KR20230157970A

KR20230157970A - 항-vista 항체 및 이의 용도

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Publication number: KR20230157970A
Application number: KR1020237031291A
Authority: KR
Inventors: 숀 피. 이아도나토; 티에리 기요두; 에릭 제이. 타르샤; 데이비드 스콧 존슨; 아담 슐츠 애들러; 레나 아비바 미즈라히; 용 웨어른 림; 마이클 아센시오
Original assignee: 키네타, 인크.
Priority date: 2021-02-18
Filing date: 2022-02-18
Publication date: 2023-11-17
Also published as: MX2023009623A; BR112023016533A2; AU2022223973A1; EP4294530A1; CN117177995A; JP2024508764A; WO2022178203A1; IL305310A; CA3208872A1; US20240132593A1

Abstract

본 개시내용은 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 함유 억제제(VISTA)에 대한 항체 및 이러한 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 질환을 치료하기 위해, 예를 들어, 암을 치료하기 위해 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

항-VISTA 항체 및 이의 용도

관련 출원

본 출원은 2021년 2월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 63/150,995를 우선권 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 명시적으로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며 전체가 참고로 포함된다. 2022년 2월 1일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 136589-00120_SL.txt이고 크기는 784,935바이트이다.

본 개시내용은 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 함유 억제제(V-domain Ig-containing Suppressor of T cell Activation, VISTA)에 대한 항체 및 이러한 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 질환을 치료하기 위해, 예를 들어, 암, 자가면역 질환 및 감염, 예를 들어, 박테리아 및 진균 감염을 치료하기 위해 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 방법이 제공된다.

VISTA는 예정사-리간드 1(Programmed Death-Ligand 1, PD-L1)과 유사한 B7 계열의 면역 억제 세포 표면 단백질이다. VISTA는 항원 제시 세포에 대한 리간드 및 T 세포에 대한 수용체로서 기능한다( 등, Oncoimmunology. 2017;6(4):e1293215 (2017). VISTA는 주로 조혈 조직(예를 들어, 비장, 흉선 및 골수(bone marrow)) 및 골수 세포(myeloid cell), 호중구, 자연 살해(NK) 세포 및 조절 T 세포(Treg)에서 발현된다(Wang 등, J. Exp. Med. Vol. 208 No. 3 577-592).

특히, VISTA는 면역 억제를 매개하는 종양 미세환경에서 골수 유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC) 및 Treg에서 고도로 발현된다. 특히, VISTA는 T 세포 수용체 활성화를 억제함으로써 T 세포 반응을 억제하여 세포 주기 정지를 유도하지만 아폽토시스(apoptosis)는 일으키지 않는다(Wang 등, J. Exp. Med. Vol. 208 No. 3 577-592). VISTA는 "차가운 종양(cold tumor)"(T 세포에 의해 침윤되지 않는 종양)에서 고도로 발현되며, 높은 VISTA 발현은, 예를 들어, 췌장암과 같은 암 환자의 낮은 생존율과 관련이 있다(Blando 등, 2019, Proc Nat Acad Sci. 116(5):1692-97). VISTA 발현은 체크포인트 억제제 요법으로 치료한 후 전립선암 및 흑색종에서 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 잠재적인 저항 메커니즘을 가리킨다(Kakavand 등, 2017, Modern Pathology 30:1666-1676; Gao 등, 2017, Nat Med. May; 23(5): 551-555).

항체 조작의 경우, 신생아 Fc 수용체(FcRn), Fc 알파 수용체, Fc 감마 수용체 및 보체 단백질 C1q에 대한 친화도 및 특이성을 결정하는 부위에서 서열 변이가 발생하기 때문에 상이한 아이소타입(isotype) 및 하위부류(subclass)가 항체 최적화 및 기능에 중요하다(Woof, J.M. 및 Burton, D.R. Nat. Rev. Immunol. 4 (2004) 89-99). IgG에 결합할 때 이펙터 세포를 활성화하는 5개의 Fc 감마 수용체(FcγR)가 있다. 활성화 수용체 중에는 FcγRⅠ, FcγRⅡa, FcγRⅡc, FcγRⅢa 및 FcγRⅢb가 있다(Nimmerjahn, F. 및 Revetch, J.V. Nat. Rev. Immunol. 8 (2008) 34-47). 하나의 억제성 Fc 감마 수용체인 FcγRⅡb가 있다. FcγR은 다형성(polymorphic)으로, 특정 대립유전자가 다른 것보다 Fc에 대해 더 높은 친화도를 나타낸다. 이러한 수용체에 결합하는 항체는 클리어런스(clearance)를 위해 옵소닌화된 표적 세포(opsonized target cell) 또는 옵소닌화된 병원체(opsonized pathogen)에 대한 이펙터 세포의 동원(recruitment)을 용이하게 할 수 있다(Nimmerjahn, F. 및 Revetch, J.V. Nat. Rev. Immunol. 8 (2008) 34-47). 따라서, 항체의 Fc 및 힌지 영역의 서열 및 번역 후 변형(post-translational modification)에 대한 변화는 주어진 항체 또는 항체 유사 단백질의 이펙터 기능 및 순환을 조작할 수 있게 한다(Presta, L.G. Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 460-470). 서열 변이에 더하여, Fc 영역은 또한 잔기 297에 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하며, 이는 Fc 구조 및 기능에 중요하다(Dwek, R.R. 등 J. Anat. 187 (1995) 279-292). Fc 감마 수용체에 대한 결합이 감소하고 Fc 감마 수용체 매개된 활성이 감소한 돌연변이된 Fc 영역이 기술되어 있다(미국 특허 제10,053,513 B2호).

항체 제거(antibody elimination)는 음세포작용(pinocytosis) 또는 수용체 매개된 엔도시토시스(endocytosis) 과정에 의해 흡수된 후 아미노산으로의 리소좀 분해(lysosomal degradation)에 의한 세포 내 이화작용(intracellular catabolism)을 통해 대부분 발생한다(Waldmann, T.A. 및 Strober, W. Prog. Allergy 13 (1969) 1-110).

항체의 수용체 매개된 엔도시토시스는 항체의 Fc 도메인 또는 Fab 결합 도메인 중 하나와 세포 표면 수용체의 상호작용으로부터 발생한다. 이 결합 이벤트는 항체의 엔도시토시스 내재화(endocytotic internalization)를 소포(vesicle) 내로 유도하고, 후속적으로 리소좀 분해를 유발한다. 항체 Fab와 이의 항원 사이에 결합이 있을 때, 생성되는 엔도시토시스 및 제거를 표적 매개된 약물 배치(target-mediated drug disposition, TMDD)라고 한다(Mager, D.E. 및 Jusko, W.J. J. Pharmacokinet. Pharmacodyn. 28 (2001) 507-5320).

TMDD를 통한 항체의 제거 속도는 항원 수용체 표적의 발현, 항원에 대한 mAb의 친화도, mAb의 용량, 수용체-항체 복합체 내재화 및 재순환(recycling), 및 표적 세포 내의 이화작용의 속도에 좌우된다. TMDD에 의해 주로 제거되는 항체는 용량 의존성 비선형 제거(dose-dependent nonlinear elimination)를 가질 것이다. VISTA와 같은 원형질막 발현 표적(plasma membrane expressed target)을 갖는 항체의 경우, TMDD는 특히 낮은 용량 및 농도-dependent nonlinear elimination의 치료용 항체의 주요 제거 경로이다(Ryman, J.T. 및 Meibohm, B. CPT Pharmacometrics Syst. Pharmacol. 6 (2017) 576-588).

원형질막에서의 항체-수용체 복합체는 엔도좀(endosome) 구획과 융합하는 소포 내로 내재화된다. 상기 복합체는 리소좀에서의 분해를 위해 전달되거나 세포 표면 및 세포 외 배지로 온전하게 재순환될 수 있다. 증거에 따르면 이 분류 결정(sorting decision)의 결과는 항체-수용체 결합 친화도와 관련이 있으며, 결합된 상태로 남아 있는 복합체는 일반적으로 분해되고 해리되는 복합체는 재순환된다(Chimalakonda, A.P., 등 AAPS J. 15 (2013) 717-727). 일반적으로 엔도좀에서 복합체의 해리는 항체 재순환을 향상시킨다. 엔도좀 및 리소좀에서 항체-수용체 복합체의 해리는 pH 민감성 상호작용에 의해 조절될 수 있다.

대부분의 조사된 pH 민감성 상호작용에 대해, pH 의존성 결합은 상호작용 단백질의 결합 또는 폴딩에서 구조적 전이를 매개하는 이온화 가능한 히스티딘("히스티딘 스위치")의 존재에 의존한다(Kulkarni, M.V. 등 J. Biol. Chem. 285 (2010) 38524-38533; Maeda, K. 등 J. Control. Release 82 (2002) 71-82; Yamamoto, T. 등 Biochemistry 47 (2008) 11647- 11652). 낮은 pH 값에서 히스티딘 양성자화 시 유도되는 정전기적 상호작용의 변경은 결합 친화도를 감소시킬 수 있으며, pH 민감성을 단백질에 통합하는 단백질 공학 접근법은 전형적으로 히스티딘 스위치 전략을 사용한다.

다음은 신진대사를 감소시키고 반감기를 개선하기 위한 치료용 단백질에서 히스티딘 스위치의 성공적인 조작의 예이다.

Igawa T., 등 Nat. Biotechnol. 28 (2010) 1203-1207은 혈장(pH 7.4)에서 IL-6 수용체(IL-6R)에 대한 결합 친화도를 유지하면서 엔도좀의 산성 환경(pH 6.0) 내에서 IL-6R로부터 빠르게 해리되는 IL-6R에 대한 조작된 항체를 기술한다.

WO2011/111007은 바람직하게는 엔도좀에서 항원으로부터 해리되는 pH 의존성 항원-결합을 갖는 항체를 개시한다.

Rother 등 Nat. Biotechnol. 25 (2007) 1256-1264는 발작성 야간혈색소 요증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)의 치료를 위해 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 매개하는 히스티딘 스위치를 갖는 보체 억제제 에쿨리주맙(eculizumab)의 발견 및 개발을 기술한다.

WO2015/134894A1은 엔도좀 pH에서 그 표적으로부터 신속하게 해리되도록 조작되어 반감기를 증가시키는, C5에 결합하는 항체를 기술한다.

US 9,540,449 B2는 중성 pH에서 세포 표면 수용체에 결합하지만 산성 pH에서 표적으로부터 쉽게 해리되는, 혈청 반감기가 개선된 PCSK9에 대한 항체를 기술한다.

Fallon 등 J. Biol. Chem. 275 (1999) 6790-6797은 강화된 리간드 재순환으로 인해 감소된 엔도시토시스 분해를 나타내는, 인터루킨 2의 돌연변이체를 기술한다. 돌연변이체 IL-2의 그 수용체에 대한 결합 친화도는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높아 엔도좀 분류 및 리간드 수용체 복합체의 재순환을 가능하게 한다.

Sarkar, C.S., 등 Nat. Biotech. 20 (2002) 908-913은 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor)의 세포 수송(cellular trafficking)을 개선하기 위한 "히스티딘 스위치"의 용도를 기술한다.

항-VISTA 항체는 기술된 바 있다(예를 들어, 미국 특허 제8,231,872호, 제8,236,304호, 제8,501,915호 및 제10,766,959호, 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2020/0407449 A1, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/207717 A8, WO 2014/197849 A9, WO 2018/169993 A1, WO 2018/237287 A1, WO2019/152810 A1, WO 2019/185879 A1 및 WO 2020/016459 A1 참조). 그러나 전술한 모든 것에도 불구하고 효과적인 치료용 항체에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.

본 개시내용에서 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 선행 기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 개시내용 이전에 공지된 항-VISTA 항체는 다수의 리간드가 VISTA 수용체에 결합한다는 사실, VISTA-발현 면역 세포의 항체 의존성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 및 독성 사이토카인 방출 가능성, 항-약물 항체 또는 면역원성, VISTA에서의 효능과 독성이 다양한 다중 결합 에피토프, 및 최적화되지 않은 Fc 결합을 해결하지 못하는 것을 포함하여 많은 결점을 나타냈다. 본 출원의 발명자들은 이러한 문제를 극복하는 신규한 항-VISTA 항체 및 이의 항원-결합 단편을 설계하기 위해 이러한 단점에 대한 지식을 활용하였다. 이러한 각 측면에 대해서는 아래에서 자세히 설명한다.

우선, 대부분의 공지된 항-VISTA 항체는 VISTA 세포 외 도메인에서의 2개의 우성 에피토프 중 하나에 결합한다. 첫 번째 에피토프인 R54/F62/Q63은 항종양 효능과 관련이 있지만 상당한 사이토카인 방출 및 염증과도 관련되어 있어 치료적 치료에 대한 심각한 안전 문제를 야기한다. 두 번째 에피토프인 H121/H122/H123은 pH 민감성 결합과 증가된 PK를 전환하지만 대부분의 항종양 활성을 제거한다. 본 출원의 발명자들은 제3의 독점 에피토프에 결합하고 종양 모델에서 개선된 안전성 및 우수한 단일 작용제 효능을 나타내는, 본원에 개시된 항-VISTA 항체 및 이의 항원-결합 단편을 확인하였다(본원의 실시예 참조).

둘째, 이전에 공지된 항-VISTA 항체는 pH 6.0 또는 pH 7.4에서 공지된 VISTA 리간드 중 단지 1개, 2개 또는 (최대) 3개만을 차단하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 본원에 기술된 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편은 6.0 내지 7.4의 pH 범위에 걸쳐 VISTA에 대한 5개의 공지된 리간드 모두의 결합을 차단할 수 있어 증가된 효능을 제공한다.

추가로, 본원에 기술된 항-VISTA 항체 및 이의 항원-결합 단편은 Fc-최적화되어 Fcγ 수용체 결합을 감소시키고, 따라서 감소된 ADCC, CDC(보체 의존성 세포독성) 및 전염증성 사이토카인 방출을 감소시켜 치료적 투여에 대한 안전성을 높인다. 본원에 기술된 몇몇 항-VISTA 항체는 FcRn 결합을 증가시키기 위해 추가로 Fc-최적화되었고, 따라서 항체 재순환 및 연장된 노출을 증가시킨다. 마지막으로, 본원에 기술된 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편은 유전자 조작된 인간화 마우스 모델을 사용하여 개발되었으며, 이는 인간에서 감소된 면역원성과 관련된 추가 이점을 부여한다. 따라서, 본원에 기술된 항-VISTA 항체 및 이의 항원-결합 단편은 본 개시내용 이전에 공지된 항-VISTA 항체 및 이의 용도에 비해 놀랍고 개선된 특성을 나타낸다.

따라서, 한 측면에서, (i) pH 6.0 및/또는 pH 7.4에서 VISTA에 대한 공지된 5개의 리간드 모두(VSIG-3(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 3), VSIG-8(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 8), PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1), LRIG1(류신 풍부 반복 및 면역글로불린 유사 도메인 1) 및 VISTA)의 결합을 차단하고/하거나; (ii) VISTA-ECD(세포 외 도메인)의 아미노산 티로신 37, 아르기닌 54, 발린 117 및 아르기닌 127을 포함하는 고유 에피토프에 결합하는, 인간 항-VISTA 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 개시된다.

한 측면에서, T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 함유 억제제(VISTA)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 개시되며, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 VISTA에 대한 5개의 리간드 모두의 결합을 차단하고, VISTA에 대한 공지된 5개의 리간드는 VSIG-3(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 3), VSIG-8(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 8), PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1), LRIG1(류신 풍부 반복 및 면역글로불린 유사 도메인 1) 및 VISTA이고; 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.

또 다른 측면에서, T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 함유 억제제(VISTA)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 개시되며, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, VH는 서열번호 584-597, 227-246 및 383-386 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지고, VL은 서열번호 84-110 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어진다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 VISTA에 대한 5개의 리간드 모두의 결합을 차단하고, VISTA에 대한 공지된 5개의 리간드는 VSIG-3(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 3), VSIG-8(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 8), PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1), LRIG1(류신 풍부 반복 및 면역글로불린 유사 도메인 1) 및 VISTA이다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 247-253 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 284-291 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 318-325 중 어느 하나의 VH CDR1; Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 254-265 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 292-298 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 326-339 중 어느 하나의 VH CDR2; Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 266-283 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 299-317 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 340-359 중 어느 하나의 VH CDR3; Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 111-122 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 152-162 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 188-196 또는 576-578 중 어느 하나의 VL CDR1; Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 123-131 및 575 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 163-167 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 197-206 중 어느 하나의 VL CDR2, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 132-151 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 168-186 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 207-226 중 어느 하나의 VL CDR3을 포함한다.

한 측면에서, VISTA에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 개시되며, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 247-253 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 284-291 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 318-325 중 어느 하나의 VH CDR1, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 254-265 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 292-298 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 326-339 중 어느 하나의 VH CDR2, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 266-283 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 299-317 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 340-359 중 어느 하나의 VH CDR3을 포함하고, VL은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 111-122 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 152-162 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 188-196 또는 576-578 중 어느 하나의 VL CDR1, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 123-131 및 575 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 163-167 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 197-206 중 어느 하나의 VL CDR2, 및 Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 132-151 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 168-186 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 207-226 중 어느 하나의 VL CDR3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 VISTA에 대한 5개의 리간드 모두의 결합을 차단하고, VISTA에 대한 공지된 5개의 리간드는 VSIG-3(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 3), VSIG-8(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 8), PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1), LRIG1(류신 풍부 반복 및 면역글로불린 유사 도메인 1) 및 VISTA이다.

한 실시양태에서, VH는 서열번호 584-597, 227-246 및 383-386 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지고, VL은 서열번호 84-110 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어진다.

다른 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 247을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 254를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 266을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 111을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 123을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 132를 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 284를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 292를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 299를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 152를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 163을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 168을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 318을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 326을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 340을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 188을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 197을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 207을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 248을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 255를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 267을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 112를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 124를 포함하고, VL CDR3은 서열번호 133을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 285를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 293을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 300을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 153을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 164를 포함하고, VL CDR3은 서열번호 169를 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 319를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 327을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 341을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 189를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 198을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 208을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 249를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 256을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 268을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 113을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 125를 포함하고, VL CDR3은 서열번호 134를 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 286을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 294를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 301을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 154를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 165를 포함하고, VL CDR3은 서열번호 170을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 320을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 328을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 342를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 190을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 199를 포함하고, VL CDR3은 서열번호 209를 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 250을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 257을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 269를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 114를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 126을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 135를 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 287을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 295를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 302를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 155를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 165를 포함하고, VL CDR3은 서열번호 171을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 321을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 329를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 343을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 191을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 200을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 210을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 251을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 258을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 270을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 115를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 127을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 136을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 288을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 295를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 303을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 156을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 166을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 172를 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 322를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 330을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 344를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 192를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 201을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 211을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 248을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 259를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 271을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 116을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 126을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 137을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 285를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 296을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 304를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 157을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 165를 포함하고, VL CDR3은 서열번호 173을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 319를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 331을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 345를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 193을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 200을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 212를 포함한다.

다른 실시양태에서, VH CDR1은 서열번호 247, 서열번호 284 또는 서열번호 318을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 254, 서열번호 292 또는 서열번호 326을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 266, 서열번호 299 또는 서열번호 340을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 111, 서열번호 152 또는 서열번호 188을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 123, 서열번호 163 또는 서열번호 197을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 132, 서열번호 168 또는 서열번호 207을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 248, 서열번호 285 또는 서열번호 319를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 255, 서열번호 293 또는 서열번호 327을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 267, 서열번호 300 또는 서열번호 341을 포함하고, VL CDR1은 서열번호 112, 서열번호 153 또는 서열번호 189를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 124, 서열번호 164 또는 서열번호 198을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 133, 서열번호 169 또는 서열번호 208을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 249, 서열번호 286 또는 서열번호 320을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 256, 서열번호 294 또는 서열번호 328을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 268, 서열번호 301 또는 서열번호 342를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 113, 서열번호 154 또는 서열번호 190을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 125, 서열번호 165 또는 서열번호 199를 포함하고, VL CDR3은 서열번호 134, 서열번호 170 또는 서열번호 209를 포함하거나; VH1 CDR1은 서열번호 250, 서열번호 287 또는 서열번호 321을 포함하고, VH CDR2는 서열번호 257, 서열번호 295 또는 서열번호 332를 포함하고, VH CDR3은 서열번호 269, 서열번호 302 또는 서열번호 346, 195를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 114, 서열번호 155 또는 서열번호 191을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 126, 서열번호 165 또는 서열번호 200을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 135, 서열번호 171 또는 서열번호 210을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 251, 서열번호 288 또는 서열번호 322를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 258, 서열번호 295 또는 서열번호 333을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 270, 서열번호 303 또는 서열번호 344를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 115, 서열번호 156 또는 서열번호 192를 포함하고, VL CDR2는 서열번호 127, 서열번호 166 또는 서열번호 201을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 136, 서열번호 172 또는 서열번호 211을 포함하거나; VH CDR1은 서열번호 248, 서열번호 185 또는 서열번호 319를 포함하고, VH CDR2는 서열번호 259, 서열번호 296 또는 서열번호 331을 포함하고, VH CDR3은 서열번호 271, 서열번호 304 또는 서열번호 345를 포함하고, VL CDR1은 서열번호 116, 서열번호 157 또는 서열번호 193을 포함하고, VL CDR2는 서열번호 126, 서열번호 165 또는 서열번호 200을 포함하고, VL CDR3은 서열번호 137, 서열번호 173 또는 서열번호 212를 포함한다.

다른 실시양태에서, (i) VH는 서열번호 592와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 86과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (ii) VH는 서열번호 584와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 84와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (iii) VH는 서열번호 585와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 85와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (iv) VH는 서열번호 586과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 86과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (v) VH는 서열번호 587과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 87과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (vi) VH는 서열번호 588과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 88과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (vii) VH는 서열번호 589와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 89와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (viii) VH는 서열번호 238과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 84와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (ix) VH는 서열번호 590과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 84와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (x) VH는 서열번호 591238과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 85와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (xi) VH는 서열번호 593과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 86과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (xii) VH는 서열번호 593238과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 87과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (xiii) VH는 서열번호 594와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 884와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나; (xiv) VH는 서열번호 595와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고, VL은 서열번호 89와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어진다.

한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 407-477, 572-574 및 604-609 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지는 중쇄(HC) 서열, 및 서열번호 387-406, 569-571 및 598-603 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지는 경쇄(LC) 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 VISTA(서열번호 377의 아미노산 33-311)에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 VISTA(서열번호 377의 아미노산 33-311)에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 HLHHG(서열번호 377의 아미노산 98-102) 또는 VVEIRHHHSEHR(서열번호 377의 아미노산 148-159)을 포함하는 인간 VISTA의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 377의 티로신 37, 아르기닌 54, 발린 117 및 아르기닌 127을 포함하는 인간 VISTA의 에피토프에 결합한다.

한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이거나 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에서 1 내지 7개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖는 인간 Fc 영역의 변이체이다. 한 실시양태에서, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4의 Fc 영역이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 불변 영역을 포함하거나 천연 불변 영역에 비해 불변 영역에서 1 내지 7개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 불변 영역의 변이체를 포함한다.

한 실시양태에서, (a) Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이고, 돌연변이는 C220D, D221C, E233P, L234A, L234E, L234Y, L235A, L235E, L235F, G236A, G236W, G236R, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, A330L, A330S, P331A, P331S, I332E, E333A, E333S, K334A, A378V, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이거나; (b) Fc 영역은 인간 IgG2의 Fc 영역이고, 돌연변이는 C220D, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, V309L, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, A330L, A330S, P331A, P331S, I332E, E333A, E333S, K334A, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이거나; (c) Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이는 S228P, E233P, F234A, L235A, L235E, L235F, G236A, G236W, G236R, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, V309L, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, I332E, E333A, E333S, K334A, A378V, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체이다. 한 실시양태에서, 항원-결합 단편은 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다.

한 측면에서, 인간 VISTA(서열번호 377)에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 개시된다. 한 측면에서, 인간 VISTA(서열번호 377)와 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나의 결합을 방지하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 결합은 ELISA 검정, 표면 플라스몬 공명 또는 BLI, 예를 들어, Octet Red 96(ForteBio System)에서의 BLI로 측정된다.

다른 측면에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 치료제를 포함하는 항체-약물 접합체가 본원에 개시된다. 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)가 본원에 개시된다.

또 다른 측면에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 VH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다. 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 VL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다. 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 VH 및 VL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다.

한 측면에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 본원에 개시된다.

한 측면에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항체-약물 접합체 또는 CAR 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다.

한 측면에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 세포에 의해 발현되어 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하도록 하는 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.

한 측면에서, 암, 자가면역 질환 및/또는 감염의 치료가 필요한 대상체에게 본원에 개시된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 암, 자가면역 질환 및/또는 감염의 치료 방법이 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 암을 치료하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환을 치료하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 감염을 치료하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 암은 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 두경부 편평세포암(head and neck squamous cell carcinoma), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 구강암(oral cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 유방암(breast cancer), 육종(sarcoma), 췌장암(pancreatic cancer), 대장암(colon cancer), 위암(gastric cancer), 융모암(choriocarcinoma), 고환암(testicular cancer), 중피종(mesothelioma), 피부암(skin cancer), 신장세포암종(renal cell carcinoma), 방광암(bladder cancer), 혈액암(hematological cancer) 또는 자궁경부암(cervical cancer)이다. 한 실시양태에서, 암은 전이성 암이다. 한 실시양태에서, 암은 혈액암(blood cancer), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 또는 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 추가 치료를 투여하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 추가 치료는 방사선요법, 화학요법제, 표적요법, 티로신 키나제 억제제, 호르몬요법 및/또는 면역 체크포인트 억제제이다. 한 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 예정사-1(Programmed Death-1, PD-1), 또는 예정사-리간드 1(Programmed death-ligand 1, PDL1), 또는 세포독성 T-림프구 연관 단백질 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)의 억제제이다.

한 측면에서, VISTA에 결합하는, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 가변 중쇄 영역(VH) 및 가변 경쇄 영역(VL)을 포함한다. 한 실시양태에서, VH는 (i) 서열번호 247의 VH 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 254의 VH CDR2 및 서열번호 266의 VH CDR3을 포함하거나; (ii) 서열번호 284의 VH CDR1, 서열번호 292의 VH CDR2 및 서열번호 299의 VH CDR3을 포함하거나; (iii) 서열번호 318의 VH CDR1, 서열번호 326의 VH CDR2 및 서열번호 340의 VH CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 (i) 서열번호 248의 VH CDR1, 서열번호 255의 VH CDR2 및 서열번호 267의 VH CDR3을 포함하거나; (ii) 서열번호 285의 VH CDR1, 서열번호 293의 VH CDR2 및 서열번호 300의 VH CDR3을 포함하거나; (iii) 서열번호 319의 VH CDR1, 서열번호 327의 VH CDR2 및 서열번호 341의 VH CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 (i) 서열번호 249의 VH CDR1, 서열번호 256의 VH CDR2 및 서열번호 268의 VH CDR3을 포함하거나; (ii) 서열번호 286의 VH CDR1, 서열번호 294의 VH CDR2 및 서열번호 301의 VH CDR3을 포함하거나; (iii) 서열번호 320의 VH CDR1, 서열번호 328의 VH CDR2 및 서열번호 342의 VH CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 (i) 서열번호 250의 VH CDR1, 서열번호 257의 VH CDR2 및 서열번호 269의 VH CDR3을 포함하거나; (ii) 서열번호 287의 VH CDR1, 서열번호 295의 VH CDR2 및 서열번호 302의 VH CDR3을 포함하거나; (iii) 서열번호 321의 VH CDR1, 서열번호 329의 VH CDR2 및 서열번호 343의 VH CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 (i) 서열번호 251의 VH CDR1, 서열번호 258의 VH CDR2 및 서열번호 270의 VH CDR3을 포함하거나; (ii) 서열번호 288의 VH CDR1, 서열번호 295의 VH CDR2 및 서열번호 303의 VH CDR3을 포함하거나; (iii) 서열번호 322의 VH CDR1, 서열번호 330의 VH CDR2 및 서열번호 344의 VH CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 (i) 서열번호 248의 VH CDR1, 서열번호 259의 VH CDR2 및 서열번호 271의 VH CDR3을 포함하거나; (ii) 서열번호 285의 VH CDR1, 서열번호 296의 VH CDR2 및 서열번호 304의 VH CDR3을 포함하거나; (iii) 서열번호 319의 VH CDR1, 서열번호 331의 VH CDR2 및 서열번호 345의 VH CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 (i) 서열번호 247의 VH CDR1, 서열번호 254의 VH CDR2 및 서열번호 277의 VH CDR3을 포함하거나; (ii) 서열번호 284의 VH CDR1, 서열번호 292의 VH CDR2 및 서열번호 310의 VH CDR3을 포함하거나; (iii) 서열번호 318의 CDR1, 서열번호 326의 CDR2 및 서열번호 352의 CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 서열번호 247의 VH CDR1, 서열번호 254의 VH CDR2 및 서열번호 266의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 111의 VL CDR1, 서열번호 123의 VL CDR2 및 서열번호 132의 VL CDR3을 포함하거나; (ii) VH는 서열번호 284의 VH CDR1, 서열번호 292의 VH CDR2 및 서열번호 299의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 152의 VL CDR1, 서열번호 163의 VL CDR2 및 서열번호 168의 VL CDR3을 포함하거나; (iii) VH는 서열번호 318의 VH CDR1, 서열번호 326의 VH CDR2 및 서열번호 340의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 188의 VL CDR1, 서열번호 197의 VL CDR2 및 서열번호 207의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 서열번호 248의 VH CDR1, 서열번호 255의 VH CDR2 및 서열번호 267의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 112의 VL CDR1, 서열번호 124의 VL CDR2 및 서열번호 133의 VL CDR3을 포함하거나; (ii) VH는 서열번호 285의 VH CDR1, 서열번호 293의 VH CDR2 및 서열번호 300의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 153의 VL CDR1, 서열번호 164의 VL CDR2 및 서열번호 169의 VL CDR3을 포함하거나; (iii) VH는 서열번호 319의 VH CDR1, 서열번호 327의 VH CDR2 및 서열번호 341의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 189의 VL CDR1, 서열번호 198의 VL CDR2 및 서열번호 208의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 서열번호 249의 VH CDR1, 서열번호 256의 VH CDR2 및 서열번호 268의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 113의 VL CDR1, 서열번호 125의 VL CDR2 및 서열번호 134의 VL CDR3을 포함하거나; (ii) VH는 서열번호 286의 VH CDR1, 서열번호 294의 VH CDR2 및 서열번호 301의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 154의 VL CDR1, 서열번호 165의 VL CDR2 및 서열번호 170의 VL CDR3을 포함하거나; (iii) VH는 서열번호 320의 VH CDR1, 서열번호 328의 VH CDR2 및 서열번호 342의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 190의 VL CDR1, 서열번호 199의 VL CDR2 및 서열번호 209의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 서열번호 250의 VH CDR1, 서열번호 257의 VH CDR2 및 서열번호 269의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 114의 VL CDR1, 서열번호 126의 VL CDR2 및 서열번호 135의 VL CDR3을 포함하거나; (ii) VH는 서열번호 287의 VH CDR1, 서열번호 295의 VH CDR2 및 서열번호 302의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 155의 VL CDR1, 서열번호 165의 VL CDR2 및 서열번호 171의 VL CDR3을 포함하거나; (iii) VH는 서열번호 321의 VH CDR1, 서열번호 329의 VH CDR2 및 서열번호 343의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 191의 VL CDR1, 서열번호 200의 VL CDR2 및 서열번호 210의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 서열번호 251의 VH CDR1, 서열번호 258의 VH CDR2 및 서열번호 270의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 115의 VL CDR1, 서열번호 127의 VL CDR2 및 서열번호 136의 VL CDR3을 포함하거나; (ii) VH는 서열번호 288의 VH CDR1, 서열번호 295의 VH CDR2 및 서열번호 303의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 156의 VL CDR1, 서열번호 166의 VL CDR2 및 서열번호 172의 VL CDR3을 포함하거나; (iii) VH는 서열번호 322의 VH CDR1, 서열번호 330의 VH CDR2 및 서열번호 344의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 192의 VL CDR1, 서열번호 201의 VL CDR2 및 서열번호 211의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 서열번호 248의 VH CDR1, 서열번호 259의 VH CDR2 및 서열번호 271의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 116의 VL CDR1, 서열번호 126의 VL CDR2 및 서열번호 137의 VL CDR3을 포함하거나; (ii) VH는 서열번호 285의 VH CDR1, 서열번호 296의 VH CDR2 및 서열번호 304의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 157의 VL CDR1, 서열번호 165의 VL CDR2 및 서열번호 173의 VL CDR3을 포함하거나; (iii) VH는 서열번호 319의 VH CDR1, 서열번호 331의 VH CDR2 및 서열번호 345의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 193의 VL CDR1, 서열번호 200의 VL CDR2 및 서열번호 212의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 서열번호 247의 VH CDR1, 서열번호 254의 VH CDR2 및 서열번호 277의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 111의 VL CDR1, 서열번호 123의 VL CDR2 및 서열번호 132의 VL CDR3을 포함하거나; (ii) VH는 서열번호 284의 VH CDR1, 서열번호 292의 VH CDR2 및 서열번호 310의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 152의 VL CDR1, 서열번호 163의 VL CDR2 및 서열번호 168의 VL CDR3을 포함하거나; (iii) VH는 서열번호 318의 VH CDR1, 서열번호 326의 VH CDR2 및 서열번호 352의 VH CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 168의 VL CDR1, 서열번호 197의 VL CDR2 및 서열번호 207의 VL CDR3을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 584의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 84의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 584의 서열을 포함하고 VL은 서열번호 84의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 585의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 85의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서 VH는 서열번호 585의 서열을 포함하고 VL은 서열번호 85의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 586의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 86의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 586의 서열을 포함하고 VL은 서열번호 86의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 587의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 87의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 587의 서열을 포함하고 VL은 서열번호 87의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 588의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 588의 서열을 포함하고 VL은 서열번호 88의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 589의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 89의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 589의 서열을 포함하고 VL은 서열번호 89의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 592의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 86의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 592의 서열을 포함하고 VL은 서열번호 86의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 238의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 84의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 238의 서열을 포함하고 VL은 서열번호 84의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 584의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 84의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 584의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함하고 VL은 서열번호 84의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 585의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 85의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 585의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함하고 VL은 서열번호 85의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 586의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 86의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 586의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함하고 VL은 서열번호 86의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 587의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 87의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 587의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함하고 VL은 서열번호 87의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 588의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 88의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 588의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함하고 VL은 서열번호 88의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 589의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 89의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 589의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함하고 VL은 서열번호 89의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 592의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 86의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 592의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함하고 VL은 서열번호 86의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, VH는 서열번호 238의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열번호 84의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열번호 238의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함하고 VL은 서열번호 84의 서열과의 동일성이 적어도 95%인 서열을 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 1에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR3이다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 2에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR3이다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 3에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR3이다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 1에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR3이고 (ii) VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1은 상기 항체에 대한 VL CDR1로서 표 4에 제시된 서열번호의 VL CDR1이고, VL CDR2는 상기 항체에 대한 VL CDR2로서 표 4에 제시된 서열번호의 VL CDR2이고, VL CDR3은 상기 항체에 대한 VL CDR3으로서 표 4에 제시된 서열번호의 VL CDR3이다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 2에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR3이고 (ii) VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1은 상기 항체에 대한 VL CDR1로서 표 5에 제시된 서열번호의 VL CDR1이고, VL CDR2는 상기 항체에 대한 VL CDR2로서 표 5에 제시된 서열번호의 VL CDR2이고, VL CDR3은 상기 항체에 대한 VL CDR3으로서 표 5에 제시된 서열번호의 VL CDR3이다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 3에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR3이고 (ii) VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1은 상기 항체에 대한 VL CDR1로서 표 6에 제시된 서열번호의 VL CDR1이고, VL CDR2는 상기 항체에 대한 VL CDR2로서 표 6에 제시된 서열번호의 VL CDR2이고, VL CDR3은 상기 항체에 대한 VL CDR3으로서 표 6에 제시된 서열번호의 VL CDR3이다.

특정 실시양태에서, VH는 항체에 대한 VH로서 표 7에 제시된 서열번호를 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 항체에 대한 VH로서 표 7에 제시된 서열번호를 포함하고, VL은 상기 항체에 대한 VL로서 표 8에 제시된 서열번호를 포함한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 경쇄는 표 9에 열거된 항체 번호에 대한 경쇄로서 표 9에 제시된 서열번호의 경쇄이고, 중쇄는 상기 항체에 대한 중쇄로서 표 9에 제시된 서열번호의 중쇄이다.

특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 VISTA(서열번호 377의 아미노산 33-311)에 특이적으로 결합한다.

또 다른 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 항체는 아미노산 서열 HLHHG(서열번호 377의 아미노산 98-102, 넘버링은 신호 서열(신호 서열은 표 11에 볼드체와 밑줄로 표시됨) 다음의 첫 번째 아미노산으로 시작) 또는 VVEIRHHHSEHR(서열번호 377의 아미노산 148-159, 넘버링은 신호 서열(표 11에 볼드체와 밑줄로 표시됨) 다음의 첫 번째 아미노산으로 시작)을 포함하는 인간 VISTA의 에피토프를 인식한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 377의 티로신 37, 아르기닌 54, 발린 117 및 아르기닌 127(넘버링은 신호 서열(표 11에 볼드체와 밑줄로 표시됨) 다음의 첫 번째 아미노산으로 시작)을 포함하는 인간 VISTA의 에피토프를 인식한다.

또 다른 측면에서, (a) (i) 서열번호 584의 서열을 포함하는 VH 및 (ii) 서열번호 84의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제1 면역글로불린; (b) (i) 서열번호 585의 서열을 포함하는 VH 및 (ii) 서열번호 85의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제2 면역글로불린; (c) (i) 서열번호 586의 서열을 포함하는 VH 및 (ii) 서열번호 86의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제3 면역글로불린; (d) (i) 서열번호 587의 서열을 포함하는 VH 및 (ii) 서열번호 87의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제4 면역글로불린; (e) (i) 서열번호 588의 서열을 포함하는 VH 및 (ii) 서열번호 88의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제5 면역글로불린; (f) (i) 서열번호 589의 서열을 포함하는 VH 및 (ii) 서열번호 89의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제6 면역글로불린; (g) (i) 서열번호 238의 서열을 포함하는 VH 및 (ii) 서열번호 84의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제7 면역글로불린; 및 (h) (i) 서열번호 592의 서열을 포함하는 VH 및 (ii) 서열번호 86의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제8 면역글로불린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 항체와 VISTA의 결합에 대해 경쟁하는 항체 및 이의 항원 결합 단편이 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 항체는 단클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 면역글로불린이다.

특정 실시양태에서, 항체는 Fc 영역 또는 Fc 영역의 변이체를 포함하고; 선택적으로 Fc 영역은 인간 Fc 영역이거나 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에서 1 내지 7개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖는 인간 Fc 영역의 변이체이고/이거나 선택적으로 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 추가로 선택적으로 항체는 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 불변 영역을 포함하거나 천연 불변 영역에 비해 불변 영역에서 1 내지 7개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 불변 영역의 변이체를 포함한다.

특정 실시양태에서, 항체는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 매개한다. 특정 실시양태에서, 항체는 보체 의존성 세포 매개 세포독성(CDC)을 매개한다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 매개한다.

특정 실시양태에서, 항체는 인간 Fc 영역의 상기 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, (a) Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이고, 돌연변이는 C220D, D221C, E233P, L234A, L234E, L234Y, L235A, L235E, L235F, G236A, G236W, G236R, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, A330L, A330S, P331A, P331S, I332E, E333A, E333S, K334A, A378V, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이거나; (b) Fc 영역은 인간 IgG2의 Fc 영역이고, 돌연변이는 C220D, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, V309L, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, A330L, A330S, P331A, P331S, I332E, E333A, E333S, K334A, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이거나; (c) Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이는 S228P, E233P, F234A, L235A, L235E, L235F, G236A, G236W, G236R, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, V309L, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, I332E, E333A, E333S, K334A, A378V, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, Fc 영역은 (a) 인간 IgG1의 Fc 영역이고, 돌연변이는 L234A 및 L235A, 및 선택적으로 P329G를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이거나; (b) 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이는 F234A 및 L235A, 및 선택적으로 P329G를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이는 M252Y, S254T 및 T256E를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이는 M428L 및 N434S를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이는 S228P 및 L235E를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이는 S228P, M252Y, S254T 및 T256E를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이는 S228P, M428L 및 N434S를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 BiTE 또는 TriKE이다.

특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 Fv 단편, Fab 단편 또는 F(ab')₂ 단편이다.

특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정제된다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 단리된다.

또 다른 측면에서, 링커 서열에 의해 분리된 VH 및 VL을 포함하는 단일쇄 Fv(scFv)가 본원에서 제공되며, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 표에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR3이다. 특정 실시양태에서, VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1은 상기 항체에 대한 VL CDR1로서 표 4-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 표에 제시된 서열번호의 VL CDR1이고, VL CDR2는 상기 항체에 대한 VL CDR2로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VL CDR2이고, VL CDR3은 상기 항체에 대한 VL CDR3으로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VL CDR3이고, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 모두 동일한 CDR 넘버링 시스템으로 정의된다. 특정 실시양태에서, VH는 상기 항체의 VH로서 표 7에 제시된 서열번호를 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 상기 항체의 VL로서 표 8에 제시된 서열번호를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 scFv를 포함하는 융합 단백질이 본원에서 제공된다.

또 다른 측면에서, 치료제에 결합된(선택적으로 공유 결합된) 임의의 이전 실시양태의 항체 또는 항원-결합 단편, scFv 또는 융합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체가 본원에서 제공된다.

또 다른 측면에서, 임의의 이전 실시양태의 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본원에서 제공된다. 또한, CAR을 발현하는 세포가 본원에서 제공된다.

또 다른 측면에서, 임의의 이전 실시양태의 항체 또는 항원-결합 단편, scFv, 융합 단백질 또는 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.

또 다른 측면에서, 임의의 이전 실시양태의 항체 또는 항원-결합 단편, scFv, 융합 단백질 또는 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 생체 외 세포가 본원에서 제공된다. 또한, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 scFv 또는 융합 단백질 또는 CAR의 생성 방법으로서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 세포에 의해 발현되어 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 항체 또는 항원-결합 단편 또는 scFv 또는 융합 단백질 또는 CAR을 생성하도록 하는 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.

또 다른 측면에서, (a) 임의의 이전 실시양태의 항체 또는 항원-결합 단편, scFv, 융합 단백질, CAR, 항체-약물 접합체 또는 세포의 치료 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 또한, 암 치료가 필요한 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암 치료 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 암은 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 두경부 편평세포암, 혈액암(blood cancer), 간세포암, 난소암, 중피종, 신경모세포종, 구강암, 갑상선암, 유방암, 육종, 췌장암, 결장암(colon cancer), 위암, 융모암, 고환암, 피부암, 신장세포암종, 방광암, 혈액암(hematological cancer)(예를 들어, 급성 골수성 백혈병) 또는 자궁경부암이다. 한 실시양태에서, 암은 골수이형성 증후군이다. 특정 실시양태에서, 암은 전이성 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병이고, 약제학적 조성물은 치료 유효량의 항체-약물 접합체를 포함하고, 치료제는 선택적으로 세포독성제이다.

특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 추가 치료를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가 치료는 암을 치료하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 대상체에게 화학요법제, 티로신 키나제 억제제 및/또는 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 대상체에게 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하며, 면역 체크포인트 억제제는 예정사-1(PD-1) 또는 예정사-리간드 1(PDL1) 또는 세포독성 T-림프구 연관 단백질 4(CTLA-4)의 억제제이다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 한 실시양태에서, 추가 치료는 방사선요법이다.

도 1a-1n. 인간 VISTA에 대한 항-VISTA 항체 번호 269.1(도 1a), 321.1(도 1b), 245.1(도 1c), 465.1(도 1d), 457.1(도 1e), 173.1(도 1f), 833.1(도 1g), 150.1(도 1h), 474.1(도 1i), 80(도 1j), 85(도 1k), 87(도 1l), 91(도 1m) 및 92(도 1n)의 친화도를 측정하는 Octet 센서그램(sensorgram). 항체 친화도는 Octet Red 96(ForteBio) 시스템에서 바이오층 간섭법(biolayer interferometry)을 사용하여 측정하였다. 바이오센서(항-인간 IgG Fc 포획 딥(capture dip) 및 판독 센서)에 고정된 항-VISTA 항체에 대한 항원(his-태그된 인간 VISTA Met 1 내지 Ala 194) 결합(association) 및 해리(dissociation)를 보여주는 센서그램.
도 2a-2g. 원숭이 VISTA에 대한 항-VISTA 항체 번호 269.1(도 2a), 321.1(도 2b), 245.1(도 2c), 465.1(도 2d), 457.1(도 2e), 173.1(도 2f) 및 833.1(도 2g)의 친화도를 측정하는 Octet 센서그램. 항체 친화도는 Octet Red 96(ForteBio) 시스템에서 바이오층 간섭법을 사용하여 측정하였다. 바이오센서(항-인간 IgG Fc 포획 딥 및 판독 센서)에 고정된 항-VISTA 항체에 대한 항원(his-태그된 사이노몰구스 원숭이 VISTA Met 1 내지 Ala 194) 결합 및 해리를 보여주는 센서그램.
도 3a-3g. 마우스 VISTA에 대한 항-VISTA 항체 번호 269.1(도 3a), 321.1(도 3b), 245.1(도 3c), 465.1(도 3d), 457.1(도 3e), 173.1호(도 3f) 및 833.1호(도 3g)의 친화도를 측정하는 Octet 센서그램. 항체 친화도는 Octet Red 96(ForteBio) 시스템에서 바이오층 간섭법을 사용하여 측정하였다. 바이오센서(항-인간 IgG Fc 포획 딥 및 판독 센서)에 고정된 항-VISTA 항체에 대한 항원(his-태그된 마우스 VISTA Met 1에서 Ala 194) 결합 및 해리를 보여주는 센서그램.
도 4a-4g. 인간 VISTA에 결합하는 항-VISTA 항체 번호 321.1(도 4a), 245.1(도 4b), 465.1(도 4c), 457.1(도 4d), 173.1 (도 4e), 150.1(도 4f) 및 474.1(도 4g)의 전체 키네틱 특성분석. 항체 친화도를 항원 농도 범위에 걸쳐 Octet Red 96(ForteBio) 시스템에서 바이오층 간섭법을 사용하여 측정하였다. 바이오센서(항-인간 IgG Fc 포획 딥 및 판독 센서)에 고정된 항-VISTA 항체에 대한 항원(his-태그된 인간 VISTA Met 1-Ala 194) 결합 및 해리를 보여주는 센서그램. 0.1-0.5nm의 반응을 일으키는 항원 농도를 분석에 사용하였다.
도 5a-5f. 인간 VISTA에 결합하는 항-VISTA 항체의 용량 반응 ELISA 분석. ELISA 검정을 사용하여 0.003-10μg/mL의 농도 범위에 걸쳐 마이크로티터 플레이트(microtiter plate)에서의 고정된 항원(his-태그 VISTA 세포 외 도메인)과 항-VISTA 항체 사이의 결합을 측정하였다. 항원-항체 복합체는 발색 검정을 사용하여 측정하였고, 데이터는 log 변환된 항체 농도에 대한 450nm에서의 흡광도로 플로팅(plotting)되어 있다. 곡선은 비선형 회귀로 피팅(fitting)하고 EC50 값을 계산하였다. 각 그래프는 1-3개의 항체에 대한 용량 반응 데이터를 나타낸다(시험된 항체는 x축에 표시되어 있음).
도 5g-5i. 다중 pH에서 인간 VISTA에 결합된 항-VISTA 항체의 용량 반응 ELISA 분석. ELISA 검정을 사용하여 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 및 pH 7.4에서 0.16-1000ng/mL의 농도 범위에 걸쳐 마이크로티터 플레이트에 고정된 항원(his-태그 VISTA 세포 외 도메인)과 항-VISTA 항체 사이의 결합을 측정하였다. 항원-항체 복합체는 발색 검정을 사용하여 측정하였고, 데이터는 log 변환된 항체 농도에 대한 450nm에서의 흡광도로 플로팅되어 있다. 곡선은 비선형 회귀로 피팅하고 EC50 값을 계산하였다. 각 그래프는 시험된 각 pH에서 단일 항체에 대한 용량 반응 데이터를 나타낸다. Maxisorb ELISA 플레이트를 이 검정에 사용하였다.
도 6a-6h. 항-VISTA 항체는 VISTA에 특이적이다. 다른 B7 계열 구성원에 대한 결합에 대해 항-VISTA 항체를 스크리닝하였다. 모든 항체는 다른 관련된 인간 단백질에 결합하지 않고 VISTA에 특이적이었다. 시험된 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 7a, 7b, 7c. VISTA에 결합하는 항-VISTA 항체는 CHO K1 세포에서 안정적으로 발현된다. 항체를 CHO K1 세포에서 안정하게 발현된 인간, 마우스 및 사이노몰구스 원숭이 VISTA에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 세포를 0.05, 1 또는 150nM의 각 항-VISTA 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포에 결합된 항체는 PE 접합된 2차 항체로 검출하였고 결합의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI)는 FACS 분석으로 측정하였다. 데이터는 log 변환된 MFI로 플로팅되어 있다. 각 항체를 인간("Hs"), 사이노몰구스 원숭이("Mf") 및 마우스("Mm") VISTA를 발현하는 CHO 세포에 대해 평가하였다. 원, 항체 농도 150nM의 MFI; 사각형, 항체 농도 1nM의 MFI, 삼각형, 항체 농도 0.05nM의 MFI. 시험된 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 8a-8r. 세포 표면에서 발현된 VISTA에 대한 다지점 용량 반응 결합 데이터. 인간 IgG1(도 8a) 및 IgG4(도 8o) 대조군 및 항-VISTA 항체 번호 269.1(도 8b), 321.1(도 8c), 245.1(도 8d), 465.1 (도 8e), 457.1(도 8f), 173.1(도 8g), VSTB174(도 8h), 474.1(도 8i), 150.1(도 8j), 80(도 8k), 92(도 8l), 87(도 8m), 91(도 8n), 245.4(도 8p), 465.4(도 8q) 및 173.4(도 8r)를 0.006, 0.024, 0.098, 0.391, 1.563, 6.25, 25 및 100nM 또는 0.003, 0.012, 0.049, 0.195, 0.781, 3.125, 12.5 및 50nM에서 CHO K1 세포에서 안정하게 발현된 인간, 마우스 및 사이노몰구스 원숭이 VISTA에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 데이터는 log 변환된 MFI 대 log 변환된 항체 농도로 플로팅되었다. 곡선은 가변 기울기를 이용해 비선형 회귀로 피팅하고 EC50 값을 계산하였다.
도 8s. 항체 번호 474.1에 대한 돌연변이체 VISTA-ECD-Fc 결합 평가. Ab 번호 474.1의 결합을 인간 VISTA-ECD 돌연변이체를 사용하여 시험하였다. 100ug/mL-0.003ug/mL에서 적정된 Ab 번호 474.1을 3ug/mL의 돌연변이체 VISTA-ECD로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 포획하였다. 비오티닐화 항-인간 Ig 경쇄 카파(kappa)에 이어 스트렙트아비딘(streptavidin)-HRP 및 TMB 기질을 사용하여 Ab 번호 474.1을 검출하였다. CLARIOstar 플레이트 판독기를 사용하여 450nm 광학 밀도를 측정하였다.
도 8t. 항체 번호 150.1에 대한 돌연변이체 VISTA-ECD-Fc 결합 평가. Ab 번호 150.1의 결합을 인간 VISTA-ECD 돌연변이체를 사용하여 시험하였다. 100ug/mL-0.003ug/mL에서 적정된 Ab 번호 150.1을 3ug/mL의 돌연변이체 VISTA-ECD로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 포획하였다. 비오티닐화 항-인간 Ig 경쇄 카파에 이어 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질을 사용하여 Ab 번호 150.1을 검출하였다. CLARIOstar 플레이트 판독기를 사용하여 450nm 광학 밀도를 측정하였다.
도 8u. 항체 번호 85에 대한 돌연변이체 VISTA-ECD-Fc 결합 평가. Ab 번호 85의 결합을 인간 VISTA-ECD 돌연변이체를 사용하여 시험하였다. 100ug/mL-0.003ug/mL에서 적정된 Ab 번호 85를 3ug/mL의 돌연변이체 VISTA-ECD로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 포획하였다. 비오티닐화 항-인간 Ig 경쇄 카파에 이어 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질을 사용하여 Ab 번호 85를 검출하였다. CLARIOstar 플레이트 판독기를 사용하여 450nm 광학 밀도를 측정하였다.
도 8v. 항체 번호 87에 대한 돌연변이체 VISTA-ECD-Fc 결합 평가. Ab 번호 87의 결합을 인간 VISTA-ECD 돌연변이체를 사용하여 시험하였다. 100ug/mL-0.003ug/mL에서 적정된 Ab 번호 87을 3ug/mL의 돌연변이체 VISTA-ECD로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 포획하였다. 비오티닐화 항-인간 Ig 경쇄 카파에 이어 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질을 사용하여 Ab 번호 87을 검출하였다. CLARIOstar 플레이트 판독기를 사용하여 450nm 광학 밀도를 측정하였다.
도 8w. 항체 번호 91에 대한 돌연변이체 VISTA-ECD-Fc 결합 평가. Ab 번호 91의 결합을 인간 VISTA-ECD 돌연변이체를 사용하여 시험하였다. 100ug/mL-0.003ug/mL에서 적정된 Ab 번호 91을 3ug/mL의 돌연변이 VISTA-ECD로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 포획하였다. 비오티닐화 항-인간 Ig 경쇄 카파에 이어 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질을 사용하여 Ab 번호 91을 검출하였다. CLARIOstar 플레이트 판독기를 사용하여 450nm 광학 밀도를 측정하였다.
도 8x. 항체 번호 92에 대한 돌연변이체 VISTA-ECD-Fc 결합 평가. Ab 번호 92의 결합을 인간 VISTA-ECD 돌연변이체를 사용하여 시험하였다. 100ug/mL-0.003ug/mL에서 적정된 Ab 번호 92를 3ug/mL의 돌연변이 VISTA-ECD로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 포획하였다. 비오티닐화 항-인간 Ig 경쇄 카파에 이어 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질을 사용하여 Ab 번호 92를 검출하였다. CLARIOstar 플레이트 판독기를 사용하여 450nm 광학 밀도를 측정하였다.
도 8y. 항체 VSTB174에 대한 돌연변이체 VISTA-ECD-Fc 결합 평가. VSTB174의 결합을 인간 VISTA-ECD 돌연변이체를 사용하여 시험하였다. 100ug/mL-0.003ug/mL에서 적정된 VSTB174를 3ug/mL의 돌연변이 VISTA-ECD로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 포획하였다. 비오티닐화 항-인간 Ig 경쇄 카파에 이어 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질을 사용하여 VSTB174를 검출하였다. CLARIOstar 플레이트 판독기를 사용하여 450nm 광학 밀도를 측정하였다.
도 9a 및 9b: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 269.1(도 9a) 및 항체 번호 833.1(도 9b)의 효과. 인간 NK 세포 고갈된 PBMC를 37℃에서 4일 동안 3, 0.3 또는 0.03μg/ml의 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체 및 5ng/ml의 포도상구균 엔테로톡신 B(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다.
도 9c: VSTB174와 비교한, 4일차에 NK 세포 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 474.1(WT), 150.1(YTE) 및 246.4의 효과. NK 세포 고갈된 인간 PBMC를 37℃에서 4일 동안 30, 3, 0.3 및 0.03ug/ml의 시험되는 항-VISTA Ab 또는 대조군 Ab 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다.
도 10: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 321.1의 효과. NK 세포 고갈된 인간 PBMC를 37℃에서 4일 동안 3, 0.3 또는 0.03μg/ml의 시험되는 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다.
도 11: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 245.1의 효과. NK 세포 고갈된 인간 PBMC를 37℃에서 4일 동안 3, 0.3 또는 0.03μg/ml의 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다.
도 12: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 465.1의 효과. NK 세포 고갈된 인간 PBMC를 37℃에서 4일 동안 3, 0.3 또는 0.03μg/ml의 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다.
도 13: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 457.1의 효과. NK 세포 고갈된 인간 PBMC를 37℃에서 4일 동안 3, 0.3 또는 0.03μg/ml의 시험되는 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다.
도 14: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 173.1의 효과. NK 세포 고갈된 인간 PBMC를 37℃에서 4일 동안 3, 0.3 또는 0.03μg/ml의 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다.
도 15: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 245.1 및 항체 번호 245.4의 효과. 37℃에서 4일 동안 도면에 열거된 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체(3μg/ml) 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다. 시험된 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 16: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 465.1 및 항체 번호 465.4의 효과. 37℃에서 4일 동안 도면에 열거된 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체(3μg/ml) 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다. 시험된 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 17: 4일차에 NK 고갈된 인간 PBMC의 SEB 유도된 자극에 대한 항체 번호 173.1 및 항체 번호 173.4의 효과. 37℃에서 4일 동안 도면에 열거된 항-VISTA 항체 또는 대조군 항체(3μg/ml) 및 5ng/ml의 SEB의 존재하에 2×10⁵개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 4일차 IFN-γ 생성은 제조업체의 사양서에 따라 ELISA(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)로 정량화하였다. 시험된 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 18a 및 18b. VISTA 매개된 T 세포 활성화 억제의 역전(reversal)에 대한 항-VISTA 항체 번호 269.1의 효과. 2×10⁵개의 Cell Trace Violet 표지된 인간 pan T 세포를 24시간 동안 VISTA 코팅된 비드(비드 대 세포 비율 2:1) 및 100μg/ml의 항체 번호 269.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 CD3에 대한 항체("Ab")로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. T 세포 증식은 유세포분석으로 정량화하였고 IFNγ는 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY285B-05)로 정량화하였다.
도 19a 및 19b. VISTA 매개된 T 세포 활성화 억제의 역전에 대한 항-VISTA 항체 번호 321.1의 효과. 2×10⁵개의 Cell Trace Violet 표지된 인간 pan T 세포를 24시간 동안 VISTA 코팅된 비드(비드 대 세포 비율 2:1) 및 100μg/ml의 항체 번호 321.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 항-CD3 Ab 코팅된 플레이트에서 배양하였다. T 세포 증식은 유세포분석으로 정량화하였고 IFNγ는 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY285B-05)로 정량화하였다.
도 20a 및 20b. VISTA 매개된 T 세포 활성화 억제의 역전에 대한 항-VISTA 항체 번호 245.1의 효과. 2×10⁵개의 Cell Trace Violet 표지된 인간 pan T 세포를 24시간 동안 VISTA 코팅된 비드(비드 대 세포 비율 2:1) 및 100μg/ml의 항체 번호 245.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 항-CD3 Ab 코팅된 플레이트에서 배양하였다. T 세포 증식은 유세포분석으로 정량화하였고 IFNγ는 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY285B-05)로 정량화하였다.
도 21a 및 21b. VISTA 매개된 T 세포 활성화 억제의 역전에 대한 항-VISTA 항체 번호 457.1의 효과. 2×10⁵개의 Cell Trace Violet 표지된 인간 pan T 세포를 24시간 동안 VISTA 코팅된 비드(비드 대 세포 비율 2:1) 및 100μg/ml의 항체 번호 457.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 항-CD3 Ab 코팅된 플레이트에서 배양하였다. T 세포 증식은 유세포분석으로 정량화하였고 IFNγ는 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY285B-05)로 정량화하였다.
도 22a 및 22b. VISTA 매개된 T 세포 활성화 억제의 역전에 대한 항-VISTA 항체 번호 173.1의 효과. 2×10⁵개의 Cell Trace Violet 표지된 인간 pan T 세포를 24시간 동안 VISTA로 코팅된 비드 및 100μg/ml의 항체 번호 173.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 항-CD3 Ab로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. T 세포 증식은 유세포분석으로 정량화하였고 IFNγ는 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY285B-05)로 정량화하였다.
도 23a-23d. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80, CD86 및 HLA-DR의 상향조절 및 CXCL10 분비에 대한 항-VISTA 항체 번호 269.1의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 269.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포(live cell)에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80, CD86 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 24a-24c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절 및 CXCL10 분비에 대한 항-VISTA 항체 번호 833.1의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 833.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 25a-25d. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80, CD86 및 HLA-DR의 상향조절 및 CXCL10 분비에 대한 항-VISTA 항체 번호 321.1의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 321.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80, CD86 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 26a-26c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절 및 CXCL10 분비에 대한 항-VISTA 항체 번호 245.1의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 245.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 27a-27c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절 및 CXCL10 분비에 대한 항-VISTA 항체 번호 465.1의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 465.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 28a-28d. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80, CD86 및 HLA-DR의 상향조절 및 CXCL10 분비에 대한 항-VISTA 항체 번호 457.1의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 457.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80, CD86 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 29a-29d. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80, CD86 및 HLA-DR의 상향조절 및 CXCL10 분비에 대한 항-VISTA 항체 번호 173.1의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 173.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80, CD86 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 30a-30c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 HLA-DR 및 CD80의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체 번호 269.1의 용량-반응 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 용량-반응 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 30, 3, 0.3, 0.03 또는 0.003μg/ml의 항체 번호 269.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-15)로 정량화하였다.
도 31a-31c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 HLA-DR 및 CD80의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체 번호 833.1의 용량-반응 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 용량-반응 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 30, 3, 0.3, 0.03 또는 0.003μg/ml의 항체 번호 833.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-15)로 정량화하였다.
도 32a-32c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 HLA-DR 및 CD80의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체 번호 321.1의 용량-반응 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 용량-반응 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 30, 3, 0.3, 0.03 또는 0.003μg/ml의 항체 번호 321.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-15)로 정량화하였다.
도 33a-33c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 HLA-DR 및 CD80의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체 번호 245.1의 용량-반응 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 용량-반응 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 30, 3, 0.3, 0.03 또는 0.003μg/ml의 항체 번호 245.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-15)로 정량화하였다.
도 34a-34c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 HLA-DR 및 CD80의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체 번호 465.1의 용량-반응 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 용량-반응 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 30, 3, 0.3, 0.03 또는 0.003μg/ml의 항체 번호 465.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-15)로 정량화하였다.
도 35a-35c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 HLA-DR 및 CD80의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체 번호 457.1의 용량-반응 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 용량-반응 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 30, 3, 0.3, 0.03 또는 0.003μg/ml의 항체 번호 457.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-15)로 정량화하였다.
도 36a-36c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 HLA-DR 및 CD80의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체 번호 173.1의 용량-반응 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 용량-반응 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 30, 3, 0.3, 0.03 또는 0.003μg/ml의 항체 번호 173.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-15)로 정량화하였다.
도 36d-36i. CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80, HLA-DR의 24시간 상향조절 및 CXCL10 분비를 유도하기 위한 Ab 번호 474.1 및 Ab 번호 150.1(대조군은 VSTB174)의 용량-반응 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 3, 0.3, 0.03ug/ml의 시험되는 항-VISTA Ab 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재하에 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. CXCL10 케모카인의 분비는 R&D Systems DuoSet ELISA Human CXCL10 키트(R&D Systems, 제품 번호 DY266)로 정량화하였다.
도 37a-37c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체의 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 245.1 및 항체 번호 245.4 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다. 시험한 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 37d-37f. CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80, HLA-DR의 24시간 상향조절 및 CXCL10 분비를 유도하기 위한 Ab 번호 474.1 및 IgG4 대응물인 Ab 번호 246.4의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 3ug/ml의 항-VISTA Ab 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재하에 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. CD14+ 세포에서 CD80 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. CXCL10 케모카인의 분비는 R&D Systems DuoSet ELISA Human CXCL10 키트(R&D Systems, 제품 번호 DY266)로 정량화하였다.
도 38a-38c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체의 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 465.1 및 항체 번호 465.4 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다. 시험한 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 39a-39c. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체의 효과 및 CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 효과. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 10μg/ml의 항체 번호 173.1 및 항체 번호 173.4 또는 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다. 시험한 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 40a-40f. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절과 관련하여 항-VISTA 항체 번호 269.1의 용량-적정 효과 및 NK 세포의 역할, CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 효과 및 NK 세포의 역할. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 3, 0.3 또는 0.03μg/ml의 항체 번호 269.1, IgG1 대조군 또는 음성 대조군 항체 번호 18.1의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 총 PBMC(도 40a-40c) 또는 NK 고갈된 인간 PBMC(도 40d-40f)와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 알아내어 MFI로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 케모카인의 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 41a-41f. 24시간 공동 배양에서 CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절에 대한 항-VISTA 항체 번호 173.1의 용량-적정 효과 및 NK 세포의 역할, CXCL10의 분비에 대한 항-VISTA 항체의 효과 및 NK 세포의 역할. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 3, 0.3 또는 0.03μg/ml의 시험되는 항체 번호 173.1 Ab, IGG1 대조군 또는 음성 대조군 항체 번호 18.1 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 총 PBMC(도 41a-41c) 또는 NK 고갈된 인간 PBMC(도 41d-41f)와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절은 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 알아내어 MFI로 정량화하였다. 24시간 공동 배양에서 CXCL10 케모카인의 분비를 ELISA(R&D Systems, 카탈로그 번호 DY266-05)로 정량화하였다.
도 41g-41i. CD14+ 단핵구에서 활성화 마커 CD80, HLA-DR의 24시간 상향조절 및 CXCL10 분비를 유도하기 위한 Ab 번호 474.1 및 Ab 번호 150.1의 용량-반응 효과 및 NK 세포의 기여. 0.5×10⁵개의 CD14+ 농축된 인간 PBMC를 24시간 동안 3, 0.3, 0.03ug/ml의 시험되는 항-VISTA Ab 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재하에 동일한 공여자로부터의 2×10⁵개의 인간 PBMC 또는 2×10⁵개의 NK 고갈된 인간 PBMC와 공동 배양하였다. 24시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 HLA-DR의 상향조절을 게이팅된 CD14+ 생세포에 대한 유세포분석으로 정량화하였다. 인간 총 PBMC(왼쪽) 또는 NK 고갈된 인간 PBMC(오른쪽)의 존재하에 CD14+ 세포에서 CD80 및 HLA-DR의 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. CXCL10 케모카인의 분비를 R&D Systems DuoSet ELISA Human CXCL10 키트(R&D Systems, 제품 번호 DY266)로 정량화하였다.
도 42a 및 42b. 사이토카인 유도된 MDSC의 억제 활성에 대한 항-VISTA 항체 번호 321.1의 효과. 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC를 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(10ng/ml) 및 IL6(10ng/ml)의 존재하에 7일 동안 배양하였다. 7일 후, 항체 번호 321.1 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재하에 PBMC의 항-CD3 Ab 유도된 증식을 억제하는 CD11b+ 세포(MDSC)의 능력을 측정하였다. PBMC(2×10⁵개의 세포/웰)를 5mM CellTrace Violet으로 표지한 다음 항-CD3 Ab(2μg/ml)의 존재하에 MDSC(2×10⁵개의 세포/웰)에 첨가하였다. 4일의 인큐베이션 후, T 세포 증식을 유세포분석(Attune Nxt)으로 알아냈고 IFNγ 생성을 ELISA(ProQuantum)로 알아냈다. 막대 그래프는 단회(singlicate)이다.
도 43a 및 43b. 사이토카인 유도된 MDSC의 억제 활성에 대한 항-VISTA 항체 번호 245.1 및 245.4의 효과. 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC를 GM-CSF(10ng/ml) 및 IL6(10ng/ml)의 존재하에 7일 동안 배양하였다. 7일 후, 항체 번호 245.1 및 항체 번호 245.4 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재하에 PBMC의 항-CD3 Ab 유도된 증식을 억제하는 CD11b+ 세포(MDSC)의 능력을 측정하였다. PBMC(2×10⁵개의 세포/웰)를 5mM CellTrace Violet으로 표지한 다음 항-CD3 Ab(2μg/ml)의 존재하에 MDSC(2×10⁵개의 세포/웰)에 첨가하였다. 4일의 인큐베이션 후, T 세포 증식을 유세포분석(Attune Nxt)으로 알아냈고 IFNγ 생성을 ELISA(ProQuantum)로 알아냈다. 막대 그래프는 단회이다. 시험한 항체는 x축에 표시된다.
도 44a 및 44b. 사이토카인 유도된 MDSC의 억제 활성에 대한 항-VISTA 항체 번호 465.1의 효과. 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC 또는 CD11b+ 세포를 GM-CSF(10ng/ml) 및 IL6(10ng/ml)의 존재하에 7일 동안 배양하였다. 7일 후, 항체 번호 465.1 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재하에 PBMC의 항-CD3 Ab 유도된 증식을 억제하는 CD11b+ 세포(MDSC)의 능력을 측정하였다. PBMC(2×10⁵개의 세포/웰)를 5mM CellTrace Violet으로 표지한 다음 항-CD3 Ab(2μg/ml)의 존재하에 MDSC(2×10⁵개의 세포/웰)에 첨가하였다. 4일의 인큐베이션 후, T 세포 증식을 유세포분석(Attune Nxt)으로 알아냈고 IFNγ 생성을 ELISA(ProQuantum)로 알아냈다. 막대 그래프는 단회이다.
도 45a 및 45b. 사이토카인 유도된 MDSC의 억제 활성에 대한 항-VISTA 항체 번호 457.1의 효과. 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC 또는 CD11b+ 세포를 GM-CSF(10ng/ml) 및 IL6(10ng/ml)의 존재하에 7일 동안 배양하였다. 7일 후, 항체 번호 457.1 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재하에 PBMC의 항-CD3 Ab 유도된 증식을 억제하는 CD11b+ 세포(MDSC)의 능력을 측정하였다. PBMC(2×10⁵개의 세포/웰)를 5mM CellTrace Violet으로 표지한 다음 항-CD3 Ab(2μg/ml)의 존재하에 MDSC(2×10⁵개의 세포/웰)에 첨가하였다. 4일의 인큐베이션 후, T 세포 증식을 유세포분석(Attune Nxt)으로 알아냈고 IFNγ 생성을 ELISA(ProQuantum)로 알아냈다. 막대 그래프는 단회이다.
도 46a 및 46b. 사이토카인 유도된 MDSC의 억제 활성에 대한 항-VISTA 항체 번호 173.1의 효과. 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC 또는 CD11b+ 세포를 GM-CSF(10ng/ml) 및 IL6(10ng/ml)의 존재하에 7일 동안 배양하였다. 7일 후, 항체 번호 173.1 또는 아이소타입 대조군 Ab의 존재하에 PBMC의 항-CD3 Ab 유도된 증식을 억제하는 CD11b+ 세포(MDSC)의 능력을 측정하였다. PBMC(2×10⁵개의 세포/웰)를 5mM CellTrace Violet으로 표지한 다음 항-CD3 Ab(2μg/ml)의 존재하에 MDSC(2×10⁵개의 세포/웰)에 첨가하였다. 4일의 인큐베이션 후, T 세포 증식을 유세포분석(Attune Nxt)으로 알아냈고 IFNγ 생성을 ELISA(ProQuantum)로 알아냈다. 막대 그래프는 단회이다.
도 47a. FcRn 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가. IgG1 또는 IgG4 백본에서의 항체 번호 173 야생형(WT) 및 각각의 LS 돌연변이, Ab 번호 289(EU 넘버링에 따른 M428L 및 N434S 치환) 및 YTE 돌연변이, Ab 번호 420(EU 넘버링에 따른 M252Y, S254T 및 T256E 치환)을 AlphaLisa 결합 키트(Perkin Elmer #AL3095C)를 사용하여 FcRn 수용체에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 항-VISTA 항체를 1.2mg/ml(최종 농도의 4배)의 농도로 제조한 후 semi-log 연속 희석을 수행하였다. FcRn을 800ng/ml(최종 농도의 4배)의 농도로 제조하고, 스트렙트아비딘 공여자 및 huIgG 접합된 수용체 비드를 20mg/ml의 농도(최종 농도의 2배)로 제조한 후 암실에서 90분 인큐베이션하였다. CLARIOstar 분광계에서 615nm에서 발광을 판독하였다. 시험한 항체는 범례에 표시되어 있다.
도 47b. FcRn 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가. IgG1 또는 IgG4 S228P 백본에서의 Ab 번호 474.1(WT) 항체(Ab 번호 246.4) 및 IgG1 백본에서의 YTE 돌연변이(Ab 번호 150.1)를 AlphaLisa 결합 키트(Perkin Elmer #AL3095C)를 사용하여 FcRn 수용체에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 항-VISTA 항체는 1mg/ml(4배)로 제조한 후 semi-log 연속 희석을 수행하였다. FcRn을 800ng/ml(4배)로 제조하고 스트렙트아비딘 공여자 및 huIgG 접합된 수용체 비드를 40mg/ml(2배)로 제조한 후 암실에서 90분 인큐베이션하였다. 발광은 CLARIOstar 분광계에서 680nm/615nm(여기/방출)에서 판독하였다.
도 48a. 면역글로불린 감마 Fc 수용체 1(FcγR1) 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가. IgG1 또는 IgG4 백본에서의 항체 번호 173 WT 및 각각의 LS(Ab 번호 289) 및 YTE(Ab 번호 420) 돌연변이를 AlphaLisa 결합 키트(Perkin Elmer #AL3081C)를 사용하여 FcγR1 수용체에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 항-VISTA 항체를 1.2mg/ml(최종 농도의 4배)의 농도로 제조한 후 semi-log 연속 희석을 수행하였다. FcγR1을 200ng/ml(최종 농도의 4배)의 농도로 제조하고 스트렙트아비딘 공여자 및 huIgG 접합된 수용체 비드를 40mg/ml(최종 농도의 2배) 농도로 제조한 후 암실에서 90분 동안 인큐베이션하였다. CLARIOstar 분광계에서 615nm에서 발광을 판독하였다. 시험한 항체는 범례에 표시되어 있다.
도 48b. FcγR1 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가. IgG1 또는 IgG4 S228P 백본에서의 Ab 번호 474.1(WT) 항체(Ab 번호 246.4) 및 IgG1 백본에서의 YTE 돌연변이(Ab 번호 150.1)를 AlphaLisa 결합 키트(Perkin Elmer #AL3081C)를 사용하여 FcγR1 수용체에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 항-VISTA 항체를 1mg/ml(4배)로 제조한 후 semi-log 연속 희석을 수행하였다. FcγR1을 200ng/ml(4배)로 제조하고 스트렙트아비딘 공여자 및 huIgG 접합된 수용체 비드를 40μg/ml(2배)로 제조한 후 암실에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 발광은 CLARIOstar 분광계에서 680nm/615nm(여기/방출)에서 판독하였다.
도 49a 및 49b. 면역글로불린 감마 Fc 수용체 Ⅱa(FcγR2a)(대립유전자 167H 및 167R) 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가. IgG1 또는 IgG4 백본에서의 Ab 번호 173 WT와 이의 각각의 LS(Ab 번호 289) 및 YTE(Ab 번호 420) 돌연변이를 AlphaLisa 결합 키트(Perkin Elmer #AL3086C 및 #AL3087C)를 사용하여 FcγR2a 수용체(대립유전자 167H 또는 167R)에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 항-VISTA 항체를 1.2mg/ml(최종 농도의 4배)의 농도로 제조한 후 semi-log 연속 희석을 수행하였다. FcγR2a(167H)는 120ng/ml(최종 농도의 4배)로 제조하는 반면, FcγR2a(167R)는 200ng/ml(최종 농도의 4배)의 농도로 제조하고 스트렙트아비딘 공여자 및 huIgG 접합된 수용체 비드를 20mg/ml(최종 농도의 2배) 농도로 제조한 후 암실에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 발광은 CLARIOstar 분광계에서 615nm에서 판독하였다. 시험한 항체는 범례에 표시되어 있다.
도 49c 및 49d. FcγR2a(167H 및 167R) 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가. IgG1 또는 IgG4 S228P 백본에서의 Ab 번호 474.1(WT) 항체(Ab 번호 246.4) 및 IgG1 백본에서의 YTE 돌연변이(Ab 번호 150.1)를 AlphaLisa 결합 키트(Perkin Elmer #AL3086C 및 #AL3087C)를 사용하여 FcγR2a 수용체(대립유전자 167H 또는 167R)에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 항-VISTA 항체를 1mg/ml(4배)로 제조한 후 semi-log 연속 희석을 수행하였다. FcγR2a(167H)는 120ng/ml(4배)로 제조하는 반면, FcγR2a(167R)는 200ng/ml(4배)로 제조하고 스트렙트아비딘 공여자 및 huIgG 접합된 수용체 비드를 20μg/ml(2배)로 제조한 후 암실에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 발광은 CLARIOstar 분광계에서 680nm/615nm(여기/방출)에서 판독하였다.
도 50a 및 50b. 면역글로불린 감마 Fc 수용체 Ⅲa(FcγR3a)(176F 및 176V 대립유전자) 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가. IgG1 또는 IgG4 백본에서의 항체 번호 173 WT와 각각의 LS(Ab 번호 289) 및 YTE(Ab 번호 420) 돌연변이를 AlphaLisa 결합 키트(Perkin Elmer #AL347HV 및 #AL348HV)를 사용하여 FcγR3a 수용체(대립유전자 176F 또는 176V)에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 항-VISTA 항체를 1.2mg/ml(최종 농도의 4배)의 농도로 제조한 후 semi-log 연속 희석을 수행하였다. FcγR3a(176F)는 8nM(최종 농도의 4배)의 제조하는 반면, FcγR3a(176V)는 1.2nM(최종 농도의 4배)의 농도로 제조하고 스트렙트아비딘 공여자 및 huIgG 접합된 수용체 비드를 40mg/ml(최종 농도의 2배) 농도로 제조한 후 암실에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 발광은 CLARIOstar 분광계에서 615nm에서 판독하였다. 시험한 항체는 범례에 표시되어 있다.
도 50c 및 50d. FcγR3a(176F 및 176V) 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가. IgG1 또는 IgG4 S228P 백본에서의 Ab 번호 474.1(WT) 항체(Ab 번호 246.4) 및 IgG1 백본에서의 YTE 돌연변이(Ab 번호 150.1)를 AlphaLisa 결합 키트(Perkin Elmer #AL347HV 및 #AL348HV)를 사용하여 FcγR3a 수용체(대립유전자 176F 또는 176V)에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 항-VISTA 항체를 1mg/ml(4배)로 제조한 후 semi-log 연속 희석을 수행하였다. FcγR3a(176F)는 8nM(4배)로 제조하는 반면 FcγR3a(176V)는 1.2nM(4배)로 제조하고 스트렙트아비딘 공여자 및 huIgG 결합 수용체 비드를 40μg/ml(2배)로 제조한 후 암실에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 발광은 CLARIOstar 분광계에서 680nm/615nm(여기/방출)에서 판독하였다.
도 50e-50g. Octet K2 시스템에서 FAB2G 바이오센서에 결합된 VISTA mAb와 FcRn 결합의 키네틱. Ab 번호 150.1, 474.1 및 VSTB174를 항-인간 Fab-CH1(FAB2G) 딥(dip)에 1ug/ml 농도로 로딩(로딩 단계)하고 120초 동안 바이오센서(ForteBio)를 판독하였다. 로딩된 바이오센서를 240초 동안 0, 50, 200 및 800나노몰 농도에서 FcRn(R&D 시스템)에 담갔다(결합 단계). 결합된 바이오센서를 인산염 검정 버퍼(phosphate assay buffer, PAB) 용액에 360초 동안 담갔다(해리 단계). FcRn-Fc 활성의 세포 내 생물학을 복제하기 위해 기준선, 결합 및 해리를 포함한 모든 단계를 PAB(pH 6.0)에서 수행하였다. FcRn 분석물의 모든 농도에 걸쳐 k_a, k_dis 및 K_D를 알아내기 위해 1:1 전체 곡선 피팅 분석(Global curve fitting analysis)을 수행하였다. 2상 분리 곡선은 처음 10초 동안만 분석하였다. 키네틱 실험은 ForteBio Octet K2 시스템에서 수행하였으며 ForteBio Data Analysis HT 소프트웨어 버전 12.0.2.59를 사용하여 분석하였다.
도 51. 3시간에 인간 VISTA를 발현하는 표적 Raji 세포(Raji-hVISTA 세포)에서 ADCC 활성에 대한 이펙터 PBMC를 갖는 항-VISTA 항체 번호 421.1의 용량-반응 효과. 이펙터 세포(5×10⁵개의 인간 PBMC)를 100, 30, 10, 3.0, 1.0 또는 0.3ng/ml의 항체 번호 421.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 3시간 동안 표적 세포(BATDA로 표지된 1×10⁴개의 Raji-hVISTA 세포)와 공동 배양하였다. 유도된 ADCC 활성은 CLARIOstar Plus에서 DELFIA® EuTDA 세포독성 시약의 단기 시간 분해 형광측정법 검출(short term time-resolved fluorometry detection)로 정량화하였다.
도 52. 3시간에 인간 VISTA를 발현하는 표적 Raji 세포(Raji-hVISTA 세포)에서 ADCC 활성에 대한 이펙터 PBMC를 갖는 항-VISTA 항체 번호 245.1 및 475.1의 용량-반응 효과. 이펙터 세포(5×10⁵개의 인간 PBMC)를 100, 30, 10, 3.0, 1.0 또는 0.3ng/ml의 항체 번호 245.1(WT), 항체 번호 475.1(LS) 또는 대조군 Ab의 존재하에 3시간 동안 표적 세포(BATDA로 표지된 1×10⁴개의 Raji-hVISTA 세포)와 공동 배양하였다. 유도된 ADCC 활성은 CLARIOstar Plus에서 DELFIA® EuTDA 세포독성 시약의 단기 시간 분해 형광측정법 검출로 정량화하였다. 시험한 항체는 범례에 표시되어 있다.
도 53. 3시간에 인간 VISTA를 발현하는 표적 Raji 세포(Raji-hVISTA 세포)에서 ADCC 활성에 대한 이펙터 PBMC를 갖는 항-VISTA 항체 번호 465.1의 용량-반응 효과. 이펙터 세포(5×10⁵개의 인간 PBMC)를 100, 30, 10, 3.0, 1.0 또는 0.3ng/ml의 항체 번호 465.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 3시간 동안 표적 세포(BATDA로 표지된 1×10⁴개의 Raji-hVISTA 세포)와 공동 배양하였다. 유도된 ADCC 활성은 CLARIOstar Plus에서 DELFIA® EuTDA 세포독성 시약의 단기 시간 분해 형광측정법 검출로 정량화하였다.
도 54. 3시간에 인간 VISTA를 발현하는 표적 Raji 세포(Raji-hVISTA 세포)에서 ADCC 활성에 대한 이펙터 PBMC를 갖는 항-VISTA 항체 번호 457.1의 용량-반응 효과. 이펙터 세포(5×10⁵개의 인간 PBMC)를 100, 30, 10, 3.0, 1.0 또는 0.3ng/ml의 항체 번호 457.1 또는 대조군 Ab의 존재하에 3시간 동안 표적 세포(BATDA로 표지된 1×10⁴개의 Raji-hVISTA 세포)와 공동 배양하였다. 유도된 ADCC 활성은 CLARIOstar Plus에서 DELFIA® EuTDA 세포독성 시약의 단기 시간 분해 형광측정법 검출로 정량화하였다.
도 55a. 3시간에 인간 VISTA를 발현하는 표적 Raji 세포(Raji-hVISTA 세포)에서 ADCC 활성에 대한 이펙터 PBMC를 갖는 항-VISTA 항체 번호 173.1, 173.4 및 420.1의 용량-반응 효과. 이펙터 세포(5×10⁵개의 인간 PBMC)를 100, 30, 10, 3.0, 1.0 또는 0.3ng/ml의 항체 번호 173.1(WT, IgG1), 항체 번호 420.1(YTE), 항체 번호 173.4(WT, IgG4) 또는 대조군 Ab의 존재하에 3시간 동안 표적 세포(BATDA로 표지된 1×10⁴개의 Raji-hVISTA 세포)와 공동 배양하였다. 유도된 ADCC 활성은 CLARIOstar Plus에서 DELFIA® EuTDA 세포독성 시약의 단기 시간 분해 형광측정법 검출로 정량화하였다. 시험한 항체는 범례에 표시되어 있다.
도 55b-55c. 세포 사멸을 CytoTox-Glo 시약의 존재하에 발광으로 측정하였다. 5×10⁵개/웰의 PBMC를 96-웰 플레이트의 X-VIVO-15 배지에서 200u/mL의 IL-2와 함께 O/N 인큐베이션하였다. 항체 및 4×10⁴개/웰의 hVISTA-Raji 세포를 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합하고, 12:1(n=2)의 이펙터:표적(E:T) 비율을 사용하여 4시간 동안 인큐베이션하였다. 6명의 건강한 공여자를 대표하는 공여자 1명의 데이터.
도 55d. CDC 검정. 세포 사멸을 CytoTox-Glo 시약의 존재하에 발광으로 측정하였다. 1×10⁵개/웰의 Raji+ hVISTA 세포를 96-웰 플레이트의 X-VIVO-15 배지에 플레이팅하였다. 항체 및 25% 인간 혈청을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합하고, 6시간 동안 인큐베이션하였다.
도 56a. 인간 VISTA 녹-인(knock-in, KI) 마우스의 MC38 종양 모델에서 항-VISTA 항체 번호 245.2의 생체 내 항종양 효능. VISTA KI 마우스에 1×10⁶개의 MC38 세포를 피하 주사하고 종양 부피가 약 70-100㎣에 도달한 후 무작위 배정하였다. 이어서, 단일요법 투여 빈도 및 양에 따라 마우스를 비히클 대조군, 10mg/kg의 항체 번호 245.2(주 3회) 또는 5mg/kg의 항-PD1 항체(주 2회), 또는 항체 번호 245.2와 항-PD1 항체 조합으로 각각 복강 내(IP) 주사로 처리하였다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원에서 주 2회 측정하였고 부피는 공식 "V = (L × W × W)/2"를 사용하여 ㎣로 표시하였으며, V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수)이며, W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다.
도 56b. VISTA KI 마우스의 MB49 종양 모델에서 Ab 번호 474.1 및 Ab 번호 150.1의 생체 내 항종양 효능. VISTA KI 마우스에 5×10⁵개의 MB49 세포를 피하 주사하고 종양 부피가 약 70-100㎣에 도달한 후 무작위 배정하였다. 마우스를 Ab 번호 474.1, Ab 번호 150.1 또는 인간 IgG1 20mg/kg으로 5일차부터 시작하여 3주 동안 주 2회 복강 내(IP) 주사로 처리하였다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원에서 주 3회 측정하였고 부피는 공식 V = (L × W × W)/2를 사용하여 ㎣로 표시하였으며, V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수)이며, W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 56c. VISTA KI 마우스의 MB49 종양 모델에서 Ab 번호 150.1의 생체 내 항종양 효능. VISTA KI 마우스에 5×10⁵개의 MB49 세포를 피하 주사하고 종양 부피가 약 70-100㎣에 도달한 후 무작위 배정하였다. 마우스를 20mg/kg의 Ab 번호 150.1, 5mg/kg의 항-mPD1 또는 병용요법으로 5일차에 시작하여 3주 동안 주 2회 복강 내(IP) 주사로 처리하였다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원에서 주 3회 측정하였고 부피는 공식 V = (L × W × W)/2를 사용하여 ㎣로 표시하였으며, V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수)이며, W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 56d-56l. 12일차에 3차 투여한 후 24시간에 hIgG(20mg/kg), Ab 번호 150.1(20mg/kg), mPD1(5mg/kg), 및 Ab 번호 150.1과 mPD1의 병용요법으로 처리된 hVISTA KI C57B/6 마우스(n = 3)로부터 종양 샘플을 수확하였다. 종양을 단일 세포 현탁액 내로 해리하고 림프성 패널(lymphoid panel)로 염색한 다음 RBC를 Biolegend RBC Lysis 버퍼로 용해시켰다. 세포를 BD cytofix로 고정하고 유세포분석(Attune Nxt)을 통해 분석하였다. gMDSC, 과립 골수 유래 억제 세포(granular Myeloid Derived Suppressor Cell); M1 TAM, M1 유형 종양 관련 대식세포(Tumor Associated Macrophage); M2 TAM, M2 유형 종양 관련 대식세포.
도 57a 및 57b. 인간 VISTA KI 마우스에서 단일 복강 내(IP) 투여 후 혈청에서 시간 경과에 따른 항-VISTA 항체의 개별 농도. (이중 샘플). 시험한 항체는 범례에 표시되어 있다.
도 57c. 암컷 인간 VISTA KI 마우스에서 단일 IP 투여 후 혈청에서 시간에 대한 항-VISTA Ab의 개별 농도(이중 샘플).
도 57d-57e. 암컷 인간 VISTA KI 마우스에서 단일 또는 반복 IP 투여 후 혈청에서 시간에 대한 항-VISTA Ab의 개별 농도(이중 샘플).
도 57f-57n. 사이노몰구스 원숭이에서 10mg/kg, 30mg/kg 또는 100mg/kg의 주 1회(채워진 기호) 또는 주 4회(채워지지 않은 기호) IV 투여 후 혈청에서 시간에 대한 Ab 번호 150.1의 항체 농도(ug/mL, 회색) 및 수용체 점유율(%, 검은색). 그룹 평균, 각 그룹에 할당된 수컷(M) 및 암컷(F) 동물에 대한 데이터가 표시된다. 10mg/kg: 범례: A. 그룹 평균, D. 동물 2001(M), G. 동물 2601(F). 30mg/kg: B. 그룹 평균, E. 동물 3001(M), H. 동물 3501(G). 100mg/kg: C. 그룹 평균, F. 동물 4001(M), I. 동물 4501(F). 점선 = 100% 수용체 점유율.
도 58a-58x: 항-VISTA 항체에 대한 비인간 영장류(NHP) 생체 내 노출 동안 골수 수지상 세포(myeloid dendritic cell, mDC) 및 CD14+ 단핵구 활성화 마커의 변화. 활성 마커의 변화 % 그래프는 생체 외 유세포분석으로 확인된 투여 전 대비 평균 형광 강도(MFI)를 의미한다. 모든 시점(0시간(투여 전), 72시간, 168시간(2차 투여 전), 240시간 및 336시간)의 샘플을 해동하고, 염색하고, 같은 날 분석하여 골수 집단 크기 및 활성화 마커를 알아냈다. CD45+CD66-CD3-CD8-CD20-, Side Scatter 중간 골수 집단은 CD14+ 단핵구 또는 CD14-HLA-DR+CD1c+ 또는 CD11c+CD123- 골수 수지상 세포(mDC)에 대해 게이팅되었다. CD14+ 단핵구 및 mDC의 CD80, CD86 및 HLA-DR의 MFI는 기술적 중복으로 획득되었고, 각각의 FMO(Fluorescence Minus One) 샘플에서 MFI를 차감하였다. (FMO(Fluorescence Minus One) 대조군은 배경 형광과 양성 집단 사이의 컷오프 지점을 알아내기 위해 실험에 사용된 형광색소 중 하나를 제외한 모든 형광색소로 세포를 염색한 샘플이며 각 형광색소(fluorochrome)에 대해 하나의 FMO 대조군을 사용함.) 투여 전 수준 대비 MFI의 변화 백분율은 변화 % = 100*(x일차 MFI-0일 MFI)/0일 MFI로 계산하였다. 생체 내 투여된 동물 샘플에 대한 결과는 항체 번호 173.1(WT); 항체 번호 173.4(WT); 항체 번호 289.1(LS); 및 항체 번호 420.1(YTE)에 대해 제시된다. 그래프는 활성화 마커 CD80의 발현 수준의 변화(도 58a, 58d, 58g, 58j, 58m, 58p, 58s 및 58v); CD86의 발현 수준의 변화(도 58b, 58e, 58h, 58k, 58n, 58q, 58t 및 58w); HLA-DR의 발현 수준의 변화(도 58c, 58f, 58i, 58l, 58o, 58r, 58u 및 58x)를 보여준다. 화살표는 0시간 및 168시간에서의 10mg/kg iv 투여를 나타낸다. 시험한 항체는 x축에 표시되어 있다.
도 59a-59d. 인간 VISTA KI 마우스의 MB49 종양 모델에서 항-VISTA 항체 번호 245.2의 생체 내 항종양 효능. VISTA KI 마우스에 5×10⁵개의 MB49 세포를 피하 주사하고 종양 부피가 약 70㎣에 도달한 후 무작위 배정하였다. 마우스를 30mg/kg의 마우스 IgG2a 대조군 항체, 30mg/kg의 항체 번호 245.2, 또는 EU 넘버링("LALA")에 따른 L234A 및 L235A 치환이 있는 30mg/kg의 항체 번호 245.2의 주 2회 총 6회 복강 내(IP) 투여로 처리하였다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원에서 주 2회 측정하였고, 부피는 공식 "V = (L × W × W)/2"를 사용하여 ㎣로 표시하였으며, V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수)이며, W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다. 도 59a는 IgG2a 대조군(정사각형), 245.2(채워지지 않은 원) 및 245.2 LALA(채워진 원)에 대한 평균 종양 부피 ± SEM을 보여준다. 도 59b-59d는 각 동물 및 각 그룹에 대한 시간 경과에 따른 개별 종양 측정치를 보여준다.
도 59e-59h. 종양 침윤 림프구 - 림프성 패널. 24일차 최종 투여(투여 #6) 후 3일차에 mIgG 2a(30mg/kg), Ab 번호 245.2-LALA(30mg/kg) 및 Ab 번호 245.2(30mg/kg)로 처리된 hVISTA KI C57B/6 마우스(n = 3)로부터 종양을 수확하였다. Miltenyi 종양 분리 키트(카탈로그 번호 130-096-730) 및 octoMACS를 사용하여 종양을 분리하였다. 이어서, 세포를 림프성 패널로 염색한 다음 RBC를 Biolegend RBS Lysis Buffer(카탈로그 번호 420301)로 용해시키고 Attune Nxt 기기에서 유세포분석을 통해 분석하였다.
도 60a-60d. 인간 VISTA KI 마우스의 E.G7-OVA 종양 모델에서 항-VISTA 항체 번호 245.2의 생체 내 항종양 효능. VISTA KI 마우스에 1×10⁶개의 E.G7-OVA 세포를 피하 주사하고 종양 부피가 약 70㎣에 도달한 후 무작위 배정하였다. 마우스를 30 mg/kg의 대조군 항체(마우스 IgG2a), 30mg/kg의 항체 번호 245.2 또는 30mg/kg의 항체 번호 245.2 LALA의 주 2회 총 6회 복강 내(IP) 주사로 처리하였다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원에서 주 2회 측정하였고, 부피는 공식 "V = (L × W × W)/2"를 사용하여 ㎣로 표시하였으며, V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수)이며, W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다. 도 60a는 IgG2a 대조군(정사각형), 245.2(채워지지 않은 원) 및 245.2 LALA(채워진 원)에 대한 평균 종양 부피 ± SEM을 보여준다. 도 60b-60d는 각 동물 및 각 그룹에 대한 시간 경과에 따른 개별 종양 측정치를 보여준다.

VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 이러한 항체 및 단편은 본원에서 각각 "항-VISTA 항체" 및 "항-VISTA 항원-결합 단편"으로도 지칭된다. 본원에서 사용되는 용어 "면역특이적으로 결합하다", "면역특이적으로 인식하다", "특이적으로 결합하다" 및 "특이적으로 인식하다"는 항체 및 이의 항원-결합 단편의 맥락에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 당업자가 이해하는 바와 같이 항체 및 항원-결합 단편이 항체의 항원 결합 부위를 통해 항원에 결합하는 것을 의미하며, 항체 또는 항원-결합 단편과 다른 항원의 교차 반응성을 배제하지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 VISTA 및 사이노몰구스 원숭이 VISTA 모두에 면역특이적으로 결합할 수 있지만, 마우스 VISTA에는 결합할 수 없다. 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 VISTA에 대한 면역특이적 결합이 일어나는지 여부를 확인할 수 있다.

본원에 기술된 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있으며, 바람직하게는 단클론 항체이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 사슬 항체, 단일 사슬 Fv(scFv) 또는 디설파이드 연결된 Fv이다. 본 개시내용을 위해, scFv는 VH 및 VL 도메인(링커에 의해 연결됨)을 포함하기 때문에 scFv는 항원-결합 단편으로 간주될 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2가이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다중특이성 또는 이중특이성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 이중특이성 단클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는 1가이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2가이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일특이성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 재조합으로 생성된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정제된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 합성 항체이다. 특정 실시양태에서 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 뮤린(murine) 항체이다.

본 발명의 항체의 특정 실시양태에서, 항체는 면역글로불린이다. 본원에 기술된 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgW 또는 IgY), 임의의 부류(예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 또는 IgA₂) 또는 임의의 하위부류(예를 들어, IgG_2a 또는 IgG_2b)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG 항체, 또는 이의 부류 또는 하위부류이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 단클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG1 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG2 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG3 항체이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG4 항체이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄와 경쇄의 결합에 의해, 또는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 결합에 의해 형성된다.

항원-결합 단편은 항원에 결합하고 프레임워크 영역으로 둘러싸인 항원에 대한 특이성을 항체 분자에 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체 분자의 일부(예를 들어, 상보성 결정 영역(CDR))를 포함한다. CDR은, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트 또는 햄스터), 닭, 소, 낙타 및 인간과 같은 임의의 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 예로서, 항원-결합 단편은 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, 및 본원에 기술된 임의의 항체의 다른 항원-결합 단편을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호교환적으로 사용되며 당업계에서 일반적이다. 가변 영역은 전형적으로 항체의 일부, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부를 가리키며, 이는 항체 사이에서 광범위하게 서열이 상이하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 서열의 가변성은 CDR에 집중되는 반면, 가변 도메인에서 더 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역이라고 한다. 임의의 특정 메카니즘 또는 이론에 얽매이지 않고, 경쇄 및 중쇄의 CDR이 항원과 항체의 상호작용 및 특이성을 주로 담당하는 것으로 여겨진다.

CDR은 Kabat, Chothia, AbM, contact, IMGT 및 Paratome 넘버링 시스템을 포함하여 당업계의 다양한 방식으로 정의된다. 당업계에 공지된 임의의 CDR 넘버링 시스템을 사용하여 본원에 개시된 항-VISTA 항체의 CDR을 정의할 수 있다. Kabat 넘버링 시스템은 서열 가변성을 기반으로 하며 CDR 영역을 예측하는 데 가장 일반적으로 사용되는 정의이다(Kabat, Elvin A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). Chothia 넘버링 시스템은 구조적 루프 영역(structural loop region)의 위치를 기반으로 한다(Chothia 등, (1987) J Mol Biol 196: 901-917). Kabat 넘버링 시스템과 Chothia 넘버링 시스템 사이의 절충안인 AbM 넘버링 시스템은 Oxford Molecular Group(bioinf.org.uk/abs)에 의해 생성된 항체 구조 모델링을 위한 통합 프로그램 모음이다(Martin ACR 등, (1989) PNAS 86: 9268-9272). contact 넘버링 시스템은 이용 가능한 복합 결정 구조(bioinf.org.uk/abs)의 분석을 기반으로 한다(MacCallum RM 등, (1996) J Mol Biol 5: 732-745 참조). IMGT 넘버링 시스템은 IMGT("IMGT®, 국제 ImMunoGeneTics information system® 웹사이트 imgt.org, 설립자 및 이사: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France)로부터 유래된다. Paratome 넘버링 시스템은 알려진 모든 항체-항원 복합체의 비중복 세트의 구조적 정렬에서 유래된 공통서열 영역 세트를 기반으로 항체의 항원 결합 영역을 예측한다. 이 알고리즘은 대부분의 항원 결합 잔기가 대략 6개의 CDR에 상응하는, 항체 서열에서 6개의 서열 스트레치를 형성하는 항체 간의 구조적 공통서열 영역 내에 있다는 전제를 기반으로 한다(Kunit 등, Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, Web Server issue W521-W524 참조).

본 개시내용은 본원에 개시된 서열을 포함하는 항체 및 항원-결합 단편 및 기타 주제(예를 들어, scFv, CDR, 가변 영역 등)뿐만 아니라 본원에 개시된 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어지는 항체 및 항원-결합 단편 및 기타 주제를 제공한다.

또 다른 측면에서, 다중특이성 항체 및 이종접합체 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 2개의 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이성 항체가 본원에서 제공되며, 결합 영역 중 하나는 VISTA에 결합하고 본원에 기술된 항체의 가변 중쇄 영역, 가변 경쇄 영역 또는 둘 다를 포함하고, 다른 결합 영역은 상이한 관심 항원에 결합한다. 특정 측면에서, 2개의 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이성 항체가 본원에서 제공되며, 결합 영역 중 하나는 VISTA에 특이적으로 결합하고 다른 결합 영역은 또 다른 관심 항원에 결합하고, VISTA에 특이적으로 결합하는 결합 영역은 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 특정 측면에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 2개의 항원 결합 부위(즉, 2가)를 함유하는 제1 가변 영역, 및 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 부위(즉, 2가)를 함유하는 제2 가변 영역을 포함하는 이중특이성 항체가 본원에서 제공되며, 제1 및 제2 가변 영역은 Fc 단편에 의해 연결되고; 이 측면의 특정 실시양태에서, 가변 영역은 각각의 Fab 영역이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체이다. 특정 실시양태에서, 2개의 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이성 항체가 본원에서 제공되며, 결합 영역 중 하나는 VISTA에 특이적으로 결합하고 다른 결합 영역은 다른 관심 항원에 결합하고, VISTA에 특이적으로 결합하는 결합 영역은 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2개의 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이성 항체가 본원에서 제공되며, 결합 영역 중 하나는 VISTA에 특이적으로 결합하고 다른 결합 영역은 다른 관심 항원에 결합하고, VISTA에 특이적으로 결합하는 결합 영역은 표 7에 제시된 항체의 VH 및 선택적으로 VL을 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 2개의 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이성 항체가 본원에서 제공되며, 결합 영역 중 하나는 VISTA에 특이적으로 결합하고 다른 결합 영역은 다른 관심 항원에 결합하고, VISTA에 특이적으로 결합하는 결합 영역은 표 7에 제시된 항체의 VH 및 표 8에 제시된 동일한 항체의 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 결합 영역은 scFv이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 이중특이성 항체의 다른 결합 영역이 결합하는 관심 항원은 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포)에 존재하는 항원이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 이중특이성 T 세포 인게이저(bispecific T cell engager, BiTE)이다. 여러 가지 다양한 포맷의 다중특이성 항체가 기술되어 있는데, 예를 들어, Brinkman and Kontermann, MABS 2017, 9(2): 182-212를 참조한다.

또한, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편의 VH 및 VL을 포함한다. 또한, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 scFv를 포함하는 융합 단백질이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, scFv는 링커 서열에 의해 분리된 VH 및 VL을 포함하고, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 표에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR3이다. 특정 실시양태에서, scFv는 링커 서열에 의해 분리된 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 표에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VH CDR3이고, (ii) VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1은 상기 항체에 대한 VL CDR1로서 표 4-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 표에 제시된 서열번호의 VL CDR1이고, VL CDR2는 상기 항체에 대한 VL CDR2로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VL CDR2이고, VL CDR3은 상기 항체에 대한 VL CDR3으로서 상기 표에 제시된 서열번호의 VL CDR3이고, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 모두 동일한 CDR 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, scFv는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 상기 항체의 VH로서 표 7에 제시된 서열번호를 포함한다. 특정 실시양태에서, scFv는 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 상기 항체의 VH로서 표 7에 제시된 서열번호를 포함하고, (ii) VL은 상기 항체의 VL로서 표 8에 제시된 서열번호를 포함한다.

본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 scFv, 및 CAR을 발현하는 세포를 포함하는, CAR을 암호화하는 핵산을 함유하는 세포를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본원에서 추가로 제공된다. 특정 실시양태에서, 세포는 세포가 CAR을 발현하도록 CAR을 암호화하는 재조합 핵산을 함유한다. 특정 실시양태에서, 세포는 생체 외이다.

"제1 세대", "제2 세대" 및 "제3 세대" CAR의 구조는 당업계에 기술되어 있다(예를 들어, Jensen 등, Immunol. Rev. 257:127-133 (2014); Sharpe 등, Dis. Model Mech. 8(4):337-350 (2015); Brentjens 등, Clin. Cancer Res. 13:5426-5435 (2007); Gade 등, Cancer Res. 65:9080-9088 (2005); Maher 등, Nat. Biotechnol. 20:70-75 (2002); Kershaw 등, J. Immunol. 173:2143-2150 (2004); Sadelain 등, Curr. Opin. Immunol. 21(2):215-223 (2009); Hollyman 등, J. Immunother. 32:169-180 (2009) 참조).

특정 실시양태에서, CAR은 T 세포 수용체 복합 사슬의 세포질/세포 내 도메인에 융합된 막관통 도메인에 융합된, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 scFv)을 포함하는 "제1 세대" CAR이다. 특정 실시양태에서, 세포질 도메인은 CD3ζ 사슬의 세포 내 도메인이다.

특정 실시양태에서, CAR은 면역 세포를 활성화할 수 있는 세포 내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ 사슬의 세포 내 도메인)에 융합된, 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 효능과 지속성을 향상시키기 위한 공동자극 도메인에 융합된 막관통 도메인에 융합된, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 scFv)을 포함하는 "제2 세대" CAR이다(Sadelain 등, Cancer Discov. 3:388-398 (2013) 참조). "제2 세대" CAR의 공동자극 도메인은 임의의 다양한 공동자극 분자로부터의 세포 내 도메인, 예를 들어, CD28, 4-IBB, ICOS 또는 OX40의 공동자극 도메인일 수 있다. 따라서, "제2 세대" CAR은 공동자극(예를 들어, CD28 또는 4-IBB 세포 내 도메인에 의해) 및 활성화(예를 들어, CD3ζ 신호전달 도메인에 의해) 모두를 제공한다.

"제3 세대" CAR은 제2 세대 CAR의 구조를 포함하지만 다중(예를 들어, 2개) 공동자극 도메인을 갖는다. 따라서, 제3 세대 CAR은, 예를 들어, CD28 및 4-1BB 세포 내 도메인 둘 다를 포함함으로써 다중 공동자극을 제공하고, 예를 들어, CD3ζ 활성화 도메인을 포함함으로써 활성화를 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 상술된 바와 같이 세포 외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포 내 도메인을 포함하고, 세포 외 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 세포 내 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인이다.

특정 실시양태에서, CAR을 포함하는 세포는 T 세포이다. 다른 특정 실시양태에서, CAR을 포함하는 세포는 자연 살해(NK) 세포이다. 다른 특정 실시양태에서, CAR을 포함하는 세포는 대식세포이다. CAR을 발현할 수 있는 세포의 예가 기술되어 있는데, 예를 들어, Basar 등., Hematology 2020 ASH Education Program pp. 570-578; Villanueva 2020, Nat. Rev. Drug Discov. Vol. 20:300; Mukhopadhyay 2020; Nat. Methods Vol. 17:561; Anderson 등, 2017, Cancer Res (2020년 11월 17일 온라인 개시); Cortez-Selva 등, 2021, Trends in Pharmacological Sciences 42 (1):45-59; Klichinsky 등, 2020, Nat. Biotech. 38:947-959; Vacca 등, 2020, Front. Immunol. 10:3013 doi: 10.3389/fimmu.2019.03013; 및 Xie 등, 2020, EBioMedicine 59:102975를 참조한다.

또한, 치료제에 결합된(예를 들어, 공유 결합된) 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편 또는 scFv를 포함하는 항체-약물 접합체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료제는 세포독성제이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체가 본원에서 제공된다.

또 다른 특정 실시양태에서, 생체 외 세포 샘플(예를 들어, 생검 종양 샘플)을 접촉시키거나 환자에게 항체를 투여하고 표지 또는 조영제를 통해 결합을 검출함으로써 생체 내 또는 생체 외(예를 들어, 환자로부터의 생검 종양 샘플에서) VISTA 수준의 검출 및/또는 측정 및/또는 국소화에 사용하기 위한, 표지 또는 조영제에 결합된 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편 또는 scFv를 포함하는 항체-약물 접합체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 환자의 암이 VISTA-양성인지 또는 원하는 수준으로 VISTA를 발현하는지를 알아냄으로써 본 발명의 (치료제에 결합된) 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편 및 항체-약물 접합체를 이용한 암 치료가 환자에게 필요한지 여부를 결정하는 데 사용된다.

1.1 항체

본 개시내용에서 특정 항체를 확인하기 위해 사용되는 각각의 항체 번호(각각의 "항체[또는 Ab] 번호")에 대해, 항체 번호에서 마침표 뒤의 숫자는 항체의 IgG 부류를 나타낸다. 따라서, 예를 들어, Ab 번호 173.1은 IgG1 항체인 반면 Ab 번호 173.4는 IgG4 항체이다.

서열 및 변이체

아래 표 1-표 6에는 상이한 넘버링 시스템(Kabat, IMGT 및 Paratome)을 사용하여 정의된, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH CDR 및 VL CDR이 제공된다. 아래 표 1-표 3은 표 4-표 6의 VL CDR과 조합될 수 있는, 상이한 시스템을 사용하여 정의된 VH CDR을 제공한다. 특정 실시양태에서, 표 1의 하나의 항체(예를 들어, 항체 번호 269.1)에 대한 VH CDR은 표 4의 동일한 항체(예를 들어, 269.1)에 대한 VL CDR과 조합된다. 특정 실시양태에서, 표 2의 하나의 항체(예를 들어, 항체 번호 269.1)에 대한 VH CDR은 표 5의 동일한 항체(예를 들어, 항체 번호 269.1)에 대한 VL CDR과 조합된다. 특정 실시양태에서, 표 3의 하나의 항체(예를 들어, 항체 번호 269.1)에 대한 VH CDR은 표 6의 동일한 항체(예를 들어, 항체 번호 269.1)에 대한 VL CDR과 조합된다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 1에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR3이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 1에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 1에 제시된 서열번호의 VH CDR3이고, (ii) VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1은 상기 항체에 대한 VL CDR1로서 표 4에 제시된 서열번호의 VL CDR1이고, VL CDR2는 상기 항체에 대한 VL CDR2로서 표 4에 제시된 서열번호의 VL CDR2이고, VL CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 4에 제시된 서열번호의 VL CDR3이다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 2에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR3이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 2에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 2에 제시된 서열번호의 VH CDR3이고, (ii) VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1은 상기 항체에 대한 VL CDR1로서 표 5에 제시된 서열번호의 VL CDR1이고, VL CDR2는 상기 항체에 대한 VL CDR2로서 표 5에 제시된 서열번호의 VL CDR2이고, VL CDR3은 상기 항체에 대한 VL CDR3으로서 표 5에 제시된 서열번호의 VL CDR3이다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1은 표 3에 열거된 항체 번호에 대한 VH CDR1로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR1이고, VH CDR2는 상기 항체에 대한 VH CDR2로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR2이고, VH CDR3은 상기 항체에 대한 VH CDR3으로서 표 3에 제시된 서열번호의 VH CDR3이고, (ii) VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1은 상기 항체에 대한 VL CDR1로서 표 6에 제시된 서열번호의 VL CDR1이고, VL CDR2는 상기 항체에 대한 VL CDR2로서 표 6에 제시된 서열번호의 VL CDR2이고, VL CDR3은 상기 항체에 대한 VL CDR3으로서 표 6에 제시된 서열번호의 VL CDR3이다.

또한, VH 및 VL을 포함하는, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, VH는 항체의 VH로서 표 7에 제시된 서열번호 중 어느 하나의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 AbM 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 Contact 넘버링 시스템에 의해 정의된다.

특정 실시양태에서, VH 및 VL을 포함하는, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편, VH는 항체의 VH로서 표 7에 제시된 서열번호 중 어느 하나의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VL은 상기 항체에 대한 VL로서 표 8에 제시된 서열번호의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 AbM 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, VH CDR은 Contact 넘버링 시스템에 의해 정의된다.

VISTA에 특이적으로 결합하는 본원에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편의 CDR은, 예를 들어, 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 변형될 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들어, 특정 pH 값에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 친화도를 변화시킬 수 있어서 항체의 생물학적 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 내재화 후 엔도좀에서 VISTA에 대한 결합 친화도가 감소된 항체를 재설계하면 항체 고갈을 줄이고 반감기를 증가시킬 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도(즉, 산성 pH에서는 감소된 결합 친화도)로 VISTA에 결합한다. 산성 pH에서 결합 친화도가 감소되는 항-VISTA 항체는 산성 pH에서 감소된 결합 친화도를 나타내지 않는 항체와 비교하여 다양한 개선/강화된 생물학적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 산성 pH에서 결합 친화도가 감소되는 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 산성 pH에서 감소된 결합 친화도를 나타내지 않는 항-VISTA 항체와 비교하여 순환계에서 반감기가 더 길어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 산성 pH에서 결합 친화도가 감소되는 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 pH 의존성 결합이 결여된 항-VISTA 항체보다 더 천천히 순환계로부터 제거될 수 있다. 더 느린 항체 클리어런스(즉, 순환계에서 더 긴 반감기)는 연장된 생물학적 활성과 상관관계가 있을 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 대상체에게 덜 빈번하게 및/또는 더 낮은 용량으로 투여될 수 있으며, 그럼에도 산성 pH에서 결합 친화도가 감소되지 않는 항체와 동등한(또는 더 나은) 효능을 나타낼 것이다.

이론 또는 메카니즘에 얽매이지 않고, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 결합 친화도가 더 낮은 항-VISTA 항체는 엔도좀의 산성 환경에서 항원으로부터 해리되고 치료용 항원 결합의 추가 라운드를 겪는 혈장으로 재순환된다. 항원 결합 영역에서 히스티딘 스위치의 도입과 함께 항체의 Fc 영역에서 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합에 대한 변형(예를 들어, 하기 기술된 변형과 같은 변형)은 세포 표면에서 VISTA에 높은 친화도로 결합하고 산성 엔도좀 환경으로의 수송(trafficking) 시 VISTA로부터 해리되고 포획되어 FcRn 수용체에 의해 세포 외 공간으로 재순환되는 항체를 생성할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 CDR 또는 중쇄 CDR에서 발견되는 임의의 Y, D, E, N 또는 Q 아미노산에 하나 이상의 히스티딘 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 CDR 또는 중쇄 CDR에서 발생하는 Y, D, E, N 또는 Q 아미노산에 하나의 히스티딘 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 2 또는 표 3에 제시된 항체 번호 474.1의 VH CDR, 및 표 4, 표 5 또는 표 6에 제시된 항체 번호 474.1의 VL CDR을 포함하며, 단 각각 Kabat 넘버링 시스템에 넘버링된 Y31H(예를 들어, 항체 번호 373.1에 존재), Y32H(예를 들어, 항체 번호 467.1에 존재), D50H(예를 들어, 항체 번호 908.1에 존재), N53H(예를 들어, 항체 번호 386.1에 존재), Q89H(예를 들어, 항체 번호 268.1에 존재), Q90H(예를 들어, 항체 번호 342.1에 존재) 및 N93H(예를 들어, 항체 번호 259.1에 존재)로부터 선택될 수 있는 VL CDR에서의 하나 이상의 히스티딘 치환은 제외한다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 2 또는 표 3에 제시된 항체 번호 474.1의 VH CDR, 및 표 4, 표 5 또는 표 6에 제시된 항체 번호 474.1의 VL CDR을 포함하며, 단 각각 Kabat 넘버링 시스템에 넘버링된 Y32H(예를 들어, 항체 번호 338.1에 존재), Y33H(예를 들어, 항체 번호 419.1에 존재), Y50H(예를 들어, 항체 번호 277.1에 존재), Y52H(예를 들어, 항체 번호 946.1에 존재), Y53H(예를 들어, 항체 번호 322.1에 존재), N58H(예를 들어, 항체 번호 346.1에 존재), Y59H(예를 들어, 항체 번호 304.1에 존재), N60H(예를 들어, 항체 번호 814.1에 존재), D95H(예를 들어, 항체 번호 210.1에 존재) 및 D101H(예를 들어, 항체 번호 460.1에 존재)로부터 선택될 수 있는 VH CDR에서의 하나 이상의 히스티딘 치환은 제외한다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 2 또는 표 3에 제시된 항체 번호 173.1의 VH CDR, 및 표 4, 표 5 또는 표 6에 제시된 항체 번호 173.1의 VL CDR을 포함하며, 단, 각각 Kabat 넘버링 시스템에 넘버링된 D47H(예를 들어, 항체 번호 374.1에 존재), D69H(예를 들어, 항체 번호 394.1에 존재), D111H(예를 들어, 항체 번호 213.1에 존재) 및 E74H(예를 들어, 항체 번호 219.1에 존재)로부터 선택될 수 있는 VL CDR에서의 하나 이상의 히스티딘 치환은 제외한다.

특정 측면에서, 본원에 기술된 항체는 이의 VH 도메인 단독, 또는 이의 VL 도메인 단독, 또는 VH 또는 VL의 3개의 CDR 세트를 특정함으로써 기술될 수 있다. 예를 들어, 특정 VH 도메인(또는 VL 도메인)을 사용하여 특정 항원에 결합하는 항체를 생성하고 상보성 가변 도메인에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 기술하며 전체가 본원에 참고로 포함된 Clackson T 등, (1991) Nature 352:624-628 참조. 또한, 특정 VH 도메인을 사용하여 특정 항원에 결합하는 항체를 생성하고 상보성 VL 도메인에 대한 라이브러리(예를 들어, 인간 VL 라이브러리)를 스크리닝하고; 선택된 VL 도메인은 결국 추가의 상보성(예를 들어, 인간) VH 도메인의 선택을 안내하기 위해 사용될 수 있는 방법을 기술하며 전체가 본원에 참고로 포함된 Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45:572-577 참조.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH를 포함하고, VH는 상기 항체의 VH로서 표 7에 제시된 서열번호를 포함한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VL을 포함하고, VL은 상기 항체의 VL로서 표 8에 제시된 서열번호를 포함한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH를 포함하고, VH는 상기 항체의 VH로서 표 7에 제시된 서열번호를 포함하고, VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, (i) VH는 상기 항체의 VH로서 표 7에 제시된 서열번호를 포함하고, (ii) VL은 상기 항체의 VL로서 표 8에 제시된 서열번호를 포함한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 표 7에 제시된 VH의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 표 7에 제시된 VH의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 95%이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, VL은 표 8에 제시된 VL의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 8에 제시된 VL의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 95%인 VL을 포함한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, (i) VL은 표 7에 제시된 항체의 VH의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이고, (ii) VL은 표 8에 제시된 상기 항체의 VL의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 표 7에 제시된 항체의 VH의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 95%이고 (ii) VL은 표 8에 제시된 상기 항체의 VL과의 서열 동일성이 적어도 95%이다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 경쇄는 표 9에 열거된 항체 번호에 대한 경쇄로서 표 9에 제시된 서열번호의 경쇄이고, 중쇄는 상기 항체의 중쇄로서 표 9에 제시된 서열번호의 중쇄이다(예를 들어, 항체 번호 269.1, 항체 번호 321.1, 항체 번호 245.1, 항체 번호 465.1, 항체 번호 457.1, 항체 번호 173.1, 항체 번호 833.1, 항체 번호 245.4, 항체 번호 465.4, 항체 번호 173.4, 항체 번호 245.2, 항체 번호 289.1 또는 항체 번호 420.1).

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 표 9에 열거된 항체 번호에 대한 중쇄로서 표 9에 제시된 서열번호와의 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 경쇄는 표 9에 열거된 항체 번호에 대한 경쇄로서 표 9에 제시된 서열번호와의 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이고, 중쇄는 상기 항체의 중쇄로서 표 9에 제시된 서열번호와의 서열 동일성이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 표 9에 열거된 항체 번호에 대한 중쇄로서 표 9에 제시된 서열번호와의 서열 동일성이 적어도 95%이다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 경쇄는 표 9에 열거된 항체 번호에 대한 경쇄로서 표 9에 제시된 서열번호와의 서열 동일성이 적어도 95%이고, 중쇄는 상기 항체의 중쇄로서 표 9에 제시된 서열번호와의 서열 동일성이 적어도 95%이다.

2개의 서열(예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 간의 동일성 %는 당업계에 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 알아낼 수 있다. 2개의 서열 사이의 동일성 %는 갭(gap)을 허용하거나 허용하지 않고 알아낼 수 있다. 동일성 %를 계산할 때 전형적으로 정확히 일치하는 항목만 계산한다. 2개의 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 특정한 비제한적인 예는 Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877로 개정된, Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul SF 등, (1990) J Mol Biol 215: 403의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램으로 수행할 수 있으며, 단백질 검색은 XBLAST 프로그램으로 수행할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST 및/또는 PSI BLAST를 Altschul SF 등, (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402에 기술된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI Blast 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 파라미터가 사용될 수 있다(예를 들어, National Center for Biotechnology Information(NCBI), www, ncbi.nlm.nih.gov 참조).

특정 측면에서, 항체 중쇄 및/또는 경쇄, 예를 들어, 중쇄 단독, 경쇄 단독, 또는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함하는, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 경쇄와 관련하여, 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄는 카파 경쇄이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄는 람다(lambda) 경쇄이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄이다.

본원에서 사용되는 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호교환 가능하고 당업계에서의 통상의 의미이다. 불변 영역은 항체 부분이고, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 예를 들어, 중쇄의 경우 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄를 포함하고, 경쇄는 VL 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 포함하고, VL은 표 8에 제시된 서열을 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적인 예는 당업계에 기술되어 있는데, 예를 들어, Kabat EA 등, (1991)을 참조한다.

중쇄와 관련하여, 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄는 인간 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄일 수 있다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, C_H1, C_H2 또는 C_H3 또는 이들의 조합)을 포함하는 중쇄, 및 표 7에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역(VH)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 인간 감마 중쇄이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에 기술된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 불변 영역은 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgW 또는 IgY 면역글로불린 분자의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG 불변 영역, 예를 들어, 표 10에 제시된 IgG1, IgG2 또는 IgG4 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA IgW 또는 IgY 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 임의의 부류(예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂) 또는 임의의 하위부류(예를 들어, IgG_2a 및 IgG_2b)의 불변 영역을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하고, 중쇄는 (a) 표 7에 제시된 항체의 VH 및 (b) 인간 IgG의 불변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 불변 중쇄 도메인을 포함한다.

또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, (i) 중쇄는 (a) 표 7에 제시된 항체의 VH 및 (b) 인간 IgG의 불변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 불변 중쇄 도메인을 포함하고; (ii) 경쇄는 표 8에 제시된 동일한 항체의 VL 및 (b) 인간 카파 경쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 불변 경쇄 도메인을 포함한다.

Fc 영역 및 변이체 Fc 영역

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는 인간 IgG1의 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 추가의 특정 실시양태에서, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG2 또는 인간 IgG4의 Fc 영역이다. 추가의 특정 실시양태에서, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 돌연변이)를 포함하는 변이체 인간 Fc 영역이다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 삽입, 치환 및/또는 결실이다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 야생형 불변 영역에 비해 불변 영역에 본 개시내용에 명시된 특정 아미노산 돌연변이 또는 아미노산 돌연변이의 특정 조합 중 하나만 가지며 야생형 불변 영역에 비해 다른 아미노산 돌연변이를 함유하지 않는다. 또 다른 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 야생형 불변 영역에 비해 불변 영역에 본 개시내용에 명시된 특정 아미노산 돌연변이 또는 아미노산 돌연변이의 특정 조합을 포함하고, 야생형 불변 영역에 비해 총 7개 이하(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 아미노산 돌연변이를 갖는다.

따라서, Fc 영역이 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 특정 실시양태에서, 돌연변이는 1개의 아미노산의 결실, 1개의 아미노산의 치환 또는 1개의 아미노산의 삽입으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 특정 실시양태에서 본원에 기술된 임의의 돌연변이일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입/부류의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입/부류의 인간 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편의 불변 영역은 천연 불변 영역에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편의 특정 실시양태에서, 항체는 Fc 영역 또는 Fc 영역의 변이체를 포함하고; 선택적으로 Fc 영역은 인간 Fc 영역이거나 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 돌연변이를 갖는 인간 Fc 영역의 변이체이고/이거나, 선택적으로 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 추가로 선택적으로 항체는 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 불변 영역을 포함하거나 천연 불변 영역에 비해 불변 영역에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 불변 영역의 변이체를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fc 영역에 1개, 2개 또는 그 이상의 돌연변이(예를 들어, 아미노산 치환)를 도입하여 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시킨다.

특정 실시양태에서, 1개, 2개 또는 그 이상의 돌연변이(예를 들어, 아미노산 치환)가 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fc 영역 및/또는 힌지 영역에 도입된다. VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fc 영역에서의 돌연변이는 Fc 수용체 및/또는 보체 수용체에 대한 항체의 친화도를 변경시킬 수 있다. 이러한 돌연변이를 Fc 수용체 또는 이의 단편에 도입하는 기술은 당업자에게 공지되어 있다. Fc 수용체에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 친화도를 변경시킬 수 있는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fc 수용체에서의 돌연변이의 예는, 예를 들어, Smith P 등, (2012) Proc. Natl. Acad. Sci 109: 6181-6186, 미국 특허 제6,737,056호 및 국제 공개 번호 WO 02/060919; WO 98/23289; 및 WO 97/34631에 기술되어 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 표 10에 제시된 불변 영역을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 항체의 불변 영역은 중쇄의 서열 변이에 기여한다. 중쇄의 가변 영역은 중쇄 불변 영역과 재조합되어 전장 중쇄를 생성한다(Dreyer, W.J., 및 J.C. Bennett Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54 (1965) 864-869). 항체는 알파, 뮤, 감마, 엡실론 또는 델타 불변 영역 유전자 절편이 가변 영역과 재조합되는지 여부에 따라 아이소타입이 달라질 수 있다(Kataoka, T., 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 919-923). 인간 감마 유전자 절편 중에는 감마 1, 2, 3 및 4로 지정된 4개의 상이한 하위부류가 있으며 이들은 서로 약 90% 동일하다. 이들 상이한 아이소타입 또는 하위부류 중 임의의 것이 본원에 기술된 항체의 가변 영역에 연결되어 전장 중쇄를 생성할 수 있고, 이어서 상보성 경쇄와 쌍을 이루어 본 발명의 항체를 생성할 수 있다.

본원에서 제공되는 항체의 항체 조작을 위해, 서열에 대한 변화 및/또는 항체의 Fc 및 힌지 영역의 번역 후 변형은 주어진 항체 또는 항체 유사 단백질의 이펙터 기능 및 순환을 조작할 수 있게 한다(Presta, L.G. Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 460-470). 서열 변이에 더하여, Fc 영역은 잔기 297(EU 넘버링 시스템)에 N-연결된 글리코실화 부위도 함유하는데, 이는 Fc 구조 및 기능에 중요하고(Dwek, R.R. 등 J. Anat. 187 (1995) 279-292), 예를 들어, 알라닌 또는 글리신 또는 글루탐산으로 돌연변이되어 항체의 특성에 영향을 미치기 위해 글리코실화 부위를 파괴할 수 있다.

N297에 존재하는 글리칸은 전형적으로 2개의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 3개의 만노스, 및 만노스에 연결된 2개의 추가 GlcNAc로 이루어져 바이안테너리 복합 글리칸(biantennary complex glycan)을 형성한다(Liu, L. J. Pharm Sci. 104 (2015) 1866-84). 2개의 GlcNAc는 만노스의 α-3 또는 α-6에 대한 β1,2 연결을 통해 만노스에 연결된다. 따라서, 글리칸의 각각의 암(arm)은 만노스와 GlcNAc2가 어떻게 연결되어 있는지에 따라 α1,3 또는 α1,6 암으로 구분될 수 있다(Liu, L. J. Pharm Sci. 104 (2015) 1866-84). 추가의 푸코스, 갈락토스, 시알산 및 GlcNAc가 코어 글리칸 구조에 추가될 수 있으며, 글리칸 구성은 FcγR 결합에 직접적인 영향을 미친다.

예를 들어, IgG를 발현할 때 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 Ⅲ의 발현은 바이안테너리 글리칸을 갖고 더 나은 ADCC 활성을 갖는 N297에서 글리코실화된 항체를 제공한다(Umana, P. 등 Nat. Biotech. 17 (1999) 176-180). 푸코스 함량이 감소된 항체는, 예를 들어, FcγRⅢa와 같은 Fc 수용체에 대해 증가된 친화도를 갖는 것으로 보고되었다. 푸코스가 결핍된 항체는 FcγRⅢa에 대해 50배 더 높은 결합 및 향상된 ADCC 활성을 갖는 것으로 나타났다(Shields, R.L., 등 J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740). N297의 갈락토실화는 C1q 결합 및 CDC 활성을 향상시킨다(Dekkers, G., 등 Front. Immunol. 8 (2017) 877). N297 글리코실화의 이러한 조작(manipulation) 중 임의의 것이 본 발명의 항체에 대해 수행될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 매개한다. 항체의 Fc 영역에서의 돌연변이는, 예를 들어, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포성 식세포작용(ADCP), 보체 의존성 세포독성(CDC)과 같은 이펙터 기능을 향상시킬 수 있다(Saunders, K.O. Front. Immunol. 10 (2019) 1-20).

돌연변이의 특정 조합은 FcγRⅢa, FcγRⅡa 및/또는 FcγRⅠa에 대한 친화도를 증가시키고 ADCC 및/또는 ADCP를 향상시키며, 본원에서 제공되는 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편에 존재할 수 있다. 본원에서 제공되는 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편에 존재할 수 있는, FcγRⅢa 및/또는 FcγRⅡa에 대한 친화도를 증가시키고 ADCC 및/또는 ADCP를 향상시키는 돌연변이 조합의 예는 (1) S298A, E333A 및 K334A의 조합; (2) S239D, A330L 및 I332E의 조합; (3) S239D와 I332E의 조합; (4) G236A, S239D, A330L 및 I332E의 조합; (5) S239D, I332E 및 G236A의 조합; 및 (6) L234Y, G236W 및 S298A의 조합 중 임의의 것을 포함하며; 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다. "EU 인덱스"라고도 하는 "EU 넘버링 시스템"(즉, Kabat 등, 1991, National Institutes of Health (U.S.) Office of the Director, Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed., DIANE Publishing: Collingdale, PA1991에 보고된 EU 인덱스)은 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급할 때 사용된다.

특정 돌연변이 또는 돌연변이의 조합은 C1q 결합 및 CDC를 증가시키고, 본원에서 제공되는 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편에 존재할 수 있다. 본원에서 제공되는 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편에 존재할 수 있는, C1q 결합 및 CDC를 증가시키는 돌연변이 또는 돌연변이의 조합의 예는 (1) K326A와 E333A의 조합 (2) K326M과 E333S의 조합; (3) C221D와 D222C의 조합; (4) S267E, H268F 및 S324T의 조합; (5) H268F와 S324T의 조합; 및 (6) E345R 중 임의의 것을 포함하며; 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

생체 내 IgG 이화작용은 신생아 Fc 수용체(FcRn)와 IgG의 상호작용에 의해 조절된다(Sockolosky J.T., 등. Adv. Drug Deliv. Rev. 91 (2015) 109-124). IgG는 리소좀으로 이동하거나 세포 표면으로 다시 재순환될 수 있는 세포에 의해 엔도시토시스된다(Roopenian, D.C., 및 Akilesh, S. Nat. Rev. Immunol. 7 (2007) 715-725). 엔도좀의 낮은 pH(pH < 6.5)에서 FcRn에 대한 IgG의 결합은 항체가 FcRn과 함께 세포 표면으로 다시 수송되도록 한다. pH < 6.5에서 FcRn에 대한 약한 결합은 항체가 리소좀으로 수송되고 분해되는 결과를 초래한다. 세포 외 환경의 생리학적 pH에서, IgG는 FcRn에 대한 친화도가 약하며, 그 결과 FcRn으로부터 다시 순환계로 방출된다. 따라서, 본원에서 제공되는 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편에 존재할 수 있는 돌연변이는 pH < 6.5에서 FcRn 결합을 증가시킬 수 있으므로 항체 재순환을 증가시키고 PK를 향상시킬 수 있다.

본원에서 제공되는 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편에 존재할 수 있는, FcRn 결합을 증가시키고 이에 따라 항체 반감기를 증가시키는 돌연변이 및 돌연변이의 조합의 예는 (1) R435H; (2) N434A; (3) M252Y, S254T 및 T256E의 조합; (4) M428L과 N434S의 조합; (5) E294결실, T307P 및 N434Y의 조합; (6) T256N, A378V, S383N 및 N434Y의 조합; 및 (7) E294의 결실 중 임의의 것을 포함하며, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

Fc 수용체 결합, 보체 수용체 결합 또는 항체 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이가 또한 바람직할 수 있으며 본원에서 제공되는 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편에 존재할 수 있다. 이러한 돌연변이는 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 매개되는 염증 및 세포사(cell killing)를 감소시킬 수 있다. FcγRⅠ, FcγRⅡ, FcγRⅢ 및/또는 C1q에 대한 결합을 감소시켜 본원에서 제공되는 항-VISTA 항체 및 항원-결합 단편에 존재할 수 있는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 감소시키는 돌연변이 및 돌연변이 조합의 예는 (1) L235E; (2) L234A와 L235A의 조합; (3) S228P와 L235E의 조합(이 조합은 S228P 돌연변이가 IgG4로의 부류 전환을 방지하는 SPLE 돌연변이라고 함; Schlothauer 등. Protein Eng Des Sel (2016) 29:457-466 참조); (4) L234A, L235A 및 P329G의 조합; (5) P331S, L234E 및 L235F의 조합; (6) D265A; (7) G237A; (8) E318A; (9) E233P; (10) G236R과 L328R의 조합; (11) H268Q, V309L, A330S 및 P331S의 조합; (12) L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S 및 P331S의 조합; (13) L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S 및 P331S 중 어느 하나, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개; (14) A330L; (15) D270A; (16) K322A; (17) P329A; (18) P331A; (19) V264A; (20) F241A; N297A; N297G; N297E; 및 (21) S228P, F234A 및 L235A의 조합 중 임의의 것을 포함하며; 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이고, Fc 영역은 C220D, D221C, E233P, L234A, L234E, L234Y, L235A, L235E, L235F, G236A, G236W, G236R, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, A330L, A330S, P331A, P331S, I332E, E333A, E333S, K334A, A378V, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 가지며, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG2의 Fc 영역이고, Fc 영역은 C220D, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, V309L, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, A330L, A330S, P331A, P331S, I332E, E333A, E333S, K334A, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 가지며, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 S228P, E233P, F234A, L235A, L235E, L235F, G236A, G236W, G236R, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, V309L, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, I332E, E333A, E333S, K334A, A378V, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 가지며, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 L234A 및 L235A, 및 선택적으로 P329G이고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 F234A 및 L235A, 및 선택적으로 P329G이고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 M252Y, S254T 및 T256E이고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 M428L 및 N434S이고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 인간 Fc 영역의 변이체, 인간 Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 S228P 및 L235E이고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 S228P, M252Y, S254T 및 T256E이고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 S228P, M428L 및 N434S이고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 1-10개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 L234A 및 L235A, 및 선택적으로 P329G를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 1-10개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 F234A 및 L235A, 및 선택적으로 P329G를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 1-10개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 M252Y, S254T 및 T256E를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 1-10개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 인간 Fc 영역의 변이체, 인간 Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 1-10개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 S228P 및 L235E를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 1-10개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 S228P, M252Y, S254T 및 T256E를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 Fc 영역의 변이체를 포함하고, 인간 Fc 영역은 인간 IgG4의 Fc 영역이고, Fc 영역은 천연 인간 Fc 영역에 비해 1-10개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖고, 돌연변이는 S228P, M428L 및 N434S를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 글리코실화된 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 글리코실화되지 않은 불변 영역을 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 푸코스 함량이 감소되거나 푸코스 함량이 없다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 혼합된 아이소타입 항체, 즉 2개 이상의 상이한 아이소타입으로부터 유래된 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 항체의 IgG-Fc의 Asn 297(EU 넘버링 시스템에 의해 결정됨)에 부착된 바이안테너리 글리칸(GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 탈글리코실화된 항체(deglycosylated antibody), 비푸코실화된 항체(afucosylated antibody) 또는 갈락토실화된 항체(galactosylated antibody)이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하고 본원에 기술된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 항체는 상기 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하지 않는 항체와 비교하여 표적 매개된 약물 배치, 예를 들어, 수용체 매개된 엔도시토시스 후 리소좀 분해를 감소시킨다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체는 VISTA에 대해 pH 의존성 결합을 나타낸다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 수용체 또는 C1q 수용체에 대한 결합을 증가 또는 감소시키는 돌연변이를 포함하여 기술된 불변 영역에 대한 임의의 돌연변이와 함께 이전 단락에 기술된 임의의 히스티딘 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 산성 pH에서 표적 해리를 향상시키는 히스티딘 치환 및 FcRn 결합을 향상시키는 돌연변이를 포함한다.

결합 특성

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 VISTA(예를 들어, 서열번호 377을 암호화하는 핵산으로부터 발현됨), 특히 신호 서열이 결여된 성숙한 인간 VISTA에 결합한다. 성숙한 인간 VISTA는 서열번호 377의 아미노산 33-311이며, 이는 서열번호 377의 아미노산 1-32인 신호 서열이 결여되어 있다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 VISTA(예를 들어, 서열번호 378의 아미노산 33-194)의 세포 외 도메인(extracellular domain, ECD)에 결합한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 VISTA 및 사이노몰구스 원숭이 VISTA(예를 들어, 서열번호 380을 암호화하는 핵산으로부터 발현되거나 그렇지 않으면 신호 서열이 결여된 성숙한 원숭이 VISTA) 둘 다에 결합한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스 VISTA(예를 들어, 서열번호 369를 암호화하는 핵산으로부터 발현되거나 그렇지 않으면 신호 서열이 결여된 성숙한 마우스 VISTA)에 결합하지 않는다. VISTA의 예시적인 서열은 하기 표 11에 제시되어 있으며, 신호 서열은 밑줄과 볼드체로 표시되어 있다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바이오층 간섭법(biolayer interferometry)으로 측정했을 때 약 0.5nM 내지 약 1nM, 약 1nM 내지 약 1.5nM, 약 1.5nM 내지 약 2nM, 약 2nM 내지 약 2.5nM, 약 2.5nM 내지 약 3nM, 약 3nM 내지 약 5nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 10nM 내지 약 20nM 또는 약 20nM 내지 약 100nM의 K_D로 인간 VISTA의 ECD에 결합한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바이오층 간섭법으로 측정했을 때 약 0.5nM 내지 약 1nM, 약 1nM 내지 약 1.5nM, 약 1.5nM 내지 약 2nM, 약 2nM 내지 약 2.5nM, 약 2.5nM 내지 약 3nM, 약 3nM 내지 약 5nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 10nM 내지 약 20nM 또는 약 20nM 내지 약 100nM의 K_D로 사이노몰구스 원숭이 VISTA의 ECD에 결합한다.

친화도는 평형 해리 상수(K_D) 및 평형 결합 상수(K_A)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다수의 방식으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. K_D는, 예를 들어, 바이오층 간섭법 또는 표면 플라스몬 공명과 같은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어, 하기 기술된 방법으로 측정할 수 있다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ELISA로 측정했을 때 약 0.5nM, 약 0.9nM, 약 1.6nM, 약 1.7nM, 약 2.1nM, 약 2.7nM, 약 3.2nM, 약 4.2nM, 약 5.5nM, 또는 약 11.7nM인 반수 유효 농도(half-effective concentration)(EC₅₀)로 인간 VISTA에 결합한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약 0.05nM, 약 0.06nM, 약 0.09nM, 약 0.1nM, 약 0.2nM, 약 0.3nM, 약 0.4nM, 약 0.6nM, 약 0.8nM 또는 약 1.2nM의 EC₅₀으로 세포 표면에서 인간 VISTA에 결합한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-1(CD80으로도 알려짐), B7-2(CD86으로도 알려짐), B7-H2(ICOS 리간드로도 알려짐), B7-H1(PD-L1 또는 CD274로도 알려짐), B7-DC(PD-L2 또는 CD273으로도 알려짐), B7-H4(B7S1로도 알려짐) 및/또는 B7-H3(CD276으로도 알려짐)에 결합하지 않는다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 V-세트 및 Ig 도메인 함유 단백질 3(VSIG3)과 VISTA 사이의 상호작용을 차단한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VISTA 이량체화 또는 또 다른 동형(homotypic) 상호작용을 차단한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1(PSGL1)과 VISTA 사이의 상호작용을 차단한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 V-세트 Ig 도메인 함유 단백질 8(VSIG 8)과 VISTA 사이의 상호작용을 차단한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 류신 풍부 반복 및 면역글로불린 유사 도메인 단백질 1(LRIG1)과 VISTA 사이의 상호작용을 차단한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 ₆₆HLHHG₇₀(서열번호 377의 아미노산 98-102) 또는 ₁₁₆VVEIRHHHSEHR₁₂₇(서열번호 377의 아미노산 148-159)(VISTA 잔기의 번호는 신호 펩티드 다음의 첫 번째 아미노산으로 시작함)을 함유하는 VISTA의 에피토프에 결합한다. VISTA의 신호 서열은 표 11에서 볼드체와 밑줄로 표시되어 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 377의 티로신 37, 아르기닌 54, 발린 117 및 아르기닌 127을 포함하는 인간 VISTA의 에피토프에 결합한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체와 동일한 또는 중복되는 VISTA의 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 본원에서 사용되는 "에피토프"는 당업계에 공지된 의미에 따라 사용되는 용어이고 항체가 이의 항원-결합 도메인을 통해 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소 영역을 가리킨다. 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드의 인접 아미노산(선형 또는 연속 에피토프)일 수 있거나, 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 2개 이상의 비인접 영역으로부터 함께 생길 수 있다(형태적(conformational), 비선형, 불연속 또는 비인접 에피토프).

본원에 기술된 항체와 동일한 또는 중복되는 VISTA의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이중특이성 항체일 수 있다. 인간화 항체는 일반적으로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 인간 불변 영역 및 가변 영역을 포함하지만, CDR은 비인간 종의 CDR(예를 들어, 뮤린 CDR)이다. 키메라 항체는 일반적으로 인간 유래 불변 영역 및 비인간 종의 가변 영역(예를 들어, 뮤린 가변 영역)을 포함한다.

특정 실시양태에서, 항체의 에피토프는, 예를 들어, NMR 분광법, X-선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분석법과 결합된 수소/중수소 교환(예를 들어, MALDI 질량 분석법), 어레이 기반 올리고-펩티드 스캐닝 검정 및/또는 돌연변이유발 맵핑(mutagenesis mapping)(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 맵핑(site-directed mutagenesis mapping)) 또는 하기 기술된 방법으로 알아낼 수 있다. X-선 결정학의 경우, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정화를 달성할 수 있다(예를 들어, Giege R 등, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). 항체:항원 결정은 잘 알려진 X-선 회절 기술을 사용하여 연구할 수 있으며, 예를 들어, X-PLOR(Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc.에서 배포함; 예를 들어, Meth Enzymol(1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW 등, 미국 특허 출원 제2004/0014194 참조) 및 BUSTER(Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P 등, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 13 16-1323)와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정제할 수 있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기술을 포함하는 돌연변이유발 기술의 설명에 대해서는 Champe M 등, (1995) 및 Cunningham BC & Wells JA (1989) 참조.

본원에 기술된 항체와 동일한 또는 중복되는 VISTA의 에피토프를 인식하고 이에 결합하는 항체는, 예를 들어, 면역검정과 같은 일상적인 기술을 사용하여, 예를 들어, 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 차단하는 하나의 항체의 능력을 보임으로써, 즉 경쟁적 결합 검정을 사용하여 확인할 수 있다. 경쟁적 결합 검정은 2개의 항체가 에피토프에 대해 유사한 결합 특이성을 갖는지 여부를 알아내는 데에도 사용될 수 있다. 경쟁적 결합은 시험 중인 면역글로불린이, 예를 들어, VISTA와 같은 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에서 알아낼 수 있다. 다양한 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사면역검정(radioimmunoassay, RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(enzyme immunoassay, EIA), 샌드위치 경쟁 검정(sandwich competition assay)(Stahli C 등, (1983) Methods Enzymol 9: 242-253 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Kirkland TN 등, (1986) J Immunol 137: 3614-9 참조); 고상 직접 표지 검정(solid phase direct labeled assay), 고상 직접 표지 샌드위치 검정(solid phase direct labeled sandwich assay)(Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 참조); I-125 표지를 사용하는 고상 직접 표지 RIA(Morel GA 등, (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung RC 등, (1990) Virology 176: 546-52); 직접 표지 RIA. (Moldenhauer G 등, (1990) Scand J Immunol 32: 77-82); 및 바이오층 간섭법("BLI"), 예를 들어, Octet Red 96(ForteBio) 시스템에서의 BLI이 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 검정은 표지되지 않은 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린 중 하나를 함유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원(예를 들어, VISTA)의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 면역글로불린의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 알아냄으로써 측정될 수 있다. 보통 시험 면역글로불린은 과잉으로 존재한다. 보통 경쟁 항체가 과잉으로 존재할 때, 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% 또는 그 이상 억제한다. 경쟁 결합 검정은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다수의 상이한 포맷으로 구성될 수 있다. 이 검정의 일반적인 버전에서 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정된다. 표지된 항체가 항원에 결합하는 것을 차단하는 표지되지 않은 항체의 능력은 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다. 더 자세한 내용은, 예를 들어, Wagener C 등, (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C 등, (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M 등, (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M 등, (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M 등, (1992) Hybridoma 11: 391-407 및 Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editors supra, pp. 386-389 참조.

특정 측면에서, 경쟁 결합 검정은 항체가, 예를 들어, 용량 의존성 방식으로 또 다른 항체에 의해 경쟁적으로 차단되는지 여부를 알아내기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 경쟁 결합 검정은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다수의 상이한 포맷으로 구성될 수 있는 경쟁적 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 항체는 본원에 기술된 항체와의 경쟁 결합 검정에서 시험될 수 있다.

특정 실시양태에서, 당업자에게 공지되거나 본원에 기술된 임의의 검정, 예를 들어, ELISA 경쟁적 검정, BLI(예를 들어, Octet Red 96(ForteBio) 시스템에서의 BLI 또는 표면 플라스몬 공명)를 사용하여 알아내는 바와 같이 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 VISTA의 결합을 위해 (예를 들어, 용량 의존성 방식으로) 경쟁하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 당업자에게 공지되거나 본원에 기술된 임의의 검정, 예를 들어, ELISA 경쟁적 검정, 현탁액 어레이, BLI(예를 들어, Octet Red 96(ForteBio) 시스템에서의 BLI 또는 표면 플라스몬 공명)를 사용하여 알아내는 바와 같이 VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 (예를 들어, 용량 의존성 방식으로) 경쟁적으로 억제하는 항체가 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체가 VISTA에 대한 결합에 대해 자가 경쟁하는 것과 동일한 정도로 VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 제1 항체가 본원에서 제공되며, 경쟁은 VISTA에 대한 제1 항체의 결합이 80% 초과(예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 98%, 또는 80% 내지 85%, 80% 내지 90%, 85% 내지 90%, 또는 85% 내지 95%) 감소한 것으로 나타난다.

VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.

특정 측면에서, 표 7에 제시된 항체의 VH 및 표 8에 제시된 동일한 항체의 VL을 포함하는 항체와 VISTA에 대한 특이적 결합에 대해 (예를 들어, 용량 의존성 방식으로) 경쟁하는 항체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 표 9에 제시된 항체의 경쇄 및 표 9에 제시된 동일한 항체의 중쇄를 포함하는 면역글로불린과 VISTA에 대한 특이적 결합에 대해 (예를 들어, 용량 의존성 방식으로) 경쟁하는 항체가 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 표 7에 제시된 항체의 VH 및 표 8에 제시된 동일한 항체의 VL을 포함하는 항체의 동일한 또는 중복되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편. 당업자에게 공지되거나 본원에 기술된 검정(예를 들어, X-선 결정학, ELISA 검정 등)을 사용하여 2개의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지를 알아낼 수 있다.

특정 실시양태에서, VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 동일한 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바이오층 간섭법 또는 당업계에 공지된 또 다른 방법으로 측정했을 때 약 0.5nM 내지 약 1nM, 약 1nM 내지 약 1.5nM, 약 1.5nM 내지 약 2nM, 약 2nM 내지 약 2.5nM, 약 2.5nM 내지 약 3nM, 약 3nM 내지 약 5nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 10nM 내지 약 20nM 또는 약 20nM 내지 약 100nM의 K_D로 인간 VISTA의 ECD에 결합한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 동일한 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바이오층 간섭법으로 측정했을 때 약 0.5nM 내지 약 1nM, 약 1nM 내지 약 1.5nM, 약 1.5nM 내지 약 2nM, 약 2nM 내지 약 2.5nM, 약 2.5nM 내지 약 3nM, 약 3nM 내지 약 5nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 10nM 내지 약 20nM 또는 약 20nM 내지 약 100nM의 K_D로 사이노몰구스 원숭이 VISTA의 ECD에 결합한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 동일한 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ELISA로 측정했을 때 약 0.5nM, 약 0.9nM, 약 1.6nM, 약 1.7nM, 약 2.1nM, 약 2.7nM, 약 3.2nM, 약 4.2nM, 약 5.5nM 또는 약 11.7nM인 반수 유효 농도(EC₅₀)로 인간 VISTA에 결합한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 동일한 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약 0.05nM, 약 0.06nM, 약 0.09nM, 약 0.1nM, 약 0.2nM, 약 0.3nM, 약 0.4nM, 약 0.6nM, 약 0.8nM 또는 약 1.2nM의 EC₅₀으로 세포 표면에서 인간 VISTA에 결합한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 동일한 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-1(CD80으로도 알려짐), B7-2(CD86으로도 알려짐), B7-H2(ICOS 리간드로도 알려짐), B7-H1(PD-L1 또는 CD274로도 알려짐), B7-DC(PD-L2 또는 CD273으로도 알려짐), B7-H4(B7S1로도 알려짐) 및/또는 B7-H3(CD276으로도 알려짐)에 결합하지 않는다.

특정 실시양태에서, VISTA에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 동일한 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VSIG3와 VISTA 사이의 상호작용을 차단한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VISTA 이량체화 또는 다른 동형 상호작용을 차단한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PSGL1과 VISTA 사이의 상호작용을 차단한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VSIG8과 VISTA 사이의 상호작용을 차단한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 LRIG1과 VISTA 사이의 상호작용을 차단한다.

본원에서 사용되는 용어 "약"은 숫자 값 또는 숫자 범위를 수식하는 데 사용될 때 해당 값 또는 범위보다 5% 내지 10% 초과 및 5% 내지 10% 미만의 편차가 인용된 값 또는 범위의 의도된 의미 내에 있음을 나타낸다.

기능적 특성

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 T 세포 활성화를 증가시킨다. 인간 T 세포 활성화는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 임의의 검정(예를 들어, 하기 기술되는 SEB 유도된 인간 T 세포 활성화 검정)으로 알아낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 T 세포 활성화를 IgG1 또는 IgG4 대조군과 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190% 또는 약 200% 증가시킨다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VISTA 매개된 T 세포 억제를 감소시킨다. VISTA 매개된 T 세포 억제는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 임의의 검정을 사용하여(예를 들어, 하기 기술된 바와 같이 ELISA를 사용하여 IFNγ 생성을 측정하거나 T 세포 증식을 측정함으로써) 알아낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T 세포 증식으로 알아내는 바와 같이 IgG1 대조군과 비교하여 VISTA 매개된 T 세포 억제를 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290% 또는 약 300% 감소시킨다.

다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IFNγ 생성으로 알아내는 바와 같이 IgG1 또는 IgG4 대조군과 비교하여 VISTA 매개된 T 세포 억제를 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290% 또는 약 300% 감소시킨다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단핵구를 활성화시킨다. 단핵구 활성화는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 임의의 검정을 사용하여(예를 들어, 하기 기술된 바와 같이 CD14+ 세포 표면에서 HLA-DR, CD80 및/또는 CD86의 수준을 측정하거나 CXCL10 케모카인 분비를 측정함으로써) 알아낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 또는 IgG4 대조군과 비교하여 CD14+ 단핵구에서 HLA-DR의 발현을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290% 또는 약 300% 증가시킨다. 특정 실시양태에서, HLA-DR 발현의 증가는 NK 세포 의존성이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 또는 IgG4 대조군과 비교하여 CD14+ 단핵구에서 CD80의 발현을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290% 또는 약 300% 증가시킨다. 특정 실시양태에서, CD80 발현은 NK 세포 의존성이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 또는 IgG4 대조군과 비교하여 CD14+ 단핵구에서 CD86의 발현을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290% 또는 약 300% 증가시킨다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 또는 IgG4 대조군과 비교하여 CXCL10의 분비를 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290%, 약 300%, 약 310%, 약 320%, 약 330%, 약 340%, 약 350%, 약 360%, 약 370%, 약 380%, 약 390%, 약 400%, 약 410%, 약 420%, 약 430%, 약 440%, 약 450%, 약 460%, 약 470%, 약 480%, 약 490% 또는 약 500% 증가시킨다. 특정 실시양태에서, CXCL10 분비는 NK 세포 의존성이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 사이토카인 유도된 활성화에 영향을 미친다. MDSC의 활성은 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 임의의 검정을 사용하여(예를 들어, 하기 기술된 바와 같이 항-CD3 유도된 T 세포 증식을 억제하는 MDSC의 능력을 유세포분석으로 측정하고/하거나 ELISA로 IFNγ 생성을 측정함으로써) 알아낼 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T 세포 증식으로 알아내는 바와 같이 IgG1 대조군과 비교하여 MDSC 매개된 T 세포 억제를 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190% 또는 약 200% 감소시킨다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IFNγ 분비로 알아내는 바와 같이 IgG1 대조군과 비교하여 MDSC 매개된 T 세포 억제를 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290%, 약 300%, 약 310%, 약 320%, 약 330%, 약 340%, 약 350%, 약 360%, 약 370%, 약 380%, 약 390%, 약 400%, 약 410%, 약 420%, 약 430%, 약 440%, 약 450%, 약 460%, 약 470%, 약 480%, 약 490% 또는 약 500% 감소시킨다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 유도한다. ADCC는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 임의의 검정으로(예를 들어, 하기 기술된 바와 같이 인간 VISTA를 발현하는 Raji 세포에 대한 ADCC를 측정함으로써) 알아낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약 1-5ng/mL, 약 5-10ng/mL, 약 10-15ng/mL, 약 15-20ng/mL 또는 약 20-25ng/mL의 반수 최대 유효 농도(EC₅₀), 또는 약 10.78ng/mL, 약 5.24ng/mL, 약 5.75ng/mL, 약 15.7ng/mL, 약 7.94ng/mL, 약 8.5ng/mL, 약 15.6ng/mL 또는 약 22.1ng/mL의 EC₅₀으로 ADCC를 유도한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 암의 생체 내 모델에서 종양 형성 또는 종양 성장을 억제한다. 특정 실시양태에서, 암의 생체 내 모델은 인간 VISTA 녹-인("hVISTA KI") 마우스, MC38 마우스 모델, MB49 마우스 모델 또는 EG7 마우스 모델이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 결장직장암(colorectal cancer)의 MC38 마우스 모델에서 종양 형성 또는 종양 성장을 억제한다. MC38 마우스 모델에서 종양 형성의 억제를 알아내기 위한 예시적인 프로토콜이 아래에 제시되어 있다). 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스 IgG2a 대조군보다 MC38 마우스 모델에서 더 큰 종양 성장 억제를 보여준다. 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-PD-1 항체보다 MC38 마우스 모델에서 더 큰 종양 성장 억제를 보여준다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방광암의 MB49 마우스 모델에서 종양 성장을 억제한다. MB49 마우스 모델에서 종양 형성 억제를 알아내기 위한 예시적인 프로토콜이 아래에 제시되어 있다). 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스 IgG2a 대조군보다 MB49 마우스 모델에서 더 큰 종양 성장 억제를 보여준다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 흉선종(thymoma)의 EG7 마우스 모델에서 종양 성장을 억제한다. EG7 마우스 모델에서 종양 형성 억제를 알아내기 위한 예시적인 프로토콜이 아래에 제시되어 있다). 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스 IgG2a 대조군보다 EG7 마우스 모델에서 더 큰 종양 성장 억제를 보여준다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hVISTA KI 마우스에서 10mg/kg의 복강 내 주사 후 제거 반감기(elimination half-life)가 약 9시간이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hVISTA KI 마우스에서 30mg/kg 또는 100mg/kg의 복강 내 주사 후 제거 반감기가 약 33시간이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 혈액에서 골수 세포 활성화 마커를 조절한다. 골수 활성화 마커는, 예를 들어, CD80, CD86, HLA-DR을 포함하고 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 임의의 검정으로(예를 들어, 골수 수지상 세포(mDC) 또는 단핵구에서 CD80, CD86, HLA-DR의 발현을 하기 기술된 바와 같이 유세포분석으로 측정함으로써) 측정할 수 있다.

1.2 항체 생성

항체 생성 및 스크리닝

또 다른 측면에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성 방법이 본원에서 제공된다.

본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 합성에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 화학적 합성 또는 재조합 발현 기술에 의해 생성될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오티드 합성 및 변형, 핵산 혼성화 및 당업계의 관련 분야에서 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은, 예를 들어, 본원에 인용된 참고문헌에 설명되어 있으며 상기 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, Maniatis T 등, (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J 등, (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J 등, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987 및 연례 업데이트); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 및 연례 업데이트) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B 등, (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는, 예를 들어, 합성, DNA 서열의 유전적 조작을 통한 생성을 포함하는 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체(예를 들어, 재조합 항체)이다. 특정 실시양태에서, 이러한 항체는 동물 또는 포유동물(예를 들어, 인간)의 생체 내 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 서열에 의해 암호화되는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는 성숙한 인간 VISTA(서열번호 377의 아미노산 33-311) 또는 이의 세포 외 도메인(서열번호 378)을 면역원으로 사용하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.

특정 측면에서, 본원에 기술된 세포 또는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 특정 측면에서, 본원에 기술된 세포 또는 숙주 세포(예를 들어, 본원에 기술된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현(예를 들어, 재조합적으로 발현)하는 단계를 포함하는, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 단리된 세포 또는 생체 외 세포이다. 특정 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 도입되었다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 세포 또는 숙주 세포로부터 수득된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

다클론 항체의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM 등, eds., John Wiley and Sons, New York 참조).

본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 하이브리도마(hybridoma) 기술을 통해 생성된 항체에 제한되지 않는다. 단클론 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체는 본원에 기술된 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 이러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 외인성으로 발현하는 숙주 세포로부터 재조합적으로 생성될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현되는 단클론 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Chapter 11 in Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM 등, supra 참조). 예를 들어, 단클론 항체는 당업계에 공지되고, 예를 들어, Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ 등, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981); 및 Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495에서 교시하는 하이브리도마 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 하이브리도마 기술을 사용하여 특정 항체를 생성하고 스크리닝하는 방법은 일상적이며 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 실시양태에서, 마우스(또는 다른 동물, 예컨대 래트, 원숭이, 당나귀, 돼지, 양, 햄스터, 소(cow), 낙타, 닭 또는 개)가 항원(예를 들어, 인간)으로 면역화될 수 있고 일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되고, 마우스 비장이 수확되고 비장 세포가 단리된다. 이어서, 비장 세포를 잘 알려진 기술로 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC^®)(Manassas, VA)에서 입수할 수 있는 세포주 SP2/0의 세포에 융합하여 하이브리도마를 형성한다. 하이브리도마를 선택하고 제한된 희석으로 복제한다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모 고루종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 시딩되고 성장된다. 하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지는 VISTA에 대한 단클론 항체 생성에 대해 분석된다. 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 서브클로닝되고, 성장되고, 표준 방법에 의해 배양 배지로부터 분리될 수 있다(Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, supra). 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론 항체의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 면역침전법 또는, 예를 들어, 방사면역검정(RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 시험관 내 결합 검정으로 알아낸다.

특정 실시양태에서, 단일 세포(예를 들어, 단일 B 세포, 하이브리도마, 또는 재조합 항체를 생성하는 숙주 세포)에 의해 생성되는 단클론 항체가 본원에 개시되며, 항체는, 예를 들어, 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 바와 같은 ELISA 또는 다른 항원 결합 또는 경쟁적 결합 검정으로 알아내는 바와 같이 VISTA에 면역특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 단클론 항체는 1가 항체 또는 다가(예를 들어, 2가) 항체이다. 특정 실시양태에서, 단클론 항체는 단일특이성 또는 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체)이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE)이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 삼중특이성 킬러 인게이저(tri-specific killer engager)(TriKE)이다.

VISTA를 인식하는 항체 단편은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 Fab 및 F(ab')₂ 단편은, 예를 들어, 파파인(papain)(Fab 단편 생성) 또는 펩신(pepsin)(F(ab')₂ 단편 생성)과 같은 효소를 사용한 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 항체 분자의 2개의 동일한 암(arm) 중 하나에 해당하며 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 짝을 이루는 완전한 경쇄를 함유한다. F(ab')₂ 단편은 힌지 영역에서 디설파이드 결합으로 연결된 항체 분자의 2개의 항원 결합 암을 함유한다.

추가로, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여서도 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서 기능적 항체 도메인은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에 디스플레이된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리(예를 들어, 감염된 조직의 인간 또는 뮤린 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합되고 파지미드 벡터(phagemid vector) 내로 클로닝된다. 상기 벡터는 대장균(E. coli) 세포 내로 전기천공되고 대장균은 헬퍼 파지로 감염된다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 필라멘트형 파지이며, VH 및 VL 도메인은 보통 파지 유전자 Ⅲ 또는 유전자 Ⅷ에 재조합적으로 융합된다. 특정 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원으로, 예를 들어, 표지된 항원, 또는 고체 표면이나 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선택하거나 확인할 수 있다. 본원에 기술된 항체를 만드는 데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 Brinkman U 등, (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS 등, (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA 등, (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L 등, (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT 출원 번호 PCT/GB91/001134; 국제 공개 번호 WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 및 WO 97/13844; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호 및 제5,969,108호에 기재된 것을 포함한다.

상기 참조문헌에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역은 단리될 수 있고 인간화 항체, 키메라 항체 또는 임의의 다른 원하는 항원-결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 하기 기술된 바와 같이 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 92/22324; Mullinax RL 등, (1992) BioTechniques 12(6):864-9; Sawai H 등, (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; 및 Better M 등, (1988) Science 240: 1041-1043에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편과 같은 항체 단편을 재조합적으로 생성하는 기술이 또한 사용될 수 있다.

한 측면에서, 전체 항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위 및 제한 부위를 보호하기 위한 측면 서열(flanking sequence)을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 주형, 예를 들어, scFv 클론으로부터 VH 또는 VL 서열을 증폭할 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인을 중쇄 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝할 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인을 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝할 수 있다. VH 및 VL 도메인은 필요한 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터 내로도 클로닝할 수 있다. 이어서, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 전장 항체, 예를 들어, IgG를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 생성하기 위해 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터를 세포주 내로 공동-형질감염시킨다.

단일 도메인 항체, 예를 들어, 경쇄가 결여된 항체는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD 등, (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; 미국 특허 제6,005,079호; 및 국제 공개 번호 WO 94/04678, WO 94/25591 및 WO 01/44301 참조.

추가로, 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 항원을 "모사"하는 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체를 생성하기 위해 VISTA 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체가 사용될 수 있다. (예를 들어, Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; 및 Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438 참조).

인간 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용할 수 있다. 특히, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역(diversity region)이 마우스 배아 줄기세포 내로 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 동시에 또는 개별적으로 기능하지 않게 될 수 있다. 특히, J_H 영역의 동형접합 결실(homozygous deletion)은 내인성 항체 생성을 방지한다. 키메라 마우스를 만들기 위해 변형된 배아 줄기세포를 확장하고 배반포(blastocyst) 내로 미세주입한다. 이어서, 인간 항체를 발현하는 동형접합 자손(homozygous offspring)을 생성하기 위해 키메라 마우스를 사육한다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어, 항원의 전부 또는 일부(예를 들어, VISTA, 또는 VISTA의 ECD, 또는 VISTA 암호화 DNA)로 일반적인 방식으로 면역화한다. 단일 B 세포 또는 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 항원에 대한 단클론 항체를 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 보유된 인간 면역글로불린 전이유전자(transgene)는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 후속적으로 부류 변환 재조합(class switching recombination) 및 체세포 과돌연변이(somatic hyper-mutation)를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 이용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성할 수 있다. 인간 항체 생성을 위한 이 기술의 개요는, 예를 들어, Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단클론 항체를 생성하기 위한 이러한 기술 및 그러한 항체를 생성하기 위한 프로토콜의 상세한 논의는, 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 98/24893, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국 특허 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호 및 제5,939,598호를 참조한다. 인간 항체를 생성할 수 있는 마우스의 예는 Trianni^® 마우스(예를 들어, 미국 특허 제10,881,084호 및 제10,793,829호에 기술됨), Xenomouse™(Abgenix, Inc.; 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,184호), HuAb-Mouse™(Medarex, Inc./Gen Pharm; 미국 특허 제5,545,806호 및 제5,569,825호), Trans Chromo Mouse™(Kirin) 및 KM Mouse™(Medarex/Kirin)를 포함한다.

VISTA에 특이적으로 결합하는 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하여 상술된 파지 디스플레이 방법을 포함한 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,444,887호, 제4,716,111호 및 제5,885,793호; 및 국제 공개 번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741 참조.

특정 실시양태에서, 인간 항체는 마우스-인간 하이브리도마를 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)로 형질전환된 인간 말초 혈액 림프구는 마우스 골수종 세포와 융합되어 인간 단클론 항체를 분비하는 마우스-인간 하이브리도마를 생성할 수 있으며, 이러한 마우스-인간 하이브리도마는 표적 항원(예를 들어, 인간 VISTA 또는 인간 VISTA의 ECD)에 면역특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체를 분비하는 것을 알아내기 위해 스크리닝될 수 있다. 이러한 방법은 공지되어 있고 당업계에 기술되어 있는데, 예를 들어, Shinmoto H 등, (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y 등, (2005) Human Antibodies 14: 27-31을 참조한다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는, 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 스크리닝 및 선택하는 방법은 본원에 기술된 바와 같다.

본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 생성되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 다음에 특정 항원에 대한 친화도, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 항체는 본원에 기술되거나 그렇지 않으면 정제를 용이하게 하기 위해 당업계에 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단리되거나 정제된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단리된 항체와 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체 제제는 세포 물질 및/또는 화학 전구체가 실질적으로 없다. "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 표현은 항체가 단리되거나 재조합적으로 생성되는 세포의 세포 성분으로부터 항체가 분리되는 항체 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%(건조 중량 기준) 미만의 이종 단백질(본원에서 "오염 단백질"이라고도 함) 및/또는 항체의 변이체, 예를 들어, 항체의 상이한 번역 후 변형된 형태 또는 항체의 다른 상이한 버전(예를 들어, 항체 단편)을 갖는 항체 제제를 포함한다. 항체가 재조합적으로 생성되는 경우, 항체는 일반적으로 배양 배지도 실질적으로 없는데, 즉 배양 배지가 단백질 제제 부피의 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만을 나타낸다. 항체가 화학적 합성에 의해 생성되는 경우, 항체는 일반적으로 화학 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는데, 즉 단백질 합성에 관여하는 화학 전구체 또는 기타 화학물질로부터는 물론 미스폴딩된(misfolded) 단백질 및 기타 전구물질로부터 분리된다. 따라서, 이러한 항체 제제는 관심 항체 이외의 화학 전구체 또는 화합물이 약 30%, 20%, 10% 또는 5%(건조 중량 기준) 미만이다.

1.3 폴리뉴클레오티드

특정 측면에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(또는 핵산 분자) 및 벡터, 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, 대장균 및 포유동물 세포)에서의 효율적인 발현을 위한 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 물론 그러한 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하고 선택적으로 이를 발현하는 생체 외 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리되거나 정제된다.

특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원(예를 들어, 마우스 또는 인간)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 더욱이, 예를 들어, cDNA 분자와 같은 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생성될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, "실질적으로 없는"이라는 표현은 다른 물질, 예를 들어, 세포 물질, 배양 배지, 다른 핵산 분자, 화학 전구체 및/또는 다른 화학물질이 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만인 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 제제를 포함한다.

특정 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 물론 VISTA 폴리펩티드에 결합하기 위해 이러한 항체와 (예를 들어, 용량 의존성 방식으로) 경쟁하거나, 이러한 항체의 에피토프와 동일한 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 항체가 본원에서 제공된다.

특정 측면에서, 본원에 기술된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH, 예를 들어, 표 7에 제시된 항체의 VH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VL, 예를 들어, 표 8에 제시된 항체의 VL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 및 VL 둘 다, 예를 들어, 표 7에 제시된 항체의 VH 및 표 8에 제시된 동일한 항체의 VL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH 및 VL은 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.

특정 측면에서, 경쇄 및 중쇄, 예를 들어, 별개의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 경쇄 및 중쇄는 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 경쇄와 관련하여, 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄를 포함하는 본원에 기술된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 서열은 표 12에 제시된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 항체의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 서열은 표 13에 제시된 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH, 예를 들어, 표 7에 제시된 항체의 VH 및 인간 중쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄 불변 영역)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VL, 예를 들어, 표 8에 제시된 항체의 VL 및 인간 경쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 (i) 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH(예를 들어, 표 7에 제시된 항체의 VH) 및 인간 중쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄 불변 영역)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (ii) 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VL(예를 들어, 표 8에 제시된 항체의 VL) 및 인간 경쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 서열은 표 12에 제시된 서열 및 표 13에 제시된 동일한 항체의 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(들), 핵산(들) 또는 뉴클레오티드(들)는 데옥시리보핵산, 리보핵산, 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체 형태를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드(들), 핵산(들) 또는 뉴클레오티드(들)는 단일 또는 이중 가닥이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 핵산 서열)은 당업자에게 공지된 방법론을 사용하여 코돈 최적화된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, VH 도메인 및/또는 VL 도메인)을 암호화하는 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, VH 도메인 및/또는 VL 도메인)을 암호화하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스(예를 들어, 상보성) 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 최적화된 뉴클레오티드 서열은 높은 엄격도 조건하에 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 최적화된 뉴클레오티드 서열은 높은 엄격도, 중간 또는 낮은 엄격도 혼성화 조건하에 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 최적화되지 않은 뉴클레오티드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 혼성화 조건에 관한 정보는, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048549(예를 들어, 단락 72-73)에 기술되어 있다.

당업계에 공지된 임의의 방법으로 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 알아낼 수 있다. 본원에 기술된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 이러한 항체의 변형된 버전은 당업계에 널리 공지된 방법, 즉 특정 아미노산을 암호화하는 것으로 공지된 뉴클레오티드 코돈을 조립하여 항체를 암호화하는 핵산 서열을 생성하는 방법을 사용하여 알아낼 수 있다. 항체를 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, Kutmeier G 등, (1994), BioTechniques 17: 242-6에 기술된 바와 같음)로부터 조립될 수 있으며, 이는 간단히는 항체를 암호화하는 서열의 일부를 함유하는 중복된 올리고뉴클레오티드의 합성, 이러한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 및 이어서 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 수반한다.

대안적으로, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법(예를 들어, PCR 및 기타 분자 클로닝 방법)을 사용하여 적합한 공급원(예를 들어, 하이브리도마 또는 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터의 B 세포)으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 공지된 서열의 3' 및 5' 엔드에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭은 관심 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 또는 B 세포로부터 수득한 게놈 DNA를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법은 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법은 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 증폭된 핵산은 숙주 세포에서의 발현 및 추가 클로닝을 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다.

특정 항체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 클론이 이용 가능하지 않지만 항체 분자의 서열이 알려져 있다면, 면역글로불린을 암호화하는 핵산은 해당 서열의 3' 및 5' 엔드에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 또는, 예를 들어, 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 클로닝함으로써 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리)으로부터 수득할 수 있거나 화학적으로 합성할 수 있다. PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당업계에 잘 알려진 임의의 방법을 사용하여 복제 가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.

VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 시퀀싱할 수 있다. 하이브리도마 세포 또는 단리된 B 세포는 그러한 DNA의 공급원으로 작용할 수 있다. DNA는 일단 단리되면 발현 벡터 내에 배치될 수 있으며, 이는 이어서 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 세포, 유인원(simian) COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포(예를 들어, CHO GS System™(Lonza) 또는 CHOZN® 시스템(Sigma)의 CHO 세포), 293F 세포, HEK293 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 합성을 수득한다.

전체 항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하기 위한 측면 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 scFv 클론에서 VH 또는 VL 서열을 증폭시킬 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인을 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 감마 1 불변 영역 또는 인간 감마 4 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝할 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인을 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 특정 실시양태에서, VH 또는 VL 도메인을 발현하기 위한 벡터는 프로모터, 분비 신호, 가변 도메인에 대한 클로닝 부위, 불변 도메인 및 선택 마커를 포함한다. 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성에 사용될 수 있는 예시적인 신호 서열은 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호 360)이다. 또한, VH 및 VL 도메인은 필요한 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이어서, VH 및/또는 VL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 전장 항체, 예를 들어, IgG를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 생성하기 위해 세포주 내로 공동 형질감염된다.

또한, DNA는, 예를 들어, 임의의 뮤린 또는 다른 비인간 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 대체함으로써, 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 항체(예를 들어, 면역글로불린) 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다.

또한, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 높은 엄격도, 중간 또는 낮은 엄격도 혼성화 조건하에 혼성화하는 프라이머를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

혼성화 조건은 당업계에 기술되어 있으며 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 엄격한 조건 하에서의 혼성화는 약 45℃에서 6× 염화나트륨/나트륨 시트레이트(SSC)에서 필터 결합된 DNA에 대한 혼성화에 이어 약 50-65℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함할 수 있으며; 매우 엄격한 조건 하에서의 혼성화는 약 45℃에서 6×SSC에서 필터 결합된 핵산에 대한 혼성화에 이어 약 68℃에서 0.1×SSC/0.2% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함할 수 있다. 다른 엄격한 혼성화 조건 하에서의 혼성화는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, Ausubel FM 등, eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc., New York, pages 6.3.1-6.3.6 및 2.10.3에 기술되어 있다.

1.4 세포 및 벡터

특정 측면에서, 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 재조합 발현을 위한 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 본원에서 제공된다. 발현 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 백시니아(vaccinia) 등)일 수 있다. 또한, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 재조합적으로 발현시키기 위한 그러한 벡터를 포함하는 생체 외 숙주 세포가 본원에서 제공된다.

본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 전장 항체, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 본원에 기술된 단일쇄 항체)의 재조합 발현은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 작제를 포함한다. 본원에 기술된 항체 분자, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술로 항체 분자의 생성을 위한 벡터를 생성할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열을 암호화하는, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 또는 둘 다)을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 또는 둘 다) 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전적 재조합을 포함한다. 또한, 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 경쇄, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는, 예를 들어, 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고(예를 들어, 국제 공개 번호 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조) 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄 또는 전체 중쇄와 경쇄 둘 다의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.

발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 세포(예를 들어, 숙주 세포)로 전달될 수 있고, 이어서 생성된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 따라서, 숙주 세포에서 이러한 서열의 발현을 위해 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 단편, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 단일쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 숙주 세포는 발현에 적합한 임의의 유형의 세포, 예를 들어, 1차 세포, 배양 중인 세포 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다.

본원에 기술된 항체 분자를 발현시키기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질도입되거나 형질감염될 때 본원에 기술된 항체 분자를 제자리에서 발현할 수 있는 세포도 나타낸다. 이것은, 예를 들어, 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 대장균 및 B. 서브틸리스(B. subtilis)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV); 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus, TMV)로 감염되거나 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, 녹조류, 예컨대 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)); 또는 포유동물 세포의 게놈에서 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터(metallothionein promoter)) 또는 포유동물 바이러스에서 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터(adenovirus late promoter); 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 함유한 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), CHO, CHO GS 시스템, CHOZN® 시스템, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa 및 NIH 3T3, HEK-293T, 293F, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMT10 세포)와 같은 미생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하기 위한 세포는 CHO 세포 또는 HEK 293 세포이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하기 위한 세포는 인간 세포, 예를 들어, 인간 세포주이다. 특정 실시양태에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한, 예를 들어, 대장균과 같은 박테리아 세포, 또는 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포)가 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를 들어, 인간 거대세포바이러스(human cytomegalovirus)로부터의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소(major intermediate early gene promoter element)와 같은 벡터와 함께, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포가 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; 및 Cockett MI 등, (1990) Biotechnology 8(7): 662-7). 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는 CHO 세포, HEK 293 세포 또는 NS0 세포에 의해 생성된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 상시발현 프로모터(constitutive promoter), 유도성 프로모터(inducible promoter) 또는 조직 특이적 프로모터(tissue specific promoter)에 의해 조절된다.

박테리아 시스템에서, 발현되는 항체 분자에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 그러한 항체를 다량 생성해야 하는 경우, 항체 분자의 약제학적 조성물의 생성을 위해, 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 융합 단백질이 생성되도록 lac Z 코딩 영역이 있는 프레임의 벡터 내로 항체 코딩 서열이 개별적으로 결찰될 수 있는 대장균 발현 벡터 pUR278(Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794); pIN 벡터(Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pGEX 벡터가 또한 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합에 이어 유리 글루타티온의 존재하의 용리에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.

곤충 시스템에서, 예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카 핵 다각체병 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)는 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 자란다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린 유전자(polyhedrin gene)) 내로 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter))의 제어하에 놓일 수 있다.

포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심 항체 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 3자 리더 서열(tripartite leader sequence)에 결찰될 수 있다. 이어서, 이 키메라 유전자는 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈을 비필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에 삽입하면 생존 가능하고 감염된 숙주에서 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성될 것이다(예를 들어, Logan J & Shenk T (1984) Proc.Natl. Acad. Sci USA 81(12): 3655-9 참조). 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 필요할 수도 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 판독 프레임과 단계(phase)가 같아야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함함으로써 향상될 수 있다(예를 들어, Bitter G 등, (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544 참조).

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 처리하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 처리(예를 들어, 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 처리 및 변형을 위한 특징적이고 특정한 메커니즘을 가지고 있다. 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위해, 유전자 산물의 1차 전사, 글리코실화 및 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 기구(cellular machinery)를 보유한 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, 293F, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(어떠한 면역글로불린 사슬도 내생적으로 생성하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HEK293, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 푸코스 함량이 감소되거나 푸코스 함량이 없다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 푸코실화 능력이 결핍되거나 결여된 세포에서 발현될 수 있다. 특정 예에서, α1,6-푸코실트랜스퍼라제의 두 대립유전자가 녹아웃된 세포주가 푸코스 함량이 감소된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다. Potelligent^® 시스템(Lonza)이 푸코스 함량이 감소된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 데 사용할 수 있는 이러한 시스템의 예이다.

재조합 단백질의 장기간 고수율 생성을 위해, 안정한 발현 세포를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 세포는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 형성하기 위해 결합하는 경쇄/경쇄 가변 도메인 및 중쇄/중쇄 가변 도메인을 안정적으로 발현한다.

특정 측면에서, 숙주 세포는 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마커(selectable marker)에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA/폴리뉴클레오티드 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장될 수 있고, 이어서 선택 배지(selective media)로 바꾼다. 재조합 플라스미드의 선별 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 이의 염색체 내로 플라스미드를 안정적으로 통합하고 성장하여 결국 세포주로 클로닝 및 확장될 수 있는 병소(foci)를 형성하도록 한다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.

각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(herpes simplex virus thymidine kinase)(Wigler M 등, (1977) Cell 11(1): 223-32), 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase)(Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(adenine phosphoribosyltransferase)(Lowy I 등, (1980) Cell 22(3): 817-23) 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 저항성이 다음 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트(methotrexate)에 대한 저항성을 부여하는 dhfr(Wigler M 등, (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K 등, (1981) PNAS 78: 1527-31); 마이코페놀산(mycophenolic acid)에 대한 저항성을 부여하는 gpt(Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); 아미노글리코시드(aminoglycoside) G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo(Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; 및 Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); 및 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 저항성을 부여하는 hygro(Santerre RF 등, (1984) Gene 30(1-3): 147-56). 재조합 DNA 기술 분야에서 통상 알려진 방법이 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일상적으로 적용될 수 있으며 이러한 방법은, 예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 Ausubel FM 등, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990); 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli NC 등, (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); 등, (1981) J Mol Biol 150: 1-14에 기술되어 있다.

항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(검토를 위해, Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vector based on gene amplification for the expression of cloned gene in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987) 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 연관되어 있기 때문에 항체 생성도 증가할 것이다(Crouse GF 등, (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).

숙주 세포는 본원에 기술된 2개 이상의 발현 벡터로 동시 형질감염될 수 있으며, 첫 번째 벡터는 중쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하고 두 번째 벡터는 경쇄 유래 폴리펩티드를 암호화한다. 상기 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선별 마커를 함유할 수 있다.

특정 측면에서, 본원에서 제공되는 숙주 세포는 벡터를 포함하며, 벡터는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 경쇄 영역(VL)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 항체의 가변 중쇄 영역(VH)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 특정 측면에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 생체 외 세포가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 생체 외 세포는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH, 예를 들어, 표 7에 제시된 항체의 VH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 생체 외 세포는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VL, 예를 들어, 표 8에 제시된 항체의 VL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 생체 외 세포는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 표 7에 제시된 항체의 VH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 표 8에 제시된 동일한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 함유한다.

대안적으로, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터에서, 두 유전자의 전사는 공통 프로모터에 의해 구동될 수 있는 반면, 제1 유전자로부터의 mRNA의 번역은 캡 의존성 스캐닝 메카니즘(cap-dependent scanning mechanism)에 의해 이루어질 수 있고 제2 유전자로부터의 mRNA의 번역은 캡 독립적 메카니즘(cap-independent mechanism), 예를 들어, IRES에 의해 이루어질 수 있다.

또 다른 특정 측면에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 생체 외 세포가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 생체 외 세포는 표 12에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 생체 외 세포는 표 13에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 생체 외 세포는 항체의 중쇄를 암호화하는 표 12에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 동일한 항체의 경쇄를 암호화하는 표 13에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 숙주 세포(예를 들어, 생체 외 숙주 세포)는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 숙주 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하기 위한 조건하에 배양된다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 숙주 세포로부터 단리되거나 정제된다.

1.5 약제학적 조성물

(a) 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정제된다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약제학적 조성물에 치료적 유효량으로 존재한다.

특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정제된다.

또한, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터(들) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다.

또한, (a) 본원에 기술된 항체-약물 접합체(예를 들어, 치료제에 결합된 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함함) 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 항체-약물 접합체는 약제학적 조성물에 치료적 유효량으로 존재한다.

또한, (a) VISTA 및 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 다른 관심 항원에 결합하는 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 정제된다. 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 약제학적 조성물에 치료적 유효량으로 존재한다.

또한, (a) 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 및 VL을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 세포 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다.

부형제 또는 안정제일 수 있는 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 예를 들어, 인산염, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 예를 들어, EDTA와 같은 킬레이트제; 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 예를 들어, 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는, 예를 들어, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 선택적으로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 유효량의 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 선택적으로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물 및/또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 치료적 유효량의 추가 치료제와 배합될 수 있다.

특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 본원에 기술된 항체-약물 접합체 및 선택적으로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 유효량의 본원에 기술된 항체-약물 접합체 및 선택적으로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물 및/또는 항체-약물 접합체는 치료적 유효량의 추가 치료제와 배합될 수 있다.

특정 실시양태에서, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약제학적 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)는 약제학적 조성물에서 유일한 활성 성분이다.

본원에 기술된 약제학적 조성물은 암, 자가면역 질환 및 감염, 예를 들어, 박테리아 및 진균 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

약제학적 조성물은 임의의 투여 경로(예를 들어, 비경구, 국소, 종양 내 등)용으로 제형화될 수 있다.

비경구 제제에 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장제, 버퍼, 항산화제, 국소 마취제, 현탁제 및 분산제, 유화제, 금속이온 봉쇄제 또는 킬레이트제 및 기타 약제학적으로 허용되는 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장성 덱스트로스 주사액(Isotonic Dextrose Injection), 멸균수 주사액, 덱스트로스 및 락테이트 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물성 고정유, 면실유, 옥수수기름, 참기름 및 땅콩기름을 포함한다. 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살(thimerosal), 벤잘코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 정균(bacteriostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도의 항미생물제가 다중 용량 용기(multiple-dose container)에 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있다. 등장제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 버퍼는 인산염 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 중황산나트륨을 포함한다. 국소 마취제는 프로카인 하이드로클로라이드(procaine hydrochloride)를 포함한다. 현탁제 및 분산제는 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리소르베이트 80(TWEEN^® 80)을 포함한다. 금속이온 봉쇄제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약제학적 담체는 또한 수혼화성 비히클을 위한 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 및 pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.

약제학적 조성물은 대상체에 대한 임의의 투여 경로용으로 제형화될 수 있다. 투여 경로의 특정 예는 비강 내, 경구, 폐, 경피, 피 내, 방광 내 및 비경구를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 종양 내 투여이다. 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사를 특징으로 하는 비경구 투여도 본원에서 고려된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체에 용해 또는 현탁하기에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼과 같은 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 주사제, 용액 및 에멀젼은 또한 하나 이상의 부형제를 포함한다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 또한, 원하는 경우, 투여될 약제학적 조성물은, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해도 향상제, 및, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 사이클로덱스트린과 같은 기타 작용제와 같은 무독성 보조 물질을 소량 함유할 수도 있다.

항체의 비경구 투여용 제제는 주사용 멸균 용액, 멸균 건조 가용성 제품, 예를 들어, 주사정(hypodermic tablet)을 포함하여 사용 직전에 용매와 배합되는 동결건조된 분말, 주사용 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 배합되는 멸균 건조 불용성 제품 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.

정맥 내 투여되는 경우, 적합한 담체는 생리 식염수 또는 인산염 완충 식염수(PBS), 및 예를 들어, 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물과 같은 증점제 및 가용화제를 함유하는 용액을 포함한다.

항체를 포함하는 국소 혼합물은 국소 및 전신 투여에 대해 기술된 바와 같이 제조된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고 크림, 젤, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 폼(foam), 에어로졸, 관주제(irrigation), 스프레이, 좌제, 붕대, 피부 패치(dermal patch) 또는 국소 투여에 적합한 임의의 다른 제형으로 제형화될 수 있다.

본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체는, 예를 들어, 흡입에 의한 것과 같은 국소 적용용 에어로졸로 제형화될 수 있다(예를 들어, 염증성 질환, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드 전달용 에어로졸을 기술하고 있는 미국 특허 제4,044,126호, 제4,414,209호 및 제4,364,923호 참조). 호흡기에 투여하기 위한 이러한 제형은 네뷸라이저용 에어로졸 또는 용액 형태이거나 단독의 또는, 예를 들어, 락토스와 같은 불활성 담체와 배합된 흡입용 초미세 분말일 수 있다. 이러한 경우에, 제형의 입자는 지름이 한 실시양태에서는 50미크론 미만, 한 실시양태에서는 10미크론 미만일 것이다.

본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체는 국소(local/topical) 적용을 위해, 예를 들어, 피부 및 점막, 예를 들어, 눈의 점막에 젤, 크림 및 로션의 형태로 국소 적용하기 위해, 또한 눈에 적용하기 위해 또는 조 내(intracisternal) 또는 척수 내 적용을 위해 제형화될 수 있다. 국소 투여는 경피 전달 및 또한 눈 또는 점막으로의 투여, 또는 흡입 치료를 위해 고려된다. 항체 단독 또는 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 배합된 항체의 비강 용액도 투여될 수 있다.

이온영동 및 전기영동 장치를 포함하는 경피 패치는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 항체를 투여하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 패치는 미국 특허 제6,267,983호, 제6,261,595호, 제6,256,533호, 제6,167,301호, 제6,024,975호, 제6,010715호, 제5,985,317호, 제5,983,134호, 제5,948,433호 및 제5,860,957호에 개시되어 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 용액, 에멀젼 및 기타 혼합물로 투여되기 위해 재구성될 수 있는 동결건조된 분말이다. 이것은 또한 고체 또는 젤로 재구성되고 제형화될 수 있다. 동결건조된 분말은 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 유도체를 적합한 용매에 용해시켜 제조한다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 분말은 멸균 상태이다. 용매는 안정성을 향상시키는 부형제, 또는 분말 또는 분말로부터 제조되는 재구성된 용액의 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 덱스트로스, 소르비톨, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 기타 적합한 작용제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 용매는 버퍼, 예를 들어, 시트레이트, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 한 실시양태에서는 대략 중성 pH에서 당업자에게 공지된 다른 버퍼를 함유할 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 조건 하에서 용액의 후속 멸균 여과에 이은 동결건조는 원하는 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알(vial)에 분배될 것이다. 각 바이알에는 화합물의 단일 용량 또는 다중 용량이 함유될 것이다. 동결건조된 분말은, 예를 들어, 약 4℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건하에 보관할 수 있다.

주사용수를 사용한 이 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여에 사용하기 위한 제형을 제공한다. 재구성을 위해 동결건조된 분말을 멸균수 또는 다른 적합한 담체에 첨가한다. 정확한 양은 선택한 화합물에 따라 다르다. 그러한 양은 경험적으로 결정할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 재구성할 필요가 없는 액체 형태로 공급된다.

본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체 및 본원에서 제공되는 다른 조성물은 또한 치료될 대상체의 신체의 특정 조직, 수용체 또는 기타 영역을 표적으로 하도록 제형화될 수 있다. 많은 이러한 표적화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 모든 표적화 방법이 본 발명의 조성물에서 사용하기 위해 본원에서 고려된다. 표적화 방법의 비제한적인 예는, 예를 들어, 미국 특허 제6,316,652호, 제6,274,552호, 제6,271,359호, 제6,253,872호, 제6,139,865호, 제6,131,570호, 제6,120,751호, 제6,071,495호, 제6,060,082호, 제6,048,736호, 제6,039,975호, 제6,004,534호, 제5,985,307호, 제5,972,366호, 제5,900,252호, 제5,840,674호, 제5,759,542호 및 제5,709,874호를 참조한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체는 종양을 표적으로 한다.

생체 내 투여를 위해 사용되는 조성물은 멸균될 수 있다. 이는, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

1.6 치료 방법

한 측면에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암 치료 방법이 본원에세 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 항체-약물 접합체(예를 들어, 치료제에 결합된 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함함) 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암 치료 방법이 본원에서 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포 또는 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암 치료 방법이 본원에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 이중특이성 항체, 또는 본원에 기술된 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암 치료 방법이 본원에서 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포, 또는 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암 치료 방법이 본원에서 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 또는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)를 포함하는 약제학적 조성물을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암 치료 방법이 제공된다.

특정 실시양태에서, 대상체는, 예를 들어, 영장류(예를 들어, 원숭이 또는 인간)와 같은 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다.

특정 실시양태에서, 치료되는 암은 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 두경부 편평세포암, 간세포암, 난소암, 신경모세포종, 구강암, 갑상선암, 유방암, 육종, 췌장암, 결장암, 위암, 융모암, 고환암, 중피종, 피부암, 신장세포암종, 방광암 또는 자궁경부암이다. 특정 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 특정 실시양태에서, 암은 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병)이다. 특정 실시양태에서, 암은 림프종(lymphoma)이다. 암은 고형 종양 또는 비고형 종양일 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 전이성이다.

특정 실시양태에서, 치료되는 암은 "차가운 종양(cold tumor)"(즉, 일반적으로 췌장 악성 종양(pancreatic malignant tumor)에서 보이는 수준과 유사한, T 세포에 의한 침윤이 낮은 수준인 종양), 예를 들어, 전립선, 유방, 난소, 방광 또는 췌장 종양, 결장직장암(CRC), 두경부 편평세포암(HNSCC), 소세포 폐암 또는 교모세포종(glioblastoma)이다. 특정 실시양태에서, 암은, 예를 들어, 건강한 조직 대조군, 예를 들어, 암과 동일한 조직 또는 기관 유형의 비암성 세포 샘플과 비교하여 VISTA 발현이 높은 차가운 종양이다.

특정 실시양태에서, 치료되는 암은 VISTA-양성 암이고, 즉 검출 가능한 수준의 VISTA를 발현한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 암을 치료하는 방법은 투여 단계 전에, 대상체로부터 종양 생검, 종양 샘플 또는 암 세포 샘플을 수득하고 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 검정을 사용하여 VISTA의 발현 수준을 평가하는 단계를 포함한다. 종양 생검 또는 암 세포 샘플을 수득하기 위해 당업자에게 공지된 기술을 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역조직화학(IHC), 웨스턴 블롯, ELISA 또는 유세포분석을 사용하여 VISTA 발현 수준을 평가한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료된 대상체는 검출 가능한, 예를 들어, 높은 VISTA 발현을 나타내는 종양, 예를 들어, 건강한 조직 대조군, 예를 들어, 암과 동일한 조직 또는 기관 유형의 비암성 세포 샘플과 비교하여 높은 VISTA 발현을 나타내는 종양을 갖는다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포, 또는 본원에 기술된 약제학적 조성물을 암을 앓는 대상체에게 투여하면 다음 효과 중 적어도 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상을 달성한다: (i) 하나 이상의 암 증상의 중증도의 감소 또는 완화; (ii) 암과 관련된 하나 이상의 증상의 지속 기간 감소; (iii) 암과 관련된 증상의 재발 방지; (iv) 대상체의 입원 감소; (v) 입원 기간 단축; (vi) 대상체의 생존율 증가; (vii) 다른 치료의 치료 효과의 향상 또는 개선; (viii) 암과 관련된 하나 이상의 증상의 발생 또는 개시의 억제; (ix) 암과 관련된 증상의 수 감소; (x) 당업계에 잘 알려진 방법으로 평가된 삶의 질 개선; (x) 종양 재발의 억제; (xi) 종양 및/또는 이와 관련된 하나 이상의 증상의 퇴행; (xii) 종양 및/또는 이와 관련된 하나 이상의 증상의 진행 억제; (xiii) 종양 성장의 감소; (xiv) 종양 크기(예를 들어, 부피 또는 지름)의 감소; (xv) 새로 형성되는 종양 형성의 감소; (xvi) 원발성, 국소성 및/또는 전이성 종양의 박멸, 제거 또는 제어; (xvii) 전이의 수 또는 크기의 예방 또는 감소; (xviii) 사망률 감소; (xix) 무재발 생존기간 증가; (xx) 종양의 크기가 유지되고, 예를 들어, 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI), 동적 조영 증강(dynamic contrast-enhanced) MRI(DCE-MRI), X-선 및 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영(PET) 스캔과 같은 당업자가 이용 가능한 통상적인 방법으로 측정할 때 표준 치료의 투여 후 종양의 증가보다 적게 증가하거나 증가하지 않음; 및/또는 (xxi) 대상체의 관해 기간의 증가.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 암 치료 방법은 다음 효과 중 하나, 둘, 셋 또는 그 이상을 초래한다: 완전 반응(complete response), 부분 반응(partial response), 객관적 반응(objective response), 전체 생존기간(overall survival) 증가, 무병 생존기간(disease free survival) 증가, 객관적 반응률(objective response rate) 증가, 종양 진행 시간(time to progression) 증가, 안정(stable disease), 무진행 생존기간(progression-free survival) 증가, 치료 실패까지의 시간(time-to-treatment failure) 증가, 및 하나 이상의 암 증상의 개선 또는 제거. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 암 치료 방법은 전체 생존기간을 증가시킨다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 암 치료 방법은 무진행 생존기간을 증가시킨다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 암 치료 방법은 전체 생존기간 증가 및 무진행 생존기간 증가를 초래한다.

특정 실시양태에서, 완전 반응은 당업자에 의해 이해되는 의미이다. 특정 실시양태에서, 완전 반응은 치료에 대한 반응으로 암의 모든 징후가 사라진 것을 의미한다. 완전 반응은 암이 완치되었음을 의미하지 않을 수 있지만 해당 환자는 관해 상태에 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 방사선학적 연구, 골수, 및 생검 또는 단백질 측정과 같은 공지된 기술에 의해 질환이 검출되지 않으면 암은 완전한 관해 상태에 있는 것이다.

특정 실시양태에서, 부분 반응은 당업자에 의해 이해되는 의미이다. 예를 들어, 부분 반응은 치료에 대한 반응으로 인체의 종양 크기가 감소하는 것을 가리킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 부분 반응은 새로운 병변의 부재하에 모든 측정 가능한 종양 부담(tumor burden)(예를 들어, 대상체에 존재하는 악성 세포의 수, 또는 측정된 종양 덩어리의 벌크 또는 비정상 단클론 단백질의 양)의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소를 가리킨다.

특정 실시양태에서, 전체 생존기간은 당업자에 의해 이해되는 의미이다. 특정 실시양태에서, 전체 생존기간은 진단일 또는 치료 시작일로부터의 기간을 가리킨다. 독성 프로파일이 허용 가능하고 종종 신약 승인을 뒷받침하는 경우 전체 생존기간의 통계적으로 유의미한 개선의 입증은 임상적으로 유의미한 것으로 간주될 수 있다.

몇몇 엔드포인트는 전형적으로 종양 평가를 기반으로 한다. 이러한 엔드포인트는 무병 생존기간(DFS), 객관적 반응률(ORR), 종양 진행 시간(TTP), 무진행 생존기간(PFS) 및 치료 실패까지의 시간(TTF)을 포함한다. 이러한 시간 의존성 엔드포인트에 대한 데이터 수집 및 분석은 종종 간접적인 평가, 계산 및 추정(예를 들어, 종양 측정)을 기반으로 한다.

특정 실시양태에서, 무병 생존기간(DFS)은 당업자에 의해 이해되는 의미이다. 특정 실시양태에서, 무병 생존기간은 암에 대한 1차 치료가 종료된 후 인간 대상체가 암의 어떠한 징후 또는 증상도 없이 생존하는 기간을 가리킬 수 있다. DFS는 생존이 연장되어 생존 엔드포인트가 비실용적으로 된 상황에서 중요한 엔드포인트일 수 있다. DFS는 임상적 이점을 대신할 수 있거나 임상적 이점의 직접적인 증거를 제공할 수 있다. 이를 결정하는 것은 전형적으로 효과의 크기, 위험-이득 관계 및 질환 세팅을 기반으로 한다. DFS의 정의는 복잡할 수 있으며, 특히 사전 종양 진행 문서 없이 사망이 기록된 경우에 그러하다. 이러한 이벤트는 질환 재발 또는 검열된 이벤트(censored event)로 점수를 매길 수 있다. 사망 통계 분석을 위한 모든 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있지만 모든 사망(모든 원인으로 인한 사망)을 재발로 간주하면 편향(bias)을 최소화할 수 있다. DFS는 특히 장기간 관찰 없이 사망한 환자의 경우 이 정의를 사용하여 과대평가될 수 있다. 장기 추적 방문 빈도가 연구 암(study arm) 간에 다르거나 독성으로 인해 탈락이 무작위가 아닌 경우 편향이 도입될 수 있다.

특정 실시양태에서, 객관적 반응률은 당업자에 의해 이해되는 의미이다. 한 실시양태에서, 객관적 반응률은 최소 기간 동안 사전 정의된 양의 종양 크기 감소가 있는 환자의 비율로 정의된다. 반응 기간은 초기 반응 시간부터 문서화된 종양 진행까지 측정할 수 있다. 일반적으로 FDA는 ORR을 부분 반응과 완전 반응의 합으로 정의하였다. 이러한 방식으로 정의할 때 ORR은 단일-암 연구(single-arm study)에서 평가할 수 있는 약물 항종양 활성의 직접적인 척도이다. 가능한 경우, 표준화된 기준을 사용하여 반응을 확인해야 한다. 다양한 반응 기준이 적절한 것으로 간주되었다(예를 들어, RECIST1.1 기준)(예를 들어, Eisenhower 등, 2009, European J. of Cancer, 45: 228-247 참조). ORR의 중요성은 그 크기와 기간, 및 완전 반응(검출 가능한 종양 증거 없음)의 백분율에 의해 평가된다.

특정 실시양태에서, 종양 진행 시간(TTP)은 당업자에 의해 이해되는 의미이다. 특정 실시양태에서, 종양 진행 시간은 암에 대한 진단일 또는 치료 시작일로부터 암이 악화되거나 인체의 다른 부분으로 퍼질 때까지의 기간을 의미한다.

특정 실시양태에서, TTP는 무작위 배정부터 객관적인 종양 진행까지의 시간이고; TTP에는 사망이 포함되지 않는다.

특정 실시양태에서, 무진행 생존기간(PFS)은 당업자에 의해 이해되는 의미이다. 특정 실시양태에서, PFS는 인간 환자가 암을 가지고 생활하지만 암이 악화되지 않는 암 치료 동안 및 치료 후의 기간을 가리킨다. 특정 실시양태에서, PFS는 무작위 배정부터 객관적인 종양 진행 또는 사망까지의 시간으로 정의된다. PFS는 사망을 포함할 수 있으므로 전체 생존기간과 더 잘 연관될 수 있다.

특정 실시양태에서, 치료 실패까지의 시간(TTF)은 당업자가 이해하는 의미이다. 특정 실시양태에서, TTF는 무작위 배정부터 질환 진행, 치료 독성 및 사망을 포함하는 임의의 이유로 치료의 중단까지의 시간을 측정하는 복합 엔드포인트이다.

특정 실시양태에서, RECIST 1.1 기준은 인간 대상체가 본원에 기술된 치료 방법에 얼마나 잘 반응하는지를 측정하는 데 사용된다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따른 치료 효능은 바이오마커를 사용하여 평가될 수 있다. 효능의 지표는, 예를 들어, 골수 수지상 세포(mDC) 빈도의 증가 및/또는 단핵구 및/또는 수지상 세포 활성화의 증가, 및/또는 CD80, CD86 및/또는 HLA-DR의 증가를 포함한다. 또한, 효능의 지표는 특정 실시양태에서 하나 이상의 특정 면역 세포 집단, 케모카인 수준 또는 사이토카인 수준, 또는 환자의 혈액 또는 종양 생검에서 측정된 VISTA 발현의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, CXCL10, MIP1β(CCL2) 및/또는 MCP-1(CCL4)의 증가를 사용하여 치료 효능을 측정한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수용하기 전에 화학요법 및/또는 방사선요법을 받았다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수용하기 전에, 예를 들어, 예정사-1(PD-1) 또는 예정사-리간드 1(PDL1)의 억제제 또는 세포독성 T-림프구 연관 단백질 4(CTLA-4)의 억제제와 같은 면역 체크포인트 억제제로 치료를 받았다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 대상체의 암 치료를 위한 2가지 이상의 치료에 실패했으며, 예를 들어, 상기 암은 2가지 이상의 치료에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 대상체는 암 치료를 위한 하나 이상의 다른 치료에 내성인 암을 가지고 있고; 그러한 다른 암 치료는, 예를 들어, 수술, 방사선, 화학요법 및 표적요법일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 종양은 수술, 방사선요법 및/또는 화학요법에 불응성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 종양은 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 아테졸리주맙(atezolizumab)과 같은 PDL1 억제제, 예를 들어, 펨브롤리주맙(pembrolizumab)과 같은 PD-1 억제제, 또는, 예를 들어 이필리무맙(ipilimumab)과 같은 CTLA-4 억제제)를 사용한 치료에 대해 불응성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 종양은 방사선요법 및/또는 화학요법에 불응성이며, 또한 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, PDL1 억제제, 예를 들어, 이필리무맙과 같은 CTLA-4 억제제, 또는, 예를 들어, 펨브롤리주맙과 같은 항-PD-1 억제제)에 대해 불응성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 종양은 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 소라페닙(sorafenib))를 사용한 치료에 대해 불응성이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 종양은 표적요법(예를 들어, 트라스투주맙(trastuzumab)과 같은 HER-2 억제제; HER3 억제제; 예를 들어, 베바시주맙(bevacizumab)과 같은 VEGF 억제제; 예를 들어, 베무라페닙(vemurafenib)과 같은 BRAF 억제제; 예를 들어, 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate)와 같은 BCR-ABL 융합 단백질 억제제; 예를 들어, MAP 키나제 억제제, MEK 억제제, TGFβ 억제제, EGFR 억제제, mTOR 억제제, 파르네실 트랜스퍼라제(farnesyl transferase) 억제제 또는 글루타티온 S 트랜스퍼라제 억제제와 같은 단일 형질도입 억제제; 또는 아폽토시스 유도제)를 사용하는 치료에 불응성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 종양은 호르몬요법(예를 들어, 아비라테론(abiraterone), 아나스트로졸(anastrozole), 엑세메스탄(exemestane), 플루베스트란트(fluvestrant), 레트로졸(letrozole), 류프로라이드(leuprolide) 또는 타목시펜(tamoxifen))을 사용하는 치료에 불응성이다.

투여 경로 및 투여량

본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기술된 약제학적 조성물은 다양한 경로에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 여기에는 비경구, 비강 내, 기관 내, 경구, 피 내, 국소, 근육 내, 복강 내, 방광 내, 경피, 정맥 내, 결막 및 피하 경로가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 투여는 종양 내 투여이다. 폐 투여는, 예를 들어, 흡입기(inhaler) 또는 네뷸라이저의 사용, 및 스프레이로 사용하기 위한 에어로졸화제와의 제형에 의해서도 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기술된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기술된 약제학적 조성물은 대상체에게 비경구로 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 비경구 투여는 정맥 내, 근육 내 또는 피하이다. 특정 실시양태에서, 정맥 내 투여가 사용된다.

본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포, 또는 병태의 치료에 효과적일 약제학적 조성물의 양은 질환의 성질에 따라 달라질 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.

약제학적 조성물에 사용되는 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체, 또는 CAR을 발현하는 세포의 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 암의 유형에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태(연령, 성별, 체중 및 건강 포함), 환자가 사람인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 또는 치료가 예방적인지 치료적인지에 따라 달라질 수 있다.

특정 실시양태에서, 최적의 투여량 범위를 확인하는 데 도움을 주기 위해 시험관 내 검정이 사용된다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 파생된 용량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.

항체(또는 이의 항원-결합 단편) 또는 항체 약물 접합체의 경우, 전형적으로 투여량은 환자 체중 kg당 약 0.0001 내지 100mg, 더 일반적으로 0.01 내지 15mg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 80kg 환자에 대해 체중 kg당 1mg, 10mg, 30mg 또는 1 내지 30mg 범위 내일 수 있거나, 즉 각각 80mg 또는 2400mg 또는 80-2400mg 범위 내일 수 있다. 특정 실시양태에서, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중 kg당 약 1mg 내지 약 30mg이다. 특정 실시양태에서, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중 kg당 약 1mg 내지 약 3mg이다. 대안적으로, 특정 실시양태에서 본원에 개시된 치료 방법에 사용되는 투여량은 1 내지 500mg, 예를 들어, 10 내지 400mg, 30 내지 300mg, 100 내지 300mg, 200mg 내지 1g, 또는 1g 내지 3g의 범위로, 예를 들어, 인간 환자의 경우 주 1회, 또는 2주 또는 3주마다 1회이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 항체는 3mg, 10mg, 30mg, 100mg 또는 300mg, 또는 100 내지 300mg, 100mg 내지 1g, 200mg 내지 1g 또는 1g 내지 3g의 범위의 용량으로 주 1회, 또는 2주 또는 3주마다 1회로 인간 대상체에게 투여된다. 소아 환자(예를 들어, 18세 미만 환자)의 경우 체중에 따른 투여량이 바람직할 수 있는 반면, 성인 환자의 경우 고정 용량이 바람직할 수 있다.

특정 실시양태에서, 상술된 요법은 진행성 고형 종양이 있는 환자를 치료하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 전이성 또는 재발성 비소세포폐암(NSCLC) 환자를 치료하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 전이성 또는 재발성 두경부 편평세포암(HNSCC) 환자를 치료하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은, 예를 들어, 티로신 키나제 억제제 치료를 포함한 화학요법에 실패한 (예를 들어, NSCLC 또는 HNSCC를 앓는) 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 화학요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 PD-1 또는 PDL1의 억제제를 사용한 치료와 조합된 방사선요법에 실패한 (예를 들어, NSCLC 또는 HNSCC를 앓는) 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 PD-1 또는 PLDL1의 억제제를 사용한 치료와 조합된 방사선요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 방사선요법 및 PD-1 또는 PDL1의 억제제를 사용한 치료와 조합된 화학요법에 실패한 (예를 들어, NSCLC 또는 HNSCC를 앓는) 환자를 치료하는데 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 방사선요법 및 PD-1 또는 PDL1의 억제제를 사용한 치료와 조합된 화학요법에 내성이 있다.

특정 실시양태에서, 상술된 요법은 백금 함유 전신 화학요법에 실패한 재발성 또는 진행성 난소암 또는 자궁경부암 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 백금 함유 전신 화학요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 외과적 절제, 방사선요법, 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈(capecitabine), 젬시타빈(gemcitabine), 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 이리노테칸(irinotecan), 류코보린(leucovorin) 및 파클리탁셀(paclitaxel) 중 하나 이상에 실패한 재발성 또는 진행성 췌장암 환자를 치료하는 데 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 외과적 절제, 방사선요법, 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈, 젬시타빈, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 류코보린 및 파클리탁셀 중 하나 이상에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 외과적 절제, 방사선요법, 화학요법(도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 5-FU, 카페시타빈, 젬시타빈, 독소루비신(doxorubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 카보플라틴(carboplatin), 백금), 호르몬요법(타목시펜, 엑세메스탄(exemestane), 아나스트로졸, 레트로졸, 풀베스트란트(fulvestrant)), 표적요법(트라스투주맙, 라파티닙(lapatinib), 페르투주맙(pertuzumab), 아베마시클립(abemaciclib), 팔보시클립(Palbociclib), 리보시클립(ribociclib), 알페리십(alpelisib), 네라티닙(neratinib), 올라파립(Olaparib), 탈라조파립(talazoparib)) 및 면역 요법(아테졸리주맙(atezolizumab)) 중 하나 이상에 실패한 재발성 또는 진행성 유방암 환자를 치료하는 데 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 외과적 절제, 방사선요법, 화학요법(도세탁셀, 파클리탁셀, 사이클로포스파미드, 5-FU, 카페시타빈, 젬시타빈, 독소루비신, 미톡산트론, 카보플라틴, 백금), 호르몬요법(타목시펜, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 레트로졸, 풀베스트란트), 표적요법(트라스투주맙, 라파티닙, 페르투주맙, 아베마시클립, 팔보시클립, 리보시클립, 알펠리십, 네라티닙, 올라파립, 탈라조파립) 및 면역요법(아테졸리주맙) 중 하나 이상에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 외과적 절제, 방사선요법, 호르몬요법(부사렐린(busarelin), 데가렐릭스(degarelix), 고세렐린(goserelin), 히스트렐린(histrelin), 류프로라이드(leuprolide), 렐루골릭스(relugolix), 트립토렐린(triptorelin), 비칼루타미드(bicalutamide), 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 아비라테론(abiraterone), 아팔루타미드(apalutamide), 엔잘루타미드(enzalutamide)), 화학요법(도세탁셀) 및 면역요법(시푸류셀-T(sipuleucel-T)) 중 하나 이상에 실패한 재발성 또는 진행성 전립선암 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 외과적 절제, 방사선요법, 호르몬요법(부사렐린, 데가렐릭스, 고세렐린, 히스트렐린, 류프로라이드, 렐루골릭스, 트립토렐린, 비칼루타미드, 플루타미드, 닐루타미드, 아비라테론, 아팔루타미드, 엔잘루타미드), 화학요법(도세탁셀) 및 면역요법(시푸류셀-T) 중 하나 이상에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 외과적 절제, 방사선요법, 화학요법(5-FU, 류코보린, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 이리노테칸) 및 표적요법(베바시주맙, 지브-아필버셉트(ziv-afilbercept), 라무시루맙, 세툭시맙(cetuximab) 또는 파니투무맙(panitumumab)) 중 하나 이상에 실패한 재발성 또는 진행성 결장직장암 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 외과적 절제, 방사선요법, 화학요법(5-FU, 류코보린, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 이리노테칸) 및 표적요법(베바시주맙, 지브-아필베르셉트, 라무시루맙, 세툭시맙 또는 파니투무맙) 중 하나 이상에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 외과적 절제, 방사선요법, 5-FU, 에피루비신(epirubicin), 시스플라틴, 옥살리플라틴, 도세탁셀, 카페시타빈, 에토포시드(etoposide), 메토트렉세이트, 류코보린, 트라스투주맙, 니볼루맙(nivolumab) 및 펨브롤리주맙 중 하나 이상에 실패한 재발성 또는 진행성 위암 또는 위식도암 환자를 치료하는 데 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 외과적 절제, 방사선요법, 5-FU, 에피루비신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 도세탁셀, 카페시타빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 류코보린, 트라스투주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 하나 이상에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 신장세포암종, 두경부암 또는 폐암 환자를 치료하기 위해 사용된다.

예시적인 치료 요법은 1년 또는 수년에 걸쳐, 또는 수년 간격으로 주 1회, 2주 또는 3주마다 1회, 또는 월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2개 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 대상체에게 동시에 투여된다. VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체는 보통 여러 차례 투여된다. 투여량은, 예를 들어, 매일, 주 2회, 주 3회, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월, 3개월마다, 6개월마다 또는 매년 주어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에서 제공되는 항체-약물 접합체는 3주마다 1회 투여된다.

병용 요법

특정 측면에서, 본원에 기술된 암 치료 방법은, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 추가 요법을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가 요법은 하나의 추가 요법이고; 대안적으로, 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 하나 초과의 추가 요법을 투여하는 것을 포함한다. 추가 요법(들)은 수술, 방사선, 화학요법, 표적요법 또는 다른 치료제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항암 요법일 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가 요법은 암을 치료하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 추가 요법은 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체, 또는 CAR을 발현하는 세포를 사용한 치료의 임의의 부작용을 치료하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 추가 요법은 본원에서 제공되는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효능을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 면역 세포 요법, 예를 들어, 수지상 세포 또는 TIL이다.

특정 실시양태에서, 추가 요법은 화학요법제 또는 표적요법, 예를 들어, 티로신 키나제 억제제인 암을 치료하기 위한 요법이다. 특정 실시양태에서, 추가 요법은 면역 체크포인트 억제제이다. 특정 실시양태에서, 추가 요법은 B7H7, OX40, CD27, CD70, CD137 (4-1BB), CD137L, CD40, OX40L, CD160, GITR, GITR-L, ICOS, ICOSL, CD80 또는 CD86의 작용제(agonist)이다. 특정 실시양태에서, 추가 요법은 CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, B7H3, B7H4, B7H6, BTLA, TIGIT, LAIR1, 2B4 (CD244), CD47, SIRPα, ILT4, TGFβ, TGFβ-R, VSIG3, VSIG8, LRIG1, PSGL1, CEACAM, HVEM, 갈렉틴(Galectin)-9 또는 FLG-1의 작용제이다

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 본원에 기술된 암 치료 방법은 대상체에게 항-PD1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙, 세미플리맙, 피딜리주맙 또는 니볼루맙), 또는 항-PD-L1 항체(예를 들어, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르바니압(durvaniab), BMS-936552 또는 CK-301), 또는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 이필리무맙)를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포는 항-PD-1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙)와 조합하여 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 두 요법은 동시에, 예를 들어, 같은 날에, 선택적으로 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 두 요법은 같은 날에, 예를 들어, 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 200mg의 용량으로 인간 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 항체(또는 이의 항원-결합 단편 또는 접합체)는 처방 정보에 인쇄된 용량 및 용량 간격으로 항 PD-1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙)와 동시에 30mg, 100mg, 300mg, 1g 또는 3g, 또는 100 내지 300mg, 200mg 내지 1g, 300mg 내지 1g 또는 1g 내지 3g 범위의 용량으로 인간 대상체에게 매주, 격주로 또는 3주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 항체(또는 이의 항원-결합 단편 또는 접합체)는 0.2 내지 3g 범위의 용량으로 성인 인간 대상체에게 주 2회 내지 3주마다 1회, 선택적으로 주 1회, 2주 또는 3주마다 1회, 더 선택적으로 3주마다 1회 투여되고, 선택적으로 대상체는 적어도 5회 용량을 제공받는다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 진행성 고형 종양 환자를 치료하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 전이성 또는 재발성 비소세포폐암(NSCLC) 환자를 치료하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 전이성 또는 재발성 두경부 편평세포암(HNSCC) 환자를 치료하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 재발성 또는 진행성 간세포암(HCC), CRC 또는 결장암 환자를 치료하기 위해 사용되며, 선택적으로 상기 환자는 소라페닙 단독, 또는 PD-1 또는 PDL1의 억제제와의 조합에 실패했으며, 예를 들어, 상기 암은 소라페닙 단독, 또는 PD-1 또는 PDL1의 억제제와의 조합에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 전이성 또는 재발성 난소암 환자를 치료하기 위해 사용되며, 선택적으로 상기 환자는 적어도 2개의 이전 요법에 실패했으며, 예를 들어, 상기 암은 적어도 2개의 이전 요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 전이성 또는 재발성 자궁경부암 환자를 치료하기 위해 사용되며, 선택적으로 상기 환자는 적어도 2개의 이전 요법에 실패했으며, 예를 들어, 상기 암은 적어도 2개의 이전 요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 이전 화학요법(예를 들어, 카보플라틴 및 파클리탁셀)에 실패한 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 화학요법(예를 들어, 카보플라틴 및 파클리탁셀)에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 PD-1 또는 PDL1의 억제제를 사용한 요법과 조합된 방사선요법에 실패한 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 PD-1 또는 PDL1의 억제제를 사용한 요법과 조합된 방사선요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 방사선요법 및 PD-1 또는 PDL1 억제제를 사용한 요법과 조합된 화학요법에 실패한 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 방사선요법 및 PD-1 또는 PDL1 억제제를 사용한 요법과 조합된 화학요법에 내성이 있다.

특정 실시양태에서, 상술된 요법은 비편평 조직학을 가지고 있고 이전 화학요법(예를 들어, 카보플라틴/파클리탁셀 또는 카보플라틴/프리메트렉시드(premetrexed)) 및/또는 PD-(L)-1 억제제 요법에 실패한 진행성/재발성 질환을 앓는 NSCLC 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 이전 화학요법(예를 들어, 카보플라틴/파클리탁셀 또는 카보플라틴/프리메트렉세드) 및/또는 PD-(L)-1 억제제 요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, EGFR 돌연변이가 있는 암을 가지고 있고 이전의 EGFR 티로신 키나제 억제제 요법에 실패한 환자가 치료되며, 예를 들어, 상기 암은 EGFR 티로신 키나제 억제제 요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 이전의 ALK 억제제 요법에 실패한 ALK 전위가 있는 암을 가지고 있는 환자가 치료되며, 예를 들어, 상기 암은 ALK 억제제 요법에 내성이 있다.

특정 실시양태에서, 상술된 요법은 조직학적으로 확인되고 치료 불가능하며 국소 진행성, 재발성 및/또는 전이성인 HNSCC를 치료하는 데 사용된다. 환자는 이전의 백금 함유 요법에 실패했을 수 있고/있거나(예를 들어, 상기 암은 백금 함유 요법에 내성이 있음) 치료 의도가 있는 추가 방사선 또는 수술 요법의 후보가 아닐 수 있다.

특정 실시양태에서, 상술된 요법은 진행성이고 이전 소라페닙 요법에 실패한 간세포암을 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 소라페닙에 대해 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 이전의 백금 기반 요법에 실패한 재발성 또는 전이성 자궁경부암 환자를 치료하기 위해 사용되며, 예를 들어, 상기 암은 백금 기반 요법에 내성이 있다. 특정 실시양태에서, 상술된 요법은 백금 함유 전신 요법 후에 진행된 난소암을 치료하기 위해 사용된다.

특정 실시양태에서 본원에서 제공되는 치료 방법은 대상체를 화학요법제 및 면역 체크포인트 억제제로 치료하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PDL1 또는 세포독성 T-림프구 연관 단백질 4(CTLA-4)의 억제제이다.

본원에 기술된 바와 같은 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체, 또는 CAR을 발현하는 세포는 추가 요법과 동시에 및/또는 순차적으로(전 및/또는 후에) 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체, 또는 세포와 추가 요법은 동일하거나 상이한 조성물로, 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 제1 요법(예를 들어, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 추가 요법)은 제2 요법(예를 들어, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 추가 요법)의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 암을 앓는 대상체에게 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 제1 요법(예를 들어, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 추가 요법)은 제2 요법(예를 들어, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 추가 요법)과 같은 날, 같은 주 또는 같은 달에 암을 앓는 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 요법(예를 들어, VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 추가 요법)은 제2 요법(예를 들어, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 추가 요법)을 투여한 지 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 이내에 암을 앓는 대상체에게 투여된다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 조합하여 대상체에게 투여되는 추가 요법은 동일한 조성물(약제학적 조성물)로 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 조합하여 투여되는 추가 요법은 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 상이한 조성물로 대상체에게 투여된다(예를 들어, 2개 이상의 약제학적 조성물이 사용됨).

1.7 키트

또한, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 본원에 기술된 항체-약물 접합체(예를 들어, 치료제에 결합된 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함함), 또는 본원에 기술된 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물의 성분 중 하나 이상, 예를 들어, 본원에 기술된 VISTA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 의약품 팩 또는 키트가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 약제학적 조성물 및 예방제 또는 치료제를 함유한다.

이러한 용기(들)와 선택적으로 연관된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형식의 통지, 투여형 및/또는 사양서일 수 있다. 특정 실시양태에서, 키트에 포함된 사양서는 약제학적 조성물(들)의 투여를 위한 투여량 및/또는 투여 요법에 관한 사양서를 제공한다.

의약품 포장 재료의 예는 블리스터 팩(blister pack), 병, 패킷(packet), 사 셰(sachet), 튜브(tube), 흡입기, 펌프(pump), 백(bag), 바이알, 용기, 주사기, 및 선택된 약제학적 조성물과 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장 재료를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 제공되는 키트는 활성 성분을 투여하는 데 사용되는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 장치의 예는 주사기, 바늘 없는 주사기(needle-less injector), 드립 백(drip bag), 패치 및 흡입기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 제공되는 키트는 성분을 투여하는 데 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 성분이 비경구 투여를 위해 재구성되어야 하는 고체 형태로 제공되는 경우, 키트는 성분이 용해되어 비경구 투여에 적합한 미립자가 없는 멸균 용액을 형성할 수 있거나 경구 투여를 위한 현탁액으로 재구성될 수 있는 적합한 비히클의 밀봉된 용기를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 비히클의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 주사용수 USP, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사액, 및 락테이트 링거 주사액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수성 비히클; 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수혼화성 비히클; 및 옥수수기름, 면실유, 땅콩기름, 참기름, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는 비수성 비히클.

실시예

이 섹션에 기술된 실시예는 설명을 위해 제공된다.

실시예 1: VISTA 단백질에 대해 생성된 항체

면역화: 인간 면역글로불린 유전자가 삽입된 5마리의 트랜스제닉 마우스(Trianni^® 마우스; WO 2012/018610 A2 참조)를 보조제로서 ALD/MDP(알하이드로겔/무라밀 디펩티드(alhydrogel/muramyl dipeptide))를 사용하여 인간 VISTA(서열번호 378)의 가용성 세포 외 도메인(ECD)(VISTA-ECD 단백질(R&D Systems)에서의 His 태그 제외)으로 면역화하였다. 10μg의 면역원을 4주 동안 주 2회 각 마우스의 발바닥에 주사하였다. 항체 역가는 1000ng/mL에서 시작하여 각 동물 혈청의 1:3 희석 시리즈를 사용하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 평가하였다. 보조제가 없는 10μg 가용성 VISTA-ECD의 두 가지 최종 발바닥 부스트를 수확 전에 각 동물에게 제공하였다. 희생 후 림프절(슬와(popliteal), 서혜부(inguinal), 겨드랑이(axillary) 및 장간막(mesenteric)), 비장 및 골수를 수집하였다. 수동 파쇄 후 70μm 메쉬 필터를 통과시켜 각 동물 조직에 대한 단일 세포 현탁액을 만들었다. EasySep™ Mouse Pan-B Cell Isolation Kit(Stemcell Technologies)인 음성 선택 키트(negative selection kit)를 사용하여 림프절과 비장에서 B 세포를 단리한 반면, 마우스 CD138+(Miltenyi Biotec) 양성 선택 키트(positive selection kit)를 사용하여 골수에서 B 세포를 단리하였다. B 세포 집단은 C-Chip 혈구계산판(hemocytometer)(Incyto)으로 계수하여 정량화하고 트립신 블루(Trypan blue)를 사용하여 생존력을 평가하였다. 이어서, 세포를 12% OptiPrep™ 밀도 차등 배지(Density Gradient Medium)(Sigma)를 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)에서 5,000-6,000개의 세포/mL로 희석하였다. 이 세포 혼합물은 미세유체 캡슐화에 사용되었다. 각각의 면역화된 동물로부터의 약 100만 개의 B 세포를 에멀젼 액적 미세유체 플랫폼(emulsion droplet microfluidics platform)을 통해 실행하였다.

쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 라이브러리의 제조: 온전한 천연 중-경쇄 Ig 쌍을 갖는 scFv를 암호화하는 DNA 라이브러리를 에멀젼 액적 미세유체 플랫폼 또는 와류 에멀젼(vortex emulsion)을 사용하여 단일 세포의 RNA로부터 생성하였다. DNA 라이브러리 생성 방법은 1) 폴리(A) + mRNA 포획, 2) 멀티플렉스 중복 확장 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(multiplexed overlap extension reverse transcriptase polymerase chain reaction)(OE-RT-PCR), 3) 아티팩트(artifact)를 제거하고 딥 시퀀싱(deep sequencing) 또는 효모 디스플레이 라이브러리(yeast display libraries)를 위한 어댑터(adapter)를 추가하는 네스티드(nested) PCR로 나누었다. scFv 라이브러리는 양성 ELISA 역가를 달성한 5마리 동물 각각으로부터의 약 400,000개의 B 세포(림프절 및 비장) 또는 30,000개의 B 세포(골수)에서 생성되었다.

폴리(A) + mRNA 포획을 위해, 이전에 기술된 바와 같이 맞춤 설계된 동축류 에멀젼 액적 미세유체 칩을 사용하였다(Asensio MA, 등, Antibody repertoire analysis of mouse immunization protocols using microfluidics and molecular genomics. Mabs. 2019 11(5):870-883 참조). 미세유체 칩에는 오일용 투입 채널 2개, 상술된 세포 현탁액 믹스용 투입 채널 1개, 및 세포 용해 버퍼(20mM Tris pH 7.5, 0.5M NaCl, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.5% Tween-20 및 20mM 디티오트레이톨) 중 1.25mg/ml의 올리고-dT 비드(NEB)용 투입 채널 1개가 있다. Pico-Break(Dolomite)를 사용하여 액적으로부터 비드를 추출하였다.

멀티플렉스 중복 확장 실시간 중합효소 연쇄 반응(multiplex overlap extension real time polymerase chain reaction)(OE-RT-PCR)을 위해, 유리 Telos 액적 에멀젼 미세유체 칩(Dolomite)을 사용하였다. mRNA이 결합된 비드를 광유 기반 계면활성제 믹스(GigaGen)와 함께 OE-RT-PCR 믹스에 재현탁시켰다. OE-RT-PCR 믹스는 2x 1단계 RT-PCR 버퍼, 2.0mM MgSO4, Superscript Ⅲ 역전사효소, 및 Platinum Taq(Thermo Fisher Scientific)와 IgK C 영역, IgG C 영역 및 모든 V 영역에 대한 프라이머 혼합물을 함유한다. 중첩 영역은 Gly-Ser이 풍부한 scFv 링커 서열을 암호화하는 DNA 서열이었다. PCR 방법 및 프라이머는 이전에 기술된 바와 같다(Adler AS 등, Rare, high-affinity anti-pathogen antibody from human repertoires, discovered using microfluidics and molecular genomics. Mabs. 2017 9(8):1282-1296 참조). 액적 파괴 용액(droplet breaking solution)(GigaGen)을 사용하여 액적에서 DNA 단편을 회수한 다음 QIAquick PCR 정제 키트(Purification Kit)(Qiagen)를 사용하여 정제하였다.

네스티드 PCR의 경우, 정제된 OE-RT-PCR 산물을 먼저 150V에서 80분 동안 1.7% 아가로스 젤에서 실행하였다. 연결된 산물에 해당하는 1200-1500개의 염기쌍(bp) 밴드를 잘라내고 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up Kit(Macherey Nagel)를 사용하여 정제하였다. 이어서, Illumina 시퀀싱 또는 효모 디스플레이를 위한 어댑터를 추가하기 위해 PCR을 수행하였다; 시퀀싱의 경우, 후속 차세대 시퀀싱 단계에서 염기 콜링 정확도(base calling accuracy)를 높이기 위해 7개의 뉴클레오티드 랜더머(randomer)를 추가하였다. 2x NEBNext High-Fidelity 증폭 믹스(NEB)로 네스티드 PCR을 Illumina 어댑터 함유 프라이머 또는 효모 발현 벡터 내에 클로닝하기 위한 프라이머와 함께 수행하였다. 네스티드 PCR 산물을 150V에서 50분 동안 1.2% 아가로스 젤에서 실행하였다. 800-1100개의 bp 밴드를 잘라내고 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up Kit(Macherey Nagel)를 사용하여 정제하였다.

FACS 분석을 위한 항원 제조: 인간 IgG1-Fc(Thermo Fisher Scientific) 및 VISTA-ECD-His(R&D Systems) 단백질을 EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 비오티닐화하였다. 비오티닐화 시약을 9mM로 재현탁시키고 50배 몰 과량으로 단백질에 첨가하였다. 반응물을 얼음 위에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 Zeba 탈염 컬럼(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 비오티닐화 시약을 제거하였다. 최종 단백질 농도는 Bradford 검정으로 계산하였다.

효모 라이브러리 스크리닝: 효모 디스플레이 DNA 스크리닝 라이브러리를 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다(Adler AS 등 Rare, high-affinity anti-pathogen antibodies from human repertoires, discovered using microfluidics and molecular genomics. Mabs. 2017 9(8):1282-1296 참조). GAL1/10 프로모터, Aga2 세포벽 테더(tether) 및 C-말단 c-Myc 태그를 함유하는 효모 표면 디스플레이 벡터(pYD)를 구축하였다. GAL1/10 프로모터는 갈락토스를 함유하는 배지에서 scFv 단백질의 발현을 유도한다. Aga2 세포벽 테더는 scFv를 효모 세포 표면으로 이동시키고 scFv를 세포 외 공간에 테더링하는 데 필요하였다. 인프레임(in-frame) scFv 단백질을 발현하는 효모 세포를 염색하기 위해 유동 분류(flow sort) 중에 c-Myc 태그를 사용되었다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 세포(ATCC)를 생체 내 상동 재조합을 위해 젤 정제된 네스티드 PCR 산물 및 선형화된 pYD 벡터로 전기천공하였다(Bio-Rad Gene Pulser Ⅱ; 0.54kV, 25uF, 무한대로 설정된 저항). 형질전환된 세포를 확장하고 갈락토스로 유도하여 효모 scFv 디스플레이 라이브러리를 생성하였다.

확장된 scFv 라이브러리의 2백만개의 효모 세포를 항-c-Myc(Thermo Fisher Scientific A21281) 및 AF488-접합된 2차 항체(Thermo Fisher Scientific A11039)로 염색하였다. VISTA-ECD에 결합하는 scFv-발현 세포를 선택하기 위해, 비오티닐화 VISTA-ECD 항원을 1차 항체 인큐베이션 동안 효모 배양물(최종 250nM)에 첨가한 다음 PE-스트렙트아비딘(Thermo Fisher Scientific)으로 염색하였다. 이중-양성 세포(AF488+/PE+)에 대해 효모 세포를 BD Influx(Stanford Shared FACS Facility)에서 유동 분류한 다음, 확장을 위해 회수된 클론을 카나마이신, 스트렙토마이신 및 페니실린(Teknova)과 함께 SD-CAA 플레이트에 플레이팅하였다. 이어서, 확장된 첫 번째 라운드 FACS 클론을 동일한 몰농도(최종 250nM)에서 동일한 항원을 사용하여 두 번째 FACS 라운드에 적용하였다. 최종 FACS 분류에서 회수한 효모로부터 플라스미드 미니프렙(plasmid miniprep)(Zymo Research)을 제조하였다. Tailed-end PCR을 사용하여 딥 시퀀싱을 위한 플라스미드 라이브러리에 Illumina 어댑터를 추가하였다.

딥 레퍼토리 시퀀싱(Deep repertoire sequencing): 정량적 PCR Illumina Library Quantification Kit(KAPA)를 사용하여 딥 항체 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 17.5pM으로 희석하였다. 제조업체의 사양서에 따라 500주기 MiSeq Reagent Kit v2를 사용하여 MiSeq(Illumina)에서 라이브러리를 시퀀싱하였다. 유지된 중쇄 및 경쇄 연결로 고품질 서열 판독을 수득하기 위해, 시퀀싱을 두 번의 개별 실행으로 수행하였다. 첫 번째 실행("연결된 실행(linked run)")에서, scFv 라이브러리를 직접 시퀀싱하여 경쇄 V-유전자 및 CDR3에 대한 340주기의 정방향 판독과 중쇄 CDR3 및 중쇄 V-유전자의 일부를 포함하는 162주기의 역방향 판독을 수득하였다. 두 번째 실행("연결되지 않은 실행(unlinked run)")에서는 먼저 scFv 라이브러리를 중쇄 및 경쇄 V-유전자를 별도로 증폭하기 위한 PCR용 주형으로 사용하였다. 이어서, 중쇄 및 경쇄 Ig에 대한 251주기의 중복된 정방향 및 역방향 판독을 별도로 수득하였다.

염기 콜 오류(base call error)를 제거하기 위해, 예상된 판독 오류 수(E)를 Phred 점수로부터 계산하였다. 기본적으로 E >1인 판독은 폐기하여 베이스 콜 오류가 발생할 가능성이 가장 높은 수가 0인 판독을 남겼다. 추가의 품질 필터로서, 두 번 이상 발견된 서열이 정확할 확률이 높기 때문에 싱글톤 뉴클레오티드(singleton nucleotide) 판독은 폐기하였다. 마지막으로, 연결된 실행과 연결되지 않은 실행으로부터 필터링된 서열을 병합하여 고품질의 연결된 항체 서열을 생성하였다.

리딩 프레임(reading frame) 및 FR/CDR 접합부를 확인하기 위해, 잘 엄선된 면역글로불린 서열의 데이터베이스(Le Franc MP, 등 IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucl. Acids Res. 2019 37:D1006-10012)를 먼저 처리하여 각 FR/CDR 접합부에 대한 위치 특이적 서열 매트릭스(position-specific sequence matrix, PSSM)를 생성하였다. 이러한 PSSM은 상술된 과정을 사용하여 생성된 병합된(merged) 뉴클레오티드 서열 각각에 대한 FR/CDR 접합부를 확인하는 데 사용하였다. 이것으로 각 뉴클레오티드 서열에 대한 단백질 리딩 프레임을 확인하였다. 유효한 예측 CDR3 서열을 갖기 위해 판독이 필요했기 때문에, 예를 들어, V 세그먼트와 J 세그먼트 사이의 프레임 시프트(frame-shift)가 있는 판독은 폐기하였다. 다음으로, scFv 뉴클레오티드 서열을 질의(queries)로 사용하고 IMGT 데이터베이스의 V 및 J 유전자 서열을 기준 서열로 사용하여 UBLAST를 실행하였다. E 값이 가장 낮은 UBLAST 정렬을 사용하여 V 및 J 유전자 패밀리를 지정하고 생식계열에 대한 ID %를 계산하였다.

효모 라이브러리의 FACS 농축 및 후속 서열 데이터 분석으로 107개의 고유 scFv 서열을 확인하였다. 쌍별 정렬을 사용하여 scFv 서열을 CDR3 서열의 유사성에 기초하여 클레드(clade) 내로 클러스터링하였다. 전장 인간 IgG1 단클론 항체를 확인된 scFv 서열로부터 재형식화하였다.

실시예 2: HEK293 세포에서 단클론 항체의 생성 및 특성분석

단클론 항-VISTA 항체를 HEK293 세포에서 생성하였다. 각 항체에 대한 서열을 코돈 최적화하였고 pcDNA3.4의 Eco RI 및 Hind Ⅲ 부위 내로 클로닝하였다. 각각의 중쇄 및 경쇄 서열을 개별적으로 클로닝하였다. 형질감염 등급 플라스미드 DNA를 표준 방법에 따라 제조하였다. Expi293F(Thermo Fisher Scientific) 세포를 오비탈 진탕기의 삼각 플라스크(Erlenmeyer Flask)(Corning Inc) 내 무혈청 Expi293 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)에서 8% CO₂ 중 37℃에서 성장시켰다. 형질감염 하루 전에 상기 세포를 최적의 밀도(3×10⁶개의 세포/mL)로 시딩하고 다음날 제조업체 권장 조건에 따라 상용 형질감염 시약(Expifectamine)을 사용하여 항체 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 약 16-18시간에, ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 1 및 ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 2를 각 플라스크에 첨가하고, 형질감염된 배양물을 수확 전 6일 동안 인큐베이션하였다. 세포 펠릿을 원심분리한 후 배지를 여과하여 세포 배양액을 수집하였다. 소규모 생성을 위해, RoboColumn Eshmuno A(EMD Millipore), PreDictor RoboColumn MabSelect Sure(Cytiva/GE), HiTrap MabSelect SuRe(Cytiva/GE) 또는 HiTrap MabSelect SuRe LX(Cytiva/GE)의 4개 컬럼 중 하나에서 배양 상청액으로부터 항체를 정제하였다. 상기 컬럼은 제조업체의 권장 사항에 따라 항체 정제에 사용하였으며, 생성된 용출액은 인산염 완충 식염수(pH 7.4)로 버퍼 교환시켰다. 샘플은 280nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 분석하고 SDS-PAGE로 순도를 분석하였다. LAL Endotoxin Assay Kit(Bioendo)를 사용하여 내독소 수준을 평가하였다.

MabSelect SuRe LX 및 HiLoad 16/600 Superdex200pg 컬럼을 사용하여 대규모 벤치 규모 산물(최대 500mL의 배지)을 정제하고 위와 같이 순도 및 단백질 농도를 평가하였다. 또한, 샘플 순도는 염소 항-인간 IgG-HRP(Genescript) 또는 염소 항-인간 카파-HRP(SouthernBiotech)를 사용하는 웨스턴 블롯 및 0.1mol/L 인산염 버퍼 pH 6.7 중 0.1mol/L Na₂SO₄로 분해되는 Tosoh TSKgel G3000SWxl 7.8 X 300mm 컬럼 상에서 SEC-HPLC로 측정하였다.

실시예 3: CHO 세포에서 단클론 항체의 생성 및 특성분석

CHO 세포에서 항체 생성을 위한 DNA 플라스미드를 Qiagen Endofree Maxi Kit(카탈로그 번호 12362), Sigma Aldrich GenElute High (HP) Endotoxin Free Maxi Plasmid Purification Kit(카탈로그 번호 NA0410) 또는 Invitrogen PureLink Expi Endotoxin-Free Maxi Plasmid Purification Kit(카탈로그 번호 A31217)를 사용하여 대장균 DH5.알파의 밤새 배양물로부터 제조하였다. 각 키트에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 플라스미드 DNA를 제조하였다. 13mm×0.22μm 필터(Foxx Life Sciences 카탈로그 번호 371-2115)를 사용하여 플라스미드 DNA를 멸균 여과하였다. NanoDrop 장비(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 DNA 농도를 알아냈다. Expi-CHO 발현 세포주는 Thermo Fisher Scientific(카탈로그 번호 A29133)에서 구입하였다. Expi-CHO 세포는 37℃ 및 8% CO₂에서 삼각 진탕 플라스크 내 ExpiCho Expression Medium(Thermo)에서 증식시켰고 4-6×10⁶개의 세포/mL의 최대 세포 밀도까지 125RPM으로 진탕하였다. 세포 집단의 일상적인 확장을 위해, 세포 배양물을 0.1-0.5×10⁶개의 세포/mL로 희석하였다. 세포는 중쇄 및 경쇄 항체 각각으로부터의 0.5μg/mL의 플라스미드 DNA로 6×10⁶개의 세포/mL의 밀도로 형질감염시켰다. 형질감염 1일 후 ExpiCHO 인핸서를 배양액에 첨가하고, 후속 성장을 위해 세포를 32℃ 및 5% CO₂로 옮겼다. 형질감염 5일 후 ExpiCHO 인핸서를 다시 첨가하고, 생존율이 ≤75%가 될 때까지 동일한 조건 하에서 세포를 성장시켰고, 이때 배양물을 수확하였다.

CHO 세포를 원심분리로 제거하고, 배양 상청액을 0.2μm 필터를 통해 여과하였다. PROchievA 재조합 단백질 A 수지(J.T. Baker, 카탈로그 번호 JT7899)를 사용하여 GE AKTA FPLC로 배양 배지로부터 단클론 항체를 정제하였다. 단백질 A 컬럼을 20mM NaPO₄ 일염기성 pH 7.4(EMD 카탈로그 번호 SX-0710-3)로 평형화시켰다. 세포 배양물 상청액을 컬럼에 적용하고, 단백질 A 수지를 20mM NaPO₄ 일염기성 pH 7.4로 세척하고, 결합된 항체를 0.10M 시트르산 pH 3.0(EMD, 카탈로그 번호 1.00242.0500)으로 용출시켰다. 항체 용출 분획을 수집하고 1/5 부피의 1M Tris HCl pH 9.0(JT Baker, 카탈로그 번호 4103-01)으로 중화시켰다. 정제된 항체를 함유하는 분획을 Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛(카탈로그 번호 UFC905024)으로 또는 PBS pH 7.4에 대한 투석으로 버퍼 교환하였다.

MES 실행 버퍼(Thermo Fisher Scientific)에서 전기영동된 프리캐스트 1mm 4-12% Bis-Tris 젤(Thermo Fisher Scientific)에 대한 환원 및 비환원 조건 하에 SDS-PAGE로 정제된 항체를 평가하였다. 젤을 쿠마시 블루로 염색하고 이미지화하였다. 또한, 정제된 항체는 이동상으로 0.2M 인산나트륨 pH 6.7을 사용하여 Tosoh TSKgel G3000SWXL 컬럼에서 220nm에서 SEC-HPLC로 평가하였다. 내독소 오염은 Charles River Endosafe PTS100을 사용하여 측정하였다.

실시예 4: Octet을 이용한 항체 친화도 측정

Octet 스카우팅(scouting): Octet Red 96(ForteBio) 시스템에서 바이오층 간섭법(BLI)을 사용하여 항체 친화도를 측정하였다. 항-인간 IgG Fc 포획(AHC) 딥 및 판독 센서(ForteBio)를 사용하여 IgG1 또는 IgG4로서 포맷되고 PBS pH 7.4에서 20μg/mL로 희석된 각 항-VISTA 항체를 포획하였다. AHC 센서로 각 IgG를 포획하기 위해 센서를 180초 동안 항체 용액에 담갔다. 추가 120초 동안 PBS pH 7.4에 각 센서를 담가서 초기 기준선을 설정하였다. HEK 293 세포(Sino Biological)에서 발현되고 PBS pH 7.4에서 50nM-300nM로 희석된 His-태그된 재조합 VISTA-ECD(Met 1에서 Ala 194)로 초기 친화도 스크리닝을 수행하였다. 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 마우스 VISTA-ECD를 평가하였다. 연구는 240초 동안 VISTA-ECD와의 결합 및 360초 동안 PBS pH 7.4에서의 해리로 수행하였다. 데이터 분석은 Octet 데이터 분석 소프트웨어 버전 9.0.0.14를 사용하여 수행하였다. 일반적으로, 원시 데이터(raw data) 처리에는 차감 없는 기준선 정렬을 사용하였다. Savitzky-Golay 디지털 필터를 사용하여 고주파 노이즈를 제거하고 처리된 데이터를 전체적으로 1:1 결합 모델에 피팅하였다. 결합이 존재하는 경우, 각 항체-항원 쌍에 대해 친화도 상수(K_D)를 계산하였다.

일부 경우에, Anti-Penta-His(HIS1K, ForteBio) 센서에서 VISTA-ECD를 포획하고 고정된 VISTA-ECD에 대한 항-VISTA 항체의 결합 키네틱을 측정함으로써 친화도보다는 결합활성(avidity)을 측정하였다.

각 항체에 대한 대표적인 데이터가 도 1a-1n, 2a-2g 및 3a-3g, 및 표 14 및 표 15에 나타나 있다. 여러 독립 실험의 데이터는 각 표에서 별도의 행으로 표시되어 있다. 각 항체는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 VISTA-ECD 모두에 대해 낮은 nM 친화도로 강력하게 결합하였다. 어떤 항체도 마우스 VISTA-ECD에 대한 측정 가능한 결합을 나타내지 않았으며 마우스에 대한 K_D 값은 계산되지 않았다. 2가 항체에 대해 예상한 바와 같이, Octet 포맷이 역전되었을 때 결합활성은 친화도보다 컸다.

Octet 검정에서 리간드 로딩 수준의 효과를 결합 단계에서 0.2 및 0.6nm의 신호 시프트를 제공하는 조건 하에서 평가하였다. 일반적으로, 센서의 리간드 로딩 농도가 감소하면 K_D 값이 2~3배 낮아졌다.

항체 친화도에 대한 pH의 효과: pH 7.4에서 VISTA에 결합된, 세포 표면 발현된 VISTA와 일치하지만 엔도좀 pH에서 수용체로부터 해리된 항체를 확인하기 위해, pH 7.4에서 측정된 리간드 결합 및 pH 6에서 측정된 해리로 Octet를 수행하였다. 표 16은 단일 실험에서 pH 7.4에서 7개 항체에 대한 평균 K_on(1/Ms) 및 K_dis(1/s)를 동일한 항체에 대한 온-레이트(on-rate)(pH 7.4) 및 오프-레이트(off-rate)(pH 6)와 비교한 것이다. 결과는 표에 나와 있다. 여러 항체에 대한 해리 상수는 pH 6에서 증가하며, 이는 이러한 항체가 pH 7.4에서 세포 표면 발현된 VISTA에 단단히 결합하지만 pH <6에서는 엔도좀 VISTA로부터 해리될 것임을 시사한다.

전체 키네틱 분석: 결합 친화도의 전체 키네틱 분석은 0-500nM의 분석물 농도의 2배 연속 희석에 걸쳐 Octet 시스템을 사용하여 BLI로 수행하였다. Octet 시스템 데이터 분석 소프트웨어의 정상 상태 분석 도구를 사용하여 평형 결합 상수를 계산하였다. 분석은 0.05 < R_eq < 0.5nm의 결합 트레이스에서 수행하였다. 이러한 방식으로 추정된 항체 결합 친화도는 도 4a-4g 및 표 17에 나와 있으며 Octet 스카우팅 연구와 일치한다.

실시예 5: ELISA에 의한 항체 친화도 결정

니켈 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트(Thermo Scientific) 또는 Maxisorb 96-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 0.1M NaHCO₃ pH 9.6 중 His-태그된 VISTA 단백질(SinoBiological, HE293 세포에서 생성된 Met1-Ala194)의 0.5-1μg/mL 용액 50 μL로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 모든 후속 인큐베이션은 실온에서 수행하였다. 웰을 PBST(0.05% Tween 20)로 3회 세척하고 PBST 중 5% BSA 200μL로 2시간 동안 차단하였다. 항-VISTA 항체를 PBST 중 0.5% BSA에서 2-23μg/mL로 희석하고 0.5% BSA/PBST에서 5배 연속 희석으로 10-0.003μg/mL로 만들었다. 각 항체 희석액을 50-100μL/웰로 ELISA 플레이트에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 1:20,000으로 희석한 비오틴 SP AffiniPure 당나귀 항-인간(Biotin SP AffiniPure Donkey Anti-Human) IgG(H+L) 다클론 항체(Jackson ImmunoResearch, 50-100μL/웰)와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBST로 3회 세척하고, 플레이트를 1:200으로 희석한 스트렙트아비딘-HRP(R&D Systems) 50-100μL와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBST로 3회 세척하고 100μL의 1-Step Ultra Fast TMB 기질(Thermo Scientific)로 2분 동안 현상하였다. 100μL의 2N H₂SO₄로 반응을 중단하고 플레이트 웰 흡광도를 450nm에서 측정하였다(Biotek ELx808).

인간 VISTA 결합 데이터의 경우, log 변환된 용량-반응 데이터의 비선형 회귀로부터 EC₅₀ 값을 계산하였다. 도 5a-5d는 인간 VISTA에 대한 각각의 항-VISTA 항체의 용량 반응 ELISA 데이터를 나타내고, 표 18은 관련된 EC₅₀ 값을 제공한다. 모든 항체는 ELISA에 의한 낮은 나노몰 EC₅₀으로 인간 VISTA에 대한 강력한 결합을 나타낸다.

원숭이 및 마우스 VISTA 결합의 경우, 1, 2 또는 23μg/mL에서 단일 엔드포인트 결정이 이루어졌다. 표 19는 인간, 원숭이 및 마우스 VISTA에 대한 각 항체의 엔드포인트 흡광도를 제공한다. 모든 항체는 이 방법으로 인간 및 원숭이 VISTA에 동등하게 결합한다. 어떠한 항체도 23μg/mL에서 조차 마우스 VISTA에 대한 감지할 수 있는 결합을 나타내지 않는다.

실시예 6: ELISA에 의한 항체 친화도 결정

니켈 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트(Thermo Scientific) 또는 Maxisorb 96-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 0.1M NaHCO₃ pH 9.6에서 His-태그 VISTA 단백질(SinoBiological, HE293 세포에서 생성된 Met1-Ala194)의 0.5-1μg/mL 용액 50μL로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 모든 후속 배양은 실온에서 수행하였다. 웰을 PBST(0.05% Tween 20)로 3회 세척하고 PBST 중 5% BSA 200μL로 2시간 동안 차단하였다. 항-VISTA 항체를 PBST 중 0.5% BSA에서 2-23μg/mL로 희석하고 0.5% BSA/PBST에서 3.5 내지 5배 연속 희석으로 10μg/mL-0.05ng/mL로 만들었다. 각 항체 희석액을 ELISA 플레이트에서 1시간 동안 인큐베이션(50-100μL/웰)한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 1:20,000으로 희석한 비오틴 SP AffiniPure 당나귀 항-인간 IgG (H+L) 다클론 항체(Jackson ImmunoResearch, 50-100μL/웰)와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBST로 3회 세척하고, 플레이트를 1:200으로 희석한 스트렙트아비딘-HRP(R&D Systems) 50-100μL와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBST로 3회 세척하고 100μL 1-Step Ultra Fast TMB 기질(Thermo Scientific)로 1.5-2분 동안 현상하였다. 100μL의 2N H₂SO₄로 반응을 중단하고 플레이트 웰 흡광도를 450nm에서 측정하였다(CLARIOstar 마이크로플레이트 판독기).

인간 VISTA 결합 데이터의 경우, log 변환된 용량-반응 데이터의 비선형 회귀로부터 EC₅₀ 값을 계산하였다. 도 5e, 5f는 인간 VISTA에 대한 각각의 항-VISTA 항체의 용량 반응 ELISA 데이터를 보여주고, 표 20은 관련된 EC₅₀ 값을 제공한다. 모든 항체는 ELISA에 의한 낮은 나노몰 EC₅₀으로 인간 VISTA에 대한 강력한 결합을 나타낸다.

실시예 7: pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 또는 pH 7.4에서 ELISA에 의한 항체 친화도 결정

Maxisorb 96-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 0.1M NaHCO3 pH 9.6 중 His-태그 VISTA 단백질(SinoBiological, HE293 세포에서 생성된 Met1-Ala194)의 0.5μg/mL 용액 100μL로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 모든 후속 인큐베이션은 실온에서 수행하였다. 웰을 PBST(0.05% Tween 20)로 3회 세척하고 PBST 중 5% BSA 200μL로 2시간 동안 차단하였다. 항-VISTA 항체를 PBST 중 0.5% BSA에서 1000ng/mL로 희석하고 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 또는 pH 7.4의 0.5% BSA/PBST에서 2.4배 연속 희석으로 1000ng/mL-0.16ng/mL로 만들었다. 각 항체 희석액을 ELISA 플레이트에서 1시간 동안 인큐베이션(100μL/웰)한 후, 플레이트를 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 또는 pH 7.4의 PBST로 3회 세척하고 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 또는 pH 7.4에서 1:20,000으로 희석한 비오틴 SP AffiniPure 당나귀 항-인간 IgG (H+L) 다클론 항체(Jackson ImmunoResearch, 100μL/웰)와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 또는 pH 7.4의 PBST로 3회 세척하고, 플레이트를 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 또는 pH 7.4에서 1:200으로 희석한 스트렙트아비딘-HRP(R&D Systems) 100μL와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 또는 pH 7.4의 PBST로 3회 세척하고 100μL의 1-Step Ultra Fast TMB 기질(Thermo Scientific)로 1.5분 동안 현상하였다. 100μL의 2N H2SO4로 반응을 중단하고 플레이트 웰 흡광도를 450nm에서 측정하였다(CLARIOstar 마이크로플레이트 판독기). 도 5g-5i는 상이한 pH에서 인간 VISTA에 대한 각각의 항-VISTA 항체의 용량 반응 ELISA 데이터를 보여주고, 표 21은 관련된 EC₅₀ 값을 제공한다. 모든 항체는 모든 pH에서 ELISA에 의한 낮은 나노몰 EC₅₀으로 인간 VISTA에 대한 강력한 결합을 나타내며 pH 6.0에서는 감소된 결합이 관찰된다. 산성 pH에서 감소된 결합은 Ab 번호 150.1에서 더 확연하다.

실시예 8: 항-VISTA 항체 결합 특이성

항-VISTA 항체를 B7 단백질 계열의 관련 구성원에 결합하는 능력에 대해 ELISA를 사용하여 평가하였다. 다음 his-태그된 B7 단백질을 표적 외 결합에 대해 평가하였다: CD80/B7-1, CD86/B7-2, ICOS/B7-H2, PD-L1/B7-H1, B7-DC/PD-L2/CD273, B7-H4/B7S1/B7x 및 B7-H3/CD276(모두 Sino Biological 제품). Maxisorb 96-웰 ELISA 플레이트(Thermo Fisher Scientific)를 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 1시간 동안 각 B7 계열 구성원 단백질의 0.1M NaHCO₃ pH 9.6 중 2μg/mL 용액으로 50μL/웰로 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 세척하고 실온에서 2시간 동안 PBST 중 5% BSA 200μL로 차단하였다. 추가 세척 후, 1차 항체를 실온에서 1시간 동안 각 플레이트에 결합시켰다. 항-VISTA 항체는 10μg/mL로 결합되었다. 다음 대조군 항체를 1:2000 또는 1:10000으로 희석하여 사용하였다: 항-CD80/B7-1 항체, 마우스 mAb(SinoBiologics, 카탈로그 번호 10698-MM01), 항-CD86/B7-2 항체, 마우스 mAb(SinoBiologics, 카탈로그 번호 10699-MM02), 항-ICOS/B7-H2 항체, 마우스 mAb(SinoBiologics, 카탈로그 번호 11559-MM07), 항-PD-L1/B7-H1 항체, 마우스 mAb(SinoBiologics, 카탈로그 번호 10084-MM37), 항-B7-DC/PD-L2/CD273 항체, 토끼 mAb(SinoBiologics 카탈로그 번호 10292-R018), 항-B7-H4/B7S1/B7x 항체, 토끼 pAb(SinoBiologics, 카탈로그 번호 10738-T24), 항-B7-H3/CD276 항체, 마우스 mAb(SinoBiologics, 카탈로그 번호 11188-M008) 및 Ultra-LEAF™ 정제된 인간 IgG1 아이소타입 대조군(BioLegend). 1차 항체를 따라내고, 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후 1:10000으로 희석된(50μL) HRP 접합된 항-마우스, 항-인간 또는 항-토끼 IgG와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가 세척 후, 플레이트를 실온에서 2분 동안 100μL의 1-Step Ultra TMB 기질로 현상하였다. 항-VISTA 항체 중 어느 것도 VISTA 이외의 B7 단백질 계열 구성원과 결합하지 않았다(도 6a-6h).

실시예 9: 세포 표면 VISTA에 대한 항체 결합 .

종간 결합: 항체를 CHO K1 세포에서 안정하게 발현된 인간, 마우스 및 사이노몰구스 원숭이 VISTA에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. VISTA-발현 CHO 세포주를 F-12K 배지(ATCC)에서 선택하의 10% 태아 소 혈청(FBS)과 합류(confluence)하도록 성장시켰다. 실온에서 Accutase(Thermo Fisher Scientific)가 있는 조직 배양 플라스크에서 세포를 분리하고, 10% FBS가 함유된 F12-K 배지에 희석하고, 차가운 PBS로 세척하였다. 현탁액의 세포를 1.5×10⁶개의 세포/mL의 최종 농도로 희석하고 마이크로티터 플레이트의 웰당 100μL로 분배하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고 1:1000으로 희석된 고정 가능한 생/사(fixable live/dead) nIR 염색제(Thermo Fisher) 50μL에 얼음 위에서 30분 동안 재현탁시켰다. 세포를 FACS 염색 버퍼(PBS 중 4% FBS, 0.05% 나트륨 아지드)에서 희석하고, 원심분리로 회수하고, FACS 염색 버퍼에서 0.05, 1 또는 150nM로 희석된 항-VISTA 항체 50μL와 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중 FACS 염색 버퍼의 점진적 희석액으로 세척하고 FACS 염색 버퍼(PE 표지된 염소 항-인간 IgG(H+L), Jackson ImmunoResearch)에서 1:200으로 희석된 2차 항체 50μL에 재현탁시킨 후 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 전과 같이 세척하고, 50μL의 차가운 PBS에 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 150μL의 Cytofix(BD Pharmingen)를 첨가하여 처리하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 PBS에 재현탁시켰다. 샘플 데이터는 Attune NXT 유세포분석기에서 수집하였다.

도 7a-7c는 150nM, 1nM 및 0.05nM의 인간, 원숭이 및 마우스 VISTA를 안정적으로 발현하는 CHO 세포에 결합하는 항-VISTA 항체로부터의 평균 형광 강도를 보여준다. 항체는 원숭이 및 인간 VISTA에 대한 강력한 결합을 나타냈다. 이러한 세포주에 대한 MFI 수준은 모든 항체 농도에서 종간에 거의 동일하다. 어떠한 항체도 마우스 VISTA에 유의한 결합을 나타내지 않는다.

다점 적정(multipoint titration): 인간 VISTA를 표면에서 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포를 성장시키고, 수확하고, 상술된 바와 같은 농도 범위(0.006, 0.024, 0.098, 0.391, 1.563, 6.25, 25 및 100nM)에 걸쳐 항-VISTA 항체로 표지하였다. 데이터를 수집하고 Log MFI 대 Log 항체 농도로 표현하였다. 변환된 데이터를 비선형 회귀(도 8a-8r)로 피팅하고, EC50 값을 아래 표에 제공된 대로 계산하였다(표 22).

실시예 10: 항-VISTA 항체의 에피토프 맵핑.

Octet 비닝(binning) 연구: 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 Octet 시스템에서 BLI로 수행하였다. AHC 센서를 사용하여 100초에 걸쳐 항-VISTA 항체(20μg/mL)를 포획하였다. 센서의 결합되지 않은 부위를 180초 동안 풀링된 정제된 인간 IgG 포화량(50μg/mL)으로 차단하였다. 항원(100nM의 his-태그된 인간 VISTA-ECD)이 180초 동안 고정된 항체에 결합되었고, 그 후 샌드위치 포맷으로 항원에 결합하는 쌍을 이룬 항체의 능력에 대해 센서를 조사하였다. 각 항체가 적어도 한 번은 상기 포맷에 포획 항체로 사용되도록 다중 페어링 배열(multiple pairing arrangement)을 조사하였다. 데이터는 2차 항체에 대한 반응(nm)으로 표시된다. 항체 VSTB-174(국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/207717 A8에 기술됨)를 대조군 항체로 사용하였다. 데이터는 각 항체가 BLI 비닝 기술을 사용하여 동일한 에피토프 빈(epitope bin)에 결합한다는 것을 보여준다. 데이터는 아래 표 23에 표시되어 있다.

에피토프 맵핑 연구: 항체 245.1, 465.1 및 VSTB-174에 대한 인간 VISTA의 결합을 매개하는 선형 에피토프를 확인하기 위해 펩티드 맵핑 연구를 사용하였다. ELISA를 사용하여 마이크로티터 플레이트에 고정된 전장 VISTA-ECD에 대한 항체의 결합을 차단하는 인간 VISTA의 순차적 중복 15-mer 합성 펩티드의 능력을 측정하였다. 니켈 코팅된 ELISA 플레이트를 BSA로 차단하고 실온에서 1시간 동안 0.5μg/mL의 VISTA 단백질(인간 재조합, HEK 293 세포에서 생성, SinoBiologics)과 결합시켰다. 항-VISTA 항체를 EC₅₀ 농도의 2배로 희석하고 실온에서 30분 동안 PBST 중 0.5% BSA에서 2μg/mL 또는 20μg/mL의 펩티드 용액과 1:1 비율로 사전 인큐베이션하였다. 펩티드 결합 항체 용액(50μL)을 각 마이크로티터 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, ELISA 플레이트를 세척하고 표준 ELISA에 대해 상술된 바와 같이 처리하였다. 데이터는 펩티드 용액과의 사전 인큐베이션 없이 수득한 ELISA 신호의 감소 백분율로 표시된다. 항체 결합을 33% 이상 감소시킨 펩티드가 잠재적인 에피토프로 확인되었다(표 24).

아미노산 서열 66HLHHG70(서열번호 380의 아미노산 98-102) 및 116VVEIRHHHSEHR127(서열번호 380의 아미노산 148-159)(넘버링은 성숙한 폴리펩티드의 첫 번째 아미노산에서 시작하여 인간 VISTA(서열번호 380)의 잔기를 가리킴)을 갖는 항체 245.1 및 465.1에 대한 이 분석으로 2개의 동일한 결합 에피토프를 확인하였다. 이러한 동일한 펩티드 서열은 VSTB-174에 대해 확인된 선형 에피토프 내에 포함된 것으로 보인다.

항체 에피토프의 돌연변이 분석: 인간 VISTA의 3개의 아미노산(R54, F62 및 Q63)이 VSTB-174의 밀접하게 관련된 유사체인 VSTB-112의 VISTA 단백질에 대한 결합에 크게 책임이 있는 것으로 이전에 보고된 바 있다(Mehta, N. Structure and functional binding epitope of V-domain Ig suppressor of T cell activation. Cell Rept. (2019) 28(10):P2509-2516 참조). 본원에 기술된 항체가 VSTB-174와 동일한 에피토프에 결합하는지 확인하기 위해, 이들 3개의 아미노산 각각을 VISTA-ECD에서 알라닌으로 치환하고 Fc 접합체로 발현된 이 3개의 돌연변이 단백질(hVISTA ECD-Fc R54A, F62A, Q63A, 서열번호 382)에 대한 항체의 결합을 측정하였다. ELISA를 사용하여 상술된 바와 같이 본질적으로 야생형 및 돌연변이체 VISTA에 대한 항체 결합을 측정하였다. VISTA-Fc(5μg/mL)를 Maxisorb 96-웰 ELISA 플레이트에 고정하고 표준 ELISA 포맷으로 10μg/mL로 희석된 각 항체와 반응시켰다. 결합 데이터는 450nm에서의 흡광도로 보고되었다.

VSTB-174는 3자 VISTA-Fc 돌연변이체에 결합하지 않았다. 항체 번호 465.1은 돌연변이체 VISTA에 대한 감소된 결합(야생형의 ~25%)을 나타냈으며, 이는 465.1과 VSTB-174 사이의 부분적인 중복 에피토프를 시사한다(하기 표 25 참조). 항체 번호 269.1, 321.1, 245.1, 457.1, 173.1 및 833.1의 결합은 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았으며, 이는 이들 항체가 VSTB-174와 상이한 에피토프에 결합함을 시사한다.

항체 비닝, 펩티드 맵핑 및 돌연변이 분석의 조합에 기초하여, 시험된 항체가 VSTB-174 및 관련 항체로부터 공간적으로 가깝지만 별개의 에피토프에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다.

ELISA에 의한 항체 에피토프의 돌연변이 분석

항-VISTA 항체의 이의 에피토프에 대한 결합을 VISTA의 세포 외 도메인의 다양한 돌연변이를 통해 평가하였다. 상이한 돌연변이의 넘버링은 신호 펩티드가 없는 VISTA-ECD에 상응한다. 각각의 돌연변이된 아미노산은 VISTA-ECD에서 알라닌으로 치환하였고 Fc 접합된 것으로 발현되었다. 다음 항체 번호: 474.1(WT), 150.1(YTE), 85, 87, 91, 92 및 VSTB174를 평가하고 돌연변이체와 WT VISTA ECD 사이를 비교하였다. 항체 결합을 측정하기 위해 ELISA를 사용하였다. VISTA-Fc(3μg/mL)를 Maxisorb 96-웰 ELISA 플레이트에 고정하고 100ug/mL-0.003ug/mL로 적정된 각 항체와 반응시키고 비오티닐화된 항-인간 Ig 경쇄 카파에 이어 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질을 사용하여 검출하였다. 결합은 CLARIOstar 플레이트 판독기를 사용하여 450nm 광학 밀도에서 알아냈다. VISTA-ECD 돌연변이체(R54A, F62A 및 Q63A)는 VSTB174에 결합하지 않았고 Ab 번호 87 및 91에 대해 감소된 결합을 보였다(표 27, 도 8s-8y). 항체 번호 150.1, 474.1, 85 및 92의 결합은 이 3개의 돌연변이체에 의해 영향을 받지 않았다(표 26-27, 도 8s-8y). VISTA-ECD 돌연변이체 2.3(Y37A, V117A, R127A)은 항체 번호 150.1, 474.1, 85, 87, 91, 92 및 VSTB174에 대해 감소된 결합을 보였다(표 26-27, 도 8s-8y). VSTB174 결합이 이 3개의 돌연변이체의 영향을 가장 적게 받았다. 2개의 VISTA-ECD 돌연변이체 10.1(R54A, R127A)은 항체 번호 150.1, 474.1, 85, 87, 91, 92 및 VSTB174에 대해 감소된 결합을 보였다(표 26-27, 도 8s-8y). VSTB174 결합이 이 2개의 돌연변이의 영향을 가장 적게 받았다.

인간 VISTA의 3개의 아미노산(R54, F62 및 Q63)이 VSTB-174의 밀접하게 관련된 유사체인 VSTB-112의 VISTA 단백질에 대한 결합에 크게 책임이 있는 것으로 이전에 보고된 바 있다(Mehta, N. Structure and functional binding epitope of V-domain Ig suppressor of T cell activation. Cell Rept. (2019) 28(10): P2509-2516 참조). 항체 번호 150.1, 474.1, 85 및 92의 결합은 영향을 받지 않았으며 이는 이들 항체가 VSTB-174에 대해 보고된 별도의 에피토프에 결합함을 시사한다. 이러한 데이터는 모두 Ab 번호 150.1 및 Ab 번호 474.1이 VSTB174와 상이한 에피토프에 결합하고 Ab 번호 150.1 및 Ab 번호 474.1에 의해 인식되는 이 에피토프의 주요 아미노산이 서열번호 377의 티로신 37, 아르기닌 54, 발린 117 및 아르기닌 127임을 나타낸다.

실시예 11: 스타필로코쿠스 엔테로톡신(Staphylococcus Enterotoxin) B(SEB) 인간 T 세포 활성화 검정에서 항-VISTA Mab의 시험관 내 기능적 특성분석

SEB 인간 T 세포 활성화 검정에서 항-VISTA mAb(모든 IgG1 및 일부 IgG4)의 효능을 평가하였다. 간단히 말해, SEB 검정에서 단일 건강한 공여자의 인간 PBMC를, 항원 제시 세포(APC)의 표면에 있는 MHC 클래스 Ⅱ 단백질을 T 세포의 T 세포 수용체(TCR)에 직접 연결하는 박테리아 슈퍼항원(SEB 5ng/ml)과 함께 인큐베이션하여 T 세포 활성화와 후속적으로 IFNγ 사이토카인 분비를 일으키고, 이를 4일 후에 정량적으로 측정한다. 또한, IFNγ은 NK 세포에 의해 분비될 수 있기 때문에, 배경 신호를 줄이고 반응의 동적 범위를 개선하기 위해 NK 세포 고갈된 PBMC를 검정에 사용하였다. 아이소타입 IgG1 또는 IgG4 mAb를 각각의 검정에서 음성 대조군으로 사용하였다. mAb를 3μg/ml의 포화 농도에서 스크리닝하였다.

건강한 공여자의 PBMC를 37℃ 수조에서 해동하였다. 세포를 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 펠릿화하고 세포 배양 배지에서 세척한 후 계수하였다. 이어서, 세포를 EasySep Media에 1E8개의 세포/ml로 재현탁시키고 5ml 폴리스티렌 환저 튜브로 옮겼다. EasySep NK 선택 키트를 사용하여 다음과 같이 NK 세포 고갈을 수행하였다. 선택 칵테일(selection Cocktail)(샘플(세포) 100μl/ml)을 첨가하고, 혼합한 다음, 실온에서 6분 동안 인큐베이션한 후 RapidSpheres(샘플(세포) 100μl/ml)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 6분 동안 인큐베이션한 후 EasySep Media로 최종 부피를 2.5ml로 완성하였다. 이어서, 튜브를 뚜껑 없이 자석에 넣고 실온에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 자석이 있는 튜브를 뒤집고 상청액을 새 튜브에 따랐다. 이 상청액을 다시 자석에 넣고 실온에서 6분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 자석이 있는 튜브를 뒤집고 폐기된 상청액을 새로운 15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브에 수집하였다. 이것은 세포 배양 배지로 12ml의 최종 부피로 완성된 NK 고갈된 PBMC 하위세트에 해당한다. 세포를 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 펠릿을 5ml의 세포 배양 배지에 재현탁시킨 후 계수하였다. 마지막으로, SEB 활성화 검정을 위해 준비된 세포 배양 배지에서 세포를 2E6개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 이를 위해, 96-웰 U자 바닥의 조직 배양 플레이트(Corning 카탈로그 번호 3799)에 웰당 100μl의 세포(2×10⁵개의 세포/웰)를 첨가하고 컨디셔닝을 3회 수행하였다. 3μg/mL의 최종 시험 Ab 농도를 위해 12μg/mL(4배)의 농도로 시험 Ab를 함유하는 50μl의 세포 배양 배지를 첨가하였다. 시험된 Ab의 용량 적정을 위해, 다음 최종 농도를 제조하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다: 30, 3, 0.3, 0.03μg/ml. 이어서, 5ng/mL의 최종 SEB 농도를 위해 20ng/mL(4배) 농도의 SEB 항원을 함유하는 50μL의 세포 배양 배지를 웰마다 첨가한 후 37℃ 및 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리한 후 상청액을 수집하고 제조업체의 사양서에 따라 ProQuantum(ThermoFischer 카탈로그 번호 A355765) 또는 ELISA 키트(Invitrogen 카탈로그 번호 88-7316-88)를 사용하여 IFNγ 생성에 대해 분석하였다.

결론적으로, Ab 번호 269.1, Ab 번호 321.1, Ab 번호 245.1, Ab 번호 474.1, Ab 번호 150.1, Ab 번호 465.1, Ab 번호 457.1, Ab 번호 173.1 및 Ab 번호 833.1은 SEB 유도된 인간 T 세포 활성화 검정에서 효능을 보이고 용량 의존성 방식에서 인간 T 세포 활성화를 증가시킨다. SEB 유도된 인간 T 세포 활성화 검정에서 IgG1 Fc 백본은 IgG4 Fc 백본보다 더 효과적이다(도 9-17).

실시예 12: T 세포 활성화 검정에서 항-VISTA Mab의 시험관 내 기능적 특성분석.

이 검정에서, VISTA 처리된 세포에서 T 세포 증식을 회복시키는 항-VISTA 항체의 능력을 유세포분석으로 평가하고 ELISA를 사용하여 IFNγ 분비를 측정함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다.

96-웰 평저 플레이트(들)를 96-웰 평저 플레이트의 웰당 100μl의 적절한 항-CD3 용액, 아이소타입 Ab 또는 항-VISTA 항체 용액으로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. CD3+ pan T 세포를 CTL Anti-Aggregate Wash가 보충된 따뜻한 X-VIVO15 배지에서 37℃에서 해동하고 계수하였다. 세포를 400g으로 5분 동안 펠릿화하고 CellTrace 표지화를 위해 PBS에서 1×10⁶개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포를 CellTrace로 표지하기 위해, 샘플 ml당 1μl의 5mM 바이올렛(최종 농도 5μM CellTrace 바이올렛)을 상기 세포에 첨가하고, 상기 세포를 암실에서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 염색을 억제하기 위해, 5부피의 10% FBS/배지를 첨가하고 세포를 20℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 20℃에서 5분 동안 400g으로 펠릿화하고 X-VIVO15 배지에서 2×10⁶개의 세포/ml로 재현탁시켰다.

항-CD3 Ab로 코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, Ab(100μg/ml)의 존재 또는 부재하에 VISTA로 코팅된 비드를 첨가한 후 100μl/웰(즉, 2×10⁵개의 세포/웰)의 T 세포를 추가로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 이어서 IFNγ 면역분석을 위해 상청액을 수집하고, 원심분리 및 세척 후 세포를 유세포분석을 위해 회수하였다.

항체 번호 173.1은 항-CD3 항체에 의해 유도된 인간 pan T 세포 활성화의 VISTA 매개된 억제의 역전을 보였다. 상기 항체에 의한 T 세포 활성화의 VISTA 매개된 억제의 역전은 인간 pan T 세포가 플레이트에 결합된 항-CD3 Ab로 자극되었을 때 관찰되었고, VISTA 억제는 VISTA로 코팅된 비드에 의해 매개되었다(그러나 VISTA가 플레이트에 결합되었을 때는 아니었음). 항체 번호 269.1, 항체 번호 321.1 및 항체 번호 457.1은 항-CD3 인간 pan T 세포 활성화의 VISTA 매개된 억제의 역전을 보였다. 항체 번호 245.1은 항-CD3 인간 pan T 세포 활성화의 VISTA 매개된 억제의 약간의 역전을 보였다(도 18a-22b).

실시예 13: 단핵구 활성화 검정에서 항-VISTA 항체의 시험관 내 기능적 특성분석

단핵구 활성화 기능 검정을 사용하여 인간 단핵구 활성화를 유도하는 데 있어서 항체의 기능적 활성을 측정하였다. 간단히 말해, 단일 공여자의 PBMC를 동일한 공여자의 CD14+ 단핵구 집단에서 농축시킨 다음 항-VISTA mAb와 함께 24시간 동안 인큐베이션하여 단핵구 활성화, CD14+ 단핵구에서의 세포 표면 활성화 마커 HLA-DR, CD80 및 CD86의 상향조절과 CXCL10 케모카인 분비를 유발하였다. 본원에 기술된 일부 항-VISTA mAb의 기능적 스크리닝을 단일 용량에서 용량 의존성 방식으로 수행하였다. NK 세포의 역할뿐만 아니라 IgG1 대 IgG4 Fc 백본의 역할도 이 검정에서 평가하였다.

CD14+ 세포 농축: 건강한 공여자의 PBMC를 해동하고 세포를 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하여 펠릿화하였다. 세포를 10ml의 세포 배양 배지로 세척한 후, 계수하고 CD14+ 농축을 위해 300ml의 MACS 버퍼에 재현탁시켰다. 100ml의 비오틴-항체 칵테일을 첨가하기 전에 100μl의 FcR 차단 시약을 먼저 첨가한 다음, 부드럽게 혼합하고 암실에서 10분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 이어서, 200μl의 Anti-Biotin MicroBeads를 첨가하고, 부드럽게 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. MACS 버퍼로 세포를 세척한 후, 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 500μl의 MACS 버퍼에 재현탁시킨 후 적합한 MACS 분리기의 자기장 내 LS 컬럼에 놓았다. 통과 후 용출된 세포를 15ml 폴리프로필렌 코니칼 튜브(polypropylene conical tube)에 수집하였다. 상기 컬럼을 MACS 버퍼로 3회 더 세척하고 용출액을 수집한 후 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 생성된 세포 펠릿을 5ml의 세포 배양 배지에 재현탁시키고, 계수하고, 농축 후 염색을 위해 약 2×106개의 세포를 저장하고, 10×106개의 세포는 표지되지 않은 공동 배양 플레이트에 보관하였다. 이러한 농축된 CD14+ 세포를 PBS에 1×106개의 세포/ml로 재현탁시키고 CellTrace 바이올렛으로 표지하였다. 샘플 ml당 1μl의 5mM 바이올렛(최종 농도: 5μM CellTrace 바이올렛)을 첨가하고 세포를 37℃, 암실에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 염색을 억제하기 위해, 10% FBS를 함유하는 5부피의 배지를 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션한 후 실온에서 5분 동안 400g으로 세포를 원심분리하였다. 이어서, 세포를 세포 배양 배지에 1×10^6개의 세포/ml로 재현탁시켰다.

PBMC 준비: 동일한 공여자의 PBMC를 해동하고 세포를 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리한 후 펠릿화하였다. 세포를 10ml의 세포 배양 배지로 세척한 후, 계수하고 세포 배양 배지에 4×106개의 세포/ml로 재현탁시켰다.

50μl/웰의 CD14+ 세포(0.5×105개의 세포/웰)를 50μl/웰의 인간 PBMC(2×105개의 세포/웰)에 첨가하고 항체를 준비하는 동안 인큐베이터 내 96-웰 플레이트에 넣었다. 시험 항체를 최종 농도의 2배로 희석하고, 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 96-웰 플레이트에 첨가하였다. CellTrace 바이올렛 표지된 CD14+ 농축 세포가 있는 플레이트 하나를 따로 보관하여 유세포분석에 사용하였고, 표지되지 않은 세포가 있는 두 번째 플레이트(동일한 레이아웃)를 CXCL-10 분비 측정에 사용하였다. CXCL10 분비를 위해, 세포를 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 펠릿화하고, 상청액을 96-웰 플레이트로 옮겨 제조업체의 프로토콜에 따라 CXCL10 ELISA를 수행하였다.

유세포분석을 위해, 웰당 50μl의 항-FcR 항체(FACS 버퍼 중 최종 100μg/ml의 huIgG)를 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 외 염색을 위해 50μl의 Ab 믹스/웰(CD14, CD80, CD86, HLA-DR 및 생/사 염색에 대한 항체 함유)을 첨가하고 암실에서 15분 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 후 원심분리하고 1000g으로 4C에서 2분 동안 세척한다. AttunNext 유세포분석기에서 세포를 분석하였다.

실험 판독을 위해, CD14+ 세포에서의 활성화 마커 CD80, CD86 및 HLA-DR의 상향조절을 24시간 유세포분석으로 분석하고 CXCL10 분비를 24시간 ELISA로 분석하였다.

항체 번호 269.1, 항체 번호 321.1, 항체 번호 245.1, 항체 번호 150.1, 항체 번호 474.1, 항체 번호 465.1, 항체 번호 457.1, 항체 번호 173.1 및 항체 번호 833.1을 초기 스크린 효능에 기초하여 선택하고 100μg/ml 내지 0.003μg/ml 범위의 시험된 항-VISTA 항체의 용량-반응 실험에서 추가로 특성분석하였다.

항체 번호 269.1, 항체 번호 321.1, 항체 번호 245.1, 항체 번호 465.1, 항체 번호 457.1, 항체 번호 173.1, 항체 번호 150.1, 항체 번호 474.1 및 항체 번호 833.1은 인간 단핵구 활성화 검정에서 용량 의존성 방식으로 효능을 보였다(도 23a-23d, 24a-24c, 25a-25d, 26a-26c, 27a-27c, 28a-28d, 29a-29d, 30a-30c, 31a-31c, 32a-32c, 33a-33c, 34a-34c, 35a-35c, 36a-36i).

단핵구 활성화 검정에서 효능을 매개하는 데 있어서 선택된 mAb의 Fc 도메인의 역할을 평가하기 위해, 상술된 동일한 프로토콜을 사용하여 단핵구 활성화 검정에서 항체 번호 245.1, 항체 번호 465.1, 항체 번호 474.1 및 항체 번호 173.1(IgG1 백본)을 이의 IgG4 백본 대응물(각각 항체 번호 245.4, 항체 번호 465.4, 항체 번호 246.4 및 항체 173.4)과 함께 시험하였다.

단핵구 활성화 검정에서 항-VISTA 항체의 효능은 IgG4 Fc 백본과 비교하여 IgG1 Fc 백본에 의해 증가된다(도 37ad-37f, 38a-38c, 39a-39c).

단핵구 활성화 검정에서 항-VISTA 항체의 효능을 매개하는 데 있어서 NK 세포의 역할을 평가하기 위해, 항체 번호 269.1, 항체 번호 173.1, 항체 번호 150.1 및 항체 번호 474.1과 음성 대조군 항체 번호 18.1을 단핵구 활성화 검정에서 시험하였다. NK 고갈을 준비하기 위해, PBMC를 이전에 설명한 대로 해동하고 원심분리한 후 세포를 EasySep 배지에 1×108개의 세포/ml로 재현탁시키고 5ml(12×75mm) 폴리스티렌 환저 튜브로 옮겼다. 이어서, 5ml(12×75mm) 폴리스티렌 환저 튜브 내 50×106개의 세포/500μl EasySep 배지를 선택 칵테일(50μl/ml의 샘플(세포))에 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, RapidSpheres(50μl/ml의 샘플(세포))를 첨가하고, 혼합한 다음, 실온에서 6분 동안 인큐베이션하였다. EasySep 배지로 최종 부피를 2.5ml로 조정하였다. 튜브를 자석에 넣고 실온에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 자석이 있는 튜브를 뒤집고 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 이어서, 상청액이 담긴 튜브를 다시 자석에 넣고 실온에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 자석이 있는 튜브를 뒤집고 상청액을 새로운 15ml 튜브로 옮겼다. 이 상청액은 NK 고갈된 PBMC 하위세트에 해당한다. 세포 배양 배지를 12ml의 최종 부피로 첨가하고, 세포를 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 세포 펠릿을 5ml의 세포 배양 배지에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 세포 배양 배지에 4×106개의 세포/ml로 재현탁시키고, 96웰 U자 바닥 플레이트에 50μl/웰로 플레이팅하고 검정 설정을 위해 37℃ 인큐베이터에 넣었다.

CD14+ 세포에서의 CD80 및 HLA-DR 활성화 마커의 발현 유도와 CXCL10 분비의 증가는 주로 NK 세포를 함유하는 PBMC의 존재하에 관찰되었다. 이러한 데이터는 NK 세포가 항-VISTA 항체 유도된 인간 단핵구 활성화에 필요함을 시사한다(도 40a-40f, 41a-41i).

실시예 14: MDSC(사이토카인 유도된) 억제 검정에서 항-VISTA 항체의 시험관 내 기능적 특성분석

사이토카인 유도된 MDSC의 억제 기능을 항-CD3 유도된 T 세포 증식(유세포분석에 의함) 및 IFNγ 생성(ELISA에 의함)을 억제하는 능력으로 측정할 수 있다.

건강한 공여자의 전체 PBMC에서 시작하여, CTL Anti-Aggregate가 보충된 따뜻한 X-VIVO15 배지에서 세포를 해동하고, 세척하고 계수하였다. 실온에서 400g으로 5분 동안 원심분리한 후, 세포를 GM-CSF(10ng/ml) 및 IL6(10ng/ml)이 보충된 X-VIVO15 배지에 5×10⁵개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 배양 배지를 GM-CSF(10ng/ml) 및 IL6(10ng/ml)이 보충된 X-VIVO15 배지로 2-3일마다 새로 갈았다. MDSC 분리를 진행하기 위해, 1ml/75㎠의 Detachin(비프로테아제 세포 분리 용액)을 사용하여 이 세포 배양물로부터 세포를 수집하고 37℃에서 5-10분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세포 스크레이퍼(cell scraper)로 분리한 후 제조업체의 사양서에 따라 CD11b MicroBeads 및 LS 컬럼 분리(Miltenyi)를 사용하여 CD11b+ 세포 분리를 진행하였다. 마지막으로, MDSC를 X-VIVO15 배지 ml당 2×10⁶개의 세포로 재현탁시켰다.

동일한 공여자의 PBMC를 해동하고, 계수한 후 400g으로 5분 동안 펠릿화하였다. 세포를 PBS에 1×10⁶개의 세포/ml로 재현탁시키고 CellTrace로 표지하였다. 샘플당 CellTrace ml당 1μl의 5mM 바이올렛(최종 농도: 5μM CellTrace 바이올렛)을 세포에 첨가하고 세포를 37℃, 암실에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 염색을 10% FBS가 보충된 5부피의 배지로 억제하고 세포를 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 현탁액을 2등분하여 실온에서 5분 동안 400g으로 펠릿화하고 X-VIVO15 배지에 2×10⁶개의 세포/ml로 재현탁시켰다.

MDSC 플레이트당 4μg/ml(플레이트에서의 최종 농도: 1μg/mL)의 항-CD3 Ab(HIT3a) 50μl를 96-웰 U자 바닥 플레이트의 웰당 50μl(즉, 1×10⁵개의 세포/웰; 2×10⁶개의 세포/mL)의 새로 해동된 PBMC에 첨가하였다. 50μl/웰(즉, 1×10⁵개의 세포/웰; 2×10⁶개의 세포/mL)의 MDSC를 동일한 96-웰 U자 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 40μg/mL의 항체를 50μl/웰로 첨가하였다(최종 농도 10μg/mL). 세포를 3일 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션한 후 세포 증식에 대한 유세포분석 및 IFNγ 분비에 대한 ELISA를 수행하였다.

항-VISTA 항체는 항-CD3 Ab-유도된 T 세포 증식의 대부분의 MDSC 억제 및 IFNγ 유도된 분비에 의한 활성화를 역전시켰다(도 42a-46b).

실시예 15: 다양한 Fc 수용체 결합 검정에서 Fc 돌연변이체의 평가

이 연구의 목적은 Fc 돌연변이의 생체 내 효과의 예측인자로서 다양한 관련 Fc 수용체에 결합하는 능력에 대해 야생형 및 다양한 IgG Fc 돌연변이를 평가하는 것이었다. 또한, 이러한 Fc 수용체에 결합하는 능력에 대해 IgG1 및 IgG4 백본을 비교하였다. 다음 항체: 항체 번호 173.1 및 항체 번호 474.1(야생형, "WT"), 각각 EU 넘버링에 따라 M252Y, S254T 및 T256E 치환("YTE")이 있는 항체 번호 420.1 및 항체 번호 150.1, 항체 번호 173.1에 비해 EU 넘버링에 따라 M428L 및 N434S 치환("LS")이 있는 항체 번호 289.1, 항체 번호 173.4 및 항체 번호 246.4(WT), 항체 번호 420.4(YTE 함유) 및 항체 번호 289.4(LS 함유)를 평가하고 FcRn; FCGR1/CD64; FCGR2a/CD32a(167H) & FCGR2a/CD32a(167R); 및 FCGR3a/CD16(176Phe/F158) & FCGR3a/CD16a(176Val/V158) 결합 검정에 대해 VSTB174(WT)와 비교하였다. 평가를 위해 다음 AlphaLisa 결합 키트를 사용하였다:

FcRn(Perkin Elmer #AL3095C)

FcgR1/CD64(Perkin Elmer #AL3081C)

FcgR2A/CD32a(167H)(Perkin Elmer #AL3086C)

FcgR2A/CD32a(167R)(Perkin Elmer #AL3087C)

FcgR3A/CD16a(176Phe/F158)(Perkin Elmer #AL347HV)

FcgR3A/CD16a(176Val/V158)(Perkin Elmer #AL348HV)

일반적인 FcR 검정 프로토콜을 이 연구에 사용하였다. MES 버퍼를 FcRn 결합 검정을 위한 모든 시약 희석에 사용하였고 HiBlock 버퍼를 FCGR1/CD64; FCGR2a/CD32a(167H) & FCGR2a/CD32a(167R); 및 FCGR3a/CD16(176Phe/F158) & FCGR3a/CD16a(176Val/V158) 결합 검정에 대한 모든 시약 희석에 사용하였다. 항-VISTA 항체의 연속 희석을 HiBlock 또는 MES 버퍼에서 1mg/mL로 100μl의 각 IgG부터 시작하여 준비하였다. 12-포인트 semi-log 희석을 스톡으로부터 다음과 같이 준비하였다.

각 수용체에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 비오티닐화된 Fc 수용체의 4배 용액을 제조하였다. 각 수용체에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 인간 IgG Fc 접합된 비드 및 스트렙트아비딘 공여체 비드의 2배 용액을 20μg/mL 또는 40μg/mL로 제조하고 사용할 때까지 은은한 조명 아래에 보관하였다. 96웰 1/2 면적 백색 플레이트에서, 웰당 10μl의 4배 시험 항체를 첨가한 다음, 10μl의 4배 Fc 수용체 및 20μl의 2배 huIgG Fc 접합된 수용체 비드 및 스트렙트아비딘 공여체 비드를 첨가하고 혼합하였다. 플레이트를 실온의 암실에서 90분 동안 인큐베이션하고 CLARIOstar 분광기에서 680nm/615nm(여기/방출)에서 판독하였다.

이러한 상이한 FcR 결합 검정에서, YTE 돌연변이체가 야생형 IgG1 및 야생형 IgG4에 비해 FcRn 결합에서 상당한 개선(5-7배)을 나타냄을 보였다. YTE 돌연변이는 야생형 IgG1에 비해 FCGR1A에 대한 감소된 결합(4배), FCGR2A 변이체에 대한 감소된 결합(4-5배) 및 FCGR3A 변이체에 대한 감소된 결합(6-7배)을 보였다. 또한, 야생형 IgG4는 야생형 IgG1에 비해 FCGR1A에 대한 감소된 결합(6배), FCGR2A 변이체에 대한 감소된 결합(3-14배) 및 FCGR3A 변이체에 대한 감소된 결합(>33배)을 보였다.

LS 돌연변이체는 IgG1 및 IgG4 모두에 대해 야생형 항체에 비해 FcRn 결합에서 상당한 개선(3-4배)을 나타낸다. LS 돌연변이체는 야생형 IgG에 비해 FcγR1 변이체에 대한 결합 증가를 보여준다. LS 돌연변이체는 추가로 야생형 대조군에 비해 FcγR2 변이체에 대한 증가된 결합을 보여준다. 돌연변이의 영향은 IgG1 형태에만 존재하는 반면, IgG4의 돌연변이는 FcγR2 결합에 영향을 미치지 않는다. LS 돌연변이체는 IgG1 작제물에 통합되었을 때 야생형에 비해 FcγR3A 변이체 결합에서 야생형에 대한 변화가 거의 없었다. IgG4 LS 변이체는 야생형에 필적하였다(도 47a-47b, 48a-48b, 49a-49d, 50a-50d).

실시예 16: FAB2G 바이오센서에 결합된 VISTA mAb에 대한 FcRn 리간드 결합의 키네틱

신생아 Fc 수용체(FcRn) 지정 재순환은 리소좀 분해를 방지하고 항체를 세포 표면으로 되돌림으로써 단클론 항체(mAb)의 반감기를 늘릴 수 있다. 이 연구의 목적은 FcRn 결합 부위의 IgG1 Fc 특이적 변형과 FcRn의 키네틱 상호작용을 평가하고 FcRn 수용체에 대해 ELISA로 이전에 관찰된 WT와 비교하여 YTE 돌연변이체 항체의 증가된 결합 특이성을 바이오층 간섭법(BLI)으로 확인하는 것이었다. 다음 mAb를 비교하였다: VSTB174, Ab 번호 474.1(WT) 및 번호 150.1(YTE). 3개의 항체와 결합하는 FcRn의 키네틱은 Octet K2(ForteBio) 시스템에서 BLI를 사용하여 측정하였다.

정제된 Ab 번호 150.1, 474.1 및 VSTB174를 항-인간 Fab-CH1(FAB2G; ForteBio) 딥 상에 1ug/ml 농도로 로딩하고(로딩 단계) 120초 동안 바이오센서를 판독하였다. 로딩된 바이오센서를 240초 동안 800, 200, 50 및 0 나노몰 농도로 연속 희석된 FcRn(R&D 시스템)에 담갔다(결합 단계). 결합된 바이오센서를 인산염 검정 버퍼(PAB; 100mM 인산나트륨, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20; pH 6.0) 용액에 360초 동안 담갔다(해리 단계). FcRn-Fc 활성의 세포 내 생물학을 복제하기 위해 기준선, 결합 및 해리를 포함한 모든 단계를 pH 6.0의 PAB에서 수행하였다. FcRn 분석물의 모든 농도에 걸쳐 k_a, k_dis 및 K_D를 알아내기 위해 1:1 전체 곡선 피팅 분석을 수행하였다. 2상 해리 곡선을 처음 10초 동안만 분석하였다. 데이터 분석은 Octet 데이터 분석 소프트웨어 버전 12.0.2.59를 사용하여 수행하였다. Savitzky-Golay 디지털 필터를 사용하여 고주파 노이즈를 제거하였다.

각 mAb에 대해 3개의 센서그램 그래프를 생성하였다. 각 mAb에 대한 FcRn 리간드의 4가지 농도의 2상 곡선은 도 50e-50g의 그래프의 하단에서 상단으로 오름차순 농도로 중첩되었다. Ab 번호 150.1(YTE)은 4개의 2상 곡선의 평균에 걸쳐 8.41E-08의 평균 KD로 FcRn 리간드에 대해 친화도가 가장 강했다. 이것은 야생형 항체 번호 474.1보다 11배 증가한 것이다. 결합된 리간드의 양을 나타낼 수 있는 곡선의 반응 역시 Ab 번호 150.1의 FcRn 변형에 의해 증가한다. 전체적으로, Ab 번호 150.1에서 FcRn 결합 부위의 변형은 KD 및 반응 측정 모두에 의해 분석물과 항체 사이의 상호작용의 강도를 향상시켰다. 이 실험은 Ab 번호 150.1의 반감기가 생체 내에서 증가하는 이유를 설명한다.

실시예 17: ADCC(항체 의존성 세포독성)를 유도하기 위한 항-VISTA Mab의 시험관 내 기능적 특성분석

항-VISTA 항체 활성을 ADCC(항체 의존성 세포독성) 검정으로 평가하였다. 용량 적정을 수행하여 이펙터 세포(건강한 공여자 PBMC) 및 표적 세포(Raji-hVISTA 세포, InvivoGen)를 사용한 DELFIA ADCC 검정으로 항체 번호 465.1, 항체 번호 173.1, 항체 번호 420.1 및 항체 번호 173.4를 100, 30, 10, 3.0, 1.0 및 0.3ng/ml에서 시험하였다.

이펙터 세포(인간 PBMC)를 [50:1] 비율의 [이펙터:표적]([5×10⁵개의 PBMC: BATDA로 표지된 1×10⁴개의 Raji-hVISTA 세포])으로 준비하였다. 이펙터 인간 PBMC를 50U/ml의 IL-2와 함께 PBMC 배양 배지에서 1×10⁶개의 세포/ml로 밤새 배양한 다음, 수확하고 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 펠릿화하였다. 세포를 계수하고 검정 배양 배지(5×10⁵개의 PBMC/ADCC 검정 웰)에 5×10⁶개의 세포/ml로 재현탁시켰다. Raji-hVISTA 세포를 정치 배양물로부터 수확하고, 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 펠릿화하고, 계수하고, 4ml의 로딩 버퍼에 4×10⁶개의 Raji-hVISTA 세포로 재현탁시켰다(1×10⁶개/ml 세포 현탁액). 5μl의 BATDA를 첨가하고 세포를 5% CO₂와 함께 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 로딩 버퍼로 세척한 후, 세포를 계수하고 검정 배양 배지에 2×10⁵개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 시험된 항체의 연속 희석액을 50μl/웰로 준비하였다. 배경, 자발 방출 및 최대 방출에 대한 조건은 다음과 같이 설정하였다:

배경 = 최종 표적^-BATDA 현탁액에서 1ml의 배양 배지를 제거하고, 실온에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 (3배) 50μl/웰의 "배경 상청액" + (3배) 150μl의 검정 배양 배지를 적용.

자발 방출 = 50μl/웰 표적^-BATDA + 150μl의 검정 배양 배지

최대 방출= 50μl/웰 표적^-BATDA + 130μl의 검정 배양 배지 + 20μl의 (따뜻한) 용해 버퍼

이어서, 표적 세포(Raji-hVISTA^-BATDA)를 최종 [50:1] 비율을 위해 100μl/웰[5×10⁵/웰]의 이펙터 세포(PBMC)와 함께 50μl/웰[1×10⁴/웰]로 배양하였다. 공동 배양물을 37℃, 5% CO2에서 2 및 3시간 동안 배양하였다. 200μl/웰의 유로퓸 용액을 DELFIA 키트 96-웰 평저 스트립-웰 판독 플레이트 내에 준비하고 ADCC 검정 배양 플레이트로부터의 20μl/웰의 상청액을 여기에 옮긴 다음, 240rpm 진탕기 상에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, CLARIOstar Plus 플레이트 판독기에서 EuTDA 형광을 측정하였다.

이 검정은 항-VISTA항체 번호 421.1, 항체 번호 245.1, 항체 번호 475.1(LS), 항체 번호 465.1, 항체 번호 457.1 및 항체 번호 173.1이 Raji-hVISTA 표적 세포에 대한 ADCC 활성을 유도함을 나타냈다. 항체 번호 245.1 및 항체 번호 475.1(LS)은 거의 동일한 유도된 ADCC 활성을 보였다. 항체 번호 173.1(WT)은 항체 번호 420.1(YTE)보다 ADCC 활성 유도율이 더 높고 EC50 값은 더 작았다. 항체 번호 173.4는 항체 번호 173.1과 비교하여 Raji-hVISTA 표적 세포에 대해 낮은 수준의 유도된 ADCC 활성을 보였다(도 51-55a).

항체 번호 474.1, 150.1 및 246.4 활성을 별도의 ADCC(항체 의존성 세포독성) 검정으로 평가하고 VSTB174와 비교하였다. ADCC 검정에서 항-VISTA 항체(100pg/mL-10mg/mL)를 시험하기 위해 이펙터 세포(X-VIVO-15 배지 중 37℃에서 200U/mL의 IL-2 O/N으로 밤새 처리된 6명의 건강한 공여자의 PBMC) 및 표적 세포(Raji-hVISTA 과발현 세포)를 [12:1] 비율로 사용하여 용량 적정을 수행하였다. 37℃에서 4시간 인큐베이션 후 CytoToxGlo^Tm 시약(Promega)을 사용하여 세포 사멸을 검출하였다. ClarioStar BMG 플레이트 판독기를 사용하여 상대적 발광 단위(RLU)를 측정하였다. 무처리 음성 대조군에 대한 죽은 세포의 배수 증가를 플로팅하였다. Levenberg-Marquardt 알고리즘을 사용하여 억제 곡선을 피팅하였다. 반수 최대 유효 농도(EC₅₀)는 기준선과 최대값 사이의 중간에서 반응을 유도하는 항체의 농도로 정의하였다(도 55b-55c). 이러한 데이터는 VST174 및 항체 번호 474.1(WT)이 Raji-hVISTA 표적 세포에 대해 강한 ADCC 활성을 유도한 반면 항체 번호 150.1(YTE)은 Raji-hVISTA에 대해 감소된 ADCC 활성을 나타냄을 보여준다.

실시예 18: CDC(보체 의존 세포독성)를 유도하기 위한 항-VISTA Mab의 시험관 내 기능적 특성분석

항-VISTA 항체 활성을 CDC(보체 의존성 세포독성) 검정으로 평가하였다. 용량 적정을 수행하여 100, 10, 1.0, 0.1, 0.01 및 0.001ng/ml의 항체 번호 474.1, 항체 번호 150.1 및 항체 번호 246.4를 시험하고 VSTB174와 비교하였다. hVISTA-Raji 세포를 100μL의 X-vivo 배지에 있는 흰색 96-웰 평저 조직 배양 검정 플레이트 상에 100,000개의 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 항체를 96-웰 V자 바닥 폴리프로필렌 플레이트의 X-Vivo-15 배지에서 연속 희석하였다. 50μL의 항체를 검정 플레이트 웰로 옮겼다. 50μL의 인간 범용 AB 혈청(Sigma)을 분석 플레이트 웰에 첨가하였다. 각 웰을 100ul씩 3회 혼합하였다. 이어서, 검정 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. CellTox-Glo 세포독성 검정 키트(Promega)를 사용하여 세포를 검정하고 ClarioStar Plus(BMG Labtech)를 사용하여 데이터를 판독하였다. 리툭시맙을 양성 대조군으로 사용하였다. VSTB174를 제외하고 시험된 항-VISTA Ab 중 어느 것도 강력한 CDC를 유도하지 않았다(도 55d).

실시예 19: 항-VISTA 항체의 인실리코(in silico) 특성분석

항-VISTA 항체의 아미노산 서열을 공분산 위반(covariance violation) 평가, 비표준 글리코실화 부위(non-standard glycosylation site), 비표준 시스테인 배치(non-standard cysteine placement), 염다리 붕괴(salt bridge disruption), 등전점(isoelectric point, pI), 탈아미드화 위험(risk of deamidation), 트립토판 산화 위험(risk of tryptophan oxidation), 이성질체화 위험(risk of isomerization), 및 높은 양성, 음성 또는 소수성 특성이 있는 표면적의 계산을 포함하여 CDR 영역의 잠재적 서열 의존성 발달 책임에 대해 인실리코 분석하였다. 일반적으로 이러한 잠재적 책임은 분해(예를 들어, 탈아미드화, 산화), 이성질체화(예를 들어, Asp-isoAsp), 생성 역가 제한(production titer limitation), 정제 문제, 응집 및 제형 문제, 및 약동학에 대한 해로운 영향, 생체 내 비특이적 결합과 생체분포 변화(changes to biodistribution)로 나타날 수 있다. 분석된 서열 중 항체 번호 269.1, 항체 번호 321.1, 항체 번호 245.1 및 항체 번호 457.1은 주요 발달 책임이 없었다. 항체 번호 465.1 및 항체 번호 173.1의 서열은 생리학적 pH에 가까운 pI 값을 나타냈는데, 이는 잠재적인 차선의 제형 안정성을 나타낼 수 있지만 유용한 활성에 영향을 미치지 않아야 한다.

실시예 20: 항-VISTA 항체의 생체 내 기능적 특성분석 - VISTA-KI 마우스에서 단일 작용제 또는 병용 요법에서의 MC38 종양 성장 억제

이 연구의 목적은 KI-VISTA 마우스의 MC38 뮤린 암 모델에서 항체 번호 245.2의 생체 내 치료 효능을 평가하는 것이었다. 항체 번호 245.2는 마우스 IgG2a 항체이다.

MC38 종양 세포를 공기 중 5% CO₂의 분위기에서 37℃에서 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM에서 시험관 내 배양하였다. 상기 세포를 지수 발육기(exponential growth phase)에서 수확하고 종양 접종 전에 세포 계수기로 정량화하였다. 종양 발달을 위해 각각의 마우스에 0.1ml의 PBS 중 MC38 종양 세포(1×10⁶개)를 오른쪽 뒤 옆구리 부위에 피하 접종하였다. 종양 세포 접종 날짜를 0일로 표시하였다. 평균 종양 크기가 약 75mm³(70-100mm³)에 도달했을 때 무작위 배정하였다. 56마리의 마우스를 연구에 등록하였다. 모든 동물을 7개의 연구 그룹에 무작위로 할당하였다. 종양 세포 접종 후, 동물의 이환율과 사망률을 매일 확인하였다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원에서 주 2회 측정하였고, 부피는 공식 "V = (L × W × W)/2"를 사용하여 mm³로 표시하였으며, 여기서 V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수)이고 W는 종양 너비(L에 수직으로 가장 긴 종양 치수)이다. 투여와 종양 및 체중 측정은 층류 캐비넷(laminar flow cabinet)에서 수행하였다. 체중과 종양 부피는 StudyDirector™ 소프트웨어(버전 3.1.399.19)를 사용하여 측정하였다. 비히클 처리된 대조군의 평균 종양 부피가 2000mm³에 도달하거나 최종 투여 후 1주일 중 먼저 발생하는 시점에 연구를 종료하였다. 미리 지정된 날짜에 상이한 그룹의 종양 부피를 비교하기 위해, Bartlett 검정을 사용하여 모든 그룹에 걸쳐 분산의 동질성 가정을 확인하였다. Bartlett 검정의 p-값이 ≥0.05인 경우 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 실행하여 모든 그룹에 걸쳐 평균의 전반적인 동등성을 시험하였다. 일원 분산 분석의 p-값이 <0.05인 경우, 모든 쌍 비교(pairwise comparison)에 대해 Tukey의 HSD(honest significant difference) 검정을 실행하고 각 처리 그룹과 비히클 그룹의 비교를 위한 Dunnett 검정을 실행하여 추가 사후 검정(post hoc testing)을 수행하였다. Bartlett 검정의 p-값이 <0.05인 경우, Kruskal-Wallis 검정을 실행하여 모든 그룹 간의 중앙값의 전반적인 동등성을 검정하였다. Kruskal-Wallis 검정의 p-값이 <0.05인 경우, 모든 쌍 비교 또는 각 처리 그룹과 비히클 그룹의 비교를 위해 단일 단계 p-값을 조정하면서 Conover의 비모수 검정(non-parametric test)을 실행하여 추가 사후 검정을 수행하였다.

또한, 다중 검정 보정 없이 쌍 비교를 수행하고 Welch의 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정으로부터 직접 명목/보정되지 않은 p-값을 보고하였다. 특히 Bartlett 검정은 한 쌍의 그룹에 대한 분산의 동질성 가정을 확인하기 위해 먼저 사용하였다. Bartlett 검정의 p-값이 ≥0.05인 경우, Welch의 t-검정을 실행하여 명목 p-값을 얻었고, 그렇지 않으면 Mann-Whitney U 검정을 실행하였다. 모든 통계 분석은 R(버전 3.3.1)에서 수행하였다. 달리 명시되지 않는 한 모든 검정은 양측 검정이었으며 p 값이 <0.05이면 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

항체 번호 245.2는 VISTA KI 마우스 모델에서 MC38 종양 성장을 억제하였고, 그 효능은 항-mPD1 항체와 조합되어 증가되었다(도 56a).

실시예 21: 항-VISTA Mab의 생체 내 기능적 특성분석 - VISTA ECD KI 마우스에서 단일 작용제 또는 병용 요법에서의 MB49 종양 성장 억제

이 연구의 목적은 VISTA ECD KI 마우스의 피하 MB49 뮤린 방광암 모델의 치료에서 Ab 번호 474.1(WT) 또는 Ab 번호 150.1(YTE)의 생체 내 치료 효능을 평가하는 것이었다. MB49 종양 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM 배지와 시험관 내에서 배양하였다. 지수 발육기의 세포를 수확하고 종양 접종 전에 세포 계수기로 정량화하였다. 각각의 마우스에 0.1ml의 PBS 중 MB49 종양 세포(마우스당 5×105개의 세포)를 오른쪽 뒤 옆구리 부위에 피하 접종하였다. 종양 세포 접종 날짜를 0일로 표시하였다. 평균 종양 크기가 약 75mm³(60-100mm³)에 도달한 5일차에 마우스를 무작위로 그룹당 8마리의 그룹으로 나누었다. 20mg/kg의 Ab 번호 474.1 또는 Ab 번호 150.1, 20mg/kg의 인간 IgG1, 5mg/kg의 항-mPD1, 또는 항-VISTA Ab와 항-mPD1의 병용 요법으로 3주 동안 5일차에 시작하여 주 2회 복강 내(IP) 투여로 마우스를 처리하였다.

종양 세포 접종 후, 동물의 이환율과 치사율을 매일 확인하였다. 일상적인 모니터링 동안 동물은 이동성, 음식 및 물 소비, 및 불편 징후와 같은 거동에 대한 종양 성장 및 치료의 임의의 영향을 확인하였다. 이러한 징후는 호흡 곤란, 구부린 자세, 그루밍 불량 및 비정상적인 보행을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 개별 동물에 대해 치사율 및 관찰된 임상 징후를 상세히 기록하였다. 체중과 종양 부피를 주당 적어도 3회 측정하였다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 측정하였고 부피는 공식 V = (L × W × W)/2를 사용하여 mm³로 표현하였으며, 여기서 V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수)이고, W는 종양 너비(L에 수직으로 가장 긴 종양 치수)이다. 마우스의 초기 체중의 ≥20%가 줄거나 신체 상태 점수가 1점에 도달하는 경우, 종양 부피가 ≥2000mm³에 도달하거나 마우스 체중의 ≥10%에 도달하는 것 중 먼저 발생하는 시점에 마우스를 안락사시켰다. 궤양 종양이 있는 마우스를 매일 모니터링하고 궤양이 24시간 동안 열리거나 궤양이 ≥1000mm³인 경우 즉시 안락사시켰다.

Ab 번호 474.1 또는 Ab 번호 150.1은 모두 단일 작용제로서 VISTA KI 마우스 모델에서 MB49 종양 성장을 강력하게 억제한다(도 56b). Ab 번호 150.1의 효능은 VISTA KI 마우스 모델에서, 예를 들어, 항-mPD1과의 병용 요법에서 향상된다(도 56c).

실시예 22: 단일 작용제 항-VISTA Mab 또는 병용 요법으로 처리된 VISTA-KI 마우스의 MB49 종양 미세환경에서의 면역 세포의 표현형 특성분석.

종양 침윤 면역 세포의 표현형을 다중-파라미터 유세포분석 실험으로 분석하였다. 종양 샘플을 13일차(3차 투여 후 24시간)에 그룹당 3마리의 마우스로부터 수확하고 단일 세포 현탁액을 종양 해리 키트, Miltenyi Biotech의 마우스(카탈로그 번호 130-096-730)를 사용하여 제조하였다. 유세포분석기 염색 버퍼(2% FBS/PBS + 1mM EDTA) 중 단일 세포 현탁액을 5천만개의 세포/mL의 최종 농도로 제조하였다. 표현형 분석을 위해 세포를 염색하기 위해 각 종양 샘플에서 제조된 50uL의 단일 세포 현탁액을 96-웰 u자 바닥 플레이트에 첨가하였다. 나머지 샘플을 조합하여 FMO 염색에 사용하였다. 세포를 400g/5분으로 회전시키고 상청액을 버렸다. 50uL의 블록 버퍼를 각 샘플에 첨가하고(FCS 버퍼 중 BD 마우스 Fc 블록 카탈로그 번호 553141의 1:50 희석) 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플 수를 기준으로 항체 칵테일을 준비하고 전체 염색 칵테일에서 하나의 형광단 접합된 항체를 뺀 모든 항체를 첨가하여 각 FMO 칵테일을 제조하였다. 블록 버퍼에서 염색된 세포에 각 샘플과 FMO에 대한 50uL의 항체 칵테일을 첨가하고 얼음에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후 세포를 400g으로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 버린다. 표면 염색 후, RBC를 용해시키고 샘플을 100uL의 1x 1 단계 Lyse Fix 버퍼(ebiosciences 카탈로그 번호 00-5333-54)로 고정하고 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 유세포분석 염색 버퍼로 세포를 2회 세척한다. 125uL의 유세포분석 염색 버퍼에 세포를 재현탁시키고 Attune NXT 유세포분석기에서 실행한다.

Ab 번호 150.1에 의한 MB49 방광 종양의 처리는 종양 내 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 물론 NK 세포의 증가를 유도한다. 이러한 T 세포는 대부분 이펙터 기억 T 세포이다. 게다가, Ab 번호 150.1 처리는 종양으로 들어가는 억제성 gMDSC의 수를 줄이고 M2 대식세포를 M1으로 전환시킨다. Ab 번호 150.1과 항 mPD1의 조합은 종양 내 이펙터 기억 CD4+ T 세포의 빈도를 추가로 증가시킨다(도 56d-56l).

실시예 23: 인간 VISTA KI 마우스에서 항-hVISTA 항체의 노출 수준을 평가하기 위한 생체 내 약동학 연구.

이 약동학 연구는 10, 30 또는 100mg/kg의 복강 내(IP) 투여 후 인간 VISTA KI 마우스에서 항-hVISTA 항체의 노출 수준을 평가하기 위해 수행하였다. 투여 후 2, 4, 8, 24, 48 또는 72시간 시점에 채혈을 수행하였다.

0.5% BSA-PBS 및 0.1-10% 마우스 혈청에서의 각각의 항-VISTA 항체에 대해 10-포인트 표준 곡선을 먼저 생성하였다. 항체 번호 245.1 및 항체 번호 245.2를 PBS에서 500ng/mL로 희석하고 0.1-10% 마우스 혈청에서 0.5ng/mL-500ng/mL의 최종 농도 범위를 위해 2.4배 희석하였다. 각 플레이트에 대해 표준 곡선을 생성하고 S자형 용량-반응(가변 기울기)을 이용한 비선형 회귀를 사용하여 샘플에 적용하였다. 이어서, 샘플을 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000 또는 1:100,000으로 희석하고 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 마우스 혈청의 표준 곡선에서 농도를 알아냈다. 공개된 지침(A Fray 등 1998. A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. Journal of Immunological Methods 221, 35-41)에 따라 95% 신뢰 구간으로 양성 샘플을 검출하기 위해 다음 방정식을 사용하여 각 ELISA 플레이트에 대해 양성 OD 컷 포인트를 계산하였다: 컷 포인트 = 배경의 평균 OD₄₅₀ + (배경의 OD₄₅₀의 SD × SD 승수). SD: 표준 편차; SD 승수: 표준 편차 승수는 반복 횟수에 따라 다르다: 3.372를 3회 반복 샘플의 승수로 사용하였다.

블랭크 표준(0ng/mL)에 대한 컷 포인트를 결정하였다. 블랭크 표준에 대해 계산된 컷 포인트는 표준 곡선에 대한 양성 샘플을 결정하는 데 사용하였고 투여 전 혈장 샘플에 대해 계산된 컷 포인트는 각 동물에 대한 양성 샘플을 결정하는 데 사용하였다. 각 표준 곡선 농도에 대해, 정확도(공칭값의 %) 및 정밀도(변동 계수; CV %)를 계산하였다. 정량 범위는 다음 기준에 따라 결정하였다.

표준 정확도는 공칭값의 ±20%(정량 하한(lower limit of quantitation, LLOQ) 및 정량 상한(upper limit of quantitation, ULOQ)에서는 ±25%)이다.

표준 정밀도는 CV의 ±20%(LLOQ 및 ULOQ에서는 ±25%)이다.

전체 오차(정확도 + 정밀도)는 30%(LLOQ 및 ULOQ에서는 40%)를 초과하지 않는다.

정량 범위에서 0이 아닌 표준의 75%가 위의 기준(LLOQ 및 ULOQ 포함)을 충족한다.

LLOQ는 표준 곡선에 대해 결정된 컷 포인트를 초과한다.

그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 S자형 용량-반응(가변 기울기)을 이용한 비선형 회귀를 사용하여 각 샘플의 농도 값을 결정하였다. 각 샘플에 대해, 용량-반응 곡선의 EC₅₀의 OD₄₅₀ 값에 가장 근접한 OD₄₅₀ 값을 초래하는 혈장 희석을 사용하여 해당 시점에 대한 농도를 결정하였다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 각 표준 곡선의 EC₅₀을 결정하였다. EC₅₀의 OD₄₅₀ 값을 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:

암컷 인간 VISTA KI 마우스에 항체 번호 245.1을 30mg/kg IP 투여한 후, 항체 번호 245.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 4시간에 C_max 645μg/mL를 달성하였고, 상기 노출은 투여 후 72시간에 6μg/mL로 감소하였다. AUC는 11,008시간*μg/mL였고 반감기는 9.6시간이었다. 10mg/kg 및 100mg/kg 용량의 항체 번호 245.1과 비교하여, 10mg/kg에서 30mg/kg으로 용량이 증가함에 따라 AUC가 7.6배 증가하였고, 30mg/kg에서 100mg/kg으로 용량이 증가함에 따라 AUC가 3.4배 증가하였다. 30mg/kg 용량의 반감기(9.6시간)는 10mg/kg 용량의 반감기(9.4시간)와 유사하였다.

항체 번호 245.1(인간 IgG1) 및 항체 번호 245.2(마우스 IgG2a)의 약동학 프로파일은 거의 동일하였다(도 57a 및 57b).

실시예 24: 인간 VISTA KI 마우스에서 항-hVISTA 항체의 노출 수준을 평가하기 위한 생체 내 약동학 연구.

10mg/kg의 복강 내(IP) 투여 후 인간 VISTA KI 마우스에서 신규 항-hVISTA 항체의 노출 수준을 평가하기 위해 약동학 연구를 수행하였다. 채혈은 2, 4, 8, 12, 24 또는 48시간 시점에서 수행하였다.

10mg/kg 또는 30mg/kg의 복강 내(IP) 반복 투여 후 인간 VISTA KI 마우스에서 신규 항-VISTA 항체의 노출 수준을 평가하기 위해 또 다른 약동학 연구를 수행하였다. 10mg/kg 그룹의 마우스에게 총 3회 용량으로 48시간마다 투여하였고 30mg/kg 그룹의 마우스에게 총 4회 용량으로 3-4일마다 투여하였다. 채혈은 4, 8, 12, 24, 48, 72 또는 96시간 시점에서 수행하였다.

0.5% BSA-PBS 및 0.1-10% 마우스 혈청에서의 각각의 항-VISTA 항체에 대해 10-포인트 표준 곡선을 먼저 생성하였다. Ab 번호 474.1, 150.1 및 VSTB174를 PBS에서 250ng/mL로 희석하고 0.1-10% 마우스 혈청에서 0.2ng/mL-250ng/mL의 최종 농도 범위로 2.4배 희석하였다. 각 플레이트에 대한 표준 곡선을 생성하고 S자형 용량-반응(가변 기울기)을 이용한 비선형 회귀를 사용하여 샘플에 적용하였다. 이어서, 샘플을 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000 또는 1:100,000으로 희석하고 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 상술된 바와 같이 마우스 혈청에서의 항-VISTA 항체 표준 곡선으로부터 농도를 알아냈다. 공개된 지침(A Frey, 등)에 따라 95% 신뢰 구간으로 양성 샘플을 검출하기 위해 아래 방정식을 사용하여 각 ELISA 플레이트에 대한 양성 OD 컷 포인트를 계산하였다:

컷 포인트 = 배경의 평균 OD450 + (배경의 OD450의 SD × SD 승수)

SD: 표준편차

SD 승수: 표준 편차 승수는 반복 횟수에 따라 다르다: 3.372를 3회 반복 샘플의 승수로 사용하였다.

블랭크 표준(0ng/mL)에 대한 컷 포인트를 결정하였다. 블랭크 표준에 대해 계산된 컷 포인트를 표준 곡선 및 미지 샘플에 대한 양성 샘플을 결정하는 데 사용하였다. 각 표준 곡선 농도에 대해 정확도(공칭값의 %) 및 정밀도(변동 계수; CV %)를 계산하였다. 정량 범위는 다음 기준에 따라 결정하였다:

1. 표준 정확도는 공칭값의 ±20%(LLOQ 및 ULOQ에서는 ±25%)이다.

2. 표준 정밀도는 CV의 ±20%(LLOQ 및 ULOQ에서는 ±25%)이다.

3. 전체 오차(정확도 + 정밀도)는 30%(LLOQ 및 ULOQ에서는 40%)를 초과하지 않는다.

4. 정량 범위에서 0이 아닌 표준의 75%가 위의 기준(LLOQ 및 ULOQ 포함)을 충족한다.

5. LLOQ는 표준 곡선에 대해 결정된 컷 포인트를 초과한다.

그래프패드 프리즘을 사용하여 S자형 용량-반응(가변 기울기)을 이용한 비선형 회귀를 사용하여 각 샘플에 대한 농도 값을 결정하였다. 각 샘플에 대해, 용량-반응 곡선의 EC50의 OD450 값에 가장 근접한 OD450 값을 초래하는 혈장 희석을 사용하여 해당 시점에 대한 농도를 결정하였다(도 57c-57e 및 표 32 및 33). 그래프패드 프리즘을 사용하여 각 표준 곡선의 EC50을 결정하였다. EC50의 OD450 값은 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:

암컷 인간 VISTA KI 마우스에 Ab 번호 474.1을 10mg/kg IP 투여한 후, Ab 번호 474.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 2시간에 Cmax가 96ug/mL였으며 투여 후 24시간(T_last)에 노출이 0.008ug/mL로 감소하였다. 혈청 노출은 투여 후 48시간에 BLQ였다. AUC는 975시간*ug/mL였고 반감기는 1.4시간이었다.

암컷 인간 VISTA KI 마우스에 Ab 번호 150.1을 10mg/kg IP 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 4시간에 Cmax가 56ug/mL였으며 투여 후 24시간에 노출이 0.007ug/mL로 감소하였다. 혈청 노출은 투여 후 48시간에 BLQ였다. AUC는 680시간*ug/mL였고 반감기는 1.2시간이었다.

암컷 인간 VISTA KI 마우스에 VSTB174를 10mg/kg IP 투여한 후, VSTB174 최고 혈청 노출은 투여 후 4시간에 Cmax가 92ug/mL였으며 투여 후 24시간에 노출이 0.003ug/mL로 감소하였다. 혈청 노출은 투여 후 48시간에 BLQ였다. AUC는 1046시간*ug/mL였고 반감기는 1.3시간이었다.

암컷 인간 VISTA KI 마우스에 Ab 번호 150.1을 단일 10mg/kg IP 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 4시간에 Cmax가 65ug/mL였으며 투여 후 24시간에 노출이 0.02ug/mL로 감소하였다. AUC는 590시간*ug/mL였고 반감기는 1.4시간이었다. 5일차에, 암컷 인간 VISTA KI 마우스에 48시간마다 Ab 번호 150.1을 3회 반복 10mg/kg IP 투여한 후, Ab 번호 150.1 혈청 노출은 단일 투여 후 관찰된 노출과 유사하였다. Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 4시간에 Cmax가 67ug/mL(1일차 Cmax의 1배)였으며 투여 후 24시간에 노출이 0.02ug/mL로 감소하였다. AUC는 645시간*ug/mL(1일차 AUC의 1.1배)이었고 반감기는 1.4시간이었다.

암컷 인간 VISTA KI 마우스에 Ab 번호 150.1을 단일 30mg/kg IP 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 4시간에 Cmax가 294ug/mL였으며 투여 후 48시간에 노출이 0.01ug/mL로 감소하였다. AUC는 4327시간*ug/mL였고 반감기는 2.8시간이었다. 11일차에, 암컷 인간 VISTA KI에 3-4일마다 Ab 번호 150.1을 4회 반복 30mg/kg IP 투여한 후, Ab 번호 150.1의 마우스 최고 혈청 노출은 투여 후 4시간에 Cmax가 135ug/mL(1일차 Cmax의 0.5배)였으며 투여 후 48시간에 노출이 0.01ug/mL로 감소하였다. AUC는 902시간*ug/mL(1일차 AUC의 0.2배)이었고 반감기는 3.3시간이었다.

실시예 25: 사이노몰구스 원숭이에서 항-hVISTA 항체 Ab 번호 150.1의 노출 수준을 평가하기 위한 생체 내 약동학 연구

수컷 및 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 단일 30mg/kg 정맥 내(IV) 투여 후, 매일 3회 10mg/kg IV 투여 후, 및 격일로 5회 5mg/kg IV 투여 후 사이노몰구스 원숭이에서 신규 항-hVISTA 항체의 노출 수준을 평가하기 위해 약동학 연구를 수행하였다. 채혈은 30mg/kg 및 10mg/kg 투여 후 0.083, 24, 72, 120, 168, 216, 240 또는 264시간 시점에, 그리고 5mg/kg 투여 후 0.083, 24, 48, 72 또는 120시간 시점에 수행하였다.

10mg/kg, 30mg/kg 또는 100mg/kg의 반복 정맥 내(IV) 투여 후 사이노몰구스 원숭이에서 신규 항-VISTA 항체의 노출 수준을 평가하기 위해 독성동태학(toxicokinetics) 연구를 수행하였다. 원숭이에게 총 4회 용량으로 7일마다 투여하였다. 채혈은 1차 및 4차 투여 후 0.083, 6, 24, 48, 72 또는 168시간 시점에 수행하였다.

0.5% BSA-PBS 및 0.01-10% 사이노몰구스 원숭이 혈청에서의 각각의 Ab에 대해 10-포인트 표준 곡선을 먼저 생성하였다. Ab 번호 150.1을 PBS에서 250ng/mL로 희석하였고 0.01-10% 원숭이 혈청에서 0.2ng/mL-250ng/mL의 최종 농도 범위를 위해 2.4배 희석하였다. 표준 곡선을 각 플레이트에 대해 생성하고 S자형 용량-반응(가변 기울기)을 이용한 비선형 회귀를 사용하여 샘플에 적용하였다. 이어서, 샘플을 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000 또는 1:100,000으로 희석하고 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 상술된 바와 같이 원숭이 혈청의 항체 표준 곡선으로부터 농도를 알아냈다. 공개된 지침(A Frey, 등)에 따라 95% 신뢰 구간으로 양성 샘플을 검출하기 위해 아래 방정식을 사용하여 각 ELISA 플레이트에 대한 양성 OD 컷 포인트를 계산하였다:

컷 포인트 = 배경의 평균 OD₄₅₀ + (배경의 OD₄₅₀의 SD × SD 승수)

SD: 표준편차

SD 승수: 표준편차 승수는 반복 횟수에 따라 다르다: 3.372를 3회 반복 샘플의 승수로 사용하였다.

블랭크 표준(0ng/mL)과 동물의 사전 출혈 혈청 샘플에 대해 컷 포인트를 결정하였다. 블랭크 표준에 대해 계산된 컷 포인트는 표준 곡선에 대한 양성 샘플을 결정하는 데 사용하였고 사전 출혈 혈장 샘플에 대해 계산된 컷 포인트는 해당 동물에 대한 양성 샘플을 결정하는 데 사용하였다. 각 표준 곡선 농도에 대해 정확도(공칭값의 %) 및 정밀도(변동 계수; CV %)를 계산하였다. 정량 범위는 다음 기준에 따라 결정하였다:

1. 표준 정확도는 공칭값의 ±20%(LLOQ 및 ULOQ에서는 ±25%)이다.

2. 표준 정밀도는 CV의 ±20%(LLOQ 및 ULOQ에서는 ±25%)이다.

5. LLOQ는 표준 곡선에 대해 결정된 컷 포인트를 초과한다.

그래프패드 프리즘을 사용하여 S자형 용량-반응(가변 기울기)을 이용한 비선형 회귀를 사용하여 각 샘플에 대한 농도 값을 결정하였다. 각 샘플에 대해, 용량-반응 곡선의 EC₅₀의 OD₄₅₀ 값에 가장 근접한 OD₄₅₀ 값을 초래하는 혈장 희석을 사용하여 해당 시점에 대한 농도를 결정하였다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 각 표준 곡선의 EC₅₀을 결정하였다. EC₅₀의 OD₄₅₀ 값은 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:

수컷 사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 단일 30mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 1032ug/mL였으며 투여 후 264시간에 노출이 40ug/mL로 감소하였다. AUC는 71811시간*ug/mL였고 반감기는 65시간이었다. 암컷 사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 단일 30mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 987ug/mL였으며 투여 후 264시간에 노출이 0.04ug/mL로 감소하였다. AUC는 45742시간*ug/mL였고 반감기는 10시간이었다.

수컷 사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 3회 매일 10mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 624ug/mL였으며 투여 후 264시간에 노출이 5ug/mL로 감소하였다. AUC는 51617시간*ug/mL였고 반감기는 22시간이었다. 암컷 사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 3회 매일 10mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 647ug/mL였으며 투여 후 264시간에 노출이 0.01ug/mL로 감소하였다. AUC는 36735시간*ug/mL였고 반감기는 9시간이었다.

암컷 사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 격일로 5회 5mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 222ug/mL였으며 투여 후 120시간에 노출이 6ug/mL로 감소하였다. AUC는 7470시간*ug/mL였고 반감기는 24시간이었다.

사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 단일 10mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 320ug/mL였으며 투여 후 168시간에 노출이 18ug/mL로 감소하였다. AUC는 16955시간*ug/mL였고 반감기는 47시간이었다. 22일차에 사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 4회 매주 10mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 291ug/mL(1일차 Cmax의 0.9배)였으며 투여 후 168시간에 노출이 0.3ug/mL로 감소하였다. AUC는 3493시간*ug/mL(1일차 AUC의 0.2배)였고 반감기는 19시간이었다.

사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 단일 30mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 900ug/mL였으며 투여 후 168시간에 노출이 66ug/mL로 감소하였다. AUC는 54708시간*ug/mL였고 반감기는 50시간이었다. 22일차에 사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 4회 매주 30mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고, Cmax는 885ug/mL(1일차 Cmax의 1배)였으며 투여 후 168시간에 노출이 6ug/mL로 감소하였다. AUC는 18924시간*ug/mL(1일차 AUC의 0.3배)였고 반감기는 44시간이었다.

사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 단일 100mg/kg IV 투여 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 2261ug/mL였으며 투여 후 168시간에 노출이 820ug/mL로 감소하였다. AUC는 184167시간*ug/mL였고 반감기는 118시간이었다. 22일차에 사이노몰구스 원숭이에게 Ab 번호 150.1을 4회 매주 100mg/kg IV 투여한 후, Ab 번호 150.1의 최고 혈청 노출은 투여 후 0.083시간이었고 Cmax는 3498ug/mL(1일차 Cmax의 1.5배)였으며 투여 후 168시간에 노출이 1427ug/mL로 감소하였다. AUC는 317489시간*ug/mL(1일차 AUC의 1.7배)였고 반감기는 121시간이었다.

이러한 생체 내 약동학 연구에 더하여, 임상 관찰, 혈액학, 임상 화학 및 면역원성을 모니터링하였다. 명백한 임상 징후 또는 체중 감소가 관찰되지 않았고, 임상 병리학적 엔드포인트에 대한 치료 관련 소견이 검출되지 않았으며, 사이토카인 방출 증후군, 특히 IL6 및 TNFα와 관련된 사이토카인 수준의 변화가 관찰되지 않았다. 요약하면, 높은 반복 투여량(100mg/kg)에서도 항체 번호 150.1은 연장된 PK와 관련된 탁월한 내약성을 나타냈다.

실시예 26: 사이노몰구스 원숭이에서 항-hVISTA 항체 Ab 번호 150.1의 혈청 노출 수준과 단핵구 수용체 점유율의 관계를 평가하기 위한 생체 내 독성동태학 연구

10mg/kg, 30mg/kg 또는 100mg/kg의 반복 정맥 내(IV) 투여 후 사이노몰구스 원숭이에서 신규 항-VISTA 항체의 혈청 노출 수준과 단핵구 수용체 점유율의 관계를 평가하기 위한 독성동태학 연구도 수행하였다. 원숭이에게 총 4회 용량으로 7일마다 투여하였다. 혈청 노출 측정을 위한 채혈은 1차 및 4차 투여 후 0.083, 6, 24, 48, 72 또는 168시간 시점에 수행하였다. 이러한 데이터는 표 36에 보고되어 있다. 수용체 점유율 측정을 위한 혈액 채혈은 1차 및 4차 투여 후 6, 72 또는 168시간 시점에 수행하였다.

혈액 채취일에 세포 샘플을 동결하였다. 모든 시점의 샘플을 해동하고, 염색하고, 유리(Free), 배경(Background), 결합(Bound) 및 전체(Total) 검정에서 생존 가능한 싱글렛(singlet) CD45+, CD14+, HLA-DR+ 세포의 항-VISTA-AlexaFluor 647 중간 형광 강도를 유세포분석 측정으로 같은 날에 분석하였다. 항-CD45-PE, 항-CD14-Brilliant Violet 421, 항-HLA-DR-AlexaFluor488 및 고정 가능한 생/사 라임 생존력 염료(Fixable Live/Dead Lime Viability Dye)를 함유하는 염색 칵테일 및 Ab 번호 150.1-AlexaFluor647을 첨가하기 전에, 유리 및 배경 검정 샘플을 각각 염색 버퍼 또는 1000ug/mL의 시험 항목 항체 번호 150.1과 함께 1/2시간 동안 인큐베이션하였다. 고정/용해 용액을 첨가하여 샘플을 고정하였다. 결합 및 전체 검정 샘플을 각각 염색 버퍼 또는 80ug/mL의 시험 항목 항체 Ab 번호 150.1과 함께 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 2회 세척하였다. 이어서, 샘플을 항-CD45-PE, 항-CD14-Brilliant Violet 421, 항-HLA-DR-AlexaFluor488, 고정 가능한 생/사 라임 생존력 염료 및 염소-항-인간 IgG(NHP-흡착)-AlexaFluor647을 함유하는 염색 칵테일과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 한 번 세척한 다음, 고정/용해 용액을 첨가하여 고정하였다. 연구 샘플, QC 샘플, 비드 보상 샘플(bead compensation sample) 및 AlexaFluor647 MESF 비드 샘플을 Attune Nxt 음향 세포계산기(acoustic cytometer)로 획득하였다. 획득한 샘플의 .fcs 파일은 Flowjo 소프트웨어로 보상 및 분석하였다. Quantum AlexaFluor647 MESF 비드 및 QuickCal v2.3 정량 소프트웨어를 적용하여 생존 가능한 싱글렛 CD45+, CD14+, HLA-DR+ 세포의 항-VISTA-AlexaFluor 647 중간 형광 강도를 정량하고 AlexaFluor647 형광 강도의 표준화된 단위로 변환하였다. 이러한 값을 아래 계산에 입력하여 유리 수용체 %(방정식 1), 결합 수용체 %(방정식 2) 및 가중 수용체 점유율 %(방정식 3) 값을 생성하였다. 100%를 초과하는 방정식 2의 값은 100%로 변환하여 방정식 3에 입력하였다. 데이터는 Microsoft Excel(365 for Business)로 분석하고 그래프패드 프리즘(v8)으로 그래프로 작성하였다. 가중 수용체 점유율 %값은 도면 및 표에서 "수용체 점유율 %"로 보고하였다.

방정식 1:

방정식 2:

방정식 3:

10, 30 및 100mg/kg의 Ab 번호 150.1 투여 그룹의 평균 VISTA 수용체 점유율 수준은 10, 30 및 100mg/kg 그룹에서 각각 >18, 66 및 820ug/ml의 생체 내 노출 수준으로 1차 투여 후 해당 주 동안 >90%로 유지되었다. 10 및 30mg/kg 용량 그룹 각각에서 한 마리의 동물이 1차 투여 후 120시간에서 168시간 사이에 혈청 노출 및 수용체 점유율의 중간 정도의 감소와 함께 가속화된 베타 단계 클리어런스를 나타냈다. 대조적으로, 두 동물 모두 1차 투여 후 168시간 동안 지속적으로 높은 노출 및 수용체 점유율을 나타냈다. 높은 수용체 점유율 수준은 4차 투여 후 100mg/kg 투여 동물에서 높은 노출 수준으로 계속 유지되었다. 대조적으로 수용체 점유율은 4차 투여 후 30 및 10mg/kg 그룹의 동물 모두에서 노출 수준과 평행하게 빠르게 감소하였다. 이것은 아마도 ADA의 발달로 설명될 수 있다. 도 57f-57n 참조.

실시예 27: 사이노몰구스 원숭이에서 항-VISTA Mab 면역 활성화의 생체 내 기능적 특성분석

항체 번호 173.1, 항체 번호 173.4, 항체 번호 289.1 및 항체 번호 420.1 항체가 10mg/kg의 단일 및 반복 정맥 내 투여 후 사이노몰구스 원숭이의 말초 혈액에서 골수 세포 활성화 마커를 조절하는 능력을 하기 방법에 따라 평가하였다:

동시(투여 전) 임상 병리학 샘플 수집을 위해 투여 전에 동물을 절식시켰다. 각 동물은 적절한 시험 항체의 단일 정맥 주사(IV) 용량을 받았다. 1일차 및 8일차 처리는 표 37에 요약된 바와 같다. 정맥 내 용량을 요측피정맥(cephalic vein)/복재정맥(saphenous vein)(또는 다른 적합한 정맥)을 통해 투여하였다. 상기 용량은 최소 2분에 걸쳐 느린 주사로 투여하였으며, 모든 채혈 시간은 투여 종료 시점부터 계산하였다.

골수 세포 집단 및 활성화 마커의 발현을 생체 외 유세포분석으로 평가하였다. 세포 샘플을 채혈 당일 동결하였고 분석할 때까지 보관하였다. 골수 집단 크기 및 활성화 마커 측정을 위해 투여 전 및 투여 후 모든 시점의 샘플을 동일한 날에 해동, 염색 및 분석하였다. 생존 가능한 싱글렛 세포 및 CD45+ 세포에 대한 샘플을 게이팅하였다. 골수 세포는 CD45+ 집단에서 CD66-CD3-CD8-CD20-, 측방 산란 중층 세포(side scatter intermediate cell)로 확인되었다. 단핵구는 골수 집단에서 CD14+ 세포로 확인되었다. CD14-HLA-DR+ 집단은 골수 세포의 분석으로 확인되었다. 골수성 DC(mDC)는 CD14-HLA-DR+ 집단에서 CD1c+ 및/또는 CD11c+CD123- 세포로 확인되었다.

항-VISTA 항체에 대한 생체 내 노출 후 mDC 및 CD14+ 집단에서 활성화 마커의 변화를 측정하였다. 도 58a-58x는 생체 외 유세포분석에 의해 확인된 투여 전 대비 MFI의 변화 %를 보여준다. 골수성 DC(mDC)는 CD45+ 세포의 게이팅 분석에 의해 확인되었다. mDC의 CD80, CD86 및 HLA-DR의 평균 형광 강도를 기술적 복제물에 대해 얻었고 FMO 샘플로부터의 MFI를 뺐다. 투여 전 수준 대비 MFI의 변화 백분율을 다음과 같이 계산하였다:

골수 활성화 마커는 항-VISTA 항체에 의해 mDC 및 단핵구(CD14+ 세포) 모두에서 상향조절되었다. 항체 번호 173.1은 두 용량 투여 후 72시간에 mDC에서 활성화 마커 CD80 및 CD86을 강력하게 상향조절하고 HLA-DR을 완만하게 상향조절하였다. 항체 번호 173.4는 1차 투여 후 mDC에서 CD86 및 HLA-DR을 완만하게 상향조절하였다. 항체 번호 173.1은 두 용량 투여 후 72시간에 CD14+ 세포에서 활성화 마커 CD80 및 CD86을 강력하게 상향조절하였다. 항체 번호 173.4는 CD14+ 세포에서 CD80 및 CD86을 완만하게 상향조절하였다. 항체 번호 173.1(WT)에 비해, 항체 번호 289.1(LS 돌연변이)은 mDC 및 단핵구(CD14+ 세포) 모두에서 CD80 발현을 향상시키면서 CD86 유도를 감소(mDC에서) 또는 제거(단핵구에서)하였다. CD80 및 CD86 유도의 진동 리듬은 본원에 기술된 항-VISTA 항체의 약동학적 프로파일과 일치하며, 이 리듬은 WT 항체보다 돌연변이 항체에서 훨씬 더 두드러졌다. 이러한 패턴은 mDC와 CD14+ 집단 간에 매우 유사하였다. 항체 번호 420.1(YTE 돌연변이)의 CD80 및 CD86 결과는 항체 번호 173.4(WT)의 결과와 가장 유사했지만 약간 더 두드러졌다(CD80은 더 유도됨; CD86은 기준선에서 더 감소함). mDC 및 HLA-DR에서 WT에 의한 적당한 HLA-DR 유도는 LS 및 YTE에 의해 약간 감소되었다(도 58a-58x).

실시예 28: MB49 방광암 모델에서 항-VISTA 항체의 항종양 활성.

VISTA 인간 녹-인 마우스(생후 16-19주)에 PBS 중 5×10⁵개의 MB49 세포를 함유하는 50μL를 0일차에 오른쪽 옆구리에 접종하였다. 마우스를 종양 성장에 대해 모니터링하고 평균 종양 부피가 약 70mm³에 도달했을 때 처리 암에 무작위 배정하였다(그룹당 n=10-11마리의 동물). 동물에게 총 6회 용량으로 5일차부터 시작하여 마우스 kg당 30mg의 IgG2a 대조군 항체(Bio XCell, 클론 C1.18.4), 항체 번호 245.2 또는 항체 번호 245.2 L234A, L235A(LALA)를 2회 매주 주사하였다. 캘리퍼로 2-3일마다 종양 부피를 측정하였다. 최종 연구 투여 후 2일째인 24일차에 동물을 안락사시키고, 종양, 혈액 및 배액 림프절을 수집하였다. 24일차 각 그룹의 평균 종양 부피: IgG2a(1522mm³), 245.2(511mm³) 및 245.2 LALA(1112mm³)(도 59a-59d). 항-VISTA 항체 처리는 245.2 및 245.2 LALA에 대해 각각 66% 및 27%의 종양 성장 억제를 초래하였다. 돌연변이 Fc 항-VISTA 항체는 MB49 모델에서 야생형 항-VISTA IgG2a 항체에 비해 효능이 감소하였다.

실시예 29: 단일 작용제 항-VISTA Mab 또는 병용 요법으로 처리된 VISTA-KI 마우스의 MB49 종양 미세환경에서 면역 세포의 표현형 특성분석.

종양 침윤 면역 세포의 표현형을 다중-파라미터 유세포분석 실험으로 분석하였다. 종양 샘플을 24일차(6회 투여 후 3일)에 그룹당 3마리의 마우스로부터 수확하고 단일 세포 현탁액을 종양 해리 키트, Miltenyi Biotech의 마우스(카탈로그 번호 130-096-730)를 사용하여 제조하였다. 유세포분석기 염색 버퍼(2% FBS/PBS + 1mM EDTA) 중 단일 세포 현탁액을 5천만개의 세포/mL의 최종 농도로 제조하였다. 표현형 분석을 위해 세포를 염색하기 위해 각 종양 샘플에서 제조된 50uL의 단일 세포 현탁액을 96-웰 u자 바닥 플레이트에 첨가하였다. 나머지 샘플을 조합하여 FMO 염색에 사용하였다. 세포를 400g/5분으로 회전시키고 상청액을 버렸다. 50uL의 블록 버퍼를 각 샘플에 첨가하고(FCS 버퍼 중 BD 마우스 Fc 블록 카탈로그 번호 553141의 1:50 희석) 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플 수를 기준으로 항체 칵테일을 준비하고 전체 염색 칵테일에서 하나의 형광단 접합된 항체를 뺀 모든 항체를 첨가하여 각 FMO 칵테일을 제조하였다. 블록 버퍼에서 염색된 세포에 각 샘플과 FMO에 대한 50uL의 항체 칵테일을 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후 세포를 400g으로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 버린다. 표면 염색 후, RBC를 200uL의 1x RBC 용해 버퍼(Biolegend 카탈로그 번호 420301)로 용해시키고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 세포를 400g으로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 버린다. 표면 염색 후, RBC를 용해시키고 샘플을 100uL의 1x 1 단계 Lyse Fix 버퍼(ebiosciences 카탈로그 번호 00-5333-54)로 고정하고 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 유세포분석 염색 버퍼로 세포를 2회 세척한다. 125uL의 유세포분석 염색 버퍼에 세포를 재현탁시키고 Attune NXT 유세포분석기에서 실행한다.

Ab 번호 245.2(Mse IgG2a 백본)에 의한 MB49 방광 종양의 치료는 대부분 CD4+인 종양 내 CD3+ T 세포는 물론 NK 세포의 증가를 유도하는 반면, LALA 돌연변이가 있는 Ab 번호 245.2는 T 세포가 종양으로 침윤하는 빈도를 증가시키지 않는다. 게다가, Ab 번호 245.2 처리는 종양으로 들어가는 억제성 gMDSC의 빈도를 감소시킨다. 도 59e-59h 참조.

실시예 30: E.G7-OVA 흉선종 모델에서 항-VISTA 항체의 항종양 활성.

VISTA 인간 녹-인 마우스(생후 16-18주)에 PBS 중 1 × 10⁶개의 E.G7-OVA 세포를 함유하는 100μL를 0일차에 오른쪽 옆구리에 접종하였다. 마우스를 종양 성장에 대해 모니터링하고 평균 종양 부피가 약 70mm³에 도달했을 때 처리 암에 무작위 배정하였다(그룹당 n=11-12마리의 동물). 동물에게 총 6회 용량으로 7일차부터 시작하여 마우스 kg당 30mg의 IgG2a 대조군 항체(Bio XCell, 클론 C1.18.4), 항체 번호 245.2 또는 항체 번호 245.2 L234A, L235A(LALA)를 2회 매주 주사하였다. 캘리퍼로 2-3일마다 종양 부피를 측정하였다. 최종 연구 투여 후 2일째인 27일차에 동물을 안락사시키고, 종양, 혈액 및 배액 림프절을 수집하였다. 27일차 각 그룹의 평균 종양 부피: IgG2a(1692mm³), 245.2(594mm³) 및 245.2 LALA(716mm³)(도 60a-60d). 항-VISTA 항체 처리는 245.2 및 245.2 LALA에 대해 각각 65% 및 58%의 종양 성장 억제를 초래하였다. 돌연변이 Fc 항-VISTA 항체는 E.G7-OVA 모델에서 야생형 항-VISTA IgG2a 항체와 비교하여 효능이 대략 동일하였다. 항체 번호 245.2 및 항체 245.2 LALA를 사용한 처리는 각각 3마리 및 3마리 동물에서 완전한 종양 퇴행을 초래하였다.

실시예 31: pH 6.0 대 pH 7.4에서 VISTA-ECD로부터의 오프-레이트를 증가시키는 항체 번호 245.1 및 474.1의 중쇄 및 경쇄에서의 히스티딘 치환.

티로신, 아스파르트산, 글루탐산 및 아스파라긴 잔기를 표적화함으로써 항체 번호 245.1 및 항체 번호 474.1의 중쇄 및 경쇄 모두의 CDR 1 내지 3에서 히스티딘 스위치를 설계하였다. EU 넘버링 시스템에 따른 경쇄 Y31H 및 경쇄 Y32H 단일 아미노산 치환은 항체 번호 245.1 배경에서 이루어졌다. 다른 모든 단일 및 다중 치환은 항체 번호 474.1 배경에서 이루어졌다.

히스티딘 치환을 함유하는 항체를 Expi293 세포에서 발현시키고 mAbSelect SuRe 단백질 A 수지로 정제하였다. 항-인간 Fc(AHC) 바이오센서(ForteBio 18-5060) 및 2개의 센서가 병렬로 실행되는 Octet K2를 사용하여 항체-표적 결합 키네틱을 평가하였다. 항체 돌연변이체를 1xPBS pH 7.4(GE SH30028.02)에서 20ug/mL로 희석하고 AHC 바이오센서 상에 120초 동안 로딩하였다. 1xPBS에서 160초 세척 후, 로딩된 바이오센서를 240초 결합 단계를 위해 50nM VISTA-His ECD(Sino Biological 13482-H08H) 분석물에 담갔다. 이어서, 병렬 바이오센서를 360초 해리 단계를 위해 1xPBS에 담궜는데, 하나의 PBS 샘플은 pH 7.4이고 다른 하나는 pH 6.0(1M HCl로 조정됨)이다. 데이터 분석은 Octet 데이터 분석 소프트웨어 버전 9.0.0.14를 사용하여 수행하였다. 원시 데이터 처리에는 차감 없는 기준선 정렬을 사용했으며 Savitzky-Golay 디지털 필터를 사용하여 고주파 노이즈를 제거하였다. 처리된 데이터는 전체적으로 1:1 결합 모델로 피팅하였고 Ka(1/밀리초) 및 Kdis(1/초)를 알아냈다. pH 6.0에서 항체 친화도에 대한 단일 히스티딘 치환의 효과가 표 38에 나와 있다("로딩 샘플 ID"는 항체 번호임). 다음 항체는 pH 7.4에서 Ka 및 Kds가 야생형과 유사했으나 해리 속도는 pH 7.4에 비해 pH 6.0에서 4 내지 6배 증가하였다: 항체 번호 373.1, 467.1, 338.1, 277.1 및 419.1. 돌연변이는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. "VH"는 가변 중쇄 서열의 돌연변이를 나타낸다. "VL"은 가변 경쇄 서열의 돌연변이를 나타낸다. 항체 번호 245.1은 이 분석에서 변형되지 않은 대조군 항체로 사용되었으며 이의 CDR에 히스티딘 치환을 함유하지 않는다. 하나 이상의 히스티딘 스위치 조합을 항체 번호 474.1로 만들고 pH 6.0 대 pH 7.4에서 VISTA-ECD에 대한 Kds를 위와 같이 평가하였다. 결과는 표 39에 제시되어 있다. 돌연변이는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. "VH"는 가변 중쇄 서열의 돌연변이를 나타낸다. "VL"은 가변 경쇄 서열의 돌연변이를 나타낸다. 항체 번호 245.1은 이 분석에서 변형되지 않은 대조군 항체로 사용되었다. 이러한 항체 치환은 단독으로 또는 조합하여 VISTA 수용체로부터 항체의 엔도좀 해리를 증가시킬 것으로 예상된다. 표 39의 결과는 2개 이상의 히스티딘 치환의 조합이 pH 6.0에서 VISTA로부터 항체의 해리를 증가시킬 수 있음을 보여준다.

실시예 32: 진행성 고형 종양 환자에서 항-VISTA 항체의 1/2상 공개 임상 시험(Open Label Trial)

항-VISTA 항체 단독 및 펨브롤리주맙과의 조합의 안전성 및 효능을 진행성 고형 종양 환자의 1/2상 임상 시험으로 평가한다.

연구는 4개의 파트로 수행한다. 파트 A는 진행된 종양이 있는 대상체에게 단일 작용제로서 투여되는 항-VISTA 단클론 면역글로불린 항체를 사용한 용량 증가(dose escalation)로 이루어진다. 파트 B는 항-VISTA 단클론 면역글로불린 항체와 고정 용량(3주에 한 번(Q3W) 200mg)의 펨브롤리주맙을 조합한 용량 증가로 이루어진다. 파트 A와 B의 용량 증가는 동시에 진행된다. 파트 A 및 B의 연구 집단은 용량 수준당 최대 6명의 대상체로 이루어지며 최대 용량 1g까지의 용량 수준 사이에서 항-VISTA 항체 용량이 0.3 내지 0.5 log 증가된다. 치료는 항-VISTA 항체 0.1 내지 1mg 범위의 시작 용량으로 시작한 다음 200mg 내지 1g 범위의 최대 용량까지 증가한다. 용량 증가 시간은 주어진 용량에 대한 환자의 반응에 따라 다르다. 항-VISTA 항체는 Q3W로 느린 IV 주사로 투여된다. 항-VISTA 항체와 펨브롤리주맙은 같은 날 투여하며, 펨브롤리주맙은 30분에 걸쳐 정맥 내 주사로 1차 투여한다. 최대 60명의 대상체가 각 용량 증가 코호트에서 치료를 받는다.

파트 C 및 D는 각각의 용량 증가 그룹에서 최대 내약 용량(maximum tolerated dose, MTD)이 정의되면 시작된다(파트 A는 파트 C에 선행하는 용량 증가 그룹이고 파트 B는 파트 D에 선행하는 용량 증가 그룹이다).

코호트 확장은 항-VISTA 항체를 단일요법(파트 C) 및 펨브롤리주맙과의 조합(파트 D)으로 수행하며, 항-VISTA 항체는 각각의 용량 증가 그룹에서 정의된 MTD로 제공된다. 파트 C에서, 항-VISTA 단일요법은 이전 화학요법(또는 화학방사선요법) 및 항-PD-1(또는 항-PD-L1 요법)에 실패한 재발성 또는 진행성 질환을 가진 비소세포 폐암(NSCLC) 또는 두경부 편평세포암(SCCHN) 환자에게 투여되며, 예를 들어, 상기 암은 화학요법 또는 화학방사선요법 및 항-PD-1 또는 항-PD-L1 요법에 내성이 있다. 파트 C에서는 총 50명의 치료 대상체에 대해 각 종양 그룹에서 약 25명의 대상체를 치료한다.

파트 D에서, 펨브롤리주맙과 조합된 항-VISTA 항체는 다음과 같은 질환 제한된 환자 집단에 투여된다: 각각 (i) NSCLC, (ii) SCCHN, (iii) 간세포암(HCC), (iv) 난소암 및 (v) 자궁경부암 환자. 파트 D에서는 총 125명의 대상체에 대해 각 종양 그룹에서 약 25명의 대상체를 치료한다.

각 암(arm)에 등록된 대상체는 각각의 용량 증가 그룹에서 정의된 MTD로 최대 4회, 12주 주기의 연구 약물(항-VISTA 항체)(총 16회 용량)을 받을 자격이 있다.

파트 A 및 파트 B의 대상체에 대한 추가 포함 기준: (1) 대상체는 진행성(전이성 또는 절제 불가능)이며 기존 요법으로 치료할 수 없는, 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 고형 악성 종양(중추 신경계의 원발성 종양 제외)을 가지고 있고; (2) 대상체는 진행성 또는 전이성 환경에서 적어도 하나의 표준 치료 요법 후에 질환이 진행되었거나 상기 요법에 불내성(intolerant)이었다.

파트 C 및 파트 D의 대상체에 대한 추가 포함 기준은 다음과 같다. 대상체는 다음 종양 특이적 기준 중 하나를 충족한다: NSCLC의 경우, 대상체는 진행성 또는 재발성 질환이 있는 비편평 조직학을 가지고 있어야 하며 이전 화학요법(카보플라틴/파클리탁셀 또는 카보플라틴/프리메트렉시드) 및 항 PD-1 또는 항 PD-L1 요법에 실패했어야 하며, 예를 들어, 상기 암은 화학요법(카보플라틴/파클리탁셀 또는 카보플라틴/프리메트렉시드) 및 항 PD-1 또는 항 PD-L1 요법에 내성이 있다. EGFR 돌연변이가 있는 NSCLC 대상체는 이전 EGFR 티로신 키나제 억제제 요법에 실패했어야 하며, 예를 들어, 상기 암은 EGFR 티로신 키나제 억제제 요법에 내성이 있다. ALK 전좌가 있는 대상체는 이전 ALK 억제제 요법에 실패했어야 하며, 예를 들어, 상기 암은 ALK 억제제 요법에 내성이 있다.

SCCHN의 경우, 대상체는 조직학적으로 확인된 난치성, 국소 진행성, 재발성 또는 전이성 SCCHN이 있어야 한다. SCCHN 대상체는 이전의 백금 함유 요법에 실패했어야 하며(예를 들어, 상기 암은 백금 함유 요법에 내성이 있음) 치유 의도가 있는 방사선요법 또는 외과적 개입의 후보가 아니어야 한다.

HCC의 경우, 대상체는 뇌병증(encephalopathy) 및 임상적으로 유의한 식도 정맥류(esophageal varices)가 없으면서 차일드-퍼 점수(Child-Pugh Score)가 6 미만인 진행성 질환을 가지고 있고 이전의 소라페닙 치료에 실패했어야 한다(예를 들어, 상기 암은 소라페닙에 내성이 있음).

자궁경부암의 경우, 대상체는 편평(squamous), 선편평(adenosquamous) 또는 선암(adenocarcinoma) 조직학의 재발성 또는 전이성 질환이 있어야 하고 이전의 백금 기반 요법에 실패했어야 한다(예를 들어, 상기 암은 백금 기반 요법에 내성이 있음). 난소암 환자는 문서화된 질환 진행과 함께 조직학적으로 확인된 상피성 난소암이 있어야 하고, 이전의 카보플라틴/파클리탁셀 또는 기타 표준 백금 함유 전신 요법에 실패했어야 하며, 예를 들어, 상기 암은 카보플라틴/파클리탁셀 또는 기타 표준 백금 함유 전신 요법에 내성이 있다.

본 발명은 본원에 기술된 특정 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 기술된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 수반되는 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러한 수정은 첨부된 청구범위 내에 있는 것으로 의도된다.

본원에 인용된 모든 참고문헌(예를 들어, 간행물 또는 특허 또는 특허 출원)은 각각의 개별 참고문헌(예를 들어, 간행물 또는 특허 또는 특허 출원)이 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> KINETA, INC. <120> ANTI-VISTA ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 136589-00120 <140> <141> <150> 63/150,995 <151> 2021-02-18 <160> 654 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <400> 8 000 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <400> 20 000 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <400> 22 000 <210> 23 <400> 23 000 <210> 24 <400> 24 000 <210> 25 <400> 25 000 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <400> 27 000 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <400> 38 000 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<211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Gln 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 85 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 86 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 86 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ile Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 87 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln His Asp His Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 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Synthetic polypeptide <400> 95 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 96 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 96 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 103 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe His Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ile Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 104 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 104 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 114 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 115 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Gly Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 116 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 116 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Thr 1 5 10 <210> 117 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Leu His 1 5 10 <210> 118 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 118 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu Gln 1 5 10 <210> 119 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 119 Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Tyr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 120 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 121 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr His Leu Ala 1 5 10 <210> 122 <211> 11 <212> PRT 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 His Ala Phe Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Asp Ala Phe His Arg Ala Thr 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 His Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Asp Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 132 His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Gln Thr 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 261 Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 262 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 262 Tyr Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 263 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 263 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 264 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 264 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn His Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 265 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 265 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 266 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 282 Asp Ile Pro Ala Phe Ala Leu Asp Ile 1 5 <210> 283 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 283 Asp Ile Pro Ala Ser Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 284 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 284 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 285 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 285 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 286 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 286 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> 287 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 287 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 10 <210> 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Synthetic polypeptide <400> 416 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Leu Tyr Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Pro Val Ala Met Asn Phe Asp Asp Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 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tcatctttcc cccttccgac gagcagctga agtctggcac cgccagcgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctaccctcgg gaggccaagg tccagtggaa ggtggataac gccctgcagt 540 ctggcaatag ccaggagtcc gtgaccgagc aggactctaa ggatagcaca tattccctgt 600 ctagcaccct gacactgagc aaggccgatt acgagaagca caaggtgtat gcctgtgaag 660 tcacccatca ggggctgtca tcacccgtca ctaagtcatt caatcgcgga gaatgctgat 720 aagctt 726 <210> 479 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 479 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gtattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggggtcca tagtgagatc gtgctgacac agagccccga tttccagagc gtgaccccta 120 aagaaaaagt gaccatcacc tgtcgggcca gccagagcat cggatctagc ctgcattggt 180 atcagcagaa gcccgatcag agccccaagc tgctgattaa gtacgccagc cagtccatca 240 gcggcgtgcc aagcagattt tctggcagcg gctctggcac cgacttcacc ctgacaatca 300 acagcctgga agccgaggat gccgccgctt actactgtca ccagtctagc agcctgcctc 360 agacctttgg ccagggcacc aaggtggaaa tcaagagagc cgacgccgcc cctaccgtgt 420 ccatcttccc acctagctct gaacagctga ccagcggcgg agccagcgtg gtgtgcttcc 480 tgaacaactt ctaccccaag gacatcaacg tgaagtggaa gatcgacggc agcgagagac 540 agaacggcgt gctgaatagc tggaccgacc aggacagcaa ggatagcacc tacagcatga 600 gcagcaccct gacactgacc aaggacgagt acgagcggca caacagctac acatgcgagg 660 ccacacacaa gaccagcaca tctcctatcg tgaagagctt caacagaaac gagtgctgat 720 aagctt 726 <210> 480 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 480 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gtattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggggtcca tagtgacatc cagatgacac agagccctag cagcctgtct gccagcgtgg 120 gagacagagt gaccatcacc tgtagagcca gccagggcat ctcttcttgg ctggcctggt 180 atcagcagaa gcccgagaag gcccctaaga gcctgatcta tgccgccagc tctctgcagt 240 ctggcgtgcc atctagattt tccggcagcg gctctggcac cgacttcacc ctgaccatat 300 ctagcctgca gcctgaggac ttcgccacct actactgcca gcagtacaac agctacccct 360 acacctttgg ccagggcacc aagctggaaa tcaagaggac agtggccgcc ccaagcgtgt 420 tcatctttcc cccttccgac gagcagctga agtctggcac cgccagcgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctaccctcgg gaggccaagg tccagtggaa ggtggataac gccctgcagt 540 ctggcaatag ccaggagtcc gtgaccgagc aggactctaa ggatagcaca tattccctgt 600 ctagcaccct gacactgagc aaggccgatt acgagaagca caaggtgtat gcctgtgaag 660 tcacccatca ggggctgtca tcacccgtca ctaagtcatt caatcgcgga gaatgctgat 720 aagctt 726 <210> 481 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 481 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gttcctggtg gccaccgcca 60 caggcgtgca cagcgagatc gtgctgacac agtctccagc caccctgagc ctgtcacctg 120 gcgagagggc caccctgtct tgtagagctt ctcagagcgt gtcttattac ctggcctggt 180 accagcagaa gcccggccag gcccctagac tgctgatcta cgacgccttc aacagagcca 240 ccggcatccc cgccagattc agcggcagcg gaagcggcac cgacttcacc ctgaccatca 300 gcagcctgga acctgaggac ttcgccgtgt actactgcca gcaaagaatc aactggcctc 360 tgaccttcgg cggcgggacc aaggtggaaa tcaagagagc cgacgccgcc cctaccgtgt 420 ccatcttccc acctagctct gaacagctga 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tccctgtcta 600 gcaccctgac actgagcaag gccgattacg agaagcacaa ggtgtatgcc tgtgaagtca 660 cccatcaggg gctgtcatca cccgtcacta agtcattcaa tcgcggagaa tgctgataag 720 ctt 723 <210> 498 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 498 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gtattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggggtcca tagtgacatc cagatgacac agagccctag cagcctgtct gccagcgtgg 120 gagacagagt gaccattacc tgtcaggcca gccagcatat caccaactac ctgacctggt 180 atcagcagaa gcccggcaac gcccctaagc tgctgatcta cgatgccagc aacctggaaa 240 ccggcgtgcc cagcagattt tctggcagcg gctctggcac cgacttcacc ttcaccatca 300 acagcctgca gcctgaggac gtggccacct acttttgcca gcagtacgac aacctgccta 360 ccttcggcgg aggcaccaag gtggaaatca agaggacagt ggccgcccca agcgtgttca 420 tctttccccc ttccgacgag cagctgaagt ctggcaccgc cagcgtggtg tgcctgctga 480 acaacttcta ccctcgggag gccaaggtcc agtggaaggt ggataacgcc ctgcagtctg 540 gcaatagcca ggagtccgtg accgagcagg actctaagga tagcacatat tccctgtcta 600 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 506 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcaggtg cagctggttg aatctggtgg cggagttgtg cagcctggca 120 gaagcctgag actgtcttgt gccgccagcg gcttcacctt tagcagctat ggcatgcact 180 gggtccgaca ggcccctggc aaaggacttg aatgggtcgc cgacatttgg tacgacggca 240 gcaacaagca ctacgccgac agcgtgaagg gcagattcac catcagccgg gacaacagca 300 agaacaccct gtacctgcag atgaacagcc tgagagccga ggacaccgcc gtgtactatt 360 gtgccagaga gagcgactac gagcggccct acttctacta cggcatggat gtgtggggcc 420 agggcaccac agtgacagtt agttctgctg ccagcaccaa gggcccttcc gtgtttccac 480 tggccccctc ctctaaatcc acatctggcg gcaccgccgc cctgggctgt ctggtgaagg 540 actacttccc agagcctgtg acagtgtcct ggaactctgg cgccctgaca tccggcgtgc 600 acacatttcc agccgtgctg cagagctccg gcctgtacag cctgtctagc gtggtgacag 660 tgccctcctc tagcctgggc acacagacct atatctgcaa cgtgaatcac aagccaagca 720 ataccaaggt ggacaagaag gtggagccca agtcctgtga taagacacac acctgccccc 780 cttgtcctgc 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tccactggcc ccctcctcta 480 aatccacatc tggcggcacc gccgccctgg gctgtctggt gaaggactac ttcccagagc 540 ctgtgacagt gtcctggaac tctggcgccc tgacatccgg cgtgcacaca tttccagccg 600 tgctgcagag ctccggcctg tacagcctgt ctagcgtggt gacagtgccc tcctctagcc 660 tgggcacaca gacctatatc tgcaacgtga atcacaagcc aagcaatacc aaggtggaca 720 agaaggtgga gcccaagtcc tgtgataaga cacacacctg ccccccttgt cctgctcccg 780 agctgctggg cggccctagc gtgttcctgt ttccacccaa gcctaaggac accctgatga 840 tctcccggac acccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtctcacgag gatcctgagg 900 tgaagttcaa ctggtatgtg gatggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccagag 960 aggagcagta caactctaca tatagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact 1020 ggctgaacgg caaggagtat aagtgcaagg tgtccaataa ggccctgccc gcccccatcg 1080 agaagacaat cagcaaggcc aagggccagc ctcgggagcc acaggtgtac accctgcctc 1140 catccagaga cgagctgaca aagaaccagg tgtctctgac atgtctggtg aagggcttct 1200 atcctagcga tatcgccgtg gagtgggagt ccaatggcca gccagagaac aattacaaga 1260 ccacaccccc tgtgctggac tccgatggct ccttctttct gtattccaag 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 518 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt acagtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggcagc ctgtacagct 240 ctggctacac ctactacaac cccagcctga agtccagagt gaccatcagc gtggacacca 300 gcaagaacca ggcctccctg aagctgaaca gcgtgaccac agccgatacc gccgtgtact 360 actgcgccag acatcccgtg gccatgaact tcgatgattg gggccagggc accctggtca 420 cagtctcgag tgccagcacc aagggccctt ccgtgtttcc actggccccc tcctctaaat 480 ccacatctgg cggcaccgcc gccctgggct gtctggtgaa ggactacttc ccagagcctg 540 tgacagtgtc ctggaactct ggcgccctga catccggcgt gcacacattt ccagccgtgc 600 tgcagagctc cggcctgtac agcctgtcta gcgtggtgac agtgccctcc tctagcctgg 660 gcacacagac ctatatctgc aacgtgaatc acaagccaag caataccaag gtggacaaga 720 aggtggagcc caagtcctgt gataagacac 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gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt acagtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggcagc ctgtacagct 240 ctggctacac ctactacaac cccagcctga agtccagagt gaccatcagc gtggacacca 300 gcaagaacca ggcctccctg aagctgaaca gcgtgaccac agccgatacc gccgtgtact 360 actgcgccag acatcccgtg gccatgaact tcgatgattg gggccagggc accctggtca 420 cagtctcgag tgccagcacc aagggccctt ccgtgtttcc actggccccc tcctctaaat 480 ccacatctgg cggcaccgcc gccctgggct gtctggtgaa ggactacttc ccagagcctg 540 tgacagtgtc ctggaactct ggcgccctga catccggcgt gcacacattt ccagccgtgc 600 tgcagagctc cggcctgtac agcctgtcta gcgtggtgac agtgccctcc tctagcctgg 660 gcacacagac ctatatctgc aacgtgaatc acaagccaag caataccaag gtggacaaga 720 aggtggagcc caagtcctgt gataagacac acacctgccc cccttgtcct gctcccgagc 780 tgctgggcgg ccctagcgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaggacacc ctgtatatca 840 cccgggagcc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgtc tcacgaggat cctgaggtga 900 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 524 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcaggtt cagctgcaag agtctggccc tggcctggtc aagcctagcg 120 aaacactgag cctgacctgt accgtgtctg gcggcagcat cagcagctac tactggtcct 180 ggatcagaca gcctcctggc aaaggcctgg aatggatcgg ctacatctac tacagcggca 240 gcaccaacta caaccccagc ctgaagtcca gagtgaccat cagcgtggac accagcaaga 300 gccagttctc cctgaagctg agcagcgtga cagccgccga tacagccgtg tactactgcg 360 ccagagacat ccctgccttc gccttcgata tctggggcca gggcacaatg gtcatcgtgt 420 ctagtgctgc cagcaccaag ggcccttccg tgtttccact ggccccctcc tctaaatcca 480 catctggcgg caccgccgcc ctgggctgtc tggtgaagga ctacttccca gagcctgtga 540 cagtgtcctg gaactctggc gccctgacat ccggcgtgca cacatttcca gccgtgctgc 600 agagctccgg cctgtacagc ctgtctagcg tggtgacagt gccctcctct agcctgggca 660 cacagaccta tatctgcaac gtgaatcaca agccaagcaa taccaaggtg gacaagaagg 720 tggagcccaa gtcctgtgat aagacacaca cctgcccccc ttgtcctgct cccgagctgc 780 tgggcggccc tagcgtgttc ctgtttccac 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 535 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcaggtt cagctgcaag agtctggccc tggcctggtc aagcctagcg 120 aaacactgag cctgacctgt accgtgtctg gcggcagcat cagcagctac tactggtcct 180 ggatcagaca gcctcctggc aaaggcctgg aatggatcgg ctacatctac tacagcggca 240 gcaccaacta caaccccagc ctgaagtcca gagtgaccat cagcgtggac accagcaaga 300 gccagttctc cctgaagctg agcagcgtga cagccgccga tacagccgtg tactactgcg 360 ccagacatat ccctgccttc gccttcgata tctggggcca gggcacaatg gtcatcgtct 420 cgagtgccag caccaagggc ccttccgtgt ttccactggc cccctcctct aaatccacat 480 ctggcggcac cgccgccctg ggctgtctgg tgaaggacta cttcccagag cctgtgacag 540 tgtcctggaa ctctggcgcc ctgacatccg gcgtgcacac atttccagcc gtgctgcaga 600 gctccggcct gtacagcctg tctagcgtgg tgacagtgcc ctcctctagc ctgggcacac 660 agacctatat ctgcaacgtg aatcacaagc caagcaatac caaggtggac aagaaggtgg 720 agcccaagtc ctgtgataag acacacacct gccccccttg tcctgctccc gagctgctgg 780 gcggccctag cgtgttcctg tttccaccca 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 546 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtgaggtg cagctggttg aatctggcgg cggactgatt cagcctggcg 120 gcagcctgag attttcttgt gccgccagcg gcttcacctt cagcagctac gccatgaact 180 gggtccgaca ggcccctggc aaaggccttg aatgggtgtc cgccatctct ggctctggcg 240 gcatcaccta ctacgccgat tctgtgaagg gcagattcac catcagccgg gacaacagca 300 agaacaccct gtacctgcag atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc gtgtactact 360 gtgccagaga ctgggagctg ggccgctttg attattgggg ccagggcaca ctggtcaccg 420 tctcgagtgc cagcaccaag ggcccttccg tgtttccact ggccccctcc tctaaatcca 480 catctggcgg caccgccgcc ctgggctgtc tggtgaagga ctacttccca gagcctgtga 540 cagtgtcctg gaactctggc gccctgacat ccggcgtgca cacatttcca gccgtgctgc 600 agagctccgg cctgtacagc ctgtctagcg tggtgacagt gccctcctct agcctgggca 660 cacagaccta tatctgcaac gtgaatcaca agccaagcaa taccaaggtg gacaagaagg 720 tggagcccaa gtcctgtgat aagacacaca cctgcccccc ttgtcctgct cccgagctgc 780 tgggcggccc 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gggcagaggc accctggtca 420 cagttagttc tgctgccagc accaagggcc cttccgtgtt tccactggcc ccctcctcta 480 aatccacatc tggcggcacc gccgccctgg gctgtctggt gaaggactac ttcccagagc 540 ctgtgacagt gtcctggaac tctggcgccc tgacatccgg cgtgcacaca tttccagccg 600 tgctgcagag ctccggcctg tacagcctgt ctagcgtggt gacagtgccc tcctctagcc 660 tgggcacaca gacctatatc tgcaacgtga atcacaagcc aagcaatacc aaggtggaca 720 agaaggtgga gcccaagtcc tgtgataaga cacacacctg ccccccttgt cctgctcccg 780 agctgctggg cggccctagc gtgttcctgt ttccacccaa gcctaaggac accctgatga 840 tctcccggac acccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtctcacgag gatcctgagg 900 tgaagttcaa ctggtatgtg gatggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccagag 960 aggagcagta caactctaca tatagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact 1020 ggctgaacgg caaggagtat aagtgcaagg tgtccaataa ggccctgccc gcccccatcg 1080 agaagacaat cagcaaggcc aagggccagc ctcgggagcc acaggtgtac accctgcctc 1140 catccagaga cgagctgaca aagaaccagg tgtctctgac atgtctggtg aagggcttct 1200 atcctagcga tatcgccgtg gagtgggagt ccaatggcca gccagagaac 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polynucleotide <400> 552 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtgaggtg cagctggttg aatctggcgg aggactggtt cagcctggcg 120 gatctctgag actgtcttgt gccgccagcg gcttcacctt tagcagctac gccatgagct 180 gggtccgaca ggctcctggc aaaggccttg aatgggtgtc cgtgatctct ggctctggcg 240 gcatcaccta ctacagcgac tctgtgaagg gcagattcac catcagccgg gacaacagca 300 agaacaccct gtacctgcag atgaacagcc tgagagccga ggacaccgcc gtgtactact 360 gtgccaagga ctgggagttc ttctggtact tcgacctgtg gggcagaggc accctggtca 420 cagttagttc tgctgccagc accaagggcc cttccgtgtt tccactggcc ccctcctcta 480 aatccacatc tggcggcacc gccgccctgg gctgtctggt gaaggactac ttcccagagc 540 ctgtgacagt gtcctggaac tctggcgccc tgacatccgg cgtgcacaca tttccagccg 600 tgctgcagag ctccggcctg tacagcctgt ctagcgtggt gacagtgccc tcctctagcc 660 tgggcacaca gacctatatc tgcaacgtga atcacaagcc aagcaatacc aaggtggaca 720 agaaggtgga gcccaagtcc tgtgataaga cacacacctg ccccccttgt cctgctcccg 780 agctgctggg cggccctagc gtgttcctgt ttccacccaa gcctaaggac accctgtata 840 tcacccggga gcccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtctcacgag gatcctgagg 900 tgaagttcaa ctggtatgtg gatggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccagag 960 aggagcagta caactctaca tatagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact 1020 ggctgaacgg caaggagtat aagtgcaagg tgtccaataa ggccctgccc gcccccatcg 1080 agaagacaat cagcaaggcc aagggccagc ctcgggagcc acaggtgtac accctgcctc 1140 catccagaga cgagctgaca aagaaccagg tgtctctgac atgtctggtg aagggcttct 1200 atcctagcga tatcgccgtg gagtgggagt ccaatggcca gccagagaac aattacaaga 1260 ccacaccccc tgtgctggac tccgatggct ccttctttct gtattccaag ctgaccgtgg 1320 ataagtctcg gtggcagcag ggcaacgtgt tcagctgttc cgtgatgcac gaagccctgc 1380 ataatcacta tactcagaaa tccctgtccc tgtcacctgg aaagtgataa gctt 1434 <210> 553 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 553 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtgaggtg cagctggttg aatctggcgg aggactggtt cagcctggcg 120 gatctctgag 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catcagccgg gacaacagca 300 agaacaccct gtacctgcag atgaacagcc tgagagccga ggacaccgcc gtgtactact 360 gtgccaagga ctgggagttc ttctggtact tcgacctgtg gggcagaggc accctggtca 420 cagtctcgag tgccaagaca accgccccta gcgtttaccc cctggcccct gtgtgcggcg 480 acaccaccgg ctcctccgtg acactgggat gtctggtgaa gggctacttt ccagaacccg 540 tgacgctgac ctggaacagc ggcagcctga gcagcggcgt gcataccttc cctgccgtgc 600 tccagtctga tctgtacacc ctgagcagca gcgtcacagt gaccagctct acatggcctt 660 ctcagagcat cacctgtaat gtggcccacc ccgccagcag caccaaggtg gacaagaaaa 720 tcgagcccag aggccccacc atcaagcctt gtcctccatg taaatgcccc gctcctaacc 780 tgctgggcgg ccctagcgtc tttatcttcc cgcctaagat caaagacgtg ctgatgatca 840 gcctgtctcc tatagttacc tgcgtggttg ttgatgtgtc cgaggacgac cccgacgtgc 900 agatcagctg gttcgtgaac aacgtggaag tgcacacagc ccagacacag acccacagag 960 aggattacaa cagcaccctg agagtggtgt ctgccctgcc catccagcac caggactgga 1020 tgtctggcaa agagttcaag tgcaaggtga acaacaagga cctgcctgct cctatcgagc 1080 ggaccatctc taagcccaag ggctctgtgc gggccccaca ggtgtacgtg ctgcctcctc 1140 ctgaggaaga gatgaccaag aaacaggtga cgctgacatg catggtgacc gacttcatgc 1200 ctgaagatat ctacgtggaa tggacaaaca atggcaagac cgagctgaac tacaagaaca 1260 ccgagcctgt gctggacagc gacggcagct acttcatgta cagcaagctg agagtggaaa 1320 agaagaactg ggtggaaaga aactcttata gctgcagcgt ggtccacgag ggcctgcaca 1380 accaccacac cacaaagagc ttcagcagaa cccctggaaa gtgataagct tgtt 1434 <210> 555 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 555 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt atcgtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggctcc atcttctaca 240 gcggcaacac ccactacaac cccagcctga agtccagagt gacaatcccc gtggacacca 300 gcaagaacca gttctccctg aagctgagca gcgtgacagc cgccgatagc gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgttag ctctgctgcc agcaccaagg gcccttccgt gtttccactg gccccctcct 480 ctaaatccac atctggcggc accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcctgtgac agtgtcctgg aactctggcg ccctgacatc cggcgtgcac acatttccag 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtacagcc tgtctagcgt ggtgacagtg ccctcctcta 660 gcctgggcac acagacctat atctgcaacg tgaatcacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 acaagaaggt ggagcccaag tcctgtgata agacacacac ctgcccccct tgtcctgctc 780 ccgagctgct gggcggccct agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaag gacaccctga 840 tgatctcccg gacacccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcac gaggatcctg 900 aggtgaagtt caactggtat gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccca 960 gagaggagca gtacaactct acatataggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg 1020 actggctgaa cggcaaggag tataagtgca aggtgtccaa taaggccctg cccgccccca 1080 tcgagaagac aatcagcaag gccaagggcc agcctcggga gccacaggtg tacaccctgc 1140 ctccatccag agacgagctg acaaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct 1200 tctatcctag cgatatcgcc gtggagtggg agtccaatgg ccagccagag aacaattaca 1260 agaccacacc 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ccctgacatc cggcgtgcac acatttccag 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtacagcc tgtctagcgt ggtgacagtg ccctcctcta 660 gcctgggcac acagacctat atctgcaacg tgaatcacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 acaagaaggt ggagcccaag tcctgtgata agacacacac ctgcccccct tgtcctgctc 780 ccgaggcggc gggcggccct agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaag gacaccctga 840 tgatctcccg gacacccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcac gaggatcctg 900 aggtgaagtt caactggtat gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccca 960 gagaggagca gtacaactct acatataggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg 1020 actggctgaa cggcaaggag tataagtgca aggtgtccaa taaggccctg cccgccccca 1080 tcgagaagac aatcagcaag gccaagggcc agcctcggga gccacaggtg tacaccctgc 1140 ctccatccag agacgagctg acaaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct 1200 tctatcctag cgatatcgcc gtggagtggg agtccaatgg ccagccagag aacaattaca 1260 agaccacacc ccctgtgctg gactccgatg gctccttctt tctgtattcc aagctgaccg 1320 tggataagtc tcggtggcag cagggcaacg tgttcagctg ttccgtgatg cacgaagccc 1380 tgcataatca ctatactcag aaatccctgt ccctgtcacc tggaaagtga taagctt 1437 <210> 557 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 557 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt atcgtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggctcc atcttctaca 240 gcggcaacac ccactacaac cccagcctga agtccagagt gacaatcccc gtggacacca 300 gcaagaacca gttctccctg aagctgagca gcgtgacagc cgccgatagc gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgttag ctctgctgcc agcaccaagg gcccttccgt gtttccactg gccccctcct 480 ctaaatccac atctggcggc accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcctgtgac agtgtcctgg aactctggcg ccctgacatc cggcgtgcac acatttccag 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtacagcc tgtctagcgt ggtgacagtg ccctcctcta 660 gcctgggcac acagacctat atctgcaacg tgaatcacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 acaagaaggt ggagcccaag tcctgtgata agacacacac ctgcccccct tgtcctgctc 780 ccgagctgct gggcggccct agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaag gacaccctga 840 tgatctcccg gacacccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcac gaggatcctg 900 aggtgaagtt caactggtat gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccca 960 gagaggagca gtacgcctct acatataggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg 1020 actggctgaa cggcaaggag tataagtgca aggtgtccaa taaggccctg cccgccccca 1080 tcgagaagac aatcagcaag gccaagggcc agcctcggga gccacaggtg tacaccctgc 1140 ctccatccag agacgagctg acaaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct 1200 tctatcctag cgatatcgcc gtggagtggg agtccaatgg ccagccagag aacaattaca 1260 agaccacacc ccctgtgctg gactccgatg gctccttctt tctgtattcc aagctgaccg 1320 tggataagtc tcggtggcag cagggcaacg tgttcagctg ttccgtgatg cacgaagccc 1380 tgcataatca ctatactcag aaatccctgt ccctgtcacc tggaaagtga taagctt 1437 <210> 558 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 558 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt atcgtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggctcc atcttctaca 240 gcggcaacac ccactacaac cccagcctga agtccagagt gacaatcccc gtggacacca 300 gcaagaacca gttctccctg aagctgagca gcgtgacagc cgccgatagc gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgttag ctctgctgcc agcaccaagg gcccttccgt gtttccactg gccccctcct 480 ctaaatccac atctggcggc accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcctgtgac agtgtcctgg aactctggcg ccctgacatc cggcgtgcac acatttccag 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtacagcc tgtctagcgt ggtgacagtg ccctcctcta 660 gcctgggcac acagacctat atctgcaacg tgaatcacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 acaagaaggt ggagcccaag tcctgtgata agacacacac ctgcccccct tgtcctgctc 780 ccgagctgct gggcggccct agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaag gacaccctgt 840 atatcacccg ggagcccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcac gaggatcctg 900 aggtgaagtt caactggtat gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccca 960 gagaggagca gtacaactct acatataggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg 1020 actggctgaa cggcaaggag tataagtgca aggtgtccaa taaggccctg cccgccccca 1080 tcgagaagac aatcagcaag gccaagggcc agcctcggga gccacaggtg tacaccctgc 1140 ctccatccag agacgagctg acaaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct 1200 tctatcctag cgatatcgcc gtggagtggg agtccaatgg ccagccagag aacaattaca 1260 agaccacacc ccctgtgctg gactccgatg gctccttctt tctgtattcc aagctgaccg 1320 tggataagtc tcggtggcag cagggcaacg tgttcagctg ttccgtgatg cacgaagccc 1380 tgcataatca ctatactcag aaatccctgt ccctgtcacc tggaaagtga taagctt 1437 <210> 559 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 559 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt atcgtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggctcc atcttctaca 240 gcggcaacac ccactacaac cccagcctga agtccagagt gacaatcccc gtggacacca 300 gcaagaacca gttctccctg aagctgagca gcgtgacagc cgccgatagc gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgttag ctctgctgcc agcaccaagg gcccttccgt gtttccactg gccccctcct 480 ctaaatccac atctggcggc accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcctgtgac agtgtcctgg aactctggcg ccctgacatc cggcgtgcac acatttccag 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtacagcc tgtctagcgt ggtgacagtg ccctcctcta 660 gcctgggcac acagacctat atctgcaacg tgaatcacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 acaagaaggt ggagcccaag tcctgtgata agacacacac ctgcccccct tgtcctgctc 780 ccgagctgct gggcggccct agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaag gacaccctga 840 tgatctcccg gacacccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcac gaggatcctg 900 aggtgaagtt caactggtat gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccca 960 gagaggagca gtacaactct acatataggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg 1020 actggctgaa cggcaaggag tataagtgca aggtgtccaa taaggccctg cccgccccca 1080 tcgagaagac aatcagcaag gccaagggcc agcctcggga gccacaggtg tacaccctgc 1140 ctccatccag agacgagctg acaaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct 1200 tctatcctag cgatatcgcc gtggagtggg agtccaatgg ccagccagag aacaattaca 1260 agaccacacc ccctgtgctg gactccgatg gctccttctt tctgtattcc aagctgaccg 1320 tggataagtc tcggtggcag cagggcaacg tgttcagctg ttccgtgctg cacgaagccc 1380 tgcattccca ctatactcag aaatccctgt ccctgtcacc tggaaagtga taagctt 1437 <210> 560 <211> 1434 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 560 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt atcgtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggctcc atcttctaca 240 gcggcaacac ccactacaac cccagcctga agtccagagt gacaatcccc gtggacacca 300 gcaagaacca gttctccctg aagctgagca gcgtgacagc cgccgatagc gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgtctc gagtgccagc accaagggcc cttccgtgtt tccactggcc ccctcctcta 480 aatccacatc tggcggcacc gccgccctgg gctgtctggt gaaggactac ttcccagagc 540 ctgtgacagt gtcctggaac tctggcgccc tgacatccgg cgtgcacaca tttccagccg 600 tgctgcagag ctccggcctg tacagcctgt ctagcgtggt gacagtgccc tcctctagcc 660 tgggcacaca gacctatatc tgcaacgtga atcacaagcc aagcaatacc aaggtggaca 720 agaaggtgga gcccaagtcc tgtgataaga cacacacctg ccccccttgt cctgctcccg 780 agctgctggg cggccctagc gtgttcctgt ttccacccaa gcctaaggac accctgatga 840 tctcccggac acccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtctcacgag gatcctgagg 900 tgaagttcaa ctggtatgtg gatggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccagag 960 aggagcagta caactctaca tatagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact 1020 ggctgaacgg caaggagtat aagtgcaagg tgtccaataa ggccctgccc gcccccatcg 1080 agaagacaat cagcaaggcc aagggccagc ctcgggagcc acaggtgtac accctgcctc 1140 catccagaga 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600 tgctccagtc tgatctgtac accctgagca gcagcgtcac agtgaccagc tctacatggc 660 cttctcagag catcacctgt aatgtggccc accccgccag cagcaccaag gtggacaaga 720 aaatcgagcc cagaggcccc accatcaagc cttgtcctcc atgtaaatgc cccgctccta 780 acctgctggg cggccctagc gtctttatct tcccgcctaa gatcaaagac gtgctgatga 840 tcagcctgtc tcctatagtt acctgcgtgg ttgttgatgt gtccgaggac gaccccgacg 900 tgcagatcag ctggttcgtg aacaacgtgg aagtgcacac agcccagaca cagacccaca 960 gagaggatta caacagcacc ctgagagtgg tgtctgccct gcccatccag caccaggact 1020 ggatgtctgg caaagagttc aagtgcaagg tgaacaacaa ggacctgcct gctcctatcg 1080 agcggaccat ctctaagccc aagggctctg tgcgggcccc acaggtgtac gtgctgcctc 1140 ctcctgagga agagatgacc aagaaacagg tgacgctgac atgcatggtg accgacttca 1200 tgcctgaaga tatctacgtg gaatggacaa acaatggcaa gaccgagctg aactacaaga 1260 acaccgagcc tgtgctggac agcgacggca gctacttcat gtacagcaag ctgagagtgg 1320 aaaagaagaa ctgggtggaa agaaactctt atagctgcag cgtggtccac gagggcctgc 1380 acaaccacca caccacaaag agcttcagca gaacccctgg aaagtgataa gctt 1434 <210> 563 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 563 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtctt gtattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca ttctcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt atcgtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggctcc atcttctaca 240 gcggcaacac ccactacaac cccagcctga agtccagagt gacaatcccc gtggacacca 300 gcaagaacca gttctccctg aagctgagca gcgtgacagc cgccgatagc gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgttag ctctgctgcc agcaccaagg gcccttccgt gtttcccctg gccccttgct 480 cccggtccac atctgagagc accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcccgtgac cgtgagctgg aacagcggcg ccctgacaag cggcgtgcac acatttcccg 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtactccc tgtctagcgt ggtgacagtg ccttcctcta 660 gcctgggcac caagacatat acctgtaacg tggaccacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 ataagcgggt ggagtctaag tacggccctc cttgccctag ctgtcctgct ccagagtttc 780 tgggcggccc ttccgtgttc ctgtttccac ccaaaccaaa ggacacactg atgatctcta 840 gaacaccaga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaggatccc gaggtgcagt 900 tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcca agagaggagc 960 agtttaactc tacatacagg gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctca 1020 acggcaagga gtataagtgc aaggtgtcca ataagggcct gccctcctct atcgagaaga 1080 caatctctaa ggctaagggc cagccaagag agcctcaggt gtacaccctg cctccaagcc 1140 aggaggagat gacaaagaac caggtgtccc tgacatgtct ggtgaagggc ttctatccct 1200 ccgacatcgc cgtggagtgg gagtctaatg gccagcctga gaacaattac aagaccacac 1260 cccctgtgct ggactctgat ggcagcttct ttctgtattc caggctgacc gtggataagt 1320 ctcggtggca ggagggcaac gtgttcagct gctctgtgat gcacgaagcc ctgcataatc 1380 actatactca gaaaagtctg tcactgtcac tgggaaagtg ataagctt 1428 <210> 564 <211> 1425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 564 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtctt gtattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca ttctcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt atcgtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggctcc atcttctaca 240 gcggcaacac ccactacaac cccagcctga agtccagagt gacaatcccc gtggacacca 300 gcaagaacca gttctccctg aagctgagca gcgtgacagc cgccgatagc gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgttag ctctgctgcc agcaccaagg gcccttccgt gtttcccctg gccccttgct 480 cccggtccac atctgagagc accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcccgtgac cgtgagctgg aacagcggcg ccctgacaag cggcgtgcac acatttcccg 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtactccc tgtctagcgt ggtgacagtg ccttcctcta 660 gcctgggcac caagacatat acctgtaacg tggaccacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 ataagcgggt ggagtctaag tacggccctc cttgccctag ctgtcctgct ccagagtttc 780 tgggcggccc ttccgtgttc ctgtttccac ccaaaccaaa ggacacactg atgatctcta 840 gaacaccaga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaggatccc gaggtgcagt 900 tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcca agagagcagt 960 ttaactctac atacagggtg gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctcaacg 1020 gcaaggagta taagtgcaag gtgtccaata agggcctgcc ctcctctatc gagaagacaa 1080 tctctaaggc taagggccag ccaagagagc ctcaggtgta caccctgcct ccaagccagg 1140 aggagatgac aaagaaccag gtgtccctga catgtctggt gaagggcttc tatccctccg 1200 acatcgccgt ggagtgggag tctaatggcc agcctgagaa caattacaag accacacccc 1260 ctgtgctgga ctctgatggc agcttctttc tgtattccag gctgaccgtg gataagtctc 1320 ggtggcagga gggcaacgtg ttcagctgct ctgtgatgca cgaagccctg cataatcact 1380 atactcagaa aagtctgtca ctgtcactgg gaaagtgata agctt 1425 <210> 565 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 565 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtctt gtattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca ttctcagctc cagctgcaag agtctggacc tggcctggtc aagcctagcg 120 agacactgag cctgacctgt atcgtgtctg gcggcagcat cagcagcagc ggctattact 180 ggggctggat cagacagcct cctggcaaag gcctggaatg gatcggctcc atcttctaca 240 gcggcaacac ccactacaac cccagcctga agtccagagt gacaatcccc gtggacacca 300 gcaagaacca gttctccctg aagctgagca gcgtgacagc cgccgatagc gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgttag ctctgctgcc agcaccaagg gcccttccgt gtttcccctg gccccttgct 480 cccggtccac atctgagagc accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcccgtgac cgtgagctgg aacagcggcg ccctgacaag cggcgtgcac acatttcccg 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtactccc tgtctagcgt ggtgacagtg ccttcctcta 660 gcctgggcac caagacatat acctgtaacg tggaccacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 ataagcgggt ggagtctaag tacggccctc cttgccctag ctgtcctgct ccagagtttc 780 tgggcggccc ttccgtgttc ctgtttccac ccaaaccaaa ggacacactg tatatcacta 840 gagagccaga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaggatccc gaggtgcagt 900 tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcca agagaggagc 960 agtttaactc tacatacagg gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctca 1020 acggcaagga gtataagtgc aaggtgtcca 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gccgtgtact 360 actgcgccag aagagacatc ctgacaggcc cctttgacta ctggggccag ggaacactgg 420 tcaccgttag ctctgctgcc agcaccaagg gcccttccgt gtttcccctg gccccttgct 480 cccggtccac atctgagagc accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcccgtgac cgtgagctgg aacagcggcg ccctgacaag cggcgtgcac acatttcccg 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtactccc tgtctagcgt ggtgacagtg ccttcctcta 660 gcctgggcac caagacatat acctgtaacg tggaccacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 ataagcgggt ggagtctaag tacggccctc cttgccctcc ctgtcctgct ccagagtttc 780 tgggcggccc ttccgtgttc ctgtttccac ccaaaccaaa ggacacactg atgatctcta 840 gaacaccaga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaggatccc gaggtgcagt 900 tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcca agagaggagc 960 agtttaactc tacatacagg gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctca 1020 acggcaagga gtataagtgc aaggtgtcca ataagggcct gccctcctct atcgagaaga 1080 caatctctaa ggctaagggc cagccaagag agcctcaggt gtacaccctg cctccaagcc 1140 aggaggagat gacaaagaac caggtgtccc tgacatgtct ggtgaagggc ttctatccct 1200 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accgccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag 540 agcccgtgac cgtgagctgg aacagcggcg ccctgacaag cggcgtgcac acatttcccg 600 ccgtgctgca gagctccggc ctgtactccc tgtctagcgt ggtgacagtg ccttcctcta 660 gcctgggcac caagacatat acctgtaacg tggaccacaa gccaagcaat accaaggtgg 720 ataagcgggt ggagtctaag tacggccctc cttgccctag ctgtcctgct ccagagtttc 780 tgggcggccc ttccgtgttc ctgtttccac ccaaaccaaa ggacacactg atgatctcta 840 gaacaccaga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaggatccc gaggtgcagt 900 tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcca agagaggagc 960 agtttaactc tacatacagg gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctca 1020 acggcaagga gtataagtgc aaggtgtcca ataagggcct gccctcctct atcgagaaga 1080 caatctctaa ggctaagggc cagccaagag agcctcaggt gtacaccctg cctccaagcc 1140 aggaggagat gacaaagaac caggtgtccc tgacatgtct ggtgaagggc ttctatccct 1200 ccgacatcgc cgtggagtgg gagtctaatg gccagcctga gaacaattac aagaccacac 1260 cccctgtgct ggactctgat ggcagcttct ttctgtattc caggctgacc gtggataagt 1320 ctcggtggca ggagggcaac gtgttcagct 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Synthetic peptide <400> 576 Gln Ser Val Asn Tyr Tyr Leu Ala 1 5 <210> 577 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 577 Gln Ser Val Ser His Tyr Leu Ala 1 5 <210> 578 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 578 Gln Ser Val Ser Tyr His Leu Ala 1 5 <210> 579 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 579 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 580 <211> 1425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 580 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gcattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggcgtgca tagtcaggtt cagctgcaag agtctggccc tggcctggtc aagcctagcg 120 aaacactgag cctgacctgt accgtgtctg gcggcagcat cagcagctac tactggtcct 180 ggatcagaca gcctcctggc aaaggcctgg aatggatcgg ctacatctac tacagcggca 240 gcaccaacta caaccccagc ctgaagtcca gagtgaccat cagcgtggac accagcaaga 300 gccagttctc cctgaagctg agcagcgtga cagccgccga tacagccgtg tactactgcg 360 ccagagacat ccctgccttc gccttcgata tctggggcca gggcacaatg gtcatcgtct 420 cgagtgccag caccaagggc ccttccgtgt ttccactggc cccctcctct aaatccacat 480 ctggcggcac cgccgccctg ggctgtctgg tgaaggacta cttcccagag cctgtgacag 540 tgtcctggaa ctctggcgcc ctgacatccg gcgtgcacac atttccagcc gtgctgcaga 600 gctccggcct gtacagcctg tctagcgtgg tgacagtgcc ctcctctagc ctgggcacac 660 agacctatat ctgcaacgtg aatcacaagc caagcaatac caaggtggac aagaaggtgg 720 agcccaagtc ctgtgataag acacacacct gccccccttg tcctgctccc gagctgctgg 780 gcggccctag cgtgttcctg tttccaccca agcctaagga caccctgtat atcacccggg 840 agcccgaggt gacctgcgtg gtggtggacg tgtctcacga ggatcctgag gtgaagttca 900 actggtatgt ggatggcgtg gaggtgcaca atgccaagac caagcccaga gaggagcagt 960 acaactctac atatagggtg gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg 1020 gcaaggagta taagtgcaag gtgtccaata aggccctgcc cgcccccatc gagaagacaa 1080 tcagcaaggc 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ccaggagtcc gtgaccgagc aggactctaa ggatagcaca tattccctgt 600 ctagcaccct gacactgagc aaggccgatt acgagaagca caaggtgtat gcctgtgaag 660 tcacccatca ggggctgtca tcacccgtca ctaagtcatt caatcgcgga gaatgctgat 720 aagctt 726 <210> 583 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 583 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcat gtattattct gtttctggtc gcaactgcta 60 caggggtcca tagtgagatc gtgctgacac agtctcccgc cacactgtca ctgtctccag 120 gcgaaagagc cacactgagc tgtagagcca gccagagcgt gtcctactac ctggcctggt 180 atcagcagaa gcctggacag gctccccggc tgctgatcta cgacgccttc aatagagcca 240 caggcatccc cgccagattt tctggctctg gcagcggcac cgatttcacc ctgaccataa 300 gcagcctgga acctgaggac ttcgccgtgt actactgcca gcagagaatc aactggcccc 360 tgacctttgg cggaggcacc aaggtggaaa tcaagaggac agtggccgcc ccaagcgtgt 420 tcatctttcc cccttccgac gagcagctga agtctggcac cgccagcgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctaccctcgg gaggccaagg tccagtggaa ggtggataac gccctgcagt 540 ctggcaatag ccaggagtcc gtgaccgagc aggactctaa ggatagcaca tattccctgt 600 ctagcaccct gacactgagc aaggccgatt acgagaagca caaggtgtat gcctgtgaag 660 tcacccatca ggggctgtca tcacccgtca ctaagtcatt caatcgcgga gaatgctgat 720 aagctt 726 <210> 584 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 584 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Glu Arg Pro Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 <210> 585 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 585 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Leu Tyr Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Cys 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg His Pro Val Ala Met Asn Phe Asp Asp Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 586 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 586 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser 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gcagcctgga acccgaggac ttcgccgtct actactgcca gcaaagaatc aactggcctc 360 tgcctttcgg cggaggcaca aaggtggaaa ttaagagaac cgtggccgcc cctagcgtgt 420 tcatcttccc ccccagcgac gagcagctga agagcggtac agcttctgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctacccgcgg gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga 540 gcggcaacag ccaggagagc gtgacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctga 600 gcagcaccct gaccctgagc aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgaag 660 tgacccacca gggcctgtct agccctgtga ccaagtcttt taacagaggc gagtgctgat 720 aagctt 726 <210> 616 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 616 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gttcctggtg gccacagcca 60 ccggcgtgca cagcgagatc gtcctgacac agagcccagc caccctgagc ctgagccccg 120 gcgagcgggc cacactctcc tgtagagctt ctcagagcgt gtcctactac ctggcctggt 180 atcagcagaa acctggccag gcccctagac tgctgatcta cgacgccttt aaccgggcca 240 ccggcatccc tgctagattc agcggcagcg gatctggcac agatttcacc ctgaccatca 300 gcagcctgga acccgaggac ttcgccgtgt actactgcca gcaaagaatc aactggcctc 360 tgaccttcgg cggcggaacc aaggtggaaa ttaagagaac cgtggccgcc cctagcgtgt 420 tcatcttccc ccccagcgac gagcagctga agagcggtac agcttctgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctacccgcgg gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga 540 gcggcaacag ccaggagagc gtgacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctga 600 gcagcaccct gaccctgagc aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgaag 660 tgacccacca gggcctgtct agccctgtga ccaagtcttt taacagaggc gagtgctgat 720 aagctt 726 <210> 617 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 617 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gttcctggtg gccacagcca 60 ccggcgtgca cagcgagatc gtcctgacac agagcccagc caccctgagc ctgagccccg 120 gcgagcgggc cacactctcc tgtagagctt ctcagagcgt gtcctactac ctggcctggt 180 atcagcagaa acctggccag gcccctagac tgctgatcta cgacgccttt aaccgggcca 240 ccggcatccc tgctagattc agcggcagcg gatctggcac agatttcacc ctgaccatca 300 gcagcctgga acccgaggac ttcgccgtgt actactgcca gcaaagaatc aactggcctc 360 tgaccttcgg cggcggaacc aaggtggaaa ttaagagaac cgtggccgcc cctagcgtgt 420 tcatcttccc ccccagcgac gagcagctga agagcggtac agcttctgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctacccgcgg gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga 540 gcggcaacag ccaggagagc gtgacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctga 600 gcagcaccct gaccctgagc aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgaag 660 tgacccacca gggcctgtct agccctgtga ccaagtcttt taacagaggc gagtgctgat 720 aagctt 726 <210> 618 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 618 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gttcctggtg gccacagcca 60 ccggcgtgca cagcgagatc gtcctgacac agagcccagc caccctgagc ctgagccccg 120 gcgagcgggc cacactctcc tgtagagctt ctcagagcgt gtcctactac ctggcctggt 180 atcagcagaa acctggccag gcccctagac tgctgatcta cgacgccttt aaccgggcca 240 ccggcatccc tgctagattc agcggcagcg gatctggcac agatttcacc ctgaccatca 300 gcagcctgga acccgaggac ttcgccgtgt actactgcca gcaaagaatc aactggcctc 360 tgaccttcgg cggcggaacc aaggtggaaa ttaagagaac cgtggccgcc cctagcgtgt 420 tcatcttccc ccccagcgac gagcagctga agagcggtac agcttctgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctacccgcgg gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga 540 gcggcaacag ccaggagagc gtgacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctga 600 gcagcaccct gaccctgagc aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgaag 660 tgacccacca gggcctgtct agccctgtga ccaagtcttt taacagaggc gagtgctgat 720 aagctt 726 <210> 619 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 619 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gttcctggtg gccacagcca 60 ccggcgtgca cagcgagatc gtcctgacac agagcccagc caccctgagc ctgagccccg 120 gcgagcgggc cacactctcc tgtagagctt ctcagagcgt gtcctactac ctggcctggt 180 atcagcagaa acctggccag gcccctagac tgctgatcta cgacgccttt aaccgggcca 240 ccggcatccc tgctagattc agcggcagcg gatctggcac agatttcacc ctgaccatca 300 gcagcctgga acccgaggac ttcgccgtgt actactgcca gcaaagaatc aactggcctc 360 tgaccttcgg cggcggaacc aaggtggaaa ttaagagaac cgtggccgcc cctagcgtgt 420 tcatcttccc ccccagcgac gagcagctga agagcggtac agcttctgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctacccgcgg gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga 540 gcggcaacag ccaggagagc gtgacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctga 600 gcagcaccct gaccctgagc aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgaag 660 tgacccacca gggcctgtct agccctgtga ccaagtcttt taacagaggc gagtgctgat 720 aagctt 726 <210> 620 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 620 gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gttcctggtg gccacagcca 60 ccggcgtgca cagcgagatc gtgctgacac agtccccagc tacactctcc ctgagccccg 120 gcgagcgggc caccctgtct tgtagagctt ctcagagcgt gaactactac ctggcctggt 180 atcagcagaa acctggccag gcccctagac tgctgatcta cgacgccttt aaccgggcca 240 ccggcatccc cgccagattc agcggcagcg gcagcggaac agatttcacc ctgaccatca 300 gcagcctgga acctgaggac ttcgccgtct actactgcca gcaaagaatc agctggcctc 360 tgaccttcgg cggcggaacc aaggtggaaa ttaagagaac cgtggccgcc cctagcgtgt 420 tcatcttccc ccccagcgac gagcagctga agagcggtac agcttctgtg gtgtgcctgc 480 tgaacaactt ctacccgcgg gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga 540 gcggcaacag ccaggagagc gtgacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctga 600 gcagcaccct gaccctgagc aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgtgaag 660 tgacccacca gggcctgtct agccctgtga ccaagtcttt taacagaggc gagtgctgat 720 aagctt 726 <210> 621 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 621 Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly 1 5 10 15 <210> 622 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 622 Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu 1 5 10 15 <210> 623 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 623 Val Cys Pro Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu 1 5 10 15 <210> 624 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 624 Gln Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys 1 5 10 15 <210> 625 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 625 Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His Asp Val Thr 1 5 10 15 <210> 626 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 626 Gly Pro Val Asp Lys Gly His Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp 1 5 10 15 <210> 627 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 627 Gly His Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg 1 5 10 15 <210> 628 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 628 Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val Gln Thr 1 5 10 15 <210> 629 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 629 Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg 1 5 10 15 <210> 630 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 630 Gly Glu Val Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu 1 5 10 15 <210> 631 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 631 Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp Leu 1 5 10 15 <210> 632 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 632 Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp Leu His Leu His His Gly 1 5 10 15 <210> 633 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 633 Thr Phe Gln Asp Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala 1 5 10 15 <210> 634 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 634 His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp 1 5 10 15 <210> 635 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 635 Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp Leu Ala Gln Arg His 1 5 10 15 <210> 636 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 636 Asn Thr Ser His Asp Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 <210> 637 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 637 Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly 1 5 10 15 <210> 638 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 638 Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn Phe Ser Ile Thr 1 5 10 15 <210> 639 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 639 Ser Asp His His Gly Asn Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr 1 5 10 15 <210> 640 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 640 Asn Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly 1 5 10 15 <210> 641 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 641 Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Leu 1 5 10 15 <210> 642 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 642 Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg 1 5 10 15 <210> 643 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 643 Leu Tyr Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu 1 5 10 15 <210> 644 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 644 Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val His Gly 1 5 10 15 <210> 645 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 645 His His His Ser Glu His Arg Val His Gly Ala Met Glu Leu Gln 1 5 10 15 <210> 646 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 646 His Arg Val His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys 1 5 10 15 <210> 647 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 647 Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser Asn 1 5 10 15 <210> 648 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 648 Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser Asn Cys Val Val Tyr Pro 1 5 10 15 <210> 649 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 649 Asp Ala Pro Ser Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Glu 1 5 10 15 <210> 650 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 650 Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Glu Ser Glu Asn Ile Thr 1 5 10 15 <210> 651 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 651 Ser Ser Ser Gln Glu Ser Glu Asn Ile Thr Ala Ala 1 5 10 <210> 652 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 652 atggagtggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtcggtga ccaccggcgt gcactccgaa 60 attgtgctga ctcagagccc agctaccctt tccctgtccc cgggagaaag agccaccctc 120 tcatgtcgcg cctcccaatc cgtgtcctac tacctggcct ggtatcagca gaagcctgga 180 caggcaccga ggctgctcat ctacgacgcg ttcaaccggg ccactggcat tccggcccgc 240 tttagcggat caggttccgg cactgatttc accctgacca tctcatccct ggagcccgaa 300 gatttcgccg tctactactg ccaacagcgc atcaattggc ctctcacttt cggtggcggg 360 acaaaggtcg agatcaagag aaccgtggca gctccctcgg tgttcatctt cccgccctcg 420 gacgaacagc tgaagtccgg aactgcctcg gtcgtgtgcc tgctcaacaa cttttaccct 480 cgggaggcca aagtgcagtg gaaagtggac aacgcgctgc agtccggaaa ctcacaggaa 540 agcgtgacgg agcaggattc caaggacagc acttactcgt tgagcagcac ccttaccctg 600 agcaaggcgg actacgaaaa gcacaaggtc tacgcctgcg aagtgaccca tcaaggattg 660 tcctcccccg tgaccaagtc tttcaaccgg ggggagtgct aatga 705 <210> 653 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 653 atggaatggt cctgggtgtt cctcttcttc ctctccgtga ccactggcgt gcacagccaa 60 gtgcagctgc aagaatccgg tcctgggctt gtgaagccgt cggagactct gtccctcact 120 tgcaccgtgt ccggagggag catttcgagc tactactggt catggattag gcagccgcca 180 gggaagggac tggagtggat cggctacatc tactactccg gctccaccaa ctataacccg 240 agcctgaagt cccgcgtcac catctccgtg gacacctcca agtcgcaatt cagcctgaag 300 ctgagcagtg tgactgccgc cgatactgct gtctactact gcgcgcggga cattccggcg 360 ttcgcctttg acatctgggg ccagggaact atggtcatcg tgtcatccgc ctcgaccaag 420 ggcccctcgg tgttccccct tgccccgtca tccaagtcaa cctcgggtgg aactgcggcc 480 cttggatgcc tcgtgaagga ctatttcccg gaacctgtga ccgtgtcctg gaactccgga 540 gccctgacct ccggtgtcca cacattcccc gccgtgttgc aatcctccgg actgtacagc 600 ctgtcaagcg tcgtgaccgt gccgtcgagc tcgctcggaa cccagacgta catctgcaac 660 gtgaaccaca agccgtccaa caccaaggtc gacaagaagg tcgagcctaa gtcctgcgac 720 aagacgcata cctgtccacc atgtccggca ccagaactgc tgggaggtcc cagcgtgttt 780 ctgttcccgc ccaaacctaa ggataccctg tacatcacca gagagcccga agtgacctgt 840 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggatcct gaagtcaagt tcaattggta cgtggatggc 900 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaagaac agtacaattc cacttatcgg 960 gttgtgtcgg tcctcaccgt gctgcatcag gactggctca acggaaagga gtacaagtgc 1020 aaagtgtcga acaaggctct gcccgcacct attgaaaaga ctatcagcaa ggccaaaggg 1080 cagccgagag agccccaggt ctacaccctg cctccatccc gcgacgagtt gaccaagaac 1140 caagtgtccc tgacttgcct ggtcaagggc ttctaccctt ctgacatcgc ggtggaatgg 1200 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagactaccc cgcctgtact ggacagcgac 1260 ggctcattct tcctgtactc gaagctgacc gtggataagt ctaggtggca gcaggggaac 1320 gtgttctcct gctccgtcat gcacgaagcc ctccataacc actacaccca gaagtcactg 1380 tccttgtccc ctggaaaatg ataa 1404 <210> 654 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 654 atggaatggt cctgggtgtt cctcttcttc ctctccgtga ccactggcgt gcacagccaa 60 gtgcagctgc aagaatccgg tcctgggctt gtgaagccgt cggagactct gtccctcact 120 tgcaccgtgt ccggagggag catttcgagc tactactggt catggattag gcagccgcca 180 gggaagggac tggagtggat cggctacatc tactactccg gctccaccaa ctataacccg 240 agcctgaagt cccgcgtcac catctccgtg gacacctcca agtcgcaatt cagcctgaag 300 ctgagcagtg tgactgccgc cgatactgct gtctactact gcgcgcggga cattccggcg 360 ttcgcctttg acatctgggg ccagggaact atggtcatcg tgtcatccgc ctcgaccaag 420 ggcccctcgg tgttccccct tgccccgtgt tcccgctcaa cctcggagag cactgcggcc 480 cttggatgcc tcgtgaagga ctatttcccg gaacctgtga ccgtgtcctg gaactccgga 540 gccctgacct ccggtgtcca cacattcccc gccgtgttgc aatcctccgg actgtacagc 600 ctgtcaagcg tcgtgaccgt gccgtcgagc tcgctcggaa ccaagacgta cacttgcaac 660 gtggaccaca agccgtccaa caccaaggtc gacaagagag tcgagtctaa gtacggacct 720 ccttgtccac catgtccggc accagaattt ctgggaggtc ccagcgtgtt tctgttcccg 780 cccaaaccta aggataccct gatgatctca agaacccccg aagtgacctg tgtggtggtg 840 gacgtgtccc aggaggatcc tgaagtccag ttcaattggt acgtggatgg cgtggaggtg 900 cacaacgcca agaccaagcc ccgggaagaa cagttcaatt ccacttatcg ggttgtgtcg 960 gtcctcaccg tgctgcatca ggactggctc aacggaaagg agtacaagtg caaagtgtcg 1020 aacaagggac tgccctcctc cattgaaaag actatcagca aggccaaagg gcagccgaga 1080 gagccccagg tctacaccct gcctccatcc caagaggaga tgaccaagaa ccaagtgtcc 1140 ctgacttgcc tggtcaaggg cttctaccct tctgacatcg cggtggaatg ggagagcaac 1200 ggccagcccg agaacaacta caagactacc ccgcctgtac tggacagcga cggctcattc 1260 ttcctgtact cgcgcctgac cgtggataag tctaggtggc aggaagggaa cgtgttctcc 1320 tgctccgtca tgcacgaagc cctccataac cactacaccc agaagtcact gtccttgtcc 1380 ttgggaaaat gataa 1395

Claims

T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 함유 억제제(V-domain Ig-containing Suppressor of T cell Activation, VISTA)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 VISTA에 대한 5개의 리간드 모두의 결합을 차단하며, VISTA에 대한 공지된 5개의 리간드는 VSIG-3(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 3, V-set and immunoglobulin domain containing 3), VSIG-8(V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 8, V-set and immunoglobulin domain containing 8), PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1, P-selectin glycoprotein ligand-1), LRIG1(류신 풍부 반복 및 면역글로불린 유사 도메인 1, leucine rich repeats and immunoglobulin like domains 1) 및 VISTA이고;
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 함유 억제제(VISTA)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
VH는 서열번호 584-597, 227-246 및 383-386 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지고,
VL은 서열번호 84-110 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서,
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 247-253 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 284-291 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 318-325 중 어느 하나의 VH CDR1,
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 254-265 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 292-298 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 326-339 중 어느 하나의 VH CDR2,
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 266-283 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 299-317 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 340-359 중 어느 하나의 VH CDR3,
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 111-122 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 152-162 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 188-196 또는 576-578 중 어느 하나의 VL CDR1,
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 123-131 및 575 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 163-167 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 197-206 중 어느 하나의 VL CDR2, 및
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 132-151 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 168-186 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 207-226 중 어느 하나의 VL CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
VISTA에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하고,
VH는:
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 247-253 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 284-291 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 318-325 중 어느 하나의 VH CDR1,
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 254-265 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 292-298 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 326-339 중 어느 하나의 VH CDR2,
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 266-283 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 299-317 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 340-359 중 어느 하나의 VH CDR3을 포함하고,
VL은:
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 111-122 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 152-162 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 188-196 또는 576-578 중 어느 하나의 VL CDR1,
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 123-131 및 575 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 163-167 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 197-206 중 어느 하나의 VL CDR2, 및
Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 132-151 중 어느 하나; IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 168-186 중 어느 하나; 또는 Paratome 넘버링 시스템에 의해 정의된 서열번호 207-226 중 어느 하나의 VL CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 또는 제4항에 있어서,
VH가 서열번호 584-597, 227-246 및 383-386 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지고,
VL이 서열번호 84-110 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제3항 또는 제4항에 있어서,
VH CDR1이 서열번호 247을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 254를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 266을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 111을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 123을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 132를 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 284를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 292를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 299를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 152를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 163을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 168을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 318을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 326을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 340을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 188을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 197을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 207을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 248을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 255를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 267을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 112를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 124를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 133을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 285를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 293을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 300을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 153을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 164를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 169를 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 319를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 327을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 341을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 189를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 198을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 208을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 249를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 256을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 268을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 113을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 125를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 134를 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 286을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 294를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 301을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 154를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 165를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 170을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 320을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 328을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 342를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 190을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 199를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 209를 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 250을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 257을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 269를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 114를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 126을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 135를 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 287을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 295를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 302를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 155를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 165를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 171을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 321을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 329를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 343을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 191을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 200을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 210을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 251을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 258을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 270을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 115를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 127을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 136을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 288을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 295를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 303을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 156을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 166을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 172를 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 322를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 330을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 344를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 192를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 201을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 211을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 248을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 259를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 271을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 116을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 126을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 137을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 285를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 296을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 304를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 157을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 165를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 173을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 319를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 331을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 345를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 193을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 200을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 212를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제3항 또는 제4항에 있어서,
VH CDR1이 서열번호 247, 서열번호 284 또는 서열번호 318을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 254, 서열번호 292 또는 서열번호 326을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 266, 서열번호 299 또는 서열번호 340을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 111, 서열번호 152 또는 서열번호 188을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 123, 서열번호 163 또는 서열번호 197을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 132, 서열번호 168 또는 서열번호 207을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 248, 서열번호 285 또는 서열번호 319를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 255, 서열번호 293 또는 서열번호 327을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 267, 서열번호 300 또는 서열번호 341을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 112, 서열번호 153 또는 서열번호 189를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 124, 서열번호 164 또는 서열번호 198을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 133, 서열번호 169 또는 서열번호 208을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 249, 서열번호 286 또는 서열번호 320을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 256, 서열번호 294 또는 서열번호 328을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 268, 서열번호 301 또는 서열번호 342를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 113, 서열번호 154 또는 서열번호 190을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 125, 서열번호 165 또는 서열번호 199를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 134, 서열번호 170 또는 서열번호 209를 포함하거나;
VH1 CDR1이 서열번호 250, 서열번호 287 또는 서열번호 321을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 257, 서열번호 295 또는 서열번호 332를 포함하고, VH CDR3이 서열번호 269, 서열번호 302 또는 서열번호 346, 195을 포함하고, VL CDR1이 서열번호 114, 서열번호 155 또는 서열번호 191을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 126, 서열번호 165 또는 서열번호 200을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 135, 서열번호 171 또는 서열번호 210을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 251, 서열번호 288 또는 서열번호 322를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 258, 서열번호 295 또는 서열번호 333을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 270, 서열번호 303 또는 서열번호 344를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 115, 서열번호 156 또는 서열번호 192를 포함하고, VL CDR2가 서열번호 127, 서열번호 166 또는 서열번호 201을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 136, 서열번호 172 또는 서열번호 211을 포함하거나;
VH CDR1이 서열번호 248, 서열번호 185 또는 서열번호 319를 포함하고, VH CDR2가 서열번호 259, 서열번호 296 또는 서열번호 331을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 271, 서열번호 304 또는 서열번호 345를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 116, 서열번호 157 또는 서열번호 193을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 126, 서열번호 165 또는 서열번호 200을 포함하고, VL CDR3이 서열번호 137, 서열번호 173 또는 서열번호 212를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) VH가 서열번호 592와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 86과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(ii) VH가 서열번호 584와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 84와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(iii) VH가 서열번호 585와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 85와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(iv) VH가 서열번호 586과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 86과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(v) VH가 서열번호 587과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 87과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(vi) VH가 서열번호 588과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 88과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(vii) VH가 서열번호 589와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 89와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(viii) VH가 서열번호 238과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 84와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(ix) VH가 서열번호 590과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 84와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(x) VH가 서열번호 591238과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 85와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(xi) VH가 서열번호 593과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 86과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(xii) VH가 서열번호 593238과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 87과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(xiii) VH가 서열번호 594와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 884와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지거나;
(xiv) VH가 서열번호 595와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지고,
VL이 서열번호 89와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 포함하거나, 상기 서열번호를 포함하거나, 상기 서열번호로 이루어지는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 407-477, 572-574 및 604-609 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지는 중쇄(HC) 서열을 포함하고,
서열번호 387-406, 569-571 및 598-603 중 어느 하나와의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이거나, 상기 서열번호 중 어느 하나를 포함하거나, 상기 서열번호 중 어느 하나로 이루어지는 경쇄(LC) 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 VISTA(서열번호 377의 아미노산 33-311)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제10항에 있어서, 아미노산 서열 HLHHG(서열번호 377의 아미노산 98-102) 또는 VVEIRHHHSEHR(서열번호 377의 아미노산 148-159)을 포함하는 인간 VISTA의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제10항에 있어서, 서열번호 377의 티로신 37, 아르기닌 54, 발린 117 및 아르기닌 127을 포함하는 인간 VISTA의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역을 포함하고,
선택적으로 Fc 영역은 인간 Fc 영역이거나 천연 인간 Fc 영역에 비해 Fc 영역에서 1 내지 7개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖는 인간 Fc 영역의 변이체이고/이거나,
선택적으로 인간 Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 추가로 선택적으로 항체는 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 불변 영역을 포함하거나 천연 불변 영역에 비해 불변 영역에서 1 내지 7개 범위의 아미노산 돌연변이를 갖는 상기 불변 영역의 변이체를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제13항에 있어서,
(a) Fc 영역이 인간 IgG1의 Fc 영역이고, 돌연변이가 C220D, D221C, E233P, L234A, L234E, L234Y, L235A, L235E, L235F, G236A, G236W, G236R, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, A330L, A330S, P331A, P331S, I332E, E333A, E333S, K334A, A378V, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이거나;
(b) Fc 영역이 인간 IgG2의 Fc 영역이고, 돌연변이가 C220D, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, V309L, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, A330L, A330S, P331A, P331S, I332E, E333A, E333S, K334A, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것이거나;
(c) Fc 영역이 인간 IgG4의 Fc 영역이고, 돌연변이가 S228P, E233P, F234A, L235A, L235E, L235F, G236A, G236W, G236R, G237A, P238S, S239D, F241A, M252Y, S254T, T256E, T256N, V264A, D265A, S267E, H268F, H268A, D270A, H268Q, E294결실, N297A, N297G, N297E, S298A, T307P, V309L, E318A, K322A, S324T, K326A, K326M, L328R, P329A, P329G, I332E, E333A, E333S, K334A, A378V, S383N, M428L, N434S 및 N434Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단편이 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv(scFv)인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
인간 VISTA(서열번호 377)에 대한 결합에 대해 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 치료제를 포함하는 항체-약물 접합체.
제16항의 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR).
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH, VL, 또는 VH와 VL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제18항의 항체-약물 접합체 또는 제19항의 CAR 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성 방법으로서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 세포에 의해 발현되어 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하도록 하는 조건 하에서 제21항의 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
치료를 필요로 하는 대상체에서 암, 자가면역 질환 및/또는 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제22항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 암이 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 두경부 편평세포암(head and neck squamous cell carcinoma), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 구강암(oral cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 유방암(breast cancer), 육종(sarcoma), 췌장암(pancreatic cancer), 대장암(colon cancer), 위암(gastric cancer), 융모암(choriocarcinoma), 고환암(testicular cancer), 중피종(mesothelioma), 피부암(skin cancer), 신장세포암종(renal cell carcinoma), 방광암(bladder cancer), 혈액암(hematological cancer) 또는 자궁경부암(cervical cancer)인 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 암이 전이성 암인 방법.
제24항에 있어서, 암이 혈액암(blood cancer), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 또는 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)인 방법.
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 추가 요법을 시행하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 추가 요법이 방사선요법, 화학요법제, 표적요법, 티로신 키나제 억제제, 호르몬요법 및/또는 면역 체크포인트 억제제인 방법.
제28항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 예정사-1(Programmed Death-1, PD-1), 또는 예정사-리간드 1(Programmed death-ligand 1, PDL1), 또는 세포독성 T-림프구 연관 단백질 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)의 억제제인 방법.