252Y、S254T和T256E，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG1、IgG2或IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有1-10个氨基酸突变，并且其中突变包含突变M428L和N434S，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有1-10个氨基酸突变，并且其中突变包含S228P和L235E，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有1-10个氨基酸突变，并且其中突变包含S228P、M252Y、S254T和T256E，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含人Fc区的变体，其中人Fc区属于人IgG4，其中Fc区相对于天然人Fc区具有1-10个氨基酸突变，并且其中突变包含S228P、M428L和N434S，其中残基使用EU编号系统编号。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体包含糖基化恒定区。在具体实施方案中，抗体包含非糖基化恒定区。因此，在某些实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体具有降低的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体是混合同种型抗体，即含有来源于两种或更多种不同同种型的重链恒定区的抗体。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体包含附接至抗体的IgG-Fc的Asn 297(如通过EU编号系统所确定)的双触角聚糖(GlcNAc2Man3GlcNAc2)。在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体是去糖基化抗体、无岩藻糖基化抗体或半乳糖基化抗体。
在具体实施方案中，与不包含本文所述的一个或多个氨基酸取代的抗体相比，本文提供的与VISTA特异性结合并且包含所述一个或多个氨基酸突变的抗体减少靶介导的药物处置，例如受体介导的内吞作用，随后是溶酶体降解。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体表现出与VISTA的pH依赖性结合。
在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含前述段落中所述的组氨酸突变中的任一种与所述恒定区的任何突变(包括增加或减少与Fc受体或C1q受体的结合的突变)的组合。在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含在酸性pH下增强靶标解离的组氨酸取代和增强FcRn结合的突变。
结合特性
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段与人VISTA(例如，由编码SEQ ID NO:377的核酸表达)、特别是缺乏信号序列的成熟人VISTA结合。成熟人VISTA是SEQ ID NO:377的氨基酸33-311，它缺乏作为SEQ ID NO:377的氨基酸1-32的信号序列。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段与人VISTA的细胞外结构域(ECD)(例如，SEQ ID NO:378的氨基酸33-194)结合。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段与人VISTA和食蟹猴VISTA(例如，由编码SEQ ID NO:380的核酸表达或以其他方式缺乏信号序列的成熟猴VISTA)两者结合。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段不与小鼠VISTA(例如，由编码SEQ ID NO:369的核酸表达或以其他方式缺乏信号序列的成熟小鼠VISTA)结合。VISTA的示例性序列在下表11中示出，其中信号序列加下划线并以粗体显示。
表11：示例性VISTA序列
在某些实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段以约0.5nM至约1nM、约1nM至约1.5nM、约1.5nM至约2nM、约2nM至约2.5nM、约2.5nM至约3nM、约3nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约20nM或约20nM至约100nM的KD与人VISTA的ECD结合，如通过生物层干涉测量法所确定。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段以约0.5nM至约1nM、约1nM至约1.5nM、约1.5nM至约2nM、约2nM至约2.5nM、约2.5nM至约3nM、约3nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约20nM或约20nM至约100nM的KD与食蟹猴VISTA的ECD结合，如通过生物层干涉测量法所确定。
亲和力可以以本领域已知的多种方式来测量和/或表达，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD可以通过本领域普通技术人员已知的技术来确定，诸如例如生物层干涉测量法或表面等离子共振，例如下面所述的方法。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段以约0.5nM、约0.9nM、约1.6nM、约1.7nM、约2.1nM、约2.7nM、约3.2nM、约4.2nM、约5.5nM或约11.7nM的半有效浓度(EC50)与人VISTA结合，如通过ELISA所测量。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段以约0.05nM、约0.06nM、约0.09nM、约0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.6nM、约0.8nM或约1.2nM的EC50与细胞表面上的人VISTA结合。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段不与B7-1(也称为CD80)、B7-2(也称为CD86)、B7-H2(也称为ICOS配体)、B7-H1(也称为PD-L1或CD274)、B7-DC(也称为PD-L2或CD273)、B7-H4(也称为B7S1)和/或B7-H3(也称为CD276)结合。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段阻断V-set和含Ig结构域蛋白3(VSIG3)与VISTA之间的相互作用。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段阻断VISTA二聚化或另一种同型相互作用。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段阻断P选择素蛋白糖蛋白配体1(PSGL1)与VISTA之间的相互作用。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段阻断V-set含Ig结构域蛋白8(VSIG 8)与VISTA之间的相互作用。在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段阻断富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域蛋白1(LRIG1)与VISTA之间的相互作用。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段结合VISTA的含有序列66HLHHG70(SEQ ID NO:377的氨基酸98-102)或116VVEIRHHHSEHR127(SEQ ID NO:377的氨基酸148-159)(其中VISTA残基的编号从信号肽之后的第一个氨基酸开始)的表位。VISTA的信号序列在表11中为粗体并加下划线。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与人VISTA的包含SEQ ID NO:377的酪氨酸37、精氨酸54、缬氨酸117和精氨酸127的表位结合。
在具体实施方案中，本文提供了与本文所述的抗体结合VISTA的相同或重叠表位的抗体及其抗原结合片段。如本文所用，“表位”是根据其在本领域中已知的含义使用的术语，并且是指抗体可以经由其抗原结合结构域特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可以例如来自一个或多个多肽的两个或更多个非连续区域(构象、非线性、不连续或非连续表位)。
与本文所述的抗体结合VISTA的相同或重叠表位的抗体或其抗原结合片段可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。人源化抗体一般包含人恒定区和包含人框架区的可变区，但CDR是非人物种(例如，鼠CDR)。嵌合抗体一般包含人来源的恒定区和非人物种的可变区(例如，鼠可变区)。
在某些实施方案中，抗体的表位可以通过例如NMR光谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、氢/氘交换与质谱联用(例如，MALDI质谱)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)或通过下述方法来确定。对于X射线晶体学，结晶可以使用本领域已知的任何方法来完成(例如,GiegéR等人,(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；ChayenNE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。抗体:抗原晶体可使用熟知的X射线衍射技术来研究，并且可使用计算机软件来精炼，诸如例如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations,Inc.发行；参见例如MethEnzymol(1985)第114&115卷,Wyckoff HW等人编辑；美国专利申请号2004/0014194)，以及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr DBiol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,Carter CW编辑；Roversi P等人,(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)。诱变作图研究可使用本领域技术人员已知的任何方法来完成。参见例如Champe M等人,(1995)和Cunningham BC&Wells JA(1989)关于诱变技术(包括丙氨酸扫描诱变技术)的描述。
与本文所述抗体识别并结合VISTA的相同或重叠表位的抗体也可以使用常规技术(诸如例如免疫测定，例如通过显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，即竞争结合测定)来鉴定。竞争结合测定也可以用于确定两种抗体是否对表位具有相似的结合特异性。竞争结合可以在其中待测免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原(诸如例如VISTA)的特异性结合的测定中确定。许多类型的竞争结合测定是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli C等人,(1983)Methods Enzymol 9:242-253)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见KirklandTN等人,(1986)J Immunol 137:3614-9)、固相直接标记的测定、固相直接标记的夹心测定(参见Harlow E&Lane D,(1988)Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborPress)、使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel GA等人,(1988)Mol Immunol 25(1):7-15)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung RC等人,(1990)Virology 176:546-52)、直接标记的RIA(Moldenhauer G等人,(1990)Scand J Immunol 32:77-82)，以及通过生物层干涉测量法(“BLI”)，例如Octet Red 96(ForteBio)系统上的BLI。通常，这种测定涉及使用与固体表面或者携带这些、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中的任一种的细胞结合的纯化抗原(例如，VISTA)。竞争抑制可以通过在测试免疫球蛋白存在下确定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。竞争结合测定可以使用标记的抗原或标记的抗体以大量不同的形式来配置。在该测定的常见版本中，将抗原固定在96孔板上。然后使用放射性或酶标记来测量未标记抗体阻断标记抗体与抗原结合的能力。有关更多细节，参见例如Wagener C等人,(1983)J Immunol 130:2308-2315；Wagener C等人,(1984)J ImmunolMethods 68:269-274；Kuroki M等人,(1990)Cancer Res 50:4872-4879；Kuroki M等人,(1992)Immunol Invest21:523-538；Kuroki M等人,(1992)Hybridoma 11:391-407以及Antibodies:ALaboratory Manual,Ed Harlow E&Lane D编辑(同上),第386-389页。
在某些方面，竞争结合测定可以用于确定抗体是否被另一抗体例如以剂量依赖性方式竞争性阻断。在具体实施方案中，竞争性结合测定是竞争性ELISA，其可以使用标记的抗原或标记的抗体以多种不同的形式来配置。在一个特定实施方案中，抗体可以用本文所述的抗体在竞争结合测定中测试。
在具体实施方案中，本文提供了与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争(例如，以剂量依赖性方式)结合VISTA的抗体，如使用本领域技术人员已知或本文所述的任何测定(例如，ELISA竞争测定、BLI(例如，Octet Red 96(ForteBio)系统上的BLI或表面等离振子共振))所确定。在具体实施方案中，本文提供了竞争性抑制(例如，以剂量依赖性方式)本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段与VISTA结合的抗体，如使用本领域技术人员已知或本文所述的任何测定(例如，ELISA竞争测定、悬浮阵列、BLI(例如，Octet Red 96(ForteBio)系统上的BLI或表面等离振子共振))所确定。
在某些实施方案中，本文提供了一种与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的抗体，其程度与本文所述的抗体自身竞争结合VISTA的程度相同。在某些实施方案中，本文提供了与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的第一抗体，其中竞争表现为第一抗体与VISTA的结合减少超过80％(例如，85％、90％、95％或98％，或者80％至85％、80％至90％、85％至90％或85％至95％)。
与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的抗体或其抗原结合片段可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在具体方面，本文提供了一种与包含表7中示出的抗体的VH和表8中示出的相同抗体的VL的抗体竞争(例如，以剂量依赖性方式)特异性结合VISTA的抗体。在具体实施方案中，本文提供了一种与包含表9中示出的抗体的轻链和表9中示出的相同抗体的重链的免疫球蛋白竞争(例如，以剂量依赖性方式)特异性结合VISTA的抗体。
在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段与包含表7中示出的抗体的VH和表8中示出的相同抗体的VL的抗体的相同或重叠表位特异性结合。本领域技术人员已知或本文所述的测定(例如，X射线晶体学、ELISA测定等)可以用于确定两种抗体是否与相同表位结合。
在某些实施方案中，与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的抗体或其抗原结合片段或者与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的相同或重叠表位结合的抗体或其抗原结合片段以约0.5nM至约1nM、约1nM至约1.5nM、约1.5nM至约2nM、约2nM至约2.5nM、约2.5nM至约3nM、约3nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约20nM或约20nM至约100nM的KD与人VISTA的ECD结合，如通过生物层干涉测量法或本领域已知的另一种方法所确定。
在具体实施方案中，与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的抗体或其抗原结合片段或者与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的相同或重叠表位结合的抗体或其抗原结合片段以约0.5nM至约1nM、约1nM至约1.5nM、约1.5nM至约2nM、约2nM至约2.5nM、约2.5nM至约3nM、约3nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约20nM或约20nM至约100nM的KD与食蟹猴VISTA的ECD结合，如通过生物层干涉测量法所确定。
在具体实施方案中，与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的抗体或其抗原结合片段或者与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的相同或重叠表位结合的抗体或其抗原结合片段以约0.5nM、约0.9nM、约1.6nM、约1.7nM、约2.1nM、约2.7nM、约3.2nM、约4.2nM、约5.5nM或约11.7nM的半有效浓度(EC50)与人VISTA结合，如通过ELISA所测量。
在具体实施方案中，与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的抗体或其抗原结合片段或者与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的相同或重叠表位结合的抗体或其抗原结合片段以约0.05nM、约0.06nM、约0.09nM、约0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.6nM、约0.8nM或约1.2nM的EC50与细胞表面上的人VISTA结合。
在具体实施方案中，与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的本文所述的抗体或其抗原结合片段或者与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的相同或重叠表位结合的抗体或其抗原结合片段阻断不与B7-1(也称为CD80)、B7-2(也称为CD86)、B7-H2(也称为ICOS配体)、B7-H1(也称为PD-L1或CD274)、B7-DC(也称为PD-L2或CD273)、B7-H4(也称为B7S1)和/或B7-H3(也称为CD276)结合。
在具体实施方案中，与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段竞争结合VISTA的本文所述的抗体或其抗原结合片段或者与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的相同或重叠表位结合的抗体或其抗原结合片段阻断VSIG3与VISTA之间的相互作用。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段阻断VISTA二聚化或其他同型相互作用。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段阻断PSGL1与VISTA之间的相互作用。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段阻断VSIG8与VISTA之间的相互作用。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段阻断LRIG1与VISTA之间的相互作用。
如本文所用，术语“约”当用于修饰数值或数值范围时，表示高于该值或范围5％至10％和低于该值或范围5％至10％的偏差保持在所列举的值或范围的预期含义内。
功能特性
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段增加人T细胞活化。人T细胞活化可通过本领域已知或本文所述的任何测定法(例如，下文所述的SEB诱导的人T细胞活化测定法)来测定。在某些实施方案中，与IgG1或IgG4对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使人T细胞活化增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％或约200％。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段降低VISTA介导的T细胞抑制。VISTA介导的T细胞抑制可使用本领域已知或本文所述的任何测定法(例如，通过使用ELISA测量IFNγ产生，或通过测量T细胞增殖，如下所述)来测定。在特定实施方案中，如通过T细胞增殖所确定的，与IgG1对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使VISTA介导的T细胞抑制降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290或约300％。
在其他特定实施方案中，如通过IFNγ产生所确定的，与IgG1或IgG4对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使VISTA介导的T细胞抑制降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290或约300％。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段活化单核细胞。单核细胞活化可以使用本领域已知或本文所述的任何测定法(例如，通过测量CD14+细胞的表面上HLA-DR、CD80和/或CD86的水平，或者通过测量CXCL10趋化因子分泌，如下所述)来确定。在特定实施方案中，与IgG1或IgG4对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使CD14+单核细胞上HLA-DR的表达增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290或约300％。在具体实施方案中，HLA-DR表达的增加是NK细胞依赖性的。
在特定实施方案中，与IgG1或IgG4对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使CD14+单核细胞上CD80的表达增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290或约300％。在具体实施方案中，CD80表达是NK细胞依赖性的。
在特定实施方案中，与IgG1或IgG4对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使CD14+单核细胞上CD86的表达增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290或约300％。
在具体实施方案中，与IgG1或IgG4对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使CXCL10的分泌增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％或约500％。在具体实施方案中，CXCL10分泌是NK细胞依赖性的。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段影响细胞因子诱导的骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)活化。MDSC的活性可以使用本领域已知或本文所述的任何测定法(例如，通过流式细胞术测量MDSC抑制抗CD3诱导的T细胞增殖的能力和/或通过ELISA测量IFNγ产生，如下所述)来确定。
在具体实施方案中，如通过T细胞增殖所确定的，与IgG1对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使MDSC介导的T细胞抑制降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％或约200％。
在特定实施方案中，如通过IFNγ分泌所确定的，与IgG1对照相比，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段使MDSC介导的T细胞抑制降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％或约500％。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。ADCC可通过本领域已知或本文所述的任何测定法(例如，通过测量针对表达人VISTA的Raji细胞的ADCC，如下所述)来确定。在特定实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段以约1-5ng/mL、约5-10ng/mL、约10-15ng/mL、约15-20ng/mL或约20-25ng/mL的半最大有效浓度(EC50)或者以约10.78ng/mL、约5.24ng/mL、约5.75ng/mL、约15.7ng/mL、约7.94ng/mL、约8.5ng/mL、约15.6ng/mL或约22.1ng/mL的EC50诱导ADCC。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在癌症的体内模型中抑制肿瘤形成或肿瘤生长。在具体实施方案中，癌症的体内模型是人VISTA敲入(“hVISTA KI”)小鼠、MC38小鼠模型、MB49小鼠模型或EG7小鼠模型。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在结直肠癌的MC38小鼠模型中抑制肿瘤形成或肿瘤生长。用于确定MC38小鼠模型中的肿瘤形成抑制的示例性方案在下文示出。在特定实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在MC38小鼠模型中显示出比小鼠IgG2a对照更大的肿瘤生长抑制。在其他特定实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在MC38小鼠模型中显示出比抗PD-1抗体照更大的肿瘤生长抑制。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在膀胱癌的MB49小鼠模型中抑制肿瘤生长。用于确定MB49小鼠模型中的肿瘤形成抑制的示例性方案在下文示出。在特定实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在MB49小鼠模型中显示出比小鼠IgG2a对照更大的肿瘤生长抑制。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在胸腺瘤的EG7小鼠模型中抑制肿瘤生长。用于确定EG7小鼠模型中的肿瘤形成抑制的示例性方案在下文示出。在特定实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在EG7小鼠模型中显示出比小鼠IgG2a对照更大的肿瘤生长抑制。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在hVISTA KI小鼠中腹膜内注射10mg/kg后具有约9小时的消除半衰期。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段在hVISTA KI小鼠中腹膜内注射30mg/kg或100mg/kg后具有约33小时的消除半衰期。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段调节血液中的骨髓细胞活化标记。骨髓活化标记包括例如CD80、CD86、HLA-DR，并且可通过本领域已知或本文所述的任何测定法(例如，通过流式细胞术测量骨髓树突细胞(mDC)或单核细胞上CD80、CD86、HLA-DR的表达，如下所述)来测量。
1.2抗体产生
产生和筛选抗体
在另一方面，本文提供了产生本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法。
本文所述的抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法(例如，通过化学合成或通过重组表达技术)产生。除非另有说明，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术内相关领域中的常规技术。这些技术在例如本文引用的参考文献中描述并且在文献中充分解释。参见例如Maniatis T等人,(1982)MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人,(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press；Sambrook J等人,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987年和年度更新版)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987年和年度更新版)Gait(编辑)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；Eckstein(编辑)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press；Birren B等人(编辑)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press。
在具体实施方案中，本文所述的抗体是通过涉及例如经由DNA序列的合成、基因工程化进行产生的任何手段制备、表达、产生或分离的抗体(例如，重组抗体)。在某些实施方案中，这种抗体包含由在动物或哺乳动物(例如，人)体内的抗体种系库内不天然存在的DNA序列编码的序列。在具体实施方案中，本文所述的抗体通过包括使用成熟人VISTA(SEQ IDNO:377的氨基酸33-311)或其细胞外结构域(SEQ ID NO:378)作为免疫原的方法来制备。
在某一方面，本文提供了一种制备与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养本文所述的细胞或宿主细胞。在某一方面，本文提供了一种制备与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如，包含编码本文所述的抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如，重组表达)抗体或其抗原结合片段。在一个特定实施方案中，细胞是分离或离体的细胞。在一个特定实施方案中，已经将外源多核苷酸引入细胞中。在一个特定实施方案中，方法还包括纯化从细胞或宿主细胞获得的抗体或其抗原结合片段的步骤。
用于产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见例如Short Protocols inMolecular Biology,(2002)第5版,Ausubel FM等人编辑,John Wiley and Sons,New York中的第11章)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的各种各样的技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或它们的组合。例如，单克隆抗体可以由外源表达本文所述的抗体或其片段(例如，这种抗体的轻链和/或重链)的宿主细胞重组产生。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第5版,Ausubel FM等人编辑(同上)中的第11章)。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来产生，包括本领域已知和例如在以下文献中所教导的那些：Harlow E&Lane D,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；HammerlingGJ等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563 681(Elsevier,N.Y.,1981)；以及Kohler G&Milstein C(1975)Nature 256:495。使用杂交瘤技术产生并筛选特异性抗体的方法是常规的并且是本领域熟知的。在具体实施方案中，可以用抗原(例如，人)免疫小鼠(或其他动物，诸如例如大鼠、猴、驴、猪、绵羊、仓鼠、牛、骆驼、鸡或狗)，并且一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对抗原特异的抗体，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如，来自可从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得的细胞系SP2/0的细胞)融合，以形成杂交瘤。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。将如此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使它们在其中生长，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对VISTA的单克隆抗体的产生。鉴定产生具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过标准方法(Goding JW(编辑),Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(同上))对克隆进行亚克隆、使其生长并将其从培养基中分离出来。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过本领域已知的方法来确定，例如免疫沉淀或通过体外结合测定，诸如例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。
在具体实施方案中，本文公开了由单个细胞(例如，单个B细胞、杂交瘤或产生重组抗体的宿主细胞)产生的单克隆抗体，其中抗体与VISTA免疫特异性结合，如例如通过ELISA或者本领域已知或如本文所述的其他抗原结合或竞争结合测定所确定。在某些实施方案中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如，二价)抗体。在特定实施方案中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如，双特异性抗体或三特异性抗体)。在具体实施方案中，本文提供的抗体是双特异性T细胞接合物(BiTE)。在一些实施方案中，本文提供的抗体是三特异性杀伤剂接合物(TriKE)。
识别VISTA的抗体片段可以通过本领域技术人员已知的任何技术来产生。例如，本文所述的Fab和F(ab′)2片段可以通过使用酶(诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段))对免疫球蛋白分子进行蛋白水解裂解来产生。Fab片段对应于抗体分子的两个相同臂中的一个并且含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab′)2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原结合臂。
此外，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。特别地，编码VH和VL结构域的DNA序列从动物cDNA文库(例如，受影响组织的人或鼠cDNA文库)扩增。编码VH和VL结构域的DNA通过PCR与scFv接头重组在一起并克隆到噬菌粒载体中。将载体电穿孔到大肠杆菌(E.coli)细胞中，并用辅助噬菌体感染大肠杆菌。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。表达与特定抗原结合的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原(例如，使用标记的抗原或者结合或捕获到固体表面或珠上的抗原)进行选择或鉴定。可以用于制备本文所述的抗体的噬菌体展示方法的实例包括以下文献中公开的那些：Brinkman U等人,(1995)J Immunol Methods 182:41-50；Ames RS等人,(1995)J Immunol Methods 184:177-186；Kettleborough CA等人,(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic L等人,(1997)Gene 187:9-18；Burton DR&Barbas CF(1994)Advan Immunol 57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/001134；国际公开号WO90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
如上述参考文献所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并将其用于产生完整抗体，包括人源化抗体、嵌合抗体或任何其他期望的抗原结合片段，并使其在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下所述)中表达。重组产生抗体片段(诸如例如Fab、Fab'和F(ab′)2片段)的技术也可以使用本领域已知的方法(诸如例如以下文献中公开的那些：PCT公开号WO 92/22324；Mullinax RL等人,(1992)BioTechniques 12(6):864-9；Sawai H等人,(1995)Am J Reprod Immunol 34:26-34；以及Better M等人,(1988)Science 240:1041-1043)来采用。
在一个方面，为了产生完整抗体，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧接序列的PCR引物从模板(例如，scFv克隆)中扩增VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达轻链恒定区(例如，人κ或λ恒定区)的载体中。也可以将VH和VL结构域克隆到表达必需恒定区的一个载体中。然后使用本领域技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
单结构域抗体(例如，缺乏轻链的抗体)可以通过本领域熟知的方法来产生。参见Riechmann L&Muyldermans S(1999)J Immunol 231:25-38；Nuttall SD等人,(2000)CurrPharm Biotechnol 1(3):253-263；Muyldermans S,(2001)JBiotechnol 74(4):277-302；美国专利号6,005,079；以及国际公开号WO 94/04678、WO 94/25591和WO 01/44301。
此外，与VISTA抗原免疫特异性结合的抗体又可以用于使用本领域技术人员熟知的技术产生“模拟”抗原的抗独特型抗体(参见例如Greenspan NS&Bona CA(1989)FASEB J7(5):437-444；以及Nissinoff A(1991)J Immunol147(8):2429-2438)。
可以使用本领域已知的任何方法来产生人抗体。例如，可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。特别地，可以随机或通过同源重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物引入小鼠胚胎干细胞中。替代性地，除了人重链和轻链基因外，还可以将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以通过同源重组与人免疫球蛋白位点的引入分开或同时变得无功能。特别地，JH区的纯合缺失阻止内源性抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞并将其显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后使嵌合小鼠繁殖以产生表达人抗体的纯合后代。以正常方式用选择的抗原(例如，全部或部分抗原(例如，VISTA，或VISTA的ECD，或编码VISTA的DNA))免疫转基因小鼠。可以使用单个B细胞或杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类别转换重组和体细胞超突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于用于产生人抗体的这种技术的概述，参见例如Lonberg N&Huszar D(1995)Int Rev Immunol 13:65-93。对于用于产生人抗体和人单克隆抗体的这种技术以及用于产生此类抗体的方案的详细讨论，参见例如国际公开号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598。能够产生人抗体的小鼠的实例包括小鼠(在例如美国专利号10,881,084和10,793,829中描述)、XenomouseTM(Abgenix,Inc.；美国专利号6,075,181和6,150,184)、HuAb-MouseTM(Medarex,Inc./Gen Pharm；美国专利号5,545,806和5,569,825)、Trans Chromo MouseTM(Kirin)和KM MouseTM(Medarex/Kirin)。
与VISTA特异性结合的人抗体可以通过本领域已知的多种方法来制备，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的上述噬菌体展示方法。还可参见美国专利号4,444,887、4,716,111和5,885,793；以及国际公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
在具体实施方案中，可以使用小鼠-人杂交瘤来产生人抗体。例如，可以将用爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合以产生分泌人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，并且可以筛选这些小鼠-人杂交瘤以确定分泌与靶抗原(例如，人VISTA或人VISTA的ECD)免疫特异性结合的人单克隆抗体的杂交瘤。此类方法是已知的并且在本领域中描述，参见例如Shinmoto H等人,(2004)Cytotechnology 46:19-23；NaganawaY等人,(2005)Human Antibodies 14:27-31。
在具体实施方案中，筛选和选择本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法如本文所述。
一旦产生本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法(例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法(特别是通过用于蛋白A后的特异性抗原的亲和色谱法)和分级柱色谱法)、离心、差异溶解度)或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术对其进行纯化。此外，本文所述的抗体可以与本文所述或本领域在其他方面已知的异源多肽序列融合，以便于纯化。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是分离的或纯化的。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段基本上不含与分离的抗体具有不同抗原特异性的其他抗体。例如，在一个特定实施方案中，本文所述的抗体的制剂基本上不含细胞物质和/或化学前体。语言“基本上不含细胞物质”包括抗体制剂，其中抗体与从中分离或重组产生抗体的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)和/或抗体的变体(例如，抗体的不同翻译后修饰形式或抗体的其他不同版本(例如，抗体片段))的抗体制剂。当重组产生抗体时，其一般也基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂的体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成产生抗体时，其一般基本上不含化学前体或其他化学物质，即，其与参与蛋白质的合成的化学前体或其他化学物质分离，以及与错误折叠的蛋白质和其他前体分离。因此，此类抗体制剂具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的除感兴趣的抗体以外的化学前体或化合物。
1.3多核苷酸
在某些方面，本文提供了一种或多种包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的一种或多种核苷酸序列的多核苷酸(或核酸分子)以及载体，例如包含此类多核苷酸以用于在宿主细胞(例如，大肠杆菌和哺乳动物细胞)中高效表达的载体，以及含有和任选地表达此类抗体或抗原结合片段的离体宿主细胞。在具体实施方案中，多核苷酸是分离的或纯化的。
在具体实施方案中，多核苷酸或核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源(例如，小鼠或人)中的其他核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，核酸分子(诸如例如cDNA分子)当通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或当化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学物质。例如，语言“基本上不含”包括具有少于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％的其他物质(例如，细胞物质、培养基、其他核酸分子、化学前体和/或其他化学物质)的多核苷酸或核酸分子制剂。
在特定方面中，本文提供了包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸，所述抗体或其抗原结合片段包含如本文所述的氨基酸序列；以及与此类抗体竞争结合VISTA多肽(例如，以剂量依赖性方式)或者结合与此类抗体的表位相同或重叠的表位的抗体。
在某些方面，本文提供了包含编码本文所述的抗体的轻链和/或重链的核苷酸序列的多核苷酸。
在具体实施方案中，多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VH(例如，表7中示出的抗体的VH)的核苷酸序列。在具体实施方案中，多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VL(例如，表8中示出的抗体的VL)的核苷酸序列。在具体实施方案中，多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VH和VL(例如，表7中示出的抗体的VH和表8中示出的相同抗体的VL)的核苷酸序列。在具体实施方案中，VH和VL可以由单独的多核苷酸编码。
在具体方面，本文提供了一种包含编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸，所述抗体包含轻链和重链，例如单独的轻链和重链。在具体实施方案中，轻链和重链可以由单独的多核苷酸编码。关于轻链，在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码本文所述的抗体的核苷酸序列，所述抗体包含人κ轻链或人λ轻链。
在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码抗体的重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含表12中示出的序列。在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码抗体的轻链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含表13中示出的序列。
在具体实施方案中，多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VH(例如，表7中示出的抗体的VH)和人重链恒定区(例如，人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区)的核苷酸序列。在具体实施方案中，多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VL(例如，表8中示出的抗体的VL)和人轻链恒定区(例如，人κ轻链或人λ轻链恒定区)的核苷酸序列。
在具体实施方案中，一种或多种多核苷酸包含(i)编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VH(例如，表7中示出的抗体的VH)和人重链恒定区(例如，人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区)的核苷酸序列；以及(ii)编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VL(例如，表8中示出的抗体的VL)和人轻链恒定区(例如，人κ轻链或人λ轻链恒定区)的核苷酸序列。在特定实施方案中，本文提供的一种或多种多核苷酸包含编码与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含表12中示出的序列和表13中示出的相同抗体的序列。
表12：编码抗体重链的核苷酸序列。
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表13：编码抗体轻链的核苷酸序列。
在某些实施方案中，多核苷酸、核酸或核苷酸包括脱氧核糖核酸、核糖核酸、核糖核苷酸以及它们的聚合形式。在具体实施方案中，多核苷酸、核酸或核苷酸是单链的或双链的。在具体实施方案中，多核苷酸、核酸或核苷酸序列是cDNA序列。
在具体实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法对本文所述的编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列(例如，核酸序列)进行密码子优化。在某些实施方案中，编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段(例如，VH结构域和/或VL结构域)的优化多核苷酸序列可以与编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段(例如，VH结构域和/或VL结构域)的未优化多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸杂交。在具体实施方案中，编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的优化核苷酸序列在高严格条件下与编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的未优化多核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在具体实施方案中，编码与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的优化核苷酸序列在高严格、中等严格或较低严格杂交条件下与编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的未优化核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。已经描述了关于杂交条件的信息，参见例如美国专利申请公开号US2005/0048549(例如，段落72-73)，其通过引用并入本文。
可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。可以使用本领域熟知的方法来确定编码本文所述的抗体的核苷酸序列和这些抗体的修饰版本，即以产生编码抗体的核酸序列的方式组装已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子。这种编码抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier G等人,(1994),BioTechniques 17:242-6中所述)，简言之，其涉及含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、那些寡核苷酸的退火和连接、然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
替代性地，编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可以使用本领域熟知的方法(例如，PCR和其他分子克隆方法)由来自合适来源(例如，杂交瘤或来自免疫转基因小鼠的B细胞)的核酸产生。例如，使用可与已知序列的3'和5'端杂交的合成引物的PCR扩增可以使用从产生感兴趣的抗体的杂交瘤细胞或B细胞获得的基因组DNA进行。此类PCR扩增方法可以用于获得包含编码与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的序列的核酸。此类PCR扩增方法可以用于获得包含编码与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中，用于在宿主细胞中表达和进一步克隆。
如果含有编码特定抗体的核酸序列的克隆不可获得，但抗体分子的序列是已知的，则可以通过使用可与序列的3'和5'端杂交的合成引物进行PCR扩增或通过使用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针进行克隆来鉴定例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆来化学合成或从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞(诸如例如，选择表达本文所述的抗体的杂交瘤细胞)产生的cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞分离的核酸、优选poly A+RNA)获得编码免疫球蛋白的核酸。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中。
可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离编码与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的DNA并对其进行测序。杂交瘤细胞或分离的B细胞可以充当这种DNA的来源。一旦分离，就可以将DNA置于表达载体中，然后将所述表达载体转染到宿主细胞(诸如例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHOGS SystemTM(Lonza)或系统(Sigma)的CHO细胞)、293F细胞、HEK293细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中实现与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的合成。
为了产生完整抗体，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧接序列的PCR引物来扩增scFv克隆中的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区(例如，人γ1恒定区或人γ4恒定区)的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达轻链恒定区(例如，人κ或λ恒定区)的载体中。在某些实施方案中，用于表达VH或VL结构域的载体包含启动子、分泌信号、可变结构域的克隆位点、恒定结构域和选择标记。可用于产生本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的示例性信号序列是MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:360)。也可以将VH和VL结构域克隆到表达必需恒定区的一个载体中。然后使用本领域技术人员已知的技术将包含编码VH和/或VL的核苷酸序列的载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
也可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代任何鼠或其他非人序列或者通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到抗体(例如，免疫球蛋白)编码序列来修饰DNA。
还提供了多核苷酸，所述多核苷酸包括在高严格、中等严格或较低严格杂交条件下与编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸杂交的引物。
杂交条件已在本领域中描述并且是本领域技术人员已知的。例如，在严格条件下杂交可以涉及在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2xSSC/0.1％ SDS中洗涤一次或多次；在高度严格条件下杂交可以涉及在约45℃下在6xSSC中与滤膜结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1xSSC/0.2％ SDS中洗涤一次或多次。在其他严格杂交条件下杂交是本领域技术人员已知的并且已有描述，参见例如Ausubel FM等人(编辑),(1989)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,GreenPublishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,New York,第6.3.1-6.3.6和2.10.3页。
1.4细胞和载体
在某些方面，本文提供了包含多核苷酸的载体(例如，表达载体)，用于在宿主细胞、优选哺乳动物细胞中重组表达，所述多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。表达载体可以是例如质粒或病毒载体(诸如例如新城疫病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等)。本文还提供了包含此类载体的离体宿主细胞，用于重组表达本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段(例如，全长抗体、抗体的重链和/或轻链或本文所述的单链抗体)的重组表达涉及含有编码抗体的多核苷酸的表达载体的构建。一旦获得编码本文所述的抗体分子、抗体的重链和/或轻链或其抗原结合片段(例如，重链和/或轻链可变区)的多核苷酸，就可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有与VISTA编码核苷酸序列特异性结合的抗体或其抗原结合片段(例如，轻链或重链或两者)的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建含有抗体或抗体片段(例如，轻链或重链或两者)编码序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了可复制载体，所述可复制载体包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段、本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链或者本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链可变结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接到启动子。此类载体可以例如包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公开号WO86/05807和WO 89/01036；以及美国专利号5,122,464)，并且可以将抗体的可变结构域克隆到这种载体中以表达完整重链、完整轻链或完整重链和轻链两者。
可以通过常规技术将表达载体转移到细胞(例如，宿主细胞)，然后可以通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段。因此，本文提供了含有多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或者其重链或轻链或者其片段，或者本文所述的与VISTA特异性结合的单链抗体或其抗原结合片段，所述多核苷酸可操作地连接到启动子以在宿主细胞中表达此类序列。宿主细胞可以是适于表达的任何类型的细胞，例如原代细胞、培养的细胞或来自细胞系的细胞。
多种宿主表达载体系统可以用于表达本文所述的抗体分子。此类宿主表达系统代表可以产生感兴趣的编码序列并随后对其进行纯化的媒介物，但也代表当用适当的核苷酸编码序列转导或转染时可以原位表达本文所述的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，诸如例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如，绿藻，诸如例如莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii))；或者携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS(例如，COS1或COS)、CHO、CHO GS系统、系统、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、293F、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)。在具体实施方案中，用于表达本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的细胞是CHO细胞或HEK 293细胞。在一个特定实施方案中，用于表达本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的细胞是人细胞，例如人细胞系。在特定实施方案中，特别是用于表达完整重组抗体分子的细菌细胞(诸如例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，哺乳动物细胞)用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞(诸如例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)与载体(诸如例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)结合是有效的抗体表达系统(Foecking MK&Hofstetter H(1986)Gene 45:101-5；以及Cockett MI等人,(1990)Biotechnology 8(7):662-7)。在某些实施方案中，本文所述的抗体由CHO细胞、HEK 293细胞或NS0细胞产生。在具体实施方案中，编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的表达受组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节。
在细菌系统中，可以根据预期用于所表达的抗体分子的用途来有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这种抗体时，为了产生抗体分子的药物组合物，指导容易纯化的高水平融合蛋白产物表达的载体可能是期望的。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U&Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2:1791-1794)，其中抗体编码序列可以单独连接到具有lac Z编码区的框架中的载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(InouyeS&Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13:3101-3109；Van Heeke G&Schuster SM(1989)JBiol Chem 24:5503-5509)；等等。例如，pGEX载体也可以用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。一般来讲，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附和结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠、随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解细胞中纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，加州拟金缘夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)例如可以用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将感兴趣的抗体编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联体前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区域(例如，区域El或E3)中插入将产生活的并且能够在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan J&Shenk T(1984)Proc.Natl.Acad.Sci USA 81(12):3655-9)。插入的抗体编码序列的高效翻译也需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框同相，以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成的多种来源。表达的效率可以通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强(参见例如Bitter G等人,(1987)Methods Enzymol.153:516-544)。
另外，可以选择调节插入序列的表达或以期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有适当加工初级转录物、糖基化和基因产物磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH3T3、W138、293F、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HEK293、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。
在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段具有降低的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。此类抗体可以使用本领域技术人员已知的技术来产生。例如，抗体可以在缺少或缺乏岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一个具体实例中，具有α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因的敲除的细胞系可以用于产生具有降低的岩藻糖含量的抗体或其抗原结合片段。系统(Lonza)是可以用于产生具有降低的岩藻糖含量的抗体或其抗原结合片段的这种系统的实例。
为了长期高产率地产生重组蛋白，可以产生稳定的表达细胞。例如，可以工程化稳定表达本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的细胞系。在具体实施方案中，本文提供的细胞稳定地表达缔合以形成本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的轻链/轻链可变结构域和重链/重链可变结构域。
在某些方面，不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA以及选择标记转化宿主细胞。引入外源DNA/多核苷酸后，可以使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换为选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长形成转化灶，所述转化灶又可以被克隆并扩增到细胞系中。此类工程化细胞系在筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的组合物中可能特别有用。
可以使用许多选择系统，包括但不限于可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人,(1977)Cell 11(1):223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska EH&Szybalski W(1962)PNAS 48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy I等人,(1980)Cell 22(3):817-23)基因。而且，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler M等人,(1980)PNAS 77(6):3567-70；O'Hare K等人,(1981)PNAS 78:1527-31)；gpt，其赋予对麦考酚酸的抗性(Mulligan RC&Berg P(1981)PNAS 78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Wu GY&Wu CH(1991)Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev P(1993)Ann Rev PharmacolToxicol 32:573-596；Mulligan RC(1993)Science 260:926-932；以及Morgan RA&Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62:191-217；Nabel GJ&Felgner PL(1993)TrendsBiotechnol 11(5):211-5)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre RF等人,(1984)Gene 30(1-3):147-56)。可以常规应用重组DNA技术领域中通常已知的方法来选择期望的重组克隆，并且此类方法描述于例如Ausubel FM等人(编辑),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler M,Gene Transfer andExpression,ALaboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；以及Dracopoli NC等人(编辑),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994),第12和13章；Colbère-Garapin F等人,(1981)J Mol Biol 150:1-14，这些文献通过引用整体并入本文。
可以通过载体扩增来增加抗体分子的表达水平(有关综述，参见Bebbington CR&Hentschel CCG,The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(AcademicPress,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数量。由于扩增区域与抗体基因缔合，因此抗体的产生也将增加(Crouse GF等人,(1983)Mol Cell Biol 3:257-66)。
可以用本文所述的两种或更多种表达载体共转染宿主细胞，第一种载体编码重链来源的多肽，并且第二种载体编码轻链来源的多肽。两种载体可以含有相同的选择标记，这使得重链和轻链多肽能够同等表达。
在具体方面，本文提供的宿主细胞包含载体，其中载体包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的可变轻链区(VL)的核苷酸序列和编码抗体的可变重链区(VH)的核苷酸序列。
在另一个具体方面，本文提供了含有一种或多种多核苷酸的离体细胞，所述多核苷酸各自包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。在具体实施方案中，离体细胞含有多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VH(例如，表7中示出的抗体的VH)的核苷酸序列。在具体实施方案中，离体细胞含有多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VL(例如，表8中示出的抗体的VL)的核苷酸序列。在具体实施方案中，离体细胞含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VH(例如，表7中示出的抗体的VH)，并且所述第二多核苷酸包含编码如表8中示出的相同抗体或其抗原结合片段的VL的核苷酸序列。
替代性地，可以使用编码并能够表达本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链多肽两者的单个载体。在这种表达载体中，两种基因的转录可以由共同启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以由帽依赖性扫描机制驱动，并且来自第二基因的mRNA的翻译可以由非帽依赖性机制(例如，由IRES)驱动。
在另一个具体方面，本文提供了含有一种或多种多核苷酸的离体细胞，所述多核苷酸各自包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的核苷酸序列。在具体实施方案中，离体细胞含有多核苷酸，所述多核苷酸包含表12中示出的核苷酸序列。在具体实施方案中，离体细胞含有多核苷酸，所述多核苷酸包含表13中示出的核苷酸序列。在具体实施方案中，离体细胞含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包含表12中示出的编码抗体的重链的核苷酸序列，并且所述第二多核苷酸包含表13中示出的编码相同抗体的轻链的核苷酸序列。在具体实施方案中，使用本领域已知的技术在产生由本文所述的宿主细胞(例如，离体宿主细胞)中所含的多核苷酸序列编码的抗体或其抗原结合片段的条件下培养宿主细胞。在某些实施方案中，使用本领域已知的技术从宿主细胞中分离或纯化抗体或其抗原结合片段。
1.5药物组合物
本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含(a)本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段以及(b)药学上可接受的载剂。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段是纯化的。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段以治疗有效量存在于所述药物组合物中。
在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段是纯化的。
本文还提供了包含本文所述的多核苷酸或载体以及药学上可接受的载剂的药物组合物。
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物包含(a)本文所述的抗体-药物缀合物(例如，包含与治疗剂结合的本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段)以及(b)药学上可接受的载剂。在具体实施方案中，抗体-药物缀合物以治疗有效量存在于药物组合物中。
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物包含(a)与VISTA和另一感兴趣的抗原(例如，如本文所述)结合的双特异性抗体或多特异性抗体以及(b)药学上可接受的载剂。在具体实施方案中，双特异性抗体是纯化的。在具体实施方案中，双特异性抗体以治疗有效量存在于所述药物组合物中。
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物包含(a)表达CAR的细胞和(b)药学上可接受的载剂，所述CAR包含scFv，所述scFv包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的VH和VL。
可接受的载剂(其可以是赋形剂或稳定剂)在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括但不限于缓冲剂，诸如例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚；丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如例如EDTA；糖，诸如例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如例如，TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在具体实施方案中，药物组合物包含在药学上可接受的载剂中的本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段以及任选的一种或多种附加预防剂或治疗剂。在具体实施方案中，药物组合物包含在药学上可接受的载剂中的有效量的本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段以及任选的一种或多种附加预防剂或治疗剂。在具体实施方案中，本文所述的药物组合物和/或抗体或其抗原结合片段可以与治疗有效量的附加治疗剂组合。
在具体实施方案中，药物组合物包含在药学上可接受的载剂中的本文所述的抗体-药物缀合物以及任选的一种或多种附加预防剂或治疗剂。在具体实施方案中，药物组合物包含在药学上可接受的载剂中的有效量的本文所述的抗体-药物缀合物以及任选的一种或多种附加预防剂或治疗剂。在具体实施方案中，本文所述的药物组合物和/或抗体-药物缀合物可以与治疗有效量的附加治疗剂组合。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段是药物组合物中包括的唯一活性成分。在具体实施方案中，编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或载体是药物组合物中的唯一活性成分。
本文所述的药物组合物可以用于治疗癌症、自身免疫性疾病和感染，例如细菌和真菌感染。
药物组合物可被配制用于任何施用途径(例如，肠胃外、局部、肿瘤内等)。
用于肠胃外制剂的药学上可接受的载剂包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂和其他药学上可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸化林格氏注射液。非水性肠胃外媒介物包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂添加到包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药物载剂还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇，以及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
药物组合物可被配制用于受试者的任何施用途径。施用途径的具体实例包括鼻内、口服、肺部、经皮、皮内、膀胱内和肠胃外。在一些实施方案中，施用是肿瘤内的。本文还设想了以皮下、肌内或静脉内注射为特征的肠胃外施用。注射剂可以以常规形式制备为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式或者制备为乳液。注射剂、溶液和乳液还含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，如果需要，待施用的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，诸如例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂和其他此类剂，诸如例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
用于抗体的肠胃外施用的制剂包括准备用于注射的无菌溶液、准备在临用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(诸如例如冻干粉末，包括皮下注射片剂)、准备用于注射的无菌悬浮液、准备在临用前与媒介物组合的无菌干燥不溶性产品以及无菌乳液。溶液可以是水性的或非水性的。
如果静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂(诸如例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇以及它们的混合物)的溶液。
如针对局部和全身施用所述制备包含抗体的局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，并且可以被配制成乳膏、凝胶、软膏、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或适于局部施用的任何其他制剂。
本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物可以被配制成用于局部施加(诸如例如通过吸入)的气雾剂(参见例如美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，这些文献描述了用于递送可用于治疗炎性疾病、特别是哮喘的类固醇的气雾剂)。用于施用于呼吸道的这些制剂可以呈用于喷雾器的气雾剂或溶液的形式，或者作为单独或与惰性载剂(诸如例如乳糖)组合的用于吹入的微细粉末。在这种情况下，，制剂的颗粒将具有在一个实施方案中小于50微米、在一个实施方案中小于10微米的直径。
本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物-缀合物可以被配制用于局部施加，诸如例如用于以凝胶、乳膏和洗剂的形式局部施加到皮肤和粘膜，诸如例如眼睛中，以及用于施加到眼睛或者用于脑池内或脊柱内施加。设想局部施用用于经皮递送，并且还用于向眼睛或粘膜施用，或用于吸入疗法。也可以施用单独或与其他药学上可接受的赋形剂组合的抗体鼻用溶液。
经皮贴剂(包括离子电渗和电泳装置)是本领域技术人员熟知的并且可以用于施用抗体。例如，此类贴剂公开于美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957。
在某些实施方案中，包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物的药物组合物是冻干粉末，所述冻干粉末可以被重构以作为溶液、乳液和其他混合物施用。它也可被重构和配制成固体或凝胶。通过将本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物或其药学上可接受的衍生物溶解于合适的溶剂中来制备冻干粉末。在具体实施方案中，冻干粉末是无菌的。溶剂可含有改善稳定性的赋形剂或粉末的其他药理学组分或由粉末制备的重构溶液。可使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的剂。在一个实施方案中，在约中性pH下，溶剂还可含有缓冲剂，诸如例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他这类缓冲剂。随后将溶液无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，得到期望的制剂。在一个实施方案中，所得溶液将被分配到小瓶中进行冻干。每个小瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。冻干粉末可以在适当的条件下(例如，在约4℃至室温下)储存。
用注射用水重构该冻干粉末提供了用于肠胃外施用的制剂。对于重构，将冻干粉末添加到无菌水或其他合适的载剂中。精确的量取决于所选择的化合物。这种量可以凭经验确定。
在具体实施方案中，包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物的药物组合物以液体形式提供而不需要重构。
本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物和本文提供的其他组合物也可以被配制成靶向待治疗的受试者的身体的特定组织、受体或其他区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员熟知的。本文设想了用于本发明组合物的所有此类靶向方法。对于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物靶向肿瘤。
用于体内施用的组合物可以是无菌的。这可通过例如无菌过滤膜过滤来容易地实现。
1.6治疗方法
在一个方面，本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在另一方面，本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的抗体-药物缀合物(例如，包含与治疗剂结合的本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段)，或包含本文所述的抗体-药物缀合物的药物组合物。在另一方面，本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的表达CAR的细胞或本文所述的包含表达CAR的细胞的药物组合物。
在具体实施方案中，本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的双特异性抗体或本文所述的包含双特异性或多特异性抗体的药物组合物。在另一方面，本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的表达CAR的细胞或本文所述的包含表达CAR的细胞的药物组合物。在另一方面，本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或载体，或包含编码本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或载体的药物组合物。
在具体实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如例如灵长类动物(例如，猴或人)。在具体实施方案中，受试者是人。如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。
在具体实施方案中，所治疗的癌症是非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、口腔癌、甲状腺癌、乳腺癌、肉瘤、胰腺癌、结肠癌、胃癌、绒毛膜癌、睾丸癌、间皮瘤、皮肤癌、肾细胞癌、膀胱癌或宫颈癌。在具体实施方案中，癌症是血液癌。在具体实施方案中，癌症是白血病(例如，急性髓性白血病)。在具体实施方案中，癌症是淋巴瘤。癌症可以是实体瘤或非实体瘤。在具体实施方案中，癌症是转移性的。
在具体实施方案中，所治疗的癌症是“冷肿瘤”(即，具有低水平的T细胞浸润的肿瘤，类似于通常在胰腺恶性肿瘤中见到的水平)，例如前列腺、乳腺、卵巢、膀胱或胰腺肿瘤、结直肠癌(CRC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、小细胞肺癌或成胶质细胞瘤。在具体实施方案中，癌症是与例如健康组织对照(例如，与癌症相同的组织或器官类型的非癌细胞样品)相比具有高VISTA表达的冷肿瘤。
在具体实施方案中，所治疗的癌症是VISTA阳性癌症，即其表达可检测水平的VISTA。
在某些实施方案中，本文所述的用于治疗癌症的方法包括在施用步骤之前，从受试者获得肿瘤活检、肿瘤样品或癌细胞样品并使用本文所述或本领域技术人员已知的测定评估VISTA的表达水平的步骤。本领域技术人员已知的技术可用于获得肿瘤活检或癌细胞样品。在具体实施方案中，免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、ELISA或流式细胞术用于评估VISTA表达水平。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的受试者患有显示可检测(例如，高)VISTA表达的肿瘤，例如与例如健康组织对照(例如，与癌症相同的组织或器官类型的非癌细胞样品)相比显示高VISTA表达的肿瘤。
在具体实施方案中，向患有癌症的受试者施用本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物或本文所述的表达CAR的细胞或本文所述的药物组合物实现以下效果中的至少一种、两种、三种、四种或更多种：(i)减轻或改善癌症的一种或多种症状的严重程度；(ii)减少与癌症相关的一种或多种症状的持续时间；(iii)预防与癌症相关的症状的复发；(iv)减少受试者的住院治疗；(v)减少住院时间；(vi)增加受试者存活率；(vii)增强或改善另一种疗法的治疗效果；(viii)抑制与癌症相关的一种或多种症状的发展或发作；(ix)减少与癌症相关的症状数量；(x)改善生活质量，如通过本领域熟知的方法评估；(x)抑制肿瘤的复发；(xi)使肿瘤和/或与其相关的一种或多种症状消退；(xii)抑制肿瘤和/或与其相关的一种或多种症状的进展；(xiii)减少肿瘤的生长；(xiv)减小肿瘤大小(例如，体积或直径)；(xv)减少新形成的肿瘤的形成；(xvi)根除、去除或控制原发性、区域性和/或转移性肿瘤；(xvii)预防转移或减少其数量或大小；(xviii)降低死亡率；(xix)增加无复发生存率；(xx)肿瘤的大小得以维持并且不增加或增加小于施用标准疗法之后肿瘤的增加，如通过本领域技术人员可用的常规方法(诸如例如磁共振成像(MRI)、动态对比增强MRI(DCE-MRI)、X射线和计算机断层摄影(CT)扫描或正电子发射断层摄影(PET)扫描)所测量；和/或(xxi)增加受试者的缓解时间。
在具体实施方案中，如本文所述的治疗癌症的方法产生以下效果中的一种、两种、三种或更多种：完全反应、部分反应、客观反应、总生存期增加、无疾病生存期增加、客观反应率增加、进展时间增加、疾病稳定、无进展生存期增加、治疗失败时间增加以及癌症的一种或多种症状改善或消除。在具体实施方案中，如本文所述的治疗癌症的方法使得总生存期增加。在另一个具体实施方案中，如本文所述的治疗癌症的方法使得无进展生存期增加。在另一个具体实施方案中，如本文所述的治疗癌症的方法使得总生存期增加且无进展生存期增加。
在具体实施方案中，完全反应具有本领域技术人员所理解的含义。在具体实施方案中，完全反应是指响应于治疗所有癌症体征的消失。完全反应可能并不意味着癌症被治愈，而是患者处于缓解中。在具体实施方案中，如果通过已知的技术(诸如例如放射照相研究、骨髓和活检或蛋白质测量)未检测到疾病，则癌症处于完全缓解中。
在具体实施方案中，部分反应具有本领域技术人员所理解的含义。例如，部分反应可指响应于治疗人体中肿瘤的大小减小。在具体实施方案中，部分反应是指在不存在新病变的情况下所有可测量的肿瘤负荷(例如，受试者中存在的恶性细胞的数量，或测量的肿瘤块的体积或异常单克隆蛋白的量)减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在具体实施方案中，总生存期具有本领域技术人员所理解的含义。在具体实施方案中，总生存期是指从诊断或治疗开始之日起的时间长度。如果毒性特征是可接受的，并且通常支持新药批准，则证明总生存期的统计学显著改善可以被视为具有临床意义。
若干终点通常基于肿瘤评估。这些终点包括无疾病生存期(DFS)、客观反应率(ORR)、进展时间(TTP)、无进展生存期(PFS)和治疗失败时间(TTF)。关于这些时间依赖性终点的数据的收集和分析通常基于间接评估、计算和估计(例如，肿瘤测量)。
在具体实施方案中，无疾病生存期(DFS)具有本领域技术人员所理解的含义。在具体实施方案中，无疾病生存期可指在癌症的初级治疗结束后，人受试者在没有任何癌症体征或症状的情况下生存的时间长度。在生存期可能延长从而使得生存终点不切实际的情况下，DFS可能是重要的终点。DFS可以是临床益处的替代物，或者它也可以提供临床益处的直接证据。该确定通常基于效果的大小、其风险-益处关系和疾病背景。DFS的定义可能是复杂的，特别是在没有事先记录肿瘤进展的情况下发现死亡时。这些事件可作为疾病复发或删失事件进行评分。尽管对死亡进行统计分析的所有方法都有一些局限性，但将所有死亡(所有原因的死亡)视为复发可以使偏倚最小化。使用该定义可能会高估DFS，尤其是在长期未观察后出现死亡的患者中。如果长期随访访视的频率在研究组之间不一样，或者如果由于毒性而退出不是随机的，则可以引入偏倚。
在具体实施方案中，客观反应率具有本领域技术人员所理解的意义。在一个实施方案中，客观反应率被定义为肿瘤大小减小预定量并持续最小时间段的患者的比例。反应持续时间可从最初反应的时间开始测量，直到记录肿瘤进展。一般来讲，FDA将ORR定义为部分反应加完全反应的总和。当以这种方式定义时，ORR是药物抗肿瘤活性的直接量度，其可以在单臂研究中评价。如果可用，应使用标准化标准确定反应。多种反应标准被认为是适当的(例如，RECIST1.1标准)(参见例如Eisenhower等人,2009,European J.of Cancer,45:228-247)。ORR的显著性通过其大小和持续时间以及完全反应的百分比(没有可检测的肿瘤证据)来评估。
在具体实施方案中，进展时间(TTP)具有本领域技术人员所理解的含义。在具体实施方案中，进展时间是指从癌症的诊断或治疗开始之日起直到癌症恶化或扩散到人体的其他部分的时间长度。
在具体实施方案中，TTP是从随机分配直到客观肿瘤进展的时间；TTP不包括死亡。
在具体实施方案中，无进展生存期(PFS)具有本领域技术人员所理解的含义。在具体实施方案中，PFS是指在治疗癌症期间和之后人患者与癌症一起生活但癌症没有恶化的时间长度。在具体实施方案中，PFS被定义为从随机分配直到客观肿瘤进展或死亡的时间。PFS可包括死亡，因此可更好地与总生存期相关。
在具体实施方案中，治疗失败时间(TTF)具有本领域技术人员所理解的含义。在具体实施方案中，TTF是测量从随机分配到因任何原因(包括疾病进展、治疗毒性和死亡)而中止治疗的时间的复合终点。
在具体实施方案中，RECIST 1.1标准用于测量人受试者对本文所述的治疗方法的反应程度。
在具体实施方案中，可以使用生物标记来评价根据本文所述的方法的治疗功效。功效的指标包括例如骨髓树突细胞(mDC)频率的增加和/或单核细胞和/或树突细胞活化的增加和/或CD80、CD86和/或HLA-DR的增加。在具体实施方案中，功效的指标还可以包括一种或多种特异性免疫细胞群体、趋化因子水平或细胞因子水平或VISTA表达的增加或减少，如在患者的血液中或在肿瘤活检中所测量。在具体实施方案中，CXCL10、MIP1β(CCL2)和/或MCP-1(CCL4)的增加用于测量治疗功效。
在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的受试者在接受本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段之前已经历化学疗法和/或放射疗法。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的受试者在接受本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段之前已经历用免疫检查点抑制剂(诸如例如程序性死亡-1(PD-1)或程序性死亡-配体1(PDL1)的抑制剂或者细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抑制剂)的疗法。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的受试者已在用于治疗受试者的癌症的两种或更多种疗法中失败，例如癌症对两种或更多种疗法有抗性。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的受试者患有对用于治疗癌症的一种或多种其他疗法有抗性的癌症；此类其他癌症疗法可以是例如手术、放射、化学疗法和靶向疗法。
在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的肿瘤对手术、放射疗法和/或化学疗法是难治的。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的肿瘤对用免疫检查点抑制剂(例如，PDL1抑制剂(诸如例如阿替利珠单抗(atezolizumab))、PD-1抑制剂(诸如例如帕博利珠单抗(pembrolizumab))或CTLA-4抑制剂(诸如例如伊匹单抗(ipilimumab)))治疗是难治的。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的肿瘤对放射疗法和/或化学疗法是难治的，并且还对免疫检查点抑制剂(例如，PDL1抑制剂、CTLA-4抑制剂(诸如例如伊匹单抗)或抗PD-1抑制剂(诸如例如帕博利珠单抗))是难治的。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的肿瘤对用酪氨酸激酶抑制剂(例如，索拉非尼)治疗是难治的。
在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的肿瘤对用靶向疗法(例如，HER-2抑制剂，诸如例如曲妥珠单抗(trastuzumab)；HER3抑制剂；VEGF抑制剂，诸如例如贝伐珠单抗(bevacizumab)；BRAF抑制剂，诸如例如维罗非尼；BCR-ABL融合蛋白抑制剂，诸如例如甲磺酸伊马替尼；信号转导抑制剂，诸如例如MAP激酶抑制剂、MEK抑制剂、TGFβ抑制剂、EGFR抑制剂、mTOR抑制剂、法尼基转移酶抑制剂或谷胱甘肽S转移酶抑制剂；或者细胞凋亡诱导剂)治疗是难治的。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的肿瘤对用激素疗法(例如，阿比特龙、阿那曲唑、依西美坦、氟维司群(fluvestrant)、来曲唑、亮丙瑞林或他莫昔芬)治疗是难治的。
施用途径和剂量
可通过多种途径将本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物或本文所述的药物组合物递送给受试者。这些途径包括但不限于肠胃外、鼻内、气管内、口服、皮内、局部、肌内、腹膜内、膀胱内、经皮、静脉内、结膜和皮下途径。在具体实施方案中，施用是肿瘤内的。也可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及用雾化剂配制成喷雾剂。在一个实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物或本文所述的药物组合物肠胃外施用于受试者。在具体实施方案中，所述肠胃外施用是静脉内的、肌内的或皮下的。在具体实施方案中，使用静脉内施用。
本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物或本文所述的表达CAR的细胞或药物组合物的将有效治疗病症的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
要在药物组合物中使用的本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物或表达CAR的细胞的精确剂量还将取决于施用途径和癌症类型，并且应根据从业者的判断和每名受试者的情况来决定。例如，有效剂量也可根据施用方式、靶位点、患者的生理状态(包括年龄、性别、体重和健康状况)、患者是人还是动物、所施用的其他药物或治疗是预防性的还是治疗性的而变化。
在某些实施方案中，采用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。有效剂量可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推断。
对于抗体(或其抗原结合片段)或抗体药物缀合物，剂量通常在约0.0001至100mg/kg并且更通常0.01至15mg/kg患者体重的范围内。例如，对于80kg患者，剂量可以分别为1mg/kg体重、10mg/kg体重、30mg/kg体重或在1至30mg/kg的范围内，或者换句话说，为80mg或2400mg或在80-2400mg的范围内。在具体实施方案中，施用于患者的剂量为约1mg/kg至约30mg/kg患者的体重。在具体实施方案中，施用于患者的剂量为约1mg/kg至约3mg/kg患者的体重。替代性地，在具体实施方案中，对于人患者，在本文所公开的治疗方法中使用的剂量在1至500mg(例如，10至400mg、30至300mg、100至300mg、200mg至1g或1g至3g)的范围内，例如每周一次、每两周一次或每三周一次。在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的免疫球蛋白抗体以3mg、10mg、30mg、100mg或300mg或100至300mg、100mg至1g、200mg至1g或1g至3g范围内的剂量每周一次、每两周一次或每三周一次施用于人受试者。基于体重的给药在儿科患者(例如，18岁以下的患者)中可能是优选的，而在成年患者中，固定剂量可能是优选的。
在具体实施方案中，上述方案用于治疗患有晚期实体瘤的患者。在具体实施方案中，上述方案用于治疗患有转移性或复发性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。在具体实施方案中，上述方案用于治疗患有转移性或复发性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的患者。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在化学疗法(包括例如酪氨酸激酶抑制剂疗法)中失败的患者(例如，患有NSCLC或HNSCC)，例如癌症对化学疗法有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在与用PD-1或PDL1的抑制剂的疗法组合的放射疗法中失败的患者(例如，患有NSCLC或HNSCC)，例如癌症对与用PD-1或PLDL1的抑制剂的疗法组合的放射疗法有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在与放射疗法和用PD-1或PDL1的抑制剂的疗法组合的化学疗法中失败的患者(例如，患有NSCLC或HNSCC)，例如癌症对与放射疗法和用PD-1或PDL1的抑制剂的疗法组合的化学疗法有抗性。
在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在含铂全身化学疗法中失败的患有复发性或进行性卵巢癌或宫颈癌的患者，例如癌症对含铂全身化学疗法有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在手术切除、放射疗法、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、吉西他滨、顺铂、奥沙利铂、伊立替康、亚叶酸和紫杉醇中的一种或多种中失败的患有复发性或进行性胰腺癌的患者，例如癌症对手术切除、放射疗法、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、吉西他滨、顺铂、奥沙利铂、伊立替康、亚叶酸和紫杉醇中的一种或多种有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在手术切除、放射疗法、化学疗法(多西他赛、紫杉醇、环磷酰胺、5-FU、卡培他滨、吉西他滨、多柔比星、米托蒽醌、卡铂、铂)、激素疗法(他莫昔芬、依西美坦、阿那曲唑、来曲唑、氟维司群)、靶向疗法(曲妥珠单抗、拉帕替尼、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿贝西利、帕博西尼、瑞博西利、阿培利司、来那替尼、奥拉帕尼、他拉唑帕利)和免疫疗法(阿替利珠单抗)中的一种或多种中失败的患有复发性或进行性乳腺癌的患者，例如癌症对手术切除、放射疗法、化学疗法(多西他赛、紫杉醇、环磷酰胺、5-FU、卡培他滨、吉西他滨、多柔比星、米托蒽醌、卡铂、铂)、激素疗法(他莫昔芬、依西美坦、阿那曲唑、来曲唑、氟维司群)、靶向疗法(曲妥珠单抗、拉帕替尼、帕妥珠单抗、阿贝西利、帕博西尼、瑞博西利、阿培利司、来那替尼、奥拉帕尼、他拉唑帕利)和免疫疗法(阿替利珠单抗)中的一种或多种有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在手术切除、放射疗法、激素疗法(布舍瑞林(busarelin)、地加瑞克、戈舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、瑞格列克、曲普瑞林、比卡鲁胺、氟他米特、尼鲁米特、阿比特龙、阿帕他胺、恩杂鲁胺)、化学疗法(多西他赛)和免疫疗法(sipuleucel-T)中的一种或多种中失败的患有复发性或进行性前列腺癌的患者，例如癌症对手术切除、放射疗法、激素疗法(布舍瑞林、地加瑞克、戈舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、瑞格列克、曲普瑞林、比卡鲁胺、氟他米特、尼鲁米特、阿比特龙、阿帕他胺、恩杂鲁胺)、化学疗法(多西他赛)和免疫疗法(sipuleucel-T)中的一种或多种有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在手术切除、放射疗法、化学疗法(5-FU、亚叶酸、奥沙利铂、卡培他滨、伊立替康)和靶向疗法(贝伐珠单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗(ramucirumab)、西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab))中的一种或多种失败的患有复发性或进行性结直肠癌的患者，例如癌症对手术切除、放射疗法、化学疗法(5-FU、亚叶酸、奥沙利铂、卡培他滨、伊立替康)和靶向疗法(贝伐珠单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗)中的一种或多种有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在手术切除、放射疗法、5-FU、表柔比星、顺铂、奥沙利铂、多西他赛、卡培他滨、依托泊苷、甲氨蝶呤、亚叶酸、曲妥珠单抗、纳武单抗(nivolumab)和帕博利珠单抗中的一种或多种中失败的患有复发性或进行性胃癌或胃食管癌的患者，例如癌症对手术切除、放射疗法、5-FU、表柔比星、顺铂、奥沙利铂、多西他赛、卡培他滨、依托泊苷、甲氨蝶呤、亚叶酸、曲妥珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的一种或多种有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗患有肾细胞癌、头颈癌或肺癌的患者。
示例性治疗方案需要每周、每两周或每三周施用一次或者每月施用一次或者每3至6个月施用一次，持续一年或若干年或若干年间隔。在一些方法中，两种或更多种具有不同结合特异性的抗体或其抗原结合片段同时施用于受试者。与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物通常分多次机会施用。剂量可以例如每天、每周两次、每周三次、每周一次、每2周、每3周、每月、每3个月、每6个月或每年给予。在具体实施方案中，本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文提供的抗体-药物缀合物每3周施用一次。
组合疗法
在具体方面，本文所述的用于治疗癌症的方法还包括向受试者施用附加疗法，例如用于治疗癌症。在具体实施方案中，附加疗法是一种附加疗法；替代性地，在一个具体实施例中，用于治疗癌症的方法包括施用多于一种附加疗法。附加疗法可以是选自由手术、放射、化学疗法、靶向疗法或其他治疗剂或它们的组合组成的组的抗癌疗法。在具体实施方案中，附加疗法用于治疗癌症。在具体实施方案中，附加疗法用于治疗用本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或者抗体-药物缀合物或者表达CAR的细胞治疗的任何副作用。在具体实施方案中，附加疗法增加本文提供的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的功效。在一些实施方案中，附加疗法是免疫细胞疗法，例如树突细胞或TIL。
在具体实施方案中，附加疗法是用于治疗癌症的疗法，其是化学治疗剂或靶向疗法，例如酪氨酸激酶抑制剂。在具体实施方案中，附加疗法是免疫检查点抑制剂。在具体实施方案中，附加疗法是B7H7、OX40、CD27、CD70、CD137(4-1BB)、CD137L、CD40、OX40L、CD160、GITR、GITR-L、ICOS、ICOSL、CD80或CD86的激动剂。在具体实施方案中，附加疗法是CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、B7H3、B7H4、B7H6、BTLA、TIGIT、LAIR1、2B4(CD244)、CD47、SIRPα、ILT4、TGFβ、TGFβ-R、VSIG3、VSIG8、LRIG1、PSGL1、CEACAM、HVEM、半乳凝素-9或FLG-1的拮抗剂。
在具体实施方案中，包括向受试者施用本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段的本文所述的用于治疗癌症的方法还可包括向受试者施用抗PD1抗体(例如，帕博利珠单抗、西米普利单抗(cemiplimab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)或纳武单抗)或抗PD-L1抗体(例如，阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗(durvalumab)、BMS-936552或CK-301)或抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)。
在具体实施方案中，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物缀合物或本文所述的表达CAR的细胞与抗PD-1抗体(例如，帕博利珠单抗)组合施用于受试者。在具体实施方案中，两种疗法同时施用，例如在同一天，任选地每3周一次。在具体实施方案中，两种疗法在同一天施用，例如每3周一次。在具体实施方案中，抗PD-1抗体以200mg的剂量施用于人受试者。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的免疫球蛋白抗体(或其抗原结合片段或缀合物)以30mg、100mg、300mg、1g或3g或100至300mg、200mg至1g、300mg至1g或1g至3g范围内的剂量施用于人受试者，以如打印在其处方信息上的剂量和剂量间隔与抗PD-1抗体(例如，帕博利珠单抗)同时每周、每隔一周或每三周施用。在具体实施方案中，本文所述的与VISTA特异性结合的免疫球蛋白抗体(或其抗原结合片段或缀合物)以0.2至3g范围内的剂量施用于成人受试者，每周两次至每3周一次、任选地每周、每2或3周一次、更任选地每3周一次给予，并且任选地其中受试者被给予至少5个剂量。在具体实施方案中，上述方案用于治疗患有晚期实体瘤的患者。在具体实施方案中，上述方案用于治疗患有转移性或复发性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。在具体实施方案中，上述方案用于治疗患有转移性或复发性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的患者。在具体实施方案中，上述方案用于治疗任选地已在单独或与PD-1或PDL1的抑制剂组合的索拉非尼中失败的患有复发性或进行性肝细胞癌(HCC)、CRC或结肠癌的患者，例如癌症对单独或与PD-1或PDL1的抑制剂组合的索拉非尼有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗任选地已在至少两种先前疗法中失败的患有转移性或复发性卵巢癌的患者，例如癌症对至少两种先前疗法有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗任选地已在至少两种先前疗法中失败的患有转移性或复发性宫颈癌的患者，例如癌症对至少两种先前疗法有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在先前化学疗法(例如，卡铂和紫杉醇)中失败的患者，例如癌症对化学疗法(例如，卡铂和紫杉醇)有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在与用PD-1或PDL1的抑制剂的疗法组合的放射疗法中失败的患者，例如癌症对与用PD-1或PDL1的抑制剂的疗法组合的放射疗法有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在与放射疗法和用PD-1或PDL1的抑制剂的疗法组合的化学疗法中失败的患者，例如癌症对与放射疗法和用PD-1或PDL1的抑制剂的疗法组合的化学疗法有抗性。
在具体实施方案中，上述方案用于治疗已在先前化学疗法(例如，卡铂/紫杉醇或卡铂/培美曲塞)和/或PD-(L)-1抑制剂疗法中失败的患有非鳞状组织学和进行性/复发性疾病的NSCLC患者，例如癌症对先前化学疗法(例如，卡铂/紫杉醇或卡铂/培美曲塞)和/或PD-(L)-1抑制剂疗法有抗性。在具体实施方案中，治疗已在先前EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗法中失败的患有EGFR突变的癌症的患者，例如癌症对EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗法有抗性。在具体实施方案中，治疗已在先前ALK抑制剂疗法中失败的患有ALK易位的癌症的患者，例如癌症对ALK抑制剂疗法有抗性。
在具体实施方案中，上述方案用于治疗经组织学证实是不可治愈的局部晚期的复发性和/或转移性的HNSCC。患者可能已在先前含铂方案中失败(例如，癌症对含铂方案有抗性)和/或不是具有治愈意图的进一步放射或手术疗法的候选人。
在具体实施方案中，上述方案用于治疗是进行性的并且已在先前索拉非尼疗法中失败的肝细胞癌，例如癌症对索拉非尼有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗先前基于铂的疗法失败的患有复发性或转移性宫颈癌的患者，例如癌症对基于铂的疗法有抗性。在具体实施方案中，上述方案用于治疗在含铂全身疗法后进展的卵巢癌。
在具体实施方案中，本文提供的治疗方法还包括用化学治疗剂和免疫检查点抑制剂治疗受试者。在具体实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1、PDL1或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抑制剂。
如本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物或表达CAR的细胞可以与附加疗法同时和/或依序(之前和/或之后)施用。抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物或细胞和附加疗法可以在相同或不同的组合物中并且通过相同或不同的施用途径施用。第一疗法(例如，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或附加疗法)可以在将第二疗法(例如，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或附加疗法)施用于患有癌症的受试者之前、与其同时或之后施用。
在具体实施方案中，第一疗法(例如，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或附加疗法)与第二疗法(例如，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或附加疗法)在同一天、同一周或同一月施用于患有癌症的受试者。在具体实施方案中，第一疗法(例如，与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或附加疗法)在施用第二疗法(例如，本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或附加疗法)后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周内施用于患有癌症的受试者。
在某些实施方案中，与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段组合施用于受试者的附加疗法在相同组合物(药物组合物)中施用。在具体实施方案中，与本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段组合施用的附加疗法在跟与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段不同的组合物中施用于受试者(例如，使用两种或更多种药物组合物)。
1.7试剂盒
本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段、本文所述的抗体-药物缀合物(例如，包含与治疗剂结合的本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段)或本文所述的表达包含scFv的CAR的细胞。在具体实施方案中，本文提供了包含一个或多个容器的药物包装或试剂盒，所述容器填充有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，诸如例如一种或多种本文所述的与VISTA特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，试剂盒含有本文所述的药物组合物以及预防剂或治疗剂。
任选地，与此类容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知、剂型和/或其使用说明。在某些实施方案中，与试剂盒一起包括的说明提供了关于用于施用药物组合物的剂量和/或给药方案的指导。
药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、包、小袋、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器和适于所选药物组合物以及预期施用和治疗模式的任何包装材料。
本文提供的试剂盒还可以包括用于施用活性成分的装置。此类装置的实例包括但不限于注射器、无针注射器、滴注袋、贴片和吸入器。
本文提供的试剂盒还可以包括可以用于施用所述成分的药学上可接受的媒介物。例如，如果某种成分以必须重构才能用于肠胃外施用的固体形式提供，则试剂盒可以包含合适媒介物的密封容器，在所述媒介物中，所述成分可以溶解以形成适于肠胃外施用的无颗粒无菌溶液或可以被重构为用于口服施用的悬浮液。药学上可接受的媒介物的实例包括但不限于：水性媒介物，包括但不限于注射用水USP、氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸化林格氏注射液；水混溶性媒介物，包括但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水性媒介物，包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
实施例
提供了本节中描述的实施例用于说明。
实施例1：针对VISTA蛋白产生的抗体
免疫：使用ALD/MDP(铝胶/穆拉米尔二肽)作为佐剂，用人VISTA(SEQ ID NO:378)的可溶性细胞外结构域(ECD)(除了在VISTA-ECD蛋白(R&D Systems)上具有His标签)免疫五只携带插入的人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(小鼠；参见WO 2012/018610A2)。将10μg免疫原注射到每只小鼠的足垫中，每周两次，持续四周。使用每只动物血清的1:3稀释系列，从1000ng/mL开始，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评估抗体滴度。在收获前向每只动物给予两次10μg不含佐剂的可溶性VISTA-ECD的最终足垫加强。处死后收集淋巴结(腘窝、腹股沟、腋窝和肠系膜)、脾脏和骨髓。通过手动破碎然后通过70μm目的过滤器来制备每个动物组织的单细胞悬浮液。使用EasySepTM小鼠Pan-B细胞分离试剂盒(StemcellTechnologies)阴性选择试剂盒从淋巴结和脾脏中分离B细胞，而使用小鼠CD138+(Miltenyi Biotec)阳性选择试剂盒从骨髓中分离B细胞。通过在C-Chip血细胞计数器(Incyto)上计数对B细胞群体进行定量，并使用台盼蓝评估其活力。然后将细胞在具有12％OptiPrepTM密度梯度培养基(Sigma)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至5,000-6,000个细胞/mL。将该细胞混合物用于微流体封装。每只免疫动物大约有一百万个B细胞通过乳滴微流体平台。
配对重链和轻链文库的制备：使用乳滴微流体平台或涡旋乳液由单细胞的RNA产生编码具有完整的天然重-轻Ig配对的scFv的DNA文库。用于产生DNA文库的方法分为1)poly(A)+mRNA捕获，2)多重重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应(OE-RT-PCR)，以及3)巢式PCR以去除伪影并添加用于深度测序或酵母展示文库的衔接子。scFv文库是由获得阳性ELISA滴度的五只动物中的每一只的大约400,000个B细胞(淋巴结和脾脏)或30,000个B细胞(骨髓)产生的。
对于poly(A)+mRNA捕获，如先前所述使用定制设计的共流乳滴微流体芯片(参见Asensio MA等人,Antibody repertoire analysis of mouse immunization protocolsusing microfluidics and molecular genomics.Mabs.201911(5):870-883)。微流体芯片具有两个用于油的输入通道，一个输入通道用于上述细胞悬浮液混合物，而一个输入通道用于在细胞裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5％Tween-20和20mM二硫苏糖醇)中1.25mg/ml的oligo-dT珠(NEB)。使用Pico-Break(Dolomite)从液滴中提取珠。
对于多重重叠延伸实时聚合酶链式反应(OE-RT-PCR)，使用玻璃Telos液滴乳液微流体芯片(Dolomite)。将结合mRNA的珠重悬于具有基于矿物油的表面活性剂混合物(GigaGen)的OE-RT-PCR混合物中。OE-RT-PCR混合物含有2x一步RT-PCR缓冲液、2.0mMMgSO4、Superscript III逆转录酶和Platinum Taq(Thermo Fisher Scientific)，加上针对IgK C区、IgG C区和所有V区的引物的混合物。重叠区是编码富含Gly-Ser的scFv接头序列的DNA序列。PCR方法和引物如先前所述(参见Adler AS等人,Rare,high-affinity anti-pathogen antibodies from human repertoires,discovered using microfluidics andmolecular genomics.Mabs.2017 9(8):1282-1296)。使用液滴破碎溶液(GigaGen)从液滴中回收DNA片段，然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。
对于巢式PCR，使纯化的OE-RT-PCR产物首先在150V下在1.7％琼脂糖凝胶上运行80分钟。切下1200-1500碱基对(bp)处对应于连接产物的条带，并使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up试剂盒(Macherey Nagel)纯化。然后进行PCR以添加用于Illumina测序或酵母展示的衔接子；对于测序，添加七个核苷酸的随机体以增加随后的下一代测序步骤中碱基识别的准确性。用2xNEBNext高保真扩增混合物(NEB)进行巢式PCR，所述高保真扩增混合物具有含有用于克隆到酵母表达载体中的一个或多个引物的Illumina衔接子。使巢式PCR产物在150V下在1.2％琼脂糖凝胶上运行50分钟。切下800-1100bp处的条带，并使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up试剂盒(Macherey Nagel)纯化。
用于FACS分析的抗原制剂：使用EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将人IgG1-Fc(Thermo Fisher Scientific)和VISTA-ECD-His(R&D Systems)蛋白生物素化。将生物素化试剂重悬至9mM并以50倍摩尔过量添加到蛋白质中。将反应物在冰上孵育2小时，然后使用Zeba脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)除去生物素化试剂。用Bradford测定法计算最终蛋白质浓度。
酵母文库筛选：如先前所述制备酵母展示DNA筛选文库(参见Adler AS等人,Rare,high-affinity anti-pathogen antibodies from human repertoires,discoveredusing microfluidics and molecular genomics.Mabs.20179(8):1282-1296)。构建含有GAL1/10启动子、Aga2细胞壁栓系物和C末端c-Myc标签的酵母表面展示载体(pYD)。GAL1/10启动子诱导scFv蛋白在含有半乳糖的培养基中表达。需要Aga2细胞壁栓系物将scFv穿梭到酵母细胞表面并将scFv栓系到细胞外空间。在流式分选期间使用c-Myc标签对表达框内scFv蛋白的酵母细胞进行染色。将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞(ATCC)与凝胶纯化的巢式PCR产物和线性化的pYD载体一起电穿孔(Bio-Rad Gene Pulser II；0.54kV，25uF，电阻设置为无穷大)以进行体内同源重组。扩增转化细胞并用半乳糖诱导以产生酵母scFv展示文库。
用抗c-Myc(Thermo Fisher Scientific A21281)和AF488缀合的二抗(ThermoFisher Scientific A11039)对两百万个来自扩增scFv文库的酵母细胞进行染色。为了选择与VISTA-ECD结合的表达scFv的细胞，在一抗孵育期间将生物素化VISTA-ECD抗原添加到酵母培养物(最终为250nM)中，然后用PE-链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)进行染色。在BD Influx(Stanford Shared FACS Facility)上流式分选酵母细胞的双阳性细胞(AF488+/PE+)，然后将回收的克隆铺在具有卡那霉素、链霉素和青霉素(Teknova)的SD-CAA板上进行扩增。然后将扩增的第一轮FACS克隆用相同抗原在相同摩尔浓度(最终为250nM)下进行第二轮FACS。由从最终FACS分选中回收的酵母制备质粒minipreps(ZymoResearch)。使用尾端PCR将Illumina衔接子添加到质粒文库中用于深度测序。
深度库测序：使用定量PCR Illumina文库定量试剂盒(KAPA)对深度抗体测序文库进行定量并将其稀释至17.5pM。根据制造商的说明，使用500循环MiSeq Reagent Kit v2在MiSeq(Illumina)上对文库进行测序。为了获得维持重链和轻链连接的高质量序列读段，在两个单独的运行中进行测序。在第一运行(“连接运行”)中，对scFv文库进行直接测序，以获得轻链V基因和CDR3的340个循环的正向读段以及覆盖重链CDR3和部分重链V基因的162个循环的反向读段。在第二运行(“未连接运行”)中，首先将scFv文库用作PCR的模板以分别扩增重链和轻链V基因。然后，分别获得重和轻链Ig的251个循环的重叠正向和反向读段。
为了去除碱基识别错误，根据读段的Phred评分计算其预期错误数(E)。默认情况下，丢弃E>1的读段，留下最有可能的碱基识别错误数为零的读段。作为附加质量过滤器，丢弃单核苷酸读段，因为发现两次或更多次的序列很有可能是正确的。最后，通过合并来自连接和未连接运行的过滤序列来产生高质量的连接抗体序列。
为了鉴定阅读框和FR/CDR结合部，首先对精确的免疫球蛋白序列的数据库(LeFranc MP等人,IMGT,the international ImMunoGeneTics informationsystem.Nucl.Acids Res.2019 37:D1006-10012)进行处理，以产生每个FR/CDR结合部的位置特异性序列矩阵(PSSM)。使用这些PSSM来鉴定使用上述过程产生的每个合并的核苷酸序列的FR/CDR结合部。这鉴定了每个核苷酸序列的蛋白质阅读框。需要读段具有有效的预测CDR3序列，因此，丢弃例如在V与J片段之间具有移码的读段。接下来，使用scFv核苷酸序列作为查询以及来自IMGT数据库的V和J基因序列作为参考序列运行UBLAST。使用E值最低的UBLAST比对来指定V和J基因家族并计算种系的％ID。
酵母文库的FACS富集和随后的序列数据分析鉴定了107个独特的scFv序列。使用成对比对基于CDR3序列的相似性将scFv序列聚类成进化枝。根据鉴定的scFv序列重新格式化全长人IgG1单克隆抗体。
实施例2：HEK293细胞中单克隆抗体的产生和表征
在HEK293细胞中产生单克隆抗VISTA抗体。对每种抗体的序列进行密码子优化并将其克隆到pcDNA3.4的Eco RI和Hind III位点中。分别克隆每个重链和轻链序列。根据标准方法制备转染级质粒DNA。使Expi293F(Thermo Fisher Scientific)细胞在Erlenmeyer烧瓶(Corning Inc)中的无血清Expi293表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中在37℃下在8％ CO2中在轨道振荡器上生长。转染前一天，以最佳密度(3x106个细胞/mL)接种细胞并在第二天使用商业转染试剂(Expifectamine)根据制造商建议的条件用抗体DNA转染。转染后大约16-18小时，将ExpiFectamine 293转染增强剂1和ExpiFectamine 293转染增强剂2添加到每个烧瓶中，并将转染的培养物孵育6天，然后收获。通过离心细胞沉淀收集细胞培养肉汤，然后过滤培养基。对于小规模生产，在以下四种柱中的一种上从培养物上清液中纯化抗体：RoboColumn Eshmuno A(EMD Millipore)、PreDictor RoboColumn MabSelectSure(Cytiva/GE)、HiTrap MabSelect SuRe(Cytiva/GE)或HiTrap MabSelect SuRe LX(Cytiva/GE)。将这些柱用于根据制造商的建议进行抗体纯化，并将所得洗脱液缓冲液交换到pH7.4的磷酸盐缓冲盐水中。通过280nm处的吸光度分析样品的蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE分析样品的纯度。使用LAL内毒素测定试剂盒(Bioendo)评价内毒素水平。
使用MabSelect SuRe LX和HiLoad 16/600Superdex200pg柱纯化较大实验室规模产物(高达500mL培养基)，并如上评价纯度和蛋白质浓度。另外，通过蛋白质印迹使用山羊抗人IgG-HRP(Genescript)或山羊抗人κ-HRP(SouthernBiotech)以及通过SEC-HPLC在Tosoh TSKgel G3000SWxl 7.8X 300mm柱(在0.1mol/L Na2SO4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.7)中分辨)上测量样品纯度。
实施例3：CHO细胞中单克隆抗体的产生和表征
使用Qiagen Endofree Maxi试剂盒(目录号12362)、Sigma Aldrich GenEluteHigh(HP)无内毒素Maxi质粒纯化试剂盒(目录号NA0410)或Invitrogen PureLink Expi无内毒素Maxi质粒纯化试剂盒(目录号A31217)由大肠杆菌DH5.α的过夜培养物制备用于在CHO细胞中产生抗体的DNA质粒。根据制造商对每个试剂盒的建议制备质粒DNA。使用13mm x0.22μm过滤器(Foxx Life Sciences，目录号371-2115)无菌过滤质粒DNA。使用NanoDrop仪器(Thermo Fisher Scientific)测定DNA浓度。Expi-CHO表达细胞系购自Thermo FisherScientific(目录号A29133)。使Expi-CHO细胞在Erlenmeyer摇瓶中的ExpiCho表达培养基(Thermo)中在37℃和8％ CO2下繁殖，以125RPM振荡至最大细胞密度为4-6x106个细胞/mL。对于细胞群体的常规扩增，将细胞培养物稀释至0.1-0.5x106个细胞/mL。以6x106个细胞/mL的密度用0.5μg/mL来自重链和轻链抗体中的每一种的质粒DNA转染细胞。转染后一天，将ExpiCHO增强剂添加到培养物中，并将细胞转移到32℃和5％ CO2用于随后的生长。转染后5天再次添加ExpiCHO增强剂，并使细胞在相同条件下生长，直到活力为≤75％，此时收获培养物。
通过离心去除CHO细胞，并通过0.2μm过滤器过滤培养上清液。使用PROchievA重组蛋白A树脂(J.T.Baker，目录号JT7899)通过GE AKTA FPLC从培养基中纯化单克隆抗体。用20mM NaPO4一元碱pH 7.4(EMD，目录号SX-0710-3)平衡蛋白A柱。将细胞培养上清液施加到柱上，用20mM NaPO4一元碱pH 7.4洗涤蛋白A树脂，并用0.10M柠檬酸pH 3.0(EMD，目录号1.00242.0500)洗脱结合的抗体。收集抗体洗脱级分并用五分之一体积的1MTris HCl pH9.0(JT Baker，目录号4103-01)中和。用Amicon Ultra-15离心过滤单元(目录号UFC905024)或通过用PBS pH 7.4透析对含有纯化抗体的级分进行缓冲液更换。
通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下在MES运行缓冲液(Thermo FisherScientific)中电泳的预制1mm 4-12％ Bis-Tris凝胶(Thermo Fisher Scientific)上评价纯化抗体。用考马斯蓝对凝胶进行染色并进行成像。还使用0.2M磷酸钠pH 6.7作为流动相，通过SEC-HPLC在220nm处在Tosoh TSKgel G3000SWXL柱上评价纯化抗体。使用CharlesRiver Endosafe PTS100测量内毒素污染。
实施例4：使用Octet的抗体亲和力测定
Octet搜索：使用生物层干涉测量法(BLI)在Octet Red 96(ForteBio)系统上测量抗体亲和力。使用抗人IgG Fc捕获(AHC)浸液和读取传感器(ForteBio)捕获格式化为IgG1或IgG4并在PBS pH 7.4中稀释至20μg/mL的每种抗VISTA抗体。将AHC传感器浸入抗体溶液中180秒以将每种IgG捕获在传感器上。通过将每个传感器在PBS pH 7.4中再浸泡120秒来建立初始基线。用在HEK 293细胞(Sino Biological)中表达并在PBS pH 7.4中稀释至50nM-300nM的His标记的重组VISTA-ECD(Met 1至Ala 194)进行初始亲和力筛选。评价人、食蟹猴和小鼠VISTA-ECD。通过与VISTA-ECD缔合240秒并在PBS pH 7.4中解离360秒进行研究。使用Octet数据分析软件版本9.0.0.14进行数据分析。一般来讲，将无减法的基线比对用于原始数据处理。使用Savitzky-Golay数字滤波器来去除高频噪声，并将处理后的数据全局拟合到1:1结合模型。当存在结合时，计算每个抗体-抗原对的亲和常数(KD)。
在一些情况下，通过将VISTA-ECD捕获在Anti-Penta-His(HIS1K，ForteBio)传感器上并测量抗VISTA抗体与固定VISTA-ECD的结合动力学来测量亲合力而非亲和力。
每种抗体的代表性数据在图1A-1N、2A-2G和3A-3G以及表14和表15中示出。来自多个独立实验的数据在每个表中表示为单独的行。每种抗体以低nM亲和力与人和食蟹猴VISTA-ECD强效结合。没有抗体显示可测量的与小鼠VISTA-ECD的结合，并且未计算小鼠的KD值。如对二价抗体所预期的，当Octet格式反转时，亲合力大于亲和力。
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在缔合步骤中提供0.2和0.6nm的信号偏移的条件下评价Octet测定中配体加载水平的影响。一般来讲，当传感器上的配体加载浓度降低时，KD值低2-3倍。
pH对抗体亲和力的影响：为了鉴定在pH 7.4下与VISTA结合、与细胞表面表达的VISTA一致但在内体pH下从受体解离的抗体，进行Octet，其中在pH 7.4下测量配体缔合并且在pH 6下测量解离。表16示出了与相同抗体在单个实验中的缔合速率(pH 7.4)和解离速率(pH 6)相比，7种抗体在pH 7.4下的平均Kon(1/Ms)和Kdis(1/s)。结果在表中示出。若干抗体的解离常数在pH6下增加，表明这些抗体在pH 7.4下将与细胞表面表达的VISTA紧密结合，但在pH<6下将从内体VISTA解离。
表16：pH 6和pH 7.4下Kdis的比率。
全动力学分析：通过BLI使用Octet系统对0-500nM的分析物浓度的2倍连续稀释液进行结合亲和力的全动力学分析。通过使用Octet系统数据分析软件中的稳态分析工具来计算平衡结合常数。在0.05<Req<0.5nm的结合踪迹上进行分析。以这种方式估计的抗体结合亲和力在图4A-4G和表17中示出，并且与Octet搜索研究一致。
表17：抗体亲和力的全动力学分析
实施例5：通过ELISA测定抗体亲和力
将镍包被的96孔ELISA板(Thermo Scientific)或Maxisorb 96孔聚苯乙烯ELISA板在4℃下用50μL 0.5-1μg/mL His标记的VISTA蛋白(SinoBiological，在HE293细胞中产生的Met1-Ala194)在0.1M NaHCO3 pH 9.6中的溶液包被过夜。所有随后的孵育都在室温下进行。将孔用PBST(0.05％Tween 20)洗涤3次并用200μL 5％ BSA的PBST溶液封闭2小时。将抗VISTA抗体在0.5％ BSA的PBST溶液中稀释至2-23μg/mL，并在0.5％ BSA/PBST中制备10-0.003μg/mL的5倍连续稀释液。将每种抗体稀释液以50-100μL/孔在ELISA板中孵育1小时，之后将板用PBST洗涤3次，并与生物素SP AffiniPure驴抗人IgG(H+L)多克隆抗体(JacksonImmunoResearch，50 -100μL/孔)的1:20,000稀释液一起孵育1小时。将孔用PBST洗涤3次，并将板与50-100μL链霉亲和素-HRP(R&D Systems)的1:200稀释液一起孵育30分钟。将孔用PBST洗涤3次，并用100μL 1步超快速TMB底物(Thermo Scientific)显色2分钟。用100μL 2NH2SO4终止反应，并在450nm下测量板孔吸光度(Biotek ELx808)。
对于人VISTA结合数据，根据对数转换的剂量-反应数据的非线性回归计算EC50值。图5A-5D示出了每种抗VISTA抗体对人VISTA的剂量反应ELISA数据，并且表18提供了相关的EC50值。所有抗体通过ELISA都显示以低纳摩尔EC50与人VISTA的强效结合。
对于猴和小鼠VISTA结合，在1、2或23μg/mL下进行单一终点测定。表19提供了每种抗体对人、猴和小鼠VISTA的终点吸光度。所有抗体通过该方法都与人和猴VISTA等同地结合。甚至在23μg/mL下，没有抗体显示与小鼠VISTA的可感知结合。
表18：如通过ELISA测量的抗VISTA抗体对人VISTA的EC50值。
抗体 EC50(μg/mL) EC50(nM)
269.1 0.475 3.2
321.1 0.230 1.6
245.1 0.139 0.9
245.4 0.254 1.7
465.1 0.619 4.2
465.4 1.729 11.7
457.1 0.394 2.7
173.1 0.306 2.1
173.4 0.808 5.5
833.1 0.074 0.5
150.1 0.01 0.07
474.1 0.008 0.06
80 0.008 0.055
85 0.009 0.059
87 0.009 0.063
91 0.012 0.078
92 0.009 0.060
表19：通过ELISA得到的人、小鼠和猴VISTA上抗VISTA抗体的终点吸光度。
*在1μg/mL下测试。
实施例6：通过ELISA测定抗体亲和力
将镍包被的96孔ELISA板(Thermo Scientific)或Maxisorb 96孔聚苯乙烯ELISA板在4℃下用50μL 0.5-1μg/mL His标记的VISTA蛋白(SinoBiological，在HE293细胞中产生的Met1-Ala194)在0.1M NaHCO3 pH 9.6中的溶液包被过夜。所有随后的孵育都在室温下进行。将孔用PBST(0.05％Tween 20)洗涤3次并用200μL 5％ BSA的PBST溶液封闭2小时。将抗VISTA抗体在0.5％ BSA的PBST溶液中稀释至2-23μg/mL，并在0.5％ BSA/PBST中制备10μg/mL-0.05ng/mL的3.5至5倍连续稀释液。将每种抗体稀释液在ELISA板中孵育(50-100μL/孔)1小时，之后将板用PBST洗涤3次，并与生物素SP AffiniPure驴抗人IgG(H+L)多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch，50-100μL/孔)的1:20,000稀释液一起孵育1小时。将孔用PBST洗涤3次，并将板与50-100μL链霉亲和素-HRP(R&D Systems)的1:200稀释液一起孵育30分钟。将孔用PBST洗涤3次，并用100μL 1步超快速TMB底物(Thermo Scientific)显色1.5-2分钟。用100μL 2N H2SO4终止反应，并在450nm下测量板孔吸光度(CLARIOstar微孔板读取器)。
对于人VISTA结合数据，根据对数转换的剂量-反应数据的非线性回归计算EC50值。图5E、5F示出了每种抗VISTA抗体对人VISTA的剂量反应ELISA数据，并且表20提供了相关的EC50值。所有抗体通过ELISA都显示以低纳摩尔EC50与人VISTA的强效结合。
表20.如通过ELISA测量的抗VISTA抗体对人VISTA的EC50值。
抗体编号 EC50(ng/mL) EC50(nM)
80 8.255 0.055
85 8.871 0.059
87 9.490 0.063
91 11.700 0.078
92 8.944 0.060
实施例7：在pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0或pH 7.4下通过ELISA确定抗体亲和力
将Maxisorb 96孔聚苯乙烯ELISA板在4℃下用100μL 0.5μg/mL His标记的VISTA蛋白(SinoBiological，在HE293细胞中产生的Met1-Ala194)在0.1M NaHCO3 pH 9.6中的溶液包被过夜。所有随后的孵育都在室温下进行。将孔用PBST(0.05％ Tween 20)洗涤3次并用200μL 5％ BSA的PBST溶液封闭2小时。将抗VISTA抗体在0.5％ BSA的PBST溶液中稀释至1000ng/mL，并在pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0或pH 7.4的0.5％ BSA/PBST中制备1000ng/mL-0.16ng/mL的2.4倍连续稀释液。将每种抗体稀释液在ELISA板中孵育(100μL/孔)1小时，之后将板用pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0或pH 7.4的PBST洗涤3次，并与pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0或pH 7.4的生物素SP AffiniPure驴抗人IgG(H+L)多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch，100μL/孔)的1:20,000稀释液一起孵育1小时。将孔用pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0或pH 7.4的PBST洗涤3次，并将板与100μL pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0或pH 7.4的链霉亲和素-HRP(R&DSystems)的1:200稀释液一起孵育30分钟。将孔用pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0或pH 7.4的PBST洗涤3次，并用100μL 1步超快速TMB底物(Thermo Scientific)显色1.5分钟。用100μL 2NH2SO4终止反应，并在450nm下测量板孔吸光度(CLARIOstar微孔板读取器)。图5G-5I示出了每种抗VISTA抗体在不同pH下对人VISTA的剂量反应ELISA数据，并且表21提供了相关的EC50值。所有抗体通过ELISA都显示在所有pH下以低纳摩尔EC50与人VISTA的强效结合，在pH6.0下观察到结合减少。对于Ab No.150.1，在酸性pH下结合减少更明显。
表21.如通过ELISA测量的在不同pH下抗VISTA抗体对人VISTA的EC50值。
实施例8：抗VISTA抗体结合特异性
使用ELISA评价抗VISTA抗体与B7蛋白家族的相关成员结合的能力。评价以下his标记的B7蛋白的脱靶结合：CD80/B7-1、CD86/B7-2、ICOS/B7-H2、PD-L1/B7-H1、B7-DC/PD-L2/CD273、B7-H4/B7S1/B7x、和B7-H3/CD276(全部来自Sino Biological)。将Maxisorb 96孔ELISA板(Thermo Fisher Scientific)用每种B7家族成员蛋白以50μL/孔的2μg/mL在0.1MNaHCO3 pH 9.6中的溶液在4℃下包被过夜或在37℃下包被1小时。用PBST洗涤板，并在室温下用200μL 5％ BSA的PBST溶液封闭2小时。进一步洗涤后，使一抗在室温下与每个板结合1小时。抗VISTA抗体以10μg/mL结合。以1:2000或1:10000稀释度使用以下对照抗体：抗CD80/B7-1抗体、小鼠mAb(SinoBiologics，目录号10698-MM01)、抗CD86/B7-2抗体、小鼠mAb(SinoBiologics，目录号10699-MM02)、抗ICOS/B7-H2抗体、小鼠mAb(SinoBiologics，目录号11559-MM07)、抗PD-L1/B7-H1抗体、小鼠mAb(SinoBiologics，目录号10084-MM37)、抗B7-DC/PD-L2/CD273抗体、兔mAb(SinoBiologics，目录号10292-R018)、抗B7-H4/B7S1/B7x抗体、兔pAb(SinoBiologics,目录号10738-T24)、抗B7-H3/CD276抗体、小鼠mAb(SinoBiologics，目录号11188-M008)和Ultra-LEAFTM纯化人IgG1同种型对照(BioLegend)。倒出一抗，并将板用PBST洗涤3次，然后在室温下与HRP缀合的抗小鼠、抗人或抗兔IgG的1:10000稀释液(50μL)一起孵育1小时。进一步洗涤后，将板用100μL 1步Ultra TMB底物在室温下显色2分钟。没有抗VISTA抗体结合除VISTA以外的B7蛋白家族成员(图6A-6H)。
实施例9：与细胞表面VISTA结合的抗体。
物种交叉结合：评价抗体结合在CHO K1细胞上稳定表达的人、小鼠和食蟹猴VISTA的能力。使表达VISTA的CHO细胞系在选择下在具有10％胎牛血清(FBS)的F-12K培养基(ATCC)中生长至汇合。在室温下用Accutase(Thermo Fisher Scientific)从组织培养瓶中分离细胞，在具有10％ FBS的F12-K培养基中稀释，并用冷PBS洗涤。将悬浮液中的细胞稀释至1.5x106个细胞/mL的最终浓度，并将100μL分配在微量滴定板的每个孔中。通过离心使细胞沉淀，并在冰上将其重悬于50μL可固定活/死nIR染料(Thermo Fisher)的1:1000稀释液中30分钟。将细胞在FACS染色缓冲液(4％ FBS，0.05％叠氮化钠的PBS溶液)中稀释，通过离心回收，并在冰上在50μL在FACS染色缓冲液中稀释至0.05、1或150nM的抗VISTA抗体中孵育30分钟。用FACS染色缓冲液在PBS中的逐步稀释液洗涤细胞，并将其重悬于50μL在FACS染色缓冲液中1:200稀释的二抗(PE标记的山羊抗人IgG(H+L)，Jackson ImmunoResearch)中，然后在冰上孵育30分钟。如前所述洗涤细胞，将其重悬于50μL冷PBS中，并在室温下添加150μLCytofix(BD Pharmingen)处理5分钟。通过离心收集细胞并将其重悬于PBS中。在AttuneNXT流式细胞仪上收集样品数据。
图7A-7C示出了抗VISTA抗体在150nM、1nM和0.05nM下与稳定表达人、猴和小鼠VISTA的CHO细胞结合的平均荧光强度。抗体显示与猴和人VISTA的强效结合。在所有抗体浓度下，这些细胞系的MFI水平在各物种间大致相当。没有抗体显示与小鼠VISTA的显著结合。
多点滴定：使在其表面上稳定表达人VISTA的CHO K1细胞生长，收获所述细胞并用抗VISTA抗体在如上所述的浓度范围(0.006、0.024、0.098、0.391、1.563、6.25、25和100nM)内标记。收集数据并将其表示为Log MFI与Log抗体浓度的关系。通过非线性回归拟合转化的数据(图8A-8R)，并如下表(表22)中所提供计算EC50值。
表22：与细胞表面表达的人VISTA结合的抗体的EC50值。
抗体 EC50(nM)
269.1 0.1138
321.1 0.2667
245.1 0.2312
465.1 0.2185
457.1 0.118
173.1 0.2037
VSTB174 0.2558
474.1 0.6606
150.1 0.06374
80 0.2946
92 0.3706
87 0.4584
91 0.8048
245.4 0.213
465.4 1.266
173.4 0.2467
实施例10：抗VISTA抗体的表位作图。
Octet分箱研究：通过BLI在Octet系统上进行表位作图。使用AHC传感器在100秒内捕获抗VISTA抗体(20μg/mL)。用饱和量(50μg/mL)的合并纯化人IgG封闭传感器上的未结合位点180秒。使抗原(his标记的人VISTA-ECD，100nM)与固定抗体结合180秒，之后询问传感器配对抗体以夹心形式结合抗原的能力。询问多个配对排列，使得将每种抗体至少一次用作该格式的捕获抗体。数据表示为二抗的反应(nm)。将抗体VSTB-174(在国际专利申请公开号WO 2016/207717 A8中描述)用作对照抗体。数据显示，使用BLI分箱技术，每种抗体与相同的表位箱结合。数据在下表23中表示。
表23：来自配对分箱格式的二抗的BLI反应数据。
表位作图研究：使用肽作图研究来鉴定介导人VISTA与抗体245.1、465.1和VSTB-174结合的线性表位。使用ELISA来测量来自人VISTA的连续重叠的15聚体合成肽阻断抗体与固定在微量滴定板上的全长VISTA-ECD结合的能力。用BSA封闭镍包被的ELISA板，并使其在室温下与0.5μg/mL VISTA蛋白(人重组体，在HEK 293细胞中产生，SinoBiologics)结合1小时。将抗VISTA抗体稀释至其EC50浓度的2倍，并在室温下与0.5％ BSA的PBST中的2μg/mL或20μg/mL肽溶液一起以1:1的比率预孵育30分钟。将肽结合的抗体溶液(50μL)添加到每个微量滴定孔中，并在室温下孵育1小时，之后洗涤ELISA板，并如上针对标准ELISA所述进行处理。数据表示为在没有与肽溶液预孵育的情况下获得的ELISA信号的减少百分比。将使抗体结合减少≥33％的肽鉴定为潜在表位(表24)。
表24：鉴定抗VISTA抗体的线性结合表位的肽阻断研究
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通过对具有氨基酸序列66HLHHG70(SEQ ID NO:380的氨基酸98-102)和116VVEIRHHHSEHR127(SEQ ID NO:380的氨基酸148-159)(编号表示从成熟多肽的第一个氨基酸开始人VISTA(SEQ ID NO:380)的残基)的抗体245.1和465.1进行该分析来鉴定两个相同的结合表位。这些相同的肽序列似乎包含在针对VSTB-174鉴定的线性表位中。
抗体表位的突变分析：先前已经报道了人VISTA的三个氨基酸(R54、F62和Q63)主要负责VSTB-112(VSTB-174的密切相关类似物)与VISTA蛋白的结合(参见Mehta,N.Structure and functional binding epitope of V-domain Ig suppressor of Tcell activation.Cell Rept.(2019)28(10):P2509-2516)。为了确定本文所述的抗体是否与VSTB-174结合相同的表位，在VISTA-ECD中用丙氨酸取代这3个氨基酸中的每一个，并测量抗体与表达为Fc缀合物的该三重突变体蛋白(hVISTA ECD-Fc R54A、F62A、Q63A，SEQ IDNO:382)的结合。基本上如上所述，使用ELISA来测量抗体与野生型和突变体VISTA的结合。将VISTA-Fc(5μg/mL)固定在Maxisorb 96孔ELISA板上，并使其以标准ELISA形式与稀释至10μg/mL的每种抗体反应。结合数据报告为450nm处的吸光度。
VSTB-174不结合三重VISTA-Fc突变体。抗体编号465.1显示与突变体VISTA的结合减少(为野生型的约25％)，表明465.1与VSTB-174之间存在部分重叠的表位(参见下表25)。抗体编号269.1、321.1、245.1、457.1、173.1和833.1的结合不受突变的影响，表明这些抗体与来自VSTB-174的不同表位结合。
基于抗体分箱、肽作图和突变分析的组合，可以得出结论，测试的抗体与来自VSTB-174和相关抗体的在空间上接近但不同的表位结合。
表25：与突变体人VISTA-Fc结合的抗体
抗体 ELISA Ab 450nm
269.1 1.650
321.1 1.646
245.1 1.484
465.1 0.351
457.1 1.603
173.1 1.656
833.1 1.560
VSTB-174 0.017
IgG1 0.019
通过ELISA进行抗体表位的突变分析
通过VISTA的细胞外结构域的各种突变评价抗VISTA抗体与其表位的结合。不同突变的编号对应于没有信号肽的VISTA-ECD。每个突变的氨基酸在VISTA-ECD中被丙氨酸取代并表达为Fc缀合物。评价以下抗体编号：474.1(WT)、150.1(YTE)、85、87、91、92和VSTB174，并在突变体与WT VISTA ECD之间进行比较。使用ELISA来测量抗体结合。将VISTA-Fc(3μg/mL)固定在Maxisorb 96孔ELISA板上，并使其与以100ug/mL-0.003ug/mL滴定的每种抗体反应，并使用生物素化抗人Ig轻链κ、随后使用链霉亲和素-HRP和TMB底物来进行检测。使用CLARIOstar读板器在450nm光密度下测定结合。VISTA-ECD突变体(R54A、F62A和Q63A)不结合VSTB174，并显示出与Ab No.87和No.91的结合减少(表27，图8S-8Y)。抗体编号150.1、编号474.1、编号85和编号92的结合不受该三重突变的影响(表26-27，图8S-8Y)。VISTA-ECD突变体2.3(Y37A、V117A、R127A)显示出与抗体编号150.1、编号474.1、编号85、编号87、编号91、编号92和VSTB174的结合减少(表26-27，图8S-8Y)。VSTB174结合受该三重突变的影响最小。双重VISTA-ECD突变体10.1(R54A、R127A)显示出与抗体编号150.1、编号474.1、编号85、编号87、编号91、编号92和VSTB174的结合减少(表26-27，图8S-8Y)。VSTB174结合受该双重突变的影响最小。
先前已经报道了人VISTA的三个氨基酸(R54、F62和Q63)主要负责VSTB-112(VSTB-174的密切相关类似物)与VISTA蛋白的结合(参见Mehta,N.Structure and functionalbinding epitope of V-domain Ig suppressor of T cell activation.Cell Rept.(2019)28(10):P2509-2516)。抗体编号150.1、编号474.1、编号85和编号92的结合不受影响，表明这些抗体与针对VSTB-174报道的单独表位结合。这些数据一起表明，Ab No.150.1和Ab No.474.1与VSTB174结合不同的表位，并且该表位中由Ab No.150.1和Ab No.474.1识别的关键氨基酸是SEQ ID NO:377的酪氨酸37、精氨酸54、缬氨酸117和精氨酸127。
表26：与突变体人VISTA-Fc结合的抗体
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表27：与突变体人VISTA-Fc结合的抗体
实施例11：在金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)人T细胞活化测定中抗VISTA Mab的体 外功能表征
在SEB人T细胞活化测定中评价抗VISTA mAb(所有IgG1和一些IgG4)的功效。简言之，在SEB测定中，将来自单个健康供体的人PBMC与细菌超抗原(5ng/ml的SEB)一起孵育，所述细菌超抗原将抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类蛋白直接连接到T细胞上的T细胞受体(TCR)，从而引起T细胞活化，随后引起IFNγ细胞因子分泌，所述分泌在4天后定量测量。由于IFNγ也可以由NK细胞分泌，因此在测定中使用NK细胞耗尽的PBMC以减少背景信号并改善反应的动态范围。将同种型IgG1或IgG4 mAb用作相应测定中的阴性对照。以3μg/ml的饱和浓度筛选mAb。
将来自健康供体的PBMC在37℃水浴中解冻。将细胞在室温下以1500rpm沉淀5分钟，并在计数前在细胞培养基中洗涤。然后将细胞以1E8个细胞/ml重悬于EasySep培养基中并转移到5ml聚苯乙烯圆底管中。如下使用EasySep NK选择试剂盒进行NK细胞耗尽。添加选择混合物(100μl/ml样品(细胞))，混合并在室温下孵育6分钟，然后添加RapidSpheres(100μl/ml样品(细胞))。将该混合物在室温下孵育6分钟，然后用EasySep培养基补足至2.5ml最终体积。然后，将管无盖置于磁体中并在室温下孵育6分钟。将带有磁体的管倒置，并将上清液丢弃到新管中。将该上清液放回磁体中并在室温下孵育6分钟。然后将带有磁体的管倒置，并将丢弃的上清液收集到新的15ml聚丙烯锥形管中。这对应于用细胞培养基将NK耗尽的PBMC亚群补足至12ml的最终体积。将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟，并在计数前将沉淀重悬于5ml细胞培养基中。最后，将细胞以2E6个细胞/ml重悬于细胞培养基中，准备用于SEB活化测定。为此，将每孔100μl细胞(2x105个细胞/孔)添加到96孔U形底组织培养板(Corning，目录号3799)中，并一式三份地进行条件。添加50μl含有浓度为12μg/mL(4X)的测试Ab的细胞培养基，使最终测试Ab浓度为3μg/mL。对于测试的Ab的剂量滴定，制备以下最终浓度并在室温下孵育20分钟：30、3、0.3、0.03μg/ml。然后，每孔添加50μL含有浓度为20ng/mL(4X)的SEB抗原的细胞培养基，使最终SEB浓度为5ng/mL，然后在37℃和5％ CO2下孵育4天。然后在室温下以1500rpm离心5分钟后收集上清液，并使用ProQuantum(ThermoFischer，目录号A355765)或ELISA试剂盒(Invitrogen，目录号88-7316-88)根据制造商的说明分析IFNγ产生。
总之，Ab No.269.1、Ab No.321.1、Ab No.245.1、Ab No.474.1、Ab No.150.1、AbNo.465.1、Ab No.457.1、Ab No.173.1和Ab No.833.1在SEB诱导的人T细胞活化测定中显示出功效，并以剂量依赖性方式增强人T细胞活化。在SEB诱导的人T细胞活化测定中，IgG1 Fc主链比IgG4 Fc主链更有效(图9-17)。
实施例12：T细胞活化测定中抗VISTAMab的体外功能表征。
在该测定中，通过流式细胞术来评价抗VISTA抗体在VISTA处理的细胞中恢复T细胞增殖的能力，并通过使用ELISA测量IFNγ分泌来评价T细胞活化。
用适当抗CD3溶液、同种型Ab或抗VISTA抗体溶液以100μl/96孔平底板的孔包被96孔平底板，并在4℃下孵育过夜。将CD3+泛T细胞在37℃下在补充有CTL抗聚集物的温X-VIVO15培养基中解冻，洗涤并计数。将细胞以400g沉淀5分钟，并以1x106个细胞/ml重悬于PBS中用于CellTrace标记。为了用CellTrace标记细胞，将1μl 5mM Violet/ml样品(最终浓度5μM CellTrace Violet)添加到细胞中，并将细胞在37℃下在黑暗中孵育20分钟。为了淬灭染色，添加5体积的10％ FBS/培养基，并将细胞在20℃下孵育5分钟。然后，将细胞在20℃下以400g沉淀5分钟，并以2x106个细胞/ml重悬于X-VIVO15培养基中。
将用抗CD3 Ab包被的板用PBS洗涤两次，并在存在或不存在Ab(100μg/ml)的情况下添加VISTA包被的珠，然后进一步添加100μl/孔(即，2x105个细胞/孔)的T细胞。然后将板在37℃下在5％ CO2中孵育4天。然后收集上清液用于IFNγ免疫测定，并在离心和洗涤后回收细胞用于流式细胞术分析。
抗体编号173.1显示出由抗CD3抗体诱导的VISTA介导的人泛T细胞活化抑制的逆转。当用板结合的抗CD3 Ab刺激人泛T细胞时，观察到抗体对VISTA介导的T细胞活化抑制的逆转，并且VISTA抑制由VISTA包被的珠介导(但当VISTA是板结合的时没有这种情况)。抗体编号269.1、抗体编号321.1和抗体编号457.1显示出VISTA介导的抗CD3人泛T细胞活化抑制的逆转。抗体编号245.1显示出VISTA介导的抗CD3人泛T细胞活化抑制的适度逆转(图18A-22B)。
实施例13：单核细胞活化测定中抗VISTA抗体的体外功能表征
使用单核细胞活化功能测定来确定抗体在诱导人单核细胞活化中的功能活性。简言之，将来自单个供体的PBMC富集来自同一供体的CD14+单核细胞群体，然后与抗VISTAmAb一起孵育24小时，从而引起单核细胞活化，CD14+单核细胞上细胞表面活化标记HLA-DR、CD80和CD86的上调，以及CXCL10趋化因子分泌。本文所述的一些抗VISTA mAb的功能筛选以单次剂量和剂量依赖性方式进行。也在该测定中评价IgG1相对于IgG4 Fc主链的作用以及NK细胞的作用。
CD14+细胞富集：将来自健康供体的PBMC解冻，并通过在室温下以1500rpm离心5分钟来沉淀细胞。用10ml细胞培养基洗涤后，对细胞进行计数并将其重悬于300ml MACS缓冲液中用于CD14+富集。首先添加100μl FcR封闭试剂，然后添加100ml生物素-抗体混合物，然后轻轻混合并在黑暗中在冰上孵育10分钟。然后添加200μl抗生物素微珠，轻轻混合并在室温下孵育15分钟。用MACS缓冲液洗涤细胞后，将它们在室温下以1500rpm离心5分钟，并重悬于500μl MACS缓冲液中，然后置于合适的MACS分离器的磁场中的LS柱上。将通过后洗脱的细胞收集在15ml聚丙烯锥形管中。将该柱用MACS缓冲液进一步洗涤3次，并收集洗脱液，然后在室温下以1500rpm离心5分钟。将所得细胞沉淀重悬于5ml细胞培养基中，计数，并保存大约2x106个细胞用于富集后染色，而对于未标记的共培养板保存10x106个细胞。将这些富集的CD14+细胞以1x106个细胞/ml重悬于PBS中并用CellTrace Violet标记。添加1μl 5mMViolet/ml样品(最终浓度：5μM CellTrace Violet)，并将细胞在37℃下在黑暗中孵育20分钟。为了淬灭染色，添加5倍体积的含有10％ FBS的培养基并孵育5分钟，然后在室温下以400g离心细胞5分钟。然后将细胞以1x10^6个细胞/ml重悬于细胞培养基中。
PBMC制备：将来自同一供体的PBMC解冻，并在室温下以1500rpm离心5分钟后沉淀细胞。用10ml细胞培养基洗涤后，对细胞进行计数并将其以4x106个细胞/ml重悬于细胞培养基中。
将50μl/孔的CD14+细胞(0.5x105个细胞/孔)添加到50μl/孔的人PBMC(2x105个细胞/孔)中，并在制备抗体时置于培养箱中的96孔板中。将测试抗体以2倍最终浓度稀释，并添加到96孔板中，在37℃和5％ CO2下保持24小时。将具有CellTrace Violet标记的CD14+富集细胞的一个板放在一边并用于流式细胞术分析，并且将具有未标记的细胞的第二个板(相同布局)用于CXCL-10分泌的测量。对于CXCL10分泌，将细胞在室温下以1500rpm沉淀5分钟，并将上清液转移到96孔板中，以根据制造商的方案进行CXCL10ELISA。
对于流式细胞术分析，每孔添加50μl抗FcR抗体(huIgG在FACS缓冲液中最终为100μg/ml)并在冰上孵育15分钟。然后，对于细胞外染色，添加50μl Ab混合物/孔(含有针对CD14、CD80、CD86、HLA-DR的抗体和活/死染色)并在黑暗中在冰上孵育15分钟，然后离心并在1000g、4℃下洗涤2分钟。在AttunNext流式细胞仪中分析细胞。
对于实验读数，在24小时通过流式细胞术分析CD14+细胞上活化标记CD80、CD86和HLA-DR的上调，并在24小时通过ELISA分析CXCL10分泌。
基于抗体编号269.1、抗体编号321.1、抗体编号245.1、抗体编号150.1、抗体编号474.1、抗体编号465.1、抗体编号457.1、抗体编号173.1和抗体编号833.1在初始筛选中的功效对它们进行选择，并在剂量反应实验中进一步表征，范围从100μg/ml至0.003μg/ml的测试抗VISTA抗体。
抗体编号269.1、抗体编号321.1、抗体编号245.1、抗体编号465.1、抗体编号457.1、抗体编号173.1、抗体编号150.1、抗体编号474.1和抗体编号833.1在人单核细胞活化测定中以剂量依赖性方式显示出功效(图23A-23D、24A-24C、25A-25D、26A-26C、27A-27C、28A-28D、29A-29-D、30A-30C、31A-31C、32A-32C、33A-33C、34A-34C、35A-35C、36A-36I)。
为了评价所选mAb的Fc结构域在单核细胞活化测定中介导功效的作用，使用与上述相同的方案在单核细胞活化测定中测试抗体编号245.1、抗体编号465.1、抗体编号474.1和抗体编号173.1(IgG1主链)以及它们的IgG4主链对应物(分别为抗体编号245.4、抗体编号465.4、抗体编号246.4和抗体编号173.4)。
与IgG4 Fc主链相比，IgG1 Fc主链增加了抗VISTA抗体在单核细胞活化测定中的功效(图37AD-37F、38A-38C、39A-39C)。
为了评价NK细胞在单核细胞活化测定中介导抗VISTA抗体的功效中的作用，在单核细胞活化测定中测试抗体编号269.1、抗体编号173.1、抗体编号150.1和抗体编号474.1以及阴性对照抗体编号18.1。为了准备NK耗尽，如前所述解冻PBMC，并在离心后将细胞以1x108个细胞/ml重悬于EasySep培养基中，并转移到5ml(12x75mm)聚苯乙烯圆底管中。然后，将5ml(12x75mm)聚苯乙烯圆底管中的50x106个细胞/500μl EasySep培养基添加到选择混合物(50μl/ml样品(细胞))中，混合，并在室温下孵育6分钟。然后添加RapidSpheres(50μl/ml样品(细胞))，混合，并在室温下孵育6分钟。用EasySep培养基将最终体积调节为2.5ml。将管置于磁体中并在室温下孵育6分钟。将带有磁体的试管倒置，并将上清液转移到新管中。然后，将具有上清液的管放回磁体中并在室温下孵育6分钟。将带有磁体的管倒置，并将上清液转移到新的15ml管中。该上清液对应于NK耗尽的PBMC亚群。添加细胞培养基使最终体积为12ml，并将细胞在室温下以1500rpm离心5分钟，并将细胞沉淀重悬于5ml细胞培养基中。对细胞进行计数，将其以4x106个细胞/ml重悬于细胞培养基中，以50μl/孔铺在96孔U形底板中，并置于37℃培养箱中用于测定设置。
主要在存在含有NK细胞的PBMC的情况下观察到CD14+细胞上CD80和HLA-DR活化标记的表达的诱导以及CXCL10分泌的增加。这些数据表明NK细胞是抗VISTA抗体诱导的人单核细胞活化所必需的(图40A-40F、41A-41I)。
实施例14：MDSC(细胞因子诱导的)抑制测定中抗VISTA抗体的体外功能表征
细胞因子诱导的MDSC的抑制功能可以通过其抑制抗CD3诱导的T细胞增殖(通过流式细胞术)和IFNγ产生(通过ELISA)的能力来测量。
从来自健康供体的总PBMC开始，将细胞在补充有CTL抗聚集物的温X-VIVO15培养基中解冻，洗涤并计数。在室温下以400g离心5分钟后，将细胞以5x105个细胞/ml重悬于补充有GM-CSF(10ng/ml)和IL6(10ng/ml)的X-VIVO15培养基中。每2-3天用补充有GM-CSF(10ng/ml)和IL6(10ng/ml)的X-VIVO15培养基更新培养基。为了进行MDSC分离，用1ml/75cm2的Detachin(非蛋白酶细胞分离溶液)从该细胞培养物中收集细胞，并在37℃下孵育5-10分钟。用细胞刮棒分离细胞，然后按照制造商的说明使用CD11b微珠和LS柱分离(Miltenyi)进行CD11b+细胞分离。最后，以2x106个细胞/ml X-VIVO15培养基重悬MDSC。
将来自同一供体的PBMC解冻并计数，然后以400g沉淀5分钟。将细胞以1x106个细胞/ml重悬于PBS中并用CellTrace标记。向细胞中添加1μl5mM Violet/ml CellTrace/样品(最终浓度：5μM CellTrace Violet)，并将细胞在37℃下在黑暗中孵育20分钟。然后用5体积的补充有10％ FBS的培养基淬灭染色，并将细胞孵育5分钟。然后将细胞悬浮液等分成2等份，在室温下以400g沉淀5分钟，并以2x106个细胞/ml重悬于X-VIVO15培养基中。
按照MDSC板，将50μl 4μg/ml的抗CD3 Ab(HIT3a)(板上的最终浓度：1μg/mL)以50μl/孔(即，1x105个细胞/孔；2x106个细胞/mL)添加到96孔U形底板的新鲜解冻的PBMC中。将MDSC以50μl/孔(即，1x105个细胞/孔；2x106个细胞/mL)铺在同一96孔U形底板上。添加50μl/孔的40μg/mL抗体(最终浓度10μg/mL)。将细胞在37℃下在5％ CO2中孵育3天，然后进行细胞增殖的流动分析和IFNγ分泌的ELISA。
抗VISTA抗体逆转了抗CD3 Ab诱导的T细胞增殖的大部分MDSC抑制和IFNγ诱导的分泌的活化(图42A-46B)。
实施例15：在多种Fc受体结合测定中评价Fc突变体
本研究的目的是评价野生型和各种IgG Fc突变结合一系列相关Fc受体作为Fc突变的体内作用的预测因子的能力。我们还比较了IgG1和IgG4主链结合这些Fc受体的能力。评价以下抗体：抗体编号173.1和抗体编号474.1(野生型，“WT”)、相应的抗体编号420.1和抗体编号150.1(根据EU编号均具有M252Y、S254T和T256E取代(“YTE”))、抗体编号289.1(根据EU编号相对于抗体编号173.1具有M428L和N434S取代(“LS”))、抗体编号173.4和抗体编号246.4(WT)、抗体编号420.4(含有YTE)和抗体编号289.4(含有LS)，并在FcRn上与VSTB174(WT)进行比较；FCGR1/CD64；FCGR2a/CD32a(167H)&FCGR2a/CD32a(167R)；以及FCGR3a/CD16(176Phe/F158)&FCGR3a/CD16a(176Val/V158)结合测定。使用以下AlphaLisa结合试剂盒进行评价：
·FcRn(Perkin Elmer#AL3095C)
·FcgR1/CD64(Perkin Elmer#AL3081C)
·FcgR2A/CD32a(167H)(Perkin Elmer#AL3086C)
·FcgR2A/CD32a(167R)(Perkin Elmer#AL3087C)
·FcgR3A/CD16a(176Phe/F158)(Perkin Elmer#AL347HV)
·FcgR3A/CD16a(176Val/V158)(Perkin Elmer#AL348HV)
使用通用FcR测定方案进行本研究。将MES缓冲液用于FcRn结合测定的所有试剂稀释，并将HiBlock缓冲液用于FCGR1/CD64；FCGR2a/CD32a(167H)&FCGR2a/CD32a(167R)；以及FCGR3a/CD16(176Phe/F158)&FCGR3a/CD16a(176Val/V158)结合测定的所有试剂稀释。从100μl每种IgG开始，在HiBlock或MES缓冲液中以1mg/mL制备抗VISTA抗体的系列稀释液。如下由储备液制备12点半对数稀释液。
表28.
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根据制造商对每种受体的建议制备生物素化Fc受体的4倍溶液。根据制造商对每种受体的建议，制备20μg/mL或40μg/mL的人IgG Fc缀合的受体珠和链霉亲和素供体珠的2倍溶液，并保存在弱光下直至使用。在96孔半区白色板中，每孔添加10μl 4x测试抗体，然后添加10μl 4x Fc受体以及20μl 2x huIgG Fc缀合的受体珠和链霉亲和素供体珠并混合。将板在室温下在黑暗中孵育90分钟，并在CLARIOstar光谱仪中在680nm/615nm(激发/发射)处读数。
在这些不同的FcR结合测定中，我们表明YTE突变体在FcRn结合方面比野生型IgG1和野生型IgG4表现出显著的改善(5-7倍)。与野生型IgG1相比，YTE突变显示出与FCGR1A的结合减少(4倍)，与FCGR2A变体的结合减少(4-5倍)，并且与FCGR3A变体的结合减少(6-7倍)。与野生型IgG1相比，野生型IgG4也显示出与FCGR1A的结合减少(6倍)，与FCGR2A变体的结合减少(3-14倍)，并且与FCGR3A变体的结合减少(>33倍)。
对于IgG1和IgG4，LS突变体在FcRn结合方面比野生型抗体表现出显著的改善(3-4倍)。与野生型IgG相比，LS突变体显示出与FcγR1变体的结合增加。LS突变体另外相对于野生型对照显示出与FcγR2变体的结合增加。突变的作用仅存在于IgG1形式中，而IgG4中的突变在FcγR2结合中没有显示出作用。当掺入IgG1构建体中时，LS突变体相对于野生型在FcγR3A变体结合方面表现出很小的变化。IgG4 LS变体与野生型相当(图47A-47B、48A-48B、49A-49D、50A-50D)。
实施例16：FcRn配体与结合到FAB2G生物传感器的VISTA mAb结合的动力学
新生儿Fc受体(FcRn)指导的再循环可以通过防止溶酶体降解并将抗体返回到细胞表面来增加单克隆抗体(mAb)的半衰期。本研究的目的是评价FcRn结合位点的IgG1 Fc特异性修饰与FcRn的动力学相互作用，并通过生物层干涉测量法(BLI)证实与先前通过ELISA在FcRn受体上观察到的WT相比，YTE突变抗体的结合特异性增加。比较以下mAb：VSTB174、AbNo.474.1(WT)和No.150.1(YTE)。使用BLI在Octet K2(ForteBio)系统上测量FcRn与三种抗体结合的动力学。
将浓度为1ug/ml的纯化抗体编号150.1、编号474.1和VSTB174加载(加载步骤)到抗人Fab-CH1(FAB2G；ForteBio)浸液和读取生物传感器120秒。将加载后的生物传感器浸入(缔合步骤)800、200、50和0纳摩尔浓度的连续稀释的FcRn(R&D systems)中240秒。将相关的生物传感器浸入磷酸盐测定缓冲液(PAB；100mM磷酸钠、150mM NaCl、0.05％ Tween-20；pH 6.0)溶液中360秒(解离步骤)。包括基线、缔合和解离在内的所有步骤均在pH为6.0的PAB中进行以复制FcRn-Fc活性的细胞内生物学。进行1:1全局曲线拟合分析以确定所有浓度的FcRn分析物的ka、kdis和KD。仅分析前10秒的双相解离曲线。使用Octet数据分析软件版本12.0.2.59进行数据分析。使用Savitzky-Golay数字滤波器来去除高频噪声。
为每种mAb创建三个传感图。FcRn配体的四种浓度与每种mAb的双相曲线在图50E-50G中从图的底部到顶部在上升浓度中重叠。Ab No.150.1(YTE)对FcRn配体具有最强的亲和力，在四个双相曲线的平均值上平均KD为8.41E-08。这比野生型抗体No.474.1增加11倍。通过Ab No.150.1的FcRn修饰，也增加了可以指示结合配体的量的曲线的反应。总之，通过KD和反应测量，Ab No.150.1上的FcRn结合位点的修饰增强了分析物与抗体之间的相互作用的强度。该实验说明了Ab No.150.1的半衰期为在体内增加的原因。
表29.
实施例17：抗VISTA Mab诱导ADCC(抗体依赖性细胞毒性)的体外功能表征
在ADCC(抗体依赖性细胞毒性)测定中评价抗VISTA抗体活性。进行剂量滴定以用效应细胞(健康供体PBMC)和靶细胞(Raji-hVISTA细胞，InvivoGen)在DELFIA ADCC测定中测试100、30、10、3.0、1.0和0.3ng/ml的抗体编号465.1、抗体编号173.1、抗体编号420.1和抗体编号173.4。
以[50:1]的比率[效应物:靶标]([5x105个PBMC:1x104个用BATDA标记的Raji-hVISTA细胞])制备效应细胞(人PBMC)。将效应物人PBMC在PBMC培养基中以1x106个细胞/ml与50U/ml的IL-2培养过夜，然后收获并在室温下以1500rpm沉淀5分钟。对细胞进行计数并将其以5x106个细胞/ml重悬于测定培养基(5x105个PBMC/ADCC测定孔)中。从静置培养物中收获Raji-hVISTA细胞，在室温下以1500rpm沉淀5分钟，计数并以4x106个Raji-hVISTA细胞重悬于4ml加载缓冲液中(1x106个/ml细胞悬液)。添加5μlBATDA并将细胞在37℃和5％ CO2下孵育20分钟。用加载缓冲液洗涤后，对细胞进行计数并将其以2x105个细胞/ml重悬于测定培养基中。以50μl/孔制备测试抗体的连续稀释液。背景、自发释放和最大释放的条件如下设置：
·背景＝从最终靶标-BATDA悬浮液中取出1ml培养基，在室温下以1500rpm离心5min，并应用(3X)50μl/孔“背景上清液”+(3X)150μl测定培养基。
·自发释放＝50μl/孔靶标-BATDA+150μl测定培养基
·最大释放＝50μl/孔靶标-BATDA+130μl测定培养基+20μl(温)裂解缓冲液
然后将50μl/孔[1x104个/孔]的靶细胞(Raji-hVISTA-BATDA)与100μl/孔[5x105个/孔]的效应细胞(PBMC)(最终比率为[50:1])一起培养。将共培养物在37℃、5％ CO2下孵育2小时和3小时。在DELFIA试剂盒96孔平底条形孔读数板中制备200μl/孔的铕溶液，并将来自ADCC测定培养板的20μl/孔上清液转移到其中，然后在室温下在240rpm振荡器上孵育15分钟。然后在CLARIOstar Plus读板器上测量EuTDA荧光。
该测定证明，抗VISTA抗体编号421.1、抗体编号245.1、抗体编号475.1(LS)、抗体编号465.1、抗体编号457.1和抗体编号173.1诱导了针对Raji-hVISTA靶细胞的ADCC活性。抗体编号245.1和抗体编号475.1(LS)显示出几乎相同的诱导ADCC活性。抗体编号173.1(WT)比抗体编号420.1(YTE)具有更高的ADCC活性诱导率和更低的EC50值。与抗体编号173.1相比，抗体编号173.4显示出低水平的针对Raji-hVISTA靶细胞的诱导ADCC活性(图51-55A)。
在单独的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)测定中评价抗体编号474.1、编号150.1和编号246.4活性，并与VSTB174进行比较。进行剂量滴定以用比率为[12:1]的效应细胞(来自6个健康供体的PBMC，在37℃下在X-VIVO-15培养基中用200U/mL的IL-2O/N处理)和靶细胞(Raji-hVISTA过表达细胞)在ADCC测定中测试抗VISTA抗体(100pg/mL-10mg/mL)。在37℃下孵育4小时后，使用CytoToxGloTm试剂(Promega)检测细胞死亡。使用ClarioStar BMG读板器测量相对发光单位(RLU)。绘制死细胞相对于未处理的阴性对照的倍数增加。使用Levenberg-Marquardt算法拟合抑制曲线。半最大有效浓度(EC50)被定义为诱导基线与最大值之间一半反应的抗体浓度。(图55B-55C)。这些数据表明，VST174和抗体编号474.1(WT)诱导针对Raji-hVISTA靶细胞的强ADCC活性，而抗体编号150.1(YTE)显示出针对Raji-hVISTA的ADCC活性降低。
实施例18：抗VISTA Mab诱导CDC(补体依赖性细胞毒性)的体外功能表征
在CDC(补体依赖性细胞毒性)测定中评价抗VISTA抗体活性。进行剂量滴定以测试100、10、1.0、0.1、0.01和0.001ng/ml的抗体编号474.1、抗体编号150.1和抗体编号246.4，并与VSTB174进行比较。将hVISTA-Raji细胞以100,000个细胞/孔的密度接种到白色96孔平底组织培养测定板上的100μL X-vivo培养基中。在96孔V形底聚丙烯板中的X-Vivo-15培养基中连续稀释抗体。将50μL抗体转移到测定板孔中。将50μL人通用AB血清(Sigma)添加到测定板孔中。每个孔混合100ul三次。然后将测定板在37℃、5％ CO2加湿的培养箱中孵育6小时。使用CellTox-Glo细胞毒性测定试剂盒(Promega)测定细胞，并使用ClarioStar Plus(BMG Labtech)读取数据。将利妥昔单抗用作阳性对照。除了VSTB174，测试的抗VISTA Ab中没有一种诱导强CDC(图55D)。
实施例19：抗VISTA抗体的计算机表征
在计算机上分析抗VISTA抗体的氨基酸序列的CDR区的潜在序列依赖性发展倾向，包括评估协方差违规、非标准糖基化位点、非标准半胱氨酸位置、盐桥破坏、等电点(pI)、脱酰胺化风险、色氨酸氧化风险、异构化风险以及具有高正电、负电或疏水特征的表面积的计算。一般来讲，此类潜在倾向可以表现为降解位点(例如，脱酰胺化、氧化)、异构化(例如，Asp-isoAsp)、产生滴度限制、纯化挑战、聚集和配制挑战以及对药代动力学、体内非特异性结合以及生物分布变化的有害影响。在所分析的序列中，抗体编号269.1、抗体编号321.1、抗体编号245.1和抗体编号457.1没有主要的发展倾向。抗体编号465.1和抗体编号173.1的序列显示出pI值接近生理pH，这不会影响它们的有用活性，尽管这可能表明潜在的次优配制稳定性。
表30：抗VISTA抗体的序列倾向的计算机分析。
实施例20：抗VISTA抗体的体内功能表征—单一药剂或组合疗法在VISTA-KI小鼠 中的MC38肿瘤生长抑制
本研究的目的是评价抗体编号245.2在KI-VISTA小鼠的MC38鼠癌症模型中的体内治疗功效。抗体编号245.2是小鼠IgG2a抗体。
将MC38肿瘤细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM中在37℃下在5％CO2的空气气氛中体外培养。在指数生长期收获细胞并通过细胞计数器进行定量，然后进行肿瘤接种。在每只小鼠的右后胁腹区域皮下接种0.1ml PBS中的MC38肿瘤细胞(1x106个)用于肿瘤发展。将肿瘤细胞接种的日期表示为第0天。当平均肿瘤大小达到大约75mm3(70-100mm3)时进行随机分配。该研究入组了五十六只小鼠。将所有动物随机分配到7个研究组。接种肿瘤细胞后，每天检查动物的发病率和死亡率。使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：“V＝(L x W x W)/2”，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤大小)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤大小)。在层流柜中进行给药以及肿瘤和体重测量。通过使用StudyDirectorTM软件(版本3.1.399.19)来测量体重和肿瘤体积。当媒介物处理的对照组的平均肿瘤体积达到2000mm3时或在最后剂量后一周(以先到者为准)终止研究。为了比较在预先指定的一天不同组的肿瘤体积，使用Bartlett检验来检查所有组的方差齐性假设。如果Bartlett检验的p值≥0.05，则运行ANOVA以检验所有组的平均值的总体相等性。如果单向ANOVA的p值<0.05，则通过运行用于所有成对比较的Tukey HSD(诚实显著差异)检验和用于比较每个治疗组与媒介物组的Dunnett检验来进行进一步的事后检验。如果Bartlett检验的p值<0.05，则运行Kruskal-Wallis检验以检验所有组的中值的总体相等性。如果Kruskal-Wallis检验的p值<0.05，则通过运行用于所有成对比较或用于比较每个治疗组与媒介物组的Conover非参数检验来进行进一步的事后检验，两者均采用单步p值调整。
另外，进行了无多重检验校正的成对比较，并报告了直接来自Welch t检验或Mann-Whitney U检验的标称/未校正p值。具体地，首先使用Bartlett检验来检查一对组的方差齐性假设。如果Bartlett检验的p值≥0.05，则运行Welch t检验以获得标称p值，否则运行Mann-Whitney U检验。所有统计分析均在R(版本3.3.1)中完成。除非另有说明，否则所有检验都是双侧的，并且p值<0.05被认为具有统计学意义。
抗体编号245.2抑制VISTA KI小鼠模型中的MC38肿瘤生长，并且其功效在与抗mPD1抗体组合时增加(图56A)。
实施例21：抗VISTA Mab的体内功能表征—单一药剂或组合疗法在VISTA ECD KI 小鼠中的MB49肿瘤生长抑制
这些研究的目的是评价Ab No.474.1(WT)或Ab No.150.1(YTE)在治疗VISTA ECDKI小鼠的皮下MB49鼠膀胱癌模型中的体内治疗功效。将MB49肿瘤细胞与补充有10％胎牛血清的DMEM培养基一起在37℃下在5％ CO2中体外培养。收获指数生长期的细胞并通过细胞计数器进行定量，然后进行肿瘤接种。在每只小鼠的右后胁腹区域皮下接种0.1ml PBS中的MB49肿瘤细胞(每只小鼠5x105个细胞)。将肿瘤细胞接种的日期表示为第0天。在第5天，当平均肿瘤大小达到大约75mm3(60-100mm3)时，将小鼠随机分成每组8只小鼠的组。从第5天开始，通过一周两次腹膜内(IP)施用20mg/kg Ab No.474.1或Ab No.150.1、20mg/kg人IgG1、5mg/kg抗mPD1或抗VISTA Ab和抗mPD1的组合疗法来治疗小鼠，持续三周。
接种肿瘤细胞后，每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测期间，检查动物的肿瘤生长和治疗对行为的任何影响，诸如活动能力、食物和水消耗以及不适的体征。这些体征包括但不限于呼吸困难、弯腰驼背、梳毛不整和异常走动。详细记录每只动物的死亡率和观察到的临床体征。每周至少测量三次体重和肿瘤体积。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：V＝(L x W x W)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤大小)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤大小)。一旦肿瘤体积达到≥2000mm3或小鼠体重的≥10％(以先达到者为准)，如果小鼠体重减少≥其初始体重的20％，或如果身体状况评分达到1分，则对单只小鼠实施安乐死。每天监测患有溃烂肿瘤的小鼠，如果溃疡开放24小时，或者如果肿瘤≥1000mm3具有开放性溃疡，则立即对其实施安乐死。
Ab No.474.1或Ab No.150.1作为单一药剂均强烈抑制VISTA KI小鼠模型中的MB49肿瘤生长(图56B)。在VISTA KI小鼠模型中，Ab No.150.1的功效在例如与抗mPD1的组合疗法中增强(图56C)。
实施例22：用单一药剂抗VISTA Mab或作为组合疗法治疗的VISTA-KI小鼠的MB49 肿瘤微环境中的免疫细胞的表型表征。
通过多参数流式细胞术实验分析肿瘤浸润性免疫细胞的表型。在第13天(第3个剂量后24小时)从3只小鼠/组收获肿瘤样品，并使用来自Miltenyi Biotech的小鼠肿瘤解离试剂盒(目录号130-096-730)制备单细胞悬浮液。在流式细胞仪染色缓冲液(2％ FBS/PBS+1mM EDTA)中制备单细胞悬浮液，使最终浓度为5000万个细胞/mL。为了对用于表型分析的细胞进行染色，将从每个肿瘤样品制备的50uL单细胞悬液添加到96孔u形底板中。将剩余的样品合并并用于FMO染色。将细胞以400g旋转5分钟，并弃去上清液。将50uL封闭缓冲液添加到每个样品中(BD小鼠Fc封闭物目录号553141在FCS缓冲液中的1:50稀释液)并在冰上孵育15分钟。基于样品的数量制备抗体混合物，并通过将所有抗体添加到全染色混合物减一荧光团缀合的抗体中来制备每种FMO混合物。为了在封闭缓冲液中进行细胞染色，向每个样品和FMO中添加50uL抗体混合物，并在冰上孵育30分钟。孵育后，将细胞以400g离心5分钟并弃去上清液。表面染色后，裂解RBC并用100uL 1x 1步裂解固定缓冲液(ebiosciences，目录号00-5333-54)固定样品，并在冰上孵育20分钟。将细胞用流式细胞仪染色缓冲液洗涤两次。将细胞重悬于125uL流式细胞仪染色缓冲液中并在Attune NXT流式细胞仪上运行。
用Ab No.150.1治疗MB49膀胱肿瘤诱导了肿瘤内CD4+和CD8+T细胞以及NK细胞的增加。这些T细胞大多是效应记忆T细胞。此外，Ab No.150.1治疗减少了进入肿瘤的抑制性gMDSC的数量并将M2巨噬细胞转化为M1。Ab No.150.1与抗mPD1的组合进一步增加了肿瘤内效应记忆CD4+T细胞的频率(图56D-56L)。
实施例23：评估抗hVISTA抗体在人VISTAKI小鼠中的暴露水平的体内药代动力学 研究。
进行该药代动力学研究以评估在腹膜内(IP)施用10、30或100mg/kg后人VISTA KI小鼠中抗hVISTA抗体的暴露水平。在施用后2、4、8、24、48或72小时的时间点进行血液取样。
首先在0.5％ BSA-PBS和0.1-10％小鼠血清中产生每种抗VISTA抗体的10点标准曲线。将抗体编号245.1和抗体编号245.2在PBS中稀释至500ng/mL，并在0.1-10％小鼠血清中制成2.4倍稀释液，最终浓度范围为0.5ng/mL-500ng/mL。在每个板上产生标准曲线，并使用具有s形剂量反应(可变斜率)的非线性回归将其应用于样品。然后，以1:10、1:100、1:1,000、1:10,000或1:100,000稀释样品，并通过夹心ELISA进行分析。从小鼠血清中的标准曲线确定浓度。按照发布的指南(A Fray等人1998.A statistically defined endpointtiter determination method for immunoassays.Journal of Immunological Methods221,35-41)，使用以下等式计算每个ELISA板的阳性OD切点，以95％的置信区间检测阳性样品：切点＝背景的平均OD450+(背景的OD450的SD x SD乘数)。SD：标准偏差；SD乘数：标准偏差乘数取决于重复次数：将3.372用作具有3次重复的样品的乘数。
测定空白标准品(0ng/mL)的切点。将针对空白标准品计算的切点用于确定标准曲线的阳性样品，并且将针对给药前血浆样品计算的切点用于确定每只动物的阳性样品。对于每个标准曲线浓度，计算了准确度(标称值的％)和精确度(变异系数；％CV)。通过以下标准确定定量的范围：
·标准准确度为标称值的±20％(在定量下限(LLOQ)和定量上限(ULOQ)时为±25％)。
·标准精确度为±20％ CV(在LLOQ和ULOQ时为±25％)。
·总误差(准确度+精确度)不超过30％(在LLOQ和ULOQ时为40％)。
·定量范围内75％的非零标准品符合上述标准(包括LLOQ和ULOQ)。
·LLOQ高于针对标准曲线确定的切点。
使用GraphPad Prism，使用具有s形剂量反应(可变斜率)的非线性回归确定每个样品的浓度值。对于每个样品，将产生与剂量-反应曲线的EC50的OD450值最接近的OD450值的血浆稀释液用于确定该时间点的浓度。使用GraphPad Prism来测定每个标准曲线的EC50。使用以下等式计算EC50的OD450值：OD450＝曲线底部+(曲线顶部-曲线底部)/[1+10(LogEC50 -X)*Hill斜率)]。
表31：人VISTA敲入小鼠中IP剂量后抗VISTA抗体的PK参数。
NE：未估计
在将抗体编号245.1以30mg/kg IP施用于雌性人VISTA KI小鼠后，峰值抗体编号245.1血清暴露在给药后4小时达到，Cmax为645μg/mL，在给药后72小时暴露降低至6μg/mL。AUC为11,008h*μg/mL，并且半衰期为9.6小时。与10mg/kg和100mg/kg剂量的抗体编号245.1相比，当剂量从10mg/kg增加到30mg/kg时AUC增加7.6倍，并且当剂量从30mg/kg增加到100mg/kg时AUC增加3.4倍。30mg/kg剂量的半衰期(9.6小时)与10mg/kg剂量的半衰期(9.4小时)相似。
抗体编号245.1(人IgG1)和抗体编号245.2(小鼠IgG2a)的药代动力学曲线几乎相同(图57A和57B)。
实施例24：评估抗hVISTA抗体在人VISTA KI小鼠中的暴露水平的体内药代动力学 研究。
进行药代动力学研究以评估在腹膜内(IP)施用10mg/kg后人VISTA KI小鼠中新的抗hVISTA抗体的暴露水平。在2、4、8、12、24或48小时的时间点进行血液取样。
进行另一药代动力学研究以评估在重复腹膜内(IP)施用10mg/kg或30mg/kg后人VISTA KI小鼠中新的抗VISTA抗体的暴露水平。在10mg/kg组中每48小时对小鼠给药，总共3个剂量，并且在30mg/kg组中每3-4天对小鼠给药，总共4剂量。在4、8、12、24、48、72或96小时的时间点进行血液取样。
首先在0.5％ BSA-PBS和0.1-10％小鼠血清中产生每种抗VISTA抗体的10点标准曲线。将Ab No.474.1、No.150.1和VSTB174在PBS中稀释至250ng/mL，并在0.1-10％小鼠血清中制成2.4倍稀释液，最终浓度范围为0.2ng/mL-250ng/mL。在每个板上产生标准曲线，并使用具有s形剂量反应(可变斜率)的非线性回归将其应用于样品。然后，以1:10、1:100、1:1,000、1:10,000或1:100,000稀释样品，并通过夹心ELISA进行分析。如上所述从小鼠血清中的抗VISTA抗体标准曲线确定浓度。按照发布的指南(A Frey等人)，使用以下等式计算每个ELISA板的阳性OD切点，以便以95％的置信区间检测阳性样品：
切点＝背景的平均OD450+(背景的OD450的SD x SD乘数)
SD：标准偏差
SD乘数：标准偏差乘数取决于重复次数：将3.372用作具有3次重复的样品的乘数。
测定空白标准品(0ng/mL)的切点。将针对空白标准品计算的切点用于确定标准曲线的阳性样品和未知样品。对于每个标准曲线浓度，计算了准确度(标称值的％)和精确度(变异系数；％CV)。通过以下标准确定定量的范围：
1.标准准确度为标称值的±20％(在LLOQ和ULOQ时为±25％)。
2.标准精确度为±20％ CV(在LLOQ和ULOQ时为±25％)。
3.总误差(准确度+精确度)不超过30％(在LLOQ和ULOQ时为40％)。
4.定量范围内75％的非零标准品符合上述标准(包括LLOQ和ULOQ)。
5.LLOQ高于针对标准曲线确定的切点。
使用GraphPad Prism，使用具有s形剂量反应(可变斜率)的非线性回归确定每个样品的浓度值。对于每个样品，将产生与剂量-反应曲线的EC50的OD450值最接近的OD450值的血浆稀释液用于确定该时间点的浓度(图57C-57E以及表32和33)。使用GraphPad Prism来测定每个标准曲线的EC50。使用以下等式计算EC50的OD450值：
OD450＝曲线底部+(曲线顶部-曲线底部)/[1+10(LogEC50-X)*Hill斜率)]
表32.雌性人VISTA KI小鼠中单次10mg/kg IP剂量后抗VISTA抗体的PK参数。
NE：未估计
在将Ab No.474.1以10mg/kg IP施用于雌性人VISTA KI小鼠后，峰值Ab No.474.1血清暴露在给药后2小时出现，Cmax为96ug/mL，在给药后24小时(T最后)暴露降低至0.008ug/mL。给药后48小时血清暴露为BLQ。AUC为975h*ug/mL，并且半衰期为1.4小时。
在将Ab No.150.1以10mg/kg IP施用于雌性人VISTA KI小鼠后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后4小时出现，Cmax为56ug/mL，在给药后24小时暴露降低至0.007ug/mL。给药后48小时血清暴露为BLQ。AUC为680h*ug/mL，并且半衰期为1.2小时。
在将VSTB174以10mg/kg IP施用于雌性人VISTA KI小鼠后，峰值VSTB174血清暴露在给药后4小时出现，Cmax为92ug/mL，在给药后24小时暴露降低至0.003ug/mL。给药后48小时血清暴露为BLQ。AUC为1046h*ug/mL，并且半衰期为1.3小时。
表33.人VISTA KI小鼠中单次或重复10mg/kg或30mg/kg IP剂量后Ab No.150.1的PK参数。
NE：未估计
在将Ab No.150.1单次以10mg/kg IP施用于雌性人VISTA KI小鼠后，峰值AbNo.150.1血清暴露在给药后4小时出现，Cmax为65ug/mL，在给药后24小时暴露降低至0.02ug/mL。AUC为590h*ug/mL，并且半衰期为1.4小时。在第5天，在雌性人VISTA KI小鼠中每48小时三次重复以10mg/kg IP施用Ab No.150.1后，Ab No.150.1血清暴露与单次剂量后观察到的暴露相似。峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后4小时出现，Cmax为67ug/mL(第1天Cmax的1倍)，暴露在给药后24小时降至0.02ug/mL。AUC为645h*ug/mL(第1天AUC的1.1倍)，并且半衰期为1.4小时。
在将Ab No.150.1单次以30mg/kg IP施用于雌性人VISTA KI小鼠后，峰值AbNo.150.1血清暴露在给药后4小时出现，Cmax为294ug/mL，在给药后48小时暴露降低至0.01ug/mL。AUC为4327h*ug/mL，并且半衰期为2.8小时。在第11天，在雌性人VISTA KI中每3-4天四次重复以30mg/kg IP施用Ab No.150.1后，小鼠峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后4小时出现，Cmax为135ug/mL(第1天Cmax的0.5倍)，暴露在给药后48小时降至0.01ug/mL。AUC为902h*ug/mL(第1天AUC的0.2倍)，并且半衰期为3.3小时。
实施例25：评估抗hVISTA抗体AbNo.150.1在食蟹猴中的暴露水平的体内药代动力 学研究
进行药代动力学研究以评估雄性和雌性食蟹猴中单次30mg/kg静脉内(IV)剂量后、每天三次10mg/kg IV剂量后和每两天五次5mg/kg IV剂量后新的抗hVISTA抗体在食蟹猴中的暴露水平。在30mg/kg和10mg/kg剂量后的0.083、24、72、120、168、216、240或264小时的时间点以及在5mg/kg剂量后的0.083、24、48、72或120小时的时间点进行血液取样。
还进行毒代动力学研究以评估在重复静脉内(IV)施用10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg后新的抗VISTA抗体在食蟹猴中的暴露水平。每7天对猴给药，总共4个剂量。在第一和第四个剂量后0.083、6、24、48、72或168小时的时间点进行血液取样。
首先在0.5％ BSA-PBS和0.01-10％食蟹猴血清中产生每种Ab的10点标准曲线。将Ab No.150.1在PBS中稀释至250ng/mL，并在0.01-10％猴血清中制成2.4倍稀释液，最终浓度范围为0.2ng/mL-250ng/mL。在每个板上产生标准曲线，并使用具有s形剂量反应(可变斜率)的非线性回归将其应用于样品。然后，以1:10、1:100、1:1,000、1:10,000或1:100,000稀释样品，并通过夹心ELISA进行分析。如上所述从猴血清中的抗体标准曲线确定浓度。按照发布的指南(A Frey等人)，使用以下等式计算每个ELISA板的阳性OD切点，以便以95％的置信区间检测阳性样品：
切点＝背景的平均OD450+(背景的OD450的SD x SD乘数)
SD：标准偏差
SD乘数：标准偏差乘数取决于重复次数：将3.372用作具有3次重复的样品的乘数。
测定空白标准品(0ng/mL)以及动物的放血前血清样品的切点。将针对空白标准品计算的切点用于确定标准曲线的阳性样品，并且将针对放血前血浆样品计算的切点用于确定该动物的阳性样品。对于每个标准曲线浓度，计算了准确度(标称值的％)和精确度(变异系数；％CV)。通过以下标准确定定量的范围：
1.标准准确度为标称值的±20％(在LLOQ和ULOQ时为±25％)。
2.标准精确度为±20％ CV(在LLOQ和ULOQ时为±25％)。
3.总误差(准确度+精确度)不超过30％(在LLOQ和ULOQ时为40％)。
4.定量范围内75％的非零标准品符合上述标准(包括LLOQ和ULOQ)。
5.LLOQ高于针对标准曲线确定的切点。
使用GraphPad Prism，使用具有s形剂量反应(可变斜率)的非线性回归确定每个样品的浓度值。对于每个样品，将产生与剂量-反应曲线的EC50的OD450值最接近的OD450值的血浆稀释液用于确定该时间点的浓度。使用GraphPad Prism来测定每个标准曲线的EC50。使用以下等式计算EC50的OD450值：OD450＝曲线底部+(曲线顶部-曲线底部)/[1+10(LogEC50 -X)*Hill斜率)]。
表34.雄性和雌性食蟹猴中单次30mg/kg IV剂量后、每天三次10mg/kg IV剂量后或每两天五次5mg/kg IV剂量后Ab No.150.1的药代动力学参数。
NE：未估计
在将Ab No.150.1单次以30mg/kg IV施用于雄性食蟹猴后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为1032ug/mL，在给药后264小时暴露降低至40ug/mL。AUC为71811h*ug/mL，并且半衰期为65小时。在将Ab No.150.1单次以30mg/kg IV施用于雌性食蟹猴后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为987ug/mL，在给药后264小时暴露降低至0.04ug/mL。AUC为45742h*ug/mL，并且半衰期为10小时。
在将Ab No.150.1每天三次以10mg/kg IV施用于雄性食蟹猴后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为624ug/mL，在给药后264小时暴露降低至5ug/mL。AUC为51617h*ug/mL，并且半衰期为22小时。在将Ab No.150.1每天三次以10mg/kg IV施用于雌性食蟹猴后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为647ug/mL，在给药后264小时暴露降低至0.01ug/mL。AUC为36735h*ug/mL，并且半衰期为9小时。
在将Ab No.150.1每两天五次以5mg/kg IV施用于雌性食蟹猴后，峰值AbNo.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为222ug/mL，在给药后120小时暴露降低至6ug/mL。AUC为7470h*ug/mL，并且半衰期为24小时。
表35.雄性和雌性食蟹猴中单次或重复10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg IV剂量后AbNo.150.1的毒代动力学参数。
NE：未估计
在将Ab No.150.1单次以10mg/kg IV施用于食蟹猴后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为320ug/mL，在给药后168小时暴露降低至18ug/mL。AUC为16955h*ug/mL，并且半衰期为47小时。在第22天，在食蟹猴中每周四次以10mg/kg IV施用AbNo.150.1后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为291ug/mL(第1天Cmax的0.9倍)，暴露在给药后168小时降至0.3ug/mL。AUC为3493h*ug/mL(第1天AUC的0.2倍)，并且半衰期为19小时。
在将Ab No.150.1单次以30mg/kg IV施用于食蟹猴后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为900ug/mL，在给药后168小时暴露降低至66ug/mL。AUC为54708h*ug/mL，并且半衰期为50小时。在第22天，在食蟹猴中每周四次以30mg/kg IV施用AbNo.150.1后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为885ug/mL(第1天Cmax的1倍)，暴露在给药后168小时降至6ug/mL。AUC为18924h*ug/mL(第1天AUC的0.3倍)，并且半衰期为44小时。
在将Ab No.150.1单次以100mg/kg IV施用于食蟹猴后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为2261ug/mL，在给药后168小时暴露降低至820ug/mL。AUC为184167h*ug/mL，并且半衰期为118小时。在第22天，在食蟹猴中每周四次以100mg/kg IV施用Ab No.150.1后，峰值Ab No.150.1血清暴露在给药后0.083小时出现，Cmax为3498ug/mL(第1天Cmax的1.5倍)，暴露在给药后168小时降至1427ug/mL。AUC为317489h*ug/mL(第1天AUC的1.7倍)，并且半衰期为121小时。
除了这些体内药代动力学研究之外，还监测了临床观察结果、血液学、临床化学和免疫原性。没有观察到明显的临床体征或体重减轻，没有检测到临床病理学终点的治疗相关发现，没有观察到细胞因子释放综合征中涉及的细胞因子水平的变化，特别是IL6和TNFα。总之，即使在高重复剂量(100mg/kg)下，抗体编号150.1也表现出与延长的PK相关的异常耐受性。
实施例26：评估食蟹猴中抗hVISTA抗体Ab No.150.1的血清暴露水平和单核细胞 受体占有率的关系的体内毒代动力学研究
还进行毒代动力学研究以评估在重复静脉内(IV)施用10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg后新的抗VISTA抗体在食蟹猴中的血清暴露水平和单核细胞受体占有率的关系。每7天对猴给药，总共4个剂量。在第一和第四个剂量后0.083、6、24、48、72或168小时的时间点进行用于血清暴露测量的血液取样。这些数据在表36中报告。在第一和第四个剂量后6、72或168小时的时间点进行用于受体占有率测量的血液取样。
在抽血当天冷冻细胞样品。将来自所有时间点的样品解冻，染色，并在同一天分析，以在游离、背景、结合和总测定中对活细胞、单线态细胞、CD45+、CD14+、HLA-DR+细胞的抗VISTA-AlexaFluor 647中值荧光强度进行流式细胞术测量。将游离和背景测定样品分别与染色缓冲液或1000ug/mL的测试制品抗体No.150.1一起孵育1/2小时，然后添加含有抗CD45-PE、抗CD14-Brilliant Violet 421、抗HLA-DR-AlexaFluor488和可固定活/死Lime活力染料的染色混合物以及Ab No.150.1-AlexaFluor647。通过添加固定/裂解溶液来固定样品。将结合和总测定样品分别与染色缓冲液或80ug/mL的测试制品抗体AbNo.150.1一起孵育1小时，然后洗涤两次。然后将样品与含有抗CD45-PE、抗CD14-Brilliant Violet 421、抗HLA-DR-AlexaFluor488、可固定活/死Lime活力染料的染色混合物以及山羊抗人IgG(NHP吸附)-AlexaFluor647一起孵育。将样品洗涤一次，然后通过添加固定/裂解溶液固定。在Attune Nxt声学细胞仪上采集研究样品、QC样品、珠补偿样品和AlexaFluor647 MESF珠样品。在Flowjo软件中对所采集的样本的.fcs文件进行补偿和分析。通过应用QuantumAlexaFluor647 MESF珠和QuickCal v2.3定量软件，对活细胞、单线态细胞、CD45+、CD14+、HLA-DR+细胞的抗VISTA-AlexaFluor 647中值荧光强度进行定量，并转换为AlexaFluor647荧光强度的标准化单位。将这些值输入以下计算中以产生％游离受体(等式1)、％结合受体(等式2)和加权％受体占有率(等式3)值。将超过100％的等式2值转换为100％并输入等式3。在Microsoft Excel(365，商务版)中分析数据，并在GraphPad Prism(v8)中作图。加权％受体占有率值在图和表中报告为“％受体占有率”。
·等式1：％游离VISTA＝100*(游离时间点-背景时间点)/(游离给药前-背景给药前)
·等式2：％结合VISTA＝100*(结合时间点-结合给药前)/(总时间点-结合给药前)
·等式3：加权％RO＝100*(100-％游离)/((100-％游离)+(100-％结合))
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10、30和100mg/kg Ab No.150.1给药组的平均VISTA受体占有率水平在第一剂量后那周期间通过10、30和100mg/kg组中分别为>18、66和820ug/ml的体内暴露水平维持在>90％。10和30mg/kg剂量组中的每一组中的一只动物在第一剂量后120至168小时表现出加速的β期清除，血清暴露和受体占有率适度降低。相比之下，两只动物在第一剂量后的168小时内都表现出持续的高暴露和受体占有率。在第四剂量后，在100mg/kg给药动物中通过高暴露水平继续维持高受体占有率水平。相比之下，在第四剂量后，在30和10mg/kg组的两只动物中受体占有率与暴露水平平行地迅速降低。这或许可以用ADA的发展来解释。参见图57F-57N。
实施例27：食蟹猴中抗VISTA Mab免疫活化的体内功能表征
根据以下方法来评价抗体编号173.1、抗体编号173.4、抗体编号289.1和抗体编号420.1抗体在以10mg/kg单次和重复静脉内施用后调节食蟹猴的外周血中的骨髓细胞活化标记的能力：
动物在给药前禁食，以同时(给药前)收集临床病理学样品。每只动物接受单次静脉内(IV)剂量的适当测试抗体。第1天和第8天的治疗如表37中所概述。经由头/隐(或其他合适的)静脉施用静脉内剂量。在至少2分钟内以缓慢注射方式施用剂量，从给药结束计算所有血液收集时间。
表37.
a无菌PBS，pH 7.2
b在给药前第1天和第8天以及在给药后5分钟和30分钟以及4小时、8小时、24小时、72小时、96小时和168小时收集血液样品。在第8天给药前收集第1天给药后168小时的样品。
通过离体流式细胞术分析评价骨髓细胞群体和活化标记的表达。在抽血当天冷冻细胞样品并储存直至分析。将来自给药前和给药后所有时间点的样品解冻，染色，并在同一天分析以测量骨髓群体大小和活化标记。针对单线态细胞、活细胞和CD45+细胞对样品进行门控。从CD45+群体中将骨髓细胞鉴定为CD66-CD3-CD8-CD20-即侧向散射中间细胞。从骨髓群体中将单核细胞鉴定为CD14+细胞。从骨髓细胞分析中鉴定CD14-HLA-DR+群体。从CD14-HLA-DR+群体中将骨髓DC(mDC)鉴定为CD1c+和/或CD11c+CD123-细胞。
测定体内暴露于抗VISTA抗体后mDC和CD14+群体中活化标记的变化。图58A-58X示出了如通过离体流式细胞术分析所鉴定的MFI相对于给药前的％变化。通过对CD45+细胞进行门控分析来鉴定骨髓DC(mDC)。在技术重复上获得mDC的CD80、CD86和HLA-DR的平均荧光强度，并减去来自FMO样品的MFI。如下计算MFI相对于给药前水平的百分比变化：％变化＝100*(MFIDx-MFID0)/MFID0。
抗VISTA抗体上调mDC和单核细胞(CD14+细胞)上的骨髓活化标记。抗体编号173.1在两个剂量给药后72小时强烈上调mDC上的活化标记CD80和CD86并适度上调HLA-DR。抗体编号173.4在第一剂量后适度上调mDC上的CD86和HLA-DR。抗体编号173.1在两个剂量给药后72小时强烈上调CD14+细胞上的活化标记CD80和CD86。抗体编号173.4适度上调CD14+细胞上的CD80和CD86。相对于抗体编号173.1(WT)，抗体编号289.1(LS突变)增强mDC和单核细胞(CD14+细胞)上的CD80表达，同时降低(在mDC中)或消除(在单核细胞中)CD86诱导。CD80和CD86诱导的波动节律与本文所述的抗VISTA抗体的药代动力学特征一致，并且这种节律在突变抗体中比在WT抗体中明显得多。这些模式在mDC与CD14+群体之间非常相似。抗体编号420.1(YTE突变)的CD80和CD86结果与抗体编号173.4(WT)最相似，但略微更明显(相对于基线，CD80诱导更多，CD86下降更多)。LS和YTE稍微降低了WT对mDC的适度HLA-DR诱导和HLA-DR(图58A-58X)。
实施例28：抗VISTA抗体在MB49膀胱癌模型中的抗肿瘤活性。
在第0天，用50μL含有5x105个MB49细胞的PBS溶液接种人VISTA敲入小鼠(16-19周龄)的右胁腹。监测小鼠的肿瘤生长，并且当平均肿瘤体积达到大约70mm3时将它们随机分配到治疗组(n＝10-11只动物/组)。从第5天开始，动物接受每周两次注射30mg/kg小鼠IgG2a对照抗体(Bio XCell，克隆C1.18.4)、抗体编号245.2或抗体编号245.2L234A、L235A(LALA)，总共六个剂量。每2-3天通过卡尺测量肿瘤体积。在第24天(即最终研究剂量后两天)对动物实施安乐死，并收集肿瘤、血液和引流淋巴结。第24天每组的平均肿瘤体积：IgG2a(1522mm3)、245.2(511mm3)和245.2LALA(1112mm3)(图59A-59D)。抗VISTA抗体治疗使得245.2和245.2LALA的肿瘤生长抑制分别为66％和27％。在MB49模型中，突变体Fc抗VISTA抗体相对于野生型抗VISTA IgG2a抗体具有降低的效力。
实施例29：用单一药剂抗VISTAMab或作为组合疗法治疗的VISTA-KI小鼠的MB49肿 瘤微环境中的免疫细胞的表型表征。
通过多参数流式细胞术实验分析肿瘤浸润性免疫细胞的表型。在第24天(第6个剂量后3天)从3只小鼠/组收获肿瘤样品，并使用来自Miltenyi Biotech的小鼠肿瘤解离试剂盒(目录号130-096-730)制备单细胞悬浮液。在流式细胞仪染色缓冲液(2％ FBS/PBS+1mMEDTA)中制备单细胞悬浮液，使最终浓度为5000万个细胞/mL。为了对用于表型分析的细胞进行染色，将从每个肿瘤样品制备的50uL单细胞悬液添加到96孔u形底板中。将剩余的样品合并并用于FMO染色。将细胞以400g旋转5分钟，并弃去上清液。将50uL封闭缓冲液添加到每个样品中(BD小鼠Fc封闭物目录号553141在FCS缓冲液中的1:50稀释液)并在冰上孵育15分钟。基于样品的数量制备抗体混合物，并通过将所有抗体添加到全染色混合物减一荧光团缀合的抗体中来制备每种FMO混合物。为了在封闭缓冲液中进行细胞染色，向每个样品和FMO中添加50uL抗体混合物，并在冰上孵育30分钟。孵育后，将细胞以400g离心5分钟并弃去上清液。表面染色后，用200uL 1x RBC裂解缓冲液(Biolegend，目录号420301)裂解RBC，并在室温下孵育10分钟。孵育后，将细胞以400g离心5分钟并弃去上清液。表面染色后，裂解RBC并用100uL 1x 1步裂解固定缓冲液(ebiosciences，目录号00-5333-54)固定样品，并在冰上孵育20分钟。将细胞用流式细胞仪染色缓冲液洗涤两次。将细胞重悬于125uL流式细胞仪染色缓冲液中并在Attune NXT流式细胞仪上运行。
用Ab No 245.2(Mse IgG2a主链)治疗MB49膀胱肿瘤诱导主要是CD4+以及NK细胞的肿瘤内CD3+T细胞增加，而具有LALA突变的Ab No.245.2不增加浸润T细胞进入肿瘤的频率。此外，Ab No 245.2治疗降低了抑制性gMDSC进入肿瘤的频率。参见图59E-59H。
实施例30：抗VISTA抗体在E.G7-OVA胸腺瘤模型中的抗肿瘤活性。
在第0天，用100μL含有1x106个E.G7-OVA细胞的PBS溶液接种人VISTA敲入小鼠(16-18周龄)的右胁腹。监测小鼠的肿瘤生长，并且当平均肿瘤体积达到大约70mm3时将它们随机分配到治疗组(n＝11-12只动物/组)。从第7天开始，动物接受每周两次注射30mg/kg小鼠IgG2a对照抗体(Bio XCell，克隆C1.18.4)、抗体编号245.2或抗体编号245.2L234A、L235A(LALA)，总共六个剂量。每2-3天通过卡尺测量肿瘤体积。在第27天(即最终研究剂量后两天)对动物实施安乐死，并收集肿瘤、血液和引流淋巴结。第27天每组的平均肿瘤体积：IgG2a(1692mm3)、245.2(594mm3)和245.2LALA(716mm3)(图60A-60D)。抗VISTA抗体处理使得245.2和245.2LALA的肿瘤生长抑制分别为65％和58％。在E.G7-OVA模型中，突变体Fc抗VISTA抗体相对于野生型抗VISTA IgG2a抗体具有大致相等的效力。用抗体编号245.2和抗体245.2LALA治疗分别使得3只和3只动物的肿瘤完全消退。
实施例31：抗体编号245.1和474.1的重链和轻链中在pH 6.0与pH 7.4下增加 VISTA-ECD的解离速率的组氨酸取代。
通过靶向酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺残基，在抗体编号245.1和抗体编号474.1的重链和轻链两者的CDR1至3中设计组氨酸开关。根据EU编号系统，在抗体编号245.1背景上进行轻链Y31H和轻链Y32H单氨基酸取代。在抗体编号474.1背景上进行所有其他单取代和多取代。
在Expi293细胞中表达含有组氨酸取代的抗体并用mAbSelect SuRe蛋白A树脂纯化。使用抗人Fc(AHC)生物传感器(ForteBio 18-5060)和Octet K2(并行运行两个传感器)来评价抗体-靶标结合的动力学。将抗体突变体在1xPBS pH7.4(GE SH30028.02)中稀释至20ug/mL，并加载到AHC生物传感器上120秒。在1xPBS中洗涤160秒后，将加载后的生物传感器浸入50nM VISTA-HisECD(Sino Biological 13482-H08H)分析物中进行240秒缔合步骤。然后将并行生物传感器浸入1xPBS中进行360秒解离步骤，其中一个PBS样品为pH 7.4，而另一个为pH 6.0(用1M HCl调节)。使用Octet数据分析软件版本9.0.0.14进行数据分析。将无减法的基线比对用于原始数据处理，并使用Savitzky-Golay数字滤波器来去除高频噪声。将处理后的数据全局拟合到1:1结合模型并测定Ka(1/ms)和Kdis(1/s)。在pH 6.0下单组氨酸取代对抗体亲和力的影响在表38中示出(其中“加载样品ID”是抗体编号)。以下抗体在pH7.4下具有与野生型相似的Ka和Kd，但解离率在pH 6.0下相对于pH 7.4增加4至6倍：抗体编号373.1、467.1、338.1、277.1和419.1。突变根据EU编号系统编号。“VH”代表可变重链序列中的突变。“VL”代表可变轻链序列中的突变。抗体编号245.1在该分析中用作未修饰的对照抗体，并且在其CDR中不含组氨酸取代。对抗体编号474.1进行一个或多个组氨酸开关的组合，并如上所述在pH 6.0与pH 7.4下评价VISTA-ECD的Kd。结果在表39中给出。突变根据EU编号系统编号。“VH”代表可变重链序列中的突变。“VL”代表可变轻链序列中的突变。抗体编号245.1在该分析中用作未修饰的对照抗体。
这些抗体取代单独或组合预计会增加抗体从VISTA受体的内体解离。表39中的结果表明，两种或更多种组氨酸取代的组合可以在pH 6.0下增加抗体从VISTA的解离。
表38.在pH 6.0下单组氨酸取代对抗体解离的影响。
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表39.在pH 6.0下两个或更多个组氨酸取代的组合对抗VISTA抗体解离的影响。
实施例32：晚期实体瘤患者的抗VISTA抗体的1/2期开放标记试验
在晚期实体瘤患者的1/2期临床试验中评价抗VISTA抗体单独和与帕博利珠单抗组合的安全性和功效。
该研究分四个部分进行。部分A包括在晚期肿瘤受试者中作为单一药剂施用的抗VISTA单克隆免疫球蛋白抗体的剂量递增。部分B包括抗VISTA单克隆免疫球蛋白抗体与固定剂量(200mg，每3周一次(Q3W))的帕博利珠单抗组合的剂量递增。部分A和B中的剂量递增并行进行。部分A和部分B的研究群体包括每个剂量水平最多6名受试者，在剂量水平之间抗VISTA抗体的剂量增加0.3至0.5log，直至1g的最大剂量。治疗从0.1至1mg抗VISTA抗体范围内的起始剂量开始，然后增加直至200mg至1g范围内的最大剂量剂量增加的时间取决于患者对给定剂量的反应。通过缓慢IV输注Q3W来施用抗VISTA抗体。在同一天施用抗VISTA抗体和帕博利珠单抗，首先通过在30分钟内静脉内输注施用帕博利珠单抗。在每个剂量递增群组中治疗最多60名受试者。
一旦在各自的剂量递增组中确定了最大耐受剂量(MTD)，就启动部分C和D(部分A是在部分C之前的剂量递增组，并且部分B是在部分D之前的剂量递增组)。
用抗VISTA抗体作为单一疗法(部分C)和与帕博利珠单抗(部分D)组合进行群组扩展，抗VISTA抗体以在各自的剂量递增组中定义的MTD给予。在部分C中，将抗VISTA单一疗法施用于已在先前化学疗法(或放化疗)和抗PD-1(或抗PD-L1疗法)中失败的患有复发性或进行性疾病的非小细胞肺癌(NSCLC)或头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)患者，例如癌症对化学疗法或放化疗和抗PD-1或抗PD-L1疗法有抗性。每个肿瘤组有大约25名受试者接受治疗，部分C中总共有50名受试者接受治疗。
在部分D中，将抗VISTA抗体与帕博利珠单抗组合施用于以下疾病限制性患者群体：分别患有(i)NSCLC、(ii)SCCHN、(iii)肝细胞癌(HCC)、(iv)卵巢癌和(v)宫颈癌的患者。每个肿瘤组有大约25名受试者接受治疗，部分D中总共有125名受试者。
每个组中的入组受试者有资格以在各自的剂量递增组中定义的MTD接受对多四个12周周期的研究药物(抗VISTA抗体)(总共16个剂量)。
部分A和部分B中的受试者的其他入选标准：(1)受试者具有经组织学或细胞学证实的实体恶性肿瘤(不包括中枢神经系统的原发性肿瘤)，所述实体恶性肿瘤是晚期的(转移性的或不可切除的)并且不能用现有疗法治愈的；以及(2)在晚期或转移性环境中，受试者在至少一种标准治疗方案后进行或对其不耐受。
部分C和部分D中的受试者的其他入选标准如下。受试者符合以下肿瘤特异性标准之一：对于NSCLC，受试者必须具有进行性或复发性疾病的非鳞状组织学并且已在先前化学疗法(卡铂/紫杉醇或卡铂/培美曲塞)和抗PD-1或抗PD-L1疗法中失败，例如癌症对化学疗法(卡铂/紫杉醇或卡铂/培美曲塞)和抗PD-1或抗PD-L1疗法有抗性。具有EGFR突变的NSCLC受试者必须已在先前EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗法中失败，例如癌症对EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗法有抗性。具有ALK易位的受试者必须已在先前ALK抑制剂疗法中失败，例如癌症对ALK抑制剂疗法有抗性。
对于SCCHN，受试者必须患有经组织学证实的不可治愈的局部晚期复发性或转移性SCCHN。SCCHN受试者必须已在先前含铂方案中失败(例如，癌症对含铂方案有抗性)并且必须不是具有治愈意图的放射疗法或手术干预的候选人。
对于HCC，受试者必须患有进行性疾病并且在先前索拉非尼疗法中失败(例如，癌症对索拉非尼有抗性)，在不存在脑病和具有临床意义的食管静脉曲张的情况下Child-Pugh评分<6。
对于宫颈癌，受试者必须患有鳞状、腺鳞状或腺癌组织学的复发性或转移性疾病，并且在先前基于铂的疗法中失败(例如，癌症对基于铂的疗法有抗性)。卵巢癌患者必须患有具有记录的疾病进展的经组织学证实的上皮卵巢癌，在先前卡铂/紫杉醇或其他标准含铂全身性疗法中失败，例如癌症对卡铂/紫杉醇或其他标准含铂全身性疗法有抗性。
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，根据前面的描述和附图，除了所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改意图落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)通过引用整体并入本文并且用于所有目的，其程度如同每个单独的参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)被具体地和单独地指示为通过引用整体并入用于所有目的。

Claims (29)

1.一种与T细胞活化V结构域含Ig抑制因子(VISTA)结合的抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗体或其抗原结合片段在pH 6.0和pH 7.4下阻断所有五种配体与VISTA的结合，其中所述五种已知的VISTA配体是VSIG-3(V-set和含免疫球蛋白结构域3)、VSIG-8(V-set和含免疫球蛋白结构域8)、PSGL-1(P选择素糖蛋白配体-1)、LRIG1(富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域1)和VISTA；并且
其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
2.一种与T细胞活化V结构域含Ig抑制因子(VISTA)结合的抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，
其中所述VH包含与SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个或者由SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:84-110中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84-110中的任一个或者由SEQ ID NO:84-110中的任一个组成。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含
以下的VH CDR1：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:247-253中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:284-291中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:318-325中的任一个，
以下的VH CDR2：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:254-265中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:292-298中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:326-339中的任一个，
以下的VH CDR3：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:266-283中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:299-317中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:340-359中的任一个，
以下的VL CDR1：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:111-122中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:152-162中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:188-196或576-578中的任一个，
以下的VL CDR2：如Kabat编号系统所定义的123-131和575中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:163-167中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ IDNO:197-206中的任一个，以及
以下的VL CDR3：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:132-151中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:168-186中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:207-226中的任一个。
4.一种与VISTA结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，
其中所述VH包含：
以下的VH CDR1：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:247-253中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:284-291中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:318-325中的任一个，
以下的VH CDR2：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:254-265中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:292-298中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:326-339中的任一个，
以下的VH CDR3：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:266-283中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:299-317中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:340-359中的任一个，并且
其中所述VL包含：
以下的VL CDR1：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:111-122中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:152-162中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:188-196或576-578中的任一个，
以下的VL CDR2：如Kabat编号系统所定义的123-131和575中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:163-167中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQ IDNO:197-206中的任一个，以及
以下的VL CDR3：如Kabat编号系统所定义的SEQ ID NO:132-151中的任一个；如IMGT编号系统所定义的SEQ ID NO:168-186中的任一个；或者如Paratome编号系统所定义的SEQID NO:207-226中的任一个。
5.如权利要求1或权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，
其中所述VH包含与SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个或者由SEQ ID NO:584-597、227-246和383-386中的任一个组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:84-110中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84-110中的任一个或者由SEQ ID NO:84-110中的任一个组成。
6.如权利要求3或权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:247，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:254，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:266，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:111，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:123，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:132；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:284，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:292，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:299，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:152，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:163，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:168；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:318，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:326，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:340，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:188，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:197，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:207；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:248，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:255，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:267，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:112，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:124，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:133；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:285，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:293，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:300，并且所述VL CDR1包含SEQ ID NO:153，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:164，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:169；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:319，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:327，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:341，并且所述VL CDR1包含SEQ ID NO:189，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:198，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:208；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:249，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:256，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:268，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:113，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:125，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:134；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:286，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:294，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:301，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:154，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:165，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:170；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:320，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:328，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:342，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:190，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:199，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:209；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:250，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:257，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:269，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:114，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:126，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:135；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:287，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:295，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:302，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:155，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:165，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:171；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:321，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:329，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:343，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:191，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:200，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:210；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:251，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:258，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:270，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:115，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:127，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:136；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:288，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:295，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:303，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:156，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:166，并且所述VL CDR3包含SEQ IDNO:172；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:322，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:330，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:344，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:192，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:201，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:211；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:248，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:259，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:271，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:116，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:126，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:137；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:285，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:296，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:304，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:157，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:165，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:173；或者
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:319，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:331，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:345，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:193，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:200，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:212。
7.如权利要求3或权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:318，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:292或SEQ ID NO:326，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:266、SEQID NO:299或SEQ ID NO:340，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:152或SEQ IDNO 188，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:163或SEQ ID NO:197，并且所述VLCDR3包含SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:207；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:285或SEQ ID NO:319，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:293或SEQ ID NO:327，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:267、SEQID NO:300或SEQ ID NO:341，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:153或SEQ IDNO 189，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:198，并且所述VLCDR3包含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:169或SEQ ID NO:208；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:286或SEQ ID NO:320，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:294或SEQ ID NO:328，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:268、SEQID NO:301或SEQ ID NO:342，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:154或SEQ IDNO 190，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:199，并且所述VLCDR3包含SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:170或SEQ ID NO:209；
所述VH1 CDR1包含SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:287或SEQ ID NO:321，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:295或SEQ ID NO:332，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:269、SEQID NO:302或SEQ ID NO:346，195，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:155或SEQID NO 191，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:200，并且所述VL CDR3包含SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:210；
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:288或SEQ ID NO:322，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:295或SEQ ID NO:333，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:270、SEQID NO:303或SEQ ID NO:344，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:156或SEQ IDNO 192，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:201，并且所述VLCDR3包含SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:211；或者
所述VH CDR1包含SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:185或SEQ ID NO:319，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:296或SEQ ID NO:331，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:271、SEQID NO:304或SEQ ID NO:345，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:157或SEQ IDNO 193，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:200，并且所述VLCDR3包含SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:212。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
(i)其中所述VH包含与SEQ ID NO:592具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:592或者由SEQ ID NO:592组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:86或者由SEQ ID NO:86组成；
(ii)其中所述VH包含与SEQ ID NO:584具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:584或者由SEQ ID NO:584组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84或者由SEQ ID NO:84组成；
(iii)其中所述VH包含与SEQ ID NO:585具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:585或者由SEQ ID NO:585组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:85具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:85或者由SEQ ID NO:85组成；
(iv)其中所述VH包含与SEQ ID NO:586具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:586或者由SEQ ID NO:586组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:86或者由SEQ ID NO:86组成；
(v)其中所述VH包含与SEQ ID NO:587具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:587或者由SEQ ID NO:587组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:87具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:87或者由SEQ ID NO:87组成；
(vi)其中所述VH包含与SEQ ID NO:588具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:588或者由SEQ ID NO:588组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:88具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:88或者由SEQ ID NO:88组成；
(vii)其中所述VH包含与SEQ ID NO:589具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:589或者由SEQ ID NO:589组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:89或者由SEQ ID NO:89组成；
(viii)其中所述VH包含与SEQ ID NO:238具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:238或者由SEQ ID NO:238组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84或者由SEQ ID NO:84组成；
(ix)其中所述VH包含与SEQ ID NO:590具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:590或者由SEQ ID NO:590组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:84或者由SEQ ID NO:84组成；
(x)其中所述VH包含与SEQ ID NO:591238具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:591238或者由SEQ ID NO:591238组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:85具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:85或者由SEQ ID NO:85组成；
(xi)其中所述VH包含与SEQ ID NO:593具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:593或者由SEQ ID NO:593组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:86或者由SEQ ID NO:86组成；
(xii)其中所述VH包含与SEQ ID NO:593238具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:593238或者由SEQ ID NO:593238组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:87具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:87或者由SEQ ID NO:87组成；
(xiii)其中所述VH包含与SEQ ID NO:594具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:594或者由SEQ ID NO:594组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:884具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:884或者由SEQ ID NO:884组成；或者
(xiv)其中所述VH包含与SEQ ID NO:595具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:595或者由SEQ ID NO:595组成，并且
其中所述VL包含与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:89或者由SEQ ID NO:89组成。
9.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段，
包含与SEQ ID NO:407-477、572-574和604-609中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链(HC)序列，包含SEQ ID NO:407-477、572-574和604-609中的任一个或者由SEQ ID NO:407-477、572-574和604-609中的任一个组成，并且
包含与SEQ ID NO:387-406、569-571和598-603中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链(LC)序列，包含SEQ ID NO:387-406、569-571和598-603中的任一个或者由SEQ ID NO:387-406、569-571和598-603中的任一个组成。
10.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人VISTA(SEQ ID NO:377的氨基酸33-311)结合。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人VISTA的包含氨基酸序列HLHHG(SEQ ID NO:377的氨基酸98-102)或VVEIRHHHSEHR(SEQ IDNO:377的氨基酸148-159)的表位结合。
12.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人VISTA的包含SEQ ID NO:377的酪氨酸37、精氨酸54、缬氨酸117和精氨酸127的表位结合。
13.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含Fc区，
任选地其中所述Fc区是人Fc区或相对于天然人Fc区在所述Fc区中具有一至七个氨基酸突变的所述人Fc区变体，和/或
任选地其中所述人Fc区属于人IgG1、人IgG2或人IgG4，进一步任选地其中所述抗体包含人IgG1或人IgG4的恒定区或者相对于天然恒定区在所述恒定区中具有一至七个氨基酸突变的所述恒定区变体。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中
(a)所述Fc区属于人IgG1，并且其中所述突变选自由以下组成的组：C220D、D221C、E233P、L234A、L234E、L234Y、L235A、L235E、L235F、G236A、G236W、G236R、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、A330L、A330S、P331A、P331S、I332E、E333A、E333S、K334A、A378V、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中所述残基使用EU编号系统编号；
(b)所述Fc区属于人IgG2，并且其中所述突变选自由以下组成的组：C220D、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、V309L、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、A330L、A330S、P331A、P331S、I332E、E333A、E333S、K334A、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中所述残基使用EU编号系统编号；或者
(c)所述Fc区属于人IgG4，并且其中所述突变选自由以下组成的组：S228P、E233P、F234A、L235A、L235E、L235F、G236A、G236W、G236R、G237A、P238S、S239D、F241A、M252Y、S254T、T256E、T256N、V264A、D265A、S267E、H268F、H268A、D270A、H268Q、E294缺失、N297A、N297G、N297E、S298A、T307P、V309L、E318A、K322A、S324T、K326A、K326M、L328R、P329A、P329G、I332E、E333A、E333S、K334A、A378V、S383N、M428L、N434S和N434Y，其中所述残基使用EU编号系统编号。
15.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体或多特异性抗体。
16.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段或单链Fv(scFv)。
17.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与如前述权利要求所述的抗体或其抗原结合片段中的任一种竞争结合人VISTA(SEQ ID NO:377)。
18.一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及治疗剂。
19.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含如权利要求16所述的scFv。
20.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的所述VH、所述VL或所述VH和所述VL的核苷酸序列。
21.一种细胞，所述细胞包含一种或多种编码如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
22.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求18所述的抗体-药物缀合物或如权利要求19所述的CAR，以及药学上可接受的载剂。
23.一种产生如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在使得所述一种或多种多核苷酸由如权利要求21所述的细胞表达以产生由所述多核苷酸编码的所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述细胞。
24.一种治疗有需要的受试者的癌症、自身免疫性疾病和/或感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求22所述的药物组合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、口腔癌、甲状腺癌、乳腺癌、肉瘤、胰腺癌、结肠癌、胃癌、绒毛膜癌、睾丸癌、间皮瘤、皮肤癌、肾细胞癌、膀胱癌、血液癌或宫颈癌。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症是血癌、急性髓性白血病或骨髓增生异常综合征。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用附加疗法，任选地其中所述附加疗法是放射疗法、化学治疗剂、靶向疗法、酪氨酸激酶抑制剂、激素疗法和/或免疫检查点抑制剂。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性死亡-1(PD-1)或程序性死亡-配体1(PDL1)或细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抑制剂。
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