KR102648966B1 - Folr1 및 cd3에 대한 t 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 - Google Patents
Folr1 및 cd3에 대한 t 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 일반적으로 T 세포 활성화 및 특이적 표적 세포에 대한 재유도를 위한 신규한 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하는 방법, 및 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 질병의 치료에서 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 T 세포 활성화를 위한 이중특이적 항원 결합 분자, 특히 CD3 및 엽산 수용체 1(FolR1)을 표적하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하는 방법, 및 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 질병의 치료시 사용하는 방법에 관한 것이다.
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개별 세포 또는 특이적 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상적 설정에서 바람직하다. 예를 들면, 종양 세포를 특이적으로 파괴하면서 건강한 세포 및 조직을 온전하고 손상되지 않게 남겨 두는 것이 암 치료의 주목적이다.
이를 달성하는 매력적인 방법은 종양에 대한 면역 반응을 유도하여 종양 세포를 공격하고 파괴하는 천연 살해자(NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL)와 같은 면역 효과기 세포를 생성하는 것이다. CTL은 면역계의 가장 강력한 효과기 세포를 구성하지만, 공통 치료 항체의 Fc 도메인에 의해 매개된 효과기 기전에 의해 활성화될 수 없다.
이점에 있어서, 표적 세포의 표면 항원에 1개의 "아암(arm)"과 결합하고, 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화 불변 성분에 제 2 "아암"과 결합하도록 설계된 이중특이적 항체는, 최근 몇 년 동안 관심이 되었다. 상기 항체의 이의 모든 표적에 대한 동시 결합은 표적 세포와 T 세포 사이에 일시적 상호작용을 강요하여 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 이후 표적 세포의 용해를 야기한다. 이런 이유로, 면역 반응은 표적 세포에 재-유도되고 CTL의 정상적인 MHC-제한된 활성화와 관련성이 있을 수 있는 것처럼 표적 세포 또는 T 세포의 특이성에 의한 펩티드 항원 제시와 무관하다. 이와 관련하여, CTL은 표적 세포가 이중특이적 항체를 제시할 때, 즉, 면역학적 시냅스를 모방할 때 오직 활성화되는 것이 중요하다. 표적 세포의 효율적인 용해를 유발하기 위해 림프구 전처리 또는 공-자극이 필요하지 않은 이중특이적 항체가 특히 바람직하다.
FOLR1은 다양한 기원, 예를 들면 난소암, 폐암, 유방암, 신장암, 결장직장암 또는 자궁내막암의 상피 종양 세포에서 발현된다. 파를레투주맙과 같은 치료 항체, 항체 약물 접합체 또는 종양의 이미징을 위한 입양 T 세포 요법으로 FOLR1을 표적하는 여러 접근법은 문헌[Kandalaft et al., J Transl Med. 2012 Aug 3;10:157. doi: 10.1186/1479-5876-10-157]; [van Dam et al., Nat Med. 2011 Sep 18;17(10):1315-9. doi: 10.1038/nm.2472]; [Cliftonet al., Hum Vaccin. 2011 Feb;7(2):183-90. Epub 2011 Feb 1]; [Kelemen et al., Int J Cancer. 2006 Jul 15;119(2):243-50]; [Vaitilingam et al., J Nucl Med. 2012 Jul;53(7)]; [Teng et al., 2012 Aug;9(8):901-8. doi: 10.1517/17425247.2012.694863. Epub 2012 Jun 5]에 기재되어 있다. 일부 시도는 엽산 수용체 및 CD3을 표적하는 구축물로 엽산 수용체-양성 종양을 표적하도록 만들어져 있다(문헌[Kranz et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 26, 1995; 92(20): 9057-9061]; [Roy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2004 Apr 29;56(8):1219-31]; [Huiting Cui et al Biol Chem. Aug 17, 2012; 287(34): 28206-28214]; [Lamers et al., Int. J. Cancer. 60(4):450(1995)]; [Thompson et al., MAbs. 2009 Jul-Aug;1(4):348-56. Epub 2009 Jul 19]; [Mezzanzanca et al., Int. J. Cancer, 41, 609-615(1988)]). 그러나, 상기 접근법은 많은 단점을 갖는다. 지금 까지 사용된 분자는 화학적 가교가 필요하기 때문에 용이하고 확실하게 생성될 수 없었다. 유사하게, 하이브리드 분자는 인간 단백질과 같은 큰 규모에서 생성될 수 없고 이에 따라 인간에게 투여될 때 주로 면역원성인 제한된 치료 값의 래트, 뮤린 또는 다른 단백질의 사용을 필요로 한다. 또한, 많은 종래 분자는 FcgR 결합을 보유한다.
따라서, T 세포 매개된 면역요법을 표적하는 신규의 개선된 이중특이적 항체에 대한 요구가 남아있다. 본 발명은 T 세포 활성화를 표적하기 위해 설계된 이중특이적 항원 결합 분자, 특히, 용이하게 생성되고 투여될 수 있는 효과적이고 안전한 치료제로서 적합한 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (iii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 제 2 항원 결합 모이어티와 동일하다.
상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티 중 하나 이상은 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제 1 및 제 2 하위단위로 이루어진 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에, 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 융합된다.
상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다. 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다. 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 서열번호 8, 서열번호 56 및 서열번호 57로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 및 서열번호 59, 서열번호 60 및 서열번호 65로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다. 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
또 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 및 열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다. 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 (a) 서열번호 8의 상보성 결정 영역 중쇄 1(CDR-H1) 아미노산 서열; (b) 서열번호 9의 CDR-H2 아미노산 서열; (c) 서열번호 50의 CDR-H3 아미노산 서열; (d) 서열번호 52의 상보성 결정 영역 경쇄 1(CDR-L1) 아미노산 서열; (e) 서열번호 53의 CDR-L2 아미노산 서열; 및 (f) 서열번호 54의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
또 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 서열번호 16, 서열번호 275 및 서열번호 315로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34의 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다. 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 (a) 서열번호 16의 상보성 결정 영역 중쇄 1(CDR-H1) 아미노산 서열; (b) 서열번호 275의 CDR-H2 아미노산 서열; (c) 서열번호 315의 CDR-H3 아미노산 서열; (d) 서열번호 32의 상보성 결정 영역 경쇄 1(CDR-L1) 아미노산 서열; (e) 서열번호 33의 CDR-L2 아미노산 서열; 및 (f) 서열번호 34의 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 FolR1 및 시노몰구스 원숭이 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 FolR1, 시노몰구스 원숭이 FolR1 및 뮤린 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 FolR1, 시노몰구스 원숭이 FolR1에 결합하고 뮤린 FolR1에 결합하지 않는다.
임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 교차Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 1개 이하로 포함한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG 클래스 면역글로불린, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 하위단위의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 하위단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되어, 제 2 하위단위의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제 1 하위단위의 CH3 도메인 내에 돌출부를 생성하고, Fc 도메인의 제 2 하위단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 1 하위단위의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제 2 하위단위의 CH3 도메인 내에 캐비티를 생성한다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 본래의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 각각의 하위단위는 활성화 Fc 수용체에 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G(카밧 넘버링)이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시양태에서, 효과기 기능은 항체-의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)이다.
임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 인간 CD3+ T 세포의 증식을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 FolR1-발현 인간 종양 세포의 인간 말초 혈액 단핵 세포 매개된 사멸을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 FolR1-발현 인간 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 하나의 실시양태에서, FolR1-발현 인간 종양 세포는 HeLa, Skov-3, HT-29, 또는 HRCEpiC 세포이다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 24 시간 후 약 36 pM 내지 약 39573 pM의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 인간 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 24 시간 후 약 36 pM의 EC50으로 시험관내 FoR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 24 시간 후 약 178.4 pM의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 48 시간 후 약 134.5 pM 이상의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다.
하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 유동 세포계측법에 의해 측정시 T 세포에서 CD25 및 CD69 중 하나 이상의 세포 표면 발현의 상향조절을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 5.36 pM 내지 약 4 nM의 겉보기 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 4 nM의 겉보기 KD로 인간 및 시노몰구스 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1.5 nM의 겉보기 KD로 뮤린 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1000 nM 이상의 1가 결합 KD로 인간 FolR1에 결합한다.
하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 FolR1에 대하여 특이적이고 FolR2 또는 FolR3에 결합하지 않는다. 하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 1 μM 이상의 친화성(1가 결합)을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 친화성은 인간 FolR1의 경우 약 1.4 μM이다. 하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1 내지 100 nM 이하의 결합활성(2가 결합)을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 결합활성은 약 10 nM 이하이다. 하나의 실시양태에서, 결합활성은 10 nM이다.
하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 종양 세포 상에 발현된 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 FolR1 상의 구조적 에피토프에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 엽산 수용체 2(FolR2) 또는 인간 엽산 수용체 3(FolR3)에 결합하지 않는다. 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 인간 FolR1(서열번호 227)의 아미노산 23 내지 234를 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합한다. 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 227, 230 및 231의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합하고, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 228 및 229의 아미노산 서열을 포함하는 FolR 폴리펩티드에 결합하지 않는다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 인간 FolR1에의 결합에 대해 서열번호 49의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 41의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 기준 항체와 경쟁하는 제 1 항원 결합 부위; 및 (b) 인간 CD3에의 결합에 대해 서열번호 36의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 기준 항체와 경쟁하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하고, 이때 결합 경쟁은 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 측정된다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 인간 FolR1에의 결합에 대해 서열번호 274의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 기준 항체와 경쟁하는 제 1 항원 결합 부위; 및 (b) 인간 CD3에의 결합에 대해 서열번호 36의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 기준 항체와 경쟁하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하고, 이때 결합 경쟁은 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 측정된다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티, 및 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 이때 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 49의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 51의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제 1 기준 항체로서 인간 FolR1에서 동일한 에피토프에 결합하고; T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 36의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제 2 기준 항체로서 인간 CD3에서 동일한 에피토프에 결합한다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티, 및 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 이때 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 274의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 제 1 기준 항체로서 인간 FolR1에서 동일한 에피토프에 결합하고; T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 36의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 제 2 기준 항체로서 인간 CD3에서 동일한 에피토프에 결합한다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 인간 FolR1에의 결합에 대해 서열번호 274의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이고, 이때 결합 경쟁은 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 측정된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 항원 결합 분자가 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티를 형성하는 제 1, 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 제 1 항원 결합 모이어티가 CD3에 결합할 수 있고 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티가 각각 FolR1에 결합할 수 있는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 이때 (a) 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는 아미노(N)-말단에서 카복실(C)-말단 방향으로, VLD1 및 CLD1을 포함하고; (b) 제 3 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, VLD2 및 CH1D2를 포함하고; (c) 제 4 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, VHD1, CH1D1, CH2D1 및 CH3D1을 포함하고; (d) 제 5 폴리펩티드 쇄는 VHD1, CH1D1, VHD2, CLD2, CH2D2 및 CH3D2를 포함하되, VLD1은 제 1 경쇄 가변 도메인이고, VLD2는 제 2 경쇄 가변 도메인이고, CLD1은 제 1 경쇄 불변 도메인이고, CLD2는 제 2 경쇄 불변 도메인이고, VHD1은 제 1 중쇄 가변 도메인이고, VHD2는 제 2 중쇄 가변 도메인, CH1D1은 제 1 중쇄 불변 도메인 1이고, CH1D2는 제 2 중쇄 불변 도메인 1이고, CH2D1은 제 1 중쇄 불변 도메인 2이고, CH2D2는 제 2 중쇄 불변 도메인 2이고, CH3D1은 제 1 중쇄 불변 도메인 3이고, CH3D2는 제 2 중쇄 불변 도메인 3이다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, (i) 제 3 폴리펩티드 쇄, 및 제 5 폴리펩티드 쇄의 VHD2 및 CLD2는 CD3에 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티를 형성하고; (ii) 제 1 폴리펩티드 쇄, 및 제 4 폴리펩티드 쇄의 VHD1 및 CH1D1은 FolR1에 결합할 수 있는 제 2 결합 모이어티를 형성하고; (iii) 제 2 폴리펩티드 쇄, 및 제 5 폴리펩티드 쇄의 VHD1 및 CH1D1은 FolR1에 결합할 수 있는 제 3 결합 모이어티를 형성한다. 하나의 실시양태에서, CH2D1, CH3D1, CH2D2 및 CH3D2는 IgG 클래스 면역글로불린의 Fc 도메인을 형성한다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 하위단위의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 하나의 실시양태에서, CH3D2는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기를 포함하고, 이는 CH3D1 내의 캐비티에 위치할 수 있다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 본래의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 각각의 하위단위는 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및 효과기 기능 중 하나 이상의 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 이때 상기 아미노산 치환은 카밧 넘버링에 따라 L234A, L235A 및 P329G이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 인간 CD3+ T 세포의 증식을 유도한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 FolR1-발현 인간 종양 세포의 인간 말초 혈액 단핵 세포 매개된 사멸을 유도한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 FolR1-발현 인간 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 하나의 상기 실시양태에서, FolR1-발현 인간 종양 세포는 HeLa, Skov-3, HT-29, 또는 HRCEpiC 세포이다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 24 시간 후 약 36 pM 내지 약 39573 pM의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 24 시간 후 약 36 pM의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 24 시간 후 약 178.4 pM의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 48 시간 후 약 134.5 pM 이상의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 유동 세포계측법에 의해 측정시 T 세포에서 CD25 및 CD69 중 하나 이상의 세포 표면 발현의 상향조절을 유도한다. 하나의 상기 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 5.36 pM 내지 약 4 nM의 겉보기 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 4 nM의 겉보기 KD로 인간 및 시노몰구스 FolR1에 결합한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1.5 nM의 겉보기 KD로 뮤린 FolR1에 결합한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1000 nM 이상의 1가 결합 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 종양 세포 상에 발현된 FolR1에 결합한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 FolR1 상의 구조적 에피토프에 결합한다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 엽산 수용체 2(FolR2) 또는 인간 엽산 수용체 3(FolR3)에 결합하지 않는다. 상기 실시양태 중 하나에서, 항원 결합 모이어티는 인간 FolR1(서열번호 227)의 아미노산 25 내지 234를 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합한다. 상기 실시양태 중 하나에서, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 227, 230 및 231의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합하고, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 228 및 229의 아미노산 서열을 포함하는 FolR 폴리펩티드에 결합하지 않는다. 상기 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간화 또는 키메라 분자이다. 상기 실시양태 중 하나에서, VHD2 및 CH1D1은 펩티드 연결기를 통해 연결된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상기 실시양태 중 하나에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상기 실시양태 중 하나에서, 제 3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 상기 실시양태 중 하나에서, 제 4 폴리펩티드 쇄는 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상기 실시양태 중 하나에서, 제 5 폴리펩티드 쇄는 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상기 실시양태 중 하나에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함한고; 제 3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하고; 제 4 폴리펩티드 쇄는 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하고; 제 5 폴리펩티드 쇄는 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 230의 아미노산 서열 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 277의 아미노산 서열 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 277의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 서열번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 하나의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 169의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 246의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 247의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 97의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 198의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 287의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 288의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 289의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 상기 실시양태의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 또 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 하나의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터를 제공한다. 또 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 실시양태의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은, (a) 상기 실시양태의 숙주 세포를 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, CD3 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생성 방법을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 상기 실시양태의 방법에 의해 생성된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 임의의 하나의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 약제로서 사용하는 상기 실시양태 중 임의의 하나의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 임의의 상기 실시양태의 약학 조성물을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에서 질병의 치료에 사용하는 상기 실시양태 중 임의의 하나의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 상기 실시양태 중 임의의 하나의 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질병은 암이다. 하나의 양상에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에서 질병의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 실시양태 중 임의의 하나의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 임의의 하나의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는, 약학적으로 허용되는 형태의 조성물을 치료 효과량으로 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 질병의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 질병은 암이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 표적 세포를 T 세포의 존재하에 상기 실시양태 중 임의의 하나의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 앞서 기재된 바를 제공한다.
도 1a 내지 1i는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(TCB)의 예시적인 배열을 도시한다. 카파-감마 포맷(도 1i)을 제외한 모든 구축물은 P329G LALA 돌연변이를 갖고 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변형을 갖는 놉-인투-홀 Fc 단편을 포함한다. (도 1a) "FolR1 TCB 2+1 도립된(공통 경쇄)"를 예시한다. FolR1 결합제는 Fab 중쇄의 C-말단에서 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 제 1 하위단위의 N-말단에 융합된다. 이러한 구축물은 교차되지 않고 3회 동일한 VLCL 경쇄를 갖는다. (도 1b) "FoLR1 TCB 1+1 헤드-투-테일(head-to-tail)(공통 경쇄)"을 예시한다. 이러한 구축물은 교차되지 않고 2회 동일한 VLCL 경쇄를 갖는다. (도 1c) "FolR1 TCB 1+1 고전적(공통 경쇄)"를 예시한다. 이러한 구축물은 교차되지 않고 2회 동일한 VLCL 경쇄를 갖는다. (도 1d) "FolR1 TCB 2+1 고전적(공통 경쇄)"를 예시한다. CD3 결합제는 Fab 중쇄의 C-말단에서 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 제 1 하위단위의 N-말단에 융합된다. 이러한 구축물은 교차되지 않고 3회 동일한 VLCL 경쇄를 갖는다. (도 1e) "FolR1 TCB 2+1 고전적 교차Fab"의 예시이다. 이러한 구축물은 공통 CH1-VH 쇄 대신에 CD3 결합제를 위한 Ck-VH 쇄를 포함한다. CD3 결합제는 Fab 중쇄의 C-말단에서 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 제 1 하위단위의 N-말단에 융합된다. (도 1f) "FolR1 TCB 2+1 도립된 교차Fab"을 예시한다. 이러한 구축물은 공통 CH1-VH 쇄 대신에 CD3 결합체를 위한 Ck-VH 쇄를 포함한다. FolR1 결합제는 Fab 중쇄의 C-말단에서 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 제 1 하위단위의 N-말단에 융합된다. (도 1g) "FolR1 TCB 1+1 헤드-투-테일 교차Fab"를 예시한다. 이러한 구축물은 공통 CH1-VH 쇄 대신에 CD3 결합제를 위한 Ck-VH 쇄를 포함한다. (도 1h) "고전적 FolR1 TCB 1+1 교차Fab"를 예시한다. 이러한 구축물은 공통 CH1-VH 쇄 대신에 CD3 결합제를 위한 Ck-VH 쇄를 포함한다. (도 1i) CD3/FolR1 카파-감마 항체 포맷을 예시한다. 이러한 구축물은 교차된 공통 경쇄 VLCH1 및 CD3에 특이적인 1개의 교차된 VHCL 쇄 및 FolR1에 특이적인 1개의 교차된 VHCL 쇄를 포함한다.
도 2a 내지 2c는 HeLa 세포에 FoLR1 IgG 결합제의 결합을 요약하는 그래프를 도시한다. HeLa 세포에서 발현된 FolR1에 신규하게 생성된 FolR1 결합제의 결합은 유동 세포계측법으로 측정된다. 결합된 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 3a 및 3b는 FolR1에 대한 FolR1 결합제의 특이성을 요약하는 그래프를 도시한다. FolR1 또는 FolR2로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에 FolR1 IgG의 결합은 유동 세포계측법으로 분석하여 FolR2가 아니라 FolR1에 특이적으로 결합하는 클론을 확인하였다. 상기 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 4a 및 4b는 cyFoLR1에 대한 FolR1 결합제의 교차 반응성을 요약하는 그래프를 도시한다. 시노몰구스 FolR1에 대한 FolR1 항체의 교차 반응성은 cyFolR1로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 유동 세포계측법으로 입증하였다. 상기 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 5는 결합 후 FolR1 TCB의 내재화를 예시하는 그래프를 도시한다. FolR1에 결합 후 2개의 FolR1 TCB의 내재화는 HeLa 세포에서 시험하였다. 표면에 남아있는 FolR1 TCB는 37℃에서 항온처리의 나타난 시점 후 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다. 내재화율(%)을 계산하였다.
도 6a 내지 6e는 상이한 FolR1 발현 수준을 갖는 세포에 FolR1 IgG의 결합을 요약하는 그래프를 도시한다. 상이한 FolR1 발현 수준을 갖는 종양 세포에 9D11, 16D5 및 Mov19 IgG의 결합은 유동 세포계측법으로 분석하였다. DP47 IgG는 이소타입(isotype) 대조군으로서 포함되고 MKN-45는 FolR1 음성 세포주로서 포함되었다. 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 7a 내지 7f는 HT-29 및 SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸을 요약하는 그래프를 도시한다. FolR1 TCB를 사용하여 HT-29 및 SKOV3 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸 및 사멸시 T 세포에서 활성화 마커의 상향조절을 시험하였다. (A 내지 D) 9D11 FolR1 TCB 및 16D5 FolR1 TCB의 존재 하에 HT-29 및 SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸은 24 시간 및 48 시간 후 LDH 방출에 의해 측정하였다. DP47 TCB는 음성 대조군으로서 포함되었다. 48 시간 항온처리 후, SKOV3(E 내지 H) 또는 HT-29(I 내지 L) 종양 세포의 사멸시 CD8 T 세포 및 CD4 T 세포에서 활성화 마커 CD25 및 CD69의 상향조절은 유동 세포계측법으로 측정하였다.
도 8은 적혈구에 결합하는 항-FolR1의 부재를 나타내는 그래프를 도시한다. 적혈구는 CD235a 양성 집단으로서 게이팅하고 이 집단에 9D11 IgG, 16D5 IgG, Mov19 IgG 및 DP47 IgG의 결합은 유동 세포계측법으로 측정하였다. 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 9는 전혈에서 활성화 마커 상향조절을 요약하는 그래프를 도시한다(A 내지 D). 9D11 FolR1 TCB, 16D5 FolR1 TCB, Mov19 FolR1 TCB 및 DP47 TCB의 첨가 24 시간 후 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 CD25 및 CD69 활성화 마커 상향조절은 유동 세포계측법으로 분석하였다.
도 10은 HeLa 세포에 9D11 TCB a-글리코 변이체의 결합을 도시한다. HeLa 세포에 9D11 FolR1 TCB a-글리코 변이체의 결합은 HeLa 세포에 원래 9D11 TCB의 결합에 비교하였다. 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하고 결합은 유동 세포계측법으로 측정하였다.
도 11a 내지 11c는 종양 세포의 9D11 FolR1 TCB a-글리코 변이체로 인한 T 세포 매개된 사멸을 요약하는 그래프를 도시한다. 9D11 FolR1 TCB a-글리코 변이체를 사용하여 원래의 9D11 FolR1 TCB와의 사멸과 비교하여 (도 11a 및 11b) SKOV3, MKN-45(FolR1 음성 대조군으로서) 및 (도 11c) HT-29 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 시험하였다. 판독된 바와 같이 24 시간 및 48 시간 후 LDH 방출을 사용하였다.
도 12a 내지 12l은 1차 상피 세포의 T 세포 매개된 사멸을 요약하는 그래프를 도시한다. 매우 낮은 수준의 FolR1을 갖는 1차 상피 세포를 사용하여 16D5 FolR1 TCB 및 9D11 FolR1 TCB로의 T 세포 매개된 사멸을 시험하고, DP47 TCB는 음성 대조군으로서 포함되고 HT29 세포는 양성 대조군으로서 포함되었다. (도 12a 내지 12h) 인간 망막 색소(HRP), 인간 신장 피질(HRC), 인간 기관지(HB), 및 HT29 세포의 LDH 방출은 24 시간 및 48 시간 후 측정하였다. HRP(도 12i), HRC(도 12j), HB(도 12k) 및 HT29(도 12l)의 사멸시 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD25 및 CD69 활성화 마커 상향조절을 48 시간 후 유동 세포계측법에 의해 측정하였다.
도 13a 내지 13c는 16D5를 갖는 상이한 TCB 포맷의 비교를 나타낸다. FolR1 결합제 16D5를 함유하는 4개의 상이한 TCB 포맷은 HeLa 세포에 대한 결합(도 13a), 24 시간 및 48 시간 후 SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸(도 13b), 및 사멸 48 시간 후 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD25 및 CD69 활성화 마커 상향조절(도 13c)에서 비교하였다.
도 14a 내지 14c는 9D11을 갖는 상이한 TCB 포맷의 비교를 도시한다. FolR1 결합제 9D11을 함유하는 3개의 상이한 TCB 포맷을 (a) HeLa 세포에 대한 결합, (b) 24 시간 및 48 시간 후 SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸, 및 (c) 사멸 48 시간 후 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD25 및 CD69 활성화 마커 상향조절에서 비교하였다.
도 15는 3가지 상이한 용량에 대하여 NOG 마우스에서 FOLR1 TCB의 PK 프로필을 도시한다.
도 16은 FOLR1 TCB로 효능 연구를 하는 실험 프로토콜을 예시한다.
도 17a 및 17b는 종양 성장 곡선을 도시한다. (도 17a) 상이한 처리 군에서 종양 부피의 평균값 및 SEM. (도 17b) 모든 처리 군에서 단일 마우스의 종양 성장. TGI(종양 성장 억제)는 비히클 군과 비교하여 평균 종양 부피의 %로 제공된다.
도 18은 연구 종결시에 종양 중량을 나타낸다.
도 19a 및 19b는 연구 32일에 T 세포를 침윤하는 종양의 FACS 분석을 나타낸다. (도 19a) 종양 단세포 현탁액을 항-인간 CD3/CD4/CD8로 염색하고 유동 세포계측법으로 분석하다. (도 19b) T 세포의 평균값 및 SEM을 상이한 처리 군에서 종양 조직 1 mg당 카운트하였다.
도 20a 및 20b는 연구 32일에 T 세포 활성화/탈과립 및 사이토카인 분비에 대한 FACS 분석을 나타낸다. T 세포를 침윤하는 CD4+(도 20a) 및 CD8+(도 20b) 종양을 사이토카인, 활성화 및 탈과립 마커로 염색하였다. 상이한 처리 군에서 종양 조직 1 mg당 T 세포 카운트의 평균값 및 SEM을 나타내었다.
도 21은 종양 용해율(%)을 나타낸다(A 및 B). SKOV3 세포를 κγFolR1 TCB 또는 DP47 TCB의 존재하에 PBMC와 함께 항온처리하였다. 24 시간(A) 및 48 시간(B) 후 종양 세포의 사멸은 LDH 방출을 측정하여 결정하였다.
도 22는 CD4 T 세포에서 CD25 및 CD69 상향조절을 나타낸다(A 내지 D). SKOV3 세포를 κγFolR1 TCB 또는 DP47 TCB의 존재하에 PBMC와 함께 항온처리하였다. 48 시간 후 CD4 T 세포(A 및 B) 및 CD8 T 세포(C 및 D)에서 CD25 및 CD69 상향조절은 유동 세포계측법으로 측정하였다.
도 23은 종양 용해율을 나타낸다(A 및 B). SKov-3 세포(중간 FolR1)의 T 세포 사멸은 항온처리 24 시간(A) 및 48 시간(B) 후 36F2 TCB, Mov19 TCB 및 21A5 TCB에 의해 유도된다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC).
도 24는 36F2 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB 1+1 고전적 및 HeLa의 16D5 TCB HT(높은 FolR1)(A), Skov-3(중간 FolR1)(B) 및 HT-29(낮은 FolR1)(C) 인간 종양 세포(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 24 시간 항온처리)에 의해 유도된 T 세포 사멸을 도시한다. DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군을 포함하였다.
도 25a 내지 25c는 인간 CD8+(도 25a 및 25b) 및 CD4+(도 25c)에서 CD25 및 CD69의 상향조절을 나타내고, HeLa 세포(높은 FolR1)(도 25a), SKov-3 세포(중간 FolR1)(도 25b) 및 HT-29 세포(낮은 FolR1)(도 25c)의 T 세포 매개된 사멸 후 T 세포(E:T = 10:1, 48 시간 항온처리)는 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 DP47 TCB(결합하지 않는 대조군)에 의해 유도된다.
도 26은 24 시간(A, C 및 E)및 48 시간(B, D 및 F)의 항온처리(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC) 후 인간 신장 피질 상피 세포(A 및 B), 인간 망막 색소 상피 세포(C 및 D) 및 HT-29 세포(E 및 F) 세포의 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 DP47 TCB에 의해 유도된 T 세포 사멸을 나타낸다.
도 27은 다양한 정상 세포주 및 암 세포주에서 FolR1 결합 부위의 정량화를 요약하는 표를 도시한다.
도 28은 주르카트 세포에서 발현된 인간 CD3에 대한 16D5 TCB 및 이의 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A 및 16D5 TCB S100aA(A), 및 9D11 TCB 및 이의 탈아미드화 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aAB(B)의 결합을 나타낸다.
도 29는 16D5 TCB 및 이의 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A 및 16D5 TCB S100aA(A), 및 9D11 TCB 및 이의 탈아미드화 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aA(B)에 의해 유도된 SKov-3(중간 FolR1) 인간 종양 세포의 T 세포 사멸을 나타낸다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 항온처리 시간 24 시간). DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군으로서 포함하였다.
도 30은 16D5 TCB 및 이의 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A 및 16D5 TCB S100aA(A), 및 9D11 TCB 및 이의 탈아미드화 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aA(B)에 의해 유도된 HT-29(낮은 FolR1) 인간 종양 세포의 T 세포 사멸을 나타낸다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 항온처리 시간 24 시간). DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군으로서 포함하였다.
도 31a 내지 31c는 평균 형광 강도 및 종양 세포 용해를 나타낸다.
도 32a 내지 32e는 HeLa 세포에서 발현된 인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 16D5 HC/LC 변이체의 결합을 나타낸다.
도 33은 HeLa 세포에서 인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 2개의 16D5 친화성 감소된 변이체 16D5 W96Y/D52E TCB 및 16D5 G49S/S93A TCB의 결합을 나타낸다.
도 34a 내지 34e는 HT-29 세포에서 발현된 인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 16D5 HC/LC 변이체의 결합을 나타낸다.
도 35는 인간 또는 마우스 FolR1 또는 FolR2를 발현하는 HEK293T 세포에 대한 중간 FolR1 결합제(6E10 TCB, 14B1 TCB 및 9C7 TCB), 16D5 TCB 및 36F2 TCB의 결합을 나타낸다.
도 36a 내지 36c는 항온처리 24 시간 및 48 시간 후 중간 FolR1 결합제(6E10 TCB, 14B1 TCB 및 9C7 TCB), 16D5 TCB 및 36F2 TCB에 의해 유도된 HeLa(높은 FolR1 발현), SKov-3(중간 FolR1 발현) 및 HT-29(낮은 FolR1 발현) 인간 종양 세포의 T 세포 사멸을 나타낸다. 인간 PBMC는 효과기 세포로서 사용하였다(E:T = 10:1).
도 37a 내지 37c는 항온처리 24 시간 및 48 시간 후 친화성 감소된 16D5 변이체(16D5-G49S/S93A TCB, 16D5-G49S/K53A TCB, 16D5 W96Y TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB), 16D5 TCB 및 36F2 TCB에 의해 유도된HeLa(높은 FolR1 발현), SKov-3(중간 FolR1 발현) 및 HT-29(낮은 FolR1 발현) 인간 종양 세포의 T 세포 사멸을 나타낸다. 인간 PBMC는 효과기 세포로서 사용하였다(E:T = 10:1).
도 38a 내지 38c는 친화성 감소된 16D5 변이체(16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB), 16D5 TCB, 36F2 TCB에 의해 유도된 망막 색소 상피 및 신장 피질 상피로부터 1차 인간 세포의 T 세포 사멸을 나타내고, 중간 FolR1 결합제 14B1 TCB를 항온처리 24 시간 및 48 시간 후 평가하였다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC). HT-29 세포(낮은 FolR1발현)는 대조군 세포주를 포함하고 DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군으로서 제공하였다.
도 39a 및 39b는 암컴 NOG 마우스에서 FOLR1 TCB 구축물의 단일 용량 PK를 나타낸다.
도 40a 내지 40g는 HeLa-함유 NOG 마우스에서 인간 PBMC 전달 후 FOLR1 TCB 구축물(16D5, 16D5 G49S/S93A 및 16D5 W96Y/D52E)의 생체내 효능을 나타낸다.
도 41은 파를레투주맙(짙은 녹색, 위에서 두번째) 및 Mov19(회색, 맨 위)가 16D5에서 포획되는 huFolR1에 결합할 수 있음을 나타내고, 16D5 시리즈 결합제는 파를레투주맙 또는 Mov19에 의해 인식되는 것과 별개로 에피토프를 인식함이 입증되었다.
도 2a 내지 2c는 HeLa 세포에 FoLR1 IgG 결합제의 결합을 요약하는 그래프를 도시한다. HeLa 세포에서 발현된 FolR1에 신규하게 생성된 FolR1 결합제의 결합은 유동 세포계측법으로 측정된다. 결합된 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 3a 및 3b는 FolR1에 대한 FolR1 결합제의 특이성을 요약하는 그래프를 도시한다. FolR1 또는 FolR2로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에 FolR1 IgG의 결합은 유동 세포계측법으로 분석하여 FolR2가 아니라 FolR1에 특이적으로 결합하는 클론을 확인하였다. 상기 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 4a 및 4b는 cyFoLR1에 대한 FolR1 결합제의 교차 반응성을 요약하는 그래프를 도시한다. 시노몰구스 FolR1에 대한 FolR1 항체의 교차 반응성은 cyFolR1로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 유동 세포계측법으로 입증하였다. 상기 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 5는 결합 후 FolR1 TCB의 내재화를 예시하는 그래프를 도시한다. FolR1에 결합 후 2개의 FolR1 TCB의 내재화는 HeLa 세포에서 시험하였다. 표면에 남아있는 FolR1 TCB는 37℃에서 항온처리의 나타난 시점 후 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다. 내재화율(%)을 계산하였다.
도 6a 내지 6e는 상이한 FolR1 발현 수준을 갖는 세포에 FolR1 IgG의 결합을 요약하는 그래프를 도시한다. 상이한 FolR1 발현 수준을 갖는 종양 세포에 9D11, 16D5 및 Mov19 IgG의 결합은 유동 세포계측법으로 분석하였다. DP47 IgG는 이소타입(isotype) 대조군으로서 포함되고 MKN-45는 FolR1 음성 세포주로서 포함되었다. 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 7a 내지 7f는 HT-29 및 SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸을 요약하는 그래프를 도시한다. FolR1 TCB를 사용하여 HT-29 및 SKOV3 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸 및 사멸시 T 세포에서 활성화 마커의 상향조절을 시험하였다. (A 내지 D) 9D11 FolR1 TCB 및 16D5 FolR1 TCB의 존재 하에 HT-29 및 SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸은 24 시간 및 48 시간 후 LDH 방출에 의해 측정하였다. DP47 TCB는 음성 대조군으로서 포함되었다. 48 시간 항온처리 후, SKOV3(E 내지 H) 또는 HT-29(I 내지 L) 종양 세포의 사멸시 CD8 T 세포 및 CD4 T 세포에서 활성화 마커 CD25 및 CD69의 상향조절은 유동 세포계측법으로 측정하였다.
도 8은 적혈구에 결합하는 항-FolR1의 부재를 나타내는 그래프를 도시한다. 적혈구는 CD235a 양성 집단으로서 게이팅하고 이 집단에 9D11 IgG, 16D5 IgG, Mov19 IgG 및 DP47 IgG의 결합은 유동 세포계측법으로 측정하였다. 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하였다.
도 9는 전혈에서 활성화 마커 상향조절을 요약하는 그래프를 도시한다(A 내지 D). 9D11 FolR1 TCB, 16D5 FolR1 TCB, Mov19 FolR1 TCB 및 DP47 TCB의 첨가 24 시간 후 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 CD25 및 CD69 활성화 마커 상향조절은 유동 세포계측법으로 분석하였다.
도 10은 HeLa 세포에 9D11 TCB a-글리코 변이체의 결합을 도시한다. HeLa 세포에 9D11 FolR1 TCB a-글리코 변이체의 결합은 HeLa 세포에 원래 9D11 TCB의 결합에 비교하였다. 항체는 형광으로 표지된 항-인간 2차 항체로 검출하고 결합은 유동 세포계측법으로 측정하였다.
도 11a 내지 11c는 종양 세포의 9D11 FolR1 TCB a-글리코 변이체로 인한 T 세포 매개된 사멸을 요약하는 그래프를 도시한다. 9D11 FolR1 TCB a-글리코 변이체를 사용하여 원래의 9D11 FolR1 TCB와의 사멸과 비교하여 (도 11a 및 11b) SKOV3, MKN-45(FolR1 음성 대조군으로서) 및 (도 11c) HT-29 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 시험하였다. 판독된 바와 같이 24 시간 및 48 시간 후 LDH 방출을 사용하였다.
도 12a 내지 12l은 1차 상피 세포의 T 세포 매개된 사멸을 요약하는 그래프를 도시한다. 매우 낮은 수준의 FolR1을 갖는 1차 상피 세포를 사용하여 16D5 FolR1 TCB 및 9D11 FolR1 TCB로의 T 세포 매개된 사멸을 시험하고, DP47 TCB는 음성 대조군으로서 포함되고 HT29 세포는 양성 대조군으로서 포함되었다. (도 12a 내지 12h) 인간 망막 색소(HRP), 인간 신장 피질(HRC), 인간 기관지(HB), 및 HT29 세포의 LDH 방출은 24 시간 및 48 시간 후 측정하였다. HRP(도 12i), HRC(도 12j), HB(도 12k) 및 HT29(도 12l)의 사멸시 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD25 및 CD69 활성화 마커 상향조절을 48 시간 후 유동 세포계측법에 의해 측정하였다.
도 13a 내지 13c는 16D5를 갖는 상이한 TCB 포맷의 비교를 나타낸다. FolR1 결합제 16D5를 함유하는 4개의 상이한 TCB 포맷은 HeLa 세포에 대한 결합(도 13a), 24 시간 및 48 시간 후 SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸(도 13b), 및 사멸 48 시간 후 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD25 및 CD69 활성화 마커 상향조절(도 13c)에서 비교하였다.
도 14a 내지 14c는 9D11을 갖는 상이한 TCB 포맷의 비교를 도시한다. FolR1 결합제 9D11을 함유하는 3개의 상이한 TCB 포맷을 (a) HeLa 세포에 대한 결합, (b) 24 시간 및 48 시간 후 SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸, 및 (c) 사멸 48 시간 후 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD25 및 CD69 활성화 마커 상향조절에서 비교하였다.
도 15는 3가지 상이한 용량에 대하여 NOG 마우스에서 FOLR1 TCB의 PK 프로필을 도시한다.
도 16은 FOLR1 TCB로 효능 연구를 하는 실험 프로토콜을 예시한다.
도 17a 및 17b는 종양 성장 곡선을 도시한다. (도 17a) 상이한 처리 군에서 종양 부피의 평균값 및 SEM. (도 17b) 모든 처리 군에서 단일 마우스의 종양 성장. TGI(종양 성장 억제)는 비히클 군과 비교하여 평균 종양 부피의 %로 제공된다.
도 18은 연구 종결시에 종양 중량을 나타낸다.
도 19a 및 19b는 연구 32일에 T 세포를 침윤하는 종양의 FACS 분석을 나타낸다. (도 19a) 종양 단세포 현탁액을 항-인간 CD3/CD4/CD8로 염색하고 유동 세포계측법으로 분석하다. (도 19b) T 세포의 평균값 및 SEM을 상이한 처리 군에서 종양 조직 1 mg당 카운트하였다.
도 20a 및 20b는 연구 32일에 T 세포 활성화/탈과립 및 사이토카인 분비에 대한 FACS 분석을 나타낸다. T 세포를 침윤하는 CD4+(도 20a) 및 CD8+(도 20b) 종양을 사이토카인, 활성화 및 탈과립 마커로 염색하였다. 상이한 처리 군에서 종양 조직 1 mg당 T 세포 카운트의 평균값 및 SEM을 나타내었다.
도 21은 종양 용해율(%)을 나타낸다(A 및 B). SKOV3 세포를 κγFolR1 TCB 또는 DP47 TCB의 존재하에 PBMC와 함께 항온처리하였다. 24 시간(A) 및 48 시간(B) 후 종양 세포의 사멸은 LDH 방출을 측정하여 결정하였다.
도 22는 CD4 T 세포에서 CD25 및 CD69 상향조절을 나타낸다(A 내지 D). SKOV3 세포를 κγFolR1 TCB 또는 DP47 TCB의 존재하에 PBMC와 함께 항온처리하였다. 48 시간 후 CD4 T 세포(A 및 B) 및 CD8 T 세포(C 및 D)에서 CD25 및 CD69 상향조절은 유동 세포계측법으로 측정하였다.
도 23은 종양 용해율을 나타낸다(A 및 B). SKov-3 세포(중간 FolR1)의 T 세포 사멸은 항온처리 24 시간(A) 및 48 시간(B) 후 36F2 TCB, Mov19 TCB 및 21A5 TCB에 의해 유도된다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC).
도 24는 36F2 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB 1+1 고전적 및 HeLa의 16D5 TCB HT(높은 FolR1)(A), Skov-3(중간 FolR1)(B) 및 HT-29(낮은 FolR1)(C) 인간 종양 세포(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 24 시간 항온처리)에 의해 유도된 T 세포 사멸을 도시한다. DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군을 포함하였다.
도 25a 내지 25c는 인간 CD8+(도 25a 및 25b) 및 CD4+(도 25c)에서 CD25 및 CD69의 상향조절을 나타내고, HeLa 세포(높은 FolR1)(도 25a), SKov-3 세포(중간 FolR1)(도 25b) 및 HT-29 세포(낮은 FolR1)(도 25c)의 T 세포 매개된 사멸 후 T 세포(E:T = 10:1, 48 시간 항온처리)는 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 DP47 TCB(결합하지 않는 대조군)에 의해 유도된다.
도 26은 24 시간(A, C 및 E)및 48 시간(B, D 및 F)의 항온처리(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC) 후 인간 신장 피질 상피 세포(A 및 B), 인간 망막 색소 상피 세포(C 및 D) 및 HT-29 세포(E 및 F) 세포의 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 DP47 TCB에 의해 유도된 T 세포 사멸을 나타낸다.
도 27은 다양한 정상 세포주 및 암 세포주에서 FolR1 결합 부위의 정량화를 요약하는 표를 도시한다.
도 28은 주르카트 세포에서 발현된 인간 CD3에 대한 16D5 TCB 및 이의 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A 및 16D5 TCB S100aA(A), 및 9D11 TCB 및 이의 탈아미드화 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aAB(B)의 결합을 나타낸다.
도 29는 16D5 TCB 및 이의 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A 및 16D5 TCB S100aA(A), 및 9D11 TCB 및 이의 탈아미드화 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aA(B)에 의해 유도된 SKov-3(중간 FolR1) 인간 종양 세포의 T 세포 사멸을 나타낸다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 항온처리 시간 24 시간). DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군으로서 포함하였다.
도 30은 16D5 TCB 및 이의 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A 및 16D5 TCB S100aA(A), 및 9D11 TCB 및 이의 탈아미드화 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aA(B)에 의해 유도된 HT-29(낮은 FolR1) 인간 종양 세포의 T 세포 사멸을 나타낸다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 항온처리 시간 24 시간). DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군으로서 포함하였다.
도 31a 내지 31c는 평균 형광 강도 및 종양 세포 용해를 나타낸다.
도 32a 내지 32e는 HeLa 세포에서 발현된 인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 16D5 HC/LC 변이체의 결합을 나타낸다.
도 33은 HeLa 세포에서 인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 2개의 16D5 친화성 감소된 변이체 16D5 W96Y/D52E TCB 및 16D5 G49S/S93A TCB의 결합을 나타낸다.
도 34a 내지 34e는 HT-29 세포에서 발현된 인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 16D5 HC/LC 변이체의 결합을 나타낸다.
도 35는 인간 또는 마우스 FolR1 또는 FolR2를 발현하는 HEK293T 세포에 대한 중간 FolR1 결합제(6E10 TCB, 14B1 TCB 및 9C7 TCB), 16D5 TCB 및 36F2 TCB의 결합을 나타낸다.
도 36a 내지 36c는 항온처리 24 시간 및 48 시간 후 중간 FolR1 결합제(6E10 TCB, 14B1 TCB 및 9C7 TCB), 16D5 TCB 및 36F2 TCB에 의해 유도된 HeLa(높은 FolR1 발현), SKov-3(중간 FolR1 발현) 및 HT-29(낮은 FolR1 발현) 인간 종양 세포의 T 세포 사멸을 나타낸다. 인간 PBMC는 효과기 세포로서 사용하였다(E:T = 10:1).
도 37a 내지 37c는 항온처리 24 시간 및 48 시간 후 친화성 감소된 16D5 변이체(16D5-G49S/S93A TCB, 16D5-G49S/K53A TCB, 16D5 W96Y TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB), 16D5 TCB 및 36F2 TCB에 의해 유도된HeLa(높은 FolR1 발현), SKov-3(중간 FolR1 발현) 및 HT-29(낮은 FolR1 발현) 인간 종양 세포의 T 세포 사멸을 나타낸다. 인간 PBMC는 효과기 세포로서 사용하였다(E:T = 10:1).
도 38a 내지 38c는 친화성 감소된 16D5 변이체(16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB), 16D5 TCB, 36F2 TCB에 의해 유도된 망막 색소 상피 및 신장 피질 상피로부터 1차 인간 세포의 T 세포 사멸을 나타내고, 중간 FolR1 결합제 14B1 TCB를 항온처리 24 시간 및 48 시간 후 평가하였다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC). HT-29 세포(낮은 FolR1발현)는 대조군 세포주를 포함하고 DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군으로서 제공하였다.
도 39a 및 39b는 암컴 NOG 마우스에서 FOLR1 TCB 구축물의 단일 용량 PK를 나타낸다.
도 40a 내지 40g는 HeLa-함유 NOG 마우스에서 인간 PBMC 전달 후 FOLR1 TCB 구축물(16D5, 16D5 G49S/S93A 및 16D5 W96Y/D52E)의 생체내 효능을 나타낸다.
도 41은 파를레투주맙(짙은 녹색, 위에서 두번째) 및 Mov19(회색, 맨 위)가 16D5에서 포획되는 huFolR1에 결합할 수 있음을 나타내고, 16D5 시리즈 결합제는 파를레투주맙 또는 Mov19에 의해 인식되는 것과 별개로 에피토프를 인식함이 입증되었다.
정의
용어는 하기 달리 정의되지 않는 한, 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 사용된다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 분자" 광범위한 의미에서 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 이의 유도체, 예를 들면, 단편이다.
용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 별도의 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 이들 각각은 상이한 항원 결정기에 특이적이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정기, 특히 2개의 별도의 세포에서 발현되는 2개의 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "원자가(valent)"는 항원 결합 분자에서 명시된 수의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다. 상기와 같이, 용어 "항원에 대한 1가 결합"은 항원 결합 분자에서 항원에 대하여 특이적인 1개의(1개를 초과하지 않는) 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"항원 결합 부위"는 항원과 상호작용하는 항원 결합 분자의 부위, 즉, 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본래의 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 표적 부위, 예를 들면 특이적 유형의 종양 세포 또는 항원 결정기를 보유하는 종양 기질에 부착되는(예를 들면, 제 2 항원 결합 모이어티) 독립체를 유도할 수 있다. 또 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 이의 표적 항원, 예를 들면 T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 항원 결합 모이어티는 본원에 추가로 정의된 바와 같이 항체 및 이의 단편을 포함한다. 특정한 항원 결합 모이어티는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 본원에 추가로 정의되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5개의 이소타입(α, δ, ε, γ 또는 μ) 중 임의의 것을 포함한다. 유용한 경쇄 불변 영역은 2개의 이소타입(κ 및 λ) 중 임의의 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결정기"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 항원 결합 모이어티를 결합하는 폴리펩티드 매크로분자에서의 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 부위(예를 들면, 아미노산의 인접한 거리 또는 비-인접한 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 구조 배열)를 지칭한다. 유용한 항원 결정기는 예를 들면, 종양 세포의 표면에서, 바이러스 감염된 세포의 표면에서, 다른 질환 세포의 표면에서, 면역 세포의 표면에서, 혈청에서 자유롭게, 및/또는 세포외 기질(ECM)에서 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로서 지칭된 단백질, 예를 들면, FolR1 및 CD3은 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터 단백질의 임의의 본래의 형태일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특이적 단백질로 제조됨을 언급하는 경우, 상기 용어는 "전장" 미가공된 단백질 및 세포에서 가공하여 발생하는 임의의 형태의 단백질을 포괄한다. 또한, 상기 용어는 단백질의 자연 발생하는 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 항원으로서 유용한 예시적인 인간 단백질은 비제한적으로, FolR1(엽산 수용체 알파(FRA); 엽산 결합 단백질(FBP); 인간 FolR1 유니프롯 번호 P15328; 뮤린 FolR1 유니프롯 번호 P35846; 시노몰구스 FolR1 유니프롯 번호 G7PR14) 및 CD3, 특히 CD3의 ε 하위단위(인간 서열의 경우 유니프롯 번호 P07766(버전 130), NCBI 기준 서열번호 NP_000724.1, 서열번호 150; 또는 시노몰구스[마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)] 서열의 경우 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 진뱅크 번호 BAB71849.1 참조)를 포함한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3 또는 상이한 종으로부터 표적 항원 중에서 보존되는 CD3의 에피토프 또는 표적 세포 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3 및 FolR1에 결합하지만, FolR2(엽산 수용체 베타; FRB; 인간 FolR2 유니프롯 번호: P14207) 또는 FolR3(엽산 수용체 감마; 인간 FolR3 유니프롯 번호: P41439)에 결합하지 않는다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대하여 선택적이고 원치않은 또는 비-특이적 상호작용으로부터 구별될 수 있음을 의미한다. 특이적 항원 결정기에 결합하는 항원 결합 모이어티의 능력은 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(비아코어(Biacore) 계측기에서 분석됨; 문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329(2000)]), 및 통상의 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)])을 통해 측정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 관련없는 단백질에 대한 항원 결합 모이어티의 결합 정도는 예를 들면, SPR에 의해 측정된 바와 같이 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화성"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 수용체)와 이의 결합 파트너(예를 들면, 리간드) 사이의 비-공유결합 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화성"는 결합 쌍(예를 들면, 항원 결합 모이어티 및 항원, 또는 수용체 및 이의 리간드)의 수 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 지칭한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시될 수 있고, 이는 해리 및 회합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 따라서, 동등한 친화성은 속도 상수의 비가 동일하게 유지되는 동안은 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것을 비롯하여 당해 분야에서 공지된 널리 수립된 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화성을 측정하는 특정한 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
"결합 감소", 예를 들면 Fc 수용체에 대한 결합 감소는 예를 들면 SPR에 의해 측정된 바와 같이 각각의 상호작용에 대한 친화성의 감소를 나타낸다. 명료성을 위해 상기 용어는 또한 0까지(또는 분석적 방법의 검출치 미만까지) 친화성의 감소, 즉, 상호작용의 완전한 파괴를 포함한다. 역으로, "결합 증가"는 각각의 상호작용을 위해 결합 친화성의 증가를 나타낸다.
본원에 사용된 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 나타낸다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재된 분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면 종양의 세포, 예컨대 암 세포 또는 종양 기질의 세포의 표면에 제시된 항원 결정기를 나타낸다. 특히 "표적 세포 항원"은 엽산 수용체 1을 나타낸다.
항원 결합 모이어티 등과 관련하여 본원에 사용된 용어 "제 1" 및 "제 2"는 모이어티의 각각의 유형이 1개 초과로 존재할 때 구별하기 편리하게 사용된다. 이러한 용어의 사용은 달리 그렇게 언급지 않는 한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정한 순서 또는 배향을 부여하는 것이 아니다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인("Fab 중쇄") 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 구성된 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "동일한 VLCL 경쇄를 갖는 Fab 분자"는 1개의 경쇄를 공유하지만 여전히 별도의 특이성을 갖는, 예를 들면, CD3 또는 FolR1에 결합할 수 있는 결합제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 분자는 2개 이상의 동일한 VLCL 경쇄를 갖는 Fab 분자를 포함한다. 상응하는 중쇄는 리모델링되고 이중특이적 T 세포 활성화 항원 CD3 및 표적 세포 항원 FolR1에 각각 특이적 결합을 부여한다.
"융합된"은 성분(예를 들면, Fab 분자 및 Fc 도메인 하위단위)이 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 연결기를 통해 펩티드 결합에 의해 연결되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단일-쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티 중 1개는 단일-쇄 Fab 분자, 즉, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 연결기에 의해 연결되어 단일 펩티드 쇄를 형성하는 Fab 분자이다. 특정한 상기 실시양태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일-쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결된다.
"교차" Fab 분자("교차Fab"로도 언급됨)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, 즉, 교차Fab 분자가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 쇄 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 쇄를 포함하는 Fab 분자를 의미한다. 명료성을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교차된 교차Fab 분자에서, 중쇄 불변 영역을 포함하는 펩티드 쇄는 교차Fab 분자의 "중쇄"로서 본원에서 지칭된다. 역으로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교차된 교차Fab 분자에서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드 쇄는 교차Fab 분자의 "중쇄"로서 본원에서 지칭된다. 1개의 이상 교차Fab를 포함하는 항체는 "교차Mab"로서 본원에서 지칭된다.
이와 대조적으로, "공통" Fab 분자는 이의 천연 포맷에서, 즉, 중쇄 가변 및 불변 영역(VH-CH1)으로 구성된 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 영역(VL-CL)으로 구성된 경쇄를 포함하는 Fab 분자를 의미한다.
용어 "면역글로불린 분자"는 자연 발생하는 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 클래스의 면역글로불린은 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 1.5 x 105 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH), 이어서 중쇄 불변 영역이라고도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL), 이어서 경쇄 불변 영역이라고도 불리는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)라 불리는 5개 유형 중 1개로 할당될 수 있고, 이들 중 일부는 하위유형, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)라 불리는 2개의 유형 중 1개에 할당될 수 있다. 면역글로불린은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자 및 1개의 Fc 도메인으로 본질적으로 이루어진다.
본원에서 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되고 항체가 목적한 항원 결합 활성을 나타내는한 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체 및 항체 단편을 비롯한 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로, Fv, Fab, Fab,, Fab,-SH, F(ab')2, 다이아바디(diabody), 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자(예를 들면, scFv), 및 단일-도메인 항체를 포함한다. 특정한 항체 단편에 대한 검토를 위해, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134(2003)]을 참조한다. scFv 단편에 대한 검토를 위해, 예를 들면, 문헌[Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)]; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 5,571,894 호 및 제 5,587,458 호를 참조한다. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의를 위해, 미국 특허 5,869,046 호를 참조한다. 다이아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134(2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448(1993)]을 참조한다. 트라이아바디(Triabody) 및 테트라바디(tetrabody)는 또한 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134(2003)]에 기재되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체[도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월섬 소재; 예를 들면, 미국 특허 6,248,516 B1 호 참조]이다. 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 비제한적으로 온전한 항체의 단백질분해 소화 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 생성을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다
용어 "항원 결합 도메인"은 특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 항체의 부분을 지칭하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적이다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합하는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 본래의 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함하는 각각의 도메인과 함께 유사한 구조를 갖는다. 예를 들면, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는"HVR"은 구조적으로 정의된 루프 서열 및/또는 형태에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다("초가변 루프"). 일반적으로, 본래의 4-쇄 항체는 6개의 HVR[VH에서 3개(H1, H2, H3), 및 VL에서 3개(L1, L2, L3)]을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 최대 서열 가변성이 있고/있거나 항원 인식에 수반된다. VH에서 CDR1은 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역(HVR)은 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 지칭되고, 이러한 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분과 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 특정한 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequencing of Proteins of Immunological Interest(1983)] 및 [Chotia et al., J Mol Biol 196:901-917(1987)]에 기재되어 있고, 여기서 정의는 서로에 대하여 비교될 때 아미노산 잔기의 중접 또는 하위부분을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하는 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 용어의 범주 내에서 의도된다. 상기 인용된 각각의 문헌에 의해 정의된 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기 표 A에 제시된다. 특정한 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 수는 서열 및 CDR의 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 제공된 특정한 CDR을 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있다.
[표 A]
CDR 정의1
또한, 카밧 등은 임의의 항체에 적용가능한 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 임의의 가변 영역 서열에 "카밧 넘버링"의 이 시스템을 분명하게 할당할 수 있다. 본원에 사용된 "카밧 넘버링"은 문헌[Kabat et al, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequencing of Proteins of Immunological Interest"(1983)]에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역에서 특정한 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 카밧 넘버링 시스템에 따른다.
서열 목록의 폴리펩티드 서열은 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링되지 않는다. 그러나, 서열 목록의 서열의 넘버링을 카밧 넘버링으로 전환하는 것은 당업자의 공통 기술 내에 속한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외에 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 서열로 나타낸다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
항체 또는 면역글로불린의 "클래스"는 이의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 클래스(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)가 존재하고, 이들 중 일부는 이소타입(isotype), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 사응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 본래의 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 달라질 수 있을지라도, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 확장되어 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재할 수 없다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al, Sequencing of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이, EU 지수라고도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 사용된 Fc 도메인의 "하위단위"는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 1개, 즉, 안정된 자가-회합을 할 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 하위단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제 1 및 제 2 하위단위의 회합을 촉진하는 변형"은 펩티드 골격의 조작 또는 호모다이머를 형성하는 Fc 도메인 하위단위를 포함하는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드의 회합을 감소시키거나 방지하는 Fc 도메인 하위단위의 번역-후 변형이다. 본원에 사용된 회합을 촉진하는 변형은 특히 결합하기 위해 목적한 2개의 Fc 도메인 하위단위 각각(즉, Fc 도메인의 제 1 및 제 2 하위단위)로 만들어진 별도의 변형을 포함하고, 상기 변형은 2개의 Fc 도메인 하위단위의 회합을 촉진하기 위해 서로 상보적이다. 예를 들면, 회합을 촉진하는 변형은 이들의 회합을 각각 입체 구조적으로 또는 정전기적으로 호의적으로 만들기 위해 Fc 도메인 하위단위 중 1개 또는 2개의 구조 또는 전하를 변경시킬 수 있다. 따라서, (헤테로)이량체화는 제 1 Fc 도메인 하위단위를 포함하는 폴리펩티드와 제 2 Fc 도메인 하위단위를 포함하는 폴리펩티드 사이에 발생하고, 이는 각각의 하위단위(예를 들면, 항원 결합 모이어티)에 융합된 추가의 성분이 동일하지 않다는 의미와 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 회합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 회합을 촉진하는 변형은 별도의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 Fc 도메인의 2개의 하위 단위 각각에서 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "효과기 기능"은 항체 이소타입으로 달라지는 항체의 Fc 영역에 기인하는 그러한 생물학적 활성를 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "조작하다, 조작된, 조작하는"은 자연 발생하거나 재조합된 폴리펩티드 또는 이의 단편의 전사 후 변형 또는 펩티드 골격의 임의의 조작을 포함하는 것으로 간주된다. "조작하는"은 아미노산 서열의 변형, 당화 패턴의 변형, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형, 뿐만 아니라 이러한 접근법의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄함을 의미한다. 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합은 최종 구축물이 목적한 특징, 예를 들면, Fc 수용체에 대한 결합 감소, 또는 또 다른 펩티드와의 회합 증가를 보유하는 경우, 최종 구축물에 이르도록 만들어질 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면, 변경을 위해, Fc 영역의 결합 특징, 비-보존적 아미노산 치환, 즉, 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 자연적으로 발생하지 않은 아미노산에 의한 또는 20개 표준 아미노산(예를 들면, 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시리신)의 자연 발생하는 아미노산 유도체에 의한 치환을 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정된 돌연변이생성, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전적 조작 이외의 방법, 예컨대 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법이 또한 유용할 수 있음이 간주된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 나타내기 위해 본원에서 다양한 명칭이 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인의 위치 329에서 프롤린으로부터 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly으로서 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄를 지칭하고, 생성물의 특정한 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄를 지칭하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이러한 용어 대신에 또는 임의의 이러한 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 비제한적으로 공지된 보호기/차단기에 의한 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 자연적으로 발생하지 않은 아미노산에 의한 변형을 비롯한 폴리펩티드의 발현 후 변형 생성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유도되거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 나타낸 핵산 서열로부터 번역될 필요는 없다. 이는 화학적 합성을 비롯한 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 약 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1000 이상, 또는 2000 이상 크기의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 한정된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 상기 구조를 가질 필요를 없다. 확정된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 접힌 상태이지만, 확정된 3차원 구조를 갖지 않지만, 오히려 다수의 상이한 형태를 채택할 수 있는 폴리펩티드는 풀린 상태이다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 변이체, 또는 이의 유도체는 이의 자연적 환경에서 존재하지 않는 폴리펩티드를 의도한다. 특정한 수준의 정제를 필요로 하지 않는다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 이의 본래의 또는 천연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리된, 분별된, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 본래의 또는 재조합 폴리펩티드로서 존재한다.
기준 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 필요한 경우 서열을 정렬하고 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성에 도달하고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 기준 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들면, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메갈라인(Megalign)[디엔에이스타(DNASTAR)] 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하는 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 얼라인-2를 사용하여 생성된다. 얼라인-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc)에 의해 창시되었고, 공급 코드는 미국 저작권 협회(U.S. Copyright Office; 미국 워싱턴 D.C., 20559 소재)에서 사용자 문서로 제출되었다(이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록됨). 얼라인-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)로부터 공개적으로 이용가능하거나, 공급 코드로부터 편집될 수 있다. 얼라인-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 작동 시스템에서 사용하기 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 얼라인-2 프로그램에 의해 설정되고 달라지지 않는다. 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 제공된 아미노산 서열 B에, 제공된 아미노산 서열 B와, 또는 제공된 아미노산 서열 B에 대하여 제공된 아미노산 서열 A의 퍼센트 아미노산 서열 동일성(이는 대안적으로 제공된 아미노산 서열 B에, 제공된 아미노산 B와, 또는 제공된 아미노산 B에 대하여 특정한 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 제공된 아미노산 서열로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 x X/Y 분율
상기 식에서, X는 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 얼라인-2에 의해 동일하게 일치하는 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않고, B에 대한 A의 퍼센트 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 퍼센트 아미노산 서열 동일성과 같지 않음이 이해될 것이다. 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 모든 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값은 얼라인-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전 문단에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스-유래 RNA, 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 공통 포스포다이에스터 결합 또는 비-공통 결합(예를 들면, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견된 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의도하고, 이는 본래의 환경으로부터 제거되었다. 예를 들면, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리되는 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예는 이종 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체 외로 또는 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에서 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체, 뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 상기 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들면, 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에 의해, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은, 폴리뉴클레오티드 서열이 기분 뉴클레오티드의 100개 뉴클레오티드당 5개 이상의 점 돌연변이를 포함할 수 있음을 제외하고 기준 서열과 동일한 것으로 의도된다. 다시 말해서, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열에서 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 기준 서열에서 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오티드는 기준서열로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 변경은 기준 뉴클레오티드 서열의 5, 또는 3, 말단 위치에서, 또는 기준 서열 내에서 하나 이상의 연속 기에서 또는 기준 서열의 잔기 중에 개별적으로 배치된 상기 말단 위치 어디서든 발생할 수 있다. 현실적으로, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지는 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 폴리펩티드에 대하여 전술된 것(예를 들면, 얼라인-2)을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정한 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소로, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스 또는, 핵산 단편으로 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 서열 중에서, 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구축물"과 동의어이고, 표적 세포에서 작동적으로 결합하는 특이적 유전자의 발현을 유도하고 도입하기 위해 사용된 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 도입된 숙주 세포의 게놈으로 혼입된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 많은 양의 안정한 mRNA의 전사를 허용한다. 발현 벡터가 표적 세포 내에 존재하면, 유전자에 의해 암호화된 리보핵산 분자 또는 단백질은 세포 전사 및/또는 번역 기작에 의해 생성된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양"은 상호교환적으로 사용되고, 상기 세포의 자손을 비롯한 도입된 외인성 핵산에 대한 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질 전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대의 수에 상관없이 이들로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포에 대한 핵산 함량이 완전히 동일할 수 없지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하기 위해 사용될 수 있는 세포계의 임의의 유형이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 몇 개만 말하면, 포유동물 배양된 세포, 예컨대 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포, 뿐만 아니라 유전자변형 동물, 유전자변형 식물, 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 이후 결합이 수용체-함유 세포를 자극하여 효과기 기능을 수행하도록 신호전달 사건을 유발하는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체-의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의해 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 유도하는 면역 기전이다. 표적 세포는 일반적으로 N-말단인 단백질 부분을 통해 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체에 대한 세포이다. 본원에 사용된 용어 "감소된 ADCC"는 주어진 시간에, 표적 세포를 둘러싸는 배지 중에 항체의 주어진 농도에서, 상기 정의된 ADCC의 기전에 의해 용해되는 표적 세포의 수의 감소, 및/또는 주어진 시간에, ADCC의 기전에 의해 표적 세포의 주어진 수의 용해를 달성하기 위해 요구된, 표적 세포를 둘러싸는 배지 중에 항체의 농도의 증가로서 정의된다. ADCC의 감소는 동일한 표준 생성, 정제, 제형화 및 저장 방법(이는 당업자에게 공지되어 있음)을 사용하여, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC와 관련되지만, 조작되지 않았다. 예를 들면, 이의 FC 도메인에서 ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC에서 감소는 Fc 도메인에서 이 아미노산 치환없이 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC와 관련된다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831 참조).
약제의 "효과량"은 투여된 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기할 필요가 있는 양을 지칭한다.
약제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 목적한 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 치료 기간 동안 및 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다. 약제의 치료 효과량은 예를 들면, 질병의 역효과를 제거하거나 감소시키거나 지연시키거나 최소화하거나 예방한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로, 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특히, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "약학 조성물"은 효과적으로 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 허용하는 그러한 형태의 제제를 지칭하고, 제형이 투여될 수 있는 대상체에 허용되지 않는 독성이 있는 추가의 성분은 함유하지 않는다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외에 대상체에게 무독성인 약학 조성물의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로, 완충액, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함한다.
본원에 사용된 "치료"(및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질병의 자연스러운 과정을 변경하는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발을 예방, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접적 또는 간접적 병리적 결과의 약화, 전이 예방, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 및 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 질병의 발달을 지연시키기 위해 또는 질병의 진행을 느리게 하기 위해 사용된다.
용어 "길항제"는 넓은 의미로 사용되고, 본원에 개시된 본래의 폴리펩티드의 생물학적 활성를 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 유사한 방식에서, 용어 "작용제"는 넓은 의미로 사용되고, 본원에 개시된 본래의 폴리펩티드의 생물학적 활성를 유도하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 작용제 또는 길항제 분자는 구체적으로 조작된 항체 단편, 본래의 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유기 소분자 등을 비롯한 작용제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제를 확인하는 방법은 폴리펩티드를 후보 작용제 또는 길항제 분자와 접촉하는 단계 및 상기 폴리펩티드와 정상적으로 결합된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 생성물의 상업적인 포장에 통상적으로 포함된 설명서를 지칭하기 위해 사용되고, 상기 치료적 생성물의 사용에 관한 징후, 용법, 용량, 투여, 조합 요법, 사용 금지 이유 및/또는 경고에 관한 정보를 함유한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 공개공보, 특허 및 특허 출원은 이들의 전체가 참조로서 본원에 혼입된다.
실시양태의 상세한 설명
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 이중특이적이고, 즉, 2개의 별도의 항원 결정기, 즉, CD3 및 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 본 발명에 따라, 항원 결합 모이어티는 Fab 분자(즉, 가변 및 불변 영역을 각각 포함하는, 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간이다. 또 하나의 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간화된다. 추가의 또 하나의 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 FolR1 및 CD3에 동시 결합할 수 있다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 FolR1 및 CD3에 동시 결합함으로써 T 세포 및 FolR1 발현 표적 세포를 교차결합할 수 있다. 더욱더 특정한 실시양태에서, 상기 동시 결합은 FolR1 발현 표적 세포, 특히 FolR1 발현 종양 세포의 용해를 야기한다. 하나의 실시양태에서, 상기 동시 결합은 T 세포의 활성화를 야기한다. 또 하나의 실시양태에서, 상기 동시 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현으로 이루어진 군으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 야기한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 표적 세포 항원 FolR1에 동시 결합하지 않고 CD3에 결합하는 것은 T 세포 활성화를 야기하지 않는다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 FolR1 발현 표적 세포에 T 세포의 세포독성 활성을 재유도할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 재-유도는 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성에 독립적이다.
특히, 본 발명의 실시양태 중 일부에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다(또한, 본원에서 "CD3 항원 결합 모이어티" 또는 "제 1 항원 결합 모이어티"로 지칭됨). 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 1개 이하의 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3에 1가 결합을 제공한다. 특정한 실시양태에서, CD3은 인간 CD3 또는 시노몰구스 CD3, 가장 특히 인간 CD3이다. 특정한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 인간 및 시노몰구스 CD3에 대하여 교차반응성이 있다(즉, 특이적으로 결합된다). 일부 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3의 ε 하위단위에 특이적으로 결합할 수 있다(인간 서열에 대하여 유니프롯 번호 P07766(버전 130), NCBI 기준 서열번호 NP_000724.1, 서열번호 150; 시노몰구스[마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)] 서열에 대하여 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 젠뱅크 번호 BAB71849.1 참조).
일부 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 36에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 31에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 FolR1에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다(또한 "FolR1 결합 모이어티", 또는 "제 2" 또는 "제 3" 항원 결합 모이어티로 지칭됨). 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원 FolR1에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 FolR2 또는 FolR3에 결합하지 않는다. 특정한 실시양태에서, FolR1 항원 결합 모이어티는 인간 및 시노몰구스 FolR1에 대하여 교차반응성이 있다(즉, 특이적으로 결합된다). 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 FolR1에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 특정한 상기 실시양태에서, 각각의 이러한 항원 결합 모이어티는 동일한 항원 결정기에 특이적으로 결합한다. 더욱더 특정한 실시양태에서, 모든 이러한 항원 결합 모이어티는 동일하다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 FolR1에 결합할 수 있는 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
FolR1 결합 모이어티는 일반적으로 FolR1에 특이적으로 결합하는 Fab 분자이고, 표적 부위, 예를 들면 FolR1을 발현하는 특이적 유형의 종양 세포에 연결된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 유도할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 추가적으로 (iii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 상기 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 제 2 항원 결합 모이어티와 동일하다.
하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 추가적으로 안정하게 회합할 수 있는 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 융합된다.
하나의 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 융합된다.
추가의 특정한 실시양태에서, 1개 초과의 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재하지 않는다(즉, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3에 1가 결합을 제공한다).
공통
경쇄를
갖는 T 세포 활성화
이중특이적
항원 결합 분자
본 발명자들은 결합 모이어티가 CD3에 대한 모 단일특이적 항체의 특이성 및 효능을 보유하는 공통 경쇄를 공유하고 동일한 경쇄를 사용하여 제 2 항원(예를 들면, FolR1)을 결합할 수 있는 이중특이적 상체를 생성하였다. 모 항체의 결합 특성을 보유하는 공통 경쇄를 갖는 이중특이적 분자의 생성은 2개의 표적에 대한 결합 특이성을 발효시키기 위한 하이브리드 경쇄의 공통 CDR로서 직시하지 않는다. 하나의 양상에서, 본 발명은 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하고, 이들 중 하나는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 다른 하나는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 이때 제 1 및 제 2 Fab 분자는 동일한 VLCL 경쇄를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 상기 동일한 경쇄(VLCL)는 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34의 경쇄 CDR을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 동일한 경쇄(VLCL)는 서열번호 35를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 상기 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하고, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 16의 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 중쇄 CDR2, 서열번호 18의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 16, 서열번호 275 및 서열번호 315로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 16, 서열번호 275 및 서열번호 315의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
추가의 실시양태에서, FolR1에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 15와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 31과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열 또는 작용기를 보유하는 이의 변이체를 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 36과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 15와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 서열번호 31과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 추가적으로 (iii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 (Fab 분자인) 제 3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 상기 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 제 2 항원 결합 모이어티와 동일하다.
이로 인해, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄를 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티; (ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 제 2 항원 결합 모이어티; 및 (iii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 제 3 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 상기 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하고, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 16의 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 중쇄 CDR2, 서열번호 18의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티; 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 결합 모이어티가 동일한 경쇄, 및 T 세포 활성화 항원 CD3 및 표적 세포 항원 FolR1에 각각 특이적 결합을 부여하는 상응하는 리모델링된 중쇄를 갖는 이중 특이적 분자에 관한 것이다. 이 소위 "공통 경쇄" 원칙, 즉, 1개의 경쇄를 공유하지만 여전히 별도의 특이성을 갖는 2개의 결합제의 조합의 사용은, 경쇄 짝짓기오류를 막는다. 따라서, 생성 동안 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 균일한 제조를 용이하게 하는 부산물이 적다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분은 다양한 배열로 서로 융합될 수 있다. 예시적인 배열은 도 1a 내지 1i에 도시되어 있고 추가로 후술된다.
일부 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함한다. Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 예시적인 실시양태가 후술된다.
교차
Fab
단편을 갖는 T 세포 활성화
이중특이적
항원 결합 분자
본 발명자들은 결합 모이어티 중 1개가 교차Fab 단편인 제 2 이중특이적 항체 포맷을 생성하였다. 본 발명의 하나의 양상에서, IgG 분자의 Fab 단편 중 1개가 교차Fab 단편으로 대체된 1가 이중특이적 항체가 제공된다. 교차Fab 단편은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 단편이다. 교차Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체 포맷은 예를 들면, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080251, WO 2009/080254, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에 기재되어 있다. 특정한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환된 교차Fab 분자이다. 상기 변형은 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 짝짓기오류를 막고, 이로 인해 재조합 생성에서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정한 교차Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역은 교환된다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 또 다른 교차Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역은 교환된다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 교차 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) 서열번호 8, 서열번호 56 및 서열번호 57로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 59, 서열번호 60 및 서열번호 65로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 상기 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하고, and the FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 56의 중쇄 CDR2, 서열번호 57의 중쇄 CDR3, 서열번호 59의 경쇄 CDR1, 서열번호 60의 경쇄 CDR2 및 서열번호 65의 경쇄 CDR3을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 교차 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다.
추가의 실시양태에서, FolR1에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 55와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 64와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열 또는 작용기를 보유하는 이의 변이체를 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 36과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 31과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 55와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 서열번호 64와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 추가적으로 (iii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이다.
하나의 상기 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 제 2 항원 결합 모이어티와 동일하다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 교차 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; (ii) 서열번호 8, 서열번호 56 및 서열번호 57로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 59, 서열번호 60 및 서열번호 65로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티; 및 (iii) 서열번호 8, 서열번호 56 및 서열번호 57로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 59, 서열번호 60 및 서열번호 65로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 상기 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하고, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 56의 중쇄 CDR2, 서열번호 57의 중쇄 CDR3, 서열번호 59의 경쇄 CDR1, 서열번호 60의 경쇄 CDR2 및 서열번호 65의 경쇄 CDR3을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 둘 다 공통 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 교차 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; (ii) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티; 및 (iii) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 둘 다 공통 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 교차 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 상기 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하고, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 서열번호 50의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2 및 서열번호 54의 경쇄 CDR3을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 교차 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; 및 (ii) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이다.
추가의 실시양태에서, FolR1에 대하여 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 49의 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 51과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열 또는 작용기를 보유하는 이의 변이체를 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 36과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 31과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 49와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 서열번호 51과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 추가적으로 (iii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이다.
하나의 상기 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티와 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 제 2 항원 결합 모이어티와 동일하다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 교차 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; (ii) 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 49로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티; 및 (iii) 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 50로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 상기 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하고, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 서열번호 50의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2 및 서열번호 54의 경쇄 CDR3을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 둘 다 공통 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 교차 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 1 항원 결합 모이어티; (ii) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 2 항원 결합 모이어티; 및 (iii) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티 및 제 3 항원 결합 모이어티는 둘 다 공통 Fab 분자이다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 2개의 결합 모이어티가 FolR1에 대한 특이적 결합을 부여하고 1개의 결합 모이어티가 T 세포 활성화 항원 CD3에 대한 특이성을 부여하는 이중특이적 분자에 관한 것이다. 상기 중쇄 중 하나는 변형되어 중쇄 및 경쇄의 적절한 짝짓기를 보장하고, 이에 따라 공통 경쇄 접근에 대한 요구를 제거한다. 2개의 FolR1 결합 부위의 존재는 표적 항원 FolR1 및 T 세포의 활성화에 적절하게 개입할 수 있다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분은 다양한 배열에서 서로 융합될 수 있다. 예시적인 배열은 도 1a 내지 1i에 도시되어 있고 추가로 후술된다.
일부 실시양태에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함한다. Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 예시적인 실시양태는 후술된다.
T 세포 활성화
이중특이적
항원 결합 분자 포맷
상기 및 도 1a 내지 1i에 도시된 바와 같이, 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 동일한 경쇄(VLCL)를 갖고 2개의 상이한 항원에 특이성을 부여하는 상이한 중쇄(VHCL)를 갖는 2개 이상의 Fab 단편을 포함하는바, 1개의 Fab 단편은 T 세포 활성화 항원 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고 다른 Fab 단편은 표적 세포 항원 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있다.
또 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 2개 이상의 항원 결합 모이어티(Fab 분자)를 포함하고, 이들 중 1개는 교차Fab 분자이고 다른 1개는 공통 Fab 분자이다. 하나의 상기 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이고, FolR에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 이러한 성분은 다양한 배열에서 서로 융합될 수 있다. 예시적인 배열은 도 1a 내지 1i에 도시되어 있다.
일부 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 각각 융합된다. 특정한 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티, 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 본질적으로 이루어지고, 이때 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 각각 융합된다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티는 둘 다 Fab 단편이고 동일한 경쇄(VLCL)를 갖는다. 또 하나의 상기 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이고, FolR에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 융합되고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티, 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 본질적으로 이루어지고, 이때 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 융합된다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티는 둘 다 Fab 단편이고 동일한 경쇄(VLCL)를 갖는다. 또 하나의 상기 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이고, FolR에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다. 임의적으로, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로 융합될 수 있다.
또 하나의 실시양태에서, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기 실시양태에서, 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티, 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 본질적으로 이루어지고, 이때 제 2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 융합된다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티는 둘 다 Fab 단편이고 동일한 경쇄(VLCL)를 갖는다. 또 하나의 상기 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이고, FolR에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다. 임의적으로, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로 융합될 수 있다.
항원 결합 모이어티는 Fc 도메인에 또는 서로 직접적으로 또는 펩티드 연결기를 통해 융합될 수 있고, 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 펩티드 연결기는 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 적합한, 비-면역원성 펩티드 연결기는 예를 들면, (G4S)n(서열번호 300), (SG4)n(서열번호 301), (G4S)n(서열번호 300) 또는 G4(SG4)n(서열번호 302) 펩티드 연결기를 포함한다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다. 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄를 서로 융합하기에 특히 적합한 펩티드 연결기는 (G4S)2(서열번호 303)이다. 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄를 연결하기에 적합한 예시적인 펩티드 연결기는 EPKSC(D)-(G4S)2(서열번호 304 및 305)이다. 추가적으로, 연결기는 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히, 항원 결합 모이어티가 Fc 도메인 하위단위의 N-말단에 융합되는 경우, 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부를 통해, 추가의 펩티드 연결기의 존재 또는 부재하에 융합될 수 있다.
표적 세포 항원 FolR에 특이적인 2개의 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 표적 세포 항원 FolR에 특이적인 오직 1개의 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 비교하여 뛰어난 특징을 갖는 다는 것이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 FolR에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 하나의 상기 실시양태에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 3 항원 결합 모이어티는 제 2 항원 결합 모이어티와 동일하다(즉, 동일한 아미노산 서열을 포함한다).
하나의 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 융합되고, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티, 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 본질적으로 구성되고, 이때 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 하위단위의 N-말단에 융합되고, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 단편이고 동일한 경쇄(VLCL)를 갖는다. 또 하나의 상기 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이고, FolR에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다. 임의적으로, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제 3 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로 융합될 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티를 형성하는 5개의 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이때 제 1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 FolR1에 결합할 수 있다. 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는, 아미노(N)-말단에서 카복실(C)-말단 방향으로, 제 1 경쇄 가변 도메인(VLD1) 및 제 1 경쇄 불변 도메인(CLD1)을 포함한다. 제 3 폴리펩티드 쇄는, N-말단에서 C-말단 방향으로, 제 2 경쇄 가변 도메인(VLD2) 및 제 2 중쇄 불변 도메인 1(CH1D2)을 포함한다. 제 4 폴리펩티드 쇄는, N-말단에서 C-말단 방향으로, 제 1 중쇄 가변 도메인(VHD1), 제 1 중쇄 불변 도메인 1(CH1D1), 제 1 중쇄 불변 도메인 2(CH2D1) 및 제 1 중쇄 불변 도메인 3(CH3D1)을 포함한다. 제 5 폴리펩티드 쇄는 VHD1, CH1D1, 제 2 중쇄 가변 도메인(VHD2), 제 2 경쇄 불변 도메인(CLD2), 제 2 중쇄 불변 도메인 2(CH2D2) 및 제 2 중쇄 불변 도메인 3(CH3D2)을 포함한다. 제 3 폴리펩티드 쇄 및 제 5 폴리펩티드 쇄의 VHD2 및 CLD2는 CD3에 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티를 형성한다. 제 2 폴리펩티드 쇄 및 제 5 폴리펩티드 쇄의 VHD1 및 CH1D1은 FolR1에 결합할 수 있는 제 3 결합 모이어티를 형성한다. 제 1 폴리펩티드 쇄 및 제 4 폴리펩티드 쇄의 VHD1 및 CH1D1은 FolR1에 결합할 수 있는 제 2 결합 모이어티를 형성한다.
또 하나의 실시양태에서, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 융합되고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티, 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 본질적으로 구성되고, 이때 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 하위단위의 N-말단에 융합되고, 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 3 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 하나의 상기 실시양태에서, 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 단편이고 동일한 경쇄(VLCL)를 포함한다. 또 하나의 상기 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 교차Fab 분자이고, FolR에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 분자이다. 임의적으로, 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제 2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 서로 추가적으로 융합될 수 있다.
항원 결합 모이어티는 직접적으로 또는 펩티드 연결기를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정한 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다.
하나의 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정한 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 더욱더 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 이소타입 면역글로불린이다. 또 하나의 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 이소타입 면역글로불린이다. 추가의 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 또 하나의 실시양태에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화된 면역글로불린이다.
상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정한 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이고, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 이때 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 단편이고 동일한 경쇄(VLCL)를 갖고, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하고; FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정한 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이고, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 이때 제 1, 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 공통 Fab 단편이고 동일한 경쇄(VLCL)를 갖고, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 36의 서열을 포함하는 가변 중쇄, 서열번호 31의 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하고; FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 15의 서열을 포함하는 가변 중쇄, 서열번호 31의 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정한 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이고, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되는 교차Fab 분자이고; FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 8, 서열번호 56 및 서열번호 57로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 59, 서열번호 60 및 서열번호 65로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정한 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이고, 제 3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교차되는 교차Fab 분자이고, 이때 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 모이어티는 서열번호 36의 서열을 포함하는 가변 중쇄, 서열번호 31의 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하고; FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티는 서열번호 55의 서열을 포함하는 가변 중쇄, 서열번호 65의 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 각각의 항원에 대하여 1가이다. 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 CD3 및 인간 엽산 수용체 알파(FolR1)에 결합할 수 있고 헤테로-이량체화 접근법, 예를 들면, 놉-인투-홀 기법을 사용하지 않고 제조되었다. 예를 들면, 상기 분자는 공통 경쇄 라이브러리 및 교차Mab 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 특정한 실시양태에서, CD3 결합제의 가변 영역은 표준 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인에 융합되어 모든 특이성에 대하여 공통인 VLVH 교차된 분자(Fc에 융합됨)를 형성한다. 교차된 대응물(VHCL)을 생성하기 위해, CD3 특이적 가변 중쇄 도메인은 불변 인간 λ 경쇄에 융합되는 반면, 인간 FolR1에 특이적인 가변 중쇄 도메인(예를 들면, 공통 경쇄 라이브러리로부터 단리됨)은 불변 인간 κ 경쇄에 융합된다. 정확하게 짝짓기된 쇄를 갖는 생성된 목적한 분자는 κ 및 γ 경쇄 또는 이의 단편을 포함한다. 결과적으로, 이 목적한 이중특이적 분자 종은 서열 중에서 z카파 및 람다 경쇄를 위해 선택하는 순차적인 정제 단계로 짝짓기오류 또는 호모이량체 종으로부터 정제될 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 목적한 이중특이적 항체의 정제는 카파셀렉트(KappaSelect) 및 람다Fab셀렉트(LambdaFabSelect) 컬럼(지이 헬쓰케어)을 후속 정제 단계에 이용하여 목적하지 않은 호모이량체 항제를 제거한다.
Fc
도메인
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어진다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이고, 이들의 각각의 하위단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 하위단위는 서로 안정하게 회합할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 S228(카밧 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 아암(arm) 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91(2010)] 참조). 추가의 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 인간이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적인 서열은 서열번호 245로 제공된다.
헤테로다이머화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개의 하위단위 중 1개 또는 다른 1개에 융합된 상이한 항원 결합 모이어티를 포함하고, 따라서 Fc 도메인의 2개의 하위단위는 전형적으로 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄에 포함된다. 이러한 폴리펩티드의 재조합 동시-발현 및 후속 이량체화는 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 야기한다. 따라서, 재조합 생성시 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적한 폴리펩티드의 회합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 하위단위의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 하위단위 사이에 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인이다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에서이다.
특정한 실시양태에서, 상기 변형은 소위 "놉-인투-홀" 변형이고, Fc 도메인의 2개의 하위단위 중 1개에서 놉 변형 및 Fc 도메인의 2개의 하위단위 중 다른 1개에서 홀 변형을 포함한다.
상기 놉-인투-홀 기법은 예를 들면, US 5,731,168; US 7,695,936; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621(1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15(2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌출부가 헤테로다이머를 촉진하고 호모다이머 형태를 방해하기 위해 캐비티에 위치될 수 있도록, 제 1 폴리펩티드의 계면에서 돌출부(놉) 및 제 2 폴리펩티드의 계면에서 상응하는 캐비티(홀)을 도입하는 것을 수반한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 큰 아미노산 측쇄(예를 들면, 티오신 또는 트립토판)로 대체하여 구축된다. 돌출부와 유사하거나 유사한 크기의 상보적인 캐비티는 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체하여 제 2 폴리펩티드의 계면에서 생성된다.
따라서, 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제 1 하위단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 2 하위단위의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제 1 하위단위의 CH3 도메인 내에 돌출부를 생성하고, Fc 도메인의 제 2 하위단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 1 하위단의의 CH3 도메인 내에 위치할 수 있는 돌출부 내에 제 2 하위단위의 CH3 도메인 내에 캐비티를 생성한다.
돌출부 및 캐비티는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변경시켜, 예를 들면, 부위-특이적 돌연변이생성에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
특정한 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 하위단위의 CH3 도메인에서 위치 366에서 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, Fc 도메인의 제 2 하위단위의 CH3 도메인이에서 위치 407에서 티로신 잔기는 발린 잔기(Y407V)로 대체된다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 제 2 하위단위에서 추가적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기는 세린 잔기(T366S)로 대체되고, 위치 368에서 류신 잔기는 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다.
추가의 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 하위단위에서 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기는 시스테인 잔기(S354C)로 대체되고, Fc 도메인의 제 2 하위단위에서 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기는 시스테인 잔기(Y349C)로 대체된다. 이러한 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개의 하위단위 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기하여 이량체를 추가로 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15(2001)]).
특정한 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 (임의적으로 표적 세포 항원에서 FolR1에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 통해) Fc 도메인의 제 1 하위단위(놉 변형 포함)에 융합된다. 이론에 얽매이지 않고, Fc 도메인의 놉-함유 하위단위에 CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티의 융합은 CD3에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자의 생성(2개의 놉-함유 폴리펩티드의 입체적 충돌)을 (추가로) 최소화할 것이다.
대안적인 실시양태에서, Fc 도메인의 제 1 및 제 2 하위단위의 회합을 촉진하는 변형은 예를 들면, PCT 공개 WO 2009/089004에 기재된 바와 같이 정전기 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이 방법은 하전된 아미노산 잔기에 의해 2개의 Fc 도메인 하위단위의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체하여 호모다이머 형태는 정전기적으로 불리하지만 헤테로다이머화는 정전기적으로 유리하도록 수반한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 파괴하는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 표적 조직에서 우수한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 유리한 조직-혈액 분포 비를 비롯한 유리한 약동학 특성을 부여한다. 그러나, 동시에 이는 바람직한 항원-함유 세포보다 Fc 수용체를 발현하는 세포에 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 바람직하지 않게 표적하도록 할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공-활성화는 T 세포 활성화 특성 및 항원 결합 분자의 긴 반감기와 함께 사이토카인 방출을 야기하여 전신 투여시 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 심각한 부작용을 초래할 수 있다. T 세포 이외에 (Fc 수용체-함유) 면역 세포의 활성화는 심지어 T 세포의 잠재적인 파괴로 인해, 예를 들면, NK 세포에 의해 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효능을 감소시킬 수 있다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 본래의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 상기 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)는 본래의 IgG1 Fc 도메인(또는 본래의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성을 나타내고/내거나, 본래의 IgG1 Fc 도메인(또는 본래의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도한다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더욱 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 하나의 실시양태에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP, 및 사이토카인 분비의 군으로부터 하나 이상 선택된다. 특정한 실시양태에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인 도메인은 본래의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 실질적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합은 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 본래의 IgG1 Fc 도메인(또는 본래의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 더욱 특히 약 90% 초과를 나타낼 때 달성된다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 Fc 도메인의 2개의 하위단위의 각각에 존재한다. 하나의 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 하나의 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 2배 이상, 5배 이상, 또는 10배 이상까지 감소시킨다. Fc 수용체의 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 아미노산 돌연변이가 1개 초과인 실시양태에서, 이러한 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 10배 이상, 20배 이상, 또는 심지어 50배 이상까지 감소시킬 수 있다. 하나의 실시양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 비교하여 20% 미만, 특히 10% 미만, 더욱 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체 Fcγ 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더욱 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게, 이러한 수용체의 각각에 대한 결합은 감소된다. 일부 실시양태에서, 보체 성분에 대한 결합 친화성, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화성은 또한 감소된다. 하나의 실시양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. FcRn에 대하여 실질적으로 유사한 결합, 즉, 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존은 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 약 70% 초과의 FcRn에 대한 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 조작되지 않은 형태의 결합 친화성을 나타낼 때 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 80% 초과, 심지어 약 90% 초과의 상기 친화성을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 비제한적으로, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 감소된 보체 의존적 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존적 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대하여 감소된 결합, 대식세포에 대하여 감소된 결합, 단핵구에 대하여 감소된 결합, 다형핵 세포에 대하여 감소된 결합, 세포자멸을 유도하는 감소된 직접 신호전달, 표적-결합된 항체의 감소된 교차결합, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 프라이밍(priming). 하나의 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 및 감소된 사이토카인 분비의 군으로부터 하나 이상 선택된다. 특정한 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 하나의 실시양태에서, 감소된 ADCC는 20% 미만의 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 의해 유도된 ADCC이다.
하나의 실시양태에서, Fc 수용체의 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329의 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329의 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 하나의 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시양태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환 및 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택된 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시양태에서, 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 하나의 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 전체가 참조로서 본원에 혼입된 PCT 공개 WO 2012/130831에 기재된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 파괴한다. 또한, WO 2012/130831은 상기 돌연변이체 Fc 도메인의 제조 방법 및 이의 특성, 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능의 측정 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 이로 인해, 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P를 포함한다. Fc 수용체에 대한 이의 결합 친화성 및/또는 이의 효과기 기능을 추가로 감소시키기 위해, 하나의 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G를 포함한다. 특정한 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다. 상기 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이의 Fcγ 수용체 결합 특성은 전체가 참조로 본원에 혼입된 PCT 공개 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
특정한 실시양태에서, 본래의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 N-당화는 제거되었다. 하나의 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
전술되고 PCT 공개 WO 2012/130831에 기재된 Fc 도메인 이외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다(미국 특허 6,737,056). 상기 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297을 알라닌으로 치환하는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체(미국 특허 7,332,581)를 비롯한, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327의 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다.
돌연변이체 Fc 도메인은 당해 분야에 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형을 제조할 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이생성, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 서열확인에 의해 입증될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 표준 계측 장비, 예컨대 비아코어(Biacore) 계측기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적합한 상기 결합 분석이 본원에 기재된다. 대안적으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화성은 특정한 Fc 수용체를 발현하기 위해 공지된 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 평가될 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효과기 기능은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석이 본원에 기재된다. 관심 분자의 ADCC 활성을 추정하는 시험관내 분석의 다른 예는 미국 특허 5,500,362; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063(1986)] 및 [Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502(1985)]; 미국 특허 5,821,337; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361(1987)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사선 분석 방법이 이용될 수 있다[예를 들면, 유동 세포계측을 위한 ACTI(상표) 비-방사선 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사선 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조]. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해자(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예컨대 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656(1998)]에 기재된 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 보체 성분, 구체적으로 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합은 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된 일부 실시양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있고 이로 인해 CDC 활성을 갖는지를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석이 수행될 수 있다(예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163(1996)]; 문헌[Cragg et al., Blood 101, 1045-1052(2003)]; 및 문헌[Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743(2004)] 참조).
T 세포 활성화
이중특이적
항원 결합 분자의 생물학적 특성 및 기능적 특성 규명
당업자는 암성 및 비-암성 건강한 세포를 선택적으로 구별하는 분자의 유리한 효율을 이해할 수 있다. 이러한 목적을 달성하는 한가지 방식은 적절한 표적 선별에 의해서이다. 종양 세포에서 독점적으로 발현된 마커는 종양 세포에 대한 효과기 분자 또는 세포를 선택적으로 표적하기 위해 이용될 수 있지만 상기 마커를 발현하지 않는 정상 세포는 남겨둔다. 그러나, 일부 경우에, 소위 종양 세포 마커는 비록 낮은 수준이라도 정상 조직에서도 발현된다. 정상 조직에서 이러한 발현은 독성의 가능성을 증가시킨다. 따라서, 종양 세포를 더욱 선택적으로 표적할 수 있는 분자에 대한 당해 분야의 요구가 있다. 본원에 기재된 본 발명은 FolR1을 낮은 수준에서 또는 전혀 발현하지 않는 정상, 비-암성 세포가 아니라 FolR1-양성 종양 세포를 선택적으로 표적하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 높은 FolR1 발현 세포와 낮은 FolR1 발현 세포 사이에 분화를 허용하는 결합활성 효과를 부여하는 비교적 낮은 친화성의 FolR1 결합 모이어티를 2개 이상, 바람직하게는 2개 포함한다. 종양 세포는 높거나 중간 수준에서 FolR1을 발현하기 때문에, 본 발명의 이 실시양태는 FolR1을 낮은 수준에서 또는 전혀 발현하지 않는 정상, 비-암성 세포가 아니라 종양 세포에 선택적으로 결합하고/하거나 이의 사멸을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 2+1 도립된 포맷으로 존재한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 비-종양 세포가 아니라 FolR1-양성 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도하고, 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하는 CD3 항원 결합 모이어티; 및 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 서열번호 50의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2 및 서열번호 54의 경쇄 CDR3을 각각 포함하는 2개의 FolR1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 이의 표면의 FolR1의 약 1000개 미만의 카피(copy)를 갖는 정상 세포의 사멸을 유도하지 않는다.
상기 유리한 특징 이외에, 본 발명의 하나의 실시양태는 화학적 가교 결합 또는 하이브리드 접근법을 필요로 하지 않는다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 CHO 세포에서 생성할 수 있는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간화된 및 인간 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 FcgR 교차결합을 야기하지 않는다. 하나의 상기 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CHO 세포에서 생성될 수 있고, 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하는 CD3 항원 결합 모이어티; 및 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 서열번호 50의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2 및 서열번호 54의 경쇄 CDR3을 각각 포함하는 2개의 FolR1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에 고려된 일부 실시양태는 FolR1에 특이적 결합을 부여하는 2개의 결합 모이어티 및 T 세포 활성화 항원 CD3에 특이성을 부여하는 1개의 결합 모이어티를 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하고, 이때 각각의 개별 FolR1 결합 모이어티는 낮은 친화성을 갖는 항원과 접촉을 유지한다. 분자는 FolR1에 결합을 부여하는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함하기 때문에, 그럼에도 불구하고, 분자의 전체 결합활성은 FolR1-발현 표적 세포에 대한 효과적인 결합 및 T 세포 효과기 기능을 유도하는 T 세포의 활성화를 제공한다. FolR1이 종양 세포에서 다양한 수준으로 발현되는 동안 또한 특정한 정상 세포에서 매우 낮은 수준(예를 들면, 세포 표면에서 약 1000개 복사 미만)으로 발현되는 것을 고려하면, 당업자는 치료제로서 사용하는 상기 분자의 유리한 효율을 용이하게 인지할 수 있다. 상기 분자는 정상 세포에 비해 종양 세포를 선택적으로 표적한다. 따라서, 상기 분자는 FolR1 양성 정상 세포로부터 발생하는 독성에 대하여, 높은 친화성로 FolR1에 결합하여 효과기 기능을 유도하는 분자와 비교하여 상당히 덜 우려할 필요가 있는 개체에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 마이크로몰 범위에서 huFolR1에 대한 1가 결합 친화성 및 나노몰 범위에서 huFolR1에 대한 결합활성을 갖는다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 10 nM 내지 약 40 nM의 겉보기 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 10 nM의 겉보기 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 10 nM 및 약 30 nM의 겉보기 KD로 인간 및 시노몰구스 FolR1에 각각 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1000 nM 이상의 1가 결합 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1400 nM의 1가 결합 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1400 nM의 1가 결합 KD로 인간 FolR1 및 약 5600 nM의 1가 결합 KD로 시노몰구스 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 10 nM의 겉보기 KD 및 약 1400 nM의 1가 결합 KD로 인간 FolR1에 결합한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 5.36 pM 내지 약 4 nM의 겉보기 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 4 nM의 겉보기 KD로 인간 및 시노몰구스 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1.5 nM의 겉보기 KD로 뮤린 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1000 nM 이상의 1가 결합 KD로 인간 FolR1에 결합한다. 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 4 nM의 겉보기 KD로 인간 및 시노몰구스 FolR1에 결합하고, 약 1.5 nM의 겉보기 KD로 뮤린 FolR1에 결합하고, 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하는 CD3 항원 결합 모이어티 및 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 서열번호 50의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2 및 서열번호 54의 경쇄 CDR3을 각각 포함하는 2개의 FolR1 항원 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1000 nM 이상의 1가 결합 KD로 인간 FolR1에 결합하고 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하는 CD3 항원 결합 모이어티 및 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 서열번호 50의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2 및 서열번호 54의 경쇄 CDR3을 각각 포함하는 2개의 FolR1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
전술한 바와 같이, 본원에서 고려되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 효과기 기능, 예를 들면, 세포 표면 마커 발현, 사이토카인 생성, T 세포 매개된 사멸을 유도할 수 있다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 FolR1-발현 표적 세포, 예컨대 시험관내 인간 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. FolR1-발현 인간 종양 세포의 예는 비제한적으로, HeLa, Skov-3, HT-29, 및 HRCEpiC 세포를 포함한다. 시험관내 시험을 위해 사용될 수 있는 다른 FolR1 양성 인간 암 세포는 당업자에게 용이하게 이용가능하다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 24 시간 후 약 36 pM 내지 약 39573 pM의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 인간 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 24 시간 후 약 36 pM의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 구체적으로 고려된다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 24 시간 후 약 178.4 pM의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 48 시간 후 약 134.5 pM 이상의 EC50으로 시험관내 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도한다. EC50은 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 실시예에 의해 본원에 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 유동 세포계측법에 의해 측정시 T 세포에서 CD25 및 CD69 중 하나 이상의 세포 표면 발현의 상향조절을 유도한다. 하나의 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다.
하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 종양 세포 상에 발현된 FolR1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 FolR1 상의 구조적 에피토프에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 엽산 수용체 2(FolR2)에 또는 인간 엽산 수용체 3(FolR3)에 결합하지 않는다. 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 인간 FolR1(서열번호 227)의 아미노산 25 내지 234를 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합한다. 임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드에, 서열번호 230의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드 및 서열번호 231의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합하고, 이때 FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 228 또는 229의 아미노산 서열을 포함하는 FolR 폴리펩티드에 결합하지 않는다. 하나의 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 227, 230 및 231의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합하는 FolR1 항원 결합 모이어티를 포함하고, 이때 FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 228 또는 229의 아미노산 서열을 포함하는 FolR 폴리펩티드에 결합하지 않고, 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하는 CD3 항원 결합 모이어티 및 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 9의 중쇄 CDR2, 서열번호 50의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 53의 경쇄 CDR2 및 서열번호 54의 경쇄 CDR3을 각각 포함하는 2개의 FolR1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 실시양태의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드 및 서열번호 231의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합하고, 이때 FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 228, 229 또는 230의 아미노산 서열을 포함하는 FolR 폴리펩티드에 결합하지 않는다. 하나의 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드 및 서열번호 231의 아미노산 서열을 포함하는 FolR1 폴리펩티드에 결합하는 FolR1 항원 결합 모이어티를 포함하고, 이때 FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 228, 229 또는 230의 아미노산 서열을 포함하는 FolR 폴리펩티드에 결합하지 않고, 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하는 CD3 항원 결합 모이어티 및 서열번호 16의 중쇄 CDR1, 서열번호 275의 중쇄 CDR2, 서열번호 315의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 각각 포함하는 2개의 FolR1 항원 결합 모이어티를 포함한다.
FolR1과 관련하여, 본원에서 고려되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 작용제, 길항제 또는 중성 효과를 가질 수 있다. 작용제 효과의 예는 표적 세포에서 FolR1 결합 모이어티와 FolR1 수용체에 의한 연결시 FolR1을 통해 신호전달의 유도 또는 강화를 포함한다. 길항제 활성의 예는 표적 세포에서 FolR1 결합 모이어티와 FolR1 수용체에 의한 연결시 FolR1을 통해 신호전달의 폐기 또는 감소를 포함한다. 이는 예를 들면, 폴레이트와 FolR1 사이의 상호작용을 차단하거나 감소시켜 발생할 수 있다. 낮은 친화성 갖지만 상기 기재된 생물학적 특성을 보유하는 본원에 개시된 실시양태의 서열 변이체가 구체적으로 고려된다.
면역접합
또한, 본 발명은 세포독성제, 예컨대 화학치료제, 성장 억제제, 독소(예를 들면, 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원, 또는 이의 단편의 효소적으로 활성인 독소), 또는 방사선 동위원소(즉, 방사선접합물)에 접합된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 면역접합에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하여 서열번호 151 내지 226에서 제시된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 것을 포함한다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 또는 동시-발현되는 다중(예를 들면, 2개 이상의) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 동시-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 모이어티의 경쇄 부분은 항원 결합 모이어티의 중쇄 부분, Fc 도메인 하위단위 및 임의적으로 또 다른 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 동시-발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 항원 결합 모이어티를 형성할 수 있다. 또 하나의 예에서, 2개의 Fc 도메인 하위단위 중 1개 및 임의적으로 하나 이상의 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부는 2개의 Fc 도메인 하위단위 중 다른 하나 및 임의적으로 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 동시-발현될 때, Fc 도메인 하위단위는 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화한다. 또 하나의 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 및 223에 나타낸 바와 같이 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243 및 244에 나타낸 바와 같이 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 추가로 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 97, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 246 및 247에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 97, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 246 및 247에 나타낸 핵산 서열을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7, 11,13, 15, 19, 21, 12, 25, 27, 29, 31, 36, 41, 45, 49, 51, 55, 58, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 82, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 및 135에서 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8, 9, 50, 37, 38 및 39에서 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 하나 이상의 서열을 포함하는 폴리텝티드를 암호화하는 서열을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포괄하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 및 223의 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포괄하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243 및 244의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 또 하나의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는, 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생성을 위해, 예를 들면, 전술한 바와 같이 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 단리되고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터로 삽입된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 공통 방법을 사용하여 용이하게 단리되고 서열 확인할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 널리 공지된 방법은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열과 함께 적절한 전사/번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전적 재조합을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y(1989)]에 기재된 기술을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와의 작동가능한 회합에서 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역된 코돈으로 이루어진 핵산의 일부이다. 비록 "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)이 아미노산으로 번역되지 않을지라도, 이는 존재하는 경우 암호화 영역의 일부로 간주될 수 있지만, 임의의 측면 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5 및 3 미번역된 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물, 예를 들면, 단일 벡터에서, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물, 예를 들면, 별도의 (상이한) 벡터에서 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있고, 예를 들면, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있고, 이는 단백질분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역 후 또는 번역과 동시에 분리된다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체와 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 비제한적으로 특화된 요소 또는 모티프(motif), 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동가능한 회합은 유전자 생성물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 유전자 생성물의 발현을 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합할 때이다. 2개의 DNA 단편(예컨대 폴리펩티드 암호화 영역 및 이와 결합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 목적한 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우 및 2개의 DNA 단편 사이의 연결기의 특성이 유전자 생성물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동적으로 결합된다". 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 그러한 핵산의 전사에 영향을 끼칠 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작동적으로 결합할 수 있다. 프로모터는 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 른 전사 제어 요소, 예를 들면 인헨서(enhancer), 작동자(operator), 억제자(repressor), 및 전사 종결 신호는 세포-특이적 전사를 유도하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 결합할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역은 본원에 개시된다. 다양한 전사 조절 영역은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은, 비제한적으로, 척추동물 세포, 예컨대, 비제한적으로 사이토메갈로바이러스(예를 들면, 인트론-A와 함께 전초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들면, 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스 육종 바이러스)에서 작용하는 전사 조절 영역으로부터의 프로모터 및 인헨서 분절을 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자로부터 유도된 것, 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 _-글로빈, 뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이적 프로모터 및 인헨서, 뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들면, 프로모터 유도성 테트라사이클린)을 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소는 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 비제한적으로, 리보솜결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스계로부터 유도된 요소(특히 내부 리보솜 유입 부위, 또는 IRES, CITE 서열로도 지칭됨)를 포함한다. 또한, 발현 카세트는 다른 특징, 예컨대 복제의 기원, 및/또는 염색체 통합 요소, 예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노-관련된 바이러스(AAV) 도립된 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 영역과 결합할 수 있고, 이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 유도한다. 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 분비가 바람직한 경우, 신호서열을 암호화하는 DNA는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 놓을 수 있다. 신호 가설에 따라, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 조면 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 유출이 개시되자마자 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합되고, 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성함을 알고 있다. 특정 실시양태에서, 본래의 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 기능성 유도체는 이와 작동적으로 연결되는 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 그러한 서열에 사용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성체(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
이후 정제를 용이하게 하거나(예를 들면, 히스티딘 태그) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 표시를 보조하기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 말단에서 또는 이에 포함될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터에 관하여 각각 본원에 기재된 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 혼입할 수 있다. 하나의 상기 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 이로 형질전환되거나 형질감염된다). 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 생성하기 위해 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포계를 지칭한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 복제하고 이의 발현을 지원하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 세포는 적절한 경우 특정한 발현 벡터로 형질감염되거나 형질도입될 수 있고 많은 양의 벡터 함유 세포는 임상 적용을 위한 충분한 양의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하기 위해 큰 규모의 발효조에 시딩하기 위해 성장할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵생물 미생물, 예컨대 에스케리키아 콜라이, 또는 다양한 진핵생물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 당화가 필요하지 않을 때, 박테리아에서 생성될 수 있다. 발현 후, 상기 폴리펩티드는 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 곰팡이 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 적합하게 클로닝하거나 당화 경로가 "인간화된" 곰팡이 및 효모 균주를 비롯한 폴리펩티드-암호화 벡터를 위한 발현 숙주는 부분적으로 또는 완전한 인간 당화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생성을 야기한다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414(2004)], 및 문헌[Li et al., Nat Biotech 24, 210-215(2006)]을 참조한다. 또한, (당화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 많은 배큘로바이러스 균주는 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 식물 세포 배양은 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429(유전자변형 식물에서 항체를 생성하기 위해 PL항체(상표) 기법을 기재함)를 참조한다. 또한, 척추동물 세포는 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 채택된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59(1977)]에 기재된 293 또는 293T 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251(1980)]에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 경부 암 세포(HeLa); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68(1982)]에 기재됨); MRC5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216(1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0을 포함한다. 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토는, 예를 들면, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)]을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 몇 개의 예를 들면 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포, 뿐만 아니라 유전자변형 동물, 유전자변형 식물, 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 임파상 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)를 포함한다.
표준 기술은 이러한 시스템에서 외부 유전자를 발현하기 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 항원 결합 도메인, 예컨대 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 갖는 항체이도록 또한 다른 항체 쇄를 발현하기 위해 조작될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분은 서로 유전적으로 융합된다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 이의 성분이 서로 직접적으로 융합되거나 연결기 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 연결기의 조성 및 길이는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 결정될 수 있고 효능에 대하여 시험될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 성분 사이의 연결기 서열의 예는 본원에 제공된 서열에서 찾을 수 있다. 추가의 서열, 예를 들면 엔토펩티다아제 인식 서열은 또한 융합이 바람직한 경우 개별 성분을 분리하는 절단 부위를 혼입하기 위해 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나 이상의 항원 결합 모이어티는 항원 결정기에 결합할 수 있는 항체 가변 영역을 적어도 포함한다. 가변 영역은 자연 발생하거나 자연적으로 발생하지 않은 항체 및 이의 단편의 일부를 형성할 수 있거나 자연 발생하거나 자연적으로 발생하지 않은 항체 및 이의 단편으로부터 유도될 수 있다. 다클론 항체 및 단클론 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 자연적으로 발생하지 않은 항체는 고체 상-펩티드 합성을 사용하여 구축될 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있거나(예를 들면, 미국 특허 4,186,567에 기재된 바와 같음), 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리의 선별에 의해 수득될 수 있다(예를 들면, 맥카페티(McCafferty)의 미국 특허 5,969,108 참조).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비제한적인 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류 또는 인간 기원의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역일 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 인간 용도를 위해 의도되는 경우, 항체의 불변 영역이 인간에서 온 키메라 형태의 항체가 사용될 수 있다. 항체의 인간화된 또는 완전히 인간 형태는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 또한 제조될 수 있다(예를 들면, 윈터(Winter)의 미국 특허 5,565,332 참조). 인간화는 비제한적으로 (a) 중요한 프레임워크 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 보유하기에 중요한 것)를 보유하거나 보유하지 않고 인간(예를 들면, 수용자 항체) 프레임워크 및 불변 영역에 비-인간(예를 들면, 공여자 항체) CDR을 그래프팅하거나, (b) 인간 프레임워크 및 불변 영역에 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)만을 그래프팅하거나, (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 부분으로 이를 "클로킹(cloking)"하는 것을 비롯한 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화된 항체 및 이의 제조 방법은 예를 들면, 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633(2008)]에서 검토되고, 추가로 예를 들면, 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329(1988)]; 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033(1989)]; 미국 특허 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525(1986)]; 문헌[Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855(1984)]; 문헌[Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92(1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536(1988)]; 문헌[Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217(1994)]; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36, 25-34(2005)](SDR(a-CDR) 그래프팅을 기재함); 문헌[Padlan, Mol Immunol 28, 489-498(1991)]("재표면화"를 기재함); 문헌[Dall,Acqua et al., Methods 36, 43-60(2005)]("FR 셔플링"을 기재함); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36, 61-68(2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260(2000)](FR 셔플링에 대한 "선별 지침" 접근법을 기재함)에 기재되어 있다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74(2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459(2008)]에 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단클론 항체의 일부를 형성할 수 있고 이로부터 유래될 수 있다(예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 항원성 시험에 대한 반응에서 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체 또는 온전한 인간 항체를 생성하기 위해 변형된 유전자변형 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125(2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리하여 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37(O,Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]; 문헌[McCafferty et al., Nature 348, 552-554]; 및 문헌[Clackson et al., Nature 352, 624-628(1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 유용한 항원 결합 모이어티는 예를 들면, 전체 내용이 본원에 참조로 혼입된 미국 특허 출원 공개 2004/0132066에 개시된 방법에 따라 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정기에 결합하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 능력은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어(비아코어) T100 시스템에서 분석됨)(문헌[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329(2000)]), 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)])을 통해 측정될 수 있다. 경쟁 분석은 특정한 항원에의 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들면, CD3에 결합하는 V9 항체와 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 구조적 에피토프)에 결합하는 상기 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합한다. 항체 결합에 대한 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적인 방법은 문헌[Morris, "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (1996)(Humana Press, Totowa, NJ)]에서 제공되고 있다. 예시적인 경쟁 분석에서, 고정화 항원(예를 들면, CD3)는 항원에 결합하는 표지된 1차 항체(예를 들면, US 6,054,297에 기재된 V9 항체) 및 항원에 결합하는 1차 항체와 경쟁하는 이의 능력이 시험된 표지되지 않은 2차 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 2차 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화 항원은 표지되지 않은 2차 항체가 아니라 표지된 1차 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 항원에 대한 1차 항체의 결합을 허용하는 조건하에 항온처리한 후, 과잉 결합하지 않은 항체는 제거되고, 고정화 항원과 결합된 표지의 양은 측정된다. 고정화 항체와 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우, 2차 항체는 항원에 결합하는 1차 항체와 경쟁하는 것을 나타낸다. 문헌[Harlow and Lane(1988) Antibodies A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당해 분야에 공지된 기술, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등으로 정제될 수 있다. 특정한 단백질을 정제하기 위해 사용된 실제 조건은 일부 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 따르고, 당업자에게 자명하다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해 항체, 리간드, 수용체 또는 항원은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 결합하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 순차적인 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피는 실시예에 본질적으로 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 단리하기 위해 사용될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 비롯한 임의의 다양한 널리 공지된 분석 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 발현된 중쇄 융합 단백질은 온전하게 나타나고 환원성 SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이 적절하게 모였다(예를 들면, 도 2 참조). 3개의 밴드는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 경쇄, 중쇄 및 중쇄/경쇄 융합 단백질의 예상된 분자량에 상응하는 약 Mr 25,000, Mr 50,000 및 Mr 75,000에서 분해되었다.
분석
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 이들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대하여 확인되거나, 선별되거나, 특성 규명될 수 있다.
친화성 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성은 표준 계측 장비, 예컨대 비아코어 계측기[지이 헬쓰케어(GE Healthcare)]를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 제시된 방법에 따라 측정될 수 있고, 수용체 또는 단백질은 예컨대 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합은 예를 들면 유동 세포계측법(FACS)에 의해 특정한 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여 평가될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특이적 예시 및 예시적인 실시양태는 하기 및 실시예에 기재된다.
하나의 실시양태에 따라, KD는 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다.
Fc-부분과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His-태깅된 재조합 Fc-수용체를 CM5 칩에 고정된 항-펜타 His 항체("펜타 His"는 서열번호 306으로서 기재됨)(퀴아겐(Qiagen))에 의해 포획하고 이중특이적 구축물을 분석물로서 사용하였다. 간단히 말해, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급처의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시켰다. 항 펜타-His 항체("펜타 His"는 서열번호 306으로서 개시됨)를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 40 ㎍/㎖로 희석한 후 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 약 6500 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성하였다. 리간드를 주사한 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 기를 차단하였다. 이후, Fc-수용체를 60 초 동안 4 또는 10 nM에서 포획하였다. 운동 측정을 위해, 이중특이적 구축물의 4배 연속 희석물(500 nM 내지 4000 nM의 범위)을 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 120 초 동안 HBS-EP(지이 헬쓰케어; 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)에 주사하였다.
표적 항원에 대한 친화성을 측정하기 위해, 이중특이적 구축물을 항 펜타-His 항체("펜타 His"는 서열번호 306으로서 개시됨)에 대하여 기재된 바와 같이 활성화된 CM5-센서 칩에 고정된 항-인간 Fab 특이적 항체(지이 헬쓰케어)에 의해 포획하였다. 커플링된 단백질의 최종 양은 약 12000 RU이다. 이중특이적 구축물을 300 nM으로 90 초 동안 포획하였다. 표적 항원을 유동 세포를 통해 180 초 동안 250 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 유속으로 통과시켰다. 해리를 180 초 동안 모니터링하였다.
벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 정상 상태 반응을 사용하여 랭뮤어(Langmuir) 결합 등온선의 비-선형 곡선 맞춤에 의해 해리 상수(KD)를 유도하였다. 회합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 회합 및 해리 센서그램을 동시에 맞추어 단순한 1:1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon의 비로 계산하였다. 예를 들면, 문헌[Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881(1999)]을 참조한다.
활성 분석
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생물학적 활성은 실시예에 기재된 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들면 T 세포의 증식의 유도, T 세포에서 신호전달의 유도, T 세포에서 활성화 마커의 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비의 유도, 표적 세포, 예컨대 종양 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴행의 유도 및/또는 생존의 개선을 포함할 수 있다.
조성물, 제형, 및 투여 경로
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들면, 하기 임의의 치료 방법에 사용하는 본원에 제공된 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 예를 들면 하기 기재된 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
또한, (a) 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하는 단계; 및 (b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체로 제형화하여 생체내 투여를 위해 제형화된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 단계를 포함하는, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 치료 효과량으로 포함한다. 어구 "약학적으로 또는 약리적으로 허용되는"은 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성인, 즉, 적절한 경우 동물, 예를 들면, 인간에게 투여될 때 불리한 반응, 알러지 반응 또는 다른 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 개에 및 조성물을 지칭한다. 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 임의적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제조는 참조로서 본원에 혼입된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에서 예시된 바와 같이 본원에 비추어 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 동물(예를 들면, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 위원회의 생물학적 표준 또는 다른 나라에서 상응하는 당국에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족시켜야 함이 이해될 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지될 수 있는 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 완충액, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장성제, 흡수 지연제, 염, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 상기 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들면, 참조로서 본원에 혼입된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 임의의 공통 담체가 활성 성분과 호환될 수 없음을 제외하고, 치료제 또는 약학 조성물에서 이의 용도가 간주된다.
조성물은, 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지, 및 주사로서 상기 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는지에 따라 상이한 유형의 단체를 포함할 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(및 임의의 추가의 치료제)는 정맥내로, 피부내로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 비장내로, 신장내로, 흉막내로, 기관지내로, 비강내로, 유리체강내로, 질내로, 직장내로, 종양내로, 근육내로, 복강내로, 피하로, 결막하로, 소낭으로, 점막으로, 심낭내로, 탯줄로, 안내로, 경구로, 국소로, 국부로, 흡입(예를 들면, 에어로졸 흡입), 주사, 주사, 연속 주사, 직접적으로 표적 세포를 침하하는 국소화된 살포에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림으로, 액체 조성물(예를 들면, 리포좀)로, 또는 다른 방법 또는 당업자에게 공지될 수 있는 바와 같은 상기의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(예를 들면, 참조로서 본원에 혼입된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 참조). 비경구 투여, 특히 정맥내 주사는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 같은 폴리펩티드 분자를 투여하는데 가장 통상적으로 사용된다.
비경구 조성물은 주사에 의해, 예를 들면, 피하, 피내, 병소내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척추강내 또는 복강내 주사에 의한 투여를 위해 설계된 것을 포함한다. 주사를 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 수용액, 바람직하게는 생리적으로 호환되는 완충액, 예컨대 행크스(Hanks) 용액, 링거(Ringer) 용액, 또는 생리 식염수 완충액 중에 제형화될 수 있다. 상기 용액은 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균 주사용 증류수로 구성하는 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사 용액은 적절한 용매 중 필요한 양의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 하기 열거된 다양한 다른 성분과 필요한 만큼 혼입하여 제조된다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통해 여과에 의해 용이하게 성취될 수 있다. 일반적으로, 분산제는 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 + 이전의 멸균-여과된 액체 매질로부터 임의의 추가의 목적한 성분을 수득하는 진공-건조 또는 냉동-건조 기술이다. 액체 매질은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 주사 전에 충분한 염분 또는 글루코스를 갖는 등장성으로 제공된다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정하여야 하고, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용을 막는다. 내독성 오염은 최고한으로 안전한 수준에서, 예를 들면 단백질 1 mg당 0.5 ng 미만으로 유지되어야 함이 이해될 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 하기를 포함한다: 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린, 친수성 중합체, 예컨대 포릴비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니ㅌㄹ, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사용 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 또한 고도로 농축된 용액을 제조하기 위해 화합물의 가용성을 증가시키는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사용 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예컨대 참깨유, 또는 합성 지방산 에스터, 예컨대 에틸 클레이트 또는 트라이글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐, 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐 각각에, 콜로이드 약물 전달계(예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구체, 미소에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 상기 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 기재되어 있다. 지연-방출 제제가 제조될 수 있다. 지연-방출 제제의 적합한 예는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스이고, 상기 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들면, 필름 또는 미소캡슐이다. 특정한 실시양태에서, 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 약제의 조성물, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이의 조합의 사용을 유발할 수 있다.
전술된 조성물 이외에, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 또한 데폿 제제로서 제형화될 수 있다. 상기 긴 작용 제형은 이식에 의해(예를 들면 피하로 또는 근육내로), 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예를 들면 적합한 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체, 예를 들면 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물은 공통 혼합, 용해, 에멀젼화, 캡슐화, 포획화 또는 동결건조화 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제제에 단백질의 가공을 용이하게 하는 하나 이상의 생리적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 공통 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 따른다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 자유 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 실질적으로 자유 산 또는 염기의 생물학적 활성을 보유하는 염이다. 이들은 산 부가 염, 예를 들면, 단백질 조성물의 자유 아미노기로 형성된 것, 또는 무기산, 예컨대 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 상기 유기산으로 형성된 것을 포함한다. 자유 카복실 기로부터 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드; 또는 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 상기 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 약학 염은 상응하는 자유 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에 더욱 가용성인 경향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 면역치료제로서, 예를 들면 암의 치료에서 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 우수한 의료 실시와 일치하는 방식으로 제형화되고 복용되고 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자는 치료되는 특정한 질환, 치료되는 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
하나의 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가의 양상에서, 질병을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 질병의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 치료 효과량으로 개체에게 투여함을 포함하는 질병을 갖는 개임을 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료할 질병은 증식 질환이다. 특정한 실시양태에서, 질병은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제(치료되는 질병이 암인 경우)를 치료 효과량으로 개체에게 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포의 용해를 유도하기 위해 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 효과량으로 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 준비시 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 사용을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 약제는 이를 필요로 하는 개체에서 질병의 치료를 위함이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 치료 효과량의 상기 약제를 질병을 가진 개체에게 투여함을 포함하는 질병의 치료 방법에 사용하기 위함이다. 특정 실시양태에서, 치료할 질병은 증식 질환이다. 특정한 실시양태에서, 질병은 암이다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 치료할 질병이 암인 경우, 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제를 개체에게 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위함이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 효과량의 약제를 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위함이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 질병의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 치료 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 상기 질병을 갖는 개체에게 투여함을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물은 상기 개체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 치료할 질병은 증식 질환이다. 특정한 실시양태에서, 질병은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료할 질병이 암인 경우, 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제를 개체에게 투여함을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 표적 세포를 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재 하에 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시킴을 포함한다. 추가의 양상에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 방법이 제공된다. 하나의 상기 실시양태에서, 상기 방법은 표적 세포의 용해를 유도하기 위해 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 환자에게 투여함을 포함한다. 하나의 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
특정 실시양태에서, 치료할 질병은 증식 질환, 특히 암이다. 암의 비제한적인 예는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 대장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피암, 골암 및 신장암을 포함한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 치료할 수 있는 다른 세포 증식 질환은 비제한적으로 복부, 골, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비샘(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부, 및 비뇨생식계에 위치된 신생물을 포함한다. 또한, 전암성 질환 또는 병변, 및 암 전이가 포함된다. 특정 실시양태에서, 암은 신장 세포암, 피부암, 폐암, 직장결장암, 유방암, 뇌암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 당업자는 많은 경우에 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치유법을 제공할 수 없지만 오직 부분적인 이점을 제공할 수 있음을 용이하게 인지한다. 일부 실시양태에서, 일부 유익한 생리적 변화는 또한 치료적으로 유익한 것을 간주된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생리적 변화를 제공하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로 간주된다. 치료를 필요로 하는 대상체, 환자, 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 더욱 구체적으로 인간이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 효과량으로 세포에 투여된다. 또 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료 효과량으로 질병의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 적절한 투여량(단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가의 체로제와 함께 사용될 때)은 치료할 질병의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유형, 질병의 중증도 및 과정에 따를 것이고, 이때 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예방적 또는 치료적 목적, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 병력 및 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 의사의 재량에 따라 투여된다. 투여에 책임이 있는 의사는 임의의 사건에서 개별 대상체를 위해 조성물 중 활성 성분 및 적절한 투여량의 농도를 결정할 것이다. 비제한적으로 다양한 시점에 따른 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비롯한 다양한 투여 일정은 본원에서 고려된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질병의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들면 하나 이상의 별도 투여에 의해서든, 연속 주입에 의해서든 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 전술된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 상태에 따라 수일 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 상기 치료는 일반적으로 질병 증상의 목적한 억제가 발생할 때까지 지속될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 이내일 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 투여량은 또한 투여당 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 ㎎/kg 체중, 약 5 ㎎/kg 체중, 약 10 ㎎/kg 체중, 약 50 ㎎/kg 체중, 약 100 ㎎/kg 체중, 약 200 ㎎/kg 체중, 약 350 ㎎/kg 체중, 약 500 ㎎/kg 체중, 내지 약 1000 mg/kg 체중 이상을 포함할 수 있고 이 중 어떤 범위도 유도할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도가능한 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 ㎎/kg 체중 등의 범위가 전술된 수치에 기초하여 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 투여량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 마다 또는 3주 마다 투여될 수 있다(예를 들면, 환자가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면 약 6회 투여받도록 하기 위함). 초기 도입 투여량이 높을수록, 이후 적어도 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 양생법이 유용할 수 있다. 이 치료법의 진행은 공통 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질병 상태를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자, 또는 이의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 당업자의 역량 내에 잘 결정된다.
전신 투여를 위해, 치료 효과적인 용량은 처음에 시험관내 분석, 예컨대 세포 배양 분석으로부터 추측될 수 있다. 이어서, 투여량은 세포 배양시 측정된 IC50를 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 동물 모델에서 배합될 수 있다. 상기 정보는 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 특정하기 위해 사용된다.
또한, 초기 투여량은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 기술을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 추측될 수 있다. 당업자는 동물 데이터에 기초하여 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 및 투여 간격은 개별적으로 조정되어 치료 효과를 유지하기에 충분한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 혈장 수준을 제공할 수 있다. 주사 투여를 위한 보통 환자의 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일 범위이다. 치료 효과적인 혈장 수준은 매일 다중 투여량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들면, HPLC에 의해 특정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련될 수 없다. 당업자는 과도한 실헙없이 치료 효과적인 국소 투여량을 최적화할 수 있다.
본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 치료 효과적인 용량은 일반적으로 상당한 독성을 야기하지 않고 치료 이점을 제공할 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 과정에 의해 측정될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료 효과적인 용량)을 측정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있는 치료 지수이다. 큰 치료 지수를 나타내는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 사용하여 인간에서 사용하기에 적합한 투여량의 범위를 만들어 낼 수 있다. 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 놓여 있다. 투여량은 다양한 인자, 예를 들면, 사용된 투여 형태, 대상체의 상태 등에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 전체가 참조로 본원에 혼입된 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로 치료된 환자를 위한 주치의는 독성, 기관 기능장애 등으로 인해 투여를 언제 어떻게 종료하거나 중단하거나 조정하는지를 알 수 있다. 반대로, 주치의는 또한 임상 반응이 적정하지 않은 경우(독성 배제) 더 높은 수준으로 치료를 조정하는 것을 알 수 있다. 관심 질병의 관리에서 투여된 투여량의 규모는 치료할 질환의 중증도, 투여 경로 등으로 달라질 것이다. 질환의 중증도는, 예를 들면, 표준 예후 평가 방법에 의해 부분적으로 평가될 수 있다. 또한, 투여량 및 아마도 투여 빈도는 또한 개별 환자의 연령, 체중 및 응답에 따라 달라질 것이다.
다른 약제 및 치료법
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료시 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 상기 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질병을 치료하기 위해 투여된 임의의 약제를 포괄한다. 상기 추가의 치료제는 치료받은 특정한 적응증에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 악영향을 끼치지 않는 상보성 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역조절제, 세포정지제, 세포 부착 억제제, 세포독성제, 세포자멸 활성체, 또는 세포자멸 유도제에 대한 세포의 감도를 증가시키는 약제이다. 특정한 실시양태에서, 추가의 치료제는 항암제, 예를 들면 미소관 교란물질, 항대사물질, 토포이소머라아제 억제제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬 치료제, 키나아제 억제제, 수용체 길항제, 종양 세포자멸 활성체, 또는 항신생혈관제이다.
상기 다른 약제는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 상기 다른 약제의 효과량은 사용된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 전술된 다른 인자에 따른다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 경험적으로/임상적으로 적절하도록 투여되는 임의의 투여량 및 임의의 경로에서 사용된다.
전술된 상기 조합 요법은 조합된 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별도의 조성물에 포함되는 경우), 별도 투여를 포함하고, 이 경우 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 투여는 추가의 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 발생할 수 있다. 또한, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 방사선 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
또 하나의 양상에서, 본 발명은 PD-L1 또는 FAP-4-1BBL에 대한 항체과 조합하여 사용하기 위한, (a) 서열번호 274의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제 1 항원 결합 부위; 및 (b) 서열번호 36의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열번호 274의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 31의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제 3 항원 결합 부위를 추가로 포함한다.
제품
본 발명의 또 하나의 양상에서, 전술된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품 용기 및 용기에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 존재하거나 질환을 치료하고/하거나 예방하고/하거나 진단하는데 효과적인 또 다른 치료제와 조합된 조성물을 보유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스톱퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 상기 조성물에서 하나 이상의 활성제는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자이다. 라벨 또는 포장 삽입물은, 조성물이 선택 질환을 치료하는데 사용되는 것을 나타낸다. 더욱이, 제품은 (a) 이에 함유된, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 갖는 제 1 용기; 및 (b) 이에 함유된, 추가의 세포 독성 또를 달리 치료제를 포함하는 조성물을 갖는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은, 조성물이 특정한 질환을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 주사용 세균 발육 저지 수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적이고 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질, 예컨대 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 다양한 또 하나의 실시양태는 전술된 일반적일 설명을 제시하고 실시할 수 있음이 이해된다.
일반적인 방법
재조합
DNA
기술
표준 방법을 사용하여 문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약은 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242]에 제시된다.
DNA
서열확인
DNA 서열은 시너젠(Synergene; 스위스 슐리렌 소재)에서 표준 이중 가닥 서열확인에 의해 결정하였다.
유전자 합성
목적한 유전자 분절은 필요한 경우 적절한 주형을 사용하여 PCR로 생성되거나, 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 젠아트 아게(Genart AG; 독일 레겐스부르크 소재)에 의해 합성되었다. 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 가장 가까운 동족체로부터의 서열에 기초하여 설계하고, 유전자는 적절한 조직으로부터 기원하는 RNA로부터 RT-PCR에 의해 단리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 플랭킹된(flanked) 유전자 분절은 표준 클로닝/서열확인 벡터로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA는 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, UV 분광학으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열확인으로 확인하였다. 유전자 분절은 적합한 제한 부위로 설계하여 각각의 발현 벡터로 서브클로닝하도록 하였다. 모든 구축물은 진핵생물 세포의 분비를 위한 단백질을 표적하는 리더 펩티드를 위한 5'-말단 DNA 서열 코딩으로 설계하였다.
PBMC
로부터 1차 인간
pan
T 세포의 단리
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 지역 혈액 은행으로부터 또는 건강한 인간 공여자의 선혈로부터 수득된 농축 림프구 제제(버피 코트)로부터 히스토파크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 간단히 말해, 혈액을 멸군 PBS로 희석하고 히스토파크 구배[시그마(Sigma), H8889] 위에 조심스럽게 적층하였다. 30 분 동안 450 xg로 실온에서 원심분리 후(제동 스위치 오프), 중간상을 함유하는 PBMC의 상부 혈장 부분을 버렸다. PBMC를 새 50 ml 팔콘 튜브로 옮기고, 50 ml의 총 용량까지 PBS로 채웠다. 혼합물을 실온에서 10 분 동안 400 xg로 원심분리하였다(제동 스위치 온). 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(4℃에서 10 분 동안 350 xg로 원심분리 단계). 생성된 PBMC 집단을 자동적으로 카운트하고(바이셀(ViCell) 분석을 시작할 때까지 37℃, 5% CO2 항온처리기에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민[바이오크롬(Biochrom), K0302]을 함유하는 RPMI1640 배지 중에 저장하였다.
PBMC로부터 T 세포 농축은 제조자의 설명서에 따라 Pan T 세포 단리 키트 II[밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec) #130-091-156]를 사용하여 수행하였다. 간단리 발해, 세포 펠렛을 10 x 107개 세포당 40 ㎕의 저온 완충액(0.5% BSA, 2 mM EDTA를 함유하는 PBS, 멸균 여과됨)으로 희석하고 10 x 107개 세포당 10 ㎕의 비오틴-항체 칵테일로 10분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 10 x 107개 세포당 30 ㎕의 저온 완충액 및 20 ㎕의 항-비오틴 자기 비드를 첨가하고, 혼합물을 추가 15분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 현재 용량의 10 내지 20배를 첨가하여 세포를 세척하고 300 xg으로 10분 동안 후속 원심분리하였다. 10 x 108개 이하의 세포를 500 ㎕의 완충액 중에 재현탁하였다. 표지되지 않은 인간 pan T 세포의 자기 분리는 제조자의 설명서에 따라 LS 컬럼(밀테니이 바이오테크 #130-042-401)을 사용하여 수행하였다. 생성된 T 세포 집단은 자동적으로 카운트하고(바이셀) 분석이 시작할 때까지(24 시간을 초과하지 않음), 37℃, 5% CO2 항온처리기에서 AIM-V 배지 중에 저장하였다.
PBMC
로부터 1차 인간 본래의 T 세포의 단리
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 지역 혈액 은행으로부터 또는 건강한 인간 공여자의 선혈로부터 수득된 농축 림프구 제제(버피 코트)로부터 히스토파크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. PBMC로부터 T 세포 농축은 제조자의 설명서에 따라 밀테니이 바이오테크로부터의 본래의 CD8+ T 세포 단리 키트(#130-093-244)를 사용하여 수행하였지만, CD8+ T 세포의 마지막 단리 단계는 생략하였다(또한 1차 인간 pan T 세포의 단리를 위한 설명 참조).
비장 세포로부터
뮤린
pan
T 세포의 단리
비장을 C57BL/6 마우스로부터 단리하고, MACS 완충액(PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)을 함유하는 젠틀MACS C-튜브(밀테니이 바이오테크 #130-093-237)로 옮기고, 젠틀MACS 분해자로 분해하여 단일-세포 현탁액 제조자의 설명서에 따라 단일-세포 현탁액을 수득하였다. 세포 현탁액을 예비-분리 필터를 통과시켜 남아있는 분해되지 않은 조직 입자를 제거하였다. 400 xg으로 4 분 동안 4℃에서 원심분리한 후, ACK 용해 완충액을 첨가하여 적혈구 세포를 용해하였다(5분 동안 실온에서 항온처리). 남아있는 세포를 MACS 완충액으로 2회 세척하고, 카운팅하고 뮤린 pan T 세포의 단리를 위해 사용하였다. 밀테니이 바이오테크(#130-090-861)로부터의 Pan T 세포 단리 키트를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 음성 (자기) 선별을 수행하였다. 생성된 T 세포 집단을 자동적으로 카운팅하고(바이셀) 추가 분석을 위해 즉시 사용하였다.
헤파린처리된 혈액으로부터 1차
시노몰구스
PBMC
의 단리
하기와 같이 건강한 시노몰구스 공여자의 선혈로부터 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 제조하였다: 헤파린처리된 혈액을 멸균 PBS로 1:3으로 희석하고, 림포프렙(Lymphoprep) 배지[액손 랩(Axon Lab) #1114545]를 멸균 PBS로 90%까지 희석하였다. 2 부피의 희석된 혈액을 1 부피의 희석된 밀도 구배 위에 적층하고, PBMC 분획을 30 분 동안 520 xg로 제동 없이 실온에서 원심분리에 의해 분리하였다. PBMC 밴드를 새 50 ml 팔콘 튜브로 옮기고 10 분 동안 400 xg로 4℃에서 원심분리에 의해 멸균 PBS로 세척하였다. 하나의 저속 원심분리를 수행하여 혈소판을 제거하고(4℃에서 15 분 동안 150 xg로 원심분리), 생성된 PBMC 집단을 자동적으로 카운팅하고(바이셀) 추가 분석을 위해 즉시 사용하였다.
실시예 1
비오틴화된
엽산 수용체-
Fc
융합물의
정제
인간 FolR1에 대한 새로운 항체를 생성하기 위해, 하기 항원 및 선별 도구를 1가 Fc 융합 단백질(Fc-홀 분자와 공동-발현되는 Fc-놉의 힌지 영역에 연결된 항원의 세포외 도메인)과 같이 생성하였다. 항원 유전자는 젠뱅크(GenBank) 또는 스위스프롯(SwissProt)으로부터 수득된 서열에 기초하여 합성하고[젠아트(Geneart), 독일 레젠스부르크 소재] 발현 벡터로 삽입하여 생체내 또는 시험관내 비오틴화를 위해 C-말단 Avi-tag을 갖는 Fc-놉을 갖는 융합 단백질을 생성하였다. 생체내 비오틴화는 생성 동안 박테리아 비오틴 리가아제를 암호화하는 박테리아 birA 유전자의 공동-발현에 의해 달성된다. 모든 유전자의 발현은 EBNA 함유 세포주에서 플라스미드의 안정한 유지를 위한 oriP 요소를 함유하는 플라스미드에서 키메라 MPSV 프로모터로 잘 제어된다.
비오틴화된 단량체 항원/Fc 융합 분자를 제조하기 위해, 기하급수적으로 성장하는 현탁액 HEK293 EBNA 세포를 융합 단백질의 2가지 성분(놉 및 홀 쇄) 뿐만 아니라 BirA(비오틴화 반응을 위해 필수적인 효소)를 암호화하는 3개의 벡터로 공동-형질감염시켰다. 상응하는 벡터는 9.5:9.5:1 비("항원 ECD-Fc 놉-avi-tag":"Fc 홀":"BirA")로 사용하였다.
500 ml 쉐이크 플라스크에서 단백질 생성을 위해, 4 x 109개의 HEK293 EBNA 세포룰 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해 세포를 5 분 동안 210 xg로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍의 벡터 DNA를 함유하는 20 mL의 CD CHO 배지에 재현탁하였다. 540 ㎕의 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가한 후, 상기 용액을 15 초 동안 혼합하고 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 쉐이크 플라스크로 옮기고, 5% CO2 대기하에 항온처리기에서 37℃에서 3 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드(Feed) 1[론자(Lonza)]을 배양물에 첨가하였다. 또한, 생성 배지는 100 μM 비오틴으로 보충하였다. 배양 7일 후, 세포를 15 분 동안 210 xg으로 스핀 다운하여 세포 상청액을 수집하였다. 상기 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 0.01%(w/v)의 최종 농도까지 나트륨 아자이드를 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질은 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해, 이후 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상청액은 20 mM 나트륨 포스페이트 + 20 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.5, 40 mL)로 평형시킨 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어)에 부하하였다. 결합하지 않은 단백질은 적어도 10 컬럼 용량의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.5)로 세척하여 제거하였다. 결합된 단백질은 20 컬럼 초과 용량의 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신(pH 3.0)으로 생성된 선형 pH 구배를 사용하여 용해하였다. 이어서, 컬럼은 10 컬럼 용량의 20 mM 나트륨 시트레이트 + 100 mM 나트륨 클로라이드 + 100 mM 글리신(pH 3.0)으로 세척하였다.
수집된 분획의 pH는 1/10(v/v)의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8.0)를 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축하고 여과한 후 20 mM 히스티딘 + 140 mM 나트륨 클로라이드(pH 6.0)로 평형시킨 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 부하하였다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서의 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. FolR1-Fc-융합의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동에 의해 분석하였다(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스(Caliper LabChipGX), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)). 샘플의 응집물 함량은 25℃에서 실행 완충액(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7)으로 평형시킨 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소(Tosoh))을 사용하여 분석하였다.
정제된 항원-Fc-융합 단백질은 시판중인 항체를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 분석하여 항원의 정확하고 자연적 형태를 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
| 항원 | ECD ( aa ) | 수탁 번호 | 서열 | 서열번호 |
| 인간 FolR1 | 25 - 234 | P15328 | RIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAM | 227 |
| 인간 FolR2 | 17 - 230 | P14207 | TMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQSWRKERFLDVPLCKEDCQRWWEDCHTSHTCKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVARFYAAAMHVN | 228 |
| 인간 FolR3 | 24 - 243 | P41439 | SARARTDLLNVCMNAKHHKTQPSPEDELYGQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPTCKRHFIQDSCLYECSPNLGPWIRQVNQSWRKERILNVPLCKEDCERWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGINECPAGALCSTFESYFPTPAALCEGLWSHSFKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVAKFYAAAMNAGAPSRGIIDS | 229 |
| 뮤린 FolR1 | 25 - 232 | P35846 | TRARTELLNVCMDAKHHKEKPGPEDNLHDQCSPWKTNSCCSTNTSQEAHKDISYLYRFNWNHCGTMTSECKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERILDVPLCKEDCQQWWEDCQSSFTCKSNWHKGWNWSSGHNECPVGASCHPFTFYFPTSAALCEEIWSHSYKLSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAEAMS | 230 |
| 시노몰구스 FolR1 | 25 - 234 | G7PR14 | EAQTRTARARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWKKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCERWWEDCRTSYCKSNWHKGWNWTSGFNKCPVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTYSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMS | 231 |
| 항원 | 단량체 [%] ( SEC ) | 수율 |
| huFolR1 | 100 | 30 mg/L |
| cyFolR1 | 100 | 32 mg/L |
| muFolR1 | 100 | 31 mg/L |
| huFolR2 | 100 | 16 mg/L |
| huFolR3 | 95 | 38 mg/L |
실시예
2
CD3
ε 특이성을 갖는 공통
경쇄의
생성
본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 분자는 하나 이상의 CD3 결합 모이어티를 포함한다. 이 모이어티는 실험 동물 면역화, 선별 파지 라이브러리 또는 공지된 항-CD3 항체의 사용에 의해 생성될 수 있다. CD3ε 특이성을 갖는 공통 경쇄는 뮤린 모 항-CD3ε 항체(CH2527)의 경쇄를 인간화하여 생성된다. 비-인간 기원의 항체의 인간화를 위해, 비-인간 항체(공여자)로부터의 CDR 잔기는 인간(수용기) 항체의 프레임워크에 이식되어야 한다. 일반적으로, 수용기 프레임워크 서열은 잠재적인 수용기 서열의 수집에 대하여 공여자의 서열을 정렬하고 공여자에 대한 적당한 동족체를 갖거나, 구조 및 활성을 위해 중요한 일부 위치에서 유사한 아미노산을 나타내는 것을 선택함으로써 선택된다. 본 경우에, 항체 수용기 프레임워크에 대한 연구는 인간 생식계열 서열의 수집에 대하여 모 항체의 마우스 VL-도메인 서열을 정렬하고 높은 서열 동일성을 나타내는 인간 서열을 선택함으로써 수행되었다. 놀랍게도, 프레임워크 서열 동족체에 관한 우수한 매치는 γ 유형의 V-도메인 계열 7에 속하는 상당히 희귀한 인간 경쇄, 더욱 정확히 말하면, hVL_7_46(IMGT 명명법, 진뱅크 수탁 번호 Z73674)에서 밝혀졌다. 이 희귀한 인간 경쇄는 이후 CH2527의 경쇄의 인간화를 위한 수용기 프레임워크로서 선택되었다. 마우스 경쇄 가변 도메인의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)은 이 수용기 프레임워크에 그래프팅되었다. 프레임워크 4 영역은 생식계열 V-유전자의 가변 영역의 일부가 아니므로, 이 영역(J-요소)을 위한 정렬을 개별적으로 수행하였다. 이로 인해, IGLJ3-02 서열은 이 경쇄의 인간화를 위해 선택되었다.
13개의 인간화된 변이체를 생성하였다(CH2527-VL7_46-1 내지 VL7_46-10, VL7_46-12 내지 VL7_46-14). 이들은 뮤린 V-도메인 서열에 다시 돌연변이된 프레임워크 잔기(및 이들의 조합) 또는 인간 생식계열 서열에 동일하게 유지될 수 있는 CDR-잔기(카밧 정의)에 따라 상이하다. 하기 프레임워크 잔기 외부 CDR은 최종 인간화된 VL-도메인 변이체 VL7_46-13의 뮤린 잔기(열거된 뮤린 잔기)에 다시 돌연변이된다: 각각 V36, E38, F44, G46, G49 및 G57. 인간 J-요소 IGLJ3-02는 뮤린 모 항체의 J-요소와 100% 동일하였다.
실시예 3
CD3
ε 특이성을 갖는 인간화된
변이체의
SPR
평가
인간화된 VL 변이체는 2+1 고전적 포맷(도 1D)으로 키메라로서 평가되고, 즉, 인간화된 경쇄 V-도메인은 뮤린 중쇄 V-도메인과 짝을 이뤘다. SPR 평가는 프로테온(ProteOn) XPR36 계측기[바이오-라드(Bio-Rad)]로 수행하였다. 더욱 정확히 말하면, 변이체는 항-Fab 유도체화된 GLM 센서칩(염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이적, 잭슨 이뮨리서치)에서 수직 방향으로 배양 상청액으로부터 직접 포획하였다. 하기 분석물은 이후 단일 농도로서 수평으로 주사되어 인간 및 시노몰구스 CD3ε에 대한 결합을 평가하였다: 각각 3 μM hu CD3ε(-1-26)-Fc(놉)-avi(ID807) 및 2.5 μM cy CD3ε-(-1-26)-Fc(놉)-Avi-Fc(홀)(ID873). 결합 반응은 정성적으로 뮤린 대조군 구축물의 결합을 정성적으로 비교하고, +(필적할만한 결합이 관찰됨), +/-(결합 감소가 관찰됨) 및 -(결합이 관찰되지 않음)로 등급이 나눠졌다. 포획 항체는 리간드 포획의 각각의 주기 및 분석물 결합 후 재생성되고, 뮤린 구축물은 연구의 끝에 재주사하여 포획 표면의 활성을 확인하였다. 상기 결과는 하기 표 3에 요약하였다.
실시예 4
CD3
ε 특이성을 갖는 인간화된 공통
경쇄의
특성
인간화된 납 분자를 위해 선택된 경쇄 V-도메인 변이체는 VL7_46-13이다. 인간성 정도, 즉, 인간 생식계열 V-도메인 서열에 대한 인간화된 V-도메인의 서열 동일성이 측정되었다. VL7_46-13의 경우, 가장 가까운 인간 생식계열 동족체와의 전체 서열 동일성은 인간화 전에 65%이고 인간화 이후 80%이다. CDR 영역을 제외하면, 가장 가까운 인간 생식계열 동족체와의 서열 동일성은 92%이다. 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, VL7_46-13은 모 뮤린 항체에 결합할 수 있게 보이고 또한 시노몰구스 CD3ε에 대한 이의 교차 반응성을 보유하는 13개 변이체의 패널 중 유일한 인간화된 VL 변이체이다. 이 결과는, CDR1에서 G24를 유지하면서 뮤린 프레임워크 잔기(특히 G46)에 대한 여러 복귀-돌연변이를 필요로 하는 CD3ε에 대해 결합 친화성을 잃지 않고 뮤린 VL-도메인을 인간화하는 것이 사소한 것이 아님을 나타낸다. 또한, 이 결과는 VL-도메인이 표적 인식에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 중요하게는, γ 유형의 V-도메인 계열 7에 속하고 CD3ε에 대한 친화성 및 특이성을 보유하는 희귀한 인간 생식계열에 기초한 인간화된 VL-도메인 VL7_46-13이, 또한 Fab-포맷의 파지-디스플레이 항체 라이브러리에서 공통 경쇄로서 사용하기에 적합하고, CD3ε 및 예를 들면, 종양 표적에 결합하고 동일한 "공통" 경쇄를 공유하는 이중특이적 분자의 발생 및 생성을 매우 용이하게 하는 신규한 특이성에 대하여 성공적인 선별을 할 수 있게 한다.
실시예 5
HVK1-39로부터 유도된 인간 생식계열 공통 경쇄를 사용하여 파지 디스플레이 항체 라이브러리의 생성
전장 인간 IgG와 유사한 이중특이적 항체를 생성하는 여러 접근법은 2개의 별도의 중쇄의 헤테로다이머화를 유도하는 Fc 영역에서의 변형을 이용한다. 이러한 예는 놉-인투-홀(문헌[Merchant et al., Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81]) SEED(문헌[Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202]) 및 정전기 스티어링 기술(문헌[Gunasekaran et al., J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46])을 포함한다. 이러한 접근법이 2개의 별도의 중쇄의 헤테로다이머화에 효과적일 수 있을지라도, 동족 경쇄 및 중쇄의 적절한 접합은 문제로 남아 있다. 공통 경쇄(LC)의 사용은 이 문제를 해결할 수 있다(문헌[Merchant, et al. Nat Biotech 16, 677-681(1998)]).
본원은 M13 파지에서 디스플레이를 위한 항체 라이브러리의 생성을 기재한다. 본질적으로, 1개의 불변(또는 "공통") 경쇄를 갖는 중쇄에 대한 다중 프레이워크 라이브러리를 설계하였다. 이 라이브러리는 경쇄 짝짓기오류를 피하기 위해 정교한 기술을 사용할 필요없이 다중특이적 항체를 생성하기 위해 설계된다.
공통 경쇄를 사용함으로써, 이러한 분자의 생성은 짝짓기오류가 더 이상 발생하지 않고 촉진될 수 있고, 고도로 순수한 이중특이적 항체의 단리가 촉진된다. 다른 포맷과 비교하여, 빌딩 블록으로서 Fab 단편의 사용은 예를 들면, scFv 단편의 사용이 더 큰 열 안정성, 및 scFv 응집 및 분자간 scFv 형태의 결핍을 야기하는 것과는 대조적이다.
라이브러리 생성
하기에서, M13 파지에서 디스플레이를 위한 항체 라이브러리의 생성이 기재된다. 특히, 본 발명자들은 1개의 불변(또는 "공통") 경쇄를 갖는 중쇄에 대하여 다중 프레임워크 라이브러리를 설계하였다.
라이브러리에서 하기 중쇄를 사용하였다(괄호는 젠뱅크 수탁 번호임):
IGHV1-46*01(X92343)(서열번호 104),
IGHV1-69*06(L22583)(서열번호 105),
IGHV3-15*01(X92216)(서열번호 106),
IGHV3-23*01(M99660)(서열번호 107),
IGHV4-59*01(AB019438)(서열번호 108),
IGHV5-51*01(M99686)(서열번호 109).
모든 중쇄는 IGHJ6 서열을 사용하는 IGHV1-69*06을 제외하고, J-요소로서 IGHJ2를 사용하였다. 무작위 추출의 디자인은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이 포함되었다. CDR-H1 및 CDR-H2의 경우, "가벼운" 무작위 추출 전략이 선택되었고, 무작위 추출 올리고뉴클레오티드는 생식계열 서열의 아미노산에 대한 코돈이 50%로 존재하도록 하였다. 시스테인을 제외한 모든 다른 아미노산은 나머지 50%를 위해 합산하였다. 유전적 D-요소의 존재로 인해 생식계열 아미노산이 존재하지 않는 CDR-H3에서, 올리고뉴클레오티드는, V-요소와 J-요소 사이에 4 내지 9개 아미노산의 길이의 무작위 추출된 삽입의 사용을 허용하여 설계하였다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 이들의 무작위 추출된 부분에 함유된다. 3개의 아미노산 G/Y/S는 각각 15%로 존재하고, 그러한 아미노산 A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E는 각각 4.6%로 존재한다.
항체 라이브러리의 생성을 위한 예시적인 방법은 문헌[Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413]; 및 문헌[Lee et., al J. Mol. Biol.(2004) 340, 1073-1093]에 기재되어 있다.
경쇄는 인간 서열 hVK1-39로부터 유도되고, 변경되지 않고 비-무작위 추출된 방식에 사용된다. 이는 동일한 경쇄가 추가의 변형 없이 다른 프로젝트레 사용될 수 있음을 보장한다.
예시적인 라이브러리 선별
모든 친화성 성숙 라이브러리를 갖는 선별은 표적 항원 X의 단량체 및 비오틴화된 세포외 도메인을 사용하여 하기 과정에 따라 용액에서 수행된다.
1. 각각의 라이브러리의 1012개 파지미드(phagemid) 입자를 100 nM 비오틴화된 가용성 항원에 0.5 시간 동안 1 ml의 총 부피로 결합시킨다.
2. 비오틴화된 항원을 포획하고, 구체적으로 결합된 파지 입자를 약 5 x 107 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 10 분 동안 첨가하여 단리한다.
3. 비드를 1 ml의 5 내지 10x PBS/트윈20 및 1 ml의 5 내지 10x PBS를 사용하여 세척한다.
4. 1 ml의 100 mM TEA(트라이에틸아민)을 10 분 동안 첨가하고 500 ㎕의 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)을 첨가하여 중화하여 파지 입자를 용해한다.
5. 기하급수적으로 성장하는 에스케리키아 콜라이 TG1 박테리아의 재감염, 헬퍼 파지 VCSM13로 감염 및 이후 파지미드 입자의 PEG/NaCl 침전을 후속 선발에 적용한다.
선별은 항원 농도를 유지하거나 감소시켜(10-7 M 내지 2 x 10-9 M) 3 내지 5 라운드에 걸쳐 수행하였다. 2 라운드에서, 스트렙타비딘 비드 대신에 뉴트라비딘 플레이트를 사용하여 항원/파지 복합체의 포획을 수행하였다. 모든 결합 반응 생성물에 플라스틱 지지체에 대한 항체의 단지 접착 결합으로부터 발생하는 원치않은 클론과 경쟁하기 위해 100 nM 소 혈청 알부민, 또는 무지방 분유를 보충하였다.
선별은 항원의 항원 농도를 100 nM에서 시작하여 최종 선발시 5 nM까지 감소시켜 3 또는 4 라운드에 걸쳐 수행하였다. 특이적 결합제는 배경보다 약 5배 높은 신호로서 정의되고 ELISA에 의해 확인되었다. 특이적 결합제는 ELISA에 의해 다음과 같이 확인되었다: 웰당 100 ㎕의 10 nM 비오틴화된 항원을 뉴트라비딘 플레이트에 코팅하였다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고 결합하는 Fab를 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 이들의 Flag-태그를 통해 검출하였다. ELISA-양성 클론은 96-웰 포맷에서 가용성 Fab 단편으로서 박테리아에 의해 발현되고 상청액은 프로테온 XPR36[바이오라드(BioRad)]를 사용하여 SPR-분석에 의해 운동 선별 실험에 이용하였다. 가장 높은 친화 상수를 갖는 Fab를 발현하는 클론을 확인하고, 상응하는 파지미드를 서열확인하였다. 추가 특성 규명을 위해, Fab 서열을 파지미드로부터 PCF을 통해 증폭시키고 적절한 제한 부위를 통해 포유동물 생성을 위한 인간 IgG1 발현 벡터에 클로닝하였다.
인간화된 CD3ε 특이적 공통 경쇄를 사용하여 파지 디스플레이 항체 라이브러리의 생성
M13 파지에서 디스플레이를 위한 항체 라이브러리의 생성을 기재하였다. 필수적으로, 1개의 불변(또는 "공통") 경쇄를 갖는 중쇄에 대한 다중 프레임워크 라이브러리를 설계하였다. 이 라이브러리는 Fc를 함유하지만, 1 또는 2개의 Fab가 종양 세포에서 발현되는 종양 표면 항원을 인식하지만 항체의 남아있는 Fab 아암이 T 세포에서 CD3ε를 인식하는 IgG1 P329G LALA 또는 IgG4 SPLE PG 이소타입의 FcgR 결합 비활성 이중특이적 T 세포 항체의 생성을 위해 설계되었다.
라이브러리 생성
하기에서, M13 파지에서 디스플레이를 위한 항체 라이브러리의 생성이 기재된다. 필수적으로, 1개의 불변(또는 "공통") 경쇄를 갖는 중쇄에 대한 다중 프레임워크 라이브러리를 설계하였다. 이 라이브러리는 Fc를 함유하지만, IgG1 P329G LALA 또는 IgG4 SPLE PG 이소타입의 FcgR 결합 비활성 이중특이적 T 세포 항체를 위해서만 설계된다.
다양성은 무작위 추출 올리고뉴클레오티드를 통해 상이한 중쇄의 CDR3에서만 도입되었다. 항체 라이브러리의 생성 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 문헌[Hoogenboom et al., Nucleic Acids. 1991, 19, 4133-413]; 또는 문헌[Lee et., al J. Mol. Biol.(2004) 340, 1073-1093]에 기재되어 있다.
라이브러리에서 하기 중쇄를 사용하였다:
IGHV1-46*01(X92343)(서열번호 104),
IGHV1-69*06(L22583)(서열번호 105),
IGHV3-15*01(X92216)(서열번호 106),
IGHV3-23*01(M99660)(서열번호 107),
IGHV4-59*01(AB019438)(서열번호 108),
IGHV5-51*01(M99686)(서열번호 109).
본 발명자들은 라이브러리에서 인간화된 인간 및 시노몰구스 CD3ε 특이적 항체 CH2527로부터 유도된 경쇄를 사용하였다(VL7_46-13; 서열번호 112). 이 경쇄는 무작위 추출되지 않았고 상이한 이중특이적 결합제와의 호환성을 보장하기 위해 임의의 추가 변형 없이 사용되었다.
모든 중쇄는 IGHJ6 서열을 사용하는 IGHV1-69*06을 제외하고, J-요소로서 IGHJ2를 사용한다. 무작위 추출의 설계는 CDR-H3에만 중점을 두고, PCR 올리고뉴클레오티드는 V-요소와 J-요소 사이에 4 내지 9개 아미노산 길이의 무작위 추출된 삽입의 사용을 허용하도록 설계되었다.
실시예 6
FolR1에 대한 공통 경쇄 라이브러리(CD3ε 특이성을 갖는 경쇄를 포함함)로부터 항체 단편의 선별
CD3ε 특이성을 갖는 공통 경쇄 VL7_46-13을 포함하는 항체 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8, 19H3, 20G6 및 20H7을 FolR1의 상이한 종(인간, 시노몰구스 및 뮤린)에 대한 파지 디스플레이 선별에 의해 수득하였다. 클론 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 21D1, 16F12, 19H3, 20G6 및 20H7은 공통 경쇄가 인간 생식계열 VH1_46에 기초한 중쇄 레퍼토리와 짝을 이루는 하위-라이브러리로부터 선택하였다. 이러한 하위-라이브러리에서, VH1_46의 CDR3을 6개의 상이한 CDR3 길이에 기초하여 무작위 추출하였다. 클론 16D5, 15E12, 21A5 및 21G8은 공통 경쇄가 인간 생식계열 VH3_15에 기초한 중쇄 레퍼토리와 짝을 이루는 하위-라이브러리로부터 선택하였다. 이러한 하위-라이브러리에서, VH3_15의 CDR3은 6개의 상이한 CDR3 길이에 기초하여 무작위 추출하였다. 종 교차반응성(또는 뮤린 FolR1-반응성) 항체를 수득하기 위해, 상이한 종의 FolR1을 3 라운드의 바이오패닝(biopanning)에 걸쳐 상이한 방식으로 대체하였다(또는 지속하였다): 16A3 및 15A1(인간-시노몰구스-인간 FolR1); 18D3(시노몰구스-인간-뮤린 FolR1); 19E5 및 19A4(뮤린 FolR1에 대하여 3 라운드); 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8(인간-시노몰구스-인간 FolR1); 19H3, 20G6 및 20H7(뮤린 FolR1에 대하여 3 라운드).
파지 디스플레이 선별뿐만 아니라 ELISA-기초 및 SPR-기초 선별을 위한 항원으로서 인간, 뮤린 및 시노몰구스 FolR1은 HEK EBNA 세포에서 N-말단 단량체 Fc-융합으로 일시적으로 발현되고 수용체 쇄(Fc 놉 쇄)를 보유하는 Fc 부분의 C-말단에서 위치된 avi-tag 인식 서열로서 BirA 비오틴 리가아제의 공동-발현을 통해 생체내 부위-특이적으로 비오틴화된다. FolR1에 대한 특이성을 평가하기 위해, 2개의 관련된 수용체인 인간 FolR2 및 FolR3을 동일한 방식으로 생성하였다.
선발(바이오패닝)을 하기 패턴에 따라 용액 중에서 수행하였다:
1. 10 ㎍/㎖의 관련없는 인간 IgG로 코팅된 맥시소르프 플레이트에서 약 1012개 파지미드 입자를 예비 세척하여 항원의 Fc-부분을 인식하는 항체의 라이브러리를 고갈시킨다.
2. 1 ml의 최종 부피의 Fc-결합제의 추가 감소를 위해 비-Fc-결합 파지미드 입자를 100 nM 비오틴화된 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 FolR1과 0.5 시간 동안 100 nM 관련없는 비-비오틴화된 Fc 놉-인투-홀 구축물의 존재하에 항온처리한다.
3. 비오틴화된 FolR1을 포획하고 10분 동안 뉴트라비딘 예비-코팅된 마이크로역가 플레이트(1 및 3 라운드)의 4개 웰로 옮겨 특이적 결합 파지를 부착시킨다.
4. 각각의 웰을 5x PBS/트윈20 및 5x PBS를 사용하여 세척한다.
5. 웰당 250 ㎕의 100 mM TEA(트라이에틸아민)을 10 분 동안 첨가하고 500 ㎕의 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)을 첨가하여 중화시켜 파지 입자를 용해하여 4개의 웰로부터 용해물을 모았다.
6. Fc-특이적 및 비특이적 결합제의 최종 제거를 위해 뉴트라비딘 예비-코팅된 마이크로역가 플레이트에서 항온처리에 의해 중화된 용해물을 100 nM 비오틴-포획된 FolR2 또는 FolR3으로 후속 세척한다 .
7. 로그-파지 에스케리키아 콜라이 TG1 세포를 융출된 파지 입자의 상청액으로 재감염시키고, 헬퍼파지 VCSM13으로 감염시키고, 진탕기에서 30℃에서 밤새 항온처리하고 이후 다음 선발에 사용하기 위해 파지미드 입자를 PEG/NaCl 침전시킨다.
선별은 100 nM의 불변 항원 농도를 사용하여 3 라운드에 걸쳐 수행하였다. 2 라운드에서, 뉴트라비딘에 대한 결합제의 풍부를 피하기 위해, 항원:파지 복합체의 포획은 5.4 x 107개의 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 첨가하여 수행하였다. 특이적 결합제는 다음과 같이 ELISA로 확인하였다: 100 ㎕의 25 nM 비오틴화된 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 FolR1 및 10 ㎍/㎖의 인간 IgG를 각각 뉴트라비딘 플레이트 및 맥시소르프 플레이트에 코팅하였다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고 결합하는 Fab는 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 이들의 Flag-태그를 통해 검출하였다. 인간 FolR1에서 신호를 나타내고 인간 IgG에서 음성인 클론을 추가 분석을 최종 후보자 명단에 넣고 FolR1의 남아있는 2종에 대하여 유사한 방식으로 시험하였다. 이들은 0.5 L 배양 부피에서 박테리아에 의해 발현되고, 친화성 정제하고 바이오라드의 프로테온 XPR36 바이오센서를 사용하여 SPR-분석에 의해 추가로 특성 규명하였다.
선별된 클론의 친화성(KD)은 25℃에서 프로테온 XPR36 계측기(바이오라드)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 비오틴화된 인간, 시노몰구스 및 뮤린 FolR1 뿐만 아니라 뉴트라비딘 포획에 의해 NLC 칩에 고정시킨 인간 FolR2 및 FolR3(음성 대조군)에 의해 측정되었다.
항원(리간드)의 고정화: 재조합 항원을 PBST(10 mM 포스페이트, 150 mM 나트륨 클로라이드 pH 7.4, 0.005% 트윈20)로 10 ㎍/㎖까지 희석한 후, 30 ㎕/분으로 수직 방향을 주사하였다.
분석물의 주입: '1회 운동' 측정을 위해, 주입 방향을 수평 방향으로 바꾸고, 2배 연속 희석의 정제된 Fab(농도 범위 달라짐)를 별도의 채널 1 내지 5에 따라, 200 초의 회합 시간 및 600 초의 해리 시간으로 동시에 주사하였다. 완충액(PBST)을 6번째 채널에 따라 주사하여 기준을 위해 "인-라인" 블랭크를 막았다. 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)는 회합 및 해리 센서그램을 동시에 맞추어 프로테온 매니저 v3.1 소프트웨어에서 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon 비로 계산하였다. 표 4는 FolR1에 대하여 특이적으로 선별된 클론의 평형 해리 상수(KD)를 열거한다.
실시예 7
유전적 다중-
프레임워크
라이브러리로부터
FolR1
까지 항체 단편의 선별
항체 11F8, 36F2, 9D11, 5D9, 6B6 및 14E4는 FolR1의 상이한 종(인간, 시노몰구스 및 뮤린)에 대하여 유전적 다중-프레임워크 하위라이브러리에 기초하여 선별된 파지 디스플레이에 의해 수득하였다. 이러한 다중-프레임워크 하위라이브러리에서, 무작위 추출된 CDR3(3개의 상이한 길이)을 갖는 상이한 VL-도메인은 무작위 추출된 CDR3(6개의 상이한 길이)을 갖는 상이한 VH-도메인과 짝을 이룬다. 선별된 클론은 하기 VL/VH 짝짓기이다: 11F8(Vk_1_5/VH_1_69), 36F2(Vk_3_20/VH_1_46), 9D11(Vk2D_28/VH1_46), 5D9(Vk3_20/VH1_46), 6B6(Vk3_20/VH1_46), 및 14E4(Vk3_20/VH3_23). 종 교차반응성(또는 뮤린 FolR1-반응성) 항체를 수득하기 위해, FolR1의 상이한 종을 3 또는 4 라운드의 바이오패닝에 걸쳐 상이한 방식으로 대체하였다(또는 지속하였다): 11F8(시노몰구스-뮤린-인간 FolR1); 36F2(인간-뮤린-시노몰구스-뮤린 FolR1); 9D11(시노몰구스-인간-시노몰구스 FolR1); 5D9(인간-시노몰구스-인간 FolR1); 6B6(인간-시노몰구스-인간 FolR1) 및 14E4(뮤린 FolR1에 대하여 3 라운드).
파지 디스플레이 선별, 뿐만 아니라 ELISA-계 및 SPR-계 선별을 위한 항원으로서 인간, 뮤린 및 시노몰구스 FolR1은 HEK EBNA 세포에서 N-말단 단량체 Fc-융합으로 일시적으로 발현되고 수용체 쇄(Fc 놉 쇄)를 보유하는 Fc 부분의 C-말단에서 위치된 avi-tag 인식 서열에서 BirA 비오틴 리가아제의 공동-발현을 통해 생체내 부위-특이적으로 비오틴화하였다. FolR1에 대한 특이성을 평가하기 위해, 2개의 방출된 수용체(인간 FolR2 및 FolR3)를 동일한 방식으로 생성하였다.
선발(바이오패닝)은 하기 패턴에 따라 용액에서 수행하였다:
1. 10 ㎍/㎖의 관련없는 인간 IgG로 코팅된 맥시소르프 플레이트에서 약 1012개 파지미드 입자를 예비 세척하여 항원의 Fc-부분을 인식하는 항체의 라이브러리를 감소시킨다.
2. 1 ml의 총 부피에서 Fc-결합제의 추가 감소를 위해 Fc-결합하지 않은 파지미드 입자를 100 nM 비오틴화된 인간, 시노몰구스, 또는 뮤린 FolR1과 0.5 시간 동안 100 nM 관련없는 비오틴화 되지않은 Fc 놉-인투-홀 구축물의 존재하에 항온처리한다.
3. 비오틴화된 FolR1을 포획하고 10 분 동안 뉴트라비딘 예비-코팅된 마이크로역가 플레이트의 4개 웰로 옮겨 특이적으로 결합하는 파지를 부착시킨다(1 및 3 라운드에서).
4. 각각의 웰을 5x PBS/트윈20 및 5x PBS를 사용하여 세척한다.
5. 웰당 250 ㎕의 100 mM TEA(트라이에틸아민)를 10 분 동안 첨가하고 500 ㎕의 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)을 첨가하여 중화하여 파지 입자를 용해하여 4개 웰로부터 용리물을 모았다.
6. Fc-특이적 및 비특이적 결합제의 최종 제거를 위해 뉴트라비딘 예비-코팅된 마이크로역가 플레이트에서 100 nM 비오틴-포획된 FolR2 또는 FolR3과 함께 항온처리하여 중화된 용리물을 후속 세척한다.
7. 로그-파지 에스케리키아 콜라이 TG1 세포를 융출된 파지 입자의 상청액으로 재감염시키고, 헬퍼파지 VCSM13으로 감염시키고, 진탕기에서 30℃에서 밤새 항온처리하고 이후 다음 선발에 사용하기 위해 파지미드 입자를 PEG/NaCl 침전시킨다.
선별은 100 nM의 불변 항원 농도를 사용하여 3 라운드에 걸쳐 수행하였다. 2 및 4 라운드에서, 뉴트라비딘에 결합체의 풍부를 피하기 위해, 항원:파지 복합체의 포획은 5.4 x 107개의 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 첨가하여 수행하였다. 특이적 결합제는 다음과 같이 ELISA로 확인하였다: 100 ㎕의 25 nM 비오틴화된 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 FolR1 및 10 ㎍/㎖의 인간 IgG를 각각 뉴트라비딘 플레이트 및 맥시소르프 플레이트에 코팅하였다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고 결합하는 Fab는 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 이들의 Flag-태그를 통해 검출하였다. 인간 FolR1에서 신호를 나타내고 인간 IgG에서 음성인 클론을 추가 분석을 최종 후보자 명단에 넣고 FolR1의 남아있는 2종에 대하여 유사한 방식으로 시험하였다. 이들은 0.5 L 배양 부피에서 박테리아에 의해 발현되고, 친화성 정제하고 바이오라드의 프로테온 XPR36 바이오센서를 사용하여 SPR-분석에 의해 추가로 특성 규명하였다.
선별된 클론의 친화성(KD)은 25℃에서 프로테온 XPR36 계측기(바이오라드)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 비오틴화된 인간, 시노몰구스 및 뮤린 FolR1 뿐만 아니라 뉴트라비딘 포획에 의해 NLC 칩에 고정시킨 인간 FolR2 및 FolR3(음성 대조군)에 의해 측정되었다.
항원(리간드)의 고정화: 재조합 항원을 PBST(10 mM 포스페이트, 150 mM 나트륨 클로라이드 pH 7.4, 0.005% 트윈20)로 10 ㎍/㎖까지 희석한 후, 30 ㎕/분으로 수직 방향을 주사하였다.
분석물의 주입: '1회 운동' 측정을 위해, 주입 방향을 수평 방향으로 바꾸고, 2배 연속 희석의 정제된 Fab(농도 범위 달라짐)를 별도의 채널 1 내지 5에 따라, 150 또는 200 초의 회합 시간 및 200 또는 600 초의 해리 시간으로 각각 동시에 주사하였다. 완충액(PBST)을 6번째 채널에 따라 주사하여 기준을 위해 "인-라인" 블랭크를 막았다. 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)는 회합 및 해리 센서그램을 동시에 맞추어 프로테온 매니저 v3.1 소프트웨어에서 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon 비로 계산하였다. 표 5는 FolR1에 대하여 특이적으로 선별된 클론의 평형 해리 상수(KD)를 열거한다.
실시예 8
IgG
및
이중특이적
T 세포 포맷에서
신규한
FolR1
결합제의 생성 및 정제
선별된 표적 세포의 T 세포 의존적 사멸을 유도할 수 있는 FolR1 결합제를 확인하기 위해, 공통 경쇄- 또는 Fab-라이브러리로부터 단리된 항체를 상응하는 인간 IgG1 포맷으로 전환하였다. 간단히 말해, 파지 디스플레이로부터 독특한 FolR1 결합제의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 주형으로서 Fab 클론을 사용하여 표준 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. PCR 생성물을 정제하고 적절한 인간 불변 중쇄 또는 인간 불변 경쇄에 융합되는 적합한 발현 벡터로 삽입하였다(제한 엔도뉴클레아제 및 리가아제 기초한 클로닝에 의해, 또는 인비트로겐(Invitrogen)의 투입 키트를 사용하여 "재조합"에 의해). 이러한 벡터에서 발현 카세트는 키메라 MPSV 프로모터 및 합성 폴리아데닐화 부위로 이루어진다. 또한, 플라스미드는 EBV 핵 항원(EBNA)을 보유하는 HEK293 세포에서 플라스미드의 안정한 유지를 위해 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus)로부터의 oriP 영역을 함유한다. PEI 매개된 형질감염 후, 항체를 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성하고 기재된 바와 같이 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피 이어서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
일시적 형질감염 및 생성
본원에 사용된 모든 (이중특이적) 항체(상업적 공급처로부터 수득되지 않은 경우)는 후술된 필요한 벡터를 위해 PEI 매개된 형질감염 방법을 사용하여 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성되었다. HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 경작하였다. 500 ml 쉐이크 플라스크에서 생성을 위해, 4 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다(대안적인 규모를 위해 모든 양은 이에 따라 조정됨). 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg으로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml의 CD CHO 배지 중에서 200 ㎍의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI 용액을 첨가한 후 15 초 동안 볼텍싱한 후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 쉐이크 플라스크로 옮기고 항온처리기에서 5% CO2 대기하에 37℃에서 3 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 160 ml의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 경작하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 첨가하였다. 7일 후 배양 상청액을 수집하여 15 분 동안 210 xg으로 원심분리하여 정제하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 0.01% w/v의 최종 농도의 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다. 생성 후, 상청액을 수확하고, 상청액을 함유하는 항체를 0.22 μm 멸균 필터를 통해 여과하고 정제할 때까지 4℃에서 저장하였다.
항체 정제
모든 분자는 표준 방법, 예컨대 단백질 A 친화성 정제[아크타 익스플로러(Akta Explorer)] 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 2 단계로 정제하였다. 일시적 생성물로부터 수득된 상청액을 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)으로 조정하고 8 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5)로 평형시킨 하이트랩 PA FF(지이 헬쓰케어, 컬럼 용량(cv) = 5 ml)에 적용하였다. 10 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 구배를 사용하여 12 cv 이상의 버퍼 B(20 mM 나트륨 시트레이트, pH 3, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 용액의 pH를 pH 6.0(0.5 M Na2HPO4, pH 8.0 사용)으로 완만하게 조정하였다. 샘플을 울트라 농축기[비바스핀(Vivaspin) 15R 30,000 MWCO HY, 사르토리우스(Sartorius)]를 사용하여 2 mL까지 농축하고 이후 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, 0.01% 트윈20, pH 6.0으로 평형시킨 하이로드(상표) 16/60 슈퍼덱스(상표) 200 제조 구배(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용리된 분획의 응집물 함량을 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 이에 따라, 30 ㎕의 각각의 분획을 25℃에서 실행 완충액(25 mM K2HPO4 + 125 mM NaCl + 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드 + 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7))으로 평형시킨 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)에 적용하였다. 2% 미만의 올리고머를 함유하는 분획을 모으고 울트라 농축기(비바스핀 15R 30,000 MWCO HY, 사르토리우스)를 사용하여 1 내지 1.5 mg/㎖의 최종 농도로 농축하였다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영에 의해 분석하였다. 정제된 단백질을 액체 N2에서 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
시험관내 특징 결과에 기초하여, 선별된 결합제를 이중특이적 T 세포 포맷으로 전환하였다. 이러한 분자에서, FolR1:CD3 결합 모이어티는 N-말단에서 위치되는 FolR1 Fab와 함께 2:1 순서로 배열된다. 표준 Fab 라이브러리로부터 단리된 클론의 경우, CD3 결합부를 교차Fab(CH1Cκ 교차)로서 생성하는 반면, 공통 경쇄 라이브러리로부터의 클론의 경우 교차는 필요하지 않았다. 이러한 이중특이적 분자는 IgG와 유사하게 생성하고 정제하였다.
실시예
9
2+1 및 1+1
이중특이적
T 세포 포맷
Fab 라이브러리(9D11)로부터 4개의 상이한 이중특이적 T 세포 포맷(1개의 공통 경쇄 결합제(16D5) 및 1개의 결합제에 대한 3개의 포맷)을 제조하여 이들의 시험관내 사멸 특성을 비교하였다.
표준 포맷은 이미 기재된 바와 같이 2+1 도립된 포맷이다(FolR1:CD3 결합 모이어티는 N-말단에서 위치된 FolR1 Fab와 함께 2:1 순서로 배열된다). 2+1 고전적 포맷에서, FolR1:CD3 결합 모이어티는 N-말단에서 위치되는 CD3 Fab와 함께 2:1 순서로 배열된다. 2개의 1가 포맷이 또한 제조되었다. 1+1 헤드-투-테일은 N-말단에서 위치된 FolR1 Fab와 함께 분자의 동일한 아암에서 1:1 순서로 배열된 FolR1:CD3 결합 모이어티를 갖는다. 1+1 고전적 포맷에서, FolR1:CD3 결합 모이어티는 분자의 1개의 아암에서 각각, 1회 존재한다. 9D11의 경우, 표준 Fab 라이브러리 CD3 결합부로부터 단리된 클론은 교차Fab(CH1Cκ 교차)로서 생성되는 반면, 공통 경쇄 라이브러리로부터 16D5의 경우 교차는 필요하지 않았다. 이러한 이중특이적 분자는 표준 도립된 이중특이적 T 세포 포맷과 유사하게 생성하고 정제하였다.
| 구축물 | 단량체 [%] ( SEC ) | 수율 |
| 16D5 FolR1 TCB 2+1 (도립된) | 96% | 5.4 mg/L |
| 16D5 FolR1 TCB 2+1 (고전적) | 90% | 4.6 mg/L |
| 16D5 FolR1 TCB 1+1 (헤드-투-테일) | 100 % | 5.4 mg/L |
| 16D5 FolR1 TCB 1+1 (고전적) | 100% | 0.7 mg/L |
| 9D11 FolR1 TCB 2+1 (도립된) | 100% | 2.6 mg/L |
| 9D11 FolR1 TCB 1+1 (헤드-투-테일) | 100% | 6.1 mg/L |
| 9D11 FolR1 TCB 1+1 (고전적) | 96% | 1.3 mg/L |
| Mov19 FolR1 TCB 2+1 (도립된) | 98% | 3 mg/L |
| Mov19 FolR1 TCB 1+1 (헤드-투-테일) | 100% | 5.2 mg/L |
실시예
10
표면
플라즈몬
공명에 의한
FolR1
결합제의 생화학적 특성 규명
IgG로서 또는 상이한 재조합 엽산 수용체에 대한 이중특이적 T 세포 포맷(인간 FolR1, 2 및 3, 뮤린 FolR1 및 시노몰구스 FolR1; 모두 Fc 융합물으로)에서 FolR1 결합제의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을 비아코어 T200에서 25℃에서 실행 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES, pH 7.4 + 0.15 M NaCl + 3 mM EDTA + 0.005% 계면활성제 P20; 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 수행하였다.
단일 주사
먼저, 항-FolR1 IgG를 단일 주사(표 1)에 의해 분석하여 이들의 교차반응성(인간, 뮤린 및 시노몰구스 FolR1에 대한) 및 특이성(인간 FolR1, 인간 FolR2 및 인간 FolR3에 대한)을 특성 규명하였다. 인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(FolR1-Fc) 또는 인간 엽산 수용체 2 및 3(FolR2-Fc, FolR3-Fc)의 재조합 비오틴화된 단량체 Fc 융합물을 표준 커플링 지침(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)을 사용하여 SA 칩에서 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 300 내지 400 RU였다. IgG를 60 초 동안 500 nM의 농도로 주사하였다. huFolR2 및 huFolR3에 결합하는 IgG는 특이성의 부족을 이유로 거절하였다. 대부분의 결합제는 인간과 시노몰구스 FolR1 사이에서만 교차반응성이고, 뮤린 FolR1에 대한 추가의 교차반응성은 대부분의 시간이 특이성의 손실과 함께 진행된다.
| 클론 명칭 | huFolR1 에 결합 | cyFolR1 에 결합 | muFolR1 에 결합 | huFolR2 에 결합 | huFolR3 에 결합 |
| Mov19 | + | + | - | - | - |
| 파를레투주맙 | + | + | - | - | - |
| 16A3 | + | + | +/- | - | - |
| 18D3 | + | + | - | - | - |
| 19E5 | + | + | + | + | + |
| 19A4 | - | - | + | + | + |
| 15H7 | + | + | + | - | - |
| 15B6 | + | + | - | - | - |
| 16D5 | + | + | - | - | - |
| 15E12 | + | + | +/- | + | + |
| 21D1 | + | + | +/- | - | - |
| 16F12 | + | + | - | - | - |
| 21A5 | + | + | - | - | +/- |
| 21G8 | + | + | - | + | + |
| 19H3 | - | - | + | - | - |
| 20G6 | - | - | + | - | - |
| 20H7 | - | - | + | - | - |
| 9D11 | + | + | - | - | - |
| 5D9 | + | + | - | + | + |
| 6B6 | + | + | - | + | + |
| 11F8 | + | + | + | + | + |
| 36F2 | + | + | + | - | - |
| 14E4 | - | - | + | - | - |
엽산 수용체 1에 대한 결합활성
항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 결합활성은 후술된 바와 같이 측정하였다(표 9).
인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(FolR1-Fc)의 재조합 비오틴화된 단량체 Fc 융합물을 표준 커플링 지침(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)을 사용하여 SA 칩에서 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 300 내지 400 RU였다. 항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포 항체를 180 초에 걸쳐 유동 세포를 통해 30 ㎕/분의 유속으로 2.1 내지 500 nM의 농도 범위에서 통과시켰다. 해리를 600 초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이는 재조합 비오틴화된 IL2 수용체 Fc 융합물로 고정시킨 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 19H3 IgG 및 뮤린 엽산 수용체 1의 상호작용을 분석하기 위해, 폴레이트(시그마 F7876)를 2.3 μM의 농도에서 HBS-EP 실행 완충액에 첨가하였다. IgG 또는 이중특이적 T 세포의 2가 결합으로부터 발생한 결합 곡선은 1:1 랭뮤어 결합에 근사치이고 그러한 모델과 맞았다(이는 정확하지 않지만 결합활성의 개념을 제공한다). 상호작용에 대한 분명한 결합 상수는 비아 이볼루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 맞춘 속도 상수로부터 유래된다.
| 분석물 | 리간드 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | 겉보기 KD (M) |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 8.31E+04 | 3.53E-04 | 4.24E-09 |
| cyFolR1 | 1.07E+05 | 3.70E-04 | 3.45E-09 | |
| 9 D11 TCB | huFolR1 | 1.83E+05 | 9.83E-05 | 5.36E-10 |
| cyFolR1 | 2.90E+05 | 6.80E-05 | 2.35E-10 | |
| 21A5 TCB | huFolR1 | 2.43E+05 | 2.64E-04 | 1.09E-09 |
| cyFolR1 | 2.96E+05 | 2.76E-04 | 9.32E-10 | |
| 36F2 IgG | huFolR1 | 2.62E+06 | 1.51E-02 | 5.74E-9 |
| cyFolR1 | 3.02E+06 | 1.60E-02 | 5.31E-9 | |
| muFolR1 | 3.7E+05 | 6.03E-04 | 1.63E-9 | |
| Mov19 IgG | huFolR1 | 8.61E+05 | 1.21E-04 | 1.4E-10 |
| cyFolR1 | 1.29E+06 | 1.39E-04 | 1.08E-10 | |
| 파를레투주맙 | huFolR1 | 1.23E+06 | 9E-04 | 7.3E-10 |
| cyFolR1 | 1.33E+06 | 8.68E-04 | 6.5E-10 | |
| 19 H3 IgG | muFolR1 | 7.1E+05 | 1.1E-03 | 1.55E-09 |
엽산 수용체 1에 대한 친화성
항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 친화성을 후술된 바와 같 측정하였다(표 10).
친화성 측정을 위해, 항-인간 Fab 특이적 항체의 약 6000 내지 7000 공명 단위(RU)의 직접 커플링(Fab 캡쳐 키트, 지이 헬쓰케어)을 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩에서 수행하였다. 항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포를 20 또는 40 초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 20 nM에서 포획하고, 기준 유동 세포를 포획 없이 남겨두었다. 인간 또는 시노몰구스 엽산 수용체 1 Fc 융합물의 연속 희석(6.17 내지 500 nM 또는 12.35 내지 3000 nM)를 120 또는 240 초 동안 30 ㎕/분으로 모든 유동 세포에 통과시켜 회합 단계를 기록하였다. 해리 단계를 240 초 동안 모니터링하고 샘플 용액으로부터 HBS-EP로의 스위칭을 촉발시켰다. 칩 표면은 60 초, 10 mM 글리신-HCl(pH 2.1 또는 pH 1.5)의 이중 주사를 사용하여 모든 사이클 후 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 1에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 상호작용에 대한 친화 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 맞추어 속도 상수로부터 유래된다.
| 리간드 | 분석물 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | KD (M) |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 1.53E+04 | 6.88E-04 | 4.49E-08 |
| cyFolR1 | 1.32E+04 | 1.59E-03 | 1.21E-07 | |
| 9 D11 TCB | huFolR1 | 3.69E+04 | 3.00E-04 | 8.13E-09 |
| cyFolR1 | 3.54E+04 | 2.06E-04 | 5.82E-09 | |
| 21A5 TCB | huFolR1 | 1.79E+04 | 1.1E-03 | 6.16E-08 |
| cyFolR1 | 1.48E+04 | 2.06E-03 | 1.4E-07 | |
| Mov19 IgG | huFolR1 | 2.89E+05 | 1.59E-04 | 5.5E-10 |
| cyFolR1 | 2.97E+05 | 1.93E-04 | 6.5E-10 | |
| 파를레투주맙 | huFolR1 | 4.17E+05 | 2.30E-02 | 5.53E-08 |
| cyFolR1 | 5.53E+05 | 3.73E-02 | 6.73E-08 |
CD3
에 대한 친화성
항-FolR1 이중특이적 T 세포와 재조합 인간 CD3εδ-Fc 사이의 상호작용의 친화성은 후술된 바와 같이 측정하였다(표 11).
친화성 측정을 위해, 항-인간 Fab 특이적 항체(Fab 캡쳐 키트, 지이 헬쓰케어)의 약 9000 공명 단위(RU)의 직접 커플링을 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 pH 5.0으로 CM5 칩에서 수행하였다. 항-FolR1 이중특이적 T 세포를 20 nM으로 10 ㎕/분의 유속으로 40 초 동안 포획하고, 기준 유동 세포를 포획 없이 남겨두었다. 인간 CD3εδ-Fc 융합물의 연속 희석(6.17 내지 500 nM)을 모든 유동 세포에서 30 ㎕/분으로 240 초 동안 통과시켜 회합 단계를 기록하였다. 해리 단계를 240 초 동안 모니터링하고 샘플 용액으로부터 HBS-EP로의 스위칭에 의해 촉발시켰다. 칩 표면을 10 mM 글리신-HCl(pH 2.1)의 60 초 이중 주사를 사용하여 모든 사이클 후 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 1에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 상호작용에 대한 친화 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 맞춰 속도 상수로부터 유래되었다.
| 리간드 | 분석물 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | KD (M) |
| 16 D5 TCB | huCD3 | 4.25E+04 | 3.46E-03 | 8.14E-08 |
| 21A5 TCB | huCD3 | 3.72E+04 | 3.29E-03 | 8.8E-08 |
CD3 결합부는 모든 구축물에 대하여 동일하고, 친화성은 측정된 이중특이적 T 세포(KD는 60 내지 90 nM 범위임)와 유사하다.
실시예 11
엽산 수용체 1 및
CD3
에서 동시 결합
이중특이적
T 세포
재조합 엽산 수용체 1 및 재조합 인간 CD3εδ-Fc에서 항-FolR1 이중특이적 T 세포의 동시 결합은 후술된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되었다. 인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(FolR1-Fc)의 재조합 비오틴화된 단량체 Fc 융합물은 표준 커플링 지침(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)을 사용하여 SA 칩에서 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 300 내지 400 RU였다. 항-FolR1 이중특이적 T 세포를 유동 세포를 통해 60 초 동안 500 nM로 30 ㎕/분의 유속으로 주사한 후, hu CDεδ-Fc를 60 초 동안 500 nM로 주사하였다. 벌크 굴절률 차이는 재조합 비오틴화된 IL2 수용체 Fc 융합물로 고정시킨 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 시험된 4개의 이중특이적 T 세포(16D5 TCB, 21A5 TCB, 51C7 TCB 및 45D2 TCB)는 예상된 바와 같이 엽산 수용체 1 및 인간 CD3에 동시에 결합할 수 있다.
실시예 12
에피토프
비닝
에피토프 비닝을 위해, 항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포를 최종 반응 약 700 RU로 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩에 직접 고정화하였다. 이어서, 500 nM huFolR1-Fc를 60 초 동안 포획한 후, 500 nM의 상이한 결합제를 30 초 동안 포획하였다. 표면은 10 mM 글리신(pH 2)의 2개 주사로 30 초 동안 각각 재생성하였다. 상이한 결합제가 고정시킨 결합제에 포획된 huFolR1에 결합할 수 있는 경우를 추정하였다(표 12).
| 용액 중 분석물 | |||||||
| huFolR1에서 | 16D5 TCB | 21A5 TCB | 9D11 TCB | 36F2 IgG | Mov19 IgG | 파를레투주맙 | |
| 고정화됨 | 16D5 TCB | - | - | - | + | + | + |
| 21A5 TCB | - | - | - | + | + | + | |
| 9D11 TCB | 9D11 TCBFolR1에서 추가 결합은 9D11에서 포획시 가능하지 않음 | ||||||
| 36F2 IgG | huFolR1이 너무 빨리 분해되어 측정할 수 없음 | ||||||
| Mov19 IgG | + | + | +/- | - | - | - | |
이러한 결과 및 고정시킨 huFolR1에서 동시 결합을 갖는 추가의 데이터에 기초하여, 결합제를 3개의 군으로 분리하였다. 9D11이 분리 에피토프를 갖는 경우, 이는 모든 다른 결합제로 대체되기 때문에 분명하지 않다. 16D5 및 21A5는 동일한 군처럼 보이고, Mov19, 파를레투주맙(문헌[Coney et al., Cancer Res. 1991 Nov 15;51(22):6125-32] 및 문헌[Kalli et al., Curr Opin Investig Drugs. 2007 Dec;8(12):1067-73]) 및 36F2는 또 다른 군처럼 보인다(표 13). 그러나, 36F2는 인간, 시노몰구스 및 뮤린 FolR1에 결합하는 것처럼 Mov19 및 파를레투주맙보다 상이한 에피토프에 결합한다.
| 에피토프 1 | 에피토프 2 | 에피토프 3 |
| 16D5 | 9D11 | Mov19 |
| 21A5 | 파를레투주맙 | |
| 36F2 |
실시예
13
결합제의 선별
IgG 포맷에서 FolR1 결합제는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 및 세포에서 시험관내 분석에 의해 선정되어 최고의 후보자를 선택하였다.
항-FolR1 IgG를 SPR에 의해 분석하여 이들의 교차반응성(인간, 뮤린 및 시노몰구스 FolR1에 대한) 및 특이성(인간 FolR1, 인간 FolR2 및 인간 FolR3에 대한)을 특성 규명하였다. 인간 FolR2 및 FolR3에 대한 비특이적 결합은 제외 인자로 간주되었다. 인간 FolR1에 대한 결합 및 특이성은 세포에서 확인하였다. 일부 결합제는 SPR에서 재조합 인간 FolR1을 인식할지라도 FolR1을 발현하는 세포에 결합하지 않았다. 응집 온도는 측정되었지만 선별된 결합제가 모두 안정하기 때문에 제외 인자가 아니었다. 선별된 결합제를 다중반응성 ELISA에서 시험하여 비특이적 결합을 확인하고, 이는 4개 결합제의 제외를 야기하였다. 이 과정은 3개 결합제, 즉, 36F2(Fab 라이브러리), 9D11(Fab 라이브러리) 및 16D5(공통 경쇄)의 초기 선별을 야기하였다. 36F2는 huFolR1로부터 신속하게 분해되고, 따라서 초기에 선호하지 않았다.
실시예 14
인간
FolR1
양성 종양 세포에
신규하게
생성된
FolR1
결합제의 특이적 결합
신규한 FolR1 결합제를 파지 디스플레이를 통해 CD3 경쇄를 사용하여 Fab 라이브러리 또는 공통 경쇄 라이브러리를 사용하여 생성하였다. 확인된 결합제를 인간 IgG1 포맷으로 전환하고 HeLa 세포를 많이 발현하는 FolR1에 대한 결합을 입증하였다. 기준 분자로서 인간 FolR1 결합제 Mov19가 포함되었다. 이 분석에서 시험된 대부분의 결합제는 Mov19과 같이 매우 동일하게 결합하는 일부 클론을 갖는 FolR1에 대한 우수한 결합을 중간으로 나타내었다(도 2 참조). 클론 16A3, 18D3, 15H7, 15B6, 21D1, 14E4 및 16F12는 세포에서 FolR1에 대한 결합이 유동 세포계측법으로 확인될 수 없었기에 제외하였다. 다음 단계에서, 밀접한 관계가 있는 인간 FolR2에 대한 결합을 제외하여 선별된 클론을 인간 FolR1에 대한 특이성에 대하여 시험하였다. HEK 세포를 인간 FolR1 또는 인간 FolR2로 일시적으로 형질감염시켜 특이성을 입증하였다. Fab 라이브러리로부터 유래된 클론 36F2 및 9D11, 및 CLC 라이브러리로부터 유래된 클론 16D5 및 21A5는 인간 FolR1에 특이적으로 결합하고 인간 FolR2에 결합하지 않는다(도 3a 및 3b 참조). 모든 다른 시험된 클론은 인간 FolR2에 대한 최소한의 일부 결합을 나타내었다(도 3a 및 3b 참조). 따라서, 이러한 클론은 추가 특성 규명으로부터 제외되었다. 동일하게, 시노몰구스 FolR1에 대한 FolR1 클론의 교차 반응성은 시노몰구스 FolR1로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에 대한 결합 연구를 수행하여 입증하였다. 모든 시험된 클론은 시노몰구스 FolR1에 결합할 수 있고, 4개의 선별된 인간 FoLR1 특이적 클론 36F2, 9D11, 16D5 및 21A5는 인간 및 시노몰구스 FoLR1에 필적하게 잘 결합된다(도 4 참조). 이후 3개의 인간 FolR1 특이적 시노몰구스 교차반응성 결합제를 TCB 포맷으로 전환하고 T 세포 사멸 및 T 세포 활성화를 유도하기 위해 시험하였다. 이러한 클론은 Fab 라이브러리로부터 9D11이었고 CLC 라이브러리로부터 16D5 및 21A5였다. 기준 분자로서 Mov19 FolR1 TCB가 모든 연구에 포함되었다. 이어서, 이러한 FolR1 TCB를 사용하여 HeLa 세포에서 FolR1에 결합 후 내재화의 유도를 비교하였다. 모든 3개의 시험된 클론을 Mov19 FoLR1 TCB의 결합시 내재화와 필적할만한 FolR1에 결합시 내재화하였다(도 5). 21A5 FolR1 TCB는 다중반응성의 징후로 인해 중단하였다.
실시예 15
FolR1
TCB
항체에 의해 유도된
FolR1
-발현 종양 표적 세포의 T 세포
매개된
사멸
FolR1 TCB를 사용하여 FoLR1을 발현하는 종양 세포의 T 세포 매개된 사멸을 측정하였다. 잠재적인 표적 세포주의 패널을 사용하여 퀴피키트 분석에 의해 FoLR1 결합 부위를 측정하였다.
종양 세포의 사용된 패널은 FolR1 높은, 중간 및 낮은 발현 종양 세포 및 FolR1 음성 세포주를 함유한다.
| 세포주 | 기원 | FolR1 결합 부위 |
| HeLa | 자궁경부 선암 | 2, 240,716 |
| Skov3 | 난소 선암 | 91,510 |
| OVCAR5 | 난소 선암 | 22,077 |
| HT29 | 직장결장 선암 | 10,135 |
| MKN45 | 위 선암 | 54 |
이 패널에 대한 종양 세포주의 3개의 상이한 FoLR1 TCB(9D11, 16D5 및 Mov19 결합제 함유)의 결합은 FoLR1 TCB가 FolR1 발현 종양 세포에 특이적으로 결합하고 FoLR1 음성 종양 세포주에 결합하지 않음을 나타내어 측정되었다. 결합된 구축물의 양은 FolR1 발현 수준에 비례하고 여전히 검출가능한 FolR1 적은 세포주 HT-29에 대한 구축물의 우수한 결합이 존재한다. 또한, 음성 대조군 DP47 TCB는 임의의 사용된 세포주에 결합하지 않는다(도 6a 내지 6e).
중간 발현하는 세포주 SKOV3 및 적게 발현하는 세포주 HT-29을 추가로 사용하여 16D5 TCB 및 9D11 TCB를 사용하는 T 세포 매개된 사멸 및 T 세포 활성화를 시험하였고; DP47 TCB는 음성 대조군으로서 포함하였다. 2개의 세포주는 이미 매우 낮은 수준의 16D5 TCB 및 9D11 TCB의 존재하에 사멸되었고 9D11 TCB가 16D5 TCB보다 FolR1에 더 강하게 결합할지라도 2개의 TCB 사이에 활성의 차이가 없었다. SKOV3 세포의 전체 사멸은 SKOV3 세포에서 FolR1의 높은 발현 수준을 반영하는 HT-29에 비해 더 높았다(도 7a 및 7b). 이에 따라, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 활성화 마커 CD25 및 CD69의 강한 상향조절이 검출되었다. T 세포의 활성화는 SKOV3 세포 및 HT-29 세포의 존재하에 매우 유사하였다. 음성 대조군 DP47 TCB는 사용된 농도에서 어떠한 사멸을 유도하지 않고 T 세포에서 CD25 및 CD69의 유의미한 상향조절은 없었다.
| 구축물 | 24 시간 후 사멸( pM ) | 48시간 후 사멸( pM ) | CD4 + CD69+ (%) | CD4 + CD25+ (%) | CD8 + CD69+ (%) | CD8 + CD25+ (%) |
| 9D11 FolR1 TCB | 1.1 | 0.03 | 0.51 | 0.46 | 0.019 | 0.03 |
| 16D5 FolR1 TCB | 0.7 | 0.04 | 0.34 | 0.33 | 0.025 | 0.031 |
| 구축물 | 24 시간 후 사멸( pM ) | 48시간 후 사멸( pM ) | CD4 + CD69+ (%) | CD4 + CD25+ (%) | CD8 + CD69+ (%) | CD8 + CD25+ (%) |
| 9D11 FolR1 TCB | 2.3 | 0.1 | 1.22 | 1.11 | 0.071 | 0.084 |
| 16D5 FolR1 TCB | 2.8 | 0.1 | 0.69 | 0.62 | 0.021 | 0.028 |
실시예
16
적혈구에 대한 결합 및
전혈에서
T 세포 활성화
FolR1 발현 종양 세포의 부재하에 자발적인 활성화가 없음을 입증하기 위해, 잠재적으로 FolR1을 발현할 수 있는 적혈구에 FolR1 클론이 결합하는 경우를 시험하였다. 본 발명자들은 적혈구에 대한 9D11 IgG, 16D5 IgG 및 Mov19 IgG의 어떠한 특이적 결합을 관찰할 수 없었고, 음성 대조군으로서 DP47 IgG가 포함되었다(도 8).
혈액 세포에 대한 임의의 추가의 비특이적 결합 또는 FoLR1 TCB를 통한 비특이적 활성화를 제외하기 위해, 9D11 TCB, 16D5 TCB 및 Mov19 TCB를 전혈에 첨가하하고 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 CD25 및 CD69의 상향조절을 유동 세포계측법으로 분석하였다. DP47 TCB는 음성 대조군으로서 포함되었다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 CD25 및 CD69의 상향조절을 분석하여 어떠한 시험된 구축물을 갖는 T 세포에서 활성화를 관찰할 수 없었다(도 9).
실시예 17
9
D11
경쇄에서
N-
당화
부위의 제거
잠재적인 서열 핫스팟을 확인하기 위해 상이한 FolR1 결합제를 분석하는 동안, 클론 9D11의 CDR L3의 말단에서 추정되는 N-당화 부위를 확인하였다. 보통 N-당화를 위한 교감 모티프는 N-X-S/T-X(이때 X는 P가 아니다)로서 정의된다. CDR L3(MQASIMNRT)의 서열(서열번호 61)은 서열 N-R-T를 갖는 이 교감 모티프와 완벽하게 일치한다. 당화가 CDR L3에서 항원 결합에 기여하는 경우, 당화는 상이한 생성 배취 중에서 완전히 재생성될 수 없기 때문에 FolR1 결합에서 영향을 가질 수 있다. 이 N-당화 부위가 FolR1 결합을 위해 중요하거나, 짝짓기오류 결합 없이 대체될 수 있는 경우를 평가하기 위해, N-당화 부위는 부위 특이적 돌연변이생성에 의해 교환된 9D11 경쇄의 상이한 변이체가 생성되었다.
일시적 형질감염 및 생성
4개의 이중특이적 T 세포는 후술된 바와 같이 필요한 벡터에 대한 PEI 매개된 형질감염 방법을 사용하여 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성하였다. HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 500 ml 쉐이크 플라스크에서 생성을 위해, 4 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시 시간 전에 시딩하였다(대안적인 규모를 위해 모든 양은 이에 따라 조정됨). 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml의 CD CHO 배지 중에 200 ㎍의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI 용액을 첨가한 후 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 쉐이크 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃에서 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기 중에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 160 ml의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 15 분 동안 210 xg로 원심분리하여 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 0.01% w/v 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다. 생성 후 상청액을 수확하고, 상청액을 함유하는 항체를 0.22 μm 멸균 필터를 통해 여과하고 정제할 때까지 4℃에서 저장하였다.
항체 정제
모든 분자를 표준 방법, 예컨대 단백질 A 친화성 정제(아크타 익스플로러) 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 2 단계로 정제하였다. 일시적인 생성으로부터 수득된 상청액을 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)로 조정하고 8 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(20 mM 나트륨 포스페이트 + 20 mM 나트륨 시트레이트 + 0.5 M NaCl + 0.01% 트윈20, pH 7.5)로 평형시킨 하이트랩 PA HP(지이 헬쓰케어, 컬럼 용량(cv) = 5 ml)에 적용하였다. 10 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 구배를 사용하여 20 cv 이상의 버퍼 B(20 mM 나트륨 시트레이트(pH 2.5) + 0.5 M NaCl + 0.01% 트윈20)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 용액의 pH를 완만하게 pH 6.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)으로 조정하였다. 샘플을 울트라 농축기(비바스핀 15R 30,000 MWCO HY, 사르토리우스)를 사용하여 1 ml까지 농축하고, 이후 20 mM 히스티딘(pH 6.0), 140 mM NaCl, 0.01% 트윈20으로 평형시킨 슈퍼덱스(상표) 200 10/300 GL(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용리된 분획의 응집물 함량은 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 이에 따라, 30 ㎕의 각각의 분획을 25℃에서 실행 완충액(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7))으로 평형시킨 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)에 적용하였다. 2% 미만의 올리고머를 함유하는 분획을 모으고 울트라 농축기(비바스핀 15R 30,000 MWCO HY, 사르토리우스)를 사용하여 1 내지 1.5 mg/㎖의 최종 농도까지 농축하였다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. 정제된 단백질을 액체 N2 중에 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
응집 온도
4개 구축물의 안정성을 0.1℃/분으로 25℃로부터 80℃까지 구배 가열하여 Optim1000[아박타(Avacta), 폴 코포레이션(PALL Corporation)]에서 시험하였다. 응집의 개시시 온도를 기록하였다.
4개 변이체, 즉, N100S(N95S), N100Q(N95Q), T102A(T97A) 및 T102N(T97N)(카밧 넘버링는 괄호에 나타냄)을 생성하고 이중특이적 T 세포 포맷으로 전환하였다. HEK293 EBNA 세포에서 일시적인 생성 및 정제 후, 상이한 변이체를 원래 9D11 클론과 비교하여 표적 결합 및 세포 사멸 활성에 대하여 분석하였다.
| # | 아미노산 교환 | 돌연변이생성 프라이머 |
| 1 | N95S | GAB-7735 |
| 2 | N95Q | GAB-7734 |
| 3 | T97A | GAB7736 |
| 4 | T97N | GAB-7737 |
실시예
18
9
D11
a-
글리코
변이체와의
결합 및 T 세포
매개된
사멸
CDR에서 당화 부위로 인해, 4개의 상이한 9D11 변이체를 당화 부위를 제거하는 돌연변이로 생성하였다(실시예 17). 이러한 4개의 변이체를 원래 9D11과 비교하여 HeLa 세포에서 FolR1에 결합(도 10) 및 SKOV3 및 HT-29에서 종양 세포 사멸의 유도(도 11a 및 11c)에 대하여 시험하였다. 결합 또는 종양 세포 사멸의 유도에서 차이를 나타내는 변이체는 없었다. 동시에, FolR1 음성 세포주 MKN-45의 비특이적 사멸을 입증하였다(도 11b). 또한, 변이체와 원래 결합제 사이에서 관찰될 수 있는 차이는 없었다. FoLR1 음성 종양 세포에서 비특이적 사멸을 유도하는 구축물은 없었다.
실시예 19
1차 상피 세포에서
FolR1
발현
FolR1은 1차 상피 세포에서 낮은 수준으로 발현된다. 본 발명에서는 이러한 수준이 FolR1 TCB의 존재하에 T 세포 매개된 사멸을 유도하기에 충분한지를 시험하였다. 이를 시험하기 위해, 1차 인간 기관지 상피 세포, 1차 인간 맥락 망막 상피 세포, 1차 인간 신장 피질 상피 세포 및 1차 인간 망막 색소 상피 세포를 사용하였다. 양성 대조군으로서 FolR1 양성 SKOV3 세포 또는 HT-29 세포가 포함되었다. 먼저, 사용된 단세포에서 FolR1 발현을 입증하고 이러한 세포에서 FolR1 결합 부위의 양을 측정하였다. 기관지 상피 세포, 신장 피질 상피 세포 및 망막 색소 상피 세포는 종양 세포에서 발현된 수준과 비교하여 매우 적지만 유의미한 수준의 FolR1을 발현한다. 맥락 망막 상피 세포는 유의미한 수준의 FolR1을 발현하지 않는다.
| 세포주 | 결합 부위 |
| 기관지 상피 | 492 |
| 맥락 망막 상피 | 104 |
| 신장 피질 상피 | 312 |
| 망막 색소 상피 | 822 |
| Skov3 | 69,890 |
표면에서 FolR1 발현이 입증된 1차 상피 세포를 사용하여 이러한 세포가 FoLR1 TCB의 존재하에 T 세포에 의해 사멸될 수 있는 경우의 문제를 입증하였다. 유의미한 수준의 사멸은 측정될 수 없지만 망막 색소 상피 세포, 기관지 상피 세포 및 신장 피질 세포의 존재하에 T 세포 활성화의 유도가 CD25 및 CD69의 상향조절을 야기함을 검출하였다. 가장 강한 활성화는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 CD25 및 CD69 둘 다의 상향조절을 야기하는 망막 색소 상피 세포에서 보여졌다. 기관지 상피 세포의 존재하에 T 세포의 낮은 활성화는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 CD69의 상향조절로 유도되지만 CD25의 매우 낮은 상향조절은 CD8+ T 세포가 아니라 CD4+ T 세포에서만 유도된다. T 세포의 가장 낮은 활성화는 CD4 T+ 세포 및 CD8+ T 세포에서 CD25의 상향조절이 없고 CD69는 CD8+ T 세포에서만 상향조절된 신장 상피 세포의 존재하에 수득된다(도 12a 내지 12l).
실시예 20
16
D5
또는 9
D11
결합제를 함유하는 상이한
TCB
포맷의 비교
2+1 도립된 TCB 포맷이 선택된 FolR1 결합제를 갖는 가장 활성인 포맷인지를 확인하기 위해, 상이한 포맷 16D5 또는 9D11을 함유하는 상이한 포맷을 생성하고 표적 세포 결합, T 세포 매개된 사멸 및 T 세포 활성화를 비교하였다. 16D5 결합제는 2+1 도립된 TCB(도 1a), 2+1 고전적 TCB(도 1d), TCB 1+1 고전적(도 1c) 및 TCB 1+1 헤드-투-테일(도 1b) 포맷에서 시험하였고; 9D11 결합제는 2+1 도립된 TCB(도 1a), TCB 1+1 고전적(도 1c) 및 TCB 1+1 헤드-투-테일(도 1b) 포맷에서 시험하였다.
모든 구축물은 HeLa 세포에서 FolR1에 대한 결합을 시험하였다. FolR1에 결합하기 위한 2가 분자는 결합활성으로 인해 1가 구축물과 비교하여 더 강하게 결합한다. 2가 대 1가 구축물 사이의 차이는 16D5에 대하여 더욱 확연하다. 상기 이유는 16D5의 낮은 친화성으로 인해 이 결합제에 대한 결합활성 효과가 더 강하기 때문이다. 2개의 1+1 TCB 사이에 결합의 유의미한 차이는 없지만 2개의 2+1 구축물 사이에 차이가 있다. 2+1 도립된 구축물은 2+1 고전적 구축물보다 FolR1에 더 강하게 결합한다. 이는 2+1 고전적 구축물에서 FoLR1에 대한 결합이 CD3 Fab의 존재에 의해 영향을 받는 반면, 도립된 구축물에서 결합은 영향을 적게 받음을 나타낸다.
이러한 구축물을 갖는 T 세포 매개된 사멸을 시험함으로써, 2+1 도립된 TCB의 더 강한 결합이 2+1 고전적 TCB와 비교하여 더 강한 종양 세포 사멸 및 T 세포 활성화로 전환됨을 나타낼 수 있다. 16D5 FolR1 TCB 2+1 고전적 구축물은 각각의 1+1 헤드-투-테일 구축물보다 단지 조금더 활성이다. 1+1 헤드-투-테일 구축물은 1+1 고전적 구축물보다 유의미하게 더 활성이다. 이는 결합에서 보여진 상황을 반영하지 않고 헤드-투-테일 구축물과의 더 나은 교차결합에 인할 수 있다. 전체 종양 세포 사멸 및 T 세포 활성화는 모든 시험된 구축물에 필적할만하고, 차이를 보이는 효능에서의 차이는 단지 EC50 값에 관한다. 일반적으로, 사용된 결합제와는 관계없이 FolR1 TCB 2+1 도립된는 T 세포 매개된 종양 세포 사멸 및 T 세포 활성화를 유도하기 위한 바람직한 포맷이라는 결혼을 내릴 수 있다(도 13a 내지 13c 및 도 14a 내지 14c 참조).
| 구축물 | 결합 EC50 ( nM ) | 24 시간 후 사멸 ( pM ) | 48 시간 후 사멸 ( pM ) |
| 16D5 FolR1 TCB 2+1 도립된 | 11.03 | 1.43 | 0.18 |
| 16D5 FolR1 TCB 2+1 고전적 | 17.07 | 5.60 | 2.18 |
| 16D5 FolR1 TCB 1+1 고전적 | 107.3 | n.d. | n.d. |
| 16D5 FoLR1 TCB 1+1 헤드-투-테일 | 102.6 | 26.24 | 6.06 |
| 9D11 FoLR1 TCB 2+1 도립된 | 17.52 | 0.74 | 0.14 |
| 9D11 FoLR1 TCB 1+1 고전적 | 38.57 | 20.92 | n.d. |
| 9D11 FoLR1 TCB 1+1 헤드-투-테일 | 44.20 | 4.73 | n.d. |
| 구축물 | CD4 + CD25 + (%) | CD4 + CD69 + (%) | CD8 + CD25 + (%) | CD8 + CD69 + (%) |
| 16D5 FolR1 TCB 2+1 도립된 | 1.96 | 0.33 | 2.10 | n.d. |
| 16D5 FolR1 TCB 2+1 고전적 | 13.83 | 3.67 | 12.88 | 4.47 |
| 16D5 FolR1 TCB 1+1 고전적 | 38.54 | n.d. | n.d. | n.d. |
| 16D5 FoLR1 TCB 1+1 헤드-투-테일 | 17.14 | 7.47 | 25.15 | n.d. |
| 9D11 FoLR1 TCB 2+1 도립된 | 1.41 | 0.27 | 1.24 | 0.35 |
| 9D11 FoLR1 TCB 1+1 고전적 | 34.01 | n.d. | 34.39 | 7.40 |
| 9D11 FoLR1 TCB 1+1 헤드-투-테일 | 3.73 | 2.47 | 4.98 | 2.89 |
실시예
21
종양 세포주 및 단세포
HeLa 세포(CCL-2)는 ATCC로부터 수득하고 10% FCS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM 중에서 배양하고, SKOV3(HTB-77)은 ATCC로부터 수득하고 10% FCS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 중에서 배양하고, OVCAR5는 NCI로부터 수득하고 10% FCS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 중에서 배양하고, HT-29(ACC-299)는 DSMZ로부터 수득하고 10% FCS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 맥코이(McCoy) 5A 배지 중에 배양하고, MKN-45(ACC-409)는 DSMZ로부터 수득하고 10% FCS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 중에서 배양하였다.
모든 시험된 1차 상피 세포는 사이언셀 리서치 래보래토리즈로부터 수득하였다. 인간 기관지 상피 세포(HBEpiC, 카탈로그 번호 3210)는 기관지 상피 세포 배지(BEpiCM, 카탈로그 번호 3211, 사이언셀) 중에서 배양하였다. 인간 결장 상피 세포(HCoEpiC, 카탈로그 번호 2950)는 결장 상피 세포 배지(CoEpiCM, 카탈로그 번호 2951, 사이언셀) 중에서 배양하였다. 인간 망막 색소 상피 세포(HRPEpiC, 카탈로그 번호 6540)는 상피 세포 배지(EpiCM, 카탈로그 번호 4101, 사이언셀) 중에서 배양하였다. 인간 신장 피질 상피 세포(HRCEpiC, 카탈로그 번호 4110)는 상피 세포 배지(EpiCM, 카탈로그 번호 4101, 사이언셀) 중에서 배양하였다. 인간 맥락 망막 상피 세포(HCPEpiC, 카탈로그 번호 1310)는 상피 세포 배지(EpiCM, 카탈로그 번호 4101, 사이언셀) 중에서 배양하였다.
실시예 22
유동 세포계측법에 의한 표적 결합
나타낸 바와 같은 표적 세포를 세포 해리 완충액으로 배양하고, PBS로 세척하고, FACS 완충액 중에 재현탁하였다. 항체 염색을 96-웰 환저 플레이트에서 수행하였다. 이에 따라, 2 x 106개 세포를 웰당 시딩하였다. 플레이트를 4 분 동안 400 xg로 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 시험 항체는 FACS 버퍼 중에서 희석하고, 20 ㎕의 항체 용액을 세포에 30 분 동안 4℃에서 첨가하였다. 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해, 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 후 희석된 2차 항체(FITC 공액결합된 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fcg 단편, 잭슨 이뮨리서치 #109-096-098; 또는 PE-공액결합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적, 잭슨 이뮨리서치 #109-116-170)를 첨가하였다. 4℃에서 30 분 동안 항온처리한 후, 결합하지 않은 2차 항체를 세척하여 제거하였다. 측정하기 전에 세포를 200 ㎕의 FACS 버퍼 중에 재현탁하고, BD 칸토(Canto) II 또는 BD 포레테싸(Fortessa)를 사용하여 유동 세포계측법으로 분석하였다.
실시예 23
내재화
세포를 배양하고 생존력을 측정하였다. 세포를 2 Mio 세포/ml로 신선한 저온 배지에 재현탁하고, 세포 현탁액을 각각의 항체에 대하여 15 ml 팔콘 튜브에 옮겼다. 내재화를 위해 시험되어야 하는 항체를 20 ㎍/ml의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 상기 튜브를 45 분 동안 냉장실에서 진탕기에 넣고 항온처리 하였다. 항온처리 후, 세포를 저온 PBS로 3회 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 웰당 0.2 Mio 세포를 시점 0에서 FACS 플레이트로 옮겼다. 표지된 세포를 미온 배지 중에 재현탁하고 37℃에서 항온처리하였다. 나타낸 시점에서 웰당 0.2 Mio 세포를 저온 PBS로 옮기고, FACS 프레이트에서 플레이트를 세척하였다. 표면에 남아있는 구축물을 검출하기 위해, 세포를 PE-표지된 항-인간 Fc 2차 항체로 염색하였다. 이에 따라, 20 ㎕의 희석된 항체를 웰당 첨가하고, 플레이트를 30 분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거한 후 1% PFA로 고정시켜 임의의 추가 내재화를 막았다. BD FACS 칸토II를 사용하여 형광을 측정하였다.
실시예 24
퀴피키트
(
QIFIKIT
: 등록상표) 분석
퀴피키트(등록상표)는 상이하지만 명확한 양의 마우스 Mab 분자(고-친화성 항-인간 CD5, 클론 CRIS-1, 이소타입 IgG2a)로 코팅되고 지름이 10 μm인 일련의 비드를 함유한다. 이 비드는 1차 마우스 Mab, 이소타입 IgG로 표지되어 있는 상이한 항원 밀도를 갖는 세포처럼 보인다. 간단히 말해, 세포를 관심 항원에 대하여 유도된 1차 마우스 단클론 항체로 표지하였다. 별도의 시험 웰에서, 세포를 무관한 마우스 단클론 항체(이소타입 대조군)로 표지하였다. 이어서, 세포, 셋업(Set-Up) 비드 및 교정(Calibration) 비드를 키트에 포함된 플루오레세인-공액결합된 항-마우스 2차 항체로 표지하였다. 세포를 표지하기 위해 사용된 1차 항체는 포화 농도에서 사용되어야 한다. 1차 항체는 임의의 마우스 IgG 이소타입일 수 있다. 이러한 조건하에, 결합된 1차 항체 분자의 수는 세포 표면에서 존재하는 항원 부위의 수에 상응한다. 2차 항체 또한 포화 농도에서 사용된다. 결론적으로, 형광은 세포 및 비드에서 결합된 1차 항체 분자의 수와 관련이 있다.
실시예 25
T 세포
매개된
종양 세포 사멸 및 T 세포 활성화
표적 세포를 트립신/EDTA로 배양하고, 카운팅하고 생존력을 확인하였다. 세포를 3 x 106개 세포/ml의 최종 농도로 이들의 각각의 배지 중에 재현탁하였다. 이어서, 100 ㎕의 표적 세포 현탁액을 96-웰 평저 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다. 플레이트를 밤새 37℃에서 항온처리기에서 항온처리하여 플레이트에서 세포에 부착하도록 하였다. 다음날, PBMC를 건강한 공여자의 전혈로부터 단리하였다. 혈액을 PBS로 2:1로 희석하고, 류코셉(Leucosep) 튜브 중에서 15 ml 히스토파크-1077[# 10771, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)]에 덮어씌우고, 30 분 동안 450 xg로 제동 없이 원심분리하였다. 원심분리 후 세포를 함유하는 밴드를 10 ml 피펫으로 수집하고, 50 ml 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 PBS로 50 ml까지 채우고, 원심분리하였다(400 xg, 10 분, 실온). 상청액을 제거하고, 펠렛을 PBS 중에 재현탁하였다. 원심분리(300 xg, 10 분, 실온) 후, 상청액을 버리고, 2개 튜브를 모으고, 세척 단계를 반복하였다(350 xg, 10 분, 실온에서 원심분리). 이후, 세포를 재현탁하고, 펠렛을 세포 카운팅을 위해 50 ml PBS 중에 모았다. 카운팅 후, 세포를 원심분리하고(350 xg, 10분, 실온), 2% FCS 및 2 nM 글루타민을 함유하는 RPMI 중에 6 Mio 세포/ml로 재현탁하였다. 배지를 플레이팅된 표적 세포로부터 제거하고, 2% FCS 및 2 nM 글루타민을 함유하는 RPMI 중에 희석된 시험 항체를 웰마다 첨가하였다. 효과기 세포 용액의 300,000개 세포를 각각의 웰로 옮겨 10:1의 E:T 비를 야기하였다. 최대 방출을 측정하기 위해, 표적 세포를 트리톤 X-100으로 용리하였다. LDH 방출은 세포독성 검출 키트[#1644793, 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)]를 사용하여 24 시간 및 48 시간 후 측정하였다. 종양 세포 사멸후 T 세포에서 활성화 마커 상향조절은 유동 세포계측법으로 측정하였다. 간단히 말해, PBMC를 배양하고 96-웰 환저 플레이트로 옮기고, FACS 완충액 중에 희석된 CD4 PE-Cy7[#3557852, 비디 바이오사이언스(BD Bioscience)], CD8 FITC(#555634, 비디 바이오사이언스), CD25 APC(#555434, 비디 바이오사이언스), CD69 PE[#310906, 바이오레전드(BioLegend)] 항체로 염색하였다. 30 분 동안 4℃에서 항온처리 후, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. DB 칸토 II를 사용하여 형광을 측정하기 전에, 세포를 200 ㎕의 FACS 완충액 중에 재현탁하였다.
실시예 26
전혈에서의
T 세포 활성화
280 ㎕의 선혈을 96-웰 코티칼 딥웰 프레이트에 첨가하였다. 이어서, 20 ㎕의 희석된 TCB를 혈액에 첨가하고, 플레이트를 진탕하여 잘 혼합하였다. 항온처리기에서 37℃에서 24 시간 항온처리 후, 혈액을 혼합하고, 35 ㎕의 혈액을 96-웰 환저 플레이트로 옮겼다. 이어서, CD4 PE-Cy7(#3557852, 비디 바이오사이언스), CD8 FITC(#555634, 비디 바이오사이언스), CD25 APC(#555434, 비디 바이오사이언스), CD69 PE(#310906, 바이오레전드) 및 CD45 V500[#560777, 비디 호리존(BD Horizon)]으로 이루어진 항체 염색 믹스를 20 ㎕ 첨가하고, 15 분 동안 암실에서 실온에서 항온처리하였다. 측정하기 전에, 200 ㎕의 신선하게 제조된 BD FACS 용리 용액(#349202, BD FACS)을 혈액에 첨가하였다. 실온에서 15 분 동안 항온처리 후, 세포를 BD 포레테싸로 측정하였다.
실시예 27
면역결핍 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG) 마우스에서 인간화된 FOLR1 TCB(클론 16
D5
)의
SDPK
(단일 용량 약동학) 연구
실험 시작시 6 내지 7 주령의 암컷 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG) 마우스[덴마크 소재의 타코닉(Taconic)에서 사육됨]를 무특이 병원체 조건하에 회부된 지침[지브이-솔라스; 펠라사; 티에르슈게(GV-Solas; Felasa; TierschG)]에 따라 12 시간 명/12 시간 암의 일일 사이클로 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P 2011/128). 도착 후, 동물을 1 주 동안 새로운 환경에 익숙하도록 하고 관찰을 위해 유지하였다. 연속적인 건강 모니터링을 정기적으로 수행하였다.
마우스에 10, 1 또는 0.1 ㎍의 FOLR1 TCB를 정맥내 주사하고, 처리 군 및 시점당 3마리 마우스를 채혈하였다. 모든 마우스에 총 부피 200 ㎕의 적절한 용액을 주사하였다. 200 ㎕당 적절한 양의 FOLR1 TCB를 수득하기 위해, 스톡 용액은 필요할 때 PBS로 희석하였다. 혈청 샘플을 치료 주사하고 5 분, 1 시간, 3 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간 및 168 시간 후 수집하였다.
도 15는 16D5 FOLR1 TCB가 느린 간격을 갖는 NOG 마우스에서 전형적이고 용량 비례 IgG-유사 PK 특성을 보임을 나타낸다.
| 화합물 | 용량 | 제형 완충액 |
농도
( mg / mL ) |
| FOLR1 TCB (16D5) | 10 ㎍(약 0.5 mg/kg에 상응함) | 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 |
5.43 (= 스톡 용액) |
| FOLR1 TCB (16D5) | 1 ㎍(약 0.05 mg/kg에 상응함) | 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 |
5.43 (= 스톡 용액) |
| FOLR1 TCB (16D5) | 0.1 ㎍(약 0.005 mg/kg에 상응함) | 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 |
5.43 (= 스톡 용액) |
실시예
28
Skov3
-함유
NOG
마우스에서 인간
PBMC
전이 후
FOLR1
TCB
(클론 16
D5
)의
생체내
효능
FOLR1 TCB는 PBMC 이식된 NOG 마우스에 피하 주사된 인간 난소 암종 세포주 Skov3에서 시험하였다.
Skov3 난소 암종 세포는 ATCC(HTB-77)로부터 수득하였다. 종양 세포주는 10% FCS(깁코(Gibco))를 함유하는 RPMI 중에서 37℃에서 5% CO2의 수포화된 대기하에 배양하였다. 계대 35를 95% 초과의 생존력으로 이식을 위해 사용하였다. 총 100 ㎕의 RPMI 세포 배양 배지(깁코) 중에서 동물당 5 x 106개 세포를 동물의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다.
Skov3 난소 암종 세포는 ATCC(HTB-77)로부터 수득하였다. 종양 세포주는 10% FCS(깁코(Gibco))를 함유하는 RPMI 중에서 37℃에서 5% CO2의 수포화된 대기하에 배양하였다. 계대 35를 95% 초과의 생존력으로 이식을 위해 사용하였다. 총 100 ㎕의 RPMI 세포 배양 배지(깁코) 중에서 동물당 5 x 106개 세포를 동물의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다.
실험 시작시 6 내지 7 주령의 암컷 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG) 마우스(덴마크 소재의 타코닉에서 사육됨)를 무특히 병원체 조건하에 회부된 지침(지브이-솔라스; 펠라사; 티에르슈게)에 따라 12 시간 명/12 시간 암의 일일 사이클로 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P 2011/128). 도착 후, 동물을 1 주 동안 새로운 환경에 익숙하도록 하고 관찰을 위해 유지하였다. 연속적인 건강 모니터링을 정기적으로 수행하였다.
프로토콜에 따라(도 16), 연구 0일에 마우스에 5 x 106개 Skov3을 피하 주사하였다. 연구 21일에, 건강한 공여자의 인간 PBMC를 피콜(Ficoll) 방법을 통해 단리하고, 10 x 106개 세포를 종양-함유 마우스에 복강내 주사하였다. 2일 후, 마우스를 무작위 추출하고 5개의 처리 군으로 동일하게 분배하고(n = 12), 이어서 마우스당 10, 1 또는 0.1 ㎍의 FOLR1 TCB 또는 10 ㎍의 DP47 대조군 TCB를 3주 동안 매주 1회 정맥내 주사하였다. 모든 마우스에 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내 주사하였다. 비히클 군의 마우스에 PBS를 주사하였다. 200 ㎕당 적절한 양의 TCB를 수득하기 위해, 스톡 용액을 필요할 때 PBS로 희석하였다. 종양 성장은 칼리퍼를 사용하여 매주 1회 측정하고(도 17), 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다(W: 너비, L: 길이):
Tv:(W2/2) x L
FOLR1 TCB의 매주 1회 주사는 용량-의존적 항-종양 효과를 야기한다. 반면에 10 ㎍/마우스 및 1 ㎍/마우스의 용량은 종양 수축을 유도하고, 0.1 ㎍/마우스는 종양 정체를 유도한다(도 17, 표 22). 최대 종양 수축은 표적되지 않은 대조군 DP47 TCB와 비교하여 10 ㎍/마우스의 용량으로 달성되었다.
| 화합물 | 용량 | 종양 성장 억제 |
| DP47 TCB 대조군 TCB |
10 ㎍(약 0.5 mg/kg에 상응함) | 7% |
| FOLR1 TCB (16D5) | 10 ㎍(약 0.5 mg/kg에 상응함) | 90% |
| FOLR1 TCB (16D5) | 1 ㎍(약 0.05 mg/kg에 상응함) | 74% |
| FOLR1 TCB (16D5) | 0.1 ㎍(약 0.005 mg/kg에 상응함) | 56% |
PD 판독을 위해, 처리 군당 3마리 마우스를 연구 32일에 희생시키고, 종양을 제거하고, 단세포 현탁액을 콜라게나아제 V, 디스파아제 II 및 후속 FACS-분석용 DNAse로 효소 소화를 통해 제조하였다(도 19 및 20). 단세포는 세포외 항원 및 활성화 마커의 염색을 위해 직접 사용되거나, 5 ng/㎖ PMA 및 500 ng/㎖ 이오노마이신을 사용하여 단백질 수송 억제제인 모네신의 존재하에 5 시간 동안 정상 배양 배지 중에 재현탁하였다. 재현탁후, 세포를 표면 항원에 대하여 염색하고, 고정화 및 투과화 단계가 따른다. 이어서, 고정 샘플을 TNF-α, IFN-γ, IL-10 및 IL-2로 세포내 염색하고 유동 세포계측법으로 분석하였다. 세포의 탈과립을 위해 동일한 과정을 사용하였지만, 항-CD107a 항체는 재자극 기간 동안 첨가되고 고정된 샘플을 세포내 퍼포린 및 그랜자임-B 내용물로 염색하였다. FACS 분석은 비히클 및 표적되지 않은 대조군 TCB에 비해 FOLR1 TCB로 처리시 종양 조직에서 침윤성 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 통계적으로 더 큰 수를 입증하였다. 또한, 더 큰 수의 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2 생성뿐만 아니라 퍼포린+/그랜자임-B+ CD4+ 및 CD8+ T 세포를 FOLR1 TCB 처리된 종양에서 검출하였다. 또한, FOLR1 TCB로 처리된 종양 침윤성 T 세포는 대조군 군에 비해 더 큰 탈과립율(%)을 나타내었다.
연구 종료일(38일)에, 모든 동물을 희생시키고, 종양을 제거하고 중량을 측정하였다(도 18). 마우스당 10 및 1 ㎍의 FOLR1 TCB로 처리된 종양의 중량은 대조군 군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다.
| 화합물 | 용량 | 제형 완충액 |
농도
( mg / mL ) |
| PBS |
|||
| FOLR1 TCB (16D5) | 10 ㎍ | 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 |
3.88 (= 스톡 용액) |
| FOLR1 TCB (16D5) | 1 ㎍ | 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 |
3.88 (= 스톡 용액) |
| FOLR1 TCB (16D5) | 0.1 ㎍ | 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 |
3.88 (= 스톡 용액) |
| DP47 TCB | 10 ㎍ | 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 |
4.35 (= 스톡 용액) |
실시예
29
이중특이적
FolR1
/
CD3
-
카파
-감마 항체의 발생
임의의 헤테로-이량체화 접근법(예를 들면, 놉-인투-홀 기법)을 사용하지 않고 동시에 인간 CD3 및 인간 엽산 수용체 알파(FolR1)에 결합할 수 있는 이중특이적 항체(각각의 항원에 대하여 1가)를 생성하기 위해, 소위 교차Mab 기법을 사용하여 공통 경쇄 라이브러리의 조합을 적용하였다. 인간화된 CD3 결합제의 가변 영역(CH2527_VL7_46/13)을 표준 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인에 융합하여 2개의 특이성에 대하여 통상적인 VLVH 교차된 분자(Fc에 융합됨)를 형성하였다. 교차된 대응물(VHCL)을 생성하기 위해, CD3 특이적 가변 중쇄 도메인(CH2527_VH_23/12)을 불변 인간 γ 경쇄에 융합시킨 반면, 인간 FolR1(클론 16D5, 공통 경쇄 라이브러리로부터 단리됨)에 특이적인 가변 중쇄 도메인을 불변 인간 κ 경쇄에 융합시켰다. 이는 카파셀렉트 및 감마Fab셀렉트 컬럼(지이 헬쓰케어)으로 후속 정제 단계를 적용하여 목적하지 않은 호모이량체 항체를 제거함으로써 목적한 이중특이적 항체의 정제를 가능하게 한다.
모든 항체 발현 벡터는 문헌[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성하였다. 분자 생물학 시약은 제조자의 권고에 따라 사용하였다. 유전자 또는 유전자 단편은 중합효소 쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키거나 젠아트 아게(독일 레겐스부르크 소재)에서 자동화 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드로부터 생성하였다. PCR-증폭된 또는 서브클로닝된 DNA 단편은 DNA 서열확인(시너젠 게엠베하, 스위스 소재)에 의해 확인하였다. 플라스미드 DNA는 표준 맥시프렙(Maxiprep) 키트(퀴아겐)를 사용하여 형질감염-등급 플라스미드 DNA의 제조를 위해 적합한 에스케리키아 콜라이 숙주 세포주로 형질전환하고 이에 증폭시켰다. 이중특이적 분자의 생성을 위해, HEK293 EBNA 세포를 표준 폴리에틸렌이민(PEI) 기반 방법을 사용하여 각각의 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 3개의 발현 벡터의 사용된 플라스미드 비율은 1:1:1이었다. 형질감염된 세포를 7일 동안 배양한 후 정제를 위해 상청액을 수확하였다. 하기와 같이 이중특이적 FolR1/CD3- 카파-감마항체를 생성하고 정제하였다.
일시적 형질감염 및 생성
카파-감마 이중특이적 항체를 후술된 바와 같이 필요한 벡터를 위해 PEI 매개된 형질감염 방법을 사용하여 HEK293 EBNA 세포 중에서 일시적으로 생성하였다. HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 500 ml 쉐이크 플라스크 내에서 생성을 위해, 4 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다(대안적인 규모를 위해 모든 양은 이에 따라 조정됨). 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg으로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml의 CD CHO 배지 중에서 200 ㎍의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI 용액을 첨가한 후 15 초 동안 볼텍싱하고 이후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 쉐이크 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃에서 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 160 ml의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 첨가하였다. 7일 후, 정제를 위해 배양 상청액을 15 분 동안 210 xg로 원심분리하여 수집하고, 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)하고, 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
정제
카파-감마 이중특이적 항체를, κ 경쇄에 특이적인 친화성 단계, 이어서 γ 경쇄에 특이적인 친화성 단계, 및 마지막으로 응집물의 제거를 위한 크기 배제 크로마토그래피 단계를 사용하여 3 단계로 정제하였다. 일시적 생성물로부터 수득된 상청액을 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)으로 조정하고 5 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(50 mM 트리스, 100 mM 글리신, 150 mM NaCl, pH 8.0)로 평형시킨 캡쳐 셀렉트 κ 친화성 매트릭스, 또는 하이트랩 카파셀렉트(지이 헬쓰케어, 컬럼 용량(cv) = 1 ml)에 적용하였다. 15 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 구배를 사용하여 25 cv 이상의 버퍼 B(50 mM 트리스, 100 mM 글리신, 150 mM NaCl, pH 2.0)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 용액의 pH를 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)로 조정하였다. 중화된 모은 분획을 5 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(50 mM Tris, 100 mM 글리신, 150 mM NaCl, pH 8.0)로 평형시킨 캡쳐 셀렉트 γ 친화성 매트릭스(현재: 하이트랩 감마Fab셀렉트, 지이 헬쓰케어, 컬럼 용량(cv) = 1 ml)에 적용하였다. 15 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 구배를 사용하여 25 cv 이상의 버퍼 B(50 mM Tris, 100 mM 글리신, 150 mM NaCl, pH 2.0)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 용액의 pH를 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)으로 조정하였다. 이 용액을 울트라 농축기(비바스핀 15R 30,000 MWCO HY, 사르토리우스)를 사용하여 농축한 후 20 mM 히스티딘, pH 6.0, 140 mM NaCl, 0.01% 트윈20으로 평형시킨 슈퍼덱스(상표) 200 10/300 GL(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 크기 배제 후 모은 분획을 울트라 농축기(비바스핀 15R 30,000 MWCO HY, 사르토리우스)를 사용하여 다시 농축하였다.
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동으로 분석하였다. 오직 적은 양의 단백질을 0.17 mg/L의 최종 수율로 정제할 수 있었다.
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동으로 분석하였다. 오직 적은 양의 단백질을 0.17 mg/L의 최종 수율로 정제할 수 있었다.
실시예 30
이중특이적
FolR1
/
CD3
-
카파
-감마 항체로의 T 세포
매개된
사멸
κγFolR1 TCB의 활성을 신선하게 단리된 PBMC의 존재하에 SKOV3 세포에서 시험하였다. 음성 대조군으로서 DP47 TCB가 포함되었다. SKOV3 세포의 T 세포 매개된 사멸은 LDH 방출에 의해 24 시간 및 48 시간 후 측정하였다. 48 시간 후, T 세포를 배양하고 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD69 및 CD25 상향조절을 유동 세포계측법으로 측정하였다.
κγFolR1 구축물은 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD69 및 CD25 상향조절 둘 다에 의해 수반되는 농도 의존 방식으로 SKOV3 세포의 사멸을 유도한다.
SKOV3 세포를 κγFolR1 TCB 또는 DP47 TCB의 존재하에 PBMC와 함께 항온처리하였다. 24 시간 및 48 시간 후, 종양 세포의 사멸을 LDH 방출을 측정하여 측정하였다(도 21). SKOV3 세포를 κγFolR1 TCB 또는 DP47 TCB의 존재하에 PBMC와 함께 항온처리하였다. 48 시간 후, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD25 및 CD69 상향조절을 유동 세포계측법으로 측정하였다(도 22).
실시예 31
표면
플라즈몬
공명에 의한 16
D5
및 36F2
FolR1
결합제의 생화학 특성 규명
재조합 인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(모두 Fc 융합물로)에 대한 상이한 1가 또는 2가 이중특이적 T 세포 포맷에서 항-FolR1 16D5의 결합 및 IgG로서 또는 이중특이적 T 세포로서 항-FolR1 36F2의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험은 비아코어 T200에서 25℃에서 실행 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 지이 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다.
시험된
분자
친화성 및 결합활성 측정을 위해 사용된 분자를 하기 표 24에 기재하였다.
| 명칭 | 설명 |
| 16D5 TCB | 2+1 T 세포 이중특이적, 도립된 포맷(공통 경쇄) |
| 16D5 TCB 고전적 | 적2+1 T 세포 이중특이적, 고전적 포맷 (공통 경쇄) |
| 16D5 TCB 1+1 | 1+1 T 세포 이중특이적 (공통 경쇄) |
| 16D5 TCB 1+ 1 HT | 1+1 T 세포 이중특이적 헤드-투-테일 (공통 경쇄) |
| 36F2 IgG | P329G LALA를 갖는 인간 IgG1 |
| 36F2 TCB | 2+1 T 세포 이중특이적, 도립된 포맷, 교차fab |
엽산 수용체 1에 대한 결합활성
항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 결합활성은 후술된 바와 같이 측정하였다(표 25).
인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(FolR1-Fc)의 재조합 비오틴화된 단량체 Fc 융합물을 표준 커플링 지침(비아코어, 지이 헬쓰케어)을 사용하여 SA 칩에 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 300 내지 400 RU였다. 항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포를 180 초에 걸쳐 유동 세포를 통해 30 ㎕/분의 유속으로 3.7 내지 900 nM의 농도 범위에서 통과시켰다. 해리를 240 또는 600 초 동안 모니터링하였다. 30 초 동안 10 mM 글리신-HCl(pH 2)의 이중 주입을 사용하여 모든 주기 후 칩 표면을 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 재조합 비오틴화된 뮤린 CD134 Fc 융합물로 고정시킨 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. IgG 또는 이중특이적 T 세포의 2가 결합으로부터 야기된 결합 곡선은 1:1 랭뮤어 결합(심지어 1:2 결합일지라도)에 근사치이고 그 모델로 맞추어 2가 결합의 결합활성을 나타내는 겉보기 KD를 수득하였다. 상호작용에 대한 겉보기 결합 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 맞춘 속도 상수로부터 유도되었다. 1+1 이중특이적 T 세포 포맷의 경우, 상호작용은 실제 1:1이고, KD는 이 구축물에서 오직 1개의 FolR1 결합제가 존재하므로 친화성을 나타낸다.
| 분석물 | 리간드 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | 겉보기 KD |
| 36F2 IgG | huFolR1 | 2.07E+06 | 1.3E-02 | 6 nM |
| cyFolR1 | 2.78E+06 | 1.75E-02 | 6 nM | |
| muFolR1 | 4.28E+05 | 8.23E-04 | 2 nM | |
| 36F2 TCB | huFolR1 | 2.45E+06 | 9.120E-03 | 4 nM |
| cyFolR1 | 4.31E+06 | 1.45E-02 | 3 nM | |
| muFolR1 | 6.97E+05 | 9.51E-04 | 1 nM | |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 1.57E+05 | 3.92E-04 | 3 nM |
| cyFolR1 | 2.01E+05 | 3.81E-04 | 2 nM | |
| 16 D5 TCB 고전적 | huFolR1 | 2.04E+05 | 1.84E-04 | 0.9 nM |
| cyFolR1 | 2.50E+05 | 3.05E-04 | 1 nM | |
| 16 D5 TCB 1+ 1 HT | huFolR1 | 5.00E+04 | 2.25E-03 | 45 nM |
| cyFolR1 | 5.75E+04 | 4.10E-03 | 70 nM | |
| 16 D5 TCB 1+1 | huFolR1 | 3.65E+04 | 2.04E-03 | 56 nM |
| cyFolR1 | 4.09E+04 | 3.60E-03 | 90 nM |
엽산 수용체 1에 대한 친화성
항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 친화성을 후술된 바와 같이 측정하였다(표 26).
친화성 측정을 위해, 항-인간 Fab 특이적 항체(Fab 캡쳐 키트, 지이 헬쓰케어)의 약 12000 공명 단위(RU)의 직접 커플링을 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩에서 수행하였다. 항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포를 20 nM으로 10 ㎕/분의 유속으로 40 초 동안 포획하고, 기준 유동 세포를 포획하지 않고 남겨두었다. 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 엽산 수용체 1 Fc 융합물의 희석 시리즈(12.3 내지 3000 nM)를 모든 유동 세포에서 30 ㎕/분으로 240 초 동안 통과시켜 회합 단계를 기록하였다. 해리 단계를 300 초 동안 모니터링하고 샘플 용액으로부터 HBS-EP로 스위칭하여 촉발하였다. 60 초 동안 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)의 이중 주입을 사용하여 모든 사이클 후 칩 표면을 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 1에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 상호작용을 위한 친화 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 맞춤으로써 속도 상수로부터 유도되었다.
| 분석물 | 리간드 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | KD |
| 36F2 IgG | huFolR1 | 9.10E+04 | 6.65E-02 | 730 nM |
| cyFolR1 | 1.02E+05 | 5.78E-02 | 570 nM | |
| muFolR1 | 8.32E+04 | 1.78E-02 | 210 nM | |
|
36F2 TCB |
huFolR1 | 5.94E+04 | 6.13E-02 | 1000 nM |
| cyFolR1 | 6.29E+04 | 5.42E-02 | 860 nM | |
| muFolR1 | 5.68E+04 | 1.75E-02 | 300 nM | |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 2.23E+04 | 7.33E-04 | 33 nM |
| cyFolR1 | 1.57E+04 | 1.60E-03 | 100 nM | |
| 16 D5 TCB 고전적 | huFolR1 | 1.03E+04 | 7.59E-04 | 74 nM |
| cyFolR1 | 9.18E+03 | 1.61E-03 | 175 nM | |
| 16 D5 TCB 1+ 1 HT | huFolR1 | 2.05E+04 | 7.08E-04 | 35 nM |
| cyFolR1 | 1.67E+04 | 1.53E-03 | 92 nM | |
| 16 D5 TCB 1+1 | huFolR1 | 1.43E+04 | 9.91E-04 | 69 nM |
| cyFolR1 | 1.20E+04 | 1.80E-03 | 150 nM |
36F2 TCB의 인간 및 시노몰구스 FolR1-Fc에 대한 친화성(1가 결합)은 둘 다의 경우 유사하고 약 1000 nM인 반면, 뮤린 FolR1-Fc에 대한 친화성은 약간 더 우수하고 약 300 nM이다. 36F2는 뮤린 및 영장류 모델에서 사용될 수 있고, 대용물은 필요하지 않다.
인간 FolR1에 대한 36F2 TCB의 결합활성(겉보기 KD)은 인간 FolR1에 대한 16D5 TCB의 친화성보다 약 30배 적다. 2가 포맷에서, 36F2 TCB는 작은 나노몰 범위에서 존재하는 반면, 16D5 TCB는 작은 피코몰 범위에서 존재한다(1000 배 차이).
FolR1은 난소암, 유방암, 신장암, 결장직장암, 폐암 및 다른 고형암을 비롯한 상피 악성 종양의 스펙트럼에서 암 세포의 표면에서 간헐적이고 높은 수준으로 과발현된 종양 세포에서 발현되고, 또한 정상 조직에서 극성화된 상피 세포의 제한된 일부의 선단 표면에서 발현된다. 이러한 비암성 정상세포는 단지 낮은 수준으로 FolR1을 발현하고, 예를 들면, 치조 표면에서 세기관지 상피 세포, 관상 세포의 신장 피질 루미날 경계, 망막 색소 상피(기저측면 막) 및 맥락 망막을 포함한다.
16D5 TCB는 이들의 T 세포 매개된 사멸을 야기하는 FolR1을 적은 양으로 발현하는 정상 조직 세포에 결합한다. 이는 최소한 어느 정도로, 시노몰구스 원숭이 중에서 10 ㎍/kg으로 관찰된 허용 한도를 설명할 수 있다. 본 발명자들은 이중특이적 T 세포 분자의 친화성의 저하가 높은 표적 밀도 조직과 낮은 표적 밀도 조직 사이에 분화를 증가시킬 수 있고, 이로 인해 2가 결합 및 결합 활성을 사용하여 독성을 줄이는지를 결정하려 하였다. 낮은 친화성 결합제는 보통, 낮은 친화성이 종종 낮은 효력 및 효능과 관련되기 때문에 추가 분석을 위한 적합한 후보자로서 선택되지 않았다. 그럼에도, 낮은 친화성 FolR1 결합제 36F2는 여러 포맷으로 개발되었고 이의 생물학적 특성을 특성 규명하였다. 2가 이중특이적 T 세포 포맷에 사용된 36F2의 경우, 결합활성 효과(1가 결합과 2가 결합 사이의 차이)는 약 250 배이다(1000 nM 대 4 nM). 낮은 표적 밀도에서, 친화성은 상호작용을 정의하고 1000 nM은 TCB의 낮은 효능을 야기한다. 그러나, 높은 표적 밀도에서, 분자의 결합활성은 역할을 하고 4 nM은 TCB의 높은 활성을 야기한다(실시예 32 참조).
대안적 접근법에서, 본 발명자들은 16D5의 1가 포맷 및 2가 포맷에서 16D5의 낮은 친화성 변이체(친화성 약 10 내지 40 nM)를 생성하였다. 1가 포맷(1+1)에서 사용된 16D5 결합제는 약 50 nM의 친화성을 갖는다. 높은 표적 밀도 조직과 낮은 표적 밀도 조직 사이의 분화는 결화활성 효과의 장점을 취하여 더 잘 달성될 수 있다.
실시예 32
36F2
TCB
,
Mov19
TCB
및 21A5
TCB
에 의해 유도된
SKov
-3 세포의 T 세포 사멸
36F2 TCB, Mov19 TCB 및 21A5 TCB에 의해 매개된 T 세포 사멸을 SKov-3 세포(중간 FolR1)에서 평가하였다. 인간 PBMC를 효과기로서 사용하고 이중특이적 항체로 항온처리하여 24 시간 및 48 시간에 사멸을 검출하였다. 간단히 말해, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포가 부착하도록 밤새 방치하였다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트)를 히스토파크 밀도 원심분리하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 선혈을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토파크 구배(시그마, #H8889)에 따라 적층하였다. 원심분리(450 xg, 30 분, 실온) 후, BMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고 PBMC를 새 팔콘 튜브로 옮긴 후 50 ml의 PBS를 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 xg, 10 분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계, 350 xg, 10 분). 생성된 PBMC 집단을 자동적으로(바이셀) 카운팅하고, 추가로 사용할 때까지(24 시간 미만) 세포 항온처리기에서 37℃, 5% CO2로 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지 중에 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 나타낸 농도(0.005 pM 내지 5 nM의 범위, 3회 반복검정)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T의 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸은 세포자멸성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 37℃, 5% CO2로 24 시간 및 48 시간 항온처리 후 평가하였다. 표적 세포의 최대 용리(= 100%)는 표적 세포를 1% 트리톤 X-100과 함께 항온처리하여 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 구축물없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 언급한다.
상기 결과는 36F2에 의해 유도된 사멸이 Mov19 TCB 및 21A5 TCB에 비해 강하게 감소됨을 나타낸다(도 23A 및 23B). 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 계산된 사멸 분석에 대한 EC50 값을 하기 표 27에 요약하였다.
| EC50 [ pM ] | ||
| 항체 | 24 시간 | 48 시간 |
| 36F2 TCB | 1406.07* | 134.5 |
| Mov19 TCB | 0.75 | 0.05 |
| 21A5 TCB | 2.83 | 0.10 |
| *기울기는 포화에 도달하지 않았고, 값은 이론적이다. | ||
실시예
33
상이한 1가 및 2가 이중특이적 T 세포 포맷에서 36F2 TCB 및 16D5 TCB에 의해 유도된 T 세포 사멸
HeLa(높은 FolR1, 약 2 x 106개 카피, 표 14, 도 27), Skov-3(중간 FolR1, 약 7 x 104 내지 9 x 104 개 카피, 표 14, 도 27) 및 HT-29(낮은 FolR1, 약 10 x 104개 카피, 표 14, 도 27) 인간 종양 세포의 36F2 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB 고전적, 1+1 16D5 TCB 및 16D5 TCB HT 항체에 의해 매개된 T 세포 사멸을 평가하였다. DP47 TCB 항체를 음성 대조군으로서 포함하였다. 인간 PBMC를 효과기로서 사용하고, 이중특이적 항체로 항온처리하고 24 시간에 사멸을 검출하였다. 간단히 말해, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포가 부착하도록 밤새 방치하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자로부터 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토파크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 선혈을 몇균 PBS로 희석하고, 히스토파크 구배(시그마, #H8889)에 따라 적층하였다. 원심분리(450 xg, 30 분, 실온) 후, PBMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고, PBMC를 새 팔콘 튜브로 옮긴 후 50 ml의 PBS로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 xg, 10 분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계, 350 xg, 10 분). 생성된 PBMC 집단을 자동적으로(바이셀) 카운팅하고, 추가로 사용할 때까지(24 시간 미만) 세포 항온처리기에서 37℃, 5% CO2로 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지 중에 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 나타낸 농도(0.01 pM 내지 100 nM의 범위, 3회 반복검정)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸은 세포자멸성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 37℃, 5% CO2로 항온처리 24 시간 후 평가하였다. 표적 세포의 최대 용리(= 100%)는 표적 세포를 1% 트리톤 X-100과 함께 항온처리하여 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 언급한다.
상기 결과는 36F2 TCB에 의해 유도된 모든 3개의 FolR1+ 표적 세포주의 표적-특이적 사멸이 16D5 TCB에 의해 유도된 사멸과 비교하여 훨씬 약하다는 것을 나타낸다(도 24, 표 29). 1가 16D5 TCB(16D5 HT 및 16D5 1+1)에 의해 유도된 표적-특이적 사멸은 2가 16D5 TCB(16D5 TCB 및 16D5 TCB 고전적)에 비해 더 나빴다. 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 계산된 사멸 분석과 관련한 EC50 값을 하기 표 28에 요약하였다. 중요하게는, 이 데이터는 2가 2+1 TCB 포맷에서 36F2 FolR1 결합제를 사용하면 16D5 FOLR1 TCB에 비해 치료적 창을 넓힌다는 것을 나타낸다(도 24). 반면에, 16D5와 36F2 FOLR1 TCB 사이의 효능 감소는 HeLa 세포의 경우 약 45 배(높은 FolR1 발현, 표 28 참조: 16D5 TCB = 0.8 대 36F2 TCB 36.0) 및 Skov3 세포의 경우 약 297 배(중간 FolR1 발현, 표 28 참조: 16D5 TCB = 0.6 대 36F2 TCB 178.4)이고, 이러한 감소는 낮은 FolR1 발현을 갖는 HT29의 경우 거의 7000 배(표 28 참조: 16D5 TCB = 5.7 대 36F2 TCB 39573)이다. 따라서, 36F2 FOLR1 TCB는 높게 발현하는 세포와 낮게 발현하는 세포 사이를 구별하고, 이는 일부 정상의 비암성 조직의 세포가 매우 낮은 수준의 FolR1(세포당 약 1000개 미만 카피)을 발현하는 것처럼 독성을 감소시키는데 특별히 중요하다. 이 관찰과 일치하게, 하기 실시예 35에서 논의된 결과는, 36F2 TCB가 단세포의 T 세포 사멸을 유도하지 않는 반면(도 26A 내지 26D), 16D5 TCB의 경우 일부 사멸이 항온처리 48 시간 후 HRCEpiC 및 HRPEpiC 세포에서 관찰될 수 있음(도 26B 및 26C)을 나타낸다. 36F2 TCB의 이러한 중요한 특징은 낮은(부분적으로 극성화된) 발현을 갖는 정상 조직이 아니라 높은 또는 중간 FolR1 발현을 갖는 종양 조직의 강력한 사멸을 매개하도록, FolR1-양성 종양의 치료를 위한 투여량을 허용한다. 특히, 이 특징은 동일한 낮은 친화성 36F2 결합제를 보유하는 1가 1+1 포맷을 사용할 때 관찰되지 않는 것처럼, 2가 2+1 도립된 포맷에서 36F2 TCB의 결합활성에 의해 매개되는 것처럼 보인다.
환언하면, 2가 2+1 포맷에서 36F2 TCB는 비교적 낮은 친화성의 FolR1 결합 모이어티를 포함하지만, 이는 높은 FolR1 발현 세포와 낮은 FolR1 발현 세포 사이에 분화를 허용하는 결합활성 효과를 갖는다. 종양 세포는 높은 수준 또는 중간 수준으로 FolR1을 발현하기 때문에, 이러한 TCB는 종양 세포에 선택적으로 결합하고, 낮은 수준에서 FolR1을 발현하거나 전혀 발현하지 않는 정상의 비-암성 세포에 결합하지 않는다.
상기 유리한 특징 이외에, 2가 2+1 도립된 포맷에서 36F2 TCB는 또한 화학적 가교 결합 또는 다른 하이브리드 접근을 필요로 하지 않는 장점을 갖는다. 이는 환자, 예를 들면, FolR1-양성 암성 종양을 갖는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에 적합하게 만든다. 2가 2+1 도립된 포맷에서 36F2 TCB는 표준 CHO 방법을 사용하여 적은 응집물을 생성할 수 있다. 또한, 2가 2+1 포맷에서 36F2 TCB는 인간에게 투여될 때 고도로 면역원성인 래트 및 뮤린 폴리펩티드를 이용하는 분자보다 뛰어나게 만드는 인간 및 인간화된 서열을 포함한다. 더욱이, 2가 2+1 포맷에서 36F2 TCB는 FcgR 결합을 파괴하도록 조작되고, 상기와 같이, FcgR 교차 결합 및 투입 반응을 야기하지 않고, 또한 환자에게 투여될 때 이의 안정성을 강화시킨다.
전술된 경과에 의해 입증된 바와 같이, 이의 헤드-투-테일 기하구조는 2가 2+1 도립된 포맷에서 36F2 TCB를 절대 표적 세포 사멸을 유도하는 고도로 강한 분자로 만든다. 이의 2가는 결합활성 및 효능을 강화시키지만, 또한 높은 발현 세포와 낮은 발현 세포 사이에 분화를 허용한다. 이의 결합활성 영향으로 인해 높은 표적 발현 세포 또는 중간 표적 발현 세포에 대한 이의 선호도는 FolR1을 낮은 수준으로 발현하는 정상 세포의 T 세포 매개된 사멸로부터 야기된 독성을 감소시킨다.
2가 2+1 포맷에서 36F2 TCB 및 본원에 개시된 다른 실시양태의 추가의 이점은 이들의 임상 개발이 인간, 시노몰구스 및 뮤린 FolR1에 결합하는 것처럼 분자를 파괴하는 용도를 필요로 하지 않는다는 것이다. 상기와 같이, 본원에 개시된 분자는 항체보다 3종 모두로부터 FolR1을 인식하지 않는 이전에 기대된 FolR1에 대한 상이한 에피토프를 인식한다.
| 항체 |
Hela
( FolR1 높음) |
Skov
-3
( FolR1 중간) |
HT
-29
( FolR1 낮음) |
| 16 D5 TCB | 0.8 | 0.6 | 5.7 |
|
16
D5
TCB
고전적 |
4.6 | 2.0 | 13.0 |
| 16 D5 TCB HT | 11.6 | 12.3 | 15.1 |
| 16 D5 TCB 1+1 | 23.8 | 48.9 | 883.8* |
| 36F2 TCB | 36.0 | 178.4 | 39573.0* |
| *기울기는 포화에 도달하지 않았고, 오직 이론적인 값이다. | |||
표 29는 시험된 상이한 세포주에서 16D5 TCB 및 36F2 TCB의 EC50 값의 비교를 나타낸다. 수득된 EC50 값 중에서 δ(16D5 TCB의 EC50 - 36F2 TCB의 EC50) 및 x-배 차이(16D5 TCB의 EC50/36F2 TCB의 EC50)를 계산하였다.
| 항체 |
Hela
( FolR1 높음) |
Skov
-3
( FolR1 중간) |
HT
-29
( FolR1 낮음) |
| 16 D5 TCB | 0.82 | 0.63 | 5.73 |
| 36F2 TCB | 35.99 | 178.40 | 39573.00* |
| Δ | 35.17 | 177.77 | 39567.27 |
| x-배 | 43.83 | 284.61 | 6906.58 |
| *기울기는 포화에 도달하지 않았고, 오직 이론적인 값이다. | |||
계산된 EC50 값은 표적 세포에서 FolR1 발현이 낮을수록 36F2 TCB와 16D5 TCB 사이의 차이가 더 커짐을 분명하게 나타낸다.
16D5 TCB 및 36F2 TCB의 EC50 값의 비교를 위해 수행한 것과 동일한 계산을 16D5 TCB 및 2개의 1가 16D5 TCB(16D5 TCB HT 및 16D5 1+1)에 대하여 수행하였다. 표 30 및 31은 16D5 TCB 대 16D5 TCB HT(표 30) 및 16D5 TCB 대 16D5 TCB 1+1(표 31)의 EC50 값의 비교, 뿐만 아니라 상응하는 δ(16D5 TCB의 EC50 - 16D5 TCB HT/1+1의 EC50) 및 x-배 차이(16D5 TCB의 EC50/16D5 TCB HT/1+1의 EC50)를 나타낸다.
| 항체 |
Hela
( FolR1 높음) |
Skov
-3
( FolR1 중간) |
HT
-29
( FolR1 낮음) |
| 16 D5 TCB | 0.82 | 0.63 | 5.73 |
| 16 D5 TCB HT | 11.61 | 12.27 | 15.11 |
| Δ | 10.79 | 11.65 | 9.38 |
| x-배 | 14.14 | 19.58 | 2.64 |
| 항체 |
Hela
( FolR1 높음) |
Skov
-3
( FolR1 중간) |
HT
-29
( FolR1 낮음) |
| 16 D5 TCB | 0.82 | 0.63 | 5.73 |
| 16 D5 TCB 1+1 | 23.84 | 48.86 | 883.78* |
| Δ | 23.02 | 48.24 | 878.05 |
| x-배 | 29.03 | 77.95 | 154.24 |
| *기울기는 포화에 도달하지 않았고, 오직 이론적인 값이다. | |||
16D5 TCB 및 36F2 TCB의 EC50 값의 비교는 표적 세포에서 FolR1 발현이 적을수록 EC50 값에서 차이가 커짐을 나타낸다(표 29). 이 효과는 16D5 TCB 및 1가 16D5 TCB의 비교에서 볼 수 없었다(표 29 및 표 30). 16D5 TCB 1+1의 경우(표 31), 16D5 TCB와 16D5 TCB 1+1의 EC50 사이의 차이에서 FolR1 발현의 감소와 함께 약간 증가하지만, 16D5 TCB 대 36F2 TCB의 비교에서 볼 수 있는 것만큼 현저하지는 않다.
실시예 34
36F2 TCB 및 16D5 TCB 항체에 의해 유도된 FolR1-발현 종양 세포의 T 세포-사멸 후
CD8
+ 및
CD4
+ 효과기 세포에서
CD25
및
CD69
상향조절
36F2 TCB 및 16D5 TCB에 의해 매개된 FolR1-발현 HeLa, SKov-3 및 HT-29 종양 세포의 T 세포 사멸 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화는 FACS 분석에 의해 T 세포 활성화 마커 CD25(말기 활성화 마커) 및 CD69(초기 활성화 마커)를 인식하는 항체를 사용하여 평가하였다. DP47 TCB를 결합하지 않는 대조군으로서 포함하였다. 항체 및 사멸 분석 조건은 본질적으로 동일한 항체 농도 범위(0.01 pM 내지 100 nM, 3회 반복검정), 10:1의 E:T 비 및 48 시간의 항온처리 시간을 사용하여 전술한 바와 같다(실시예 32).
항온처리 후, PBMC를 환전 96-웰 플레이트로 옮기고, 400 xg으로 4 분 동안 원심분리하고, 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. CD8(PE 항-인간 CD8, BD #555635), CD4(브릴리언트 바이올렛 421(상표) 항-인간 CD4, 바이오레전드 #300532), CD69(FITC 항-인간 CD69, BD #555530) 및 CD25(APC 항-인간 CD25, BD #555434)로 제조자의 설명서에 따라 표면 염색하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰 PBS로 2회 세척하였다. 원심분리 후, FACS 측정을 위해 샘플을 200 ㎕/웰 PBS 0.1%중에 재현탁하였다. 샘플을 BD FACS 칸토II로 분석하였다.
36F2 TCB는 HeLa(도 25a) 및 SKov-3(도 25b) 세포의 사멸 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 활성화 마커(CD25 및 CD69)의 표적-특이적 상향조절을 유도한다. 16D5 TCB와 비교하여, CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 36F2에 의해 유도된 CD25 및 CD69의 상향조절은 훨씬 약하다.
HT-29(낮은 FolR1)에서, 활성화 마커의 상향조절은 36F2 TCB의 가장 높은 농도에서만 볼 수 있다. 그에 반해, 16D5 TCB와 함께 CD25 및 CD69의 상향조절은 훨씬 낮은 항체 농도에서 이미 볼 수 있다(도 25c).
종양 용리 실험에서 잘 볼 수 있는 것처럼, 사멸 후 T 세포(CD4+ 및 CD8+)에서 활성화 마커(CD25 및 CD69)의 분석은 표적 세포에서 FolR1 발현 수준이 낮을수록 16D5 TCB와 36F2 TCB 사이의 차이가 더 커짐을 분명히 나타낸다.
실시예 35
36F2
TCB
및 16
D5
TCB
에 의해 유도된 단세포의 T 세포 사멸
36F2 TCB 및 16D5 TCB에 의해 매개된 T 세포 사멸은 단세포[인간 신장 피질 상피 세포(HRCEpiC)(사이언셀 리서치 래보래토리즈; 카탈로그 번호 4110) 및 인간 망막 색소 상피 세포(HRPEpiC)(사이언셀 리서치 래보래토리즈(ScienCell Research Laboratories), 카탈로그 번호 6540)]에서 평가하였다. HT-29 세포(낮은 FolR1)는 대조군 세포주로서 포함하였다. DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군으로서 제공하였다. 인간 PBMC는 효과기로서 사용하고 사멸은 이중특이적 항체로 24 시간 및 48 시간 항온처리 후에 검출하였다. 간단히 말해, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 2.5 x 104개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포가 부착하도록 밤새 방치하였다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트)를 히스토파크 밀도 원심분리하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 선혈을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토파크 구배(시그마, #H8889)에 따라 적층하였다. 원심분리(450 xg, 30 분, 실온) 후, PBMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고, PBMC를 새 팔콘 튜브로 옮기고, 이어서 50 ml의 PBS로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 xg, 10 분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계, 350 xg, 10 분). 생성된 PBMC 집단을 자동적으로(바이셀) 카운팅하고, 추가로 사용할 때까지(24 시간 미만) 세포 항온처리기에서 37℃, 5% CO2로 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지 중에 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 나타낸 농도로 첨가하였다(0.01 pM 내지 10 nM의 범위, 3회 반복검정). PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 세포자멸성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 37℃, 5% CO2로 24 시간 및 48 시간 항온처리 후 표적 세포 사멸을 평가하였다. 표적 세포의 최대 용리(= 100%)는 1% 트리톤 X-100과 함께 표적 세포를 항온처리하여 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 언급한다.
상기 결과는 36F2 TCB가 단세포의 T 세포 사멸을 유도하지 않는 반면(도 26A 내지 26D), 16D5 TCB의 경우 일부 사멸은 48 시간 항온처리 후 HRCEpiC 및 HRPEpiC 세포에서 관찰될 수 있음(도 26B 및 26D)을 나타낸다. 전술한 바와 같이, HT-29 세포 사이의 T 세포 사멸에서 강한 차이는 16D5 TCB와 36F2 TCB 사이에서 관찰되었다(도 26E 및 26F).
실시예 36
DP47
GS
TCB
의 제조(2+1
도립된
교차
Fab
-
IgG
P329G
LALA
= "
표적되지
않은
TCB
")
"표적되지 않은 TCB"는 상기 실험에서 대조군으로서 사용하였다. 이중특이적 항체는 CD3e를 끌어들이지만 임의의 다른 항원에 결합하지 않고, 따라서 임의의 표적 세포에 T 세포를 교차결합할 수 없다(이후 임의의 사멸을 유도할 수 없다). 따라서, 이는 분석시 음성 대조군으로서 사용되어 임의의 비특이적 T 세포 활성화를 모니터링하였다. 이 표적되지 않은 TCB는 WO 2014/131712에 기재된 바와 같이 제조하였다. 간단히 말해, 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 불변 중쇄 또는 불변 경쇄가 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터로 예비-삽입되는 프레임으로 서브클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 구동되었고 CDS의 3' 말단에 합성 폴리A 신호 서열을 보유한다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유한다.
분자는 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 공동-형질감염시켜 생성되었다. 세포는 1:2:1:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 교차Fab":"벡터 중쇄 Fc(놉)-Fab교차Fab")에 상응하는 발현 벡터로 형질감염되었다.
형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 500 ml 쉐이크 플라스크에서 생성을 위해, 4 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml의 CD CHO 배지 중에 200 g의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI 용액을 첨가한 후 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 쉐이크 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃로 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 160 ml의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 15 분 동안 210 xg로 원심분리하여 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질은 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 40 ml의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 평형시킨 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어)에 부하하였다. 결합하지 않은 단백질은 적어도 10 컬럼 용량의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 세척하여 제거하였다. 표적 단백질은 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로부터 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 2.5)까지 20 컬럼 용량에 따른 구배 동안 용리하였다. 단백질 용액은 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 중화하였다. 표적 단백질을 농축하고 졍제한 후 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 용액(pH 6.0)으로 평형시킨 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 부하하였다.
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 측정하였다.
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 측정하였다.
분자의 순도 및 분자량은 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 칼리퍼 랩칩 GXII 시스템(칼리퍼 라이프사이언스)은 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 2 ㎍의 샘플을 분석을 위해 사용하였다.
항체 샘플의 응집물 함량은 25℃에서 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 실행 완충액(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7) 중에 분석하였다.
| 구축물 | 역가 [mg/l] |
수율 [mg/l] | 1차 정제 단계 후 응집물 [%] | HMW [%] | LMW [%] | 단량체 [%] |
| DP47 GS TCB | 103.7 | 8.04 | 8 | 2.3 | 6.9 | 91.8 |
| 피크 | kDa | 상응하는 쇄 | |
| 감소되지 않은 DP47 GS TCB(A) | 1 | 165.22 | 2개 경쇄가 결실된 분자 |
| 2 | 181.35 | 1개 경쇄가 결실된 분자 | |
| 3 | 190.58 | N-연결된 당화가 없는 정확한 분자 | |
| 4 | 198.98 | 정확한 분자 | |
| 감소된 DP47 GS TCB(B) | 1 | 27.86 | 경쇄 DP47 GS |
| 2 | 35.74 | 경쇄 huCH2527 | |
| 3 | 63.57 | Fc(홀) | |
| 4 | 93.02 | Fc(놉) |
실시예
37
16D5 TCB 및 9D11 TCB, 및 이들의 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 N100A 및 S100aA의
CD3
-발현
주르카트
세포에 대한 결합
16D5 TCB 및 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A 및 16D5 TCB S100aA, 및 9D11 TCB 및 인간 CD3에 대한 탈아미드화 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aA의 결합은 CD3-발현 불멸성 T 림프구 세포주(주르카트)에서 평가하였다. 간단히 말해, 세포를 수확하고, 카운팅하고, 생존력에 대하여 확인하고, FACS 완충액(0.1% BSA를 함유하는 100 ㎕의 PBS) 중에 2 x 106개 세포/㎖로 재현탁하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액(0.2 x 106개 세포를 함유)을 환저 96-웰 플레이트에서 30 분 동안 4℃에서 상이한 농도의 이중특이적 항체(686 pM 내지 500 nM)와 함께 항온처리하였다. 저온 PBS(0.1% BSA를 함유)로 2회 세척 단계 후, 샘플을 추가 30 분 동안 4℃에서 PE-공액결합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 2차 항체[잭슨 이뮤노 리서치 랩(Jackson Immuno Research Lab), PE #109-116-170]와 함께 재항온처리하였다. 샘플을 저온 PBS(0.1% BSA 함유)로 2회 세척한 후, FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACS에 의해 즉시 분석하였다. 결합 곡선은 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 수득하였다(도 28).
상기 결과는 모 항체 16D5 TCB(도 28A) 및 9D11 TCB(도 28B)와 비교하여 CD3에 대한 탈아미드화 변이체 N100A 및 S100aA의 결합 감소를 나타낸다.
실시예 38
16D5 TCB 및 9D11 TCB, 및 이들의 CD3 탈아미드화 변이체 N100A 및 S100aA에 의해 유도된
SKov
-3 및
HT
-29 세포의 T 세포 사멸
16D5 TCB 및 상응하는 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A 및 16D5 TCB S100aA, 및 9D11 TCB 및 탈아미드화 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aA에 의해 매개된 T 세포 사멸은 SKov-3(중간 FolR1) 및 HT-29(낮은 FolR1) 세포에서 평가하였다. 인간 PBMC는 효과기로서 사용하였고, 사멸은 이중특이적 항체로 24 시간 항온처리 후 검출하였다. 간단히 말해, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포가 부착하도록 밤새 방치하였다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트)를 히스토파크 밀도 원심분리하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 선혈을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토파크 구배(시그마, #H8889)에 따라 적층하였다. 원심분리(450 xg, 30 분, 실온) 후, PBMC-함유 중간상 위에 혈장을 버리고, PBMC를 새 팔콘 튜브로 옮긴 후, 50 ml의 PBS로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 xg, 10 분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계, 350 xg, 10 분). 생성된 PBMC 집단을 자동적으로(바이셀) 카운팅하고, 추가로 사용할 때까지(24 시간 미만) 세포 항온처리기에서 37℃, 5% CO2로 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지 중에 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 나타낸 농도로 첨가하였다(0.01 pM 내지 10 nM의 범위, 3회 반복검정). PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸은 세포자멸성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 37℃, 5% CO2로 항온처리 24 시간 후 평가하였다. 표적 세포의 최대 용리(= 100%)는 1% 트리톤 X-100과 함께 표적 세포를 항온처리하여 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 언급한다.
상기 결과는 SKov-3 세포에서 CD3 탈아미드화 변이체 16D5 TCB N100A및 16D5 S100aA에 의해 유도된 사멸은 16D5 TCB에 의해 유도된 것과 필적한다는 것을 보여준다(도 29A). 9D11 TCB 및 이의 변이체 9D11 TCB N100A 및 9D11 TCB S100aA의 경우도 동일하다(도 29B). FolR1 낮은 발현 HT-29 세포에서, S100aA 변이체는 16D5 TCB(도 30A) 및 9D11 TCB(도 30B)의 경우인 짝짓기오류 사멸 효율을 나타낸다. 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 계산된 사멸 분석에 관한 EC50 값을 하기 표 35 에 제시하였다.
| EC50 [ pM ] | ||
| 항체 | SKov -3 | HT -29 |
| 16 D5 TCB | 1.283 | 56.67 |
| 16 D5 TCB N100A | 1.886 | 91.95 |
| 16 D5 TCB S100aA | 1.939 | 165.6 |
| 9 D11 TCB | 1.283 | 2.827 |
| 9 D11 TCB N100A | 1.886 | 37.72 |
| 9 D11 TCB S100aA | 1.939 | n.d.* |
| *검출되지 않음 | ||
실시예
39
탈아미드화 부위를 제거하기 위한 2개의 CD3 결합제 변이체(N100A 및 S100aA)의
TCB
로
서 표면
플라즈몬
공명에 의한 생화학 특성 규명
인간 재조합 CD3(Fc 융합물과 같은 CD3ε-CD3δ 헤테로다이머)에 대한 CD3 결합제 변이체(N100A 또는 S100aA)를 갖는 2개의 16D5의 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험은 25℃에서 실행 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20; 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)로 비아코어 T200에서 수행하였다.
CD3
εδ-
Fc
에 대한 친화성
항-FolR1 이중특이적 T 세포와 재조합 CD3ε-δ 헤테로다이머 사이의 상호작용의 친화성을 후술된 바와 같이 측정하였다(표 36).
친화성 측정을 위해, 항-인간 Fab 특이적 항체의 약 6000 공명 단위(RU)의 직접 커플링(Fab 캡쳐 키트, 지이 헬쓰케어)을 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 pH 5.0으로 CM5 칩에서 수행하였다. 항-FolR1 이중특이적 T 세포를 200 nM로 20 ㎕/분의 유속으로 60 초 동안 포획하고, 기준 유동 세포를 포획하지 않고 남겨두었다. 인간 및 시노몰구스 엽산 수용체 1 Fc 융합물의 희석 시리즈(4.1 내지 3000 nM)를 30 ㎕/분으로 240 초 동안 모든 유동 세포에서 통과시켜 회합 단계를 기록하였다. 해리 단계를 240 초 동안 모니터링하고 샘플 용액에서 HBS-EP로 스위칭하여 촉발하였다. 칩 표면은 모든 60 초 사이클 후 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)의 이중 주사를 사용하여 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 1에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 상호작용에 대한 친화 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 맞추어 속도 상수로부터 유도된다.
| 리간드 | 분석물 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | KD |
| 16 D5 TCB N100A | huCD3 | 1.23E+04 | 4.67E-03 | 380 nM |
| 16 D5 TCB S100aA | huCD3 | 1.21E+04 | 5.49E-03 | 460 nM |
| 16 D5 TCB | huCD3 | 2.03E+04 | 4.41E-03 | 220 nM |
2개의 CD3 탈아미드화 변이체는 야생형 CD3 결합제(CH2527)에 비해 약간 감소된 친화성을 갖지만, 차이는 심각하지 않다.
실시예
40
CD3 결합제에서 탈아미드화 부위를 제거하기 위한 돌연변이를 갖는 16D5 이중특이적 T 세포의 2개의 변이체(16
D5
TCB
N100A
, 16
D5
TCB
S100aA
)의 생성 및 정제
일시적 형질감염 및 생성
2개의 탈아미드화 변이체 16D5 TCB는 후술된 바와 같이 필요한 벡터에 대하여 PEI 매개된 형질감염 방법을 사용하여 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성하였다. HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 500 ml 쉐이크 플라스크에서 생성을 위해, 4 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다(대안적인 규모를 위해 모든 양은 이에 따라 조정됨). 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg으로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml의 CD CHO 배지 중에 200 ㎍의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI 용액을 첨가한 후 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 쉐이크 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃로 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 160 ml의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 15 분 동안 210 xg으로 원심분리하여 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다. 생성 후 상청액을 수확하고, 0.22 μm 멸균 필터를 통해 여과하고, 정제할 때가지 4℃에서 저장하였다.
정제
2개의 탈아미드화 변이체 16D5 TCB를 표준 방법, 예컨대 단백질 A 친화성 정제(아크타 익스플로러) 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 2 단계로 정제하였다. 일시적 생성물로부터 수득된 상청액을 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)로 조정하고 8 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.5, 20 mM 나트륨 시트레이트)로 평형시킨 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)(지이 헬쓰케어, 컬럼 용량(cv) = 2 ml)에 적용하였다. 10 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 구배를 사용하여 20 cv 이상의 버퍼 B(20 mM 나트륨 시트레이트, pH 3.0, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 용액의 pH를 pH 6.0(0.5 M Na2HPO4, pH 8.0 사용)으로 완만하게 조정하였다. 샘플을 울트라 농축기[아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15, 30,000 MWCO, 밀리포어(Millipore)]를 사용하여 1 ml까지 농축하고, 이후 20 mM 히스티딘, pH 6.0, 140 mM NaCl로 평형시킨 하이로드(상표) 16/60 슈퍼덱스(상표) 200 제조용 등급(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용리된 분획의 응집물 함량은 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 이에 따라, 30 ㎕의 각각의 분획을 25℃에서 실행 완충액(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7)으로 평형시킨 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)에 적용하였다. 2% 미만의 올리고머를 함유하는 분획을 모았다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동(CE-SDS)으로 분석하였다. 정제된 단백질은 액체 N2 중에 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
| 명칭 | CD3 결합제에서 돌연변이 | 수율 [ mg /L] | 단량체 [%] | CE - SDS 에 의한 순도 [%] |
| 16D5 TCB | N100A | 9 | 100 | 89 |
| 16D5 TCB | S100aA | 23 | 100 | 83 |
| 16D5 TCB | 야생형 | 9 | 100 | 93 |
2개의 TCB는 야생형 CD3 결합제를 갖는 구축물과 유사하게 우수한 품질로 생성되었다.
실시예 41
CDR에서 핫스팟을 제거하기 위한 IgG로서 2개의 16D5 결합제 변이체(D52dE 및
D52dQ
)의 생성 및 정제
일시적 형질감염 및 생성
2개의 IgG는 후술된 바와 같이 필요한 벡터를 위해 PEI 매개된 형질감염 방법을 사용하여 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성하였다. HEK293 EBNA 세포는 CD CHO 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 500 ml 쉐이크 플라스크에서 생성을 위해, 4 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다(대안적인 규모를 위해 모든 양은 이에 따라 조정됨). 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg으로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터을 20 ml의 CD CHO 배지 중에 200 ㎍의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI 용액을 첨가한 후 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 쉐이크 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃로 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 160 ml의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 15 분 동안 210 xg로 원심분리하여 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다. 생성 후 상청액을 수확하고, 상청액을 함유하는 항체를 0.22 μm 멸균 필터를 통해 여과하고, 정제할 때까지 4℃에서 저장하였다.
항체 정제
2개의 IgG를 표준 방법, 예컨대 단백질 A 친화성 정제(아크타 익스플로러) 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 2 단계로 정제하였다. 일시적 생성물로부터 수득된 상청액을 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)으로 조정하고, 8 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5)로 평형시킨 포로스 맵캡쳐(POROS MabCapture) A[어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 컬럼 용량(cv) = 1 ml]에 적용하였다. 10 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 단계를 사용하여 5 cv 이상의 버퍼 B(20 mM 나트륨 시트레이트, pH 3.0, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 5 ml의 단백질을 아크타 익스플로러에서 루프에서 저장하고 이후 20 mM 히스티딘, pH 6.0, 140 mM NaCl(트윈은 사용하지 않음)로 평형시킨 하이로드 16/60 슈퍼덱스(상표) 200(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. IgG를 함유하는 분획을 모으고, 울트라 농축기(아미콘 울트라-15, 30,000 MWCO, 밀리포어)를 사용하여 농축하였다. 최종 풀의 응집물 함량을 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 이에 따라, 30 ㎕를 25℃에서 실행 완충액(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7)으로 평형시킨 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)에 적용하였다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동(CE-SDS)으로 분석하였다. 정제된 단백질은 4℃에서 저장하였다.
| 클론 |
돌연변이
HC / LC |
수율 [ mg /L] | 단량체 [%] | CE - SDS 에 의한 순도 [%] |
| 16D5 | D52dE | 24 | 100 | 96 |
| 16D5 | D52dQ | 20 | 100 | 96 |
2개의 IgG는 우수한 품질로 잘 생성되었다.
실시예 42
CDR에서 핫스팟을 제거하기 위한 IgG로서 2개의 16D5 결합제 변이체(D52dE 및
D52dQ
)의 표면
플라즈몬
공명에 의한 생화학 특성 규명
인간 및 시노몰구스 재조합 엽산 수용체 1(둘 다 Fc 융합물로서)에 대한 IgG로서 2개의 16D5 결합제 변이체(D52dE 및 D52dQ)의 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험은 25℃에서 실행 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20; 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 비아코어 T200에서 수행하였다.
엽산 수용체 1에 대한 결합활성
항-FolR1 IgGs 또는 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 결합활성은 후술된 바와 같이 측정하였다(표 39).
인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(FolR1-Fc)의 재조합 비오틴화된 단량체 Fc 융합물은 표준 커플링 지침(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)을 사용하여 SA 칩에서 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 160이었다. 항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포를 3.7 내지 900 nM의 농도 범위로 30 ㎕/분의 유속으로 유동 세포를 통해 180 초에 걸쳐 통과시켰다. 해리를 600 초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이는 재조합 비오틴화된 뮤린 IL2 수용체 Fc 융합물로 기준 유동 세포 고정화에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. IgG 또는 이중특이적 T 세포의 2가 결합으로부터 생성된 결합 곡선은 1:1 랭뮤어 결합(심지어 1:2 결합일지라도)에 대한 근사치였고 2가 결합의 결합활성을 나타내는 겉보기 KD를 수득하기 위한 모델로 맞췄다. 상호작용을 위한 겉보기 결합 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 맞춘 속도 상수로부터 유래되었다.
| 분석물 | 리간드 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | 겉보기 KD |
| 16 D5 D52dE IgG | huFolR1 | 1.62E+05 | 5.45E-04 | 3.4 nM |
| cyFolR1 | 2.98E+06 | 7.47E-03 | 2.5 nM | |
| 16 D5 D52dQ IgG | huFolR1 | 8.40E+04 | 7.75E-04 | 9.2 nM |
| cyFolR1 | 4.12E+05 | 2.04E-03 | 5 nM | |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 2.25E+05 | 5.00E-04 | 2.2 nM |
| cyFolR1 | 2.71E+05 | 6.63E-04 | 2.5 nM |
엽산 수용체 1에 대한 친화성
항-FolR1 IgGs 또는 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 친화성을 후술된 바와 같이 측정하였다(표 40).
친화성 측정을 위해, 항-인간 Fab 특이적 항체(Fab 캡쳐 키트, 지이 헬쓰케어)의 약 10,000 공명 단위(RU)의 직접 결합을 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 pH 5.0으로 CM5 칩에서 수행하였다. 항-FolR1 IgGs 또는 이중특이적 T 세포를 20 nM로 10 ㎕/분의 유속으로 40 초 동안 포획하였고, 기준 유동 세포를 포획하지 않고 남겨 두었다. 인간 및 시노몰구스 엽산 수용체 1 Fc 융합물의 희석 시리즈(12.35 내지 3000 nM)를 모든 유동 세포에서 30 ㎕/분으로 240 초 동안 통과시켜 회합 단계를 기록하였다. 해리 단계를 300 초 동안 모니터링하고 샘플 용액을 HBS-EP로 스위칭하여 촉발하였다. 60 초 동안 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)의 이중 주사를 사용하여 모든 사이클 후 칩 표면을 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 1에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 상호작용에 대한 친화 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 맞추어 속도 상수로부터 유도되었다.
| 리간드 | 분석물 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | KD |
| 16 D5 D52dE IgG | huFolR1 | 2.40E+04 | 2.27E-03 | 95 nM |
| cyFolR1 | 2.25E+04 | 1.20E-02 | 530 nM | |
| 16 D5 D52dQ IgG | huFolR1 | 6.97E+03 | 1.62E-03 | 230 nM |
| cyFolR1 | 8.20E+03 | 3.32E-03 | 410 nM | |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 2.05E+04 | 7.05E-04 | 35 nM |
| cyFolR1 | 1.72E+04 | 1.62E-03 | 90 nM |
2개의 16D5 핫스팟 변이체는 야생형 16D5 결합제보다 유사한 결합활성(2가 결합)을 갖는다. 결합활성은 D52dQ 변이체의 경우 약간 감소하고, 이 차이는 친화성(1가 결합)에서 더욱더 볼 수 있다.
실시예
43
FolR1에 대한 친화성을 감소시키는 중쇄 및 경쇄에서 돌연변이를 갖는 16D5 결합제의 12개
변이체의
IgG
로서의 생성 및 정제
일시적 형질감염 및 생성
12개의 IgG는 후술된 바와 같이 PEI 매개된 형질감염 방법을 사용하여 필요한 벡터를 위해 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성되었다. HEK293 EBNA 세포는 CD CHO 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 500 ml 쉐이크 플라스크에서 생성을 위해, 4 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다(대안적인 규모를 위해 모든 양은 이에 따라 조정됨). 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml의 CD CHO 배지 중에 200 ㎍의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI 용액을 첨가한 후 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 쉐이크 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃로 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 160 ml의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 15 분 동안 210 xg로 원심분리하여 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다. 생성 후, 상청액을 수확하고, 상청액을 함유하는 항체를 0.22 μm 멸균 필터를 통해 여과하고 정제할 때까지 4℃에서 저장하였다.
항체 정제
모든 분자를 표준 방법, 예컨대 단백질 A 친화성 정제(아크타 익스플로러) 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 2 단계로 정제하였다. 일시적 생성물로부터 수득된 상청액을 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)으로 조정하고, 8 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5)로 평형시킨 포로스 맵캡쳐 A(어플라이드 바이오시스템스, 컬럼 용량(cv) = 1 ml)에 적용하였다. 10 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 단계를 사용하여 5 cv 이상의 버퍼 B(20 mM 나트륨 시트레이트, pH 3.0, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 단백질 5 ml를 아크타 익스플로러에서 루프에 저장하고, 이후 20 mM 히스티딘, pH 6.0, 140 mM NaCl, 0.01% 트윈20으로 평형시킨 하이로드 16/60 슈퍼덱스(상표) 200(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. IgG를 함유하는 분획을 모으고 울트라 농축기(아미콘 울트라-15, 30,000 MWCO, 밀리포어)를 사용하여 농축하였다. 최종 풀의 응집물 함량은 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 이에 따라, 30 ㎕를 25℃에서 실행 완충액(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7)으로 평형시킨 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)에 적용하였다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(PD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하고, 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동(CE-SDS)으로 분석하였다. 정제된 단백질은 4℃에서 저장하였다.
| 클론 |
돌연변이
HC / LC |
수율 [ mg /L] | 단량체 [%] | CE - SDS 에 의한 순도 [%] |
| 16D5 | W98Y/wt | 32 | 100 | 100 |
| 16D5 | W98Y/K53A | 24 | 100 | 100 |
| 16D5 | S35H/wt | 21 | 100 | 100 |
| 16D5 | S35H/K53A | 18 | 100 | 100 |
| 16D5 | S35H/S93A | 18 | 100 | 100 |
| 16D5 | W96Y/wt | 40 | 100 | 100 |
| 16D5 | W96Y/K53A | 21 | 100 | 100 |
| 16D5 | W96Y/S93A | 25 | 98 | 100 |
| 16D5 | R50S/K53A | 10 | 98 | 100 |
| 16D5 | R50S/S93A | 7 | 100 | 100 |
| 16D5 | G49S/K53A | 42 | 100 | 100 |
| 16D5 | G49S/S93A | 45 | 100 | 100 |
모든 12개 IgG는 우수한 품질로 잘 생성되었다.
실시예 44
표면 플라즈몬 공명에 의한 IgG로서 16D5 중쇄 및 경쇄 조합 변이체의 생화학 특성 규명
IgG로서 FolR1 16D5 중쇄 및 경쇄 조합 변이체 결합제의 상이한 재조합 엽산 수용체(인간, 뮤린 및 시노몰구스 FolR1; 모두 Fc 융합물로서)에 대한 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험은 실행 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20; 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200에서 수행하였다.
엽산 수용체 1에 대한 결합활성
항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 결합활성은 후술된 바와 같이 특정하였다(표 42).
인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(FolR1-Fc)의 재조합 비오틴화된 단량체 Fc 융합물을 표준 커플링 지침(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)을 사용하여 SA 칩에서 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 300이었다. 항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포를 11.1 내지 900 nM의 농도로 30 ㎕/분의 유속으로 유동 세포를 통해 180 초에 걸쳐 통과시켰다. 해리를 240 또는 600 초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 고정화에서 수득된 반응을 재조합 비오틴화된 뮤린 IL2 수용체 Fc 융합물로 차감하여 교정하였다. IgG 또는 이중특이적 T 세포의 2가 결합으로부터 생성된 결합 곡선은 1:1 랭뮤어 결합(심지어 1:2 결합일지라도)에 근사치였고 그 모델에 맞추어 2가 결합의 결합활성을 나타내는 겉보기 KD를 수득하였다. 상호작용을 위한 명백한 결합 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 맞춤 속도 상수로부터 유래하였다. 너무 빠른 회합 및 해리 단계를 갖는 낮은 친화성 운동을 1:1 랭뮤어 결합 모델로 맞추는 경우, 정상 상태 분석 모델은 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 적용하였다. 정상 상태 분석은 평형시 결합 반응의 KDfmf 제공한다.
|
분석물
HC 변이체 / LC 변이체 |
리간드 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | 겉보기 KD |
| W98Y / K53A | huFolR1 | 약한 결합 | ||
| cyFolR1 | 약한 결합 | |||
| S35H / K53A | huFolR1 | 2.10E+04 | 2.91E-02 | 1400 nM |
| cyFolR1 | 3.47E+04 | 4.04E-02 | 1100 nM | |
| W96Y / K53A | huFolR1 | 580 nM (정상 상태) |
||
| cyFolR1 | 660 nM (정상 상태) |
|||
| W98Y / wt | huFolR1 | 1.36E+05 | 3.28E-02 | 240 nM |
| cyFolR1 | 1.71E+05 | 3.61E-02 | 200 nM | |
| S35H / S93A | huFolR1 | 2.43E+05 | 2.20E-02 | 90 nM |
| cyFolR1 | 6.12E+05 | 6.77E-02 | 110 nM | |
| G49S / K53A | huFolR1 | 1.90E+05 | 1.15E-02 | 60 nM |
| cyFolR1 | 3.93E+05 | 3.28E-02 | 80 nM | |
| R50S / K53A | huFolR1 | 3.28E+05 | 1.97E-02 | 60 nM |
| cyFolR1 | 5.50E+05 | 4.55E-02 | 80 nM | |
| S35H / wt | huFolR1 | 1.32E+05 | 5.68E-03 | 40 nM |
| cyFolR1 | 2.23E+05 | 1.24E-02 | 55 nM | |
| R50S / S93A | huFolR1 | 1.25E+05 | 3.23E-03 | 30 nM |
| cyFolR1 | 4.39E+05 | 7.80E-03 | 20 nM | |
| W96Y / S93A | huFolR1 | 6.55E+05 | 1.89E-02 | 30 nM |
| cyFolR1 | 6.25E+05 | 1.74E-02 | 30 nM | |
| G49S / S93A | huFolR1 | 1.52E+05 | 3.06E-03 | 20 nM |
| cyFolR1 | 3.58E+05 | 6.22E-03 | 20 nM | |
| W96Y / wt | huFolR1 | 1.29E+05 | 2.13E-03 | 20 nM |
| cyFolR1 | 1.73E+05 | 2.11E-03 | 10 nM | |
| 36F2 TCB | huFolR1 | 2.44E+06 | 1.37E-02 | 6 nM |
| cyFolR1 | 4.12E+06 | 2.15E-02 | 5 nM | |
| muFolR1 | 4.86E+05 | 1.20E-03 | 2.5 nM | |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 1.41E+05 | 4.25E-04 | 3 nM |
| cyFolR1 | 1.78E+05 | 6.39E-04 | 3.5 nM |
엽산 수용체 1에 대한 친화성
항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 친화성은 후술된 바와 같이 측정하였다(표 43).
친화성 측정을 위해, 항-인간 Fab 특이적 항체(Fab 캡쳐 키트, 지이 헬쓰케어)의 약 10,000 공명 단위(RU)의 직접 커플링은 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 pH 5.0으로 CM5 칩에서 수행하였다. 항-FolR1 IgG 또는 이중특이적 T 세포를 200 nM로 10 ㎕/분의 유속으로 40 초 동안 포획하고, 기준 유동 세포를 포획하지 않고 방치하였다. 인간 엽산 수용체 1 Fc 융합물의 희석 시리즈(12.35 내지 3000 nM)는 모든 유동 세포에서 30 ㎕/분으로 240 초 동안 통과시켜 회합 단계를 기록하였다. 해리 단계는 300 초 동안 모니터링하고 샘플 용액을 HBS-EP로 스위칭하여 촉발하였다. 모든 주기 후 60 초 동안 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)의 이중 주입을 사용하여 칩 표면을 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 1에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 상호작용에 대한 친화 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 맞추어 속도 상수로부터 유도하였다.
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리간드
HC 변이체 / LC 변이체 |
분석물 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | KD |
| W98Y / K53A | huFolR1 | 결합 없음 | ||
| S35H / K53A | huFolR1 | 약한 결합 | ||
| W96Y / K53A | huFolR1 | 약한 결합 | ||
| W98Y / wt | huFolR1 | 5400 nM (정상 상태) |
||
| G49S / K53A | huFolR1 | 9.19E+03 | 1.74E-02 | 1900 nM |
| R50S / K53A | huFolR1 | 1.35E+04 | 2.45E-02 | 1800 nM |
| 36F2 TCB | huFolR1 | 5.00E+04 | 8.57E-02 | 1700 nM |
| S35H / S93A | huFolR1 | 8.43E+03 | 1.12E-02 | 1300 nM |
| S35H / wt | huFolR1 | 8.96E+03 | 1.13E-02 | 1200 nM |
| R50S / S93A | huFolR1 | 1.57E+04 | 1.23E-02 | 780 nM |
| G49S / S93A | huFolR1 | 1.05E+04 | 7.99E-03 | 760 nM |
| W96Y / wt | huFolR1 | 9.95E+03 | 5.44E-03 | 550 nM |
| W96Y / S93A | huFolR1 | 4.05E+04 | 1.72E-02 | 420 nM |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 1.18E+04 | 7.22E-04 | 60 nM |
16D5 FolR1 결합제의 12개 "친화성 감소된" 변이체는 16D5 야생형 결합제 및 36F2 결합제와 비교하기 위해 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석하였다. 목적은 36F2와 필적할만한 친화성 및 결합활성을 갖는 16D5 변이체를 찾는 것이다. 1가 결합(친화성)을 측정한 경우, 36F2보다 더 높은 친화성을 갖는 변이체 및 더 낮은 친화성을 갖는 변이체가 존재한다. 그러나, 2가 결합(결합활성)에서 모든 변이체는 36F2보다 더 큰 겉보기 KD 값을 갖는다. 이는 주로 36F2에 대하여 작은 겉보기 KD 값을 야기하는 36F2의 빠른 회합 속도(ka)로 인한다. 36F2가 2가와 결합할 때 큰 결합활성이 이 결합제에 대해 독특한 것처럼 보인다. 상기 나타낸 바와 같이, 36F2는 확인될 수 있는 유일한 인간, 뮤린 및 시노몰구스 교차반응성 결합제였다.
실시예 45
HeLa
세포에서 발현된 인간
FolR1
에 대한 16
D5
HC
/
LC
변이체의
결합
인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 16D5의 다양한 HC/LC 변이체의 결합은 HeLa 세포에서 평가하였다. 간단히 말해, 세포를 수확하고, 카운팅하고, 생존력을 확인하고, FACS 완충액(0.1% BSA를 함유하는 100 ㎕의 PBS) 중에 2 x 106개 세포/㎖로 재현탁하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액(0.2 x 106개 세포 함유)을 환저 96-웰 플레이트에서 30 분 동안 4℃에서 상이한 농도의 이중특이적 항체(229 pM 내지 500 nM)와 함께 항온처리하였다. 0.1% BSA를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척 단계 후, 샘플을 추가 30 분 동안 4℃에서 PE-공액결합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 2차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩, PE #109-116-170)와 함께 재항온처리하였다. 샘플을 0.1% BSA를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척한 후, 1% PFA로 밤새 고정시켰다. 이후 샘플을 원심분리하고, 0.1% BSA를 함유하는 PBS에 재현탁하고, FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACS로 분석하였다. 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 결합 곡선을 수득하였다(도 32a 내지 32e). FolR2에 결합된 36F2 TCB는 마우스에서 잘 견디지 않았고, 목적한 효능을 입증하지 않았다.
실시예 46
인간 및 시노몰구스 FolR1에 대한 친화성을 감소시키는 돌연변이를 갖는 16D5 이중특이적 T 세포의 4개 변이체 16D5 TCB G49S/S93A, G49S/K53A, W96Y, W96Y/D52E의 생성 및 정제
일시적 형질감염 및 생성
FolR1에 대한 감소된 친화성을 갖는 16D5 TCB의 4개의 추가 변이체는 PEI 매개된 형질감염 방법을 사용하여 후술된 바와 같이 필요한 벡터를 위해 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성하였다. 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 6 mM L-글루타민을 함유하는 엑셀 배양 배지 및 250 mg/l의 G418 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 600 ml 튜브스핀 플라스크(최대 작동 용량 400 mL)에서 생성을 위해, 6 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터는 20 ml의 CD CHO 배지 중에 400 ㎍의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 1080 ㎕의 PEI 용액(2.7 ㎍/㎖)을 첨가한 후, 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 600 ml 튜브스핀 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃로 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 360 ml의 엑셀 + 6 mM L-글루타민 + 5 g/L 펩소이 + 1.0 mM VPA 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 7% 피드 7을 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 20 내지 30 분 동안 3600 xg로 원심분리하여(시그마 8K 원심분리기) 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 mm 필터), 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
정제
감소된 친화성 변이체 16D5 TCB는 표준 방법, 예컨대 단백질 A 친화성 정제(아크타 익스플로러) 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 2 단계로 정제하였다. 일시적 생성물로부터 수득된 상청액을 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)으로 조정하고, 8 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.5, 20 mM 나트륨 시트레이트)로 평형시킨 하이트랩 단백질 A(지이 헬쓰케어, 컬럼 용량(cv) = 5 ml)에 적용하였다. 10 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 구배를 사용하여 20 cv 이상의 버퍼 B(20 mM 나트륨 시트레이트, pH 3.0, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 용액의 pH를 pH 6.0(0.5 M Na2HPO4, pH 8.0 사용)으로 완만하게 조정하였다. 샘플을 울트라 농축기(아미콘 울트라-15, 30,000 MWCO, 밀리포어)를 사용하여 1 ml까지 농축하고, 이후 20 mM 히스티딘, pH 6.0, 140 mM NaCl, 0.01% 트윈20으로 평형시킨 하이로드(상표) 16/60 슈퍼덱스(상표) 200 제조용 등급(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용리된 분획의 응집물 함량을 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 이에 따라, 30 ㎕의 각각의 분획을 25℃에서 실행 완충액(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7)으로 평형시킨 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)에 적용하였다. 2% 미만의 올리고머를 함유하는 분획을 모았다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하고, 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동(CE-SDS)으로 분석하였다. 정제된 단백질은 액체 N2에서 냉동시키고, -80℃에서 저장하였다.
| 명칭 | 감소된 친화성에 대한 돌연변이 | 수율 [ mg /L] | 단량체 [%] | CE - SDS 에 의한 순도 [%] |
| 16D5 TCB | G49S S93A | 10.3 | 100 | 88 |
| 16D5 TCB | G49S K53A | 22.3 | 98.5 | 96 |
| 16D5 TCB | W96Y | 15.2 | 98.7 | 92.5 |
| 16D5 TCB | W96Y D52E | 9.9 | 99.3 | 92.9 |
| 16D5 TCB | Wild-type | 5.4 | 96 | 91.6 |
감소된 친화성을 갖는 모든 변이체는 우수한 품질로 생성될 수 있다.
실시예 47
HeLa
세포에서 발현된 인간
FolR1
에 대한 36F2
TCB
, 16
D5
TCB
, 및 2개의 16D5 친화성
감소된
변이체
16
D5
W96Y
/
D52E
TCB
및 16
D5
G49S
/
S93A
TCB
의 결합
인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB, 및 2개의 16D5 친화성 감소된 변이체 16D5 W96Y/D52E TCB 및 16D5 G49S/S93A TCB의 결합을 HeLa 세포에서 평가하였다. 간단히 말해, 세포를 수확하고, 카운팅하고, 생존력을 확인하고, FACS 완충액(0.1% BSA를 함유하는 100 ㎕의 PBS) 중에 2 x 106개 세포/㎖로 재현탁하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액(0.2 x 106개 세포 함유)을 환저 96-웰 플레이트에서 30 분 도안 4℃에서 상이한 농도의 이중특이적 항체(30 pM 내지 500 nM)를 사용하여 항온처리하였다. 0.1% BSA를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척 단계 후, 샘플을 추가 30 분 동안 4℃에서 FITC-공액결합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 2차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩, PE #109-096-098)와 함께 재항온처리하였다. 샘플을 0.1% BSA를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척한 후, 샘플을 원심분리하고, 0.1% BSA를 함유하는 PBS에 재현탁하고, FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACF로 분석하였다. 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 결합 곡선을 수득하였다(도 33).
실시예 48
인간 및 시노몰구스 FolR1에 대한 중간 친화성을 갖는 3개의 이중특이적 T 세포 14B1, 6
E10
, 2
C7
의 생성 및 정제
일시적 형질감염 및 생성
중간 친화성 TCB는 PEI 매개된 형질감염 방법을 사용하여 후술된 바와 같이 필요한 벡터를 위해 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성하였다. 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 6 mM L-글루타민을 함유하는 엑셀 배양 배지 및 250 mg/l G418 배양 배지 중에 무혈청 현탁액 중에 배양하였다. 600 ml 튜브스핀 플라스크(최대 작동 용량 400 mL)에서 생성을 위해, 6 x 109개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 xg로 원심분리하고, 상청액을 예비-가온된 20 ml의 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터는 20 ml의 CD CHO 배지 중에 400 ㎍의 최종 양의 DNA와 혼합하였다. 1080 ㎕의 PEI 용액(2.7 ㎍/㎖)을 첨가한 후, 15 초 동안 볼텍싱하고, 이후 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 600 ml 튜브스핀 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃로 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 360 ml의 엑셀 + 6 mM L-글루타민 + 5 g/L 펩소이 + 1.0 mM VPA 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 7% 피드 7을 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 20 내지 30 분 동안 3600 xg로 원심분리하여(시그마 8K 원심분리기), 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 0.01% w/v의 최종 농도로 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
정제
중간 친화성 TCB는 표준 방법, 예컨대 단백질 A 친화성 정제(아크타 익스플로러) 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 2 단계로 정제하였다. 일시적 생성물로부터 수득된 상청액을 pH 8.0(2 M 트리스, pH 8.0 사용)으로 조정하고, 8 컬럼 용량(cv)의 버퍼 A(20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.5, 20 mM 나트륨 시트레이트)로 평형시킨 하이트랩 단백질 A(지이 헬쓰케어, 컬럼 용량(cv) = 5 ml)에 적용하였다. 10 cv의 버퍼 A로 세척한 후, 단백질을 pH 구배를 사용하여 20 cv 이상의 버퍼 B(20 mM 나트륨 시트레이트, pH 3.0, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신)로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 용액의 pH를 pH 6.0(0.5 M Na2HPO4 pH 8.0 사용)으로 완만하게 조정하였다. 샘플을 울트라 농축기(아미콘 울트라-15, 30,000 MWCO, 밀리포어)를 사용하여 1 ml까지 농축한 후 20 mM 히스티딘, pH 6.0, 140 mM NaCl, 0.01% 트윈20으로 평형시킨 하이로드(상표) 16/60 슈퍼덱스(상표) 200 제조용 등급(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용리된 분획의 응집물 함량을 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 이에 따라, 30 ㎕의 각각의 분획을 25℃에서 실행 완충액(25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7)으로 평형시킨 TSKgel G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)에 적용하였다. 2% 미만의 올리고머를 함유하는 분획을 모았다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 단백질 농도를 측정하고, 구축물의 순도 및 분자량은 제조자의 설명서에 따라(인스트루먼츠 캘리퍼 랩칩 지엑스, 퍼킨 엘머) 환원제의 존재 및 부재하에 SDS 모세관 전기영동(CE-SDS)으로 분석하였다. 정제된 단백질은 액체 N2에서 냉동시키고, -80℃에서 저장하였다.
| 명칭 | 수율 [ mg /L] | 단량체 [%] | CE - SDS 에 의한 순도 [%] |
| 6E10 TCB | 2.3 | 93 | 95 |
| 14B1 TCB | 1.8 | 94 | 70 |
| 9C7 TCB | 3.4 | 98 | 99 |
모든 중간 친화성 이중특이적 T 세포가 생성될 수 있다. 수율은 높지 않다. 품질은 9C7의 경우 우수하고 14B1 및 6E10의 경우 허용가능하다.
실시예
49
HT
-29 세포에서 발현된 인간
FolR1
에 대한 16
D5
HC
/
LC
변이체의
결합
인간 FolR1에 대한 36F2 TCB, 16D5 TCB 및 16D5의 다양한 HC/LC 변이체(도 34a 내지 34e)의 결합을 HT-29 세포에서 평가하였다. 간단히 말해, 세포를 수확하고, 카운팅하고, 생존력을 확인하고, FACS 완충액(0.1% BSA를 함유하는 100 ㎕의 PBS) 중에 2 x 106개 세포/㎖로 재현탁하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액(0.2 x 106개 세포 함유)을 환저 96-웰 플레이트에서 30 분 동안 4℃에서 상이한 농도의 이중특이적 항체(229 pM 내지 500 nM)와 함께 항온처리하였다. 0.1% BSA를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척 단계 후, 샘플을 추가 30 분 동안 4℃에서 PE-공액결합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 2차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩, PE #109-116-170)와 함께 재항온처리하였다. 샘플을 0.1% BSA를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척한 후, 1% PFA로 밤새 고정시켰다. 이후 샘플을 원심분리하고, 0.1% BSA를 함유하는 PBS에 재현탁하고, FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACF로 분석하였다. 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 결합 곡선을 수득하였다(도 34a 내지 34e).
실시예 50
인간 및 마우스
FolR1
및
FolR2
에 대한 중간
FolR1
결합제의 결합
인간 및 마우스 FolR1 및 FolR2에 대한 중간 FolR1 결합제(6E10 TCB, 14B1 TCB 및 9C7 TCB), 뿐만 아니라 16D5 TCB 및 36F2 TCB의 교차 반응성은 형질감염된 HEK293T 세포에서 FACS 결합 분석으로 평가하였다.
간단히 말해, 세포를 수확하고, 카운팅하고, 생존력을 확인하고, FACS 완충액(0.1% BSA를 함유하는 100 ㎕의 PBS) 중에 2 x 106개 세포/㎖를 재현탁하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액(0.2 x 106개 세포 함유)을 환저 96-웰 플레이트에서 30 분 동안 4℃에서 100 nM의 이중특이적 항체와 함께 항온처리하였다. 0.1% BSA를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척 단계 후, 샘플을 추가 30 분 동안 4℃에서 플루오레세인(FITC) 어피니퓨어 F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 2차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩, PE #109-096-098)와 함께 항온처리하였다. 샘플을 0.1% BSA를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척한 후, 1% PFA로 밤새 고정시켰다. 이후 샘플을 원심분리하고, 0.1% BSA를 함유하는 PBS에 재현탁하고, FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACF로 분석하였다. 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 그래프를 수득하였다(도 35A 내지 35D).
상기 결과는 36F2 TCB 및 14B1 TCB가 마우스 FolR1 및 인간 및 마우스 FolR2에 대하여 교차반응성이 있음을 나타낸다. 6E10 TCB의 경우, 인간 FolR2에 대하여 약한 결합이 관찰될 수 있다. 16D5 TCB 및 9C7 TCB는 인간 FolR1에 특이적이고, 마우스 FolR1 또는 인간 및 마우스 FolR2에 교차반응성을 나타내지 않는다.
실시예 51
이중특이적 T 세포 포맷에서 16D5 감소된 친화성 변이체 및 추가의 중간 친화성 결합제의 표면
플라즈몬
공명에 의한 생화학 특성 규명
2가 이중특이적 T 세포 포맷에서 재조합 인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(모두 Fc 융합물로서)에 대한 항-FolR1 16D5 감소된 친화성 변이체 및 추가의 중간 친화성 결합제의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험은 실행 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20; 비아코어, 지이 헬쓰케어)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200에서 수행하였다. 친화성 및 결합활성 측정을 위해 사용된 분자는 하기 표 46에 제시하였다.
| 명칭 | 설명 | 도면 참조 |
| 16 D5 감소된 친화성 변이체 16D5 TCB 16D5 G49S/S93A TCB 16D5 G49S/K53A TCB 16D5 W96Y TCB 16D5 W96Y/D52E TCB |
2+1 T 세포 이중특이적 도립된 포맷(공통 경쇄) | 도 1a |
| 중간 친화성 결합제 36F2 TCB 6E10 TCB 14B1 TCB 9C7 TCB |
2+1 2+1 T 세포 이중특이적 도립된 표맷, 교차fab | 도 1f |
단일 주사
먼저, 항-FolR1 TCB는 단일 주사(표 47)에 의해 분석하여 이들의 교차반응성(인간, 뮤린 및 시노몰구스 FolR1에 대한) 및 특이성(인간 FolR1, 인간 FolR2, 인간 FolR3에 대한)을 특성 규명하였다. 인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(FolR1-Fc) 또는 인간 엽산 수용체 2 및 3(FolR2-Fc, FolR3-Fc)의 재조합 비오틴화된 단량체 Fc 융합물은 표준 커플링 지침(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)을 사용하여 SA 칩에서 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 300 내지 400 RU이었다. TCB는 60 초 동안 500 nM의 농도로 주입하였다.
| 클론 명칭 | huFolR1 에 결합 | cyFolR1 에 결합 | muFolR1 에 결합 | huFolR2 에 결합 | huFolR3 에 결합 |
| 16 D5 TCB | + | + | - | - | - |
| 16 D5 G49S/S93A TCB | + | + | - | - | - |
| 16 D5 W96Y/D52E TCB | + | + | - | - | - |
| 36F2 TCB | + | + | + | +/- | - |
| 6 E10 TCB | + | + | - | - | - |
| 14B1 TCB | + | + | + | +/- | - |
| 9 C7 TCB | + | + | - | - | - |
엽산 수용체 1에 대한 결합활성
항-FolR1 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 결합활성은 하기 표에 기재된 바와 같이 측정하였다(표 48).
인간, 시노몰구스 및 뮤린 엽산 수용체 1(FolR1-Fc)의 재조합 비오틴화된 단량체 Fc 융합물은 표준 커플링 지침(비아코어, 지이 헬쓰케어)을 사용하여 SA 칩에서 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 200 내지 300 RU였다. 항-FolR1 이중특이적 T 세포는 11.1 내지 900 nM(16D5 감소된 친화성 변이체의 경우) 또는 0.2 내지 500 nM(추가의 중간 친화성 결합제 및 36F2의 경우)의 농도 범위로 30 ㎕/분의 유속으로 유동 세포를 통해 180 초에 걸쳐 통과하였다. The 해리 240 또는 600 초 동안 모니터링하였다. 30 초 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)의 이중 주입을 사용하여 모든 사이클 후 칩 표면을 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 재조합 비오틴화된 뮤린 IL2R Fc 융합물(관련없는 Fc 융합된 수용체)을 사용하여 기준 유동 세포 고정화에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 이중특이적 T 세포의 2가 결합으로부터 생성된 결합 곡선은 1:1 랭뮤어 결합(비록 1:2 결합일지라도)에 근사치이고 2가 결합의 결합활성을 나타내는 겉보기 KD를 수득하기 위한 모델로 맞췄다. 상호작용에 대한 겉보기 결합 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 맞춘 속도 상수로부터 유래하였다.
| 분석물 | 리간드 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | 겉보기 KD |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 1.68E+05 | 4.33E-04 | 3 nM |
| cyFolR1 | 2.08E+05 | 6.95E-04 | 3 nM | |
|
16
D5
G49S
/
S93A
TCB
|
huFolR1 | 1.49E+05 | 2.09E-03 | 10 nM |
| cyFolR1 | 4.54E+05 | 7.84E-03 | 20 nM | |
|
16
D5
G49S
/
K53A
TCB
|
huFolR1 | 1.32E+05 | 5.86E-03 | 40 nM |
| cyFolR1 | 3.73E+05 | 2.56E-02 | 70 nM | |
|
16
D5
W96Y
TCB
|
huFolR1 | 1.15E+05 | 1.44E-03 | 10 nM |
| cyFolR1 | 1.37E+05 | 1.68E-03 | 10 nM | |
| 16 D5 W96Y / D52E TCB | huFolR1 | 1.24E+05 | 1.40E-03 | 10 nM |
| cyFolR1 | 5.17E+05 | 1.41E-02 | 30 nM | |
|
36F2
TCB
|
huFolR1 | 1.12E+06 | 7.90E-03 | 7 nM |
| cyFolR1 | 1.97E+06 | 1.10E-02 | 6 nM | |
| muFolR1 | 5.54E+05 | 1.47E-03 | 3 nM | |
|
6
E10
TCB
|
huFolR1 | 7.93E+06 | 8.74E-03 | 1 nM |
| cyFolR1 | 5.56E+06 | 5.72E-03 | 1 nM | |
|
14B1
TCB
|
huFolR1 | 1.12E+06 | 1.40E-03 | 1 nM |
| cyFolR1 | 1.02E+06 | 1.66E-03 | 2 nM | |
| muFolR1 | 8.03E+06 | 8.20E-04 | 0.1 nM | |
| 9 C7 TCB | huFolR1 | 1.18E+06 | 1.42E-03 | 1 nM |
| cyFolR1 | 4.98E+06 | 4.82E-03 | 1 nM |
엽산 수용체 1에 대한 친화성
항-FolR1 이중특이적 T 세포와 재조합 엽산 수용체 사이의 상호작용의 친화성은 하기 기재된 바와 같이 측정하였다(표 49).
친화성 측정을 위해, 항-인간 Fab 특이적 항체(Fab 캡쳐 키트, 지이 헬쓰케어)의 약 12,000 공명 단위(RU)의 직접 커플링을 pH 5.0에서 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 CM5 칩에서 수행하였다. 항-FolR1 이중특이적 T 세포는 20 nM로 10 ㎕/분의 유속으로 40 초 동안 포획하고, 기준 유동 세포는 포획하지 않고 방치하였다. 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 엽산 수용체 1 Fc 융합물의 희석 시리즈(12.3 내지 3000 nM)를 모든 유동 세포에서 30 ㎕/분으로 240 초 동안 통과시켜 회합 단계를 기록하였다. 해리 단계를 300 초 동안 모니터링하고 샘플 용액을 HBS-EP로 스위칭하여 촉발하였다. 60 초 동안 10 mM 글리신-HCl(pH 2.1)의 이중 투입을 사용하여 모든 사이클 후 칩 표면을 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 1에서 수득된 반응을 차감하여 교정하였다. 상호작용에 대한 친화 상수는 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 맞추어 속도 상수로부터 유래하였다. 너무 빠른 회합 및 해리 단계를 갖는 낮은 친화성 운동을 1:1 랭뮤어 결합 모델로 맞추는 경우, 정상 상태 분석 모델을 비아 이벨루에이션 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 적용하였다. 정상 상태 분석은 평형시 결합 반응의 KD로 주어진다.
| 분석물 | 리간드 | ka (1/ Ms ) | kd (1/s) | KD |
| 16 D5 TCB | huFolR1 | 1.22E+04 | 7.02E-04 | 57 nM |
| cyFolR1 | 1.29E+04 | 1.71E-03 | 130 nM | |
|
16
D5
G49S
/
S93A
TCB
|
huFolR1 | 1.01E+04 | 8.37E-03 | 830 nM |
| cyFolR1 | 2.05E+04 | 8.60E-03 | 420 nM | |
|
16
D5
G49S
/
K53A
TCB
|
huFolR1 | 9.17E+03 | 1.59E-02 | 1700 nM |
| cyFolR1 | 1900 nM (정상 상태 분석) |
|||
|
16
D5
W96Y
TCB
|
huFolR1 | 1.11E+04 | 4.05E-03 | 370 nM |
| cyFolR1 | 1.17E+04 | 5.16E-03 | 440 nM | |
| 16 D5 W96Y / D52E TCB | huFolR1 | 1400 nM (정상 상태 분석) |
||
| cyFolR1 | 5600 nM (정상 상태 분석) |
|||
|
36F2
TCB
|
huFolR1 | 1400 nM (정상 상태 분석) |
||
| cyFolR1 | 1500 nM (정상 상태 분석) |
|||
| muFolR1 | 3.50E+04 | 1.73E-02 | 490 nM | |
|
6
E10
TCB
|
huFolR1 | 1200 nM (정상 상태 분석) |
||
| cyFolR1 | 1500 nM (정상 상태 분석) |
|||
|
14B1
TCB
|
huFolR1 | 6.16E+04 | 3.03E-02 | 490 nM |
| cyFolR1 | 1200 nM (정상 상태 분석) |
|||
| muFolR1 | 7.03E+04 | 2.28E-03 | 30 nM | |
| 9 C7 TCB | huFolR1 | 840 nM (정상 상태 분석) |
||
| cyFolR1 | 1400 nM (정상 상태 분석) |
16D5 결합제로 도립된 돌연변이는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 인간 및 시노몰구스 FolR1에 대한 이의 친화성을 감소시킨다. 감소하는 친화성에 대한 순위는 16D5 WT(57 nM)> W96Y(6.5 배 이하)> G49S/S93A(14.5 배 이하)> W96Y/D52E(24.5 배 이하)> G49S/K53A(30 배 이하)이다. 동일한 순위는 결합활성 값에서 보이지만, 배수 차이는 더 작다: 16D5 WT(3 nM)> W96Y, G49S/S93A, W96Y/D52E(3 배 이하)> G49S/K53A(13 배 이하).
중간 친화성 결합제는 친화성 16D5(57 nM)>14B1(8.5 배 이하)> 9C7(15 배 이하) > 6E10(21 배 이하)>36F2(24.5 배 이하)의 순위에 따른다. 그러나, 이러한 차이는 결합활성 측정시 사라진다: 14B1, 9C7, 6E10(1nM)> 16D5(3 nM) > 36F2(7 nM).
16D5 W96Y/D52E TCB는 이전 후보에서 관찰된 문제를 해결한다. 16D5 W96Y/D52E TCB는 공통 경쇄 16D5 결합제에 기초하고 모 16D5 결합제에 대하여 중쇄에서 2개의 점 돌연변이를 갖는다. W96Y 돌연변이는 모 결합제에 비해 FolR1에 대한 결합제의 친화성을 감소시키고, D52E 돌연변이는 탈아미드화 부위를 제거하고 또한 친화성에서의 감소에 기여한다. 16D5 W96Y/D52E TCB는 인간 및 시노몰구스 FolR1에 결합하지만, 뮤린 FolR1에 결합하지 않는다. 이는 FolR1에 특이적이고 재조합 인간 FolR2 또는 인간 FolR3에 결합하지 않는다. 16D5 W96Y/D52E의 친화성(1가 결합)은 인간 FolR1에 대하여 약 1.4 μM(모 16D5 결합제의 24.5 배 미만)이고 결합활성(2가 결합)은 약 10 nM(모 16D5 결합제의 3 배 미만)이다.
실시예 52
중간
FolR1
TCB
에 의해 유도된
HeLa
,
SKov
-3 및
HT
-29 세포의 T 세포 사멸
중간 FolR1 결합제(6E10 TCB, 14B1 TCB 및 9C7 TCB)에 의해 매개된 T 세포 사멸은 HeLa(높은 FolR1), SKov-3(중간 FolR1) 및 HT-29(낮은 FolR1) 세포에서 평가하였다. 16D5 TCB 및 36F2 TCB는 기준점으로서 포함하였다. 인간 PBMC는 효과기로서 사용하였고, 사멸은 이중특이적 항체로 항온처리 24 시간 및 48 시간 후에 검출하였다. 간단히 말해, 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 2.5 x 104개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포가 부착하도록 밤새 방치하였다. 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트)를 히스토파크 밀도 원심분리하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 선혈을 멸균 PBS로 희석하고, 히스토파크 구배(시그마, #H8889)에 따라 적층하였다. 원심분리(450 xg, 30 분, 실온) 후, PBMC-함유 중간상 위의 혈장을 버리고, PBMC를 새 팔콘 튜브로 옮긴 후 50 ml의 PBS로 채웠다. 혼합물을 원심분리하고(400 xg, 10 분, 실온), 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계, 350 xg, 10 분). 생성된 PBMC 집단을 자동적으로(바이셀) 카운팅하고, 추가 사용할 때까지(24 시간 미만) 세포 항온처리기에서 37℃, 5% CO2로 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지 중에 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 나타낸 농도로 첨가하였다(0.01 pM 내지 10 nM의 범위, 3회 반복검정). PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 세포자멸성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 37℃, 5% CO2로 항온처리 24 시간 및 48 시간 후 표적 세포 사멸을 평가하였다. 표적 세포의 최대 용리(= 100%)는 1% 트리톤 X-100과 함께 표적 세포를 항온처리하여 달성하였다. 최소 용리(= 0%)는 이중특이적 구축물 없이 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 언급한다.
상기 결과는, 중간 FolR1 결합제(6E10 TCB, 14B1 TCB 및 9C7 TCB)에 의해 유도된 종양 용리가 높은 친화성 16D5 TCB에 대하여 수득된 것과 낮은 친화성 36F2 TCB에 대하여 수득된 것 사이의 범위임을 나타낸다(도 36a 내지 36c). 중간 FolR1 결합제 중에서, 14B1 TCB는 항온처리 48 시간 후 가장 강한 사멸을 볼 수 있음을 나타낸다(도 36a 내지 36c). 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 계산된, 항온처리 24 시간 및 48 시간 후 사멸 분석에 관한 ED50 값은 하기 표 50 및 51에 제시하였다.
| EC50 [ pM ] | |||
| 항체 | Hela | SKov -3 | HT -29 |
| 6 E10 TCB | 6.5 | n.d. | *n.d. |
| 14B1 TCB | 8.5 | 30.1 | *n.d. |
| 9 C7 TCB | 2.8 | 741.4 | *n.d. |
| 16 D5 TCB | 2.2 | 1.5 | *n.d. |
| 36F2 TCB | 31.1 | *n.d. | *n.d. |
| *측정되지 않음 | |||
| EC50 [ pM ] | |||
| 항체 | Hela | SKov -3 | HT -29 |
| 6 E10 TCB | 2.1 | 2164.0 | *n.d. |
| 14B1 TCB | 5.5 | 4.7 | 397.7 |
| 9 C7 TCB | 4.3 | 519.6 | *n.d. |
| 16 D5 TCB | 2.3 | *n.d. | 4.9 |
| 36F2 TCB | 10.5 | *n.d. | n.d. |
| *측정되지 않음 | |||
실시예
53
친화성 감소된 16D5 변이체에 의해 유도된 HeLa, SKov-3 및 HT-29 세포의 T 세포 사멸
친화성 감소된 16D5 변이체(16D5-G49S/S93A TCB, 16D5-G49S/K53A TCB, 16D5 W96Y TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB)에 의해 매개된 T 세포 사멸은 HeLa(높은 FolR1), SKov-3(중간 FolR1) 및 HT-29(낮은 FolR1) 세포에서 평가하였다. 16D5 TCB 및 36F2 TCB는 기준점으로서 포함하였다. 상기 분석은 전술한 바와 같이 수행하였다(실시예 52).
상기 결과는 친화성 감소된 16D5 변이체(16D5-G49S/S93A TCB, 16D5-G49S/K53A TCB, 16D5 W96Y TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB)에 의해 유도된 종양 용리가 높은 친화성 16D5 TCB에 대하여 수득된 값과 낮은 친화성 36F2 TCB에 대하여 수득된 값 사이의 범위임을 나타낸다. 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 계산된, 24 시간 및 48 시간 항온처리 후 사멸 분석에 관한 EC50 값을 하기 표 52 및 53에 제시하였다(도 37a 내지 37c).
| EC50 [ pM ] | |||
| 항체 | Hela | SKov -3 | HT -29 |
| 16 D5 TCB | 2.2 | 1.5 | *n.d. |
| 16 D5 - G49S /S93A TCB | 2.3 | 430.4 | *n.d. |
| 16 D5 - G49S /K53A TCB | 4.4 | 1701.9 | *n.d. |
| 16 D5 W96Y TCB | 3.0 | 164.5 | *n.d. |
| 16 D5 W96Y / D52E TCB | 1.3 | 235.4 | *n.d. |
| 36F2 TCB | 31.1 | *n.d. | *n.d. |
| *측정되지 않음 | |||
| EC50 [ pM ] | |||
| 항체 | Hela | SKov -3 | HT -29 |
| 16 D5 TCB | 2.3 | 0.1 | 4.9 |
| 16 D5 - G49S /S93A TCB | 0.9 | 95.9 | 99.3 |
| 16 D5 - G49S /K53A TCB | 0.5 | 950.4 | 1790.7 |
| 16 D5 W96Y TCB | 1.8 | 24.7 | 99.3 |
| 16 D5 W96Y / D52E TCB | 0.9 | 93.0 | 399.4 |
| 36F2 TCB | 10.5 | 968.5 | *n.d. |
| *측정되지 않음 | |||
따라서, 상기 기재된 36F2 FOLR1 TCB와 같이, 16D5 W96Y/D52E TCB는 매우 낮은 수준의 FolR1(세포당 약 1000개 미만 카피)을 발현하는 일부 정상의 비-암성 조직의 세포와 같이 독성을 감소시키는데 특히 중요한 높은 발현 세포와 낮은 발현 세포 사이를 구별한다. 이 관찰과 일치하게, 하기 실시예 54에 논의된 결과는 16D5 W96Y/D52E TCB가 모 16D5 TCB에 비해 단세포의 훨씬 낮은 수준의 T 세포 매개된 사멸을 유도함을 나타낸다(도 38a 내지 38c). 상기와 같이, 16D5 W96Y/D52E TCB는 낮은 발현을 갖는 정상 조직이 아니라, 높은 또는 중간 FolR1 발현을 갖는 종양 조직의 강력한 사멸을 매개한다. 2가 2+1 포맷에서 16D5 W96Y/D52E TCB는 비교적 낮은 친화성의 FolR1 결합 모이어티를 포함하지만, 높은 FolR1 발현 세포와 낮은 FolR1 발현 세포 사이를 구별하도록 결합활성 교화를 갖는다. 종양 세포는 높은 수준 또는 중간 수준에서 FolR1을 발현하기 때문에, 이 TCB는 선택적으로 낮은 수준에서 FolR1을 발현하거나 전혀 발현하지 않는 정상의 비-암성 세포가 아니라 종양 세포에 결합한다. 전술된 36F2 FOLR1 TCB에 관한 추가의 이점과 같이, 16D5 W96Y/D52E TCB는 FolR2 또는 FolR3이 아니라 FolR1에 특이적으로 결합하고, 추가로 생체내 처리를 위한 이의 안정성을 강화한다.
상기 유리한 특징 이외에, 2가 2+1 도립된 포맷에서 16D5 W96Y/D52E TCB는 또한 화학적 교차 결합 또는 다른 하이브리드 접근이 필요하지 않은 이점을 갖는다. 이는 환자, 예를 들면, FolR1-양성 암성 종양을 갖는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에 적합하게 만든다. 2가 2+1 도립된 포맷에서 16D5 W96Y/D52E TCB는 적은 응집물을 갖는 표준 CHO 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또한, 2가 2+1에서 16D5 W96Y/D52E TCB는 인간에게 투여될 때 주로 면역원성인 래트 및 뮤린 폴리펩티드를 이용하는 분자에 뛰어나게 하는 인간 및 인간화된 서열을 포함한다. 더욱이, 2가 2+1 포맷에서 16D5 W96Y/D52E TCB는 FcgR 결합을 파괴하기 위해 조작되고, 예컨대, FcgR 교차결합 및 주사 반응을 야기하지 않고, 추가로, 환자에게 투여될 때 이의 안정성을 강화한다.
상기 기재된 결과에 의해 입증된 바와 같이, 이의 헤드-투-테일 기하구조는 2가 2+1 도립된 포맷에서 절대 표적 세포 사멸을 유도하는 매우 강력한 분자인 16D5 W96Y/D52E TCB를 제조한다. 이의 2가는 결합활성 및 효능을 강화하지만, 또한 높은 발현 세포와 낮은 발현 세포 사이에 분화를 허용한다. 이의 결합활성으로 인해 높은 또는 중간 표적 발현 세포에 대한 이의 선호성은 낮은 수준에서 FolR1을 발현하는 정상 세포의 T 세포 매개된 사별로부터 초래하는 독성을 감소시키는데 영향을 끼친다.
2가 2+1 포맷에서 16D5 W96Y/D52E TCB 및 본원에 기재된 다른 실시양태의 추가의 이점은, 이들의 임상 개발이 인간 및 시노몰구스 FolR1에 결합하는 것처럼 대용 분자의 사용을 필요로 하지 않는다는 것이다. 상기와 같이, 본원에 개시된 분자는 2개의 종으로부터 FolR1을 인식하지 않는 이전에 기재된 FolR1에 대한 항체 보다 상이한 에피토프를 인식한다.
실시예 54
친화성 감소된 16D5 변이체 및 중간 FolR1 TCB에 의해 유도된 단세포의 T 세포 사멸
친화성 감소된 16D5 변이체(16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB) 및 중간 FolR1 결합제 14B1 TCB에 의해 매개된 T 세포 사멸은 단세포(인간 신장 피질 상피 세포(HRCEpiC)(사이언셀 리서치 래보래토리즈; 카탈로그 번호 4110) 및 인간 망막 색소 상피 세포(HRPEpiC)(사이언셀 리서치 래보래토리즈; 카탈로그 번호 6540)에서 평가하였다. HT-29 세포(낮은 FolR1)는 대조군 세포주로서 포함하였다. 16D5 TCB 및 36F2 TCB는 기준점으로서 포함하고, DP47 TCB는 결합하지 않는 대조군으로서 제공하였다.
0.1 pM 내지 100 nM(3회 반복검정)의 항체 농도 범위를 사용하여 실시예 52에 기재된 바와 같이 분석을 수행하였다.
인간 단세포가 표적으로 사용되는 경우, 전체 용리는 이러한 세포에서 FolR1의 낮은 발현율로 인해 훨씬 적다(도 38a 내지 38c). 높은 친화성 FolR1 결합제의 경우, 16D5 TCB T 세포 매개된 용리는 사용된 2개의 단세포 유형에서 관찰될 수 있다. 종양 세포주가 표적으로 사용되었을 때 이전에 관찰된 바와 같이, 중간 FolR1 결합제 14B1 TCB 및 친화성 감소된 16D5 변이체(16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB)에 의해 매개된 용리는, 높은 친화성 16D5 TCB에 대하여 관찰된 것과 낮은 친화성 36F2 TCB에 대하여 관찰된 것 사이의 범위이다. 낮은 수준에서 FolR1을 발현하는 세포의 상당히 감소된 용리는 낮은 표적 활성과 일치하고, 이에 따라 친화성 감소된 16D5 변이체 16D5-G49S/S93A TCB 및 16D5 W96Y/D52E TCB는 생체내에서 잘 견딜 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 55
암컷
NOG
마우스에서
FOLR1
TCB
구축물의 단일 용량
PK
실험 시작시 평균 8 내지 10 주령의 암컷 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG) 마우스(타코닉으로부터 구입, SOPF 설비)를 무특이 병원체 조건하에 회부된 지침(지브이-솔라스; 펠라사; 티에르슈게)에 따라 12 시간 명/12 시간 암의 일일 주기로 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부(ZH193/2014)에 의해 검토되고 승인되었다. 도착 후, 동물은 1 주 동안 유지하여 새로운 환경에 익숙하게 하고 관찰하였다. 연속적인 건강 모니터링을 정기적으로 수행하였다.
단일 용량 약동학 연구(SDPK)를 수행하여 FOLR1 TCB 구축물(36F2, 16D5, 16D5 G49S/S93A 및 16D5 W96Y/D52E)의 노출을 평가하였다. 0.5 mg/kg의 정맥내 볼루스 투여를 NOG 마우스에 투여하고, 약동학 평가를 위해 선택된 시점에 혈액 샘플을 채혈하였다. 마우스 혈청 샘플을 ELISA로 분석하였다. 비오틴화된 a-huCD3-CDR(mAb<ID-mAb<CD3>>M-4.25.93-IgG-Bi), 시험 샘플, 다이곡시게닌 표지된 a-huFc 항체(mAb<H-FC pan>M-R10Z8E9-IgG-Dig) 및 항-다이곡시게닌 검출 항체(POD)를 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 마이크로역가 플레이트에 단계적으로 첨가하고 모든 단계 후 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 상기 플레이트를 각각의 단계 후 3회 세척하여 결합하지 않은 물질을 제거하였다. 최종적으로, ABTS 기질 용액을 첨가하여 유색 반응 생성물을 형성하여 페리옥시다아제-결합된 복합체를 시각화하였다. (490 nm에서의 기준 파장과 함께) 405 nm에서 광도측정으로 측정된 반응 생성물 강도는 혈성 샘플에서 분석물 농도에 비례한다. 구축물에 대한 표준 곡선의 보정 범위는 0.078 내지 5 ng/㎖이고, 이때 1.5 ng/㎖는 정량화의 하한치이다(LLOQ).
SDPK 연구는 16D5, 16D5 W96Y/D52E 및 16D5 G49S/S93A 구축물에 대한 IgG-유사 PK-프로필을 입증하였다(도 39a 및 39b). 이로 인해, 주당 1회 일정을 효능 연구를 위해 선택하였다(도 40b). 36F2에 대한 반감기는 다른 클론에 비해 작았다. 36F2는 마우스 FOLR1에 대하여 교차 반응성이 있는 시험된 4개의 분자 중 유일하고, 이는 이 분자에 대한 적은 반감기를 설명할 수 있고 TMDD(표적 매개된 약물 기질)을 나타낸다.
실시예 56
HeLa-함유 NOG 마우스에서 인간 PBMC 전이 후 FOLR1 TCB 구축물(16D5, 16D5 G49S/S93A 및 16
D5
W96Y
/
D52E
)의
생체내
효능
FOLR1 TCB 구축물은 PBMC 이식된 NOG 마우스에 피하 주사된 FOLR1-발현 인간 자궁경부 암 세포주 HeLa에서 시험하였다.
HeLa 세포는 원래 ATCC(CCL2)로부터 수득되었고 확대 후 로슈-글리카트(Roche-Glycart) 내부 세포 은행에 기탁하였다. 종양 세포주는 5% CO2에서 수포화된 대기 중에서 37℃에서 10% FCS(깁코)를 함유하는 RPMI에서 정기적으로 배양하였다. 계대 13을 생존력 > 95%에서 이식을 위해 사용하였다. 동물당 1 x 106개 세포를 총 100 ㎕의 RPMI 세포 배양 배지(깁코)에서 동물의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다.
실험 시작시 8 내지 10 주령인 60마리 암컷 NOG 마우스(덴마크 소재의 타코닉에서 사육됨)를 무특이 병원체 조건하에 회부된 지침(지브이-솔라스; 펠라사; 티에르슈게)에 따라 12 시간 명/12 시간 암의 일일 주기로 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부(ZH193/2014)에 의해 검토되고 승인되었다. 도착 후, 동물을 1 주 동안 유지하여 새로운 환경에 익숙해지도록 하고 관찰하였다. 연속적인 건강 모니터링을 정기적으로 수행하였다.
연구 프로토콜에 따라(도 40b), 연구 0일에 마우스에 1 x 106개 HeLa 세포를 피하 주사하였다. 연구 30일에, 종양이 약 150 mm3의 크기에 도달했을 때, 건강한 공여자의 인간 PBMC를 피콜 방법을 통해 단리하고, 10 x 106개 세포를 종양-함유 마우스에 정맥내 주사하였다. 2일 후(32일), 마우스를 무작위 추출하고 6개의 실험 군(n = 10)으로 동일하게 분배한 후 16D5(0.5 mg/kg), 16D5 G49S/S93A(2.5 또는 0.5 mg/kg) 및 16D5 W96Y/D52E(2.5 또는 0.5 mg/kg)를 정맥내 주사하였다. 모든 처리 군에 총 3주 동안 매주 1회 주사하였다. 마우스에 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내 주사하였다. 비히클 군의 마우스에 PBS를 주사하였다. 200 ㎕의 적절한 양의 TCB를 수득하기 위해, 스톡 용액을 필요할 때마다 PBS로 희석하였다. 종양 성장을 칼리퍼를 사용하여 매주 1회 측정하였고(도 40c 내지 40e), 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다(W: 너비, L: 길이):
Tv:(W2/2) x L
FOLR1 TCB 구축물의 매주 1회 주사는 상당한 종양 회귀를 초래하였다(도 40c 내지 40e). 16D5(0.5 mg/kg) 및 16D5 W96Y/D52E16D5(0.5 mg/kg) 의 효능을 비교하였지만, 16D5 G49S/S93A(0.5 mg/kg)는 약간 적은 효능을 나타내었다. 많은 투여량의 2.5 mg/kg의 16D5 W96Y/D52E16D5 및 16D5 G49S/S93A는 0.5 mg/kg 투여량과 비교하여 증가된 효능을 나타내지 않았다. PD 판독을 위해, 마우스를 연구 52일에 희생시키고, 종양르 제거하고, 무게를 재고, 후속 FACS 분석을 위해 콜라게나아제 V, 디스파아제 II 및 DNAse를 사용하여 효소적 소화를 통해 단세포 현탁액을 제조하였다. 모든 처리 군의 절제된 종양은 비히클 대조군 종양에 비해 연구 종료시 상당히 적은 종양 중량을 나타내었다(도 40f). huCD45 및 huCD3, 및 죽은 세포를 제외하기 위해 DAPI로 염색된 종양으로부터의 단세포 현탁액을 BD 포레싸로 분석하였다. FACS 분석은 비히클 대조군 종양에 비해 16D5뿐만 아니라 16D5 W96Y/D52E16D5로 치료시 종양 조직에서 통계적으로 많은 수의 침투된 CD3-양성 인간 T 세포를 입증하였다(도 40c).
실시예 57
시노몰구스
원숭이에서
독성 연구
약동학(PK), 약역학(PD) 및 내약성 연구를 수행하여 시노몰구스 원숭이에서 친화성 감소된 16D5 변이체 TCB(예를 들면, 16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB)의 단일 정맥내 용량의 내약성, PK 및 PD 효과를 조사하였다. 이 연구에서, 미처리(naive) 시노몰구스 원숭이(시험 군당 수컷 원숭이 1 마리 및 암컷 원숭이 1 마리)에게 16D5 W96Y/D52E TCB를 비롯한 친화성 감소된 16D5 변이체 TCB의 단일 정맥내 용량을 용량 증가 프로토콜에 따라 주사하였다. 예시적인 용량 수준은 0.003, 0.03 및 0.09 mg/kg을 포함한다. 표준 독성 파라미터(임상 징후, 체중, 혈액학 및 임상 화학) 및 혈액에서 T 세포 수 및 활성화 상태의 운동 및 사이토카인 방출의 운동을 평가하였다. 또한, 혈액 샘플은 16D5 W96Y/D52E TCB를 비롯한 친화성 감소된 16D5 변이체 TCB의 측정 및 항-약물 항체의 측정을 위해 28일의 기간 동안 PK를 위해 취하였다.
예시적 실시양태의 아미노산 서열
1) 공통 경쇄 포맷에 유용한 FolR 결합제, 가변 중쇄
2) CD3 결합제 공통 경쇄(CLC)
3) CD3 결합제, 중쇄
4) 교차Fab 포맷에 유용한 FolR 결합제
5) 교차Fab 포맷에 유용한 CD3 결합제
6) CD3-FolR 이중특이적 항체 2+1 도립된 교차Mab 포맷의 예시적인 아미노산 서열
7) 공통 경쇄를 갖는 CD3-FolR 이중특이적 항체의 예시적인 아미노산 서열
8) 감소된 친화성을 갖는 예시적인 16D5 변이체
a. 감소된 친화성을 갖는 예시적인 경쇄 변이체
b. 감소된 친화성을 갖는 예시적인 중쇄 변이체
9) 파지 디스플레이 라이브러리로부터 발생된 추가의 예시적인 실시양태(CDR은 밑줄 침)
10) 9D11 당화 부위 변이체: 예시적인 실시양태의 가변 경쇄(CDR은 밑줄 침)
11) 탈아미노화 변이체
12) 예시적인 실시양태의 TCB에 기초한 Mov19(CDR은 밑줄 침)
13) 중간 친화성 결합제를 갖는 추가의 FolR1 TCB(카밧에 따른 CDR은 밑줄 침)
14) 항원 서열
15) 예시적인 실시양태의 뉴클레오티드 서열
전술한 발명이 이해의 명료성을 위해 예시 및 실시예로써 일부 상세하게 기재되었지만, 상기 예시 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 이들의 전체가 참조로서 분명히 혼입된다.
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<120> T CELL ACTIVATING BISPECIFIC ANTIGEN BINDING MOLECULES AGIANT FOLR1 AND CD3
<130> 32186
<140> PCT/EP2015/076739
<141> 2015-11-17
<150> EP14194147.6
<151> 2014-11-20
<160> 316
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 1
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
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Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
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Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
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Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatacca acgaacatta ttatacgttc 300
ggccagggga ccaaagtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 360
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600
canggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
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Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
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Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
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Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
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Asn Phe Gly Ala Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
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545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Lys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
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Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
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Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
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Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ala Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Lys
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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225
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<213> Mus musculus
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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<213> Macaca fascicularis
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<220>
<221> modified_base
<222> (47)..(47)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<220>
<221> modified_base
<222> (177)..(177)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 161
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgnttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcntac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaacttc 300
actgttctgc gtgttccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 162
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 162
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat gggcttggtt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 163
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 163
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaacc gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccttgggaat gggcttactt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 164
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 164
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcactggt 300
tggtctcgtt ggggttacat ggactattgg ggccaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 165
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 165
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgaa 300
tggatccgtt actaccattt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 166
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 166
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcgttggt 300
tggtaccgtt ggggttacat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 167
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 167
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtaaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagctgtt 300
ttctaccgtg cttggtactc tttcgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 168
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 168
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataccagcc caccaccaac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 169
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 169
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttct 357
<210> 170
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 170
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatacca acgaacatta ttatacgttc 300
ggccagggga ccaaagtgga aatcaaa 327
<210> 171
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 171
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc t 351
<210> 172
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 172
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 173
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 173
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgagc 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
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<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide"
<400> 174
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
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agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgcag 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
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<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide"
<400> 175
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cgggcttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 176
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 176
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cggaattttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 177
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
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atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctcttac 300
atcgacatgg actattgggg tcaaggcacc ctcgtaacgg tttcttct 348
<210> 178
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 178
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
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gggaccaaag tggaaatcaa a 321
<210> 179
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide"
<400> 179
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
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gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctcttac 300
gttgacatgg actattgggg tcaaggcacc ctcgtaacgg tttcttct 348
<210> 180
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 180
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggatattt ggagcccaac gttcggccag 300
gggaccaaag tggaaatcaa a 321
<210> 181
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 181
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagactct 300
tcttacgttg aatggtacgc tttcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360
agt 363
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<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 182
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gactccactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagccaacca gcagcccaat tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 183
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 183
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagcgctag taccaagggc cccagcgtgt tccccctggc acccagcagc 420
aagagcacat ctggcggaac agccgctctg ggctgtctgg tgaaagacta cttccccgag 480
cccgtgaccg tgtcttggaa ctctggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac ctttccagcc 540
gtgctgcaga gcagcggcct gtactccctg tcctccgtgg tcaccgtgcc ctctagctcc 600
ctgggaacac agacatatat ctgtaatgtc aatcacaagc cttccaacac caaagtcgat 660
aagaaagtcg agcccaagag ctgc 684
<210> 184
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 184
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagcgctag tgtggccgct ccctccgtgt ttatctttcc cccatccgat 420
gaacagctga aaagcggcac cgcctccgtc gtgtgtctgc tgaacaattt ttaccctagg 480
gaagctaaag tgcagtggaa agtggataac gcactgcagt ccggcaactc ccaggaatct 540
gtgacagaac aggactccaa ggacagcacc tactccctgt cctccaccct gacactgtct 600
aaggctgatt atgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 696
<210> 185
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 185
gcaggcaagc attatgcagc ggacttttgg tcaagg 36
<210> 186
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 186
caggcaagca ttatgagccg gacttttggt caagg 35
<210> 187
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 187
cattatgaac cgggcttttg gtcaaggcac caaggtc 37
<210> 188
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 188
cattatgaac cggaattttg gtcaaggcac caaggtc 37
<210> 189
<211> 2067
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 189
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
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ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
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gtgacagaac aggactccaa ggacagcacc tactccctgt cctccaccct gacactgtct 600
aaggctgatt atgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgtgaca agacccacac ctgtccccct 720
tgtcctgccc ctgaagctgc tggcggccct tctgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag 780
gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac 840
gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 900
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 960
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agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
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ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
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acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
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gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
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<400> 216
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatacgct 300
tacgctctgg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc tagc 354
<210> 217
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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polynucleotide"
<400> 217
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagcatggca gcagcagcac gttcggccag 300
gggaccaaag tggaaatcaa acgtacg 327
<210> 218
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide"
<400> 218
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttctctgctg gtcgtctgat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
gctagc 366
<210> 219
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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polynucleotide"
<400> 219
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcact gcagacccca 300
ccaattacct ttggtcaagg caccaaggtc gaaattaaac gtacg 345
<210> 220
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 220
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
tacaacgctt tcgactattg gggtcacggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagc 357
<210> 221
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 221
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcatg gcatagccca 300
acttttggtc aaggcaccaa ggtcgaaatt aaacgtacg 339
<210> 222
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 222
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgct 300
acttacacta tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagc 357
<210> 223
<211> 342
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide"
<400> 223
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcact gcagacccca 300
attacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgta cg 342
<210> 224
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 224
caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc ggctacttca tgaactgggt caagcagagc 120
cacggcaaga gcctggaatg gatcggcaga atccacccct acgacggcga caccttctac 180
aaccagaact tcaaggacaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcaa caccgcccac 240
atggaactgc tgagcctgac cagcgaggac ttcgccgtgt actactgcac cagatacgac 300
ggcagccggg ccatggatta ttggggccag ggcaccaccg tgacagtgtc cagcgctagc 360
accaagggcc cctccgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcaca 420
gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480
agcggagccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag ttctggcctg 540
tatagcctga gcagcgtggt caccgtgcct tctagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660
tgcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtgc accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctctc gtgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct cgtgagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 225
<211> 2073
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 225
caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc ggctacttca tgaactgggt caagcagagc 120
cacggcaaga gcctggaatg gatcggcaga atccacccct acgacggcga caccttctac 180
aaccagaact tcaaggacaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcaa caccgcccac 240
atggaactgc tgagcctgac cagcgaggac ttcgccgtgt actactgcac cagatacgac 300
ggcagccggg ccatggatta ttggggccag ggcaccaccg tgacagtgtc cagcgctagc 360
acaaagggcc ccagcgtgtt ccctctggcc cctagcagca agagcacatc tggcggaaca 420
gccgccctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 480
tctggcgccc tgacaagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540
tactctctga gcagcgtggt caccgtgcct agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaagtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660
tgtgatggcg gaggagggtc cggaggcgga ggatccgaag tgcagctggt ggaaagcggc 720
ggaggcctgg tgcagcctaa gggctctctg aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc 780
ttcaacacct acgccatgaa ctgggtgcgc caggcccctg gcaaaggcct ggaatgggtg 840
gcccggatca gaagcaagta caacaattac gccacctact acgccgacag cgtgaaggac 900
cggttcacca tcagccggga cgacagccag agcatcctgt acctgcagat gaacaacctg 960
aaaaccgagg acaccgccat gtactactgc gtgcggcacg gcaacttcgg caacagctat 1020
gtgtcttggt ttgcctactg gggccagggc accctcgtga cagtgtctgc tgctagcgtg 1080
gccgctccct ccgtgtttat ctttccccca tccgatgaac agctgaaaag cggcaccgcc 1140
tccgtcgtgt gtctgctgaa caatttttac cctagggaag ctaaagtgca gtggaaagtg 1200
gataacgcac tgcagtccgg caactcccag gaatctgtga cagaacagga ctccaaggac 1260
agcacctact ccctgtcctc caccctgaca ctgtctaagg ctgattatga gaaacacaaa 1320
gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 1380
aggggagagt gtgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga agctgctggc 1440
ggcccttctg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1500
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 1560
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1620
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1680
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1740
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1800
gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1860
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1920
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1980
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 2040
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 2073
<210> 226
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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polynucleotide"
<400> 226
gacatcgagc tgacccagag ccctgcctct ctggccgtgt ctctgggaca gagagccatc 60
atcagctgca aggccagcca gagcgtgtcc tttgccggca cctctctgat gcactggtat 120
caccagaagc ccggccagca gcccaagctg ctgatctaca gagccagcaa cctggaagcc 180
ggcgtgccca caagattttc cggcagcggc agcaagaccg acttcaccct gaacatccac 240
cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc agagcagaga gtacccctac 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
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<210> 227
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 227
Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala
1 5 10 15
Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln
20 25 30
Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln
35 40 45
Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His
50 55 60
Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr
65 70 75 80
Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val
85 90 95
Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys
100 105 110
Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys
115 120 125
Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys
130 135 140
Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr
145 150 155 160
Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser
165 170 175
Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro
180 185 190
Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala
195 200 205
Met
<210> 228
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 228
Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met
1 5 10 15
Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His
20 25 30
Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr
35 40 45
Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp
50 55 60
Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln
65 70 75 80
Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln
85 90 95
Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu
100 105 110
Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His
115 120 125
Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val
130 135 140
Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys
165 170 175
Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe
180 185 190
Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
195 200 205
Ala Ala Met His Val Asn
210
<210> 229
<211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 229
Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys
1 5 10 15
His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys
20 25 30
Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu
35 40 45
Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys
50 55 60
Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn
85 90 95
Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu
100 105 110
Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys
115 120 125
Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys
130 135 140
Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn
165 170 175
Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala
180 185 190
Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met
195 200 205
Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile Ile Asp Ser
210 215 220
<210> 230
<211> 208
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 230
Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His
1 5 10 15
His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Asn Leu His Asp Gln Cys Ser
20 25 30
Pro Trp Lys Thr Asn Ser Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala
35 40 45
His Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly
50 55 60
Thr Met Thr Ser Glu Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu
65 70 75 80
Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln
85 90 95
Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Gln Trp Trp Glu Asp Cys Gln Ser Ser Phe Thr Cys Lys Ser
115 120 125
Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Ser Ser Gly His Asn Glu Cys Pro
130 135 140
Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe Thr Phe Tyr Phe Pro Thr Ser Ala
145 150 155 160
Ala Leu Cys Glu Glu Ile Trp Ser His Ser Tyr Lys Leu Ser Asn Tyr
165 170 175
Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln
180 185 190
Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Glu Ala Met Ser
195 200 205
<210> 231
<211> 213
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 231
Glu Ala Gln Thr Arg Thr Ala Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val
1 5 10 15
Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys
20 25 30
Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr
35 40 45
Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe
50 55 60
Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe
65 70 75 80
Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp
85 90 95
Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val
100 105 110
Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr
115 120 125
Ser Tyr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly
130 135 140
Phe Asn Lys Cys Pro Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr Tyr Ser Tyr
165 170 175
Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp
180 185 190
Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr
195 200 205
Ala Ala Ala Met Ser
210
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Pro Trp Glu Tyr Ser Trp Tyr Asp Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide"
<400> 233
Asn Tyr Thr Ile Val Val Ser Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 234
Asn Tyr Phe Ile Gly Ser Val Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 235
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 235
Gly Leu Thr Tyr Ser Met Asp Tyr
1 5
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 236
Met Gln Ala Leu Gln Ile Pro Asn Thr
1 5
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
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<400> 237
Tyr Ala Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5
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<211> 8
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<400> 238
Gln Gln His Gly Ser Ser Ser Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
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Gly Asp Phe Ser Ala Gly Arg Leu Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 10
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Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
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peptide"
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Gly Asp Tyr Asn Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 242
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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Pro Gly Lys
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caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttctgct 360
agcacaaagg gccccagcgt gttccctctg gcccctagca gcaagagcac atctggcgga 420
acagccgccc tgggctgcct cgtgaaggac tactttcccg agcctgtgac cgtgtcctgg 480
aactctggcg ccctgacaag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtactctc tgagcagcgt ggtcaccgtg cctagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaagtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgtgatg gcggaggagg gtccggaggc ggaggatccg aggtgcagct gctggaatct 720
ggcggcggac tggtgcagcc tggcggatct ctgagactga gctgtgccgc cagcggcttc 780
accttcagca cctacgccat gaactgggtg cgccaggccc ctggcaaagg cctggaatgg 840
gtgtcccgga tcagaagcaa gtacaacaac tacgccacct actacgccga cagcgtgaag 900
ggccggttca ccatcagccg ggacgacagc aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc 960
ctgcgggccg aggacaccgc cgtgtactat tgtgtgcggc acggcaactt cggcaacagc 1020
tatgtgtctt ggtttgccta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc aagcgctagt 1080
gtggccgctc cctccgtgtt tatctttccc ccatccgatg aacagctgaa aagcggcacc 1140
gcctccgtcg tgtgtctgct gaacaatttt taccctaggg aagctaaagt gcagtggaaa 1200
gtggataacg cactgcagtc cggcaactcc caggaatctg tgacagaaca ggactccaag 1260
gacagcacct actccctgtc ctccaccctg acactgtcta aggctgatta tgagaaacac 1320
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 1380
aacaggggag agtgtgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaagctgct 1440
ggcggccctt ctgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 1500
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 1560
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1620
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1680
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc 1740
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 1800
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1860
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1920
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1980
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 2040
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 2076
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agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttctgct 360
agcaccaagg gcccctccgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
acagccgctc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480
aacagcggag ccctgacctc cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagttctggc 540
ctgtatagcc tgagcagcgt ggtcaccgtg ccttctagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
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gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080
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caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Gln Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Ala Ser Tyr Val Ser Trp Phe
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
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Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Ala Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
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Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
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Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
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Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
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Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
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Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
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Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
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ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 267
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
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cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtcctaggt caacccaagg ctgcccccag cgtgaccctg 360
ttccccccca gcagcgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatcagc 420
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ggcgtggaga ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca agtacgccgc cagcagctac 540
ctgagcctga cccccgagca gtggaagagc cacaggtcct acagctgcca ggtgacccac 600
gagggcagca ccgtggagaa aaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645
<210> 268
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 268
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
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gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
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ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
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tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
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<211> 2070
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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polynucleotide"
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caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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polynucleotide"
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<211> 2070
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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polynucleotide"
<400> 273
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aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480
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<400> 274
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
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peptide"
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Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polypeptide"
<400> 276
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Tyr Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
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<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 299
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcacg gcagacccca 300
acttttggtc aaggcaccaa ggtcgaaatt aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatcg gaagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 300
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> /note="This sequence may encompass 1-10 'Gly Gly Gly Gly Ser'
repeating units, wherein some positions may be absent"
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 301
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> /note="This sequence may encompass 1-10 'Ser Gly Gly Gly Gly'
repeating units, wherein some positions may be absent"
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 301
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 302
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(54)
<223> /note="This region may encompass 1-10 'Ser Gly Gly Gly Gly'
repeating units, wherein some positions may be absent"
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 302
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50
<210> 303
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide"
<400> 303
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 304
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 304
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 305
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 305
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 306
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Penta-His tag"
<400> 306
His His His His His
1 5
<210> 307
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 307
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
100
<210> 308
<211> 692
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 308
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr His Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Phe Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
260 265 270
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
275 280 285
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
325 330 335
Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
340 345 350
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
355 360 365
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
370 375 380
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
385 390 395 400
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
405 410 415
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
420 425 430
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
435 440 445
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
450 455 460
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
465 470 475 480
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
485 490 495
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
500 505 510
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
515 520 525
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
530 535 540
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
545 550 555 560
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
565 570 575
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
580 585 590
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
595 600 605
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
610 615 620
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
625 630 635 640
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
645 650 655
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
660 665 670
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
675 680 685
Ser Pro Gly Lys
690
<210> 309
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 309
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr His Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Phe Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 310
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (201)..(201)
<223> Any amino acid
<400> 310
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Asn Glu His
85 90 95
Tyr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Xaa Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 311
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 311
Gly Thr Asn Ala Arg Ala Pro
1 5
<210> 312
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 312
Ala Leu Trp Tyr Ala Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 313
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 313
Asn Ala Trp Met His
1 5
<210> 314
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 314
Ser Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 315
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 315
Pro Tyr Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 316
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 316
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Arg Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
Claims (123)
- (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 서열번호 37의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하는 제 1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 모이어티
를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 제 2 항원 결합 모이어티가
a) 서열번호 16의 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 중쇄 CDR2, 서열번호 18의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3;
b) 서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 56의 중쇄 CDR2, 서열번호 57의 중쇄 CDR3, 서열번호 59의 경쇄 CDR1, 서열번호 60의 경쇄 CDR2 및 서열번호 65의 경쇄 CDR3; 또는
c) 서열번호 16의 중쇄 CDR1, 서열번호 275의 중쇄 CDR2, 서열번호 315의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3
을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
제 1 항원 결합 모이어티가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
(iii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 3 항에 있어서,
FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티가 동일한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 서열을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 3 항에 있어서,
제 3 항원 결합 모이어티가 제 2 항원 결합 모이어티와 동일한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 3 항에 있어서,
제 2 및 제 3 항원 결합 모이어티 중 하나 이상이 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
(iv) 안정하게 회합할 수 있는 제 1 및 제 2 하위단위로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제 1 항원 결합 모이어티 및 제 2 항원 결합 모이어티가 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 하위단위의 N-말단에 연결되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제 3 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 연결되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티가 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티가 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티가 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 11 항에 있어서,
제 1 항원 결합 모이어티가 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환된 교차 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항에 있어서,
CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 1개 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제 1 및 제 2 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인이 면역글로불린 분자의 일부인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 15 항에 있어서,
Fc 도메인이 IgG 클래스 면역글로불린 Fc 도메인, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
Fc 도메인이 인간 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
Fc 도메인이 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 하위단위의 회합을 촉진하는 변형을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 18 항에 있어서,
Fc 도메인의 제 1 하위단위의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 제 2 하위단위의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제 1 하위단위의 CH3 도메인 내에 돌출부를 생성하고, Fc 도메인의 제 2 하위단위의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 제 1 하위단위의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제 2 하위단위의 CH3 도메인 내에 캐비티를 생성하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
Fc 도메인이 본래의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 치환을 하나 이상 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 20 항에 있어서,
Fc 도메인의 각각의 하위단위가 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환인(카밧 넘버링에 따른) L234A, L235A 및 P329G를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 16 항에 있어서,
Fc 수용체가 Fcγ 수용체인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 20 항에 있어서,
효과기 기능이 항체-의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC)인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 서열번호 276의 아미노산 서열, 서열번호 277의 아미노산 서열 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
- 삭제
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 질병의 치료에 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 27 항에 있어서,
질병이 암인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자. - 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제 29 항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드.
- 제 29 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제 29 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
- (a) 제 32 항에 따른 숙주 세포를 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및
(b) 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계
를 포함하는, CD3 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 생성하는 방법. - 제 33 항에 따른 방법에 의해 생성된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
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- 표적 세포를 CD3+ T 세포의 존재하에 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, FolR1+ 표적 세포의 용해를 유도하는 시험관내 방법.
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| WO2020210392A1 (en) * | 2019-04-09 | 2020-10-15 | Sanofi | Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof |
| MX2021014433A (es) * | 2019-06-05 | 2022-03-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molecula de union a sitio de escision de anticuerpo. |
| BR112021025401A2 (pt) * | 2019-06-19 | 2022-02-01 | Hoffmann La Roche | Métodos para produzir um anticorpo trivalente, ácido desoxirribonucleico, uso de um ácido desoxirribonucleico, célula de mamífero recombinante, composição e método para produzir uma célula de mamífero recombinante |
| CN114258403A (zh) * | 2019-06-19 | 2022-03-29 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生多价多特异性抗体表达细胞的方法 |
| CA3140323A1 (en) * | 2019-06-19 | 2020-12-24 | Johannes Auer | Method for the generation of a multivalent, bispecific antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization |
| CN114531878A (zh) | 2019-06-27 | 2022-05-24 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 新颖icos抗体及包含它们的肿瘤靶向抗原结合分子 |
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| CN111018969A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-17 | 上海药明生物技术有限公司 | 采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法 |
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| CA3153085A1 (en) * | 2020-06-19 | 2021-12-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies binding to cd3 and cd19 |
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Non-Patent Citations (1)
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| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 34, pp. 28206-28214, August 17, 2012 |
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