CN111018969A - 采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法,包括:将待纯化双特异性抗体样品依次经过层析柱1和层析柱2进行平衡、上样、清洗、洗脱等步骤完成分离纯化;所述层析柱1的层析填料选自Capto L,Protein L,Kappaselect中的至少一种;所述层析柱2的层析填料选自LambdaFabselect。本发明的方法,可以直接运用表达上清进行纯化,无需先经过Protein A;只需要两步亲和层析,操作简单,特异性强,载量高,能有效缩短纯化时间;相对于SEC、离子交换和疏水层析,轻链select亲和纯化更能达到高纯度的要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别是涉及双特异性抗体的分离纯化技术。
背景技术
双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体,能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应,激发具有导向性的免疫反应,是基因工程抗体的一种,现已成为抗体工程领域的热点,在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
目前已知的双特异性抗体具有各种各样的Format结构形式,但大多都是具有Fc段结构,因而可以使用Protein A亲和层析或者Protein A联合SEC或离子交换或疏水层析进行分离纯化,但对于具有共同的IgG重链和两条不同的轻链的双特异性抗体,即Kappa/Lambda一体的双特异性抗体,在表达过程中可以出现多种形式错配或掉链的情形,此时再运用上述方法,一般需要多种方法联用,条件摸索比较困难,费时费力,而很难达到高效率的分离效果。
因此寻求一种适合的分离纯化方法应用于双特异性抗体特别是Kappa/Lambda一体的双特异性抗体的分离与提纯具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种纯化双特异性抗体的方法,能够高效率的分离双特异性抗体,条件摸索简单,分离效果好,产品纯度高,并可用于工艺放大。
为解决上述技术问题,本发明提供的技术方案为:
一种采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法,包括:将待纯化双特异性抗体样品依次经过层析柱1和层析柱2进行分离纯化;
所述层析柱1的工艺步骤包括:
1a、用平衡缓冲液平衡层析柱,所述平衡缓冲液为pH 7.4的PBS溶液;
1b、将待纯化双特异性抗体样品上样至层析柱1,所述层析柱1的层析填料选自Capto L,Protein L,Kappaselect中的至少一种;
1c、用清洗缓冲液进行清洗,所述清洗缓冲液为pH 7.4的PBS溶液;
1d、用洗脱缓冲液进行洗脱,所述洗脱缓冲液为初始pH 3.0~3.5的0.05~0.2M甘氨酸溶液,且pH值以0.5pH单位逐渐递减进行梯度洗脱,至少递减一次;收集洗脱产品;
所述层析柱2的工艺步骤包括:
2a、用平衡缓冲液平衡层析柱,所述平衡缓冲液为pH 7.4的PBS溶液;
2b、将经所述层析柱1的洗脱产品上样至层析柱2,所述层析柱2的层析填料选自LambdaFabselect;
2c、用清洗缓冲液进行清洗,所述清洗缓冲液为pH 7.4的PBS溶液;
2d、用洗脱缓冲液进行洗脱,所述洗脱缓冲液为pH 3.0~3.5的0.05~0.2M甘氨酸溶液,且pH值以0.5pH单位逐渐递减进行梯度洗脱,至少递减一次;收集产物。
优选的,所述双特异性抗体为Kappa/Lambda一体的双特异性抗体。
具体的,所述步骤1a中,平衡缓冲液的用量为5~20倍柱体积;优选的,平衡缓冲液的用量为5~15倍柱体积;更优选的,平衡缓冲液的用量为10倍柱体积。
具体的,所述步骤1c中,清洗缓冲液的用量为5~20倍柱体积;优选的,清洗缓冲液的用量为5~15倍柱体积;更优选的,清洗缓冲液的用量为10倍柱体积。
具体的,所述步骤1d中,甘氨酸溶液浓度为0.08~0.15M。优选的,所述步骤1d中,甘氨酸溶液浓度为0.08M,0.09M,0.10M,0.11M,0.12M,0.13M,0.14M,或0.15M。
具体的,所述步骤1d中,所述洗脱缓冲液为初始pH 3.5的0.05~0.2M甘氨酸溶液,且pH值以0.5pH单位逐渐递减一次、递减两次、递减三次、或递减三次以上进行梯度洗脱。梯度洗脱时,每一个pH值梯度的洗脱液用量相等。
具体的,所述步骤1d中,洗脱缓冲液的用量为5~30倍柱体积;优选的,洗脱缓冲液的用量为10~20倍柱体积;更优选的,洗脱缓冲液的用量为10倍柱体积。
一种具体的实施方式中,所述步骤1d中,所述洗脱缓冲液的pH值以0.5pH单位逐渐递减一次,依次以pH 3.5、pH 3.0的甘氨酸溶液进行洗脱。其中,pH 3.5、pH 3.0的甘氨酸溶液的用量均为10倍柱体积。
一种具体的实施方式中,所述步骤1d中,所述洗脱缓冲液的pH值以0.5pH单位逐渐递减两次,依次以pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5的甘氨酸溶液进行洗脱。其中,pH 3.5、pH 3.0、pH2.5的甘氨酸溶液的用量均为10倍柱体积。
一种具体的实施方式中,所述步骤1d中,所述洗脱缓冲液的pH值以0.5pH单位逐渐递减三次,依次以pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0的甘氨酸溶液进行洗脱。其中,pH 3.5、pH3.0、pH 2.5、pH 2.0的甘氨酸溶液的用量均为10倍柱体积。
具体的,所述层析柱1的工艺步骤还包括:1e、用CIP缓冲液进行就地清洗。优选的,所述CIP缓冲液为pH 1.8的含0.12M磷酸和0.167M乙酸的溶液。
具体的,所述层析柱1的工艺步骤还包括:1f、用再生液进行清洗。优选的,所述再生液为0.015M NaOH溶液。
具体的,所述步骤1f中,所述再生液的用量为3~10倍柱体积。优选的,所述再生液的用量为5倍柱体积。
具体的,所述层析柱1的工艺步骤还包括:1g、用储存液储存层析柱。优选的,所述储存液为体积分数10%~50%乙醇水溶液;优选的,所述储存液为体积分数15%~30%乙醇水溶液;更优选的,所述储存液为体积分数20%乙醇水溶液。
具体的,所述步骤1g中,所述储存液的用量为1~5倍柱体积;优选的,所述储存液的用量为2倍柱体积。
具体的,所述步骤2a中,平衡缓冲液的用量为5~20倍柱体积;优选的,平衡缓冲液的用量为5~15倍柱体积;更优选的,平衡缓冲液的用量为10倍柱体积。
具体的,所述步骤2c中,清洗缓冲液的用量为5~20倍柱体积;优选的,清洗缓冲液的用量为5~15倍柱体积;更优选的,清洗缓冲液的用量为10倍柱体积。
具体的,所述步骤2d中,甘氨酸溶液浓度为0.08~0.15M。优选的,所述步骤1d中,甘氨酸溶液浓度为0.08M,0.09M,0.10M,0.11M,0.12M,0.13M,0.14M,或0.15M。
具体的,所述步骤2d中,所述洗脱缓冲液为初始pH 3.0或pH 3.5或的0.05~0.2M甘氨酸溶液,且pH值以0.5pH单位逐渐递减一次、两次、三次、或三次以上进行梯度洗脱。梯度洗脱时,每一个pH值梯度的洗脱时间相同。
一种具体的实施方式中,所述步骤2d中,所述洗脱缓冲液的pH值以0.5pH单位逐渐递减一次,依次以pH 3.5、pH 3.0的甘氨酸溶液进行洗脱。其中,pH 3.5、pH 3.0的甘氨酸溶液的用量均为10倍柱体积。
一种具体的实施方式中,所述步骤2d中,所述洗脱缓冲液的pH值以0.5pH单位逐渐递减一次,依次以pH 3.0、pH 2.5的甘氨酸溶液进行洗脱。其中,pH 3.0、pH 2.5的甘氨酸溶液的用量均为10倍柱体积。
一种具体的实施方式中,所述步骤2d中,所述洗脱缓冲液的pH值以0.5pH单位逐渐递减两次,即依次以pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5的甘氨酸溶液进行洗脱。其中,pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5的甘氨酸溶液的用量均为10倍柱体积。
一种具体的实施方式中,所述步骤2d中,所述洗脱缓冲液的pH值以0.5pH单位逐渐递减三次,即依次以pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0的甘氨酸溶液进行洗脱。其中,pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0的甘氨酸溶液的用量均为10倍柱体积。
具体的,所述层析柱2的工艺步骤还包括:2e、用CIP缓冲液进行就地清洗。优选的,所述CIP缓冲液为pH 1.8的含0.12M磷酸和0.167M乙酸的溶液。
具体的,所述层析柱2的工艺步骤还包括:2f、用再生液进行清洗。优选的,所述再生液为0.015M NaOH溶液;
具体的,所述层析柱21的工艺步骤还包括:2g、用储存液储存层析柱。优选的,所述储存液为20%乙醇。
双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体,一般分为两大类,一类是含Fc区的双特异性抗体,一类是不含Fc区的双特异性抗体。其中,含Fc区的双特异性抗体可以使用不同的轻重链进行组合构建,故使其format结构更加复杂,在表达纯化过程中可能产生不同程度的错配或掉链情形,特别是Kappa/Lambda一体的双特异性抗体,在表达过程中可以产生三种不同形式的组合方式,通过传统的Protein A纯化,或联合使用SEC或离子交换或疏水层析,操作相对比较复杂,条件摸索比较费时费力,且很难达到高纯度的分离效果。本发明采用轻链select的特异性结合方式,可以更快更有效的解决轻重链错配或掉链的问题。还有一类双特异性抗体是不含Fc区的,而是有两个抗体的VH区及VL区组成或者有Fab片段组成,此类双特异性抗体主要有BiTE,DART,TandAbs,bi-Nanobody等。此类双特异性抗体一般体型较小,改良后可以大幅度降低使用剂量,约为普通抗体的1/100以下。对于此类抗体也适用于本发明中的轻链select的方法进行分离纯化。
本发明采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法,具有以下优点:
(1)可以直接运用表达上清进行纯化,无需先经过Protein A。
(2)只需要两步亲和层析,操作简单,特异性强,载量高,能有效缩短纯化时间。
(3)相对于SEC、离子交换和疏水层析,轻链select亲和纯化更能达到高纯度的要求。
附图说明
图1为Protein L亲和纯化Kappa/Lambda Bispecific Ab-1抗体时蛋白在UV280的吸收色谱图。
图2为Kappa/Lambda Bispecific Ab-1经过Protein L纯化后的SDS-PAGE胶图。
图3为LambdaFabselect(已经过Protein L)亲和层析纯化后的Kappa/LambdaBispecific Ab-1抗体时蛋白在UV280的吸收色谱图。
图4为Kappa/Lambda Bispecific Ab-1经过Protein L及LambdaFab select亲和纯化后的SDS-PAGE胶图。
图5为Capto L亲和纯化Kappa/Lambda Bispecific Ab-2抗体时蛋白在UV280的吸收色谱图。
图6为Kappa/Lambda Bispecific Ab-2经过Capto L纯化后的SDS-PAGE胶图。
图7为LambdaFabselect(已经过Capto L)亲和层析纯化后的Kappa/LambdaBispecific Ab-2抗体时蛋白在UV280的吸收色谱图
图8为Kappa/Lambda Bispecific Ab-2经过Capto L及LambdaFab select亲和纯化后的SDS-PAGE胶图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1.轻链select层析柱的选择
目前市面上轻链select的品牌和种类不是很多,常见的包括GE的CaptureSelectTM系列、Capto L系列和LambdaFabSelect;Thermo FisherCaptureSelectTM系列及Bio-rad等品牌。其中GE的轻链select使用最为广泛,其包括Kappaselect、LambdaFabselect、Capto L、Protein L等子系列。这些填料可以特异性的结合抗体轻链、Fab或ScFv的特定区域,包括可变区和恒定区,例如Kappaselect和LambdaFabselect可以分别特异性的结合抗体轻链恒定区、Fab,Capto L和Protein L可以特异性的结合抗体轻链的可变区、ScFv以及VL domain或Fab。此类轻链select填料动态载量、亲和力、特异性或纯度、可重复性、耐碱等稳定性、内毒素及宿主蛋白控制上都可以达到预期效果。本专利选择了Capto L、Protein L、LambdaFabselect和Kappaselect的轻链select填料应用于双特异性抗体纯化。
实施例2.Protein L/LambdaFabselect联用纯化双特异性抗-1
1)各种溶剂的配制:
平衡缓冲液/清洗缓冲液:PBS,pH 7.4;
洗脱缓冲液1:0.1M Glycine,pH 3.5;
洗脱缓冲液2:0.1M Glycine,pH 3.0;
洗脱缓冲液3:0.1M Glycine,pH 2.5;
CIP缓冲液:0.12M Phosphate acid,0.167M acetic acid,pH 1.8;
再生液:0.015M NaOH;
储存液:20%Ethanol。
2)洗脱步骤:
层析柱1:填料为Protein L;
层析柱2:填料为LambdaFabselect;
(1)用平衡缓冲液平衡Protein L层析柱10倍柱体积;
(2)Load样品上清;
(3)用清洗缓冲液进行10倍柱体积的清洗;
(4)10倍柱体积的洗脱缓冲液1洗脱;
(5)10倍柱体积的洗脱缓冲液2洗脱;
(6)用CIP缓冲液进行5倍柱体积的清洗;
(7)用5倍柱体积再生液再生清洗;
(8)清洗缓冲液平衡层析柱5倍柱体积后,用5倍柱体积储存液储存层析柱;
(9)洗脱组分PBS稀释或换液;
(10)用平衡缓冲液平衡LambdaFabselect层析柱10倍柱体积;
(11)Load前面处理过的洗脱组分;
(12)用清洗液进行10倍柱体积的清洗;
(13)10倍柱体积的洗脱缓冲液2洗脱;
(14)10倍柱体积的洗脱缓冲液3洗脱;
(15)用CIP缓冲液进行5倍柱体积的清洗;
(16)用5倍柱体积再生液再生清洗;
(17)清洗缓冲液平衡层析柱5倍柱体积后,用5倍柱体积储存液储存层析柱。
纯化结果见图1-4。
图2SDS-PAGE还原胶中检测图1的两个峰,分别选取只有λ轻链(Lane1)和κ轻链(Lane2)的两个抗体作为阳性对照。Lane3泳道所示为双特异性抗-1过Protein L柱前的状态,λ轻链和κ轻链比例不均,存在错配现象;Lane4为双特异性抗-1过Protein L柱后的流穿峰,过柱后只有λ轻链的抗体被流穿;Lane5和Lane6为过完Protein L柱的洗脱峰及洗脱峰透析换液后抗体状态,抗体中带有κ轻链的抗体结合在Protein L柱上被pH 3.5的甘氨酸洗脱下来。
图4SDS-PAGE还原胶中检测图3的两个峰,分别选取只有λ轻链(Lane1)和κ轻链(Lane2)的两个抗体作为阳性对照。Lane3泳道所示为双特异性抗-1过Protein L柱洗脱透析后的状态(图2Lane6泳道),此时抗体可能存在轻链为λ轻链和κ轻链或者只存在κ轻链,Lane4为双特异性抗-1过LambdaFabselect柱后的流穿峰,过柱后只有κ轻链的抗体被流穿;Lane5为过完LambdaFabselect柱的洗脱峰透析换液后抗体状态,抗体中同时带有λ轻链和κ轻链的抗体结合在LambdaFabselect柱上被pH 3.0的甘氨酸洗脱下来。如图3所示,pH 2.5和pH 2.0的甘氨酸也有洗脱峰出来,经SEC-HPLC检测多为聚体状态。经过两步纯化,可以将双特异性抗-1中轻链正确配对抗体完全纯化出来。
实施例3.Capto L/LambdaFabselect联用纯化双特异性抗体-2
1)各种溶剂的配制:
平衡缓冲液/清洗缓冲液:PBS,pH 7.4
洗脱缓冲液1:0.1M Glycine,pH 3.5
洗脱缓冲液2:0.1M Glycine,pH 3.0
洗脱缓冲液3:0.1M Glycine,pH 2.5
洗脱缓冲液4:0.1M Glycine,pH 2.0
CIP缓冲液:0.12M Phosphate acid,0.167M acetic acid,pH 1.8
再生液:0.015M NaOH
储存液:20%Ethanol
2)洗脱步骤:
层析柱1:填料为Capto L;
层析柱2:填料为LambdaFabselect;
(1)用平衡缓冲液平衡Capto L层析柱10倍柱体积;
(2)Load样品上清;
(3)用清洗缓冲液进行10倍柱体积的清洗;
(4)10倍柱体积的洗脱缓冲液1洗脱;
(5)10倍柱体积的洗脱缓冲液2洗脱;
(6)10倍柱体积的洗脱缓冲液3洗脱;
(7)10倍柱体积的洗脱缓冲液4洗脱;
(8)用CIP缓冲液进行5倍柱体积的清洗;
(9)用5倍柱体积再生液再生清洗;
(10)清洗缓冲液平衡层析柱5倍柱体积后,用5倍柱体积储存液储存层析柱;
(11)洗脱组分PBS稀释或换液;
(12)用平衡缓冲液平衡LambdaFabselect层析柱10倍柱体积;
(13)Load前面处理过的洗脱组分;
(14)用清洗缓冲液进行10倍柱体积的清洗;
(15)10倍柱体积的洗脱缓冲液1洗脱;
(16)10倍柱体积的洗脱缓冲液2洗脱;
(17)10倍柱体积的洗脱缓冲液3洗脱;
(18)10倍柱体积的洗脱缓冲液4洗脱;
(19)用CIP缓冲液进行5倍柱体积的清洗;
(20)用5倍柱体积再生液再生清洗;
(21)清洗缓冲液平衡层析柱5倍柱体积后,用5倍柱体积储存液储存层析柱。
纯化结果见图5-8。
图6SDS-PAGE还原胶中检测图5的两个峰,分别选取只有λ轻链(Lane1)和κ轻链(Lane2)的两个单价抗体作为阳性对照。Lane3泳道所示为双特异性抗-2过Protein L柱前的状态,λ轻链和κ轻链比例不均,存在错配现象;Lane4为双特异性抗-1过Capto L柱后的流穿峰,过柱后只有λ轻链的抗体被流穿;Lane5和Lane6为过完Capto L柱的洗脱峰及洗脱峰透析换液后抗体状态,抗体中带有κ轻链的抗体结合在Capto L柱上被pH 3.5的甘氨酸洗脱下来。
图8SDS-PAGE还原胶中检测图7的两个峰,分别选取只有λ轻链(Lane1)和κ轻链(Lane2)的两个单价抗体作为阳性对照。Lane3泳道为双特异性抗-2过LambdaFabselect柱后的流穿峰,过柱后只有κ轻链的抗体被流穿;Lane4-Lane8为过完LambdaFabselect柱的洗脱峰,抗体中同时带有λ轻链和κ轻链的抗体结合在LambdaFabselect柱上被分别pH 3.5、pH3.0、pH 2.5和pH 2.0的甘氨酸及CIP缓冲液洗脱下来,如图7所示,经SEC-HPLC检测,pH2.5和pH 2.0的甘氨酸及CIP缓冲液洗脱下来的峰为聚体状态,且占比很少。经过两步纯化,可以将双特异性抗-2中轻链正确配对抗体完全纯化出来。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (11)
1.一种采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法,其特征在于,包括:将待纯化双特异性抗体样品依次经过层析柱1和层析柱2进行分离纯化;
所述层析柱1的工艺步骤包括:
1a、用平衡缓冲液平衡层析柱,所述平衡缓冲液为pH 7.4的PBS溶液;
1b、将待纯化双特异性抗体样品上样至层析柱1,所述层析柱1的层析填料选自CaptoL,Protein L,Kappaselect中的至少一种;
1c、用清洗缓冲液进行清洗,所述清洗缓冲液为pH 7.4的PBS溶液;
1d、用洗脱缓冲液进行洗脱,所述洗脱缓冲液为初始pH 3.0~3.5的0.05~0.2M甘氨酸溶液,且pH值以0.5pH单位逐渐递减进行梯度洗脱,至少递减一次;收集洗脱产品;
所述层析柱2的工艺步骤包括:
2a、用平衡缓冲液平衡层析柱,所述平衡缓冲液为pH 7.4的PBS溶液;
2b、将经所述层析柱1的洗脱产品上样至层析柱2,所述层析柱2的层析填料选自LambdaFabselect;
2c、用清洗缓冲液进行清洗,所述清洗缓冲液为pH 7.4的PBS溶液;
2d、用洗脱缓冲液进行洗脱,所述洗脱缓冲液为pH 3.0~3.5的0.05~0.2M甘氨酸溶液,且pH值以0.5pH单位逐渐递减进行梯度洗脱,至少递减一次;收集产物。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述双特异性抗体为Kappa/Lambda一体的双特异性抗体。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1a或步骤2a中,平衡缓冲液的用量为5~20倍柱体积;优选的,平衡缓冲液的用量为5~15倍柱体积;更优选的,平衡缓冲液的用量为10倍柱体积。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1c或步骤2c中,清洗缓冲液的用量为5~20倍柱体积;优选的,清洗缓冲液的用量为5~15倍柱体积;更优选的,清洗缓冲液的用量为10倍柱体积。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1d或步骤2d中,甘氨酸溶液浓度为0.08~0.15M;优选的,所述甘氨酸溶液浓度为0.08M,0.09M,0.10M,0.11M,0.12M,0.13M,0.14M,或0.15M。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1d或步骤2d中,洗脱缓冲液的用量为5~30倍柱体积;优选的,洗脱缓冲液的用量为10~20倍柱体积;更优选的,洗脱缓冲液的用量为10倍柱体积。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述层析柱1或层析柱2的工艺步骤还包括步骤:在洗脱步骤之后,用CIP缓冲液进行就地清洗;优选的,所述CIP缓冲液为pH 1.8的含0.12M磷酸和0.167M乙酸的溶液。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述层析柱1或层析柱2的工艺步骤还包括步骤:在CIP清洗步骤之后,用再生液进行清洗;优选的,所述再生液为0.015M NaOH溶液。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述再生液的用量为3~10倍柱体积。优选的,所述再生液的用量为5倍柱体积。
10.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述层析柱1或层析柱2的工艺步骤还包括:在再生步骤之后,用储存液储存层析柱;优选的,所述储存液为体积分数10%~50%乙醇水溶液;优选的,所述储存液为体积分数15%~30%乙醇水溶液;更优选的,所述储存液为体积分数20%乙醇水溶液。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述储存液的用量为1~5倍柱体积;优选的,所述储存液的用量为2倍柱体积。
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- 2019-12-27 CN CN201911376026.5A patent/CN111018969A/zh active Pending
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