CN117242096A - 结合psma和cd3的异二聚体双特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及特异性结合至肿瘤相关抗原(TAA)如PSMA和/或CD3的抗体，包括结合至TAA(例如PSMA)和CD3的双特异性抗体，以及包含它们的组合物。这些抗体可用于例如通过增加肿瘤定位来增强免疫反应以及治疗病症，包括实体瘤癌症。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2020年12月1日提交的美国临时申请号63/120,154、2020年12月22日提交的美国临时申请号63/129,372和2021年3月26日提交的美国临时申请号63/166,394的权益，各案以引用的方式整体并入本文中。
有关通过EFS-WEB以电子方式提交的序列表的参考
以电子方式提交的序列表(名称：4897_005PC03_Seqlisting_ST 25.txt；大小：405,168字节；以及创建日期：2021年12月1日)的内容以引用的方式整体并入本文中。
技术领域
本公开涉及特异性结合至肿瘤相关抗原(TAA)(例如PSMA、HER2和BCMA)和/或CD3的抗体，包括结合至TAA(例如PSMA、HER2和BCMA)和CD3的双特异性抗体，以及包含它们的组合物。这些抗体可用于增强免疫反应以及治疗疾病，包括实体瘤癌症。
背景技术
用抗CD3单克隆抗体靶向人T细胞上的T细胞受体(TCR)复合物已被用于或建议用于治疗自身免疫性疾病和相关病症，例如器官同种异体移植排斥反应的治疗。对人CD3具有特异性的小鼠单克隆抗体，例如OKT3(Kung等人(1979)Science 206:347-9)是此类治疗的第一代。尽管OKT3具有强大的免疫抑制效力，但其临床应用受到与其免疫原性和促有丝分裂潜能相关的严重副作用的阻碍(Chatenoud(2003)Nature Reviews 3:123-132)。它诱导抗球蛋白反应，促进其自身的快速清除和中和(Chatenoud等人(1982)Eur.J.Immunol.137:830-8)。此外，OKT3在体外诱导T细胞增殖和细胞因子产生，并引起体内细胞因子的大规模释放(Hirsch等人(1989)J.Immunol 142:737-43,1989)。细胞因子释放(也称为“细胞因子风暴”)又导致“流感样”综合征，以发烧、发冷、头痛、恶心、呕吐、腹泻、呼吸窘迫、脓毒性脑膜炎和低血压为特征(Chatenoud,2003)。如此严重的副作用限制了OKT3在移植中更广泛的应用，也限制了其用途向自身免疫等其它临床领域的扩展。同上文。
为了减少抗CD3单克隆抗体的副作用，不仅通过将鼠抗CD3单克隆抗体的互补决定区(CDR)移植到人IgG序列中，还通过将非FcR结合突变引入Fc中以减少细胞因子风暴的发生，开发出新一代经历基因工程改造的抗CD3单克隆抗体(Cole等人(1999)Transplantation 68:563；Cole等人(1997)J.Immunol.159:3613)。另参见PCT公布号WO2010/042904，该案以引用的方式整体并入本文中。尽管抗CD3抗体和双特异性抗体的开发取得了进展，但细胞因子释放综合征仍然是接合CD3的治疗剂的开发中的关键问题。
除了靶向CD3的单特异性治疗剂外，选择性结合至T细胞和肿瘤细胞的多特异性多肽也可以提供一种将T细胞的细胞毒性重定向至肿瘤细胞以及癌症治疗的机制。然而，设计双特异性或多特异性T细胞募集抗体的一个问题是维持特异性，同时通过多个调控路径覆盖对T细胞活化的调控。此外，由于CD3存在于血液淋巴细胞中，故需要产生一种抗CD3单特异性或多特异性分子，该分子不仅会结合至淋巴细胞中的CD3，而且还会到达实体瘤并结合实体瘤附近的CD3。
因此，结合至肿瘤相关抗原(TAA)和CD3的双特异性抗体难以在临床上实现治疗实体瘤的功效。据推测，难题可能是由双特异性抗体的CD3结合结构域对CD3具有高结合亲和力引起的。由于存在这种亲和力，大多数双特异性抗体在施用给患者时会与血液中循环T细胞上的CD3结合。这可能会导致到达实体瘤的双特异性抗体的量不足。
已经开发出靶向CD3以及TAA前列腺特异性膜抗原(PSMA)的双特异性构建体。PSMA又称为谷氨酸羧肽酶II和N-乙酰化α连接的酸性二肽酶1。它是一种二聚体II型跨膜糖蛋白，属于M28肽酶家族，由叶酸水解酶1(FOLH1)基因编码。这一蛋白质作为谷氨酸羧肽酶作用于包括养分叶酸和神经肽N-乙酰-l-天冬氨酰基-l-谷氨酸在内的不同替代性底物，并在许多组织如前列腺中表达，并且在较低程度上，在小肠、中枢和周围神经系统以及肾脏中有表达。编码PSMA的基因经历替代性剪接而产生至少三种变体。这一基因中的突变可能与膳食叶酸的肠吸收受损有关，导致血液叶酸水平低以及由此引起的高同型半胱氨酸血症。这种蛋白质在脑中的表达可能涉及与谷氨酸兴奋性毒性相关的多种病理状况。
PSMA是一种充分确定的、高度限制性前列腺癌相关细胞膜抗原。在前列腺癌细胞中，PSMA的表达量比正常前列腺上皮高1000倍(Su等人,Cancer Res.1995 44:1441-1443)。PSMA的表达量随前列腺癌的进展而增加，并且在转移性疾病、激素难治性病例和更高级病变中最高(Israeli等人,Cancer Res.1994,54:1807-1811；Wright等人,UrologicOncology:Seminars and Original Investigations 1995 1:18-28；Wright等人,Urology1996 48:326-332；Sweat等人,Urology1998 52:637-A6A)。此外，PSMA在包括膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌和肾癌在内的多种其它实体瘤的新血管系统中大量表达，但在正常新血管系统中不表达(Chang等人,Urology 2001 57:801-805；Divgi等人,Clin.Cancer Res.1998 4:2729-3279)。
经显示，PSMA是免疫学方法的重要靶标，例如疫苗或利用单克隆抗体的定向疗法。与其它作为分泌蛋白(PSA，前列腺酸性磷酸酶)的前列腺限制性分子不同，PSMA是一种非分泌性整合型细胞表面膜蛋白，这使其成为抗体疗法的理想靶标。(卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide))是一种111In标记的抗PSMA鼠单克隆抗体，被FDA批准用于新诊断的和复发性前列腺癌患者的成像和分期(Hinkle等人,Cancer 1998,83:739-747)。然而，卡罗单抗结合至PSMA的细胞内表位，需要内化或暴露PSMA的内部结构域，因此优先结合凋亡或坏死的细胞(Troyer等人,Urologic Oncology:Seminars and OriginalInvestigations 1995 1:29-37；Troyer等人,Prostate 1997 30:232-242)。因此，卡罗单抗可能没有治疗益处(Liu等人,Cancer Res.1997 57:3629-3634)。
已经开发出靶向PSMA外部结构域的其它单克隆抗体(例如J591、J415、J533和E99)(Liu等人,Cancer Res.1997 57:3629-3634)。然而，有证据表明，PSMA可以充当受体介导推定配体的内化。PSMA经历组成型内化，并且PSMA特异性抗体可诱导和/或增加内化速率，然后使抗体在内体中积累(Liu等人,Cancer Res.199858:4055-4060)。虽然PSMA特异性内化抗体可能有助于开发将毒素、药物或放射性同位素靶向递送至前列腺癌细胞内部的治疗剂(Tagawa等人,Cancer 2010 116(S4):1075)，但由于PSMA特异性抗体在被效应细胞识别之前可能会被内化，故利用天然或工程改造的效应子机制(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)或重定向T细胞的细胞毒性(RTCC))的PSMA特异性抗体可能会出现问题。
因此，仍然需要能够有效治疗包括前列腺癌在内的实体瘤癌症，而且不会在患者体内引发有害的全身性细胞因子释放的TAA x CD3双特异性抗体(例如PSMA x CD3双特异性抗体)。
发明内容
本文提供了结合至CD3和肿瘤相关抗原(TAA)如PSMA的抗体。此类抗体可以“失调(detuned)”而对CD3具有降低的或较低的结合亲和力，同时维持对TAA的强结合亲和力。此类失调的抗体被设计成保留对CD3的足够结合亲和力以诱导CD8 T细胞活化和增殖。与其它基于抗CD3的治疗剂相比，本文提供的失调抗体具有强效杀灭实体瘤细胞和低细胞因子释放的益处。
双特异性抗体的降低的CD3结合亲和力可以如本文所解释的那样实现，例如，通过处理CD3结合结构域的序列、通过将CD3结合结构域放于双特异性抗体的C末端(例如通过连接至免疫球蛋白恒定区的C末端)，和/或通过使双特异性抗体对CD3呈单价来实现。例如，本文提供了被设计成对于TAA呈二价并且对于CD3呈单价的抗体。此外，本文提供的TAA x CD3抗体可包含修饰的Fc区，它防止或降低CDC和/或ADCC活性。
降低CD3结合结构域的结合亲和力可以减少血液中循环T细胞所结合的抗体量，并使TAA x CD3双特异性抗体能够到达实体瘤，在此情况下，T细胞的细胞毒性可以在肿瘤处发生。与对CD3不具有降低的结合亲和力的对照TAA x CD3抗体相比，此类TAA x CD3抗体可以对表达TAA的实体瘤细胞展现出提高的杀伤作用。
与对CD3具有高亲和力的TAA x CD3抗体相比，本文提供的TAA x CD3抗体引起降低的炎性细胞因子(例如IFN-γ、IL-2、TNF-α和/或IL-6)水平。与对CD3具有高亲和力的TAAx CD3抗体相比，本文提供的TAA x CD3抗体引起降低的炎性细胞因子(例如颗粒酶B、IL-10和/或GM-CSF)水平。本文所公开的TAA x CD3双特异性抗体在患者体内引起不可检测的水平的细胞因子释放或降低的水平的细胞因子释放。降低TAA x CD3抗体的CD3结合结构域对CD3的结合亲和力可以降低用包含TAA x CD3的药物组合物治疗的患者患细胞因子释放综合征的可能性。
TAA(例如PSMA)结合结构域与PSMA的结合强度、结合效力和/或亲合力可高于CD3结合结构域对CD3所具有的结合强度、结合效力和/或亲合力。在Jurkat细胞测定中，与TSC266和/或PSMA01110相比较，CD3结合结构域对CD3可具有降低的结合强度、结合效力和/或亲合力。
在某些方面，本文提供的双特异性抗体包含：(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至肿瘤相关抗原(TAA)的第一单链可变片段(scFv)、(ii)免疫球蛋白恒定区和(iii)结合至CD3的scFv；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含(i)结合至TAA的第二scFv和(ii)免疫球蛋白恒定区，
其中所述双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。
在某些方面，TAA是PSMA、HER2或BCMA。在某些方面中，TAA是PSMA。
在某些方面，第一多肽与第二多肽通过至少一个二硫键接合。
在某些方面，结合至TAA的第一scFv呈VH-VL取向。在某些方面，结合至TAA的第一scFv呈VL-VH取向。
在某些方面，结合至TAA的第二scFv呈VH-VL取向。在某些方面，结合至TAA的第二scFv呈VL-VH取向。
在某些方面，结合至TAA的第一scFv与结合至TAA的第二scFv是相同的。
在某些方面，结合至CD3的scFv呈VH-VL取向。在某些方面，结合至CD3的scFv呈VL-VH取向。
在某些方面，第一多肽中的免疫球蛋白恒定区包含结突变(knob mutation)和/或第二多肽中的免疫球蛋白恒定区包含孔突变(hole mutation)。在某些方面，第一多肽中的免疫球蛋白恒定区包含孔突变和/或第二多肽中的免疫球蛋白恒定区包含结突变。
在某些方面，包含结突变的免疫球蛋白恒定区包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列和/或包含孔突变的免疫球蛋白恒定区包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
在某些方面，与野生型免疫球蛋白恒定区相比，所述免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止FcγR1和/或FcγRIIIb的结合。在某些方面，与野生型免疫球蛋白恒定区相比，所述免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止或降低CDC活性。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代以及G236缺失。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含免疫球蛋白IgG1的CH2和CH3结构域。
在某些方面，双特异性抗体不含CH1结构域。
在某些方面，双特异性抗体包含结合至TAA的第一scFv、结合至CD3的scFv和/或结合至TAA的第二scFv包含甘氨酸-丝氨酸接头。
在某些方面，结合至TAA的第一scFv、结合至CD3的scFv和/或结合至TAA的第二scFv包括含氨基酸序列(Gly4Ser)n的甘氨酸-丝氨酸接头，其中n＝1-5。在某些方面，n＝4。
在某些方面，第一多肽和/或第二多肽还在scFv与免疫球蛋白恒定结构域之间包含至少一个接头。在某些方面，接头包含铰链区。在某些方面，铰链是IgG1铰链区。在某些方面，铰链包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。
在某些方面，结合至PSMA的第一scFv和/或结合至PSMA的第二scFv能够结合食蟹猴PSMA。在某些方面，结合至PSMA的第一scFv和/或结合至食蟹猴PSMA的第二scFv具有比结合至人PSMA的EC50高不超过5倍的EC50。
在某些方面，双特异性抗体能够同时结合至TAA和CD3。
在某些方面，结合至CD3的scFv结合至CD3ε。
在某些方面，结合至PSMA的第一scFv包含可变重链(VH)互补决定区(CDR)1、VHCDR2和VH CDR3，所述VH CDR 1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:70、72和74的氨基酸序列，并且包含可变轻链(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:76、78和80的氨基酸序列。
在某些方面，结合至PSMA的第一scFv包含VH结构域，该结构域包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，并且包含VL结构域，该结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
在某些方面，结合至PSMA的第一scFv包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
在某些方面，结合至CD3的scFv包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:88、90和92的氨基酸序列，并且包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:94、96和98的氨基酸序列。
在某些方面，结合至CD3的scFv包含VH结构域，该结构域包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，并且包含VL结构域，该结构域包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
在某些方面，结合至CD3的scFv包含SEQ ID NO:104或110的氨基酸序列。
在某些方面，结合至PSMA的第二scFv包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:70、72和74的氨基酸序列，并且包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:76、78和80的氨基酸序列。
在某些方面，结合至PSMA的第二scFv包含VH结构域，该结构域包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，并且包含VL结构域，该结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
在某些方面，结合至PSMA的第二scFv包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
在某些方面，第一多肽包含SEQ ID NO:106、178或112的氨基酸序列。
在某些方面，第二多肽包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
在某些方面，双特异性抗体能够促进CD8+T细胞和/或CD4+T细胞的扩增。在某些方面，双特异性抗体能够活化CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。在某些方面，双特异性抗体能够增加中央记忆T细胞(TCM)和/或效应记忆T细胞(TEM)。在某些方面，双特异性抗体能够减少原始T细胞和/或终末分化T细胞(Teff)。
在某些方面，双特异性抗体能够减少IFN-γ、IL-2、IL-6和/或TNF-α的分泌。在某些方面，双特异性抗体能够减少颗粒酶B、IL-10和/或GM-CSF的分泌。在某些方面，双特异性抗体能够增加NFκB、NFAT和/或ERK信号传导路径的信号传导。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含PSMA结合结构域，其中PSMA结合结构域包含VH和VL，其中VH包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含PSMA结合结构域，其中PSMA结合结构域包含VH和VL，其中VL包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在某些方面，VH包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含CD3抗原结合结构域，其中CD3抗原结合结构域包含VH和VL，其中VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含CD3抗原结合结构域，其中CD3抗原结合结构域包含VH和VL，其中VL包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在某些方面，VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段是IgG抗体，任选地其中IgG抗体是IgG1抗体。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区，任选地其中重链恒定区是人IgG1重链恒定区，和/或任选地其中轻链恒定区是人IgGκ轻链恒定区。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv或scFv-Fc。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含scFv。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
在某些方面，双特异性抗体或片段包含特异性结合PSMA的抗原结合结构域和特异性结合CD3的抗原结合结构域。
在某些方面，(i)特异性结合PSMA的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:82和84的氨基酸序列，和/或(ii)特异性结合CD3的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:100和102的氨基酸序列。
在某些方面，特异性结合PSMA的抗原结合结构域包含呈VH-VL取向的VH和VL。在某些方面，特异性结合PSMA的抗原结合结构域包含呈VL-VH取向的VH和VL。
在某些方面，特异性结合CD3的抗原结合结构域包含呈VH-VL取向的VH和VL。在某些方面，特异性结合CD3的抗原结合结构域包含呈VL-VH取向的VH和VL。
在某些方面，特异性结合PSMA的抗原结合结构域包含scFv，该scFv包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列。
在某些方面，特异性结合至CD3的抗原结合结构域包含scFv，该scFv包含SEQ IDNO:104的氨基酸序列。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于CD3是单价的。在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于CD3是二价的。
在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于PSMA是二价的。在某些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段对于PSMA是单价的。
在某些方面，抗体或片段包含多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含(i)第一单链可变片段(scFv)；(ii)接头，任选地其中所述接头是铰链区；(iii)免疫球蛋白恒定区；以及(iv)第二scFv，其中(a)第一scFv包含人CD3抗原结合结构域，并且第二scFv包含人PSMA抗原结合结构域，或者(b)第一scFv包含人PSMA抗原结合结构域并且第二scFv包含人CD3抗原结合结构域。
在某些方面，抗体或片段包含结突变和孔突变。
在某些方面，本文提供的双特异性抗体包含：(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至PSMA的第一单链可变片段(scFv)，该scFv包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；(ii)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的接头；(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定区；和(iv)结合至CD3的scFv，该scFv包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含(i)结合至PSMA的第二scFv，该第二scFv包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；(ii)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的接头；和(iii)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定区，其中双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。
在某些方面，本文提供的双特异性抗体包含：第一多肽，该第一多肽包含SEQ IDNO:106、178或112的氨基酸序列；以及第二多肽，该第二多肽包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列，其中双特异性抗体仅含一个CD3结合结构域。
在某些方面，本文提供的双特异性抗体由包含SEQ ID NO:106、178或112的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第二多肽组成。
在某些方面，本文提供的多核苷酸编码本文提供的双特异性抗体。
在某些方面，本文提供的载体或表达载体包含编码本文提供的双特异性抗体的多核苷酸。
在某些方面，本文提供的宿主细胞包含编码双特异性抗体的多核苷酸或编码本文提供的双特异性抗体的载体。
在某些方面，本文提供的宿主细胞包含编码本文提供的双特异性抗体的多核苷酸的组合。在某些方面，所述多核苷酸在单一载体上编码。在某些方面，所述多核苷酸在多个载体上编码。
在某些方面，宿主细胞选自由CHO、HEK293或COS细胞组成的组。
在某些方面，产生如本文提供的特异性结合至人PSMA和人CD3的双特异性抗体的方法包括培养宿主细胞以产生抗体，并且任选地还包括回收抗体。
在某些方面，用于检测样品中的PSMA和CD3的方法包括使样品与本文提供的双特异性抗体接触，任选地其中样品包含细胞。
在某些方面，本文提供的药物组合物包含本文提供的双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂。
在某些方面，本文提供的用于增加T细胞增殖的方法包括使T细胞与本文提供的双特异性抗体或本文提供的药物组合物接触。在某些方面，T细胞是CD4+T细胞。在某些方面，T细胞是CD8+T细胞。
在某些方面，细胞在受试者体内，并且接触包括向受试者施用抗体或药物组合物。
在某些方面，用于增强受试者的免疫反应的方法包括向受试者施用有效量的本文提供的双特异性抗体或本文提供的药物组合物。
在某些方面，用于诱导针对表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)的细胞的重定向T细胞的细胞毒性(RTCC)的方法包括使表达PSMA的细胞与本文提供的双特异性抗体或本文提供的组合物接触，其中所述接触处于诱导针对表达PSMA的细胞的RTCC的条件下。
在某些方面，用于治疗受试者的以前列腺特异性膜抗原(PSMA)过表达为特征的病症的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的双特异性抗体或本文提供的组合物。
在某些方面，本文提供的双特异性抗体或本文提供的组合物在受试者体内诱导重定向T细胞的细胞毒性(RTCC)。
在某些方面，双特异性抗体促进CD8+和/或CD4+T细胞的扩增或增殖。在某些方面，双特异性抗体活化CD8+和/或CD4+T细胞。在某些方面，双特异性抗体增加中央记忆T细胞(TCM)和/或效应记忆T细胞(TEM)。在某些方面，双特异性抗体减少原始T细胞和/或终末分化T细胞(Teff)。
在某些方面，双特异性抗体减少IFN-γ、IL-2、IL-6和/或TNF-α的分泌。在某些方面，双特异性抗体能够减少颗粒酶B、IL-10和/或GM-CSF的分泌。在某些方面，双特异性抗体增加NFκB、NFAT和/或ERK信号传导路径的信号传导。
在其它方面，病症是癌症。在某些方面，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、PSMA(+)癌症、转移性前列腺癌、透明细胞肾癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌和胃癌。在某些方面中，癌症是前列腺癌。在某些方面中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。在某些方面，病症是前列腺病症。在某些方面，前列腺病症选自由前列腺癌和良性前列腺增生组成的组。
附图说明
图1A至图1G显示描绘结合至CD3和肿瘤相关抗原(TAA)如PSMA的各种潜在双特异性抗体构建体的结构的卡通图。图1A-E显示不同形式的PSMA x CD3双特异性形式的实例，其中有一些形式使用Fc区中的结(K)和孔(H)突变进行评价，以改善异二聚体形成。图1A显示PSMA VH-VL Fc x CD3 VH-VL Fc。图1B显示PSMA VH-VL-Fc x PSMA VH-VL-Fc-CD3 VH-VL。图1C显示PSMA VH-VL-Fc x PSMA VH-VL-Fc-CD3VL-VH。图1D显示PSMA VH-VL-Fc-CD3VL-VH x PSMA VH-VL-Fc-CD3VL-VH。图1E显示PSMA VH-VL-Fc-CD3 VH-VL x PSMA VH-VL-Fc-CD3VH-VL。图1F显示另外的PSMA x CD3双特异性构建体。图1G显示抗TAA结构域呈VH-VL取向(上图)以及抗TAA结构域呈VL-VH取向(下图)的TAA x CD3抗体构建体。scFv可呈VH-VL或VL-VH取向。除了结合结构域是scFv之外，结合结构域还可以是细胞外结构域或细胞因子。孔中结(Knob-In-Hole)突变可以处于任一条Fc链上。取决于所希望的活性，可以并入另外的突变以消除或增强效应子功能。(参见实施例1。)
图2显示107-1A4和人源化抗PSMA结合结构域的序列。VH序列显示于上图中，而VL序列显示于下图中。显示各个序列与人种系序列之间的差异。CDR(IMGT定义)用括号表示。(参见实施例4。)
图3显示CRIS-7和人源化CD3ε特异性结合结构域的序列。VH序列显示于上图中，而VL序列显示于下图中。显示各个序列与人种系序列之间的差异。CDR(IMGT定义)用括号表示。(参见实施例5。)
图4显示的图描绘了不同细胞系的人PSMA表达水平。使用商业抗PSMA抗体，通过流式细胞术评估受体定量，并且结果以每个细胞结合的抗体数(ABC)为单位报导。(参见实施例7。)
图5显示的图描绘了人源化PSMA结合结构域变体构建体PSMA01012、PSMA01019、PSMA01020、PSMA01021、PSMA01023至PSMA01025与人和食蟹猴CHOK1SV/PSMA转染子的结合曲线。将异二聚体抗体构建体的连续稀释液与转染后的靶标细胞一起培育，随后用SULFOTAG标记的山羊抗人IgG二次抗体进行标记。结合通过MSD(Meso Scale Discovery仪器)进行定量。y轴以电化学发光(ECL)单位展示信号。(参见实施例8。)
图6显示的图描绘了呈scFv-Fc或Fc-scFv不同形式以及VH-VL与VL-VH取向的PSMA结合结构域PSMA01023与C4-2B肿瘤细胞和22RV1肿瘤细胞的结合曲线。将抗体构建体的连续稀释液与PSMA(+)肿瘤细胞一起培育，随后用荧光缀合的山羊抗人二次抗体进行标记。通过流式细胞术定量结合。y轴展示中值荧光强度单位(MFI中值)。(参见实施例10。)
图7A和图7B显示抗肿瘤抗原(TA)x抗CD3εH14、H15或H16单价或二价抗体构建体与Jurkat细胞的结合。将抗体构建体的连续稀释液与Jurkat细胞一起培育，随后用荧光缀合的山羊-α-人Fc二次抗体进行标记。通过流式细胞术定量结合。y轴展示中值荧光强度单位(MFI中值)。(参见实施例11。)
图8A和图8B显示有关在24小时在抗TA x抗CD3εH14、H15和H16构建体存在下测量肿瘤抗原诱导的CD4和CD8 T细胞活化情况的测定的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将纯化的人T细胞与TA(+)肿瘤细胞共培养。使用流式细胞术，通过圈选的CD4或CD8 T细胞上CD25和CD69的上调来定量T细胞活化情况。活化以表达CD69和CD25的CD4或CD8 T细胞的百分比表示。(参见实施例12。)
图9显示有关在96小时在抗TA x抗CD3εH14和H16构建体存在下测量肿瘤抗原诱导的CD4和CD8 T细胞增殖情况的测定的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将CellTrace Violet标记的T细胞与TA(+)肿瘤细胞共培养。使用流式细胞术，通过稀释圈选的CD4或CD8 T细胞上的Cell Trace Violet染料来对T细胞增殖定量。增殖以经历至少一次细胞分裂的CD4或CD8 T细胞的百分比表示。(参见实施例12。)
图10显示有关测量在96小时抗TA x抗-CD3ε构建体H14和H16诱导的针对表达TA的靶标细胞重定向的细胞毒性的测定的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将纯化的人T细胞与TA(+)肿瘤细胞共培养。之后，通过流式细胞术定量以非T细胞群计的活TA(+)肿瘤细胞的分数。TA(+)肿瘤细胞的细胞毒性以培养物中活细胞的损失(活细胞的百分比)表示。(参见实施例12。)
图11A和图11B显示的图描绘了呈各种形式的抗PSMA x抗CD3ε构建体(PSMA01026、PSMA01070、PSMA01071、PSMA01072和PSMA01086)与(A)C4-2B细胞和(B)Jurkat细胞的结合曲线。将异二聚体抗体构建体的连续稀释液分别与PSMA(+)或CD3(+)细胞系C4-2B或Jurkat一起培育，随后用荧光缀合的山羊抗人Fc二次抗体进行标记。通过流式细胞术定量结合。y轴展示中值荧光强度单位(MFI中值)。(参见实施例13。)
图12A和图12B显示有关在24小时测量在抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01026、PSMA01070、PSMA01071、PSMA01072和PSMA01086存在下肿瘤抗原诱导的CD4和CD8 T细胞活化的测定的结果。在异二聚体抗体构建体的连续稀释液存在下，将外周血单核细胞(PBMC)与C4-2B(A)或无靶标细胞(B)共培养。使用流式细胞术，通过圈选的CD4或CD8 T细胞上CD25和CD69的上调来定量T细胞活化情况。活化以表达CD69和CD25的CD4或CD8 T细胞的百分比表示。(参见实施例14。)
图13显示有关在C4-2B靶标细胞存在下，在24小时的时候测量由来自PBMC培养物的抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01026、PSMA01070、PSMA01071、PSMA01072和PSMA01086诱导的细胞因子分泌的测定的结果。在异二聚体抗体构建体的连续稀释液存在下，将PBMC与C4-2B靶标细胞共培养。使用基于多路复用的测定来评估培养物上清液中细胞因子的分泌情况。细胞因子水平以pg/mL为单位表示。(参见实施例14。)
图14显示有关在C4-2B靶细胞存在下，在96小时的时候利用抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01026、PSMA01070、PSMA01071、PSMA01072和PSMA01086测量肿瘤抗原诱导的CD4和CD8 T细胞增殖的测定的结果。在异二聚体抗体构建体的连续稀释液存在下，将CTV标记的人PBMC与C4-2B靶标细胞共培养。使用流式细胞术，通过稀释圈选的CD4或CD8 T细胞上的CTV来对T细胞增殖定量。增殖以经历至少一次细胞分裂的CD4或CD8 T细胞的百分比表示。(参见实施例14。)
图15显示有关在72小时和96小时的时候测量在抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01026、PSMA01070、PSMA01071、PSMA01072、PSMA01086和对照CD3构建体TRI149存在下T细胞重定向的针对表达PSMA的靶标细胞的细胞毒性的测定的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将PBMC与C4-2B-荧光素酶(C4-2B-luc)细胞共培养。在添加荧光素底物后，通过生物发光对活C4-2B细胞的分数进行定量。C4-2B-luc细胞的细胞毒性以培养物中活细胞(表达荧光素酶)的损失百分比表示，并以RLU(相对光单位)表示。(参见实施例14。)
图16显示在前列腺癌皮下异种移植小鼠模型中通过生物发光水平随时间的变化测量的用抗PSMA x抗CD3ε构建体治疗的动物中的肿瘤生长情况。将两百万个C4-2B细胞与一百万个人T细胞于50％ HC基质胶中的混合物皮下注射到雄性NOD/scid小鼠的右侧腹中(n＝10只/组)。在第0天、第4天和第8天通过IV注射施用治疗。绘制每组的平均log10肿瘤生物发光±SEM。(参见实施例15。)
图17显示如图13中所描述，在前列腺癌皮下异种移植小鼠模型中通过生物发光水平随时间的变化测量的用抗PSMA x抗CD3ε构建体治疗的动物中的肿瘤发生率。肿瘤发生率是以每组具有可检测生物发光的动物的百分比确定。(参见实施例15。)
图18A至图18E显示的图描绘了呈各种形式的抗PSMA x抗CD3ε构建体(TSC266、PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110)与(图18A和图18C)C4-2B细胞和(图18B和图18D)Jurkat细胞以及(图18E)过表达食蟹猴PSMA的CHO细胞(CHO-CynoPSMA)的结合曲线。将双特异性抗体构建体的连续稀释液分别与PSMA(+)或CD3(+)细胞系C4-2B、Jurkat或CHO-CynoPSMA一起培育，随后用荧光缀合的山羊-α-人Fc二次抗体进行标记。通过流式细胞术定量结合。y轴展示中值荧光强度单位(MFI中值)。(参见实施例20。)
图19A和图19B显示有关在(A)C4-2B靶标细胞或(B)无靶标细胞存在下，利用抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01108和TSC291a在24小时的时候测量肿瘤抗原诱导的CD4和CD8 T细胞活化情况的测定的结果。图19C和图19D显示在C4-2B靶标细胞(C)或无靶标细胞(D)存在下由抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01107、PSMA01108和PSMA0110诱导的T细胞活化情况。图19E显示在C4-2B靶标细胞存在下200pM构建体PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的汇总数据。在双特异性抗体构建体的连续稀释液存在下，将外周血单核细胞(PBMC)与C4-2B或不与靶标细胞共培养。使用流式细胞术，通过圈选的CD4或CD8 T细胞上CD25和CD69的上调来定量T细胞活化情况。活化以表达CD69和CD25的CD4或CD8 T细胞的百分比表示。(参见实施例20。)
图20A-E显示有关在存在或不存在表达PSMA的靶标细胞的情况下，在24小时的时候测量来自PBMC培养物的抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01108、PSMA01110和TSC291a所诱导的细胞因子分泌的测定的结果。图20A显示来自与C4-2B靶标细胞共培养的PBMC的抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01108和TSC291a引起的细胞因子反应。图20B和图20C显示在存在C4-2B靶标细胞(图20B)或不存在C4-2B靶标细胞(图20C)的情况下来自PBMC的200pM构建体PSMA01107和TSC291a的汇总数据。图20D显示在C4-2B靶标细胞存在下来自PBMC的200pM构建体PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的汇总数据。图20E显示在存在或不存在C4-2B靶标细胞的情况下利用构建体PSMA01107的连续稀释曲线的细胞因子反应。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将PBMC与C4-2B靶标细胞共培养。使用基于多路复用的测定来评估培养物上清液中细胞因子的分泌情况。细胞因子水平以pg/mL为单位表示。(参见实施例20。)
图21A和图21B显示有关在C4-2B靶标细胞存在下，在96小时的时候利用抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01108、TSC291a和对照CD3构建体TRI149测量肿瘤抗原诱导的CD4和CD8 T细胞增殖的测定的结果。使用流式细胞术，通过圈选的CD4或CD8 T细胞上CD25和CD69的上调来定量T细胞活化情况。(参见实施例20。)
图22A和图22B显示有关在C4-2B靶标细胞存在下，在96小时的时候利用抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110测量肿瘤抗原诱导的CD4和CD8 T细胞增殖的测定的结果(图22A)和200pM的汇总数据(图22B)。(参见实施例20。)
图23显示有关在72小时和96小时的时候测量在抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107和PSMA01108存在下T细胞重定向的针对表达PSMA的靶标细胞的细胞毒性的测定的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将PBMC与C4-2B-荧光素酶(C4-2B-luc)细胞共培养。在添加荧光素底物后，通过生物发光对活C4-2B细胞的分数进行定量。C4-2B-luc细胞的细胞毒性以培养物中活细胞(表达荧光素酶)的损失百分比表示，并以RLU(相对光单位)表示。(参见实施例20。)
图24显示使用Meso Scale Discovery平台进行的抗PSMA x抗CD3ε抗体构建体与各种细胞系的非特异性结合分析。本实验中包括的细胞系是AsPC-1、U937、K562、CHOK1SV和MDA-MB-231。C4-2B前列腺癌细胞和Jurkat细胞分别用于与PSMA和CD3的阳性结合。(参见实施例21。)
图25显示在C57BL/6小鼠中抗PSMA x抗CD3构建体的平均血清浓度。对小鼠(n＝3只/组)静脉内施用约10μg(0.5mg/kg)的PSMA01107、PSMA01108或PSMA01110。由于存在抗药物抗体，故从平均值计算中排除一只被给予PSMA01108的小鼠(小鼠#4)的浓度数据。
(参见实施例26。)
图26显示在C57BL/6小鼠中抗PSMA x抗CD3抗体构建体的个别血清浓度。对小鼠(n＝3只/组)静脉内给予约10μg(0.5mg/kg)的PSMA01107、PSMA01108或PSMA01110。(参见实施例26。)
图27显示的图描绘了肿瘤细胞系上人PSMA表面表达水平。使用商业抗PSMA抗体，通过流式细胞术评估受体定量，并且结果以每个细胞结合的抗体数(ABC)为单位报导。(参见实施例28。)
图28A至图28D显示的图描绘了(A)TSC266、(B)TSC266(重调整)、(C)PSMA01107和(D)PSMA01107(重调整)与各种表达PSMA的细胞系上的结合曲线。抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01108和PSMA01110展现出与PSMA01107相同的结合特征(数据未显示)。将抗体构建体的连续稀释液分别与PSMA(+)细胞系LNCaP、C4-2BMDA-PCa-2b、22RV1或DU145一起培育，随后用荧光缀合的山羊-α-人Fc二次抗体进行标记。通过流式细胞术定量结合。y轴展示中值荧光强度单位(MFI中值)。(参见实施例29。)
图29显示在各种表达PSMA的靶标细胞系存在下，在24小时的时候用抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110测量肿瘤抗原诱导的CD4 T细胞活化的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将外周血单核细胞(PBMC)与表达PSMA的细胞共培养。使用流式细胞术，通过圈选的CD4+T细胞上CD25和CD69的上调来定量T细胞活化情况。(参见实施例29。)
图30显示在各种表达PSMA的靶标细胞系存在下，在24小时的时候用抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110测量肿瘤抗原诱导的CD8+T细胞活化的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将外周血单核细胞(PBMC)与表达PSMA的细胞共培养。使用流式细胞术，通过圈选的CD8+T细胞上CD25和CD69的上调来定量T细胞活化情况。(参见实施例29。)
图31A和图31B显示有关在72小时和96小时的时候测量在抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110存在下T细胞重定向的针对高水平表达PSMA的靶标细胞(图31A：C4-2B)或低水平表达PSMA的靶标细胞(图31B：MDA-PCa-2b)的细胞毒性的测定的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将PBMC与C4-2B-荧光素酶(C4-2B-luc)细胞共培养。在添加荧光素底物后，通过生物发光对活C4-2B细胞或MDA-PCa-2b细胞的分数进行定量。C4-2B-luc细胞的细胞毒性以RLU(相对光单位)表示。(参见实施例29。)
图32A和图32B显示的图描绘了利用抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01107通过受体定量或直接结合测量的肿瘤细胞系上人PSMA表面表达的水平(图32A)。使用商业抗PSMA抗体，通过流式细胞术评估受体定量，并且结果以每个细胞结合的抗体数为单位报导，构建体结合是通过将含PSMA01107的细胞系与肿瘤靶标细胞系一起培育并通过流式细胞术检测结合来评估。图32B显示利用匹配的肿瘤细胞系的特异性裂解百分比进行的抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01107对肿瘤靶细胞的结合的比较。(参见实施例29。)
图33A和图33B显示连续稀释的抗PSMA x抗CD3ε构建体(PSMA01107和PSMA01116)与(A)表达PSMA的C4-2B细胞和(B)表达CD3的Jurkat细胞的结合曲线。通过流式细胞术定量结合。y轴展示中值荧光强度单位(MFI中值)。(参见实施例30。)
图34显示在C4-2B靶标细胞存在下，使用抗PSMA x抗CD3ε构建体TSC266、PSMA01107、PSMA01116和TRI149的连续稀释液在24小时的时候测量肿瘤抗原诱导的CD4+和CD8+T细胞活化的结果。使用流式细胞术，通过圈选的CD4+或CD8+T细胞上CD25和CD69的上调来定量T细胞活化情况。(参见实施例30。)
图35显示在24小时的时候来自PBMC培养物的抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01107、PSMA01116和TSC291a所诱导的细胞因子分泌水平。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将PBMC与C4-2B靶标细胞共培养。使用基于多路复用的测定来评估培养物上清液中细胞因子的分泌情况。细胞因子水平以pg/mL为单位表示。(参见实施例30。)
图36显示有关在72小时和96小时的时候测量在抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01107和PSMA01116存在下T细胞重定向的针对高水平表达PSMA的靶标细胞的细胞毒性的测定的结果。在抗体构建体的连续稀释液存在下，将PBMC与C4-2B-luc靶标细胞共培养。在添加荧光素底物后，通过生物发光对活C4-2B细胞的分数进行定量，并以RLU表示。(参见实施例31。)
图37显示在用CD3 x PSMA构建体治疗后至第28天NOD/SCID小鼠体内C4-2B-荧光素酶肿瘤细胞的生长情况。(参见实施例32。)
图38显示在用CD3 x PSMA构建体治疗后NOD/SCID小鼠体内C4-2B-荧光素酶肿瘤发生细胞的生长情况。(参见实施例32。)
图39A和图39B显示在用CD3 x PSMA构建体治疗后至第63天(图39A)或第28天(图39B)的研究终点NOD/SCID小鼠体内C4-2B-荧光素酶肿瘤细胞的生长情况。汇总表显示在第24天计算的log减少％和在第14天在最大反应下计算的无肿瘤发生率％(图32B)。(参见实施例32。)
图40显示NOD/SCID小鼠的生物发光成像，用于观察在CD3 x PSMA构建体治疗后C4-2B肿瘤的生长情况。生物发光展示为在每只动物的身体上观察到的增加的光密度和对比阴影。(参见实施例32。)
图41显示利用20nM不同抗PSMA x抗CD3ε构建体，在存在或不存在表达PSMA的C4-2B靶标细胞的情况下操作的经由NFAT、ERK和NFkB进行的下游CD3信号传导，用以展示PSMA交联的要求以及在没有交联情况下CD3信号传导的背景水平。通过测量在NFAT、ERK或NFkB报告分子测定中表达的相对光单位来评估报告分子活性。将构建体与或不与靶标细胞和报告分子细胞系一起培育24小时，随后添加BioGlo。y轴展示相对光单位(RLU)。(参见实施例34)。
图42A和图42B显示利用各种抗PSMA x抗CD3ε构建体的各种NFAT报告分子测定和CD3下游信号传导活性。图42A显示在培养10小时后针对构建体的连续稀释液评估的NFAT报告分子的活性。图42B显示在NFAT报告分子测定中从连续稀释的构建体获得的EC50值，并作图以比较不同时间点的EC50差异。(参见实施例34)。
图43显示在C4-2B肿瘤靶标细胞存在下培养4、10和24小时后，从NFAT、ERK和NFκB报告分子信号传导测定，通过抗PSMA x抗CD3ε构建体滴定获得的EC50。(参见实施例34)。
图44A至图44C显示抗PSMA x抗CD3ε构建体对人CD8+T细胞记忆表型的影响。图44A和图44B显示在72小时后，在含有PSMA01107或PSMA1110的连续稀释液和C4-2B肿瘤靶标细胞的培养物中抗PSMA x抗CD3ε构建体对人CD8+T细胞的记忆表型的体外作用。使用流式细胞术，以圈选的CD5+CD8+T细胞上CD45RO和CD62L的表面染色百分比定量记忆表型。展示了CD45RO+CD62L+中央记忆T细胞(图44A)和CD45RO-CD62L-终末分化T细胞(图44B)。图44C显示所绘制的用以展示在与抗PSMA x抗CD3ε(0.2nM)和C4-2B靶标细胞培育后原始、中央记忆(TCM)、效应记忆(TEM)和终末分化(Teff)CD8+T细胞的差异的代表性数据。(参见实施例35)。
具体实施方式
为便于理解本公开，以下定义多个术语和短语。
I.术语
如本文所用，术语“前列腺特异性膜抗原(PSMA)”，又称为谷氨酸羧肽酶II和N-乙酰化α连接的酸性二肽酶1，它是一种二聚体II型跨膜糖蛋白，属于M28肽酶家族，由FOLH1(叶酸水解酶1)基因编码。这一蛋白质作为谷氨酸羧肽酶作用于包括养分叶酸和神经肽N-乙酰基-l-天冬氨酰基-l-谷氨酸在内的不同替代性底物，并在许多组织如前列腺中表达，并且在较低程度上，在小肠、中枢和周围神经系统以及肾脏中有表达。编码PSMA的基因经历替代性剪接而产生至少三种变体。这一基因中的突变可能与膳食叶酸的肠吸收受损有关，导致血液叶酸水平低和由此引起的高同型半胱氨酸血症。这种蛋白质在脑中的表达可能涉及与谷氨酸兴奋性毒性相关的多种病理状况。PSMA的表达随着前列腺癌的进展而增加，并且在转移性疾病、激素难治性病例和更高级病变中最高。此外，PSMA在包括膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌和肾癌在内的多种其它实体瘤的新血管系统中大量表达，但在正常新血管系统中不表达。
如本文所用，术语“CD3”在本领域中称为六链多蛋白复合物(参见例如Abbas和Lichtman,2003；Janeway等人,第172和178页,1999)，它们是T细胞受体复合物的亚基。在哺乳动物中，T细胞受体复合物的CD3亚基是一条CD3γ链、一条CD3δ链、两条CD3ε链，以及CD3ζ链的同二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是免疫球蛋白超家族中高度相关的细胞表面蛋白，含有单一免疫球蛋白结构域。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电，这是允许这些链与带正电的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾各含有一个保守基序，称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM，而每条CD3ζ链具有三个保守基序。据信，免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)对于TCR复合物的信号传导能力很重要。本公开中使用的CD3可以来自各种动物物种，包括人、猴子、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
如本文所用，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”是指直接对抗和/或包围肿瘤细胞的淋巴细胞。肿瘤浸润淋巴细胞典型地是非循环淋巴细胞，并且包括CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞。
如本文所用，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”是本领域的术语并在本文中可以互换使用，并且是指具有至少一个特异性结合抗原的抗原结合位点的分子或分子复合物。
抗体可包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、表面重塑抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、异型缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和抗体(affybodies)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗-抗Id抗体)、双特异性抗体和多特异性抗体。在某些方面，本文所述的抗体是指多克隆抗体群体。
抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如IgG2a或IgG2b)。在某些方面，本文所述的抗体是IgG抗体，或其某一类别(例如人IgG1、IgG2或IgG4)或亚类。在一个特定方面，抗体是人源化单克隆抗体。在另一个特定方面，抗体是人单克隆抗体，例如免疫球蛋白。在某些方面，本文所述的抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。
“双特异性”抗体是具有两个不同抗原结合位点(不包括Fc区)的抗体，可结合两种不同的抗原。双特异性抗体可包括例如重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、表面重塑抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、异型缀合抗体、连接的单链抗体或连接的单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和抗体、连接的Fab片段、F(ab')2片段、化学连接的Fv和二硫键连接的Fv(sdFv)。双特异性抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如IgG2a或IgG2b)。在某些方面，本文所述的双特异性抗体是IgG抗体，或其某一类别(例如人IgG1、IgG2或IgG4)或亚类。
双特异性抗体可以是例如对于每个靶标是单价的(例如，一个臂靶向一种抗原且另一臂靶向另一种抗原的IgG分子)；对于每个靶标是二价的(例如当双特异性抗体呈同二聚体ADAPTIRTM形式时)；或对一个靶标(例如CD3)是单价的，而对另一个靶标(例如TAA，如PSMA、HER2或BCMA)是二价的(例如当双特异性抗体呈异二聚体ADAPTIR-FLEXTM形式时)。
在某些方面，本文所述的双特异性抗体包含两种多肽，任选地为相同的多肽，每种多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含：第一scFv抗原结合结构域、接头(任选地，其中接头是铰链区)、免疫球蛋白恒定区和第二scFv抗原结合结构域。这种特殊类型的抗体以同二聚体ADAPTIRTM技术为例，它对每个靶标都是二价的。
在某些方面，本文所述的双特异性抗体包含异二聚体，即，包含两个不相同的多肽的二聚体。例如，一方面，本文所述的双特异性抗体包含：第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含结合第一生物靶标的第一单链可变片段(scFv)、接头(例如免疫球蛋白铰链)、免疫球蛋白恒定区和结合第二生物靶标的第二单链可变片段(scFv)；以及第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含结合第一生物靶标的第一单链可变片段(scFv)、接头(例如免疫球蛋白铰链)和免疫球蛋白恒定区。在另一方面，本文所述的异二聚体双特异性抗体包含：第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含结合第一生物靶标的第一单链可变片段(scFv)、接头(例如免疫球蛋白铰链)、免疫球蛋白恒定区和结合第二生物靶标的第二单链可变片段(scFv)；以及第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含接头(例如免疫球蛋白铰链)、免疫球蛋白恒定区和结合第二生物靶标的第二单链可变片段(scFv)。这些对一个靶标是二价的且对另一个靶标是单价的特定类型抗体将以ADAPTIR-FLEXTM平台技术为例说明。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”、“抗原结合区”、“抗原结合位点”和类似术语是指抗体分子中包含赋予抗体分子对抗原的特异性的氨基酸残基的部分(例如互补决定区(CDR))。抗原结合区可以来源于任何动物物种，例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)和人类。结合至TAA的抗原结合结构域在本文中可称为例如“TAA结合结构域”。结合至PSMA的抗原结合结构域在本文中可称为例如“PSMA结合结构域”。结合至CD3的抗原结合结构域在本文中可称为例如“CD3结合结构域”。在一些方面，CD3结合结构域结合至CD3ε。
如本文所用，术语“TAA/CD3抗体”、“CD3/TAA抗体”、“抗TAA/CD3抗体”、“抗CD3/TAA抗体”、“TAA x CD3抗体”和“CD3x TAA抗体”是指一种含有结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)的抗原结合结构域和结合至CD3(例如人CD3)的抗原结合结构域的双特异性抗体。
如本文所用，术语“PSMA/CD3抗体”、“CD3/PSMA抗体”、“抗PSMA/CD3抗体”、“抗CD3/PSMA抗体”、“PSMA x CD3抗体”和“CD3 x PSMA抗体”是指一种含有结合至PSMA(例如人PSMA)的抗原结合结构域和结合至CD3(例如人CD3)的抗原结合结构域的双特异性抗体。
“单克隆”抗体是指参与单一抗原决定簇或表位的高特异性识别和结合的同源抗体群。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆”抗体涵盖完整和全长免疫球蛋白分子以及Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其它修饰过的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体是指以多种方式产生的此类抗体，包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物产生的抗体。
术语“嵌合”抗体是指氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。典型地，轻链和重链的可变区对应于来源于具有所需特异性、亲和力和能力的一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，而恒定区与来源于另一哺乳动物物种(通常是人类)的抗体中的序列同源，以避免在该物种中引发免疫反应。
术语“人源化”抗体是指含有最小非人(例如鼠)序列的非人(例如鼠)抗体的形式。典型地，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的残基置换(“CDR移植”)(Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988))。在一些方面，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种的抗体中的相应残基替换。其人源化抗体可以通过在Fv构架区中和/或被置换的非人残基内取代另外的残基进行进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般来说，人源化抗体将包含至少一个且典型地两个或三个可变结构域的基本上全部，所述可变结构域含有对应于非人免疫球蛋白的CDR区的全部或基本上全部，而FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共同序列的FR。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利5,225,539；Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)；和Roguska等人,Protein Eng.9(10):895-904(1996)。
术语“人”抗体是指具有来源于人免疫球蛋白基因座的氨基酸序列的抗体，其中此类抗体是使用本领域已知的任何技术制备的。
可变区典型地是指抗体的一部分，一般是轻链或重链的一部分，典型地是成熟重链的约氨基末端110至125个氨基酸和成熟轻链的约90至115个氨基酸链，抗体之间的序列差异很大，并且被用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域，而可变结构域中保守性较高的区域称为构架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信，轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些方面，可变区是人可变区。在某些方面，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人构架区(FR)。在特定方面，可变区是灵长类动物(例如非人灵长类动物)可变区。在某些方面，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和灵长类动物(例如非人灵长类动物)构架区(FR)。
术语“VH”与“VH结构域”可互换使用，指抗体的重链可变区。
术语“VL”与“VL结构域”可互换使用，指抗体的轻链可变区。
术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是公认的并且是指对抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面，抗体的CDR可以根据Kabat编号系统确定(参见例如Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NYAcad Sci 190:382-391以及Kabat EA等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR典型地存在于以下位置处：第31至35位氨基酸，所述CDR任选地可以在第35位之后包括一个或两个额外的氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B)(CDR1)；第50至65位氨基酸(CDR2)；和第95至102位氨基酸(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR典型地存在于以下位置处：第24至34位氨基酸(CDR1)、第50至56位氨基酸(CDR2)和第89至97位氨基酸(CDR3)。在一个特定方面，本文所述抗体的CDR已根据Kabat编号方案确定。
而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环的长度而在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入序列置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果只有35A存在，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。在一个特定方面，本文所述抗体的CDR已根据Chothia编号方案确定。
AbM高变区代表了Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并被OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用。在一个特定方面，本文所述抗体的CDR已根据AbM编号方案确定。
IMGT编号惯例描述于Brochet,X等人,Nucl.Acids Res.36:W503-508(2008)。在一个特定方面，本文所述抗体的CDR已根据IMGT编号方案确定。如本文所用，除非另外提供，否则免疫球蛋白分子可变区中氨基酸残基的位置是根据IMGT编号惯例进行编号。
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”是可互换的并且具有本领域常用的含义。恒定区是抗体的部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分，它不直接参与抗体与抗原的结合，但可以展现出各种效应子功能，例如与Fc受体的相互作用。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区一般具有更保守的氨基酸序列。免疫球蛋白“恒定区”或“恒定结构域”可含有CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域或这些结构域的子集，例如CH2结构域和CH3结构域。在本文提供的某些方面，免疫球蛋白恒定区不含CH1结构域。在本文提供的某些方面，免疫球蛋白恒定区不含铰链。在本文提供的某些方面，免疫球蛋白恒定区含有CH2结构域和CH3结构域。
“Fc区”或“Fc结构域”是指对应于或来源于源抗体中负责结合至细胞上的抗体受体和补体的C1q组分的部分的多肽序列。Fc表示“片段结晶”，指的是易于形成蛋白质晶体的抗体片段。最初通过蛋白水解消化描述的不同蛋白质片段可以定义免疫球蛋白的整体一般结构。“Fc区”或“Fc结构域”含有CH2结构域、CH3结构域和任选的全部或部分铰链。“Fc区”或“Fc结构域”可以指单一多肽或两个二硫键连接的多肽。有关免疫球蛋白结构和功能的综述，请参见Putnam,The Plasma Proteins,第V卷(Academic Press,Inc.,1987),第49-140页；以及Padlan,Mol.Immunol.31:169-217,1994。如本文所用，术语Fc包括天然存在的序列的变体。
“野生型免疫球蛋白铰链区”是指在天然存在的抗体的重链中发现的插入CH1与CH2结构域(对于IgG、IgA和IgD)之间并连接该两个结构域或者插入CH1与CH3结构域(IgE和IgM)之间并连接该两个结构域的天然存在的上部和中间铰链氨基酸序列。在某些方面，野生型免疫球蛋白铰链区序列是人的，并且可以包含人IgG铰链区。“改变的野生型免疫球蛋白铰链区”或“改变的免疫球蛋白铰链区”是指(a)具有最多30％氨基酸变化(例如最多25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白铰链区；或(b)野生型免疫球蛋白铰链区的一部分，其长度为约5个氨基酸(例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)到最多约120个氨基酸(例如长度为约10至约40个氨基酸，或约15至约30个氨基酸，或约15至约20个氨基酸，或约20至约25个氨基酸)，具有最多约30％的氨基酸变化(例如最多约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸取代或缺失或其组合)并且具有如US 2013/0129723和US2013/0095097中所公开的IgG核心铰链区。如本文所提供，“铰链区”或“铰链”可位于抗原结合结构域(例如TAA(例如PSMA)结合结构域或CD3结合结构域)与免疫球蛋白恒定区之间。
如本文所用，“接头”是指能够接合两种化合物(例如两个多肽)的部分，例如多肽。接头的非限制性实例包括含甘氨酸-丝氨酸(例如(Gly4Ser))重复的柔性接头，以及来源于以下的接头：(a)跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白)的结构域间区；(b)II型C-凝集素的茎区；或(c)免疫球蛋白铰链。如本文所提供，接头可指例如(1)单链Fv(scFv)中在VH与VL区之间的多肽区或(2)在免疫球蛋白恒定区和抗原结合结构域之间的多肽区.在某些方面，接头包含5至约35个氨基酸，例如约15至约25个氨基酸。在一些方面，接头包含至少5个氨基酸、至少7个氨基酸或至少9个氨基酸。
如本文所用，术语“重链”在用于抗体时可指任何不同类型，例如α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)、γ(gamma)和μ(mu)，基于恒定区的氨基酸序列，分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文所用，术语“轻链”当用于抗体时可指任何不同类型，例如基于恒定区的氨基酸序列为κ(kappa)或λ(lambda)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在特定方面，轻链是人轻链。
如本文所用，术语“EU编号系统”是指抗体恒定区的EU编号惯例，如以下中所描述：Edelman，G.M.等人,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)；和Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health and Human Services,第5版,1991，各自以引用的方式整体并入本文中。如本文所用，除非另外提供，否则免疫球蛋白分子恒定区中氨基酸残基的位置是根据EU命名法(Ward等人，1995 Therap.Immunol.2:77-94)。
如本文所用，术语“二聚体”是指这样一种生物实体，该生物实体由通过包括共价键(例如二硫键)和其它相互作用(例如静电相互作用、盐桥、氢键和疏水相互作用)在内的一种或多种形式的分子内力相互缔合的两个亚基组成，并且在适当的条件下(例如在生理条件下；在适合表达、纯化和/或储存重组蛋白的水溶液中；或在非变性和/或非还原电泳条件下)稳定。如本文所用，“异二聚体”或“异二聚蛋白质”是指由两种不同多肽形成的二聚体。如本文所用，“同二聚体”或“同二聚体蛋白质”是指由两个相同多肽形成的二聚体。因此，异二聚体ADAPTIR-FLEXTM构建体是指包含两个不同多肽的构建体，而同二聚体ADAPTIRTM构建体是指包含两个不同多肽的构建体。
“结合亲和力”一般是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的全部非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的多种方式测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD是由koff/kon的商计算的，而KA是由kon/koff的商计算的。kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，并且koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的技术确定，例如或KinExA。
如本文所用，“结合强度”或“结合效力”是指溶液中的蛋白质分子与在细胞表面上表达或固定于固体表面的结合对的另一成员之间的非共价相互作用的强度，所述固体表面为例如珠粒、SPR芯片、ELISA板等。这些术语可用于描述单价相互作用，其中溶液中蛋白质上的一个结合结构域与表面上的一个配体结合(1:1相互作用)。这可以是二价或多价相互作用，其中溶液中蛋白质分子上的两个或更多个结合结构域同时结合至表面上相同或不同配体的两个或多个拷贝。其它价的相互作用也是可能的，例如三价、四价等。这可以包括结合至同一配体的多个拷贝上的相同位置，或结合至一个配体分子上的不同位置或表位。
与“结合强度”或“结合效力”相关的数值一般是通过对数据作图并执行非线性回归分析以确定EC50值(达到最大结合信号的50％所需的蛋白质浓度)，由细胞结合曲线计算得到。“高结合强度”或“高结合效力”是指EC50值被确定为小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M或小于10-10M的蛋白质:表面相互作用。“低结合强度”或“低结合效力”蛋白质:表面相互作用是指EC50值大于10-7M、大于10-6M或大于10-5M的那些结合结构域。
如本文所用，“结合亲合力”一般是指结合对之间的非共价相互作用，其中结合结构域与配体之间的接触点可能大于1。而结合亲和力表示结合对之间的单一、非共价相互作用，亲合力反映了相互作用的总结合强度，其中所述对之间可能存在多个相互作用点。例如，这可以分别是蛋白质与表面结合搭配物之间的2:1或2:2相互作用。其它相互作用比率也是可能的，并且包括在这一定义中。当相互作用的比率是1:1时，亲和力和亲合力的值被认为是相等的。当相互作用的比率超过1:1时，这被认为是一种强烈的相互作用，并且相互作用的强度可能大于1:1相互作用的亲和力。
如本文所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”是在抗体情形中的类似术语。这些术语表明，抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域与表位之间存在某种互补性。因此，“特异性结合”至TAA(例如人PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体也可以结合至无关蛋白，但经例如放射免疫测定(RIA)测量，它与无关蛋白的结合程度小于抗体与TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3结合的约10％。
结合结构域可分为“高亲和力”结合结构域和“低亲和力”结合结构域。“高亲和力”结合结构域是指KD值小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M的结合结构域。“低亲和力”结合结构域是指KD值大于10-7M、大于10-6M或大于10-5M的那些结合结构域。“高亲和力”和“低亲和力”结合结构域结合它们的靶标，而不会显著结合测试样品中存在的其它成分。
如本文所用，如果抗体在紧邻靶标且处于本领域的技术人员认为结合所必需的条件时特异性结合其靶标(例如TAA(例如人PSMA)和/或人CD3)，则该抗体“能够结合”。“TAA结合结构域”应理解为指特异性结合至TAA的结合结构域。“PSMA结合结构域”应理解为指特异性结合至PSMA的结合结构域。“CD3抗原结合结构域”应理解为指特异性结合至CD3的结合结构域。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语并且是指抗体能够特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的邻接氨基酸(线性或邻接表位)，或者表位可以例如一起来自一种或多种多肽(构象表位、非线性表位、不连续表位或非邻接表位)。在某些方面，抗体结合的表位可以通过例如NMR光谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、氢/氘交换与质谱联用(例如液相色谱电喷雾质谱)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变定位(例如定点诱变定位)来确定。对于X射线晶体学，结晶可以使用本领域已知的任何方法实现(例如Gieg é R等人(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303)。抗体:抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术进行研究，并且可以使用计算机软件如X-PLOR(Yale University,1992,distributedbyMolecular Simulations,Inc.；参见例如Meth Enzymol(1985)第114&115卷,Wyckoff HW等人编辑；U.S.2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,编辑Carter CW；Roversi P等人,(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)精修。诱变定位研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法完成。有关包括丙氨酸扫描诱变技术在内的诱变技术的描述，参见例如Champe M等人,(1995)J Biol Chem270:1388-1394以及Cunningham BC和Wells JA(1989)Science 244:1081-1085。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性或有分支的，它可以包含经过修饰的氨基酸，并且它可以间杂有非氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分缀合。此定义中还包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其它修饰的多肽。多肽可以被工程改造成并入各种结合结构域，包括例如一个或多个来源于单链可变片段、细胞因子或细胞外结构域的结合结构域。
应当理解，因为本文提供的多肽与抗体相关，所以在某些方面，这些多肽可以作为单一链或缔合的链存在。两种多肽或蛋白质可以彼此键结形成“同二聚体”或“异二聚体”。当两个相同的多肽键结在一起时，可以形成同二聚体。当两个不相同的多肽键结在一起时，可以形成异二聚体。同二聚体多肽的实例是从N末端到C末端包含第一结合结构域、接头(例如免疫球蛋白铰链)、免疫球蛋白恒定区和第二结合结构域的多肽。在本文提供的一方面，同二聚体的结合结构域是单链可变片段。
例如，当从N末端到C末端包含第一结合结构域、接头(例如免疫球蛋白铰链)、免疫球蛋白恒定区和第二结合结构域的第一多肽与从N末端到C末端包含第一结合结构域、接头(例如免疫球蛋白铰链)和免疫球蛋白恒定区的第二多肽键结时，可以形成异二聚体。两条多肽可以通过在多肽链的Fc区中并入孔中结突变而键结形成异二聚体。在本文提供的一方面，异二聚体的结合结构域是单链可变片段。取决于结合结构域和靶标的数量，异二聚体构建体可以是单特异性、双特异性或多特异性构建体。双特异性异二聚体构建体可以设计为对于一个生物靶标是二价的(即，两个scFv结合靶标)或单价的(即，单个scFv结合靶标)。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，否则这些术语涵盖含有天然核苷酸类似物的核酸，所述天然核苷酸类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指示，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；Cassol等人(1992)；Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”意图包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物，以及其衍生物、片段和同源物。
如本文所用，术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元的线性或环状核酸分子。除了一个或多个表达单元之外，表达载体还可以包括额外的核酸区段，例如一个或多个复制起点或一个或多个选择性标记物。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或可含有两者的元件。
“同一性百分比”是指两个序列(例如氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性程度。同一性百分比可以通过比对两个序列，引入空位以使序列之间的同一性最大化来确定。比对可以使用本领域已知的程序产生。出于本文的目的，核苷酸序列的比对可以用设置为默认参数的blastn程序进行，而氨基酸序列的比对可以用设置为默认参数的blastp程序进行(参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)，万维网网址ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所用，“保守的氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在某些方面，抗体的一个或多个CDR内或一个或多个构架区内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似侧链的氨基酸残基置换。
如本文所用，“来源于”指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的起源。在某些方面，来源于特定序列(有时称为“起始”或“亲本(parent)”或“亲本的(parental)”序列)的多肽或氨基酸序列具有与所述起始序列或其部分基本上相同的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸，或至少50-150个氨基酸组成，或者它可被本领域普通技术人员以其它方式鉴别为在初始序列中具有其来源。例如，结合结构域可来源于抗体，例如Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、单域抗体(sdAb)等。
来源于另一多肽的多肽相对于起始多肽可具有一个或多个突变，例如一个或多个氨基酸残基被另外的氨基酸残基取代或者它具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。多肽可包含非天然存在的氨基酸序列。此类变体必然地与起始抗体具有少于100％的序列同一性或相似性。一方面，变体将具有与起始多肽的氨基酸序列具约60％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。在另一方面，变体将具有与起始多肽的氨基酸序列具约75％至少于100％、约80％至少于100％、约85％至少于100％、约90％至少于100％、约95％至少于100％的氨基酸序列同一性和相似性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如原代细胞、培养的细胞或来自细胞系的细胞。在具体方面，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞以及这种细胞的后代或潜在后代。这种细胞的后代例如由于可能发生在后续子代中的突变或环境影响或者核酸分子整合到宿主细胞基因组中可能与用核酸分子转染的亲本细胞不同。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已被纯化到不再呈它们在自然界中所呈现的形式的程度的那些多肽。在一些方面，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯的材料(即，不含污染物)。在一些方面，材料是至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的。
术语“药物配制物”或“药物组合物”是指这样一种制剂，该制剂呈允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含会对打算施用该配制物的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。所述配制物可以是无菌的。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当使用本领域众所周知的途径施用时一般不会产生过敏或其它严重不良反应的分子实体和组合物。经联邦或州政府监管机构批准或者列入美国药典或其它一般公认的药典中的用于动物，更特定地人类的分子实体和组合物被认为是“药学上可接受的”。
如本文所用，术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等是指可用于实现药物，例如TAA/CD3抗体(例如PSMA/CD3抗体)向所需生物作用部位的递送(例如静脉内施用)的方法。可与本文所述的试剂和方法一起使用的施用技术可见于例如Goodman和Gilman,The Pharmacological Basis of Therapeutics,现行版本,Pergamon；以及Remington's,Pharmaceutical Sciences,现行版本,MackPublishing Co.,Easton,Pa中。
如本文所用，术语“受试者”与“患者”可互换使用。受试者可以是动物。在一些方面，受试者是哺乳动物，例如非人动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠、猴子或其它灵长类动物等)。在一些方面，受试者是人。如本文所用，术语“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指有患疾病、病症或疾患的风险，或者患有疾病、病症或疾患的患者，该疾病、病症或疾患易于例如用本文提供的TAA/CD3抗体(例如PSMA/CD3抗体)治疗或改善。有需要的患者可以是例如被诊断患有癌症的患者。例如，患者可被诊断患有PSMA(+)肿瘤和/或前列腺癌，包括例如转移性去势抵抗性前列腺癌。
术语“治疗有效量”是指有效治疗受试者的疾病或病症的药物例如抗TAA/CD3抗体(例如抗PSMA/CD3抗体)的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小或负担；抑制(即，在一定程度上减慢且在某一方面停止)癌细胞向周围器官的浸润；抑制(即，在一定程度上减慢且在某一方面停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；在某种程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状；和/或引起有利的反应，例如增加的无进展生存期(PFS)、无病生存期(DFS)或总生存期(OS)、完全反应(CR)、部分反应(PR)，或在某些情况下稳定疾病(SD)、疾病进展(PD)减慢、进展时间(TTP)缩短或其任何组合。
术语如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“缓解(alleviating)”或“缓解(to alleviate)”是指治愈所诊断的病理疾患或病症、减慢其进展、减轻其症状和/或停止其进展的治疗措施。因此，需要治疗者包括那些已经被诊断患有或疑似患有所述病症者。在某些方面，如果患者显示出以下一项或多项，则根据本公开的方法成功地“治疗”了受试者：癌细胞数量减少或完全不存在；肿瘤大小减小；抑制或不存在癌细胞向周围器官的浸润(包括例如癌症向软组织和骨骼中的扩散)抑制或不存在；肿瘤转移抑制或不存在；肿瘤生长抑制或不存在；与特定癌症相关的一种或多种症状减轻；发病率和死亡率降低；生活质量改善；肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力降低；肿瘤中癌症干细胞的数量或频率降低；致瘤细胞分化为非致瘤状态；无进展生存期(PFS)、无病生存期(DFS)或总生存期(OS)增加、完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定疾病(SD)、进展性疾病(PD)减少、进展时间(TTP)缩短或其任何组合。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的细胞群体以细胞生长不受调控为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于前列腺癌、结直肠癌和胃癌。癌症可以是原发性肿瘤或者可以是晚期或转移性癌症。
癌症可以是实体瘤癌症。术语“实体瘤”是指通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤的实例是肉瘤、癌瘤和淋巴瘤。白血病(血癌)一般不会形成实体瘤。
应当理解，除非另外指示，否则本文所用的术语“一个(种)(a/an)”指的是所列举组分中的“一个(种)或多个(种)”。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包容性的。如本文在短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”意图包括：“A和B”二者；“A或B”；“A”，和“B”。同样地，在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意图涵盖以下方面种的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应当理解，每当本文用措辞“包含”来描述各方面时，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似方面。在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”和“具有”等可以表示“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由……组成(consisting essentiallyof)”或“基本上由……组成(consistsessentially)”是开放式的，允许存在比所述内容要多的内容，只要所述内容的基本或新颖特征不会因比所述内容要多的内容的存在而改变即可，但不包括现有技术方面。
如本文所用，术语“约”和“大约”在用于修饰数值或数值范围时，表示高于该值或范围至多5％或低于该值或范围5％的偏差仍在所述值或范围的预定含义内。应当理解，每当在本文中用措辞“约”或“大约”某一数值或范围来描述各方面时，也提供提到特定数值或范围(没有“约”)的其它类似方面。
本文提供的任何结构域、组分、组合物和/或方法可以与本文提供的任何其它结构域、组分、组合物和/或方法中的一者或多者组合。
II.TAA和CD3抗体
本文提供了CD3抗体、CD3 x TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)抗体和PSMA抗体。
CD3抗体和CD3 x TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)双特异性抗体可包含结合至人CD3的抗原结合结构域。与人CD3结合的抗原结合结构域可以与人CD3ε结合。与人CD3结合的抗原结合结构域可以是与CD3结合的人源化或人抗原结合结构域。
在本文提供的一方面，CD3抗体和CD3 x TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)对CD3展现出降低的或较低的结合亲和力。还提供了CD3 x TAA抗体，所述抗体对CD3展现出降低的或较低的结合亲和力，并且还促进CD8 T细胞活化和增殖。TAA(例如PSMA)结合结构域与PSMA的结合强度、结合效力和/或亲合力可高于CD3结合结构域对CD3所具有的结合强度、结合效力和/或亲合力。
与亲本抗体相比(例如与CRIS 7鼠单克隆抗体(VH SEQ ID NO:122；VL SEQ IDNO:124)或SP34鼠单克隆抗体相比)，与人CD3结合的抗原结合结构域(例如与CD3结合的人源化抗原结合结构域)对CD3可具有降低的亲和力。在本文提供的一方面，与CD3结合结构域DRA222(VH SEQ ID NO:126；VL SEQ ID NO:128)和/或CD3结合结构域TSC456(VH SEQ IDNO:130；VL SEQ ID NO:132相比，人源化或人抗原结合结构域对人CD3具有降低的结合亲和力。在本文提供的一方面，与比较物CD3抗体和CD3 x TAA抗体相比，CD3抗体和CD3 x TAA抗体对Jurkat细胞展现出降低的结合亲和力。
在本文提供的一方面，抗体是TAA(例如PSMA)x CD3靶向抗体，其中与TAA结合结构域对TAA的结合亲和力相比，CD3结合结构域以降低的亲和力结合至人CD3。在本文提供的一方面，CD3结合结构域对CD3的结合亲和力比TAA结合结构域对TAA的结合亲和力低1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或更高倍数。结合亲和力的差异(即，与CD3结合结构域对CD3的结合亲和力相比，TAA结合结构域对TAA的结合亲和力更大)改善了TAA x CD3抗体与表达TAA的肿瘤细胞的结合和/或降低了TAA x CD3抗体与循环T细胞的结合。
与人CD3结合的抗原结合结构域(例如与CD3结合的人源化或人抗原结合结构域)可以在构建体的C末端。在本文提供的一方面，与人CD3结合的抗原结合结构域在多肽链的C末端并且结合结构域靠近Fc结构域。在本文提供的一个方面，CD3结合结构域位于包含两个相同多肽的同二聚体的C末端，每个多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含能够结合TAA的第一scFv抗原结合结构域、接头(任选地，其中接头是免疫球蛋白铰链)、免疫球蛋白恒定区和能够结合CD3的第二scFv抗原结合结构域。与CD3结合结构域位于N末端的类似TAAxCD3 scFc-Fc-scFv同二聚体相比，CD3结合结构域位于TAA x CD3scFv-Fc-scFv同二聚体的C末端对CD3展现出降低的结合亲和力。不希望受理论束缚，假设免疫球蛋白恒定区邻近CD3结合结构域会干扰CD3结合结构域与CD3紧密结合的能力。本文所述的同二聚体抗体结构可与具有经过修饰的序列的CD3结合结构域一起使用以进一步降低CD3结合亲和力。
在本文提供的一个方面，CD3结合结构域位于包含两个不同多肽的异二聚体的C末端，第一多肽从N末端到C末端包含结合TAA的第一单链可变片段(scFv)、接头(例如免疫球蛋白铰链)、免疫球蛋白恒定区和结合CD3的第二单链可变片段(scFv)，而第二多肽从N末端到C末端包含结合TAA的第一单链可变片段(scFv)、接头(例如免疫球蛋白铰链)和免疫球蛋白恒定区。这种形式以ADAPTIR-FLEXTM技术为例。就这一点而言，结合TAA的结合结构域是二价的，而结合CD3的结合结构域是单价的。与BiTE或D.A.R.T相比，本文所述的包含单价CD3结合结构域的异二聚体抗体结构可以设计为并入任何CD3结合结构域以降低CD3结合亲和力。包含相同结合结构域的TAA x CD3。本文所述的异二聚体抗体结构可以并入具有经修饰序列的CD3结合结构域(例如具有包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VL的CD3结合结构域，或具有包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VL的CD3结合结构域，或具有包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VL的CD3结合结构域)，该经修饰的序列被设计用于进一步降低CD3结合亲和力。
在本文提供的一方面，C末端上的CD3结合结构域是来源于鼠单克隆抗体CRIS-7的人源化抗体结合结构域。在本文提供的一方面，C末端上的CD3结合结构域是来源于鼠单克隆抗体SP34(例如I2C)的人源化抗体结合结构域。
PSMA抗体和CD3x PSMA双特异性抗体可包含结合至人PSMA的抗原结合结构域。与人PSMA结合的抗原结合结构域可以是与PSMA结合的人源化或人抗原结合结构域。
CD3 x TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)双特异性抗体可包含人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和/或人源化CD3结合结构域。CD3 x TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)双特异性抗体可包含人TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和/或人CD3结合结构域。CD3 x TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)双特异性抗体可以对一个靶标(例如CD3)是单价的，而对另一个靶标(例如TAA，如PSMA、HER2或BCMA)是二价的。TAA x CD3双特异性抗体的一个实例是包含以下各物的抗体：第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至TAA的第一单链可变片段(scFv)、(ii)免疫球蛋白恒定区和(iii)结合至CD3的scFv；以及第二多肽，该第二多肽包含(i)结合至TAA的第二scFv和(ii)免疫球蛋白恒定区，其中所述双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。CD3 x TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)双特异性抗体可以对一个靶标(例如CD3)是单价的，而对另一个靶标(例如TAA，例如PSMA、HER2或BCMA)是二价的。TAAx CD3双特异性抗体的一个实例是包含以下的抗体：第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至TAA的第一单链可变片段(scFv)、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白恒定区和(iv)结合至CD3的scFv；以及第二多肽，该第二多肽包含(i)结合至TAA的第二scFv、(ii)铰链区和(iii)免疫球蛋白恒定区，其中所述双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。在本文提供的一方面，CD3 x TAA双特异性抗体包含“无效”Fc，即，不具有或具有显著降低的CDC和ADCC活性。在本文提供的一方面，与具有相同CD3和TAA抗体但呈D.A.R.T或B.i.T.E形式的CD3xTAA抗体相比，CD3xTAA抗体以降低的结合亲和力结合至Jurkat细胞。
CD3 x TAA双特异性抗体可包含人源化TAA结合结构域和/或人源化CD3结合结构域。CD3 x TAA双特异性抗体可以对一个靶标(例如CD3)是单价的，而对另一个靶标(例如PSMA)是二价的。几种示例性(非限制性)PSMA x CD3双特异性抗体形式如图1A至图1F所示。除了结合结构域是scFv之外，结合结构域还可以是细胞外结构域或细胞因子。
A.PSMA结合结构域
本文提供与人PSMA结合的抗原结合结构域(即，PSMA结合结构域)，这些结构域可用于组装PSMA x CD3双特异性抗体。除了结合至人PSMA之外，PSMA结合结构域还可以结合至来自其它物种的PSMA，例如食蟹猴和/或小鼠PSMA。在某些方面，PSMA结合结构域结合至人PSMA和食蟹猴PSMA。在某些方面，结合至PSMA的第一scFv和/或结合至食蟹猴PSMA的第二scFv具有比结合至人PSMA的EC50高不超过5倍的EC50。
PSMA结合结构域可包含六个互补决定区(CDR)，即，可变重链(VH)CDR1、VH CDR2、VH CDR3、可变轻链(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3。PSMA结合结构域可包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。VH和VL可以是分开的多肽或可以是同一多肽的部分(例如在scFv中)。
在某些方面，本文所述的PSMA结合结构域包含表A和表B中列出的六个CDR的组合(例如SEQ ID NO:70、72、74、76、78和80)。
表A.PSMA VH CDR氨基酸序列1
1CDR是根据IMGT确定。
表B.PSMA VL CDR氨基酸序列2
2CDR是根据IMGT确定。
对于PSMA是单价的PSMA x CD3双特异性抗体可以包含具有上表A和B中列出的六个CDR的组合(例如SEQ ID NO:70、72、74、76、78和80)的PSMA结合结构域。对于PSMA是二价的PSMA x CD3双特异性抗体可以包含两个PSMA结合结构域，各自包含上表A和B中列出的六个CDR的组合(例如SEQ ID NO:70、72、74、76、78和80)。
如本文所述，PSMA结合可包含表C中所列抗体的VH。
表C：PSMA可变重链(VH)氨基酸序列
如本文所述，PSMA结合结构域可包含与表C中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的VH，任选地其中VH包含分别为SEQ ID NO:70、72和74的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列。
如本文所述，PSMA结合结构域可包含VH，该VH包含表C中VH序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
如本文所述，PSMA结合可包含表D中所列抗体的VL。
表D：PSMA可变轻链(VL)氨基酸序列
如本文所述，PSMA结合结构域可包含与表D中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的VL，任选地其中VL包含SEQ ID NO:76、78和80的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
如本文所述，PSMA结合结构域可包含VL，该VL包含表D中VL序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
如本文所述，PSMA结合结构域可包含表C中所列的VH和表D中所列的VL。对于PSMA为单价的PSMA x CD3双特异性抗体可包含单个PSMA结合结构域，该PSMA结合结构域包含表C中所列的VH和表D中所列的VL。对PSMA为二价的PSMA x CD3双特异性抗体可包含两个PSMA结合结构域，各自包含表C中所列的VH和表D中所列的VL。表C中所列的VH和表D所列的VL可以是不同的多肽，或者可以在同一多肽上。当VH和VL在同一多肽上时，它们可以呈任一取向(即，VH-VL或VL-VH)，并且它们可以通过接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)连接。在某些方面，VH和VL通过长度为至少15个氨基酸(例如15-50个氨基酸、15-40个氨基酸、15-30个氨基酸、15-25个氨基酸或15-20个氨基酸)的甘氨酸-丝氨酸接头连接。在某些方面，VH和VL通过长度为至少20个氨基酸(例如20-50个氨基酸、20-40个氨基酸、20-30个氨基酸或20-25个氨基酸)的接头连接。
如本文所述，PSMA结合结构域可包含：VH，该VH包含表C中VH序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR；以及VL，该VL包含表D中VL序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
在某些方面，PSMA结合结构域包含：(i)VH，该VH包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列(或含与SEQ ID NO:82具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的序列，任选地其中VH分别包含SEQ ID NO:70、72和74的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列)；以及(ii)VL，该VL包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:84具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的序列，任选地其中VL分别包含SEQ ID NO:76、78和80的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列)。
在某些方面，本文所述的PSMA结合结构域(例如scFv)结合至人PSMA并包含表E中所列的氨基酸序列之一。
表E：PSMA结合序列
如本文所述，对PSMA为单价的PSMA x CD3双特异性抗体可包含单个PSMA结合结构域，该PSMA结合结构域包含表E中所列的序列。对PSMA为二价的PSMA x CD3双特异性抗体可包含两个PSMA结合结构域，各自包含表E中所列的序列。
如本文所述，PSMA结合结构域可包含与表E中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的氨基酸序列，任选地其中该序列包含分别为SEQ ID NO:70、72和74的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:76、78和80的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列。
在某些方面，本文提供的PSMA结合结构域竞争性抑制包含表C中的VH序列(例如包含SEQ ID NO:82的VH)和表D中的VL序列(例如包含SEQ ID NO:84的VL)的抗体与人PSMA的结合。
在某些方面，本文提供的PSMA结合结构域特异性结合至人PSMA上与针对人PSMA的包含表C中的VH序列(例如包含SEQ ID NO:82的VH)和表D中的VL序列(例如包含SEQ ID NO:84的VL)的抗体所结合相同的表位。
B.CD3结合结构域
本文提供与人CD3结合的抗原结合结构域(即，CD3结合结构域)，这些结构域可用于组装TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体。除了结合至人CD3之外，CD3结合结构域还可以结合至来自其它物种的CD3，例如食蟹猴和/或小鼠CD3。在某些方面，CD3结合结构域结合至人CD3和食蟹猴CD3。在某些方面，CD3结合结构域结合至人、食蟹猴和/或小鼠CD3ε。在Jurkat细胞测定中，与TSC266和/或PSMA01110相比，CD3结合结构域对CD3可具有降低的结合强度、结合效力和/或亲合力。
CD3结合结构域可包含六个互补决定区(CDR)，即，可变重链(VH)CDR1、VH CDR2、VHCDR3、可变轻链(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3。CD3结合结构域可包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。VH和VL可以是分开的多肽或可以是同一多肽的部分(例如在scFv中)。
在某些方面，本文所述的CD3结合结构域包含表F和表G中所列的六个CDR。
表F.CD3 VH CDR氨基酸序列3
3CDR是根据IMGT确定。
表G.CD3 VL CDR氨基酸序列4
4CDR是根据IMGT确定。
对CD3为单价的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可包含单个CD3结合结构域，该结合结构域具有上表F和表G中所列的六个CDR。对CD3为二价的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可包含两个CD3结合结构域，各自具有上表F和表G中所列的六个CDR。
如本文所述，CD3结合可包含表H中所列抗体的VH。
表H：CD3可变重链(VH)氨基酸序列
如本文所述，CD3结合结构域可包含与表H中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的VH，任选地其中VH包含分别为SEQ ID NO:88、90和92的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3序列。
如本文所述，CD3结合结构域可包含VH，该VH包含表H中VH序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
如本文所述，CD3结合结构域可包含表I中所列抗体的VL。
表I：可变轻链(VL)氨基酸序列
如本文所述，CD3结合结构域可包含与表I中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的VL，任选地其中VL包含分别为SEQ ID NO:94、96和98的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
如本文所述，CD3结合结构域可包含VL，该VL包含表I中VL序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
如本文所述，CD3结合结构域可包含表H中所列的VH和表I中所列的VL。对于CD3为单价的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可包含单个CD3结合结构域，该结合结构域包含表H中所列的VH和表I中所列的VL。对CD3为二价的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)xCD3双特异性抗体可包含两个CD3结合结构域，各自包含表H中所列的VH和表I中所列的VL。表H中所列的VH和表I所列的VL可以是不同的多肽，或者可以在同一多肽上。当VH和VL在同一多肽上时，它们可以呈任一取向(即，VH-VL或VL-VH)，并且它们可以通过接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)连接。在某些方面，VH和VL通过长度为至少15个氨基酸(例如15-50个氨基酸、15-40个氨基酸、15-30个氨基酸、15-25个氨基酸或15-20个氨基酸)的甘氨酸-丝氨酸接头连接。在某些方面，VH和VL通过长度为至少20个氨基酸(例如20-50个氨基酸、20-40个氨基酸、20-30个氨基酸或20-25个氨基酸)的接头连接。
如本文所述，CD3结合结构域可包含：VH，该VH包含表H中VH序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR；以及VL，该VL包含表I中VL序列的CDR，例如IMGT定义的CDR、Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
在某些方面，CD3结合结构域包含：(i)VH，该VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列(或含与SEQ ID NO:100具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的序列，任选地其中VH包含分别为SEQ ID NO:88、90和92的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列)；以及(ii)VL，该VL包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:102具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的序列，任选地其中VL包含分别为SEQ ID NO:94、96和98的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列)。
在某些方面，本文所述的CD3结合结构域(例如scFv)结合至人CD3并包含表J中所示氨基酸序列之一。
表J：CD3结合序列
如本文所述，对CD3为单价的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)xCD3双特异性抗体可包含单个CD3结合结构域，该结构域包含表J中所列的序列。对CD3为二价的TAA(例如PSMA，HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可包含两个CD3结合结构域，各自包含表J中所列的序列。
如本文所述，CD3结合结构域可包含与表J中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的氨基酸序列，任选地其中该序列包含分别为SEQ ID NO:88、90和92的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别为SEQ ID NO:94、96和98的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列。
在某些方面，本文提供的CD3结合结构域竞争性抑制包含表H中的VH序列(例如包含SEQ ID NO:100的VH)和表I中的VL序列(例如包含SEQ ID NO:102的VL)的抗体与人CD3的结合。
在某些方面，本文提供的CD3结合结构域特异性结合至人CD3上与针对人CD3的包含表I中的VH序列(例如包含SEQ ID NO:100的VH)和表I中的VL序列(例如包含SEQ ID NO:102的VL)的抗体所结合相同的表位。
C.TAA和/或CD3结合结构域
在TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)或CD3结合结构域中，VH CDR或VH和VL CDR或VL可以是分开的多肽或可以在同一多肽上。当VH CDR或VH与VL CDR或VL在同一多肽上时，它们可以呈任一取向(即，VH-VL或VL-VH)。
当VH CDR或VH与VL CDR或VL在同一多肽上时，它们可以通过接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)连接。VH可位于接头序列的N末端，而VL可位于接头序列的C末端。或者，VL可位于接头序列的N末端，而VH可位于接头序列的C末端。
使用肽接头接合VH和VL区是本领域众所周知的，并且在这一特定领域内存在大量出版物。在一些方面，肽接头是由三个重复的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser氨基酸序列((Gly4Ser)3)(SEQ ID NO:169)组成的15聚体。其它接头也已被使用，并且噬菌体展示技术以及选择性感染噬菌体技术已被用于对适合接头序列进行多样化和选择(Tang等人,J.Biol.Chem.271,15682-15686,1996；Hennecke等人,Protein Eng.11,405-410,1998)。在某些方面，VH区与VL区通过具有包含式(Gly4Ser)n的氨基酸序列的肽接头接合，其中n＝1-5。在某些方面，n＝3-10。在某些方面，n＝3-5。在某些方面，n＝4-10。在某些方面，n＝4-5。在某些方面，n＝4。其它适合的接头可经由随机诱变，通过优化简单的接头(例如(Gly4Ser)n)获得，其中n＝1-5。
TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3结合结构域可以是人源化结合结构域。TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3结合结构域可以是大鼠结合结构域。TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3结合结构域可以是鼠结合结构域。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和大鼠CD3结合结构域。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和鼠CD3结合结构域。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含大鼠TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和人源化CD3结合结构域。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含鼠TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和人源化CD3结合结构域。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和人源化CD3结合结构域。
TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3结合结构域可以是scFv。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体中的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3结合结构域都是scFv。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体中的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和CD3结合结构域都是scFv。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体中的至少一个TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)或CD3结合结构域是scFv。在某些方面，多肽包含TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域(例如scFv)和CD3结合结构域(例如scFv)。这样的多肽还可以含有Fc结构域。在某些方面，多肽包含TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域(例如scFv)，而不包含CD3结合结构域(例如scFv)。这样的多肽还可以含有Fc结构域。TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3结合结构域可以包含在分开的多肽链上的VH和VL。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体中的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3结合结构域都包含在分开的多肽链上的VH和VL。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)xCD3双特异性抗体中的至少一个TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)或CD3结合结构域包含在分开的多肽链上的VH和VL。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体中的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3结合结构域包含在同一多肽链上的VH和VL。
TAA(例如PSMA)结合结构域与PSMA的结合强度、结合效力和/或亲合力可高于CD3结合结构域对CD3所具有的结合强度、结合效力和/或亲合力。在Jurkat细胞测定中，与TSC266相比，CD3结合结构域对CD3可具有降低的结合强度、结合效力和/或亲合力。在Jurkat细胞测定中，与PSMA01110相比，CD3结合结构域对CD3可具有降低的结合强度、结合效力和/或亲合力。
D.TAA x CD3双特异性抗体
本文提供结合至实体瘤上表达的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3的双特异性抗体，其中CD3结合结构域对CD3具有低亲和力。这种双特异性抗体可以具有增加的肿瘤定位(并具有减少的与血液中循环T细胞上的CD3的结合)。
本文提供结合至实体瘤上表达的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3的双特异性抗体，其中双特异性对于CD3是单价的。这种双特异性抗体可以具有增加的肿瘤定位(并具有减少的与血液中循环T细胞上的CD3的结合)。
本文提供结合至实体瘤上表达的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3的双特异性抗体，其中双特异性对于CD3为单价的，并且其中CD3结合结构域对CD3具有低亲和力。在一些方面，本文提供的双特异性抗体可对于CD3可以是单价的并且对于TAA是二价的。这种双特异性抗体可以具有增加的肿瘤定位(并具有减少的与血液中循环T细胞上的CD3的结合)。
本文提供结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和人CD3的双特异性抗体(PSMA xCD3双特异性抗体)。此类双特异性抗体包含至少一个人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和至少一个人源化CD3结合结构域(例如来源于CRIS-7或SP34的人源化抗体)。双特异性抗体中的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域可以是任何人源化或人TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域，包括例如上文论述的任何TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域。双特异性抗体中的CD3结合结构域可以是任何人源化或人CD3结合结构域，包括例如上文论述的任何CD3结合结构域。
在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以同时结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3。
在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以增加T细胞增殖。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以增加CD8 T细胞增殖。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以增加CD4 T细胞增殖。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)xCD3双特异性抗体可以增加CD8 T细胞增殖和CD4 T细胞增殖。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以增加T细胞增殖。
在某些方面，与具有高CD3亲和力的TAA x CD3构建体相比，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体在施用给患者时引起减少的或不引起细胞因子产生。在某些方面，与具有相同结合结构域但呈BiTE形式的TAA x CD3构建体相比，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体在施用给患者时引起细胞因子产生减少或不会增加细胞因子产生。
在一些方面，与接受呈BiTE形式的TAA x CD3的哺乳动物相比，本文公开的呈异二聚体形式(例如ADAPTIR-FLEXTM形式)的TAA(例如(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体不引起至引起较低水平的以下一者或多者的产生：IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6。在一些方面，本文公开的呈异二聚体形式(例如ADAPTIR-FLEXTM形式)的TAA(例如(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体不引起至引起较低水平的以下一者或多者的产生：颗粒酶B、IL-10和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体(例如呈ADAPTIR-FLEXTM形式的那些)引起不显著的至不引起IFN-γ产生。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体(例如呈ADAPTIR-FLEXTM形式的那些)引起不显著的至不引起IL-2产生。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体(例如呈ADAPTIR-FLEXTM形式的那些)引起不显著的至不引起TNF-α产生。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)xCD3双特异性抗体(例如呈ADAPTIR-FLEXTM形式的那些)可引起不显著的至不引起IL-6产生。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体(例如呈ADAPTIR-FLEXTM形式的那些)可引起不显著的至不引起颗粒酶B产生。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体(例如呈ADAPTIR-FLEXTM形式的那些)可引起不显著的至不引起IL-10产生。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体(例如呈ADAPTIR-FLEXTM形式的那些)可引起不显著的至不引起GM-CSF产生。
在本文提供的一个方面，与接受呈BiTE形式的TAA x CD3的哺乳动物中相比，包含SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:108的氨基酸序列或与SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:108具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列的PSMA x CD3双特异性抗体不引起至引起降低的水平的以下一者或多者的产生：IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6。在本文提供的一个方面，与接受呈BiTE形式的TAA x CD3的哺乳动物中相比，包含SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:108的氨基酸序列或与SEQ ID NO:112和SEQID NO:108具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列的PSMA x CD3双特异性抗体不引起至引起降低的水平的以下一者或多者的产生：IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6。
在本文提供的一个方面，与接受呈BiTE形式的TAA x CD3的哺乳动物中相比，包含SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:108的氨基酸序列或与SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:108具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列的PSMA x CD3双特异性抗体不引起至引起降低的水平的以下一者或多者的产生：颗粒酶B、IL-10和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在本文提供的一个方面，与接受呈BiTE形式的TAA x CD3的哺乳动物中相比，包含SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:108的氨基酸序列或与SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:108具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列的PSMA x CD3双特异性抗体不引起至引起降低的水平的以下一者或多者的产生：颗粒酶B、IL-10和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以增加表达TAA的细胞的细胞毒性。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以增加重定向T细胞的细胞毒性ADCC。
在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以增加表达TAA的细胞的肿瘤细胞死亡。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)xCD3双特异性抗体可以在体外增加表达TAA的细胞的肿瘤细胞死亡。在某些方面，本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以在体内增加表达TAA的细胞的肿瘤细胞死亡。
在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含两个TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和一个CD3结合结构域。在某些方面，所述两个TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域包含相同的氨基酸序列。在某些方面，所述两个TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域包含不同的氨基酸序列。例如，在本文提供的一个方面，双特异性抗体包含两个PSMA结合结构域和一个CD3结合结构域，其中该两个PSMA结合结构域是相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。
本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可通过以化学方式连接两种不同的单克隆抗体或通过融合两种杂交瘤细胞系以产生杂交-杂交瘤来制备。其它可以使用的多价形式包括例如四源杂交瘤、Kλ抗体、dAb、双功能抗体、TandAb、纳米抗体、小模块化免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceutials，SMIPsTM)、CrossMab Fab、CrossMab VH-VL、链交换工程改造的结构域抗体(SEEDbodies)、Affibodies、Fynomers、Kunitz结构域、Albu-dabs、具有交换的VH的两个工程改造的Fv片段(例如双亲和重靶向分子(D.A.R.T.))、scFv x scFv(例如BiTE)、DVD-IG、Covx抗体、肽体、scFv-Ig、SVD-Ig、dAb-Ig、孔中节、在CH3结构域中包含匹配突变的IgG1抗体(例如DuoBody抗体)和tr iomAb。示例性双特异性形式在Garber等人,Nature ReviewsDrug Discovery13:799-801(2014)中进行了讨论，该文献以引用的方式整体并入本文中。另外的示例性双特异性形式论述于Liu等人Front.Immunol.8:38doi:10.2289/fimmu.2017.00038，以及Br inkmann和Kontermann,MABS 9:2,182–212(2017)，各文献以引用的方式整体并入本文中。在某些方面，双特异性抗体可以是F(ab')2片段。F(ab')2片段含有在铰链区中通过二硫键连接的四聚体抗体分子的两个抗原结合臂。
本文公开的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以并入多特异性结合蛋白支架。使用支架的多特异性结合蛋白公开于例如PCT申请公开号WO 2007/146968、美国专利申请公开号2006/0051844、PCT申请公开号WO 2010/040105、PCT申请公开号WO2010/003108、美国专利号7,166,707和美国专利号8,409,577，各案以引用的方式整体并入本文中。TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)xCD3双特异性抗体可以包含两个结合结构域(这些结构域可以设计成特异性结合相同或不同的靶标)、铰链区、接头(例如羧基末端或氨基末端接头)和免疫球蛋白恒定区。TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以是包含两个相同的、二硫键结的多肽的同二聚体蛋白质。TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以是包含两个二硫键结的多肽的异二聚体蛋白质。
一方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含两个多肽，每个多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含第一抗原结合结构域，接头(例如其中接头是铰链区)、免疫球蛋白恒定区和第二抗体原结合结构域。
一方面，双特异性抗体可包含：(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至肿瘤相关抗原(TAA)的第一单链可变片段(scFv)、(ii)免疫球蛋白恒定区和(iii)结合至CD3的scFv；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含(i)结合至TAA的第二scFv和(ii)免疫球蛋白恒定区，其中所述双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。TAA可以是例如PSMA。此类抗体例如通过图1B、图1C、图1F(异二聚体)和图1G中提供的示意图来举例说明。
一方面，双特异性抗体可包含：(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至PSMA的第一scFv、(ii)免疫球蛋白恒定区和(iii)结合至CD3的scFv；以及(b)第二多肽，该第二多肽包含(i)结合至PSMA的第二scFv、(ii)免疫球蛋白恒定区和(iii)结合至CD3的第二scFv。此类抗体例如通过图1D、图1E和图1F(同源二聚体)中提供的示意图来举例说明。
一方面，双特异性抗体可包含：(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至PSMA的scFv和(ii)免疫球蛋白恒定区；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含(i)结合至CD3的scFv和(ii)免疫球蛋白恒定区。此类抗体例如通过图1A、图1F(最左边的两个异二聚体)和图1G(A-B构建体)中提供的示意图来举例说明。
在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域(例如scFv)、接头(例如其中接头是铰链区)、免疫球蛋白恒定区、接头和CD3结合结构域(例如scFv)。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域(例如scFv)按从氨基末端到羧基末端的顺序包含VH、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)和VL。在某些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域与免疫球蛋白恒定区之间的接头是铰链，并且该铰链是IgG1铰链。在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含CH2结构域和CH3结构域。在某些方面，CD3结合结构域(例如scFv)按从氨基末端到羧基末端的顺序包含VL、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)和VH。
因此，在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域的VH、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)、TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域的VL、IgG1铰链、包含CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白恒定区、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)、CD3结合结构域的VL、接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)和CD3结合结构域的VH。在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含此类多肽的同二聚体或异二聚体。
在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含大体上如例如美国专利申请公开号2003/0133939、2003/0118592和2005/0136049中所公开的蛋白质支架。TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以包含两个肽的二聚体(例如同二聚体)，每个肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含：第一抗原结合结构域、接头(例如其中接头是铰链区)和免疫球蛋白恒定区。TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体可以包含两个肽的二聚体(例如同二聚体)，每个肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含：免疫球蛋白恒定区、接头(例如其中接头是铰链区)和第一抗原结合结构域。
在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含两个抗原结合结构域scFv，以及包含在分开的多肽上的VH和VL的两个抗原结合结构域。在这些方面，scFv可以与包含VH的多肽的N末端或C末端融合。scFv也可以与包含VL的多肽的N末端或C末端融合。
本文提供的另外的示例性双特异性抗体分子包含：(i)具有两个臂的抗体，每个臂包含两个不同的抗原结合区，一个对TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)具有特异性，而一个对CD3具有特异性；(ii)含一个对TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)具有特异性的抗原结合区或臂和另一个对CD3具有特异性的抗原结合区或臂的抗体；(iii)对TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)具有第一特异性和对CD3具有第二特异性的单链抗体，例如经由用额外肽接头串联连接的两个scFv；(iv)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每条轻链和重链含有经由短肽键联串联的两个可变结构域(Wu等人,Generation and Characterization of a Dual Variable DomainImmunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,In:AntibodyEngineering,Springer BerlinHeidelberg(2010))；(v)以化学方式连接的双特异性(Fab')2片段；(vi)Tandab，它是两个单链双功能抗体的融合物，产生四价双特异性抗体，该抗体对每个靶标抗原具有两个结合位点；(vii)flexibody，它是多个scFv与双功能抗体的组合，产生多价分子；(viii)基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”的所谓“对接和锁定”分子，该分子当应用于Fab时，可以产生由两个相同的Fab片段连接至不同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(ix)所谓的Scorpion分子，该分子包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；以及(x)双功能抗体。
不同类别双特异性抗体的实例包括但不限于具有互补CH3结构域以促使异二聚化的IgG样分子；重组IgG样双重靶向分子，其中该分子的两侧各含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双功能抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和基于双功能抗体和重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双功能抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)相互融合或与另一种蛋白质或载体分子融合。
Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AM GEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、BivalentBispecific(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。基于ScFv、基于双功能抗体和结构域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞接合物(BiTE)(Micromet)、串联双功能抗体(Tandab)(Affimed)、双重亲和力重靶向技术(D.A.R.T.)(Mac roGenics)、单链双功能抗体(Academic)、TCR样抗体(AIT,Recepto rLogics)、人血清白蛋白ScFv融合物(Merrimack)和COMBODY(Epige n Biotech)、双重靶向纳米抗体(Ablynx)和双重靶向仅重链结构域抗体。
一方面，双特异性抗体可包含：(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)的第一单链可变片段(scFv)、(ii)免疫球蛋白恒定区和(iii)结合至CD3的scFv；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含(i)结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)的第二scFv和(ii)免疫球蛋白恒定区，其中所述双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。此类抗体可以在第一多肽和/或第二多肽中，例如在一个或多个scFv与免疫球蛋白恒定区之间包含接头。因此，一方面，双特异性抗体包含：(a)第一多肽，该第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)的第一单链可变片段(scFv)、(ii)可选的接头、(iii)免疫球蛋白恒定区、(iv)可选的接头和(iv)结合至CD3的scFv；以及(b)第二多肽，该第二多肽从N末端到C末端包含(i)结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)的第二scFv、(ii)可选的接头和(iii)免疫球蛋白恒定区，其中所述双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。
如本文所提供，PSMA x CD3双特异性抗体可包含分别为SEQ ID NO:70、72和74的PSMA VH CDR1、CDR2和CDR3序列；分别为SEQ ID NO:76、78和80的PSMA VL CDR1、CDR2和CDR3序列；分别为SEQ ID NO:88、90和92的CD3 VH CDR1、CDR2和CDR3序列；以及分别为SEQID NO:94、96和98的CD3 VL CDR1、CDR2和CDR3序列。
如本文所提供，PSMA x CD3双特异性抗体可包含本文所提供的PSMA VH和VL序列与CD3 VH和VL序列的任何组合。
例如，PSMA x CD3双特异性抗体可包含PSMA结合结构域和CD3结合结构域，其中该PSMA结合结构域包括含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH和含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL，并且其中该CD3结合结构域包括含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH和含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VL。在一些方面，两个VH序列和两个VL序列都在单个多肽链上(例如含有一个PSMA scFv和一个CD3 scFv的单个多肽)。在一些方面，一种多肽包含两个VH序列并且另一种多肽包含两个VL序列。
PSMA x CD3双特异性抗体可包含PSMA结合结构域和CD3结合结构域，其中PSMA结合结构域包含：VH，该VH包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:82具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的序列，任选地其中该VH包含分别为SEQ ID NO:70、72和74的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列)；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:84具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的序列，任选地其中该VL包含分别为SEQ ID NO:76、78和80的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列)，并且其中CD3结合结构域包含：VH，该VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列或与SEQ ID NO:100具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的序列，任选地其中该VH包含分别为SEQ ID NO:88、90和92的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列)；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:102具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的序列，任选地其中该VL包含分别为SEQ ID NO:94、96和98的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列)。在一些方面，两个VH序列和两个VL序列都在单个多肽链上(例如含有一个PSMA scFv和一个CD3scFv的单个多肽)。在一些方面，一种多肽包含两个VH序列并且另一种多肽包含两个VL序列。
如本文所提供，PSMA x CD3双特异性抗体可包含本文所提供的PSMA scFv序列与CD3 scFv序列的任何组合。例如，PSMA x CD3双特异性抗体可包含SEQ ID NO:86和104的scFv。例如，PSMA x CD3双特异性抗体可包含SEQ ID NO:86和110的scFv。此类scFv对可以在同一多肽上或在分开的多肽上。当scFv对位于同一多肽上时，PSMA scFv可以位于CD3scFv的N末端，或者PSMA scFv可以位于CD3 scFv的C末端。
如本文所提供，包含本文所提供的CDR、VH、VL和/或scFv序列中的任一者的抗体或多肽还可包含铰链。铰链可位于例如TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域(例如scFv)与免疫球蛋白恒定区之间。在一些方面，多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含抗原结合结构域(例如scFv)、铰链区和免疫球蛋白恒定区。在一些方面，多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含TAA结合结构域(例如scFv)、铰链区、免疫球蛋白恒定区和CD3结合结构域(例如scFv)。在一些方面，异二聚体包含两个多肽，其中第一个多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含TAA结合结构域(例如结合PSMA的scFv)、铰链区、免疫球蛋白恒定区和CD3结合结构域(例如scFv)，并且第二多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含TAA结合结构域(例如结合PSMA的scFv)、铰链区和免疫球蛋白恒定区。
铰链可以是免疫球蛋白铰链，例如人IgG铰链。在一些方面，铰链是人IgG1铰链。在一些方面，铰链包含人IgG1的氨基酸216-230(根据EU编号)或与其具有至少90％同一性的序列。例如，铰链根据人IgG1的EU编号在氨基酸C220处可包含取代。如果来源于非人类来源，铰链可以被人源化。在一些方面，铰链包含SEQ ID NO:156的氨基酸。铰链的非限制性实例提供于下表K和表L中。
在某些方面，铰链包含或是与野生型免疫球蛋白铰链区，例如与野生型人IgG1铰链、野生型人IgG2铰链或野生型人IgG4铰链具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
示例性改变的免疫球蛋白铰链包括免疫球蛋白人IgG1铰链区，该铰链区具有在野生型人IgG1铰链中发现的一个、两个或三个半胱氨酸残基被一个、两个或三个不同的氨基酸残基(例如丝氨酸或丙氨酸)取代。改变的免疫球蛋白铰链可以另外具有被另一个氨基酸(例如丝氨酸或丙氨酸)取代的脯氨酸。例如，上述改变的人IgG1铰链可另外具有位于野生型人IgG1铰链区的三个半胱氨酸的羧基末端的脯氨酸被另一个氨基酸残基(例如丝氨酸、丙氨酸)取代。一方面，核心铰链区的脯氨酸未被取代。
在某些方面，铰链包含约5至150个氨基酸、5至10个氨基酸、10至20个氨基酸、20至30个氨基酸、30至40个氨基酸、40至50个氨基酸、50至60个氨基酸、5至60个氨基酸、5至40个氨基酸、8至20个氨基酸或10至15个氨基酸。铰链可以主要是柔性的，但也可以提供偏刚性的特征，或者可以主要含有α-螺旋结构和最小的β-折叠结构。铰链的长度或序列会影响铰链直接或间接(通过另一个区域或结构域)连接的结合结构域的结合亲和力以及铰链或接头直接或间接连接的Fc区部分的一种或多种活性。
在某些方面，铰链在血浆和血清中是稳定的并且对蛋白水解切割具有抗性。IgG1上部铰链区中的第一个赖氨酸可以被突变，以最大限度地减少蛋白水解切割。例如，赖氨酸可以被甲硫氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代，或者它可以缺失。
在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体不包含铰链。例如，在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体包含接头代替铰链。
如本文所提供，包含本文所提供的CDR、VH、VL、scFv和/或铰链中的任一者的抗体或多肽还可包含免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白恒定区可以位于例如铰链与PSMA结合结构域(例如结合PSMA的scFv)之间。免疫球蛋白恒定区也可以位于铰链与CD3结合结构域(例如结合CD3的scFv)之间。在一些方面，多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含铰链区、免疫球蛋白恒定区和抗原结合结构域(例如scFv)。
在一些方面，免疫球蛋白恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的免疫球蛋白CH2和CH3结构域，任选地其中IgG是人IgG。在一些情况下，免疫球蛋白恒定区包含IgG1(例如人IgG1)的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。在一些方面，多肽不包含CH1结构域。
在一些方面，免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止与FcγR1、FcγRI Ia、FcγRIIb、FcγRI Ia和FcγRIIIb结合。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，以防止或减少Fc介导的T细胞活化。
在一些方面，免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止或降低CDC和/或ADCC活性。在一些方面，免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止或减弱FcγR或C1q相互作用。
本文还提供了具有人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域和人源化CD3抗原结合结构域的抗体，该人源化CD3抗原结合结构域含有SEQ ID NO:100的VH的CDR和SEQID NO:102的VL的CDR。本公开还包括一种抗体，该抗体具有：人源化PSMA抗原结合结构域，该PSMA抗原结合结构域含有SEQ ID NO:82的VH的CDR和SEQ ID NO:84的VL的CDR；以及人源化CD3抗原结合结构域，该CD3抗原结合结构域含有SEQ ID NO:100的VH的CDR和SEQ ID NO:102的VL的CDR。在这些方面，人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)抗原结合结构域和人源化CD3结合结构域可以被“无效”恒定区分开，该恒定区含有阻止与FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRIIIb的结合的突变。这种“无效”恒定区允许本公开的双特异性抗体活化肿瘤浸润淋巴细胞，同时不活化或最低限度地活化其它效应细胞。与没有恒定区的类似双特异性抗体相比，恒定区的存在延长了双特异性抗体的半衰期。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含L234A、L235A、G237A和K322A取代。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含以下取代中的一者或多者：E233P、L234A、L234V、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A，和/或G236缺失。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含以下取代中的一者或多者：E233P、L234A、L234V、L235A、G237A和K322A，和/或G236缺失。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A取代。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含L234A、L235A、G237A和K322A取代。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含E233P、L234V、L235A、G237A和K322A取代。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含E233P、L234V、L235A、G237A和K322A取代，以及G236缺失。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代。例如，本公开包括双特异性抗体，该抗体从氨基末端到羧基末端包含第一scFV；免疫球蛋白铰链；根据EU编号系统包含E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代的IgG1 CH2结构域；IgG1 CH3；以及第二scFv。一方面，第一scFv特异性结合至人TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)并且第二scFv特异性结合至人CD3。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，该结构域包含E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代，以及G236缺失。例如，本公开包括一种双特异性抗体，该抗体从氨基末端到羧基末端包含第一scFv；免疫球蛋白铰链；根据EU编号系统包含E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代以及G236缺失的IgG1 CH2；IgG1 CH3；以及第二scFv。一方面，第一scFv特异性结合至人TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)并且第二scFv特异性结合至人CD3。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含人IgG1 CH3结构域。
在某些方面，免疫球蛋白恒定区包含SEQ ID NO:64、66或68的氨基酸。
可存在于本文提供的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3抗体中的另外的免疫球蛋白恒定区将在下文更详细地讨论。
在一些方面，铰链和免疫球蛋白恒定区包含SEQ ID NO:64、66或68中任一者的氨基酸序列。在一些方面，铰链和免疫球蛋白恒定区包含SEQ ID NO:66或68的氨基酸。在一些方面，铰链包含SEQ IDNO:145-158中任一者的氨基酸序列。在一些方面，铰链包含SEQ IDNO:156的氨基酸序列。
在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体不包含免疫球蛋白恒定区。在一些方面，TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3双特异性抗体不包含铰链，并且不包含免疫球蛋白恒定区。
如本文所提供，包含本文所提供的CDR、VH、VL、scFv、铰链和/或免疫球蛋白恒定区中的任一者的抗体或多肽还可包含接头。接头可以位于例如免疫球蛋白恒定区与C末端结合结构域之间。例如，接头可位于免疫球蛋白恒定区与C末端TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域之间。接头也可位于免疫球蛋白恒定区与C末端CD3结合结构域之间。在一些方面，多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含免疫球蛋白恒定区、接头和抗原结合结构域。
在一些方面，接头(例如在免疫球蛋白恒定区与抗原结合结构域之间)包含3-30个氨基酸、3-15个氨基酸或约3-10个氨基酸。在一些方面，接头(例如在免疫球蛋白恒定区与抗原结合结构域之间)包含5-30个氨基酸、5-15个氨基酸或约5-10个氨基酸。在一些方面，接头(例如在免疫球蛋白恒定区与抗原结合结构域之间)包含氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中n＝1-5，任选地其中n＝1。在一些方面，接头包含SEQ ID NO:159-175中任一者的氨基酸序列。在一些方面，接头(例如在免疫球蛋白恒定区与抗原结合结构域之间)包含氨基酸序列(G4S)4(SEQ ID NO:171)。
接头的非限制性实例提供于下表K和表L中。
表K：示例性铰链和接头
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在一些方面，PSMA x CD3抗体包含多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含：(i)含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；(ii)接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)；(iii)含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；(iv)根据EU编号包含C220S取代的IgG1铰链；(v)包含CH2结构域和野生型CH3结构域的免疫球蛋白恒定区，该CH2结构域包含以下取代：E233P、L234A、L234V、L235A、G237A和K322A，以及G236缺失(根据EU编号系统)；(vi)含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VL；(vii)接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)；以及(viii)含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH。在一些方面，PSMA x CD3抗体包含多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含：(i)含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；(ii)接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)；(iii)含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；(iv)包含CH2结构域和野生型CH3结构域的免疫球蛋白恒定区，该CH2结构域包含以下取代：E233P、L234A、L234V、L235A、G237A和K322A，以及G236缺失(根据EU编号系统)；(v)含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VL；(vi)接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)；以及(vii)含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH。在一些方面，PSMA x CD3抗体包含此类多肽的异二聚体或同二聚体。
在一些方面，PSMA x CD3抗体包含多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含：(i)含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；(ii)接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)；(iii)含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；(iv)根据EU编号包含C220S取代的IgG1铰链；(v)包含CH2结构域和野生型CH3结构域的免疫球蛋白恒定区，该CH2结构域包含以下取代：E233P、L234A、L234V、L235A、G237A和K322A，以及G236缺失(根据EU编号系统)；(vi)含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH；(vii)接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)；以及(viii)含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VL。在一些方面，PSMA x CD3抗体包含此类多肽的同二聚体或异二聚体。
在一些方面，PSMA x CD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:78-100中任一者的氨基酸序列。
表L：PSMA x CD3双特异性抗体SEQ ID NO
在一些方面，PSMA x CD3双特异性抗体包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的第一多肽链和具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第二多肽链。在一些方面，PSMA x CD3双特异性抗体包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的第一多肽链和具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的第二多肽链。在一些方面，PSMA x CD3双特异性抗体包含具有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一多肽链和具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些方面，PSMA x CD3双特异性抗体是能够结合至人PSMA和人CD3并包含两种不同多肽的异二聚体，其中每种多肽包含与SEQ ID NO:106和108、178和108，或SEQ ID NO:106和112的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列。在一些方面，PSMA x CD3双特异性抗体是包含两种多肽的异二聚体，其中每个多肽包含SEQ ID NO:106和108、178和108，或SEQ ID NO:106和112的氨基酸序列。在一些方面，结合至人PSMA和人CD3的双特异性抗体是基本上由两种多肽组成或由两种多肽组成的异二聚体，其中每种多肽包含SEQ ID NO:106和108、178和108，或SEQ ID NO:106和112的氨基酸序列。
E.PSMA和CD3单特异性抗体
本文提供了结合至人PSMA或人CD3的单特异性抗体。本文提供的抗PSMA抗体可包含本文所述的任何PSMA结合结构域中的一者或多者。本文提供的抗CD3抗体可包含本文所述的任何CD3结合结构域中的一者或多者。
在一些方面，本文提供的抗PSMA抗体或抗CD3抗体是IgG抗体。在一些方面，本文提供的抗PSMA抗体或抗CD3抗体是IgG1抗体。
在一些方面，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:70、72、74、76、78和80的六个CDR或本文提供的结合PSMA的VH和VL序列与重链恒定区的组合。在一些方面，抗PSMA抗体包含SEQ IDNO:70、72、74、76、78和80的六个CDR或本文提供的结合PSMA的VH和VL序列与轻链恒定区的组合。在一些方面，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:70、72、74、76、78和80的六个CDR或本文提供的结合PSMA的VH和VL序列与重链恒定区和轻链恒定区的组合。
在一些方面，抗CD3抗体包含SEQ ID NO:88、90、92、94、96和98的六个CDR或本文提供的结合CD3的VH和VL序列与重链恒定区的组合。在一些方面，抗CD3抗体包含SEQ ID NO:88、90、92、94、96和98的六个CDR或本文提供的结合CD3的VH和VL序列与轻链恒定区的组合。在一些方面，抗CD3抗体包含SEQ ID NO:88、90、92、94、96和98的六个CDR或本文提供的结合CD3的VH和VL序列与重链恒定区和轻链恒定区的组合。
抗PSMA抗体或CD3抗体的恒定区可以是本文所论述的任何恒定区。可存在于这些抗体中的恒定区将在下文更详细地讨论。
在一些方面，抗PSMA抗体或抗CD3抗体是Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv或scFv-Fc。在一些方面，抗PSMA抗体或抗CD3抗体包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv或scFv-Fc。例如，本公开包括如US 9,005,612中所公开的呈SMIP形式(即，scFv-Fc)的抗PSMA抗体或抗CD3抗体。SMIP抗体从氨基末端到羧基末端可以包含scFv和经过修饰的恒定结构域，该经过修饰的恒定结构域包含免疫球蛋白铰链和CH2/CH3区。本公开还包括如已公布的美国专利申请2009/0148447中所公开的呈PIMS形式的抗PSMA抗体或抗CD3抗体。PIMS抗体从氨基末端到羧基末端可以包含经过修饰的恒定结构域和scFv，该经过修饰的恒定结构域包含免疫球蛋白铰链和CH2/CH3区。
抗PSMA抗体对于PSMA可以是单价的(即，含有一个PSMA结合结构域)，对于PSMA是二价的(即，含有两个PSMA结合结构域)，或者可以具有三个或更多个PSMA结合结构域。
抗CD3抗体对于CD3可以是单价的(即，含有一个CD3结合结构域)，对于CD3是二价的(即，含有两个CD3结合结构域)，或者可以具有三个或更多个CD3结合结构域。
F.恒定区
如上文所论述，本文提供的抗体，包括结合至PSMA或CD3的单特异性抗体以及TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)x CD3或PSMA x CD3双特异性抗体，可以包含免疫球蛋白恒定区。在某些方面，免疫球蛋白恒定区不与Fcγ受体相互作用。
在一个特定方面，免疫特异性结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的本文所述的抗体包括含本文所述的任何氨基酸序列的VH结构域和VL结构域，并且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子或人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在另一特定方面，免疫特异性结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的本文所述的抗体包括含本文所述的任何氨基酸序列的VH结构域和VL结构域，并且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在一个特定方面，恒定区包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。
一方面，重链恒定区是人IgG1重链恒定区，而轻链恒定区是人IgGκ轻链恒定区。
在一些方面，恒定区包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以防止与FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRI IIb结合。
在某些方面，恒定区包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，以防止或减少Fc介导的T细胞活化。
在一些方面，恒定区包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以防止或降低CDC和/或ADCC活性。
在一些方面，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述的抗体或其抗原结合片段的Fc区(例如CH2结构域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区，根据Kabat编号系统(例如Kabat中的EU索引)进行编号)，以改变抗体或其抗原结合片段的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。
在某些方面，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入Fc区(CH1结构域)的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数量发生改变(例如增加或减少)，如例如美国专利号5,677,425中所述。CH1结构域铰链区中半胱氨酸残基数量可以改变，以例如促进轻链和重链的组装，或改变(例如增加或降低)抗体或其抗原结合片段的稳定性。
在一些方面，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述的抗体或其抗原结合片段的Fc区(例如CH2结构域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区，根据Kabat编号系统(例如Kabat中的EU索引)进行编号)，以增加或减小抗体或其抗原结合片段对效应细胞表面上的Fc受体(例如活化的Fc受体)的亲和力。降低或增加对Fc受体的亲和力的Fc区突变和用于将此类突变引入Fc受体或其片段中的技术是本领域技术人员已知的。可用于改变抗体或其抗原结合片段对Fc受体的亲和力的Fc受体突变的实例描述于例如以下中：Smith P等人,(2012)PNAS 109:6181-6186；美国专利号6,737,056；以及国际公开号WO 02/060919、WO 98/23289和WO 97/34631，所述文献以引用的方式并入本文。
在一个特定方面，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选是Fc或铰链-Fc结构域片段)中以改变(例如缩短或增加)抗体或其抗原结合片段的体内半衰期。有关会改变(例如缩短或增加)抗体或其抗原结合片段的体内半衰期的突变的实例，参见例如国际公开号WO 02/060919、WO 98/23289和WO 97/34631；以及美国专利号5,869,046、6,121,022、6,277,375和6,165,745。在一个特定方面，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选是Fc或铰链-Fc结构域片段)中以缩短抗体或其抗原结合片段的体内半衰期。在其它方面，将一个、两个或更多个氨基酸突变(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选是Fc或铰链-Fc结构域片段)中以增加抗体或其抗原结合片段的体内半衰期。在一个特定方面，抗体或其抗原结合片段可以在第二恒定(CH2)结构域(人IgG1的残基231-340)和/或第三恒定(CH3)结构域(人IgG1的残基341-447)中具有一个或多个氨基酸突变(例如取代)，其中编号是根据Kabat中的EU索引进行(Kabat EA等人，(1991)同上)。在一个特定方面，根据Kabat中的EU索引编号，IgG1恒定区包含第252位的甲硫氨酸(M)变为酪氨酸(Y)的取代、第254位的丝氨酸(S)变为苏氨酸(T)的取代，以及第256位的苏氨酸(T)变为谷氨酸(E)的取代。参见美国专利号7,658,921，该案以引用的方式并入本文。经显示，这种类型的突变型IgG，称为“YTE突变体”，展示出相较于相同抗体的野生型形式增加四倍的半衰期(参见Dal l'Acqua WF等人,(2006)J Biol Chem 281:23514-24)。在某些方面，抗体或其抗原结合片段包含IgG恒定结构域，根据Kabat中的EU索引编号，该IgG恒定结构域包含对位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸取代。
另一方面，将一个、两个或更多个氨基酸取代引入IgG恒定结构域Fc区以改变抗体或其抗原结合片段的效应子功能。例如，根据Kabat中的EU索引编号，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换以使得抗体或其抗原结合片段对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在美国专利号5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。在一些方面，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式实现)可以减少循环抗体或其抗原结合片段的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。有关使恒定结构域缺失或失活并由此增加肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利号5,585,097和8,591,886。在某些方面，可将一个或多个氨基酸取代引入Fc区中以去除Fc区上的潜在糖基化位点，由此可减少Fc受体结合(参见例如Shields RL等人,(2001)JBiol Chem 276:6591-604)。
在某些方面，根据Kabat中的EU索引编号，一个或多个选自恒定区中的氨基酸残基329、331和322的氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换以使得抗体或其抗原结合片段具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在美国专利号6,194,551(Idusogie等人)中有更详细的描述。在一些方面，CH2结构域N末端区中氨基酸位置231至238内的一个或多个氨基酸残基被改变，由此改变抗体固定补体的能力。这种方法在国际公开号WO 94/29351中有进一步描述。在某些方面，根据Kabat中的EU索引编号，通过使以下位置处的一个或多个氨基酸突变(例如引入氨基酸取代)对Fc区进行修饰以增加抗体或其抗原结合片段介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体或其抗原结合片段对Fcg受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这种方法在国际公开号WO 00/42072中有进一步描述。
在某些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含根据Kabat中的EU索引编号在第267位、第328位或其组合处具有突变(例如取代)的IgG1的恒定结构域。在某些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含具有选自由S267E、L328F及其组合组成的组的突变(例如取代)的IgG1的恒定结构域。在某些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含具有S267E/L328F突变(例如取代)的IgG1的恒定结构域。在某些方面，包含具有S267E/L328F突变(例如取代)的IgG1的恒定结构域的本文所述的抗体或其抗原结合片段具有增加的对FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIA和FcγRIIB的结合亲和力。
在某些方面，可将本文所述的任何恒定区突变或修饰引入本文所述的具有两个重链恒定区的抗体或其抗原结合片段的一个或两个重链恒定区中。
III.抗体产生
免疫特异性结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或人CD3的抗体可以通过本领域已知用于抗体合成的任何方法产生，例如通过化学合成或通过重组表达技术产生。除非另有指示，否则本文所述的方法采用在本领域技术人员技能范围内的分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及相关领域的常规技术。这些技术在例如本文引用的参考文献中有所描述，并在文献中得到了充分解释。参见例如Maniatis T等人,(1982)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,ColdSpring Harbor LaboratoryPress；Sambrook J等人,(1989),Molecular Cloning:ALaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Sambrook J等人,(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring HarborLaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)；Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)Gait(编辑)(1984)OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach,IRL Press；Eckstein(编辑)(1991)Oligonucleotidesand Analogues:A Practical Approach,IRL Press；Birren B等人(编辑)(1999)GenomeAnalysis:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress。
本文提供的双特异性抗体可通过在宿主细胞中表达多核苷酸来制备，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含第一scFv、铰链区、免疫球蛋白恒定区和第二scFv，其中(a)第一scFv包含人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)抗原结合结构域，并且第二scFv包含人源化CD3抗原结合结构域，或者(b)第一scFv包含人源化CD3抗原结合结构域，并且第二scFv包含人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)抗原结合结构域。多肽可以在宿主细胞中表达为同二聚体或异二聚体。
本文提供的双特异性抗体可通过以化学方式连接两种不同的单克隆抗体或通过融合两种杂交瘤细胞系以产生杂交-杂交瘤来制备。双特异性、二价抗体和其制备方法描述于例如美国专利号5,731,168、5,807,706、5,821,333和美国申请公布号2003/020734和2002/0155537中；各案以引用的方式整体并入本文中。双特异性四价抗体及其制备方法描述于例如国际申请公布号WO02/096948和WO00/44788中，两者的公开内容以引用的方式整体并入本文中。一般参见国际申请公布号WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360和WO92/05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利号4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920和5,601,819；以及Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)；各自以引用的方式整体并入本文中。
本文所述的双特异性抗体可以根据如例如国际公布号WO 2011/131746、WO 2011/147986、WO 2008/119353和WO 2013/060867，以及Labrijn AF等人,(2013)PNAS110(13):5145-5150中所述的DuoBody技术平台(Genmab A/S)产生。DuoBody技术可用于将含有两条重链和两条轻链的第一单特异性抗体的一半与含有两条重链和两条轻链的第二单特异性抗体的一半组合。由此得到的异二聚体含有来自第一抗体的一条重链和一条轻链以及来自第二抗体的一条重链和一条轻链。当两种单特异性抗体识别不同抗原上的不同表位时，所得到的异二聚体是双特异性抗体。
DuoBody技术需要每种单特异性抗体包括在CH3结构域中具有单点突变的重链恒定区。所述点突变使所得双特异性抗体中的CH3结构域之间的相互作用强于任一单特异性抗体中的CH3结构域之间的相互作用。每种单特异性抗体中的单点突变位于重链恒定区CH3结构域中根据EU编号系统编号的残基366、368、370、399、405、407或409处，如例如国际公布号WO 2011/131746中所述。此外，单点突变位于一种单特异性抗体中的与另一种单特异性抗体不同的残基处。例如，根据EU编号系统编号，一种单特异性抗体可包含突变F405L(即，残基405处的苯丙氨酸突变为亮氨酸)，而另一种单特异性抗体可包含突变K409R(即，残基409处的赖氨酸突变为精氨酸)。单特异性抗体的重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型(例如人IgG1同种型)，并且由DuoBody技术产生的双特异性抗体可以保留Fc介导的效应子功能。
另一种用于产生双特异性抗体的方法被称为“孔中节”策略(参见例如国际公布WO2006/028936)。在这一技术中，通过使选定氨基酸突变以形成IgG中CH3结构域的界面，将减少Ig重链的错配。在CH3结构域内两条重链直接相互作用的位置，一个带有小侧链(孔)的氨基酸被引入到一个重链的序列中，一个具有大侧链(凸起)的氨基酸被引入到对应的重链序列中另一条重链上的相互作用残基位置。在一些方面，本公开的组合物具有免疫球蛋白链，其中CH3结构域已通过使在两个多肽之间的界面处相互作用的选定氨基酸突变进行修饰，由此优先形成双特异性抗体。双特异性抗体可由相同亚类(例如IgG1或IgG3)或不同亚类(例如IgG1和IgG3，或IgG3和IgG4)的免疫球蛋白链构成。
一方面，结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3的双特异性抗体包含“节链”中的T366W突变和“孔链”中的T366S、L368A、Y407V突变，并且任选地包含通过例如将Y349C突变引入“节链”中并将E356C突变或S354C突变引入“孔链”中而在CH3结构域之间产生的另外的链间二硫桥；“节链”中的R409D、K370E突变和“孔链”中的D399K、E357K突变；“节链”中的R409D、K370E突变和“孔链”中的D399K、E357K突变；“节链”中的T366W突变和“孔链”中的T366S、L368A、Y407V突变；“节链”中的R409D、K370E突变和“孔链”中的D399K、E357K突变；一条链中的Y349C、T366W突变和对应链中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变；一条链中的Y349C、T366W突变和对应链中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变；一条链中的Y349C、T366W突变和对应链中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变；一条链中的Y349C、T366W突变和对应链中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(根据EU编号系统编号)。在某些方面，Fc区可包含SEQID NO:64、66或68。在某些方面，Fc区可以具有PAA缺失，并且可以具有允许节和孔连接的氨基酸改变。
在一些方面，结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和CD3的双特异性抗体可以含有IgG4和IgG1、IgG4和IgG2、IgG4和IgG2、IgG4和IgG3或者IgG1和IgG3链异二聚体。此类异二聚重链抗体通常可通过例如修饰选定氨基酸以形成人IgG4和IgG1或IgG3中CH3结构域的界面，由此有利于异二聚重链的形成来进行工程改造。
本文所述的双特异性抗体可通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，本文所述的F(ab')2片段可以通过使用酶如胃蛋白酶对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割来产生。
在某一方面，本文提供了一种制备免疫特异性结合至人TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或人CD3的抗体的方法，该方法包括培养本文所述的一种或多种细胞。在某一方面，本文提供了一种制备免疫特异性结合至人TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或人CD3的抗体的方法，该方法包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如包含编码本文所述的抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如重组表达)该抗体。在一个特定方面，细胞是分离的细胞。在一个特定方面，外源多核苷酸已被引入细胞中。在一个特定方面，所述方法还包括从细胞或宿主细胞中纯化出抗体的步骤。
单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，包括本领域中已知的以及例如以下中教示的那些：Harlow E和Lane D,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring HarborLaboratoryPress,第2版,1988)；Hammerling GJ等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier,N.Y.,1981)。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。例如，可以由外源表达本文所述抗体的宿主细胞重组产生单克隆抗体。本文所述的单克隆抗体可以例如通过如Kohler G和Milstein C(1975)Nature256:495中所描述的杂交瘤方法制备，或者可以例如使用本文所述的技术从噬菌体文库中分离。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其它方法是本领域众所周知的(参见例如第11章：Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第5版，Ausubel FM等人,同上)。
此外，还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生本文所述的抗体。在噬菌体展示方法中，蛋白质被展示于携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。具体点说，使来自动物cDNA文库(例如受影响组织的人或鼠cDNA文库)的编码VH和VL结构域的DNA序列扩增。通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起，并将其克隆到噬菌粒载体中。通过电穿孔将载体放入大肠杆菌(E.coli)中，并用辅助噬菌体感染大肠杆菌。这些方法中使用的噬菌体典型地是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。表达结合至特定抗原的抗体的噬菌体可以用抗原来选择或鉴别，例如，使用标记的抗原或者结合或捕获到固体表面或珠粒的抗原进行选择或鉴别。可用于制备本文所述抗体的噬菌体展示方法的实例包括以下中所公开的那些：Brinkman U等人,(1995)J Immunol Methods 182:41-50；Ames RS等人(1995)JImmunol Methods 184:177-186；Kettleborough CA等人(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic L等人(1997)Gene187:9-18；Burton DR和Barbas CF(1994)Advan Immunol57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/001134；国际公布号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
如以上参考文献所述，在选择噬菌体后，可以从噬菌体中分离抗体编码区并用于产生抗体，包括人抗体，并在任何所希望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如下文所述。重组产生抗体如Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术也可使用本领域已知的方法，如PCT公布号WO 92/22324；Mullinax RL等人(1992)BioTechniques12(6):864-9；Sawai H等人(1995)Am J Reprod Immunol 34:26-34；以及Better M等人(1988)Science 240:1041-1043中所公开的那些。
一方面，为了产生抗体，可以使用PCR引物，由模板，例如scFv克隆扩增VH或VL序列，该PCR引物包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧接序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达VH恒定区的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达VL恒定区的载体中，例如人κ或λ恒定区。VH和VL结构域也可以克隆到一个表达必要恒定区的载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达抗体，例如表达IgG的稳定或瞬时细胞系。
人源化抗体能够结合至预定抗原并且包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的构架区和基本上具有非人免疫球蛋白(例如鼠免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。在一个特定方面，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)；镶饰或表面重整(欧洲专利号EP 592106和EP 519596；Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5):489-498；Studnicka GM等人(1994)Prot Engineering 7(6):805-814；和Roguska MA等人(1994)PNAS 91:969-973)；链改组(美国专利号5,565,332)，以及例如以下文献中所公开的技术：美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公布号WO 93/17105；Tan P等人(2002)J Immunol 169:1119-25；Caldas C等人(2000)Protein Eng.13(5):353-60；Morea V等人(2000)Methods 20(3):267-79；Baca M等人(1997)J Biol Chem 272(16):10678-84；Roguska MA等人(1996)Protein Eng 9(10):895904；Couto JR等人(1995)Cancer Res.55(23增刊)；5973s-5977s；Couto JR等人(1995)Cancer Res 55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2):409-10；和Pedersen JT等人(1994)J Mol Biol 235(3):959-73。另参见美国申请公布号US2005/0042664 A1(2005年2月24日)，该案以引用的方式整体并入本文。
IV.编码抗体的多核苷酸
在某些方面，本公开涵盖多核苷酸，所述多核苷酸包含编码结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体，或此类抗体的多肽的核酸，所述多肽为例如VH、VL、VH和VL(例如在scFv中)、重链、轻链、具有scFv的重链、具有scFv的轻链、包含scFv的融合蛋白、接头(例如其中接头是铰链)、免疫球蛋白恒定区和scFv、恒定区或具有scFv的恒定区。
在某些方面，本公开涵盖多核苷酸，所述多核苷酸包含编码结合至PSMA和/或CD3的抗体，或此类抗体的多肽的核酸，所述多肽为例如VH、VL、VH和VL(例如在scFv中)、重链、轻链、具有scFv的重链、具有scFv的轻链、包含scFv的融合蛋白、接头(例如其中接头是铰链)、免疫球蛋白恒定区和scFv、恒定区或具有scFv的恒定区。
因此，本文提供分别编码SEQ ID NO:70、72、74、76、78和80的PSMA结合结构域的六个CDR的多核苷酸或多核苷酸的组合。多核苷酸可包含分别如SEQ ID NO:69、71、73、75、77和79所示的核苷酸序列。
本文还提供了分别编码SEQ ID NO:88、90、92、94、96和98的CD3结合结构域的六个CDR的多核苷酸或多核苷酸的组合。多核苷酸可包含如SEQ ID NO:87、89、91、93、95和97所示的核苷酸序列。
本文还提供了编码本文提供的PSMA结合结构域的VH的多核苷酸，所述VH为例如包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH。多核苷酸可包含如SEQ ID NO:81所示的核苷酸序列。
本文还提供了编码本文提供的PSMA结合结构域的VL的多核苷酸，所述VL为例如包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL。多核苷酸可包含如SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列。
本文还提供了编码本文提供的CD3结合结构域的VH的多核苷酸，所述VH为例如包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH。多核苷酸可包含如SEQ ID NO:99所示的核苷酸序列。
本文还提供了编码本文提供的CD3结合结构域的VL的多核苷酸，所述VL为例如包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VL。多核苷酸可包含如SEQ ID NO:101所示的核苷酸序列。
本文还提供了编码本文提供的PSMA结合序列(例如scFv)的多核苷酸，所述PSMA结合序列为例如包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的PSMA结合序列。多核苷酸可包含如SEQ IDNO:85所示的核苷酸序列。
本文还提供了编码本文提供的CD3结合序列(例如scFv)的多核苷酸，所述CD3结合序列为例如包含SEQ ID NO:104或110的氨基酸序列的CD3结合序列。多核苷酸可包含如SEQID NO:103或109所示的核苷酸序列。
本文还提供了编码本文提供的PSMA x CD3双特异性抗体的多核苷酸，所述抗体是例如包括含SEQ ID NO:106和108、178和108或112和108的氨基酸序列的第一条和第二条多肽链的抗体。多核苷酸可包含SEQ ID NO:105和107、177和107或111和107中任一者所示的核苷酸序列。
在某些方面，多核苷酸编码多肽，该多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含第一scFv、接头(例如其中接头是铰链区)、免疫球蛋白恒定区和第二scFv，其中(a)第一scFv包含人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域，并且第二scFv包含人源化CD3结合结构域，或(b)第一scFv包含人源化CD3结合结构域并且第二scFv包含人源化TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域。
如下文更详细讨论的，还提供了包含本文公开的多核苷酸的载体。
本公开的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链的，且如果是单链的，则可以是编码链或非编码(反义)链。在一些方面，多核苷酸是cDNA或缺少一个或多个内源性内含子的DNA。
在一些方面，多核苷酸是非天然存在的多核苷酸。在一些方面，多核苷酸是重组产生的。
在某些方面，多核苷酸是分离的。在某些方面，多核苷酸基本上是纯的。在一些方面，多核苷酸是从天然组分中纯化的。
在一些方面，本文提供的多核苷酸针对在特定宿主中表达进行了密码子优化(人mRNA中的密码子变为细菌宿主如大肠杆菌所偏好的密码子)。
V.细胞和载体
本文还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。
在某些方面，本文提供了表达(例如重组表达)本文所述的抗体的细胞(例如宿主细胞)，所述抗体特异性结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3，并且包含相关多核苷酸和表达载体.本文提供了用于在宿主细胞，例如在哺乳动物宿主中重组表达的载体(例如表达载体)，所述载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码特异性结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体的核苷酸序列。本文还提供包含此类载体的宿主细胞，用于重组表达特异性结合至本文所述的TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体。在一个特定方面，本文提供了用于产生本文所述的特异性结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达此类抗体。
本文所述的特异性结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体的重组表达涉及构建表达载体，该表达载体含有编码抗体或其多肽(例如融合蛋白，包含scFv、接头(例如其中接头是铰链)、免疫球蛋白恒定区；重链或轻链；包含一个或多个可变结构域的多肽；包含一个或多个抗原结合结构域的多肽(例如scFv)，任选地与接头(例如其中接头是铰链)、免疫球蛋白恒定区和/或接头等融合)的多核苷酸。在获得了编码本文所述的抗体或其多肽的多核苷酸后，可使用本领域众所周知的技术，通过重组DNA技术产生用于产生抗体或其多肽的载体。因此，本文描述了通过表达编码抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可使用本领域技术人员众所周知的方法构建含有抗体或其多肽的编码序列以及适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供了可复制的载体，所述载体包含可操作地连接至启动子的编码抗体或其片段的核苷酸序列。此类载体可以例如包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公布号WO 86/05807和WO 89/01036；以及美国专利号5,122,464)，并且可以将抗体可变结构域克隆到此类载体中以表达完整的重链、完整轻链或完整重链和轻链两者。编码额外可变结构域、TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域(例如scFv)和/或CD3结合结构域的核苷酸序列也可以被克隆到此类载体中以表达融合蛋白，所述融合蛋白包含与额外可变结构域、TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)结合结构域(例如scFv)和/或CD3结合结构域融合的重链或轻链。
为了将重组蛋白引导至宿主细胞的分泌路径中，可以在表达载体中提供分泌信号序列(又称为前导序列)。分泌信号序列可以是重组蛋白的天然形式，或者可以来源于另一种分泌蛋白或从头合成。分泌信号序列可以可操作地连接到编码多肽的DNA序列。分泌信号序列通常位于编码感兴趣多肽的DNA序列的5'端，但某些信号序列也可以位于感兴趣DNA序列的其它地方(参见例如Welch等人，美国专利号5,037,743；Hol land等人，美国专利号5,143,830)。
可以通过常规技术将表达载体转移到细胞(例如宿主细胞)中，然后可以通过常规技术培养所得到的细胞以产生本文所述的抗体或其多肽(例如融合蛋白，包含scFv、接头(例如其中接头是铰链)、免疫球蛋白恒定区；重链或轻链；包含一个或多个可变结构域的多肽；包含一个或多个抗原结合结构域的多肽(例如scFv)，任选地与铰链、免疫球蛋白恒定区和/或接头融合等融合)。因此，本文提供的宿主细胞含有编码本文所述的抗体或其多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至用于在宿主细胞中表达此类序列的启动子。
在某些方面，为了表达多-多肽抗体，编码所有多肽的载体可以个别地在宿主细胞中共表达以表达完整抗体。
在某些方面，宿主细胞含有一个载体，该载体包含编码本文所述的抗体的所有多肽的多核苷酸。在特定方面，宿主细胞含有多个不同载体，所述载体编码本文所述的抗体的所有多肽。
载体或载体组合可包含编码两种或更多种多肽的多核苷酸，所述两种或更多种多肽相互作用以形成本文所述的抗体，所述多核苷酸为例如：编码重链的第一多核苷酸和编码轻链的第二多核苷酸；编码包含重链和scFv的融合蛋白的第一多核苷酸与编码轻链的第二多核苷酸；编码包含轻链和scFv的融合蛋白的第一多核苷酸与编码重链的第二多核苷酸；编码包含重链和VH的融合蛋白的第一多核苷酸与编码包含轻链和VL的融合蛋白的第二多核苷酸等等。在两种多肽是由两个独立载体中的多核苷酸编码的情况下，可将载体转染到同一宿主细胞中。
多种宿主表达载体系统可用于表达本文所述的抗体或其多肽(例如融合蛋白，包含scFv、接头(例如其中接头是铰链)、免疫球蛋白恒定区；重链或轻链；包含一个或多个可变结构域的多肽；包含一个或多个抗原结合结构域(例如scFv)的多肽，任选地与铰链、免疫球蛋白恒定区和/或接头等融合)。此类宿主表达系统代表了可以产生并随后纯化出感兴趣编码序列的媒介物，而且还代表了当用适当核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所述的抗体或其多肽的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(caul iflower mosaicvirus)，CaMV；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如绿藻，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或带有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)，所述重组表达构建体含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。
在通过重组表达产生了本文所述的抗体或其多肽(例如融合蛋白，包含scFv、接头(例如其中接头是铰链)、免疫球蛋白恒定区；重链或轻链；包含一个或多个可变结构域的多肽；包含一个或多个抗原结合结构域(例如scFv)，任选地与铰链、免疫球蛋白恒定区和/或接头等融合)后，它可以通过本领域已知用于纯化抗体的任何方法，例如通过色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱，特别是通过在蛋白质A后对特定抗原的亲和力，以及定径柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其它标准蛋白质纯化技术制备。此外，本文所述的抗体可与本文所述的异源多肽序列(例如FLAG标签、his标签或抗生物素蛋白)或本领域已知的其它方式融合以促进纯化。
VI.组合物和试剂盒
本文提供了组合物，所述组合物包含在生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂中具有所希望纯度的本文所述的抗体(Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co.,Easton,PA)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒。
药物组合物可以被配制用于特定受试者施用途径。例如，药物组合物可以被配制用于肠胃外，例如静脉内施用。打算用于体内施用的组合物可以是无菌的。这易于通过经例如无菌过滤膜过滤来实现。
一方面，本文所述的药物组合物用作药剂。本文所述的药物组合物可用于增强免疫反应。本文所述的药物组合物可用于增加受试者体内T细胞(例如CD4 T细胞和/或CD8 T细胞)的增殖和/或活化。
本文所述的药物组合物可用于治疗如癌症或前列腺疾病等疾患。可以如本文所述治疗的癌症的实例包括但不限于前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、结直肠癌、透明细胞肾癌、结直肠癌、膀胱癌、肺癌和胃癌。在某些方面，癌症是实体瘤。在某些方面，前列腺病症是良性前列腺增生或新生血管性病症。
VII.方法和用途
结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的本公开的抗体可用于多种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，例如癌症的治疗。在某些方面，药剂可用于抑制肿瘤生长和/或减小肿瘤体积。使用方法可以是体外或体内方法。本公开包括任何所公开的抗体(和包含所公开的抗体的药物组合物)用于疗法中的用途。
本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体。本公开包括任何所公开的抗体用于治疗癌症的用途，包括但不限于用所公开的能够进行二价TAA结合和单价CD3结合的异二聚体构建体(例如呈ADAPTIR-FLEXTM形式的构建体)治疗。
在某些方面，癌症是包括但不限于以下的癌症：PSMA(+)癌症、前列腺癌、转移性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、结直肠癌、透明细胞肾癌、结直肠癌、膀胱癌、肺癌和胃癌。癌症可以是原发性肿瘤或者可以是晚期或转移性癌症。在某些方面，癌症是实体瘤。例如，本公开包括双特异性抗体用于治疗PSMA(+)癌症、前列腺癌、转移性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、结直肠癌、透明细胞肾癌、结直肠癌、膀胱癌、肺癌和胃癌的用途。本公开包括例如通过向受试者施用治疗有效量的本公开的药物组合物(例如包含双特异性抗体的药物组合物，所述双特异性抗体包含特异性结合人PSMA和人CD3的第一多肽链和第二多肽链并且包含与SEQ ID NO:106和108、178和108或112和108的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列)来治疗患有PSMA(+)癌症、前列腺癌、转移性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、结直肠癌、透明细胞肾癌、结直肠癌、膀胱癌、肺癌和胃癌的人类受试者。
本公开包括治疗患有病症的人类受试者的方法，其中所述病症以PSMA过表达为特征，所述方法是通过向受试者施用治疗有效量的PSMA x CD3双特异性抗体实现，所述双特异性抗体包括含SEQ ID NO:106和108、178和108或112和108的第一多肽链和第二多肽链。一方面，本公开包括向患有病症的人类受试者施用治疗有效量的包含抗PSMAx抗CD3双特异性抗体的药物组合物，其中人源化PSMA结合结构域包含：VH，该VH包含与氨基酸序列SEQ IDNO:82具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与氨基酸序列SEQ ID NO:84具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中人源化CD3结合结构域包含：VH，该VH包含与氨基酸序列SEQ ID NO:100具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与氨基酸序列SEQ ID NO:102具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。例如，本公开包括向患有病症的人类受试者施用治疗有效量的包含抗PSMA x抗CD3双特异性抗体的药物组合物，其中人源化PSMA结合结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:86具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中人源化CD3结合结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:104或110具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
本公开提供了治疗受试者，所述治疗包括向受试者施用治疗有效量的结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体，而不会诱导高水平的细胞因子(例如细胞因子释放综合征)。例如，本公开提供了利用TAA x CD3抗体治疗患者，而不会诱导高水平的IFN-γ、TNF-α、IL-6和/或IL-2。在本文提供的一个方面，本公开提供了用本文提供的TAA x CD3，包括例如用呈ADAPTIR-FLEXTM形式的异二聚体构建体治疗患者，无需共同施用治疗细胞因子释放(例如IFN-γ、TNF-α、IL-6和/或IL-2)所需的药物。例如，本公开提供了用TAA xCD3抗体治疗患者，而不会诱导高水平的颗粒酶B、IL-10和/或GM-CSF。在本文提供的一个方面，本公开提供了用本文提供的TAA xCD3，包括例如用呈ADAPTIR-FLEXTM形式的异二聚体构建体治疗患者，而无需共同施用治疗细胞因子释放(例如颗粒酶、IL-10和/或GM-CSF)所需的药物。
本公开提供了增加受试者体内T细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)的增殖和/或活化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体。本公开提供了增加受试者体内CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖和/或活化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体。
本公开提供了增加受试者体内T细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)的增殖和/或活化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的结合至PSMA和/或CD3的抗体。本公开提供了增加受试者体内的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖和/或活化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的结合至PSMA和/或CD3的抗体。例如，本公开包括增加受试者体内CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖和/或活化的方法，所述方法包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合人PSMA和人CD3的第一多肽链和第二多肽链并且包含与选自SEQ ID NO:106和108、178和108或112和108的组的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
本公开提供了通过接触双特异性抗体或包含结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)的所述双特异性抗体的组合物来诱导针对表达TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)的细胞的重定向T细胞的细胞毒性(RTCC)的方法。
本公开提供了通过接触双特异性抗体或包含所述双特异性抗体的组合物来诱导针对表达PSMA的细胞的重定向T细胞的细胞毒性(RTCC)的方法，其中所述双特异性抗体包含特异性结合人PSMA和人CD3的第一多肽链和第二多肽链，并且包含与选自SEQ ID NO:106和108、178和108或112和108的组的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
在某些方面，受试者是人。
结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体的施用可以是肠胃外施用，包括静脉内施用。
在一些方面，本文提供了结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体，或包含所述抗体的药物组合物，用作药剂。在一些方面，本文提供了结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体，或包含所述抗体的药物组合物，用于治疗癌症的方法中。例如，本公开包括一种包含双特异性抗体的药物组合物，所述双特异性抗体含有人PSMA结合结构域，该人PSMA结合结构域包含：VH，该VH包含与氨基酸序列SEQ ID NO:82具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与氨基酸序列SEQ ID NO:84具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中人CD3结合结构域包含：VH，该VH包含与氨基酸序列SEQ ID NO:100具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与氨基酸序列SEQ ID NO:102具有至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
一方面，本文提供的结合至TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的抗体可用于检测例如生物样品中TAA(例如PSMA、HER2或BCMA)和/或CD3的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些方面，生物样品包含细胞或组织。在某些方面，检测生物样品中PSMA和/或CD3的存在的方法包括使生物样品与本文提供的结合至PSMA和/或CD3的抗体在允许抗体结合的条件下接触，并检测所述抗体与PSMA和/或CD3之间是否形成复合物。
在某些方面，本文提供的结合至PSMA和/或CD3的抗体被标记。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)以及间接检测，例如通过酶促反应或分子相互作用检测的部分，例如酶或配体。
本公开各方面可以通过参照以下非限制性实施例进一步定义，这些实施例详细描述了本公开某些抗体的制备和使用本公开的抗体的方法。本领域一般技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的真实范围的情况下可对材料和方法实行许多修改。
实施例
应理解，本文所述的实施例和方面仅出于说明目的，并且本领域技术人员将想到根据所述实施例和方面的各种修改或变化，这些均包括在本申请的精神和权限的范围之内。
实施例1.具有不同结构和结合价的双特异性蛋白
虽然在表达PSMA的细胞与表达CD3的T细胞之间形成免疫突触的最佳距离和几何形状是未知的，但抗PSMA特异性结合结构域和抗CD3特异性结合结构域的表位是预先确定且不可移动的，故对不同的双特异性结构进行测试以实现免疫突触的最佳形成。除了进行序列改变以调节双特异性构建体中各个结合结构域的亲和力之外，还通过产生并测试具有异二聚体结构的分子来研究几何结构和结合价，所述分子含有一个或两个针对PSMA和CD3的结合结构域并且位于Fc区上的N末端或C末端位置上(图1A-E)。此外，还检查了改变scFv结构域的顺序(VH-VL对比VL-VH)的影响。这些结构变化除了影响ADAPTIRTM的结合亲和力和功能性能外，还会对双特异性蛋白的表达水平和稳定性产生重大影响，并作为本研究的一部分进行检查。
表1：抗PSMA x抗CD3构建体的设计。
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*TSC266对照(PSMA x CD3双特异性蛋白)
实施例2.表达PSMA的CHO细胞和重组细胞外结构域蛋白的产生
定义人和非人灵长类动物PSMA全长和细胞外结构域(ECD)的核苷酸序列是从Genbank数据库获得并列于表2中。
表2.用于产生细胞系和重组蛋白的构建体的SEQ ID NO
| 构建体名称 | 构建体描述 | SEQ ID NO: |
| TSC033 | 人PSMA ECD-AFH | 2 |
| TSC435 | 全长人PSMA | 4 |
| TSC308 | 全长食蟹猴PSMA | 6 |
可溶性人PSMA ECD(HuPSMA-AFH)构建体含有用于纯化、检测和基于生物素的标记目的的C末端标签合成含有HuPSMA-AFH核苷酸序列的DNA构建体，并将其插入适合哺乳动物细胞表达和分泌的表达载体中。将编码全长人和非人灵长类动物全长PSMA蛋白的DNA构建体插入适合细胞表面表达的表达载体中，该表达载体包括施加选择压力以产生稳定转染子的能力。使用这些试剂评估抗PSMA结合结构域与人PSMA的交叉反应性和结合强度，以及用于潜在毒理学评估的物种。使用编码HuPSMA-AFH的DNA表达载体瞬时转染在悬浮培养物中生长的人胚肾成纤维细胞(HEK)-293细胞。培养几天后，通过离心和无菌过滤使条件培养基变澄清。利用固定化金属亲和色谱法(IMAC)，随后尺寸排阻色谱法(SEC)的组合来执行蛋白质纯化。在IMAC捕获步骤后，样品中存在单体和二聚体PSMA的混合物。SEC去除单体PSMA，以及聚集和剪切的产物和其它宿主细胞污染物。SEC还被用于将蛋白质缓冲液交换为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。最终纯度由分析型SEC确定，并且典型地超过90％。如果打算在下周内使用，则对蛋白质批料进行无菌过滤并在4℃储存。否则，将纯PSMA ECD二聚体分数份等分试样在-80℃冰箱中冷冻。
将编码全长人PSMA的质粒DNA用限制酶消化并用乙醇沉淀，然后溶解于超纯水中，接着溶解于Maxcyte电穿孔缓冲液中。通过电穿孔将线性化DNA转染至CHO-K1SV细胞(CDACF-CHO-K1SV细胞(ID代码269-W3)，Lonza Biologics)中。将转染后的细胞从电穿孔杯转移到T75培养瓶中，静置，然后将其小心地再悬浮于含15mL补充有6mM L-谷氨酰胺的CDCHO培养基中。将烧瓶放入37℃、5％ CO2培育箱中，并使其恢复24小时，随后置于选择条件。在转染后的次日，将细胞以1000RPM离心5分钟，并再悬浮于含有1X GS(谷氨酰胺合成酶)补充剂和50μM MSX(甲硫氨酸亚砜亚胺)的CD CHO培养基中。在大量群体从初始选择中恢复后，使用市售试剂评价细胞的表面表达，并将代表性小瓶冷冻。为获得具有不同表达水平的克隆，通过流式细胞术分选细胞，通过有限稀释平板接种，并使其生长2周。在培育期间，使用Clone Select Imager对各孔进行成像，以鉴别生长呈阳性的孔。只有具有良好质量图像的孔被选择用于进一步扩增和通过流式细胞术进行的表面表达的表征。所有克隆都以每个克隆最多30个小瓶的形式冷冻在库中。
实施例3.PSMA-和CD3-结合分子和抗体的一般表达和纯化
通过瞬时转染HEK293或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生本文公开的单特异性和双特异性PSMA结合分子和CD3结合分子。通过离心和/或过滤去除培养物中的细胞、细胞碎片和不溶性物质。使用蛋白质A亲和色谱法(ProA)从澄清的条件培养基中捕获重组同二聚体蛋白。典型地执行制备型尺寸排阻色谱法(Prep SEC)将蛋白质进一步纯化至均质，并将其缓冲液交换成PBS。在每个ProA和Prep SEC纯化步骤后，都在Agilent HPLC上通过分析型尺寸排阻色谱法(分析型SEC)验证蛋白质纯度。
使用瞬时转染的CHO细胞表达异聚蛋白，其中将两条或更多条肽链组装形成可溶性蛋白质复合物，每条肽链使用单独的质粒。在一些情况下，质粒是以相等的比率转染。如果观察到一条肽链的表达明显好于其它肽链，则改变质粒比率以使低表达质粒更大量转染。使用ProA，借助洗涤步骤和低pH洗脱步骤，从细胞培养物上清液中捕获蛋白质。使用Prep SEC去除聚集的蛋白质并将样品交换至PBS中。在一些情况下，执行第二个ProA色谱步骤。用PBS洗涤色谱柱后，使用递减的pH梯度(从中性到酸性)洗脱蛋白质。在一些情况下，使用阳离子交换色谱进一步纯化异二聚体，以去除低分子量同二聚体和未配对的肽链污染物。
在大多数情况下，作为SEC纯化程序的一部分，将最终蛋白质批料缓冲液交换成PBS，调至1mg/mL，无菌过滤并在4℃储存，直到需要或另有说明。使用由氨基酸序列计算的理论消光系数，由280nm处的吸光度确定蛋白质浓度。
使用制造商的说明，用Endosafe PTS仪器确定内毒素水平。这确保了体外活性测定结果不会因内毒素的存在而混淆。使用分析型SEC结合峰面积积分进行样品纯度的定量。在一些情况下，分析型SEC的分辨率不足以将所希望的异二聚体产物与产物相关污染物分开，故使用毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)作为评估产物纯度的辅助方法。将还原型和非还原型SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶与分子量(MW)标准品一起操作，以确认产物的纯度和估计MW。
实施例4.呈scFv形式的PSMA特异性克隆107-1A4的人源化
将小鼠单克隆抗体107-1A4(VH SEQ ID NO:118；VL SEQ ID NO:120)人源化，产生PSMA特异性scFv结合结构域TSC189，即分子TSC266中存在的PSMA01012(VH SEQ ID NO:114；VL SEQ ID NO:116)，如US2018/0100021中所述。虽然TSC189的结合特性，如对PSMA抗原的特异性是令人满意的，但多种生物物理和制造特性被认为是次优的。对呈scFv形式的107-1A4进行再人源化，以优化所有结合、功能和制造特性。人源化分多个阶段执行。利用BioLuminate软件包版本2018-2(Schrodinger,LLC,New York,USA)。基于PDB ID 1JHL创建小鼠克隆107-1A4的同源模型，并使用软件的默认和修改设置鉴别在几何上最适合CDR移植的同源人类构架。产生七种基于不同靶标人种系的初始CDR移植分子，并测试它们与表达全长人PSMA或食蟹猴PSMA的细胞的结合(数据未显示)。随后，使构架残基以集合和集合组合形式发生突变，将小鼠残基转化为人种系重链序列IGHV1-46*01和IGHJ6*01以及轻链序列IGKV1-5*01和IGKJ1*01。含有种系集合G11(SEQ ID NO:30)的分子PSMA01023被鉴别为带有结合和可开发性的最佳组合。最后，为了进一步改善生物物理特性，将抗PSMA scFv中结构域的顺序从VL-VH变为VH-VL并引入突变T10S以去除O连接的糖基化位点。PSMA01071分子的序列与IGHV1-46*01具有91.8％同一性并且与IGKV1-5*01具有89.4％同一性。PSMA特异性结合结构域的VH和VL区的氨基酸比对显示于图2中(107-1A4和人源化抗PSMA结合结构域的序列)。
所有抗体蛋白质工程改造都是在蛋白质序列水平上进行的。由的Integrated DNATechnologies Inc.(Coralville,Iowa USA)，使用其在线基因设计工具合成与设计的蛋白质相对应的基因，以优化在哺乳动物系统中的表达。使用NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒(New England Biolabs，BeverlyMA)或使用例如PCT申请公布号WO 2007/146968、美国专利申请公布号2006/0051844、PCT申请公布号WO 2010/040105、PCT申请公布号WO 2010/003108以及美国专利号7,166,707中大体上公开的标准分子生物学技术和方法，将合成基因相互组合或与表达载体组合。在GENEWIZ(South Plainfield,NJ,USA)，使用Sanger测序验证DNA序列。
实施例5.呈scFv形式的CD3ε特异性克隆CRIS-7的人源化、衰减和优化
将CRIS-7小鼠单克隆抗体(VH SEQ ID NO:122；VL SEQ ID NO:124)人源化，产生CD3ε特异性scFv结合结构域，如见于例如TSC266中的DRA222(VH SEQ ID NO:126；VL SEQID NO:128)和TSC456(VH SEQ ID NO:130；VL SEQ ID NO:132)，如US2018/0273622中所述，该案以引用的方式整体并入本文中。新的人源化策略的目标是尽可能高地增加人氨基酸序列含量的百分比，同时保持尽可能接近亲本克隆CRIS-7的结合和信号特性。
最初减弱CD3ε特异性scFv结构域的结合，同时保持功能性CD 3信号完整的尝试使用了人源化抗CD3εscFv结合结构域(TSC456)并遵循本领域中确立的方案，例如CDR残基的限定性诱变(Balint,R.F.和J.W.Larrick.1993.Antibodyengineering byparsimoni ousmutagenesis.Gene 137:109)。观察到结合亲和力与抗CD3εscFv结合结构域的信号传导功能特性的线性相关性(数据未显示)。
为了规避所观察到的结合和信号传导的线性相关性并鉴别具有非线性特征的变体，尝试进行CRIS-7的再人源化。在本公开各方面中描述的CRIS-7再人源化的目标是尽可能高地增加人氨基酸序列的百分比，增加scFv结构域的热稳定性，降低与CD3ε的结合亲和力，同时保持与亲本分子CRIS-7类似的CD3信号传导特性。这一经验程序包括使用BioLuminate软件包(Schrodinger,LLC,New York,USA)进行多轮分子建模，随后设计并建构呈scFv形式的结合结构域文库，并在结合、信号传导和生物物理稳定性测定中对这些结合结构域进行测试。
除了使构架残基突变外，还使若干CDR残基突变并测试scFv结构域中VH和VL序列的两种顺序。CRIS7H16结合结构域的序列与IGHV1-46*01具有86.6％同一性，并且与IGKV1-39*01具有85.3％同一性。来自小鼠CRIS-7抗体的CD3ε特异性序列和来自分子TSC266的CD3ε特异性序列TSC456以及变体CRIS7H14(VH SEQ ID NO:134；VL SEQ ID NO:136)、CRIS7H15(VH SEQ ID NO:138；VL SEQ ID NO:140)和CRIS7H16(VH SEQ ID NO:142；VL SEQ ID NO:144)的序列以及人种系序列VH(IGHV1-46*01；IGHJ4*01)和VL(IGKV1-39*01；IGKJ1*01)的氨基酸比对显示于图3中(CRIS-7和人源化CD3ε特异性结合结构域的序列)。
实施例6.使用表面等离子体共振确定抗PSMA结合结构域的结合亲和力的方法
在Biacore T200系统上，在25℃下于含有0.2％ BSA缓冲液的dPBS中进行单特异性和双特异性蛋白与重组二聚体PSMA ECD的结合的SPR结合亲和力研究。通过标准胺偶联化学将在10mM乙酸钠pH 5.0中25μg/ml的小鼠抗人IgG(GE,BR-1008-39)以约2,000-4,000个反应单元(RU)的密度固定到CM5研究级传感器芯片(GE)的各个流槽上。用固定化的抗人IgG以10μL/min的流动速率将在含0.2％ BSA缓冲液的dPBS中约40nM的各抗PSMA蛋白捕获于流槽中，持续至多30秒，留下一个流槽表面未修饰作为参照。使用多循环动力学模式，将缓冲液空白和在1nM至243nM范围内的五种不同浓度的ECD以30μL/min依次注射越过每个流槽，其中缔合时间在300-600秒间变化，并且解离时间在600-1200秒间变化。通过以30μL/min的流动速率注射3M MgCl2，持续40秒，随后用含0.2％ BSA缓冲液的dPBS稳定化1分钟来实现再生。
使用双减法分析从动力学SPR测量获得的传感图。从捕获有配体的流槽获得的分析物结合反应中减去来自参照流槽的信号。然后，从分析物结合反应中减去缓冲液空白反应，并使用Biacore T200评价软件(2.0，GE)分析最终双参考的数据，全局拟合数据以得出动力学参数。所有传感图均使用简单的一对一结合模型进行拟合。
使用SPR评价若干单特异性抗PSMA scFv-Fc蛋白对二聚体PSMA ECD的结合亲和力。这一组中的所有scFv均以VL-VH取向构建。与测试的其它构建体相比，PSMA01024和PSMA01025两种变体显示出低得多的结合亲和力(表3)。其余蛋白质均以KD<50nM结合至PSMA，并且与抗PSMA结合结构域PSMA01012类似。
表3.使用Biacore进行的单特异性、二价抗PSMA结合结构域的亲和力测量。
实施例7.细胞系中人PSMA的表达
使用表达人PSMA的细胞系进行PSMA构建体的结合和功能表征。使用以下细胞系：22RV1，人前列腺癌细胞系(ATCC)；C4-2B，雄激素非依赖性人前列腺癌细胞系(Wu等人,1994Int.J.Cancer57:406-12；获自MD安德森癌症中心(Houston,TX)；和用人PSMA稳定转染的CHOK1SV细胞(CHOK1SV/huPSMA)。通过流式细胞术确定这些细胞上的表面PSMA表达水平。
将细胞以每孔约100,000个细胞平板接种于96孔U形底板中，并在4℃下用饱和浓度的缀合PE的抗体进行标记：抗PSMA抗体(LNI-17克隆，Biolegend#342504)和同种型对照(MOPC-21克隆，小鼠IgG同种型，Biolegend#400140)。培育一小时后，洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。所有培育和洗涤均在染色缓冲液(含0.2％BSA和2mM EDTA的PBS缓冲液)中进行。使用BDTM LSR-II流式细胞仪(BD Biosciences)收集样品，并通过FlowJo流式细胞术分析软件进行分析。在排除双细胞(doublet)后，确定细胞上结合的分子的平均荧光强度(MFI)。如制造商所描述，使用QuantibriteTM珠粒(BD Bioscience#340495)确定受体数量。
图4显示人PSMA在22RV1、C4-2B、CHOK1SV/huPSMA和亲本CHOK1SV细胞中的表达水平。图中以每个细胞结合的抗体数(ABC)为单位显示受体水平。平均起来，22RV1细胞表达少于3,000个受体/细胞，而C4-2B细胞表达超过30,000个PSMA受体/细胞，并且CHOK1SV/huPSMA细胞表达约10,000个受体/细胞。因此，22RV1细胞和C4-2B细胞分别是PSMA(低)和PSMA(高)细胞。
实施例8.PSMA结合分子与表达人和食蟹猴PSMA的CHO细胞系的结合
为了测量人源化PSMA结合结构域变体的相对结合活性，在细胞结合测定中以用人或食蟹猴PSMA转染的CHOK1SV细胞测试构建体。前面描述了CHOK1SV/huPSMA细胞的产生；使用相同的方法产生CHOK1SV/cynoPSMA细胞。在这些测定中测试呈scFv-Fc形式的二价PSMA结合结构域变体(构建体PSMA01019、PSMA01020、PSMA01021、PSMA01023、PSMA01024和PSMA01025)。
使用电化学发光(Meso Scale Discovery)，在基于活细胞的ELISA中对CHOK1SV转染子进行结合研究。洗涤CHOK1SV细胞并将其在1XHank平衡盐溶液(HBSS)中以50,000个细胞/孔接种于96孔多阵列高结合板(Meso Scale Discovery)上，并在37℃下培育一小时。在含有20％ FBS的PBS缓冲液中进行封闭步骤后，添加在含有10％ FBS的PBS缓冲液中连续稀释的PSMA结合构建体(从0.002至100nM)，并在室温下培育一小时。用PBS洗涤板，并通过SULFO TAG标记的山羊抗人IgG抗体(Meso Scale Discovery#R32AJ)检测特异性结合水平。在一小时的培育和洗涤步骤后，添加每孔150μL不含表面活性剂的1X Read Buffer T，并在MSD Sector Imager(Meso Scale Discovery)上分析样品。绘制所得电化学发光(ECL)值随浓度变化的图，并在绘图和统计软件中进行非线性回归分析以确定EC50值。
图5显示与亲本构建体PSMA01012相比，人源化PSMA结合结构域构建体PSMA01019、PSMA01020、PSMA01021、PSMA01023、PSMA01024和PSMA01025与人和食蟹猴CHOK1SV/PSMA转染子的结合曲线。构建体PSMA01023对人和食蟹猴PSMA转染子均展示最高的结合强度。
实施例9.评价抗PSMA人源化变体的稳定性以选择优选的结合结构域
除了细胞结合外，还评价构建体PSMA01019、PSMA01020、PSMA01021、PSMA01023、PSMA01024和PSMA01025的生物物理稳定性。纯化后，将样品在PBS缓冲液中配制成1mg/mL。将100μL等分试样分别在4℃、40℃和-20℃储存。在研究开始时，使用分析型SEC确定样品纯度。储存一周后，再次确定纯度百分比。分析前，将-20℃的样品在工作台上解冻。如表4中所示，在4℃和40℃储存一周后，所有样品显示极小的纯度变化。相反，检查送至-20℃冷冻/解冻的样品显示，它们对低温聚集有不同的抗性。PSMA01012因聚集而显示8.9％的纯度降低。PSMA01024也显示纯度的大幅降低(约20％)，而PSMA01023未展现任何可测量的纯度变化。这表明，PSMA01023对冷冻诱导的聚集的抗性高于作为其CDR区来源的亲本构建体PSMA01012。对冷冻期间聚集物形成的抗性是治疗性蛋白质的一个优选特征。
除了评价在4℃、40℃和-20℃的储存稳定性外，还使用差示扫描荧光法测量了第一次解链转变的中点(Tm1)。Tm1被用于反映构建体中的第一个或最不稳定的结合结构域去折叠所需的温度。DSF是使用来自Unchained Laboratories的Uncle仪器执行。使用固有荧光分析在PBS中1mg/mL的样品(不使用另外的染料来评定蛋白质去折叠情况)。亲本构建体PSMA01012的最低记录Tm1是54.5℃，而衍生构建体的值均大于61℃，表明它们都更具热稳定性。储存和DSF数据均支持对PSMA01023的进一步评价。
表4.使用抗PSMA人源化变体获得的稳定性数据
实施例10.呈不同取向的PSMA结合结构域与表达人和食蟹猴PSMA的CHO细胞系的结合
评价呈若干不同结构形式的PSMA结合结构域PSMA01023，包括具有消除效应子功能的不同突变的替代性Fc区。PSMA01023结合结构域被配置为呈VL-VH(PSMA01036)和VH-VL(PSMA01037)取向的sc Fv-Fc形式以及呈VL-VH(PSMA01040)和VH-VL(PSMA01041)取向的Fc-scFv形式。针对scFv结构域的取向(VH-VL对比VL-VH)和在Fc上的位置(N末端对比C末端)对与PSMA(+)肿瘤细胞的结合的影响来评价这些分子。
用在0.1至300nM范围内的PSMA结合构建体的连续稀释液对96孔板中每孔约100,000个细胞的C4-2B细胞和22RV1细胞进行标记，在冰上保持30分钟，随后洗涤，并与PE标记的最小跨物种反应性二次抗体，即山羊抗人IgG Fcγ,F(ab')2(Jackson Laboratory)一起在冰上培育30分钟。洗涤和培育均在染色缓冲液(含0.2％ BSA和2mM EDTA的PBS缓冲液)中进行。使用BDTM LSRII或BD FACSympho nyTM流式细胞仪(BD Biosciences)收集细胞，并通过FlowJo流式细胞术分析软件进行分析。在排除双细胞后，确定细胞上结合的分子的中值荧光强度(MFI)。使用作图。
图6显示各种构建体PSMA01036、PSMA010137、PSMA01040和PSMA01041分别与PSMA(高)和PSMA(低)表达细胞C4-2B和22RV1的结合曲线。PSMA01036代表实施例9中所公开的PSMA01023的密码子优化形式，具有替代性Fc区。如图6中所示，PSMA01023和PSMA01036的结合数据高度相似。还对TSC266和相关构建体的结合情况进行评价，TSC266含有抗PSMA结构域的亲本形式PSMA01023。总体而言，当PSMA结合结构域呈scFv-Fc形式(PSMA01036和PSMA01037)时，观察到比Fc-scFv形式(PSMA01040和PSMA01041)更好的结合。当以scFv-Fc形式存在时，呈VL-VH取向的PSMA结合结构域(PSMA01036)展示出略高于呈VH-VL取向的PSMA结合结构域(PSMA01037)的最大结合。因此，选择将PSMA01036和PSMA01037结构域并入抗PSMA x抗CD3双特异性构建体中。
实施例11.抗TA x抗CD3ε二价和单价构建体与CD3(+)细胞的结合
为了测试功能，将人源化和亲和力优化的CD3ε结合结构域变体H14、H15和H16与肿瘤抗原(TA)结合结构域融合。构建体被设计成与TA具有二价结合，并与CD3ε具有二价或单价结合。CD3ε在T细胞谱系的细胞上作为TCR/CD3复合物的一部分表达，并且CD3ε的表面表达需要完整TCR/CD3复合物的存在。因此，在CD3ε结合测定中使用表达功能性T细胞受体的人T淋巴母细胞Jurkat细胞系(克隆E6-1，ATCC)测试所设计的抗TA x CD3ε构建体。构建体具有突变的Fc，以消除Fc与Fcγ受体的相互作用。
用浓度在0.1至400nM范围内的双特异性构建体的连续稀释液对96孔板中每孔约100,000个细胞的Jurkat细胞进行标记，在冰上保持30分钟。在初次标记后进行洗涤，并将其与PE标记的最小跨物种反应性二次抗体，即山羊抗人IgG Fcγ,F(ab')2(JacksonLaboratory)一起在冰上培育30分钟。洗涤和培育均在染色缓冲液(含0.2％ BSA和2mMEDTA的PBS缓冲液)中进行。使用BDTM LSRII或BD FACSymphonyTM流式细胞仪(BDBiosciences)收集细胞，并通过FlowJo流式细胞术分析软件进行分析。在排除双细胞后，确定细胞上结合的分子的中值荧光强度(MFI)。将结果作图并使用 绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
图7A显示呈二价和单价形式的H14和H15结合结构域构建体的结合曲线。包括具有高亲和力CD3ε结合并且对TA和CD3靶标是二价的对照抗TA x CD3ε双特异性构建体TRI130用于比较。当与TRI130相比较时，呈二价形式的H14和H15结合结构域(分别为TRI01046和TRI01043)均对Jurkat细胞显示出降低的结合亲和力。正如预期的那样，当H14和H15以单价形式(分别为TRI01044和TRI01045)存在时，对Jurkat细胞的结合效力进一步降低。图7B显示H14和H16结合结构域构建体的结合曲线。用单价形式的含H16构建体(TRI01044和TRI01047)观察到对Jurkat细胞的类似地较低结合。
总之，H14、H15和H16人源化抗CD3结合结构域对表达CD3ε的细胞显示出降低的结合亲和力；正如预期的那样，当结合结构域以单价形式存在时，其总体亲和力要低于二价形式。
实施例12.响应于单价和二价抗TA x抗CD3ε构建体的人T细胞活化、增殖和针对靶标细胞的细胞毒性
为了诱导肿瘤排斥，靶向肿瘤的抗CD3ε双特异性分子引起T细胞的活化和增殖，以及针对表达TA的靶标细胞的细胞毒性。将带有H14、H15和H16 CD3结合结构域的亲和力优化的抗TA x CD3ε构建体在诱导靶标依赖性T细胞活化和增殖方面的有效性与未优化的TRI130构建体的有效性相比较。构建体具有突变的Fc，以消除Fc与Fcγ受体的相互作用。
使用从PBMC分离的人T细胞评估T细胞活化和增殖。PBMC是从健康志愿者获得，并使用标准密度梯度离心分离。分离的PBMC在分离后或从冷冻保存的细胞库解冻后立即使用。根据制造商的说明，使用阴性分离试剂盒(全T细胞分离试剂盒，Mi ltenyibiotec#130-096-535)分离T细胞。
对于活化测定，将T细胞以约100,000个细胞/孔与30,000个TA(+)细胞/孔一起平板接种于U形底的96孔板中，以实现约3:1的T细胞与肿瘤细胞比率。将浓度范围为0.02至2,000pM的测试分子的连续稀释液添加到在补充有10％胎牛血清(FBS,SIGMA)、丙酮酸钠、抗生素和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中的细胞混合物中达到每孔200μl的最终体积。将板在37℃、5％ CO2的加湿培育箱中培育。20至24小时后，在4℃下，使用含有0.1％牛血清白蛋白和2mM EDTA的盐水缓冲液，在原始板中以用于流式细胞术分析的抗体标记细胞以最大限度地减少细胞损失。离心并去除上清液后，将细胞沉淀再悬浮于50μl含有荧光标记的针对表面抗原CD5、CD8、CD4、CD25和CD69的抗体(Biolegend)以及活性染料7AAD(SIGMA)的混合物的体积中，并在冰上培育30分钟。将细胞洗涤两次并立即再悬浮，随后在BDTM LSRII或BD FACSymphonyTM流式细胞仪(BD Biosciences)中采集每孔50％的内含物。使用FlowJo软件分析样品文件，通过依序基于前向散射与侧向散射对7AAD-,CD5+,CD4+或CD8+T细胞(分别为7AAD-,CD5+CD4+或7AAD-CD5+CD8+)设门来计算具有上调的CD69和CD25的CD4+或CD8+T细胞的百分比。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
为了评估T细胞增殖，将T细胞用CellTraceTM Violet染料(CTV，Thermofisher)标记。如以上T细胞活化测定中所描述，将CTV标记的T细胞以约100,000个细胞/孔与30,000个TA(+)肿瘤细胞/孔分别平板接种于U形底的96孔板中，以实现约3:1的T细胞与肿瘤细胞比率。将板在37℃、5％ CO2的加湿培育箱中培育。4天后，在4℃下，使用含有0.2％牛血清白蛋白和2mM EDTA的盐水缓冲液，在原始板中以用于流式细胞术分析的抗体标记细胞以最大限度地减少细胞损失。离心并去除上清液后，将细胞沉淀再悬浮于50μl含有荧光标记的针对表面抗原CD5、CD8、CD4和CD25的抗体(Biolegend)以及活性染料7AAD(SIGMA)的混合物的体积中，并在冰上培育30分钟。将细胞洗涤两次并立即再悬浮，随后在BDTM LSRII或BDFACSymphonyTM流式细胞仪(BD Biosciences)中采集每孔50％的内含物。使用FlowJo软件分析样品文件，根据T细胞的CTV特征，通过依序基于前向散射与侧向散射对7AAD-,CD5+,CD4+或CD8+T细胞(分别为7AAD-,CD5+CD8-或7AAD-CD5+CD8+)设门来计算经历至少一次细胞分裂的CD4+(CD8-)或CD8+T细胞的百分比。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
为了评估细胞毒性功能，如上文关于增殖测定所描述进行测定，不同之处在于活靶标细胞的部分是通过依序基于前向散射与侧向散射对7AAD-和CD5-细胞设门来鉴别。
图8显示通过CD69和CD25上调所定义的CD4+和CD8+T细胞的活化。图8A显示，带有H14和H15 CD3结合结构域的呈二价形式的双特异性构建体(TRI1046和TRI01043)显示出比TRI130对照略低的EC50，并且当以单价形式(TRI01044和TRI01045)存在时显示出进一步降低的效力。图8B显示，与TRI130对照构建体相比，带有H14和H16 CD3结合结构域的单价构建体显示出相似的降低的效力。然而，所有构建体都诱导相似的最大水平的T细胞活化。
图9显示通过CTV染料稀释定义的CD4和CD8 T细胞的增殖情况。与TRI130对照构建体相比，带有H14或H16 CD3结合结构域的呈单价形式的双特异性抗TA x CD3ε构建体诱导略微减弱的T细胞增殖。然而，所有构建体都诱导相似的最大水平的T细胞增殖。
在96小时的时候，通过流式细胞术评估针对TA(+)肿瘤细胞的重定向T细胞的细胞毒性。图10显示，与TRI130相比，带有H14或H16 CD3结合结构域的呈单价形式的双特异性抗TA x CD3ε构建体显示出降低的效力，但它们都显示出等效的最大肿瘤生长抑制作用。
总之，亲和力优化的H14、H15和H16 CD3结合结构域显示出对T细胞系上的CD3的减少的结合。正如预期的那样，在单价形式下观察到与CD3的最低结合。然而，带有H14、H15和H16的单价构建体诱导稳健的T细胞活化和增殖以及高效的针对靶标细胞的细胞毒性，显示出与对照构建体相比略微降低的效力但相似的最大值。
实施例13.各种形式的抗PSMA x抗CD3ε构建体与PSMA(+)和CD3(+)细胞的结合
产生呈若干形式和价(单价和二价)的抗PSMA x抗CD3ε构建体，以确定诱导所希望功能的最佳配置。使用人源化和亲和力优化的CD3结合结构域H16以及优化的PSMA结合结构域PSMA01036和PSMA01037建构这些构建体。目标是获得与单独T细胞(CD3ε)具有有限的结合，但在表达PSMA的细胞存在下与T细胞发生较强功能相互作用的构建体。
抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01026、PSMA01070、PSMA01071、PSMA01072和PSMA01086最初在针对Jurkat细胞和C4-2B细胞的CD3ε和PSMA结合测定中进行测试。
用浓度在0.1至300nM范围内的双特异性构建体的连续稀释液对96孔板中每孔约100,000个细胞的Jurkat细胞和C4-2B细胞进行标记，在冰上保持30分钟。在初次标记后进行洗涤，并将其与PE标记的最小跨物种反应性二次抗体，即山羊抗人IgG Fcγ,F(ab')2(Jackson Laboratory)一起在冰上培育30分钟。洗涤和培育均在染色缓冲液(含0.2％ BSA和2mM EDTA的PBS缓冲液)中进行。使用BDTM LSRII或BD FACSymphonyTM流式细胞仪(BDBiosciences)收集细胞，并通过FlowJo流式细胞术分析软件进行分析。在排除双细胞后，确定细胞上结合的分子的中值荧光强度(MFI)。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
图11显示抗PSMA x抗CD3ε构建体与C4-2B细胞和Jurkat细胞的结合曲线。在C4-2B细胞上(图11A)，具有单价PSMA结合的构建体(PSMA01026和PSMA01070)展示出不如具有二价PSMA结合的构建体(PSMA01071、PSMA1072和PSMA01086)强效的结合。VH取向交换但其它方面相同的形式的构建体(PSMA01026和PSMA01070)显示出相当的PSMA结合。在Jurkat细胞上(图11B)，观察到一系列结合效力。与所有单价CD3结合物相比，二价CD3结合结构域(PSMA01072)显示出最强的结合。当CD3结合结构域位于C末端(PSMA01071和PSMA01086)时，与N末端(PSMA01026和PSMA01070)相比，单价CD3结合物显示出较弱的结合。将CD3结合结构域的取向从VH-VL(PSMA01071)换成VL-VH(PSMA01086)，进一步减少与位于C末端的CD3的结合。最大CD3结合信号在各构建体之间存在差异，其中N末端CD3结合结构域构建体显示出最高的最大结合。然而，效力(EC50)而不是最大结合与功能相关，这将在下一个实施例中显示。
总之，CD3结合结构域的形式和VH取向对于抗PSMA x抗CD3构建体的结合效力具有深远影响。与CD3具有最低结合的构建体是在构建体的C末端带有单价形式的CD3结合结构域的构建体。
实施例14：响应于呈各种形式的抗PSMA x抗CD3ε构建体的人T细
胞活化和增殖、细胞因子释放和针对靶标细胞的细胞毒性
将呈不同形式的抗TA x CD3ε构建体诱导靶标依赖性T细胞活化和增殖的有效性与未优化的TSC266亲本构建体的有效性相比较。
以下测定是在具有未分离的人PBMC的培养物中评估。从健康志愿者获得PBMC并使用标准密度梯度离心分离，并在分离后或从冷冻保存的细胞库解冻后立即使用。构建体具有突变的Fc，以消除Fc与Fcγ受体的相互作用。
对于活化测定，将PBMC以约100,000个细胞/孔与或不与30,000个C4-2B细胞/孔一起平板接种于U形底的96孔板中，以实现约3:1的T细胞与肿瘤细胞比率。将浓度范围为0.02至2,000pM的测试分子的连续稀释液添加到在补充有10％ FBS(SIGMA)、丙酮酸钠、抗生素和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中的细胞混合物中达到每孔200μl的最终体积。对照孔接受抗CD3(OKT3克隆，Biolegend,Ultra-LEAF)和抗CD28(克隆CD28.2，Biolegend,Ultra-LEAF)。将板在37℃、5％ CO2的加湿培育箱中培育。20至24小时后，在4℃下，使用含有0.1％牛血清白蛋白和2mM EDTA的盐水缓冲液，在原始板中以用于流式细胞术分析的抗体标记细胞以最大限度地减少细胞损失。离心并去除上清液后，将细胞沉淀再悬浮于50μl含有荧光标记的针对表面抗原CD5、CD8、CD4、CD25和CD69的抗体(Biolegend)以及活性染料7AAD(SIGMA)的混合物的体积中，并在冰上培育30分钟。将细胞洗涤两次并立即再悬浮，随后在BDTM LSRII或BD FACSymphonyTM流式细胞仪(BD Biosciences)中采集每孔50％的内含物。使用FlowJo软件分析样品文件，通过依序基于前向散射与侧向散射对7AAD-,CD5+,CD4+或CD8+T细胞(分别为7AAD-,CD5+CD4+或7AAD-CD5+CD8+)设门来计算具有上调的CD69和CD25的CD4+或CD8+T细胞的百分比。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
为了定量细胞因子释放，在细胞标记前20至24小时，收集来自活化测定的培养物上清液。根据制造商的说明，使用多重分析物测定法(Milliplex细胞因子试剂盒，Millipore/SIGMA)确定所选细胞因子(例如IFNγ、IL-2、TNFα和IL-6)的水平。使用MAGPIXTM仪器(Thermofisher)收集处理过的样品。使用绘图和统计软件对结果作图。
为了评估T细胞增殖情况，将T细胞用CellTraceTMViolet(CTV)染料(Thermofisher)标记。如以上关于T细胞活化测定所描述，将CTV标记的T细胞以约100,000个细胞/孔与30,000个C4-2B肿瘤细胞/孔一起平板接种于U形底的96孔板中，以实现约3:1的T细胞与肿瘤细胞比率。将板在37℃、5％ CO2的加湿培育箱中培育。4天后，在4℃下，使用含有0.2％牛血清白蛋白和2mM EDTA的盐水缓冲液，在原始板中以用于流式细胞术分析的抗体标记细胞以最大限度地减少细胞损失。离心并去除上清液后，将细胞沉淀再悬浮于50μl含有荧光标记的针对表面抗原CD5、CD8、CD4和CD25的抗体(Biolegend)以及活性染料7AAD(SIGMA)的混合物的体积中，并在冰上培育30分钟。将细胞洗涤两次并立即再悬浮，随后在BDTM LSRII或BD FACSymphonyTM流式细胞仪(BD Biosciences)中采集每孔50％的内含物。使用FlowJo软件分析样品文件，根据T细胞的CFSE特征，通过依序基于前向散射与侧向散射对7AAD-,CD5+,CD4+或CD8+T细胞(分别为7AAD-,CD5+CD8-或7AAD-CD5+CD8+)设门来计算经历至少一次细胞分裂的CD4+(CD8-)或CD8+T细胞的百分比。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
为了评估针对靶标细胞的细胞毒性，通过C4-2B靶标细胞的荧光素酶表达来测量其活力。使用RediFectTMRed-FLuc-嘌呤霉素慢病毒颗粒(PerkinElmer)转导C4-2B细胞以表达萤火虫荧光素酶。将约60,000个PBMC/孔与12,000个C4-2B-荧光素酶细胞/孔在96孔黑底板(Corning#4591)中共培养。将浓度范围为1至1,000pM的测试分子的连续稀释液添加到补充有10％ FBS(SIGMA)、丙酮酸钠、抗生素和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中的细胞混合物中达到每孔200μl的最终体积。将板在37℃、5％ CO2的加湿培育箱中培育至多96小时。从培育箱中取出细胞，并将20μl以1:10稀释的荧光素试剂(D-荧光素萤火虫，PerkinElmer#122799)添加到每个孔中。将板盖上并在室温下培育10分钟。在MicroBeta读板器(PerkinElmer)上收集冷光信号。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
在24小时的时候，评估通过CD69和CD25上调所定义的由抗PSMA x抗CD3构建体诱导的CD4+和CD8+T细胞活化。在C4-2B靶标细胞的存在下(图12A)，所有构建体以不同效力诱导稳健的T细胞活化。与CD3和PSMA靶标具有二价结合的两种构建体(亲本构建体TSC266和PSMA01072)显示出最高的效力，而PSMA01086构建体的效力最低。这一评级与细胞结合结果中的评级相关。然而，所有构建体都诱导相似的最大T细胞活化水平，与诱导最佳T细胞活化的OKT3/CD28抗体对照所达到的水平相当。在没有靶标细胞的情况下(图12B)，没有可测量的T细胞活化。相比之下，取决于人类供体，未优化的亲本构建体TSC266显示出不同的T细胞活化水平(图12B并且数据未显示)。
细胞因子在T细胞活化期间分泌。对上述T细胞活化测定中培养物上清液中分泌的细胞因子水平进行定量(图13)。在N末端具有CD3结合结构域的构建体无论是二价(TSC266和PSMA01072)的还是单价(PSMA01071和PSMA01086)的，都诱导低于在C末端具有CD3结合结构域的构建体(PSMA01026和PSMA01070)的细胞因子分泌水平。尽管事实上后者对于CD3结合结构域是单价的。这与之前的观察结果一致，表明在ADAPTIRTM形式内CD3结合结构域的定位影响功能(Hernandez-Hoyos等人,Mol Cancer Ther.(2016)15:2155-65)。
在96小时的时候，所有抗PSMA x CD3构建体还诱导T细胞增殖(图14)。TSC266显示出最高的效力，而PSMA01086的效力最低，这与T细胞活化测定中的评级相关。再一次，所有构建体都诱导大多数CD4和CD8 T细胞的增殖。
使用C4-2B作为靶标细胞进行的细胞毒性测定展示出一系列效力(图15)。与CD3和PSMA靶标具有二价结合的两种构建体(亲本构建体TSC266和PSMA01072)显示出最高的效力，而PSMA01086构建体的效力最低，这与T细胞活化和增殖测定中的效力相关。阴性对照ADAPTIRTM TRI149显示对C4-2B细胞生长没有影响。
从这些实施例中可以得出四个主要结论。1)CD3结合与功能之间存在相关性，其中较低的CD3结合效力引起较低的T细胞活化、增殖和针对靶标的细胞毒性效力。2)在T细胞:靶标细胞相互作用期间，由于该相互作用的多价性，CD3亲和力的显著变化可被减弱，由此补偿对CD3的低亲和力。功能的减弱与结合效力的降低不成比例，例如：比较PSMA01072相对于PSMA1071的约200倍结合降低使得T细胞活化和增殖降低约3倍，以及细胞毒性活性降低约10倍(这些都是近似计算值)。3)尽管效力较低，但所有构建体(具有高或低CD3亲和力)均诱导最大水平的T细胞活化、增殖和细胞毒性。这可能取决于CD3亲和力而达到一个极限，并且会受到PSMA结合亲和力的影响。4)细胞因子分泌水平与CD3结合结构域位于N末端还是C末端相关。
实施例15：响应于抗PSMA x抗CD3ε双特异性蛋白治疗的抗肿瘤功效
在使用人T细胞作为效应细胞的预防性异种移植肿瘤模型中，在体内评估抗PSMAx CD3ε构建体的功能和效力。
在研究开始前，使来自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)的雄性NOD/scid小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J)适应一周。每天检查动物的一般健康状况。研究动物的治疗符合实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals)中规定的条件，并且研究方案获得机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee，IACUC)的批准。
使用RediFectTMRed-FLuc-嘌呤霉素慢病毒颗粒(PerkinElmer)转导C4-2B-luc细胞以表达萤火虫荧光素酶，由此能够进行体内定量。将C4-2B-luc细胞解冻并在培养物中扩增。使用全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从冷冻的leukopak PBMC中分离出人T细胞。在第0天，通过将在100μL 50％高含量基质胶(high Content Matrigel，Corning)中的2×106个C4-2B-luc人前列腺癌细胞与1×106个人leukopak T细胞的混合物皮下注射至NOD/scid小鼠的右侧腹上来攻击小鼠。从肿瘤攻击后2小时开始，用媒剂(PBS)、每只小鼠3μg和0.3μg剂量的TSC266和PSMA01072(n＝10只/组)或每只小鼠30μg、3μg和0.3μg剂量的PSMA01070和PSMA01071(n＝10只/组)治疗小鼠。在第0天、第4天和第8天进行静脉内治疗。通过使用光谱成像仪(PerkinElmer)进行生物发光成像(BLI)并每周三次用测径器测量来监测肿瘤生长。使用Living/>软件4.5.5版(PerkinElmer)计算肿瘤生物发光。使用自动ROI(感兴趣区域)选择个别肿瘤，阈值设置为5％。生物发光成像(BLI)值以光子/秒表示并通过log10转换。无肿瘤动物分配BLI值为4，刚好低于检测水平的log10值。
使用SAS/JMP软件(SAS Institute)执行统计分析。在体内研究中，使用拟合模型标准最小二乘法(Fit Model Standard Least Squares)拟合重复测量ANOVA模型以评价治疗、天数和以天计的治疗相互作用对肿瘤体积的总体影响。使用LSMeans平台，通过Tukey多重比较检验评价皮下异种移植模型的治疗组之间肿瘤大小的显著差异，并根据需要，使用LSMeans Tukey多重比较检验评价每个以天计的治疗组合的其它时间和治疗组合。
在NOD/scid小鼠中，经生物发光确定，用所有抗PSMA x抗CD3ADAPTIRTM分子治疗引起C4-2B-luc肿瘤生长的统计显著减少(图16和图17；表5)。在仅接受单次注射后第4天的第一个成像时间点观察到肿瘤生物发光减少。在治疗过程中观察到肿瘤生物发光的进一步减少。每只小鼠0.3μg剂量的治疗不如每只小鼠3μg和30μg剂量的治疗有效。因此，在C4-2B-luc攻击的小鼠中，用所有PSMA x CD3ADAPTIRTM分子治疗引起肿瘤体积的统计显著减少并防止肿瘤的外生长(图16和图17；表5)。
使用JMP重复测量分析和Tukey多重比较检验来确定研究组从第4天到第40天的平均肿瘤生物发光差异。p值<0.05被认为是显著的。
表5：到第4天时平均log10肿瘤生物发光的统计比较
实施例16：消除与Fc受体和补体的结合的Fc突变
在ADAPTIRTM双特异性分子中，使Fc区突变以消除与Fc受体和补体相互作用以及通过所述相互作用进行信号传导的能力可能是有利的。下表6显示与野生型Fc(WT)的序列相比，可以对ADAPTIRTM双特异性构建体(TSC1007)中包括的Fc区进行的突变。
表6.降低效应子功能和补体结合的ADAPTIRTM双特异性构建体的Fc突变。
实施例17：有关Fc突变对与Fcγ受体结合的影响的SPR分析
并入抗PSMA双特异性构建体中的Fc区含有旨在减少或消除与常见人和食蟹猴Fcγ受体结合的突变。SPR实验是在25℃下，在Biacore T200系统上含0.2％ BSA缓冲液的HBS-EP+中进行的，用于评价这些突变对结合的影响。对于这些实验，将CM5传感器芯片的三个流槽通过标准胺偶联，用抗PSMA双特异性抗体固定，达到约2000RU的反应水平。为了减去背景信号，对流槽#1执行空白固定。人和食蟹猴Fcγ受体(购自R&D Systems)均在含有0.2％ BSA的HBS-EP+中稀释至4-6μM，然后作为分析物以30μL/min流动120秒，随后进行240秒的解离步骤。不需要再生步骤。目视检查减去空白的传感图以了解与每种Fcγ受体蛋白的结合。如表7中所示，PSMA01107和PSMA01108展现出不可检测的与人Fcγ受体I、IIIA(均为多形性变体)或IIIB的结合。BLOD指示，结合信号(如果有的话)低于检测限。观察到与Fcγ受体IIA(均为多形性变体)和IIB/C的结合减弱。PSMA01107和PSMA01108共有相同的Fc氨基酸序列，并因此预期具有等效的Fcγ受体结合行为。
在Biacore T200系统上，使用与上述相同的实验条件并在多循环动力学模式中添加从375-6000nM的五点滴定的Fcγ受体，测量PSMA01107与II型Fcγ受体的结合亲和力。还分析了TSC266(PSMA x CD3双特异性抗体)和另一种含有野生型IgG1 Fc序列的蛋白质以进行比较。在Biacore T200评价软件中，通过双减法分析从动力学SPR测量获得的传感图。动力学参数是由一对一结合拟合模型得到，并报导于下表8中。与野生型IgG1 Fc相比，TSC266和PSMA01107均显示出降低的结合。PSMA01107中存在的Fc突变看来更有效地减弱IIA型R167与RIIB/C Fcγ受体之间的相互作用，而对RIIA H167变体的结合亲和力是相当的。
表7.人Fcγ受体结合的结果总结
表8.与人Fcγ受体的结合亲和力。
还评价了三种不同的PSMA x CD3双特异性蛋白与重组、可溶性非人灵长类动物Fcγ受体的结合。当可溶性受体以一定浓度注射时，TSC266、PSMA01107和PSMA01108未显示任何可检测的结合(表9)。
表9.Cyno Fcγ受体结合的结果总结
实施例18：有关与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的SPR实验
新生儿Fc受体FcRn通过减少细胞溶酶体区室中的降解而引起免疫球蛋白和含Fc蛋白的血清半衰期延长。为了使FcRn正确结合免疫球蛋白，它必须与另一种蛋白质β-2-巨球蛋白形成复合物。为简单起见，这一复合物在本文其余部分将仅称为FcRn。IgG和其它血清蛋白通过胞饮作用不断被细胞内化。它们从核内体转运到溶酶体进行降解。然而，血清白蛋白和IgG在囊泡中存在的酸性条件下与FcRn结合并避开溶酶体。在返回细胞表面后，IgG在中性pH下无法与FcRn结合，并被释放回循环中。这一再循环使IgG具有>7天的血清半衰期，但会受到其它血清清除机制(靶标介导的处置、降解、聚集等)的影响。
对于含有Fc区的抗体样蛋白质治疗剂，它们在酸性条件下与FcRn结合至关重要。使用SPR，在pH 6.0下评价具有不同Fc突变的PSMA x CD3双特异性构建体与FcRn的结合以验证突变不会影响在酸性条件下FcRn的结合。
通过用含有FcRn和β-2-巨球蛋白基因的双顺反子载体瞬时转染HEK-293细胞产生重组FcRn/b2M蛋白。使用IMAC色谱法纯化复合物，随后在通过分析型SEC验证IMAC洗脱液的纯度后，将缓冲液交换为PBS缓冲液。通过直接胺偶联化学将10mM乙酸钠(pH 5.0)中5μg/ml的纯化的hFcRn/b2M固定于CM5芯片上，达到约400RU的水平。参考流槽留空。
按随机顺序以30μL/min注射不同浓度的Fc变体蛋白(1-81nM，在pH 6.0的含0.2％BSA操作缓冲液的HBS-EP+中稀释3倍)，保持180秒，随后为180秒的解离期，包括操作缓冲液作为空白。通过在pH 7.5下以30μL/min的流动速率两次注射含0.2％ BSA的HBS-EP+，保持30秒，然后用操作缓冲液稳定1分钟，实现最佳再生。
使用双减法分析从动力学SPR测量获得的传感图。从固定有配体的流槽获得的分析物结合反应中减去来自参照流槽的信号。从分析物结合反应中减去缓冲液参照，并使用Biacore T200评价软件(2.0，GE)分析最终的双参考数据，全局拟合数据以得出动力学参数。如Weirong Wang等人,Drug Metab Dispos.:39(9):1469-77(2011)中所述，使用双态反应模型拟合所有传感图。稳态亲和模型也被用于比较目的并得到相似的值。
如下表10中所示，PSMA x CD3双特异性抗体的KD值在与文献中报导的含有野生型IgG1 Fc的单克隆抗体的KD值一致的范围内。
表10：ADAPTIRTM PSMA x CD3双特异性抗体的FcRn解离常数(KD)
实施例19：有关PSMA x CD3双特异性蛋白与重组PSMA ECD的结合的SPR评价
使用SPR确定一组PSMA x CD3双特异性蛋白与重组二聚体PSMA ECD的结合的KD。与表3中分析的均具有呈VL-VH取向的抗PSMA scFv的构建体相比，表11中的构建体具有可变结构域顺序相反的序列。以下构建体利用PSMA01023抗PSMA序列作为基础。反向取向的scFv引起明显比PSMA01023更紧密的结合，后者被确定具有40nM的KD。PSMA01107和PSMA01108均以<10nM的结合亲和力结合。
表11.有关优化的抗PSMA结合结构域的Biacore亲和力测量。
| 名称 | KD(nM) | ka(1/Ms) | kd(1/s) |
| PSMA01107 | 3.4 | 2.9E+04 | 8.5E-05 |
| PSMA01108 | 3.1 | 2.9E+04 | 9.0E-05 |
实施例20：PSMA x CD3双特异性蛋白的体外评价
接下来，评价Fc区改变的抗PSMA x CD3ε构建体(PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110)诱导靶标依赖性T细胞活化和增殖的能力，所述Fc区改变旨在降低Fcγ受体结合。
构建体最初在CD3ε和PSMA结合测定中针对Jurkat和C4-2B细胞进行测试。用浓度在0.1至300nM范围内的双特异性构建体的连续稀释液对96孔板中每孔约100,000个细胞的细胞进行标记，在冰上保持30分钟。在初次标记后进行洗涤，并将其与PE标记的最小跨物种反应性二次抗体，即山羊抗人IgG Fcγ,F(ab')2(Jackson Laboratory)一起在冰上培育30分钟。洗涤和培育均在染色缓冲液(含0.2％ BSA和2mM EDTA的PBS缓冲液)中进行。使用BDTMLSRII或BD FACSymphonyTM流式细胞仪(BD Biosciences)收集细胞，并通过FlowJo流式细胞术分析软件进行分析。在排除双细胞后，确定细胞上结合的分子的中值荧光强度(MFI)。将结果作图并使用 绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
对于活化测定，将PBMC以约100,000个细胞/孔与或不与30,000个C4-2B细胞/孔一起平板接种于U形底的96孔板中，以实现约3:1的T细胞与肿瘤细胞比率。将浓度范围为0.02至2,000pM的测试分子的连续稀释液添加到在补充有10％ FBS(SIGMA)、丙酮酸钠、抗生素和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中的细胞混合物中达到每孔200μl的最终体积。对照孔接受抗CD3(OKT3克隆，Biolegend,Ultra-LEAF)和抗CD28(克隆CD28.2，Biolegend,Ultra-LEAF)。将板在37℃、5％ CO2的加湿培育箱中培育。20至24小时后，在4℃下，使用含有0.1％牛血清白蛋白和2mM EDTA的盐水缓冲液，在原始板中以用于流式细胞术分析的抗体标记细胞以最大限度地减少细胞损失。离心并去除上清液后，将细胞沉淀再悬浮于50μl含有荧光标记的针对表面抗原CD5、CD8、CD4、CD25和CD69的抗体(Biolegend)以及活性染料7AAD(SIGMA)的混合物的体积中，并在冰上培育30分钟。将细胞洗涤两次并立即再悬浮，随后在BDTM LSRII或BD FACSymphonyTM流式细胞仪(BD Biosciences)中采集每孔50％的内含物。使用FlowJo软件分析样品文件，通过依序基于前向散射与侧向散射对7AAD-,CD5+,CD4+或CD8+T细胞(分别为7AAD-,CD5+CD4+或7AAD-CD5+CD8+)设门来计算具有上调的CD69和CD25的CD4+或CD8+T细胞的百分比。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
为了定量细胞因子释放，在细胞标记前20至24小时，收集来自活化测定的培养物上清液。根据制造商的说明，使用多重分析物测定法(Milliplex细胞因子试剂盒，Millipore/SIGMA)确定所选细胞因子(例如IFNγ、IL-2、TNFα和IL-6)的水平。使用MAGPIXTM仪器(Thermofisher)收集处理过的样品。使用绘图和统计软件对结果作图。
为了评估T细胞增殖情况，将T细胞用CellTraceTM Violet(CTV)染料(Thermofisher)标记。如以上关于T细胞活化测定所描述，将CTV标记的T细胞以约100,000个细胞/孔与30,000个C4-2B肿瘤细胞/孔一起平板接种于U形底的96孔板中，以实现约3:1的T细胞与肿瘤细胞比率。将板在37℃、5％ CO2的加湿培育箱中培育。4天后，在4℃下，使用含有0.2％牛血清白蛋白和2mM EDTA的盐水缓冲液，在原始板中以用于流式细胞术分析的抗体标记细胞以最大限度地减少细胞损失。离心并去除上清液后，将细胞沉淀再悬浮于50μl含有荧光标记的针对表面抗原CD5、CD8、CD4和CD25的抗体(Biolegend)以及活性染料7AAD(SIGMA)的混合物的体积中，并在冰上培育30分钟。将细胞洗涤两次并立即再悬浮，随后在BDTM LSRII或BD FACSymphonyTM流式细胞仪(BD Biosciences)中采集每孔50％的内含物。使用FlowJo软件分析样品文件，根据T细胞的CFSE特征，通过依序基于前向散射与侧向散射对7AAD-,CD5+,CD4+或CD8+T细胞(分别为7AAD-,CD5+CD8-或7AAD-CD5+CD8+)设门来计算经历至少一次细胞分裂的CD4+(CD8-)或CD8+T细胞的百分比。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
为了评估靶标细胞的细胞毒性，通过C4-2B靶标细胞的荧光素酶表达来测量其活力。使用RediFectTMRed-FLuc-嘌呤霉素慢病毒颗粒(PerkinElmer)转导C4-2B细胞以表达萤火虫荧光素酶。将约60,000个PBMC/孔与12,000个C4-2B-荧光素酶细胞/孔在96孔黑底板(Corning#4591)中共培养。将浓度范围为1至1,000pM的测试分子的连续稀释液添加到补充有10％ FBS(SIGMA)、丙酮酸钠、抗生素和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中的细胞混合物中达到每孔200μl的最终体积。将板在37℃、5％ CO2的加湿培育箱中培育至多96小时。从培育箱中取出细胞，并将20μl以1:10稀释的荧光素试剂(D-荧光素萤火虫，PerkinElmer#122799)添加到每个孔中。将板盖上并在室温下培育10分钟。在MicroBeta读板器(PerkinElmer)上收集冷光信号。将结果作图并使用绘图和统计软件执行非线性回归分析以确定EC50值。
图18A-E显示抗PSMA x抗CD3ε构建体对C4-2B、Jurkat细胞和CHO-CynoPSMA细胞的结合曲线。尽管所有构建体对于PSMA结合都是二价的，但TSC266展示不如PSMA01107、PSMA01108或PSMA01110强效的与表达PSMA的靶标C4-2B(图18A和图18C)或过表达cynoPSMA细胞系CHO-CynoPSMA(图18E)的结合。在Jurkat细胞上(图18B和图18D)，高亲和力CD3结合物TSC266和PSMA01110具有比任一低亲和力结合物更强的结合。PSMA01107略优于PSAM01108，但两者都无法在测试浓度下显示可饱和曲线。
在24小时的时候，评估通过CD69和CD25上调所定义的由抗PSMA x抗CD3构建体诱导的CD4+和CD8+T细胞活化。在C4-2B靶标细胞的存在下(图19A)，所有构建体以不同效力诱导稳健的T细胞活化。亲本构建体TSC266显示出最高的效力(最低EC50)，而TSC291a BiTE诱导最高的CD69+和CD25+细胞百分比，与诱导最佳T细胞活化的OKT3/CD28抗体对照所达到的水平相当。与TSC266相比，PSMA01107诱导相似的活化水平，但浓度较高。虽然低于其它测试分子，但PSMA01108促进了CD4和CD8 T细胞的活化，不过，几乎检测不到细胞结合。在没有靶标细胞的情况下(图19B)，利用PSMA01107或PSMA01108都没有可测量的T细胞活化。相比之下，未优化的亲本构建体TSC266和TSC291a BiTE显示中等水平的T细胞活化(图19B)。在C4-2B存在下，高亲和力CD3构建体PSMA01110显示出与低亲和力CD3构建体PSMA01107相似的活性(图19C)。在没有C4-2B靶标交联的情况下，没有观察到活性(图19D)。PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的比较表明，PSMA01107保持与高亲和力CD3构建体PSMA01110相当的T细胞活化，但在CD3结合方面存在差异。相比之下，展示最低CD3结合的PSMA01108不会诱导T细胞活化达到PSMA01107或PSMA01110的水平(图19E)。
细胞因子在T细胞活化期间分泌。对上述T细胞活化测定中培养物上清液中分泌的细胞因子水平进行定量(图20)。TSC291a诱导T细胞分泌大量IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6，其分泌水平明显高于TSC266、PSMA01107或PSMA01108所诱导的情形(图20A)。在200pM下PSMA01107和TSC291a的比较展示出相似的细胞因子反应谱，证明尽管TSC291a的总体反应更高，但PSMA01107在C4-2B靶标细胞存在下诱导功能性反应(图20B)。这种细胞因子活性与CD3结合的强度相关，因为PSMA01108和PSMA01110在C4-2B靶标细胞存在下显示出相似的反应，其反应量值与CD3结合类似(图20D)。相比之下，在没有C4-2B靶标细胞的情况下，PSMA01107不引发任何可测量的细胞因子反应，而TSC291a引起的反应是显而易见的(图20C)。这一活性是剂量依赖性的，因为PSMA01107仅在C4-2B靶标交联的存在下显示可滴定的细胞因子诱导作用(图20E)。
在96小时的时候，所有抗PSMA x抗CD3构建体均诱导T细胞增殖(图21A)。TSC266和TSC291a均显示出最高的效力，而PSMA01108的效力最低，并且PSMA01107介于两者之间，这与T细胞活化测定中的评级相关。在测试的剂量范围内，所有构建体都诱导大多数CD4和CD8T细胞的增殖。TSC266在低至20pM的剂量下刺激适度细胞增殖(图21B)。
在96小时的时候，所有抗PSMA x抗CD3构建体均诱导T细胞增殖(图22A)。TSC266、PSMA01107和PSMA01110对CD4 T细胞显示出相似的效力。TSC266对CD8 T细胞显示的效力略高于PSMA01107和PSMA01110。与所有测试构建体相比，PSMA01108显示出降低的效力并且与其结合CD3的能力总体降低相符(图18)。相比之下，尽管与PSMA0110相比，PSMA01107与CD3的结合减少(图18)，但与PSMA01110相比，PSMA01107足以诱导相似的CD4和CD8 T细胞增殖效力。PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的比较表明，PSMA01107保持与高亲和力CD3构建体PSMA01110相当的T细胞增殖效力，但在CD3结合方面存在差异。相比之下，PSMA01108显示出最低的CD3结合，并且不会诱导T细胞增殖达到PSMA01107或PSMA01110所诱导的水平(图22B)。
使用C4-2B作为靶标细胞进行的细胞毒性测定展示出一系列效力(图23)。亲本构建体TSC266显示出最高的效力，而PSMA01108构建体的效力最低，这与在T细胞活化和增殖测定中的效力相关。尽管与CD3的结合亲和力较低，但PSMA01108能够在测试的剂量范围内显示出稳健的抗肿瘤活性。阴性对照ADAPTIRTM TRI149显示对C4-2B细胞生长没有影响。
结论：1)CD3结合与功能之间存在相关性，其中较低的CD3结合效力引起较低的T细胞活化、增殖、细胞因子分泌和针对靶标的细胞毒性效力；2)尽管效力较低，但所有构建体(高或低CD3亲和力)均诱导显著水平的T细胞活化、增殖、细胞因子分泌和细胞毒性。
对CD3的低亲和力将使抗CD3 x TA分子能够忽略外周T细胞(没有TA表达的地方)，并优先积累于TA(+)肿瘤部位，在那里，它可以诱导T细胞功能和TA(+)细胞毒性。
实施例21：抗PSMA x抗CD3ε双特异性蛋白与各种细胞系的结合
完成的细胞结合研究证实，ADAPTIRTM scFv结合结构域充分结合至表达PSMA或CD3的细胞(分别为C4-2B前列腺癌细胞和Jurkat T细胞)，但不能结合不表达PSMA或CD3的细胞(AsPC-1、U937、K562、CHOK1SV和MDA-MB-231)。使用灵敏的Meso Scale Discovery分析平台执行结合研究。这些数据表明，PSMA01107和PSMA01108与C4-2B(一种前列腺癌细胞系)的PSMA结合比TSC266的结合更强。相比之下，TSC266与表达CD3的Jurkat细胞的结合明显强于PSMA01107或PSMA01108的结合。此外，PSMA01107和PSM01108蛋白未显示出高于在没有靶标细胞的孔中所见到的结合的与已知不表达PSMA或CD3的五种细胞系的任何非特异性结合(图24)。TSC266与空孔以及测试的细胞系具有较高的非特异性结合。因此，这不会损害与这些scFv的结合或Fc的变化。
洗涤细胞并将其在1X HBSS中以50,000个细胞/孔接种于96孔多阵列高结合板(Meso Scale Discovery)上，并在37℃下培育一小时。在含有20％ FBS的PBS缓冲液中进行封闭步骤后，添加在含有10％ FBS的PBS缓冲液中连续稀释的结合构建体(从0.05至900nM)，并在室温下培育一小时。用PBS洗涤板，并使用SULFO TAG标记的山羊抗人IgG抗体(Meso Scale Discovery#R32AJ)检测特异性结合水平。在一小时的培育和洗涤步骤后，添加每孔150μL不含表面活性剂的1X Read Buffer T，并在MSD Sector Imager(Meso ScaleDiscovery)上分析样品。将得到的电化学发光(ECL)值首先除以每个细胞系的背景值，然后使用绘图软件绘制相对于背景的倍数随浓度变化的图。
如图24中所示，PSMA01107和PSMA01108的非特异性结合与非特异性细胞系具有最小结合，而TSC266在低至1nM的浓度下与所有测试的细胞系都结合。
实施例22.将结合结构域并入其它蛋白质形式中以及生物物理学、稳定性、结合和活性的表征
除了利用呈ADAPTIRTM scFv-Fc/Sc-Fc-scFv异二聚体形式的抗PSMA和抗CD3结合结构域外，还可以将它们并入其它蛋白质结构中，使其能够单独或同时结合PSMA和CD3并且可以通过接合两种受体来引起信号传导。这些其它形式包括但不限于Spiess等人,Mol.Immun.67:95-106(2015)中所描述的那些。这还包括RUBYTM、AzymetricTM和TriTACTM双特异性平台等格式。可以通过使用分子生物学技术扩增编码抗PSMA和抗CD3结合结构域的可变重链或/或可变轻链结构域或CDR区的基因序列来产生本文所公开的抗PSMA和抗CD3结合结构域的替代性组合物。然后，可以将这些基因片段剪接成适合蛋白质表达的DNA质粒中预期的双特异性形式的适当构架。表达后，可以采用纯化技术来分离双特异性蛋白质。这些技术可包括亲和纯化步骤，例如蛋白质A、蛋白质L、蛋白质G、阴离子交换、阳离子交换或疏水相互作用色谱。蛋白质纯化后，可以通过生物物理学技术，例如前面描述的技术，包括差示扫描荧光法或差示扫描量热法，对分子进行检查。也可以通过在来自不同物种的血清、不同盐浓度、机械力等条件中培育来评估这些替代性蛋白质结构的溶解度和聚集抗性。可以评估替代性蛋白质形式与表达一种或两种靶标的细胞的结合。此外，可以通过测量表达CD3的细胞的刺激来评价替代性蛋白质形式的生物活性。这些细胞群的刺激或活化可以通过确定干扰素γ或其它细胞因子浓度的增加，测量指示活化的其它细胞表面标志物如CD25或CD69的表达等输出来测量。在体外分析之后，这些形式也可以被开发作为治疗癌症等人类疾病的治疗剂。
实施例23.使用优化的CD3结合结构域靶向其它肿瘤相关抗原
除了利用本文所述的优化的抗CD3结合结构域治疗PSMA(+)肿瘤外，它们还可以用于产生靶向其它肿瘤相关抗原(TAA)的另外的治疗性蛋白质。例如，可以用抗CD3 ADAPTIRTM双特异性蛋白成功治疗在表面上表达Her2(erbB-2)或B细胞成熟抗原(BCMA)等蛋白质的癌细胞，以分别治疗乳腺癌和多发性骨髓瘤等疾病。
可以通过使用编码感兴趣TAA的DNA、在表面上表达TAA的细胞或TAA的重组形式对兔、啮齿动物、美洲驼或其它动物进行免疫来产生针对其它TAA的结合结构域。或者，可以通过淘选如噬菌体或酵母展示文库等结合结构域文库来分离结合结构域，以分离与感兴趣TAA特异性结合的序列。在鉴别出这些结合结构域后，可以对它们进一步优化以在与PSMA01107或PSMA01108等构建体中使用的抗CD3结合结构域配对时实现所希望的亲和力、稳定性和生物活性。如果TAA结合结构域来源于经历免疫的物种的抗体，则它们也可能需要人源化，以降低在人体中发生免疫原性的风险。
优化的抗TAA序列可以放置在Fc区的N末端，替代上述实施例中使用的抗PSMA结合结构域。或者，可以使用不同的结构形式来改善分子的活性或生物物理特性。替代性结构将包括前面实施例中描述的那些。
可以在体外评估靶向CD3和其它TAA的双特异性蛋白诱导T细胞引起肿瘤细胞或在表面上表达TAA的细胞系裂解的能力。可以测量T细胞活性的其它测量值，例如通过上调细胞表面标志物如CD69测量T细胞活化。诱导T细胞增殖是可以评估这些治疗性分子的另一种方式。除了这些体外评估外，其它抗TAA x抗CD3双特异性蛋白引起肿瘤缩小的能力可以使用不同的疾病动物模型，例如以上实施例中描述的小鼠异种移植模型进行测量。还可以比较双特异性蛋白在由CHO细胞产生时的表达水平、它们的稳定性、聚集或降解的倾向或者它们在不同温度下储存时的保存期，以便选择具有最佳特性的构建体以推进人类临床试验。
实施例24：使用建模来评估构建体之间的潜在生物分布差异
除了使用在小鼠和非人灵长类动物中进行的研究评价PSMA x CD3双特异性蛋白的分布和药代动力学特性外，可能还需要执行数学建模来比较不同的治疗性构建体。这可包括Appl ied Biomath开发的模型辅助药物干预(Model Aided Drug Intervention，MADI)。建模可以提供帮助确定起始剂量、基于结合亲和力差异鉴别一种构建体相对于另一种构建体的治疗剂量窗口的潜在改善以及其它有用信息的数据。
在PSMA x CD3双特异性蛋白的情况下，预期抗原PSMA将在实体瘤上表达。相反，CD3 T细胞受体在所有循环T细胞以及肿瘤部位处的驻留T细胞上表达。数学建模能够基于这两个靶标的相对表达提供帮助确定在人体临床试验中评价时哪种双特异性候选物可能具有最大治疗益处的数据。
实施例25：有关选定PSMA x CD3双特异性蛋白的差示扫描量热法(DSC)
使用MicroCal VP-CapillaryDSC系统(Malvern Instrument)执行DSC以确定温度诱导的某些双特异性蛋白去折叠的中点(Tm)。杜贝卡氏PBS(Dulbecco’s PBS，dPBS)用作缓冲液参照。将300μL的1mg/mL每种蛋白质样品与缓冲液参照的溶液装载至仪器上，并以每分钟一摄氏度的速率从25℃加热至100℃。使用Origin 7平台软件MicroCal VP-CapillaryDSC自动分析软件分析解链曲线以得到Tm值。
PSMA01107、PSMA01108、PSMA01110和PSMA01116的DSC温谱图由一系列重叠的解链转变组成。为了确定各个结构域的Tm值，产生并测试仅由Fc区(铰链、CH2、CH3，具有或没有孔中节突变)组成的其它蛋白质、抗PSMA-Fc或Fc-抗CD3(数据未显示)。
抗PSMA结构和抗CD3结构域都是热稳定的，并且分别在约66和约61(℃)下去折叠(表12)。在全部三种构建体中利用相同的抗PSMA结构域，并且这一结构域在每种构建体中具有相似的Tm值(66.4、66.2和66.5)。类似地，对全部三种双特异性构建体使用相同的含有助于异二聚体形成的KIH突变的Fc区，并在约71℃下产生由CH2和CH3结构域组成的转变相。孔中节突变对CH3结构域具有去稳定作用，使得在CH2转变附近/顶部上发生解链转变。下表报导了两个结构域的单个值。在抗CD3结构域的Tm中观察到微小差异。PSMA01108中抗CD3结构域的Tm在温谱图中没有产生明显的拐点以允许分配或拟合，因为它看来与抗PSMA scFv的去折叠有明显重叠。
表12.由DSC确定的Tm值
实施例26：小鼠的药代动力学
在时间0时静脉内(IV)注射单次10μg剂量PSMA01107、PSMA01108或PSMA01110的C57BL/6小鼠中进行药代动力学评价。每组注射三只小鼠，并根据连续采样方案，在十个时间点(2、6、24、48、96、150、222、336、504和672小时)通过对每只动物尾静脉采血来收集样品。通过半特异性ECLA方法，使用抗PSMA结合结构域单克隆抗体(5B1 mAb)捕获抗PSMA BD，并使用与生物素缀合的山羊抗人IgG多克隆抗体(SouthernBiotech，目录号2049-08)检测双特异性抗体的Fc区来确定样品中PSMA x CD3双特异性抗体的浓度。添加链霉抗生素蛋白-SULFOTAG试剂(SST，MSD目录号R32AD-1)以促进电化学发光反应。构建体的平均全身浓度示于图25中，并且各个时间点的数据示于图26中。表13中列出了使用PhoenixWinNonlinTM(v8.1)许可证，由非房室分析(NCA)估算的PK参数。
表13.抗PSMA x抗CD3构建体的NCA参数
*由于ADA的影响，未包括在平均NCA参数分析中
Cmax：在Tmax下出现的最大观察浓度；Tmax：观察到的最大浓度的时间；Tlast：最后一次观察浓度的时间；HL：表观终末消除半衰期；AUClast：从给药时间到最后一个可检测浓度的曲线下面积；AUCINF：从给药时间外推到无穷大的曲线下面积；AUC％extrap：外推的AUCinf值的百分比；CL：血清清除率；Vss：在稳态下分布容积的估计值。
在NCA期间使用静脉内给药的预编译模型，由此得到PSMA1107的表观平均终末消除半衰期为约223.6小时(9.3天)，PSMA1108为约319.6小时(13.3天)以及PSMA1110为约330.6小时(13.8天)(使用软件确定的最佳拟合)。PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的平均清除率和分布容积(在稳态下)估计值分别为约0.403、0.316和0.375mL/kg/hr，以及139.2、142.2和173.4mL/kg。总体而言，PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的PK参数值相似。
为了确定抗药物抗体(ADA)的存在，使用夹心ECLA形式分析在给药前和840小时从小鼠收集的血清样品。简单点说，将PSMA x CD3构建体涂覆于MSD 96孔板上，随后将其与小鼠血清样品一起培育以捕获构建体特异性ADA。使用与生物素缀合的山羊抗mIgG抗体(SouthernBiotech，目录号1031-08)检测血清样品中存在的ADA，并添加链霉抗生素蛋白-SULFOTAG试剂(SST，MSD目录号R32AD-1)以促进电化学发光反应。使用小鼠抗人IgG Fc抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)作为阳性对照。关于ADA结果的反应值和给药后:给药前比率列于表14中。对于PSMA01108，在给药后约10天，一只动物的暴露量迅速减少。给药后与给药前的比率证实，在一只小鼠(小鼠#4)体内存在抗PSMA01108抗体，这与观察到的血清浓度降低一致。所有其它个体动物均对抗PSMA x CD3构建体抗体呈阴性。基于这一数据，小鼠#4的结果被排除在平均浓度值以及NCA参数分析之外。
表14.抗PSMA x抗CD3构建体的各个ADA结果
SD：标准偏差
％CV：变异系数
粗体表示高于比率截止点的给药后:给药前比率(RCP＝2)
实施例27：关于与鼠Fc标记的人和食蟹猴PSMA ECD的结合的SPR
评价
SPR研究是对结合至与鼠IgG1 Fc区的c末端融合的人和食蟹猴灵长类动物PSMA胞外结构域(ECD)的一小组双特异性构建体执行的。这些实验是在Biacore T200系统上，在25℃下于含有0.2％ BSA缓冲液的dPBS(Gibco,14040-133)中进行的。通过标准胺偶联化学将双特异性构建体以约2,000-4,000个反应单元(RU)的密度固定到CM5研究级传感器芯片(GE)的各个流槽上，留下一个流槽表面未修饰作为参照。使用多循环动力学模式，将缓冲液空白和在含0.2％ BSA的dPBS中1nM至81nM范围内的四种不同浓度的PSMA二聚体以30μL/min依次注射越过每个流槽，持续300秒，随后是600秒的解离期。通过以30μL/min的流动速率注射10mM甘氨酸pH 2.0，持续40秒，随后用含0.2％ BSA缓冲液的dPBS稳定化1分钟来实现再生。
使用双减法分析从动力学SPR测量获得的传感图。从捕获有配体的流槽获得的分析物结合反应中减去来自参照流槽的信号。然后，从分析物结合反应中减去缓冲液空白反应，并使用Biacore T200评价软件(2.0，GE)分析最终双参考的数据，全局拟合数据以得出动力学参数。所有传感图均使用简单的一对一结合模型进行拟合。
对于每种构建体，测量的对人和食蟹猴PSMA ECD的结合亲和力几乎相等，并且在2至5nM的范围内。与人PSMA的结合亲和力不受纯化标签的影响。
表15.有关选定抗PSMA x抗CD3双特异性抗体对小鼠Fc标记的人和食蟹猴PSMAECD的Biacore亲和力测量。
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实施例28：在原发性肿瘤细胞系上人PSMA的表达
使用人PSMA肿瘤细胞系进行PSMA构建体的结合和功能表征。使用以下细胞系：22RV1，人前列腺癌细胞系(ATCC)；C4-2B，雄激素非依赖性人前列腺癌细胞系(Wu等人,1994Int.J.Cancer 57:406-12；获自MD安德森癌症中心(德克萨斯州休斯顿)；LNCaP，人前列腺癌细胞系(ATCC)；MDA-PCa-2b，人前列腺癌细胞系(ATCC)；以及DU-145，人前列腺癌细胞系(ATCC)。通过流式细胞术确定这些细胞上的表面PSMA表达水平。
将细胞以每孔约100,000个细胞平板接种于96孔U形底板中，并在4℃下与饱和浓度的缀合PE的抗体:抗PSMA抗体(LNI-17克隆，Biolegend#342504)或同种型对照(MOPC-21克隆，小鼠IgG同种型，Biolegend#400140)一起培育。培育一小时后，洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。所有培育和洗涤均在染色缓冲液(含0.2％ BSA和2mM EDTA的PBS缓冲液)中进行。使用BDTM LSR-II流式细胞仪(BD Biosciences)收集样品，并通过FlowJo流式细胞术分析软件进行分析。在排除双细胞后，确定平均荧光强度(MFI)。如制造商所描述，使用QuantibriteTM珠粒(BD Bioscience#340495)确定受体数量。
图27显示在22RV1、C4-2B、LNCaP、MDA-PCa-2b和DU-145细胞中人PSMA的表达水平。图中以每个细胞结合的抗体数(ABC)为单位显示受体水平。平均而言，22RV1细胞表达约10,000个受体/细胞，MDA-PCa-2b细胞表达超过30,000个PSMA受体/细胞，C4-2B细胞表达超过70,000个PSMA受体/细胞，LNCaP细胞表达超过140,000个PSMA受体/细胞，而DU145细胞表达少于20个受体/细胞。因此，LNCaP和C4-2B细胞均被视为PSMA(高)细胞，而MDA-PCa-2b和22RV1细胞被视为PSMA(低)细胞，并且DU-145细胞被视为PSMA(阴性)细胞。
实施例29：在差异表达PSMA的肿瘤细胞系上进行的抗PSMA x抗CD3
ε构建体的体外分析
使用表达不同水平的表面人PSMA的细胞系检查抗PSMA x抗CD3ε构建体(TSC266、PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110)的结合亲和力的相关性。
用浓度在0.1至300nM范围内的双特异性构建体的连续稀释液对96孔板中每孔约100,000个细胞的细胞进行标记。使用PE标记的二次抗体进行检测，并如前所述，使用流式细胞术收集细胞。
图28显示抗PSMA x抗CD3ε构建体对各种表达PSMA的肿瘤细胞的结合曲线。在图28A中，先前公开的构建体TSC266的相对结合对应于每个测试细胞系的PSMA表达水平。具有高PSMA表达的LNCaP细胞具有最高的最大MFI值，而具有低PSMA表达的细胞系22RV1具有极低的最大MFI值。PSMA阴性细胞系DU145未展现出与TSC266的结合。利用PSMA01107观察到类似的模式(图28C)，因为抗CD3单价构建体的相对结合对应于每个测试细胞系的PSMA表达水平。然而，与TSC266构建体相比，由于并入了更高亲和力的抗PSMA结合结构域，LNCaP、C4-2B和MDA-PCa-2b细胞测量到最大MFI值。具有与PSMA01107相同的抗PSMA结合结构域的构建体PMSA01108和PSMA01110得到无法区分的结果(数据未显示)。
接下来，评价抗PSMA x CD3ε构建体以确定它们在与表达不同水平PSMA的肿瘤细胞系一起使用时是否能够诱导靶标依赖性T细胞活化。
对于活化测定，将PBMC与肿瘤细胞一起平板接种以实现约3:1的T细胞与肿瘤细胞比率。将浓度范围为0.02至2,000pM的测试分子系列稀释液添加到共培养物中。24小时后，如前所述，标记细胞用于流式细胞术分析。
通过CD69和CD25上调评估由抗PSMA x抗CD3构建体诱导的CD4+T细胞活化。在各种表达PSMA的肿瘤靶标细胞的存在下(图29)，所有构建体以在一定范围内的效力诱导稳健的CD4+T细胞活化，甚至是在具有低PSMA表达的肿瘤细胞中也是如此。出乎意料的是，CD4+T细胞活化的水平与PSMA表达水平没有直接关联。一般而言，TSC266在所有PSMA细胞系中刺激强烈CD4+T细胞活化。我们还观察到在PSMA阴性细胞系DU-145中低水平的CD4+T细胞活化。相比之下，我们发现PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的CD4+T细胞活化水平相差很大。利用构建体PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110，具有高PSMA表达的细胞系C4-2B刺激最强的CD4+T细胞活化，其次分别是LNCaP、22RV1和MDA-PCa-2b靶标细胞。值得注意的是，利用PSMA01107、PSMA01108或PSMA01110，含有PSMA阴性细胞系DU-145的共培养物不会引起CD4+T细胞活化。
在各种表达PSMA的靶标细胞的存在下(图30)，所有构建体以不同效力诱导稳健的CD8+T细胞活化。与CD4+T细胞活化类似，CD8+T细胞活化水平与靶标细胞系上PSMA的表达水平没有直接关联。一般而言，TSC266在所有肿瘤细胞系中刺激强烈CD8+T细胞活化，不管PSMA表达水平如何，包括PSMA阴性细胞系DU-145。相比之下，PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的CD8+T细胞活化水平与肿瘤细胞系相关。构建体PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110与具有高PSMA表达的细胞系C4-2B的共培养物刺激最强的CD8+T细胞活化，其次分别是LNCaP、22RV1和MDA-PCa-2b靶标细胞。重要的是，含有PSMA阴性细胞系DU-145和PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110的培养物不会活化CD8+T细胞。
为了评估靶标细胞的细胞毒性，测量在共培养PBMC与双特异性构建体的稀释液后C4-2B(PSMA高)和MDA-PCa-2b(PSMA低)靶标细胞的活力。使用RediFectTMRed-FLuc-嘌呤霉素慢病毒颗粒(PerkinElmer)转导C4-2B细胞和MDA-PCa-2b细胞以表达萤火虫荧光素酶。如前所述，在72小时和96小时的时候，评估培养物中肿瘤细胞的荧光素酶表达。
使用C4-2B(PSMA高；图31A)和MDA-PCa-2b(PSMA低；图31B)靶标细胞进行的细胞毒性测定表明，抗CD3结合结构域的效价和亲和力影响PBMC的细胞毒性潜力。TSC266显示出最稳健的T细胞重定向细胞毒性，而PSMA01108构建体的有效性最低，这与在T细胞活化测定中的效力相关。尽管与CD3具有低结合亲和力，但PSMA01108能够在测试的剂量范围内显示出显著的抗肿瘤活性，并在72小时的时候实现具有高PSMA表达的细胞系C4-2B的完全裂解(图31A)。相比之下，在具有低PSMA表达的细胞系MDA-PCa-2b上，PSMA01108直到96小时的时间点时才能实现完全裂解(图31B)。阴性对照ADAPTIRTM TRI149不促进C4-2B或MDA-PCa-2b肿瘤细胞的T细胞裂解。通过定量每个细胞结合的抗体量和PSMA与抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01107的直接结合来评价靶标表达。PSMA01107的结合与通过抗体定量检测到的PSMA的量相关，表明PSMA01107能够以与PSMA表达直接相关的方式结合肿瘤靶标。(图32A)。对PSMA01107细胞毒性的评价证实，PSMA01107以与PSMA表达直接相关的方式诱导特异性裂解，并且甚至当肿瘤靶标表达水平较低时，这种反应也会以相似的水平发生(图32B)。
总之，抗PSMA x抗CD3ε构建体：1)与差异表达的PSMA肿瘤细胞系的结合与PSMA表达水平相关；2)能够在具有低或高PSMA表达的肿瘤细胞系上同等地促进T细胞活化；并且3)由于CD3结合结构域(PSMA01107和PSMA01108)较弱(即，较低的结合亲和力)而需要更长时间的培育才能实现靶标细胞的完全裂解。
实施例30：关于序列修饰的抗PSMA x抗CD3双特异性构建体
PSMA01116的体外评价
与亲本序列构建体PSMA01107相比，我们评价了序列修饰的抗PSMA x抗CD3ε构建体PSMA01116结合、诱导靶标依赖性T细胞活化和介导T细胞重定向肿瘤裂解的能力。
图33显示抗PSMA x抗CD3ε构建体对C4-2B和Jurkat细胞的结合曲线。在图33A中，PSMA01107和PSMA01116对表达PSMA的C4-2B细胞的相对结合几乎无法区分。类似地，PSMA01107和PSMA01116与表达CD3的Jurkat细胞的结合是相当的(图33B)。
在24小时的时候，评估通过CD69和CD25上调所定义的由抗PSMA x抗CD3构建体诱导的CD4+和CD8+T细胞活化。在C4-2B靶标细胞的存在下(图34)，所有构建体以一系列效力诱导稳健的T细胞活化。TSC266显示出最高的效力(最低EC50)，而PSMA01107和PSMA01116构建体显示出相当的但比较起来有所降低的效力。
总之：对PSMA01107进行的序列修饰(PSMA01116)不影响与表达PSMA或CD3的细胞的结合，也不影响T细胞激动剂活性。
接下来，对来自T细胞活化测定(如上所述)的培养物上清液中的细胞因子分泌水平进行定量。正如预期的那样，TSC291a诱导T细胞分泌大量IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6，其分泌水平明显高于PSMA01107或PSMA01116所诱导的分泌水平(图35)。与T细胞活化水平相似，PSMA01107和PSM01116介导的细胞因子水平无法区分。
实施例31.PSMA01107与PSMA01116的细胞毒性比较
在使用C4-2B(PSMA高)靶标细胞进行的T细胞重定向细胞毒性测定中，PSMA01116中的序列变化不影响针对PBMC的细胞毒性潜力的诱导。正如预期的那样，PSMA01107和PSMA01116促进等效的肿瘤裂解，这与T细胞活化和细胞因子分泌测定中的效力相关。尽管与CD3具有低结合亲和力，但PSMA01107和PSMA01116都能够在测试的剂量范围内诱导显著的抗肿瘤活性，并在72小时的时候实现肿瘤完全裂解(图36)。TRI149对照不影响C4-2B肿瘤细胞的生长。
实施例32：响应于优化的抗PSMA x抗CD3ε双特异性蛋白治疗的抗
肿瘤功效
在使用人效应T细胞的预防性异种移植肿瘤模型中，在体内评估优化的抗PSMA xCD3ε构建体的功能和效力。
如前所述，用皮下递送于侧腹上的2×106个C4-2B-luc癌细胞与1×106个人leukopak T细胞的混合物攻击NOD/scid小鼠。两小时后，在第0天、第4天和第8天，对小鼠静脉内施用每只小鼠100μg、30μg、3μg或0.3μg(n＝8只/组)剂量的媒剂(PBS)、PSMA01110、PSMA01107或PSMA01108。每周两次通过BLI监测肿瘤生长。使用光谱成像仪(PerkinElmer)，通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤生长。如前所述进行测径器测量、肿瘤生物发光计算和统计分析。
在NOD/scid小鼠中，经生物发光确定，用所有优化的抗PSMA x抗CD3εADAPTIRTM分子治疗引起C4-2B-luc肿瘤生长的统计显著减少(图37和图39；以及表16)。在仅接受单次注射后第4天的第一个成像时间点观察到肿瘤生物发光减少。在治疗过程中观察到肿瘤生物发光的进一步减少。在每只小鼠3mg及以上的剂量下，所有构建体均引起肿瘤生物发光信号的显著减少。根据在第14天的生物发光成像所观察到的，只有PSMA01110治疗在每只小鼠0.3mg的最低剂量下引起显著的肿瘤生物发光信号减少(图40)。总的来说，在C4-2B-luc攻击的小鼠中，用所有优化的PSMA x CD3构建体治疗引起肿瘤体积的统计显著减小，并防止肿瘤的外生长。(图37和图38；表16)。在所有组中，PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110对肿瘤的预防作用直至在第63天研究结束时仍然存在。(图39A)。分别在第28天和第14天计算Log％耗竭和无肿瘤发生率百分比(图39B)。此处，PSMA01107显示出与PSMA01110相当的活性，而PSMA01108显示出整体较低的抗肿瘤反应(图39B)。
使用JMP重复测量分析和Tukey多重比较检验来确定研究组从第4天到第25天的平均肿瘤生物发光差异。p值<0.05被认为是显著的。
表16.到第25天时平均log10肿瘤生物发光的统计比较
实施例33：使用靶向不止一种肿瘤相关抗原(TAA)的技术
除了使用靶向表达PSMA的肿瘤的技术外，还可以产生含有一个CD3结合结构域和一个或多个针对两种不同TAA的结合结构域的蛋白质。这将使蛋白质治疗剂能够靶向同一肿瘤类型的两种不同肿瘤抗原，或者可能使用相同的药物靶向两种不同类型的肿瘤。可以调整结合结构域对每种TAA的亲和力，以实现更高的选择性和特异性，从而显著降低组织外活性的风险。这将允许药物通过要求两种TAA都存在于肿瘤细胞上以使药物能够传导信号并活化T细胞来克服正常健康组织上的低水平表达。
实施例34：抗CD3ε结合对NFκB、NFAT和ERK下游信号传导路径的不同影响
在抗PSMA x抗CD3εADAPTIRTM构建体刺激抗CD3ε后，经由核因子活化B细胞κ轻链增强子(NFκB)、活化T细胞核因子(NFAT)和细胞外信号调控的激酶(ERK)，利用报告子测定评估下游CD3信号传导路径的强度和持续时间。将C4-2B靶标细胞用20nM的TSC266、PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110处理。24小时后，在表达PSMA的C4-2B靶标细胞的存在下，用所有构建体测量到NFκB、NFAT和ERK的较强下游信号传导(图41)。为了证明抗PSMA x抗CD3εADAPTIRTM构建体需要PSMA交联，在没有C4-2B靶标细胞的情况下进行所述测定。当与交联PSMA的ADAPTIRTM直接比较时，在没有PSMA交联的情况下活性明显降低(图41)。与PSMA01107、PSMA01108或PSMA01110构建体中优化的抗CD3结合结构域相比，未优化的亲本构建体TSC266在没有C4-2B细胞的情况下处理时具有较高的背景信号。
在4小时、10小时和24小时执行NFAT报告子测定，以确定PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110构建体的EC50值是否取决于CD3进行信号传导的时间。下游NFAT活性取决于ADAPTIRTM的浓度(图42A)和抗CD3结合的亲合力(图42B)，因为PSMA01108在所有时间点都具有降低的效力和略微较高的EC50。TSC266在4小时的时候具有较低的EC50(较强的效力)，但在24小时的时候，具有总体较低的效力和增加的EC50。相比之下，PSMA01107、PSMA1108和PSMA01110在4小时的时候具有略微较高的EC50，但到24小时的时间点时继续降低，表明下游CD3信号传导比TSC266持续时间长。图43提供了TSC266、PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110构建体在4小时、10小时和24小时的时候针对NFκB、NFAT和ERK的EC50值。图43表明，与TSC266相比，PSMA01107、PSMA01108和PSMA01110构建体从4小时到24小时对于NFκB、NFAT和ERK具有降低的EC50。
实施例35：CD3亲和力对T细胞记忆表型的影响
对抗PSMA x抗CD3ε构建体(PSMA01107和PSMA01110)进行评价以确定它们对CD8+T细胞的记忆表型的影响。对于表型测定，将PBMC与C4-2B肿瘤细胞一起平板接种以实现约3:1的T细胞与肿瘤细胞比率。将浓度范围为0.02至2,000pM的测试分子的连续稀释液添加到共培养物中。72小时后，如前所述，标记细胞用于流式细胞术分析。
CD8+T细胞记忆表型的产生受抗PSMA x抗CD3ε构建体的影响，并通过CD45RO和CD62L的表面表达进行评估。在表达PSMA的肿瘤靶标细胞的存在下，所有构建体都诱导CD8+T细胞记忆表型的剂量依赖性变化，这种变化在中央记忆细胞的数量(图44A)与终末分化细胞的数量之间呈负相关(图44B)。给予0.2nM的构建体诱导PSMA01107与PSMA01110之间在原始、中央记忆、效应记忆和终末分化细胞比率方面的最大差异(图44C)。这些结果表明，设计成ADAPTIRTM形式的较低CD3亲和力可以改变记忆表型并使得CD8+T细胞群体能够成为维持长期记忆反应的强效肿瘤杀手。
***
本公开的范围不受本文所述的具体方面的限制。实际上，根据上文的描述和附图，本领域的技术人员对于除本文所述之外的针对本公开的各种修改将是显而易见的。这些修改也在所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如出版物或专利或专利申请)以引用的方式整体并入本文中并且用于所有目的，其引用程度就如同特定且个别地指示每一个别出版物、专利或专利申请是以引用的方式整体并入用于所有目的。
其它方面也在所附权利要求的范围内。
序列
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序列表
<110> 阿帕特夫研究和发展有限公司(APTEVO RESEARCH AND DEVELOPMENT LLC)
<120> 结合PSMA和CD3的异二聚体双特异性抗体
<130> 4897.005PC03
<150> US 63/166,394
<151> 2021-03-26
<150> US 63/129,372
<151> 2020-12-22
<150> US 63/120,154
<151> 2020-12-01
<160> 206
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 2199
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Avi-His-人PSMA ECD
<400> 1
catcatcacc atcatcatca tcatcaccat ggtctgaatg acatcttcga ggctcagaaa 60
atcgaatggc acgaacataa atcctccaat gaagctacta acattactcc aaagcataat 120
atgaaagcat ttttggatga attgaaagct gagaacatca agaagttctt atataatttt 180
acacagatac cacatttagc aggaacagaa caaaactttc agcttgcaaa gcaaattcaa 240
tcccagtgga aagaatttgg cctggattct gttgagctag cacattatga tgtcctgttg 300
tcctacccaa ataagactca tcccaactac atctcaataa ttaatgaaga tggaaatgag 360
attttcaaca catcattatt tgaaccacct cctccaggat atgaaaatgt ttcggatatt 420
gtaccacctt tcagtgcttt ctctcctcaa ggaatgccag agggcgatct agtgtatgtt 480
aactatgcac gaactgaaga cttctttaaa ttggaacggg acatgaaaat caattgctct 540
gggaaaattg taattgccag atatgggaaa gttttcagag gaaataaggt taaaaatgcc 600
cagctggcag gggccaaagg agtcattctc tactccgacc ctgctgacta ctttgctcct 660
ggggtgaagt cctatccaga tggttggaat cttcctggag gtggtgtcca gcgtggaaat 720
atcctaaatc tgaatggtgc aggagaccct ctcacaccag gttacccagc aaatgaatat 780
gcttataggc gtggaattgc agaggctgtt ggtcttccaa gtattcctgt tcatccaatt 840
ggatactatg atgcacagaa gctcctagaa aaaatgggtg gctcagcacc accagatagc 900
agctggagag gaagtctcaa agtgccctac aatgttggac ctggctttac tggaaacttt 960
tctacacaaa aagtcaagat gcacatccac tctaccaatg aagtgacaag aatttacaat 1020
gtgataggta ctctcagagg agcagtggaa ccagacagat atgtcattct gggaggtcac 1080
cgggactcat gggtgtttgg tggtattgac cctcagagtg gagcagctgt tgttcatgaa 1140
attgtgagga gctttggaac actgaaaaag gaagggtgga gacctagaag aacaattttg 1200
tttgcaagct gggatgcaga agaatttggt cttcttggtt ctactgagtg ggcagaggag 1260
aactcaagac tccttcaaga gcgtggcgtg gcttatatta atgctgactc atctatagaa 1320
ggaaactaca ctctgagagt tgattgtaca ccgctgatgt acagcttggt acacaaccta 1380
acaaaagagc tgaaaagccc tgatgaaggc tttgaaggca aatctcttta tgaaagttgg 1440
actaaaaaaa gtccttcccc agagttcagt ggcatgccca ggataagcaa attgggatct 1500
ggaaatgatt ttgaggtgtt cttccaacga cttggaattg cttcaggcag agcacggtat 1560
actaaaaatt gggaaacaaa caaattcagc ggctatccac tgtatcacag tgtctatgaa 1620
acatatgagt tggtggaaaa gttttatgat ccaatgttta aatatcacct cactgtggcc 1680
caggttcgag gagggatggt gtttgagcta gccaattcca tagtgctccc ttttgattgt 1740
cgagattatg ctgtagtttt aagaaagtat gctgacaaaa tctacagtat ttctatgaaa 1800
catccacagg aaatgaagac atacagtgta tcatttgatt cacttttttc tgcagtaaag 1860
aattttacag aaattgcttc caagttcagt gagagactcc aggactttga caaaagcaac 1920
ccaatagtat taagaatgat gaatgatcaa ctcatgtttc tggaaagagc atttattgat 1980
ccattagggt taccagacag gcctttttat aggcatgtca tctatgctcc aagcagccac 2040
aacaagtatg caggggagtc attcccagga atttatgatg ctctgtttga tattgaaagc 2100
aaagtggacc cttccaaggc ctggggagaa gtgaagagac agatttatgt tgcagccttc 2160
acagtgcagg cagctgcaga gactttgagt gaagtagcc 2199
<210> 2
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Avi-His-人PSMA ECD
<400> 2
His His His His His His His His His His Gly Leu Asn Asp Ile Phe
1 5 10 15
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His Lys Ser Ser Asn Glu Ala
20 25 30
Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu Leu
35 40 45
Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile Pro
50 55 60
His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile Gln
65 70 75 80
Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His Tyr
85 90 95
Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile Ser
100 105 110
Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe Glu
115 120 125
Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro Phe
130 135 140
Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Val
145 150 155 160
Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met Lys
165 170 175
Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val Phe
180 185 190
Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val
195 200 205
Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser
210 215 220
Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn
225 230 235 240
Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro
245 250 255
Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu
260 265 270
Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys Leu
275 280 285
Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg Gly
290 295 300
Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn Phe
305 310 315 320
Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val Thr
325 330 335
Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro Asp
340 345 350
Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly Gly
355 360 365
Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg Ser
370 375 380
Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile Leu
385 390 395 400
Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr Glu
405 410 415
Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala Tyr
420 425 430
Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp
435 440 445
Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu Leu
450 455 460
Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser Trp
465 470 475 480
Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile Ser
485 490 495
Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu Gly
500 505 510
Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn Lys
515 520 525
Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu Leu
530 535 540
Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val Ala
545 550 555 560
Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val Leu
565 570 575
Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala Asp
580 585 590
Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr Tyr
595 600 605
Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr Glu
610 615 620
Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser Asn
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Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu Arg
645 650 655
Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg His
660 665 670
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675 680 685
Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp Pro
690 695 700
Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala Phe
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Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
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<220>
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Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
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Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
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145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
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195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
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Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
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Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
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Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
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485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
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Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
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Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
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Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
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Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
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Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
<223> 食蟹猴全长PSMA
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Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
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<223> TSC291 抗PSMA scFv-接头 抗CD3 scFv- His
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp
225 230 235 240
Leu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
245 250 255
Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
260 265 270
Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
275 280 285
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
290 295 300
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
305 310 315 320
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
325 330 335
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn
355 360 365
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
370 375 380
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
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405 410 415
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
420 425 430
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
435 440 445
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
450 455 460
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
465 470 475 480
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Gln
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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
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515 520 525
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Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
545 550 555 560
Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
565 570 575
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
580 585 590
Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
595 600 605
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
610 615 620
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu
625 630 635 640
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Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys
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cctccgacca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aaggtggagg cggttcaggc 360
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cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctcc agccgctgca 840
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp
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Leu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
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Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn
355 360 365
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
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Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
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Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
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Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
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Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly
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Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Arg Ile
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ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1140
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
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Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Ser Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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340 345 350
Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 23
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01020 抗PSMA scFv-Fc
<400> 23
gacatccaga tgactcaaag cccttcaacc ctgtccgcaa gtgtcgggga cagagttact 60
ataacgtgca gggcaagtaa gagtataagt aaatatctgg cctggtatca acagaaaccc 120
gggaaagccc ctaaactcct catacattca ggatctagcc ttgagtcagg tgttccgtca 180
agattctctg gttccggaag cgggaccgag ttcaccctga caatcagttc actccagcct 240
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tgcccagcac ctccagccgc tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020
caccaggact ggctgaatgg caaggaatac aagtgcgcgg tctccaacaa agccctccca 1080
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1200
aaaggcttct atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1434
<210> 36
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01036 抗PSMA scFv-Fc
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
165 170 175
Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
180 185 190
Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe
260 265 270
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
275 280 285
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
290 295 300
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
340 345 350
Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
370 375 380
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
405 410 415
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
420 425 430
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 37
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01037 抗PSMA scFv-Fc
<400> 37
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat ttcaaccctt ataatgatta cacacgctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatctgac 300
ggctactacg acgctatgga ctactggggg caagggacca cggtcaccgt ctcctcgggt 360
ggtggaggta gtggtggagg cggatctggc ggcggcggtt caggaggtgg tggatccgac 420
atccagatga cccagtctcc ttccaccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 480
acttgccggg ccagtaagag tattagtaag tacttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 540
aaagccccta agctcctgat ccattctggc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 600
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc actctcacca tcagcagcct gcagcctgat 660
gattttgcaa cttattactg ccaacagcat attgaatatc cttggacgtt cggccaaggg 720
accaaggtgg aaatcaaatc ctcgagtgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc 780
ccaccgtgcc cagcacctcc agccgctgca ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 840
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 900
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 960
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1020
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gaatacaagt gcgcggtctc caacaaagcc 1080
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1140
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1200
ctggtcaaag gcttctatcc aagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1260
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1320
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1380
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<210> 38
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01037 抗PSMA scFv-Fc
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser
260 265 270
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
275 280 285
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
290 295 300
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
305 310 315 320
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
325 330 335
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
340 345 350
Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
355 360 365
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
370 375 380
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
405 410 415
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
420 425 430
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
435 440 445
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
450 455 460
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475 480
<210> 39
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01040 Fc-接头抗PSMA scFv
<400> 39
tcctcggagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctcca 60
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cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggcggcg ggggatcccc gtcagacatc 720
cagatgaccc agtctccttc caccctgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact 780
tgccgggcca gtaagagtat tagtaagtac ttggcctggt atcagcagaa accagggaaa 840
gcccctaagc tcctgatcca ttctggctcc agtttggaaa gtggggtccc atcaaggttc 900
agcggcagtg gatctgggac agaattcact ctcaccatca gcagcctgca gcctgatgat 960
tttgcaactt attactgcca acagcatatt gaatatcctt ggacgttcgg ccaagggacc 1020
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gcctcagtga aggtttcctg caaggcatct ggatacacct tcaccgacta ctatatgcac 1200
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tgtgcgagat ctgacggcta ctacgacgct atggactact gggggcaagg gaccacggtc 1440
accgtctcct cgcgc 1455
<210> 40
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01040 Fc-接头抗PSMA scFv
<400> 40
Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Asp Ile
225 230 235 240
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
245 250 255
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
260 265 270
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ser
275 280 285
Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
290 295 300
Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp
305 310 315 320
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe
325 330 335
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
355 360 365
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
370 375 380
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His
385 390 395 400
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe
405 410 415
Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
420 425 430
Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu
435 440 445
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
450 455 460
Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
465 470 475 480
Thr Val Ser Ser Arg
485
<210> 41
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01041 Fc-接头抗PSMA scFv
<400> 41
tcctcggagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctcca 60
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ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 240
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aatggcaagg aatacaagtg cgcggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 360
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420
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cagctggtgc agtctggggc tgaggtgaag aagcctgggg cctcagtgaa ggtttcctgc 780
aaggcatctg gatacacctt caccgactac tatatgcact gggtgcgaca ggcccctgga 840
caagggcttg agtggatggg atatttcaac ccttataatg attacacacg ctacgcacag 900
aagttccagg gcagagtcac catgaccagg gacacgtcca cgagcacagt ctacatggag 960
ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc gtgtattact gtgcgagatc tgacggctac 1020
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gcaacttatt actgccaaca gcatattgaa tatccttgga cgttcggcca agggaccaag 1440
gtggaaatca aacgc 1455
<210> 42
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01041 Fc-接头抗PSMA scFv
<400> 42
Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Gln Val
225 230 235 240
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
245 250 255
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met
260 265 270
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr
275 280 285
Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
290 295 300
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
305 310 315 320
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
325 330 335
Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
370 375 380
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
385 390 395 400
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
405 410 415
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ser Gly Ser Ser Leu Glu
420 425 430
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
435 440 445
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
450 455 460
Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
465 470 475 480
Val Glu Ile Lys Arg
485
<210> 43
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA 01072 抗PSMA scFv x 抗CD3 scFv
<400> 43
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat ttcaaccctt ataatgatta cacacgctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatctgac 300
ggctactacg acgctatgga ctactggggg caagggacca cggtcaccgt ctcctcgggt 360
ggtggaggta gtggtggagg cggatctggc ggcggcggtt caggaggtgg tggatccgac 420
atccagatga cccagtctcc ttcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 480
acttgccggg ccagtaagag tattagtaag tacttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 540
aaagccccta agctcctgat ccattctggc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 600
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc actctcacca tcagcagcct gcagcctgat 660
gattttgcaa cttattactg ccaacagcat attgaatatc cttggacgtt cggccaaggg 720
accaaggtgg aaatcaaaga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 780
ccagcacctc cagccgctgc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020
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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggcgg cgggggatcc 1440
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caagcaccag ggcaaggact cgaatggatt ggttacatca acccttcctc tgcatacacc 1620
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Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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Leu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Ile Val Thr Val
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Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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370 375 380
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
405 410 415
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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435 440 445
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
450 455 460
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Gln
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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
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Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser Thr
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530 535 540
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
580 585 590
Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
595 600 605
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu
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645 650 655
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Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly
725 730 735
Thr Lys Val Glu Val Lys Arg Ser
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<211> 2232
<212> DNA
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<220>
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<400> 49
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cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctcc agccgctgca 840
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 900
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Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe
260 265 270
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
275 280 285
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
290 295 300
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv x Fc节(链1)
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<212> PRT
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Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
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Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
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435 440 445
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 抗PSMA scFv x Fc孔 x 接头 x 抗CD3 scFv (链2)
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala
340 345 350
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
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Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Pro Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
485 490 495
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
500 505 510
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp
515 520 525
Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
530 535 540
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
545 550 555 560
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro
565 570 575
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
580 585 590
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
595 600 605
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
610 615 620
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
625 630 635 640
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
645 650 655
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
660 665 670
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
675 680 685
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
690 695 700
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
705 710 715 720
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
725
<210> 63
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC01007 PAAdel Fc
<400> 63
tcctcggagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctcca 60
gccgctgcac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 120
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 180
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 240
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 300
aatggcaagg aatacaagtg cgcggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 360
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 480
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 600
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggt 696
<210> 64
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC01007 PAAdel Fc
<400> 64
Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 65
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PAAdel Fc
+ Knob
<400> 65
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tccagccgct 60
gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 120
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 180
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 240
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 300
aaggaataca agtgcgcggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 360
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 420
gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tccaagcgac 480
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 540
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 600
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 660
acgcagaaga gcctctccct gtctccg 687
<210> 66
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PAAdel Fc
+ Knob
<400> 66
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro
225
<210> 67
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PAAdel Fc +孔
<400> 67
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tccagccgct 60
gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 120
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 180
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 240
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 300
aaggaataca agtgcgcggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 360
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 420
gagctgacca agaaccaggt cagcctgtct tgcgctgtca aaggcttcta tccaagcgac 480
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 540
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gttagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 600
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 660
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 690
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<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PAAdel Fc +孔
<400> 68
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv HCDR1
<400> 70
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv HCDR2
<400> 71
ttcaaccctt ataatgatta caca 24
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv HCDR2
<400> 72
Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr
1 5
<210> 73
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv HCDR3
<400> 73
gcgagatctg acggctacta cgacgctatg gactac 36
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv HCDR3
<400> 74
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv LCDR1
<400> 75
aagagtatta gtaagtac 18
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv LCDR2
<400> 76
Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv LCDR2
<400> 77
tctggctcc 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv LCDR2
<400> 78
Ser Gly Ser
1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv LCDR3
<400> 79
caacagcata ttgaatatcc ttggacg 27
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv LCDR3
<400> 80
Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 81
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv重链
<400> 81
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat ttcaaccctt ataatgatta cacacgctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatctgac 300
ggctactacg acgctatgga ctactggggg caagggacca cggtcaccgt ctcctcg 357
<210> 82
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv重链
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv轻链
<400> 83
gacatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtaa gagtattagt aagtacttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatccattct ggctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag catattgaat atccttggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv轻链
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv
<400> 85
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat ttcaaccctt ataatgatta cacacgctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatctgac 300
ggctactacg acgctatgga ctactggggg caagggacca cggtcaccgt ctcctcggga 360
ggcggtggat caggcggtgg aggcagcgga ggaggtggct ccggtggcgg agggagcgac 420
atccagatga cccagtctcc ttcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 480
acttgccggg ccagtaagag tattagtaag tacttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 540
aaagccccta agctcctgat ccattctggc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 600
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc actctcacca tcagcagcct gcagcctgat 660
gattttgcaa cttattactg ccaacagcat attgaatatc cttggacgtt cggccaaggg 720
accaaggtgg aaatcaaa 738
<210> 86
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA scFv
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv HCDR1
<400> 87
gggtacacct tcacccggtc taca 24
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv HCDR1
<400> 88
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser Thr
1 5
<210> 89
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv HCDR2
<400> 89
atcaaccctt cctctgcata cacc 24
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv HCDR2
<400> 90
Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr
1 5
<210> 91
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv HCDR3
<400> 91
gcatctcccc aggtccatta tgactacaac gggtttccgt ac 42
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv HCDR3
<400> 92
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr
1 5 10
<210> 93
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv LCDR1
<400> 93
agttccgtat cctac 15
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv LCDR1
<400> 94
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv LCDR2
<400> 95
gattcaagt 9
<210> 96
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv LCDR2
<400> 96
Asp Ser Ser
1
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv LCDR3
<400> 97
caacaatggt caagaaatcc gccgaca 27
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv LCDR3
<400> 98
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 99
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv重链
<400> 99
caagtacaac tcgttcaaag tggcgcagaa gtaaagaagc caggcgccag tgttaaggtg 60
agctgcaagg caagcgggta caccttcacc cggtctacaa tgcactgggt aagacaagca 120
ccagggcaag gactcgaatg gattggttac atcaaccctt cctctgcata caccaactac 180
gctcaaaagt tccagggccg cgttactttg acagcggata aatctacatc cacggcctat 240
atggaactgt caagcctcag gagcgaggac acagcggtat attactgtgc atctccccag 300
gtccattatg actacaacgg gtttccgtac tggggacaag gaactctggt tacagtcagt 360
agc 363
<210> 100
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv重链
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 101
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 101
gatatccaga tgacccaaag tccgagctcg ttgagtgcaa gtgtaggaga ccgcgtaacg 60
attacttgca gagcttcaag ttccgtatcc tacatgaatt ggtatcagca aaagcctgga 120
aaagccccta agcgctggat atacgattca agtaagttgg cttctggcgt cccatcacgg 180
ttttctggtt caggttccgg tacagatttt acgctgacaa tcagctctct ccaaccggaa 240
gatttcgcaa cctattactg tcaacaatgg tcaagaaatc cgccgacatt cgggcaggga 300
acaaaagtcg agataaaa 318
<210> 102
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 103
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv
<400> 103
caagtacaac tcgttcaaag tggcgcagaa gtaaagaagc caggcgccag tgttaaggtg 60
agctgcaagg caagcgggta caccttcacc cggtctacaa tgcactgggt aagacaagca 120
ccagggcaag gactcgaatg gattggttac atcaaccctt cctctgcata caccaactac 180
gctcaaaagt tccagggccg cgttactttg acagcggata aatctacatc cacggcctat 240
atggaactgt caagcctcag gagcgaggac acagcggtat attactgtgc atctccccag 300
gtccattatg actacaacgg gtttccgtac tggggacaag gaactctggt tacagtcagt 360
agcggcggag gcggaagcgg aggtgggggc tccggaggcg ggggaagcgg cggaggtggc 420
tctgatatcc agatgaccca aagtccgagc tcgttgagtg caagtgtagg agaccgcgta 480
acgattactt gcagagcttc aagttccgta tcctacatga attggtatca gcaaaagcct 540
ggaaaagccc ctaagcgctg gatatacgat tcaagtaagt tggcttctgg cgtcccatca 600
cggttttctg gttcaggttc cggtacagat tttacgctga caatcagctc tctccaaccg 660
gaagatttcg caacctatta ctgtcaacaa tggtcaagaa atccgccgac attcgggcag 720
ggaacaaaag tcgagataaa a 741
<210> 104
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser
180 185 190
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 105
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA x Fc节x 抗CD3 scFv (链1)
<400> 105
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat ttcaaccctt ataatgatta cacacgctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatctgac 300
ggctactacg acgctatgga ctactggggg caagggacca cggtcaccgt ctcctcggga 360
ggcggtggat caggcggtgg aggcagcgga ggaggtggct ccggtggcgg agggagcgac 420
atccagatga cccagtctcc ttcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 480
acttgccggg ccagtaagag tattagtaag tacttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 540
aaagccccta agctcctgat ccattctggc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 600
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ccagcacctc cagccgctgc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960
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caggactggc tgaatggcaa ggaatacaag tgcgcggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa 1200
ggcttctatc caagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1320
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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggcgg cgggggatcc 1440
ccgtcacaag tacaactcgt tcaaagtggc gcagaagtaa agaagccagg cgccagtgtt 1500
aaggtgagct gcaaggcaag cgggtacacc ttcacccggt ctacaatgca ctgggtaaga 1560
caagcaccag ggcaaggact cgaatggatt ggttacatca acccttcctc tgcatacacc 1620
aactacgctc aaaagttcca gggccgcgtt actttgacag cggataaatc tacatccacg 1680
gcctatatgg aactgtcaag cctcaggagc gaggacacag cggtatatta ctgtgcatct 1740
ccccaggtcc attatgacta caacgggttt ccgtactggg gacaaggaac tctggttaca 1800
gtcagtagcg gcggaggcgg aagcggaggt gggggctccg gaggcggggg aagcggcgga 1860
ggtggctctg atatccagat gacccaaagt ccgagctcgt tgagtgcaag tgtaggagac 1920
cgcgtaacga ttacttgcag agcttcaagt tccgtatcct acatgaattg gtatcagcaa 1980
aagcctggaa aagcccctaa gcgctggata tacgattcaa gtaagttggc ttctggcgtc 2040
ccatcacggt tttctggttc aggttccggt acagatttta cgctgacaat cagctctctc 2100
caaccggaag atttcgcaac ctattactgt caacaatggt caagaaatcc gccgacattc 2160
gggcagggaa caaaagtcga gataaaaagg tca 2193
<210> 106
<211> 731
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA x Fc节x 抗CD3 scFv (链1)
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
245 250 255
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Pro Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
485 490 495
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
500 505 510
Arg Ser Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
515 520 525
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln
530 535 540
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr
545 550 555 560
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
565 570 575
Tyr Cys Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr
580 585 590
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
595 600 605
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
610 615 620
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
625 630 635 640
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
645 650 655
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp
660 665 670
Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
675 680 685
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
690 695 700
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe
705 710 715 720
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
725 730
<210> 107
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA x Fc孔
(链2)
<400> 107
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
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cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat ttcaaccctt ataatgatta cacacgctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
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acttgccggg ccagtaagag tattagtaag tacttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 540
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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggt 1428
<210> 108
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA x Fc孔
(链2)
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
245 250 255
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 109
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv
<400> 109
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aaagccccta agcgctggat atacgattca agtaagttgg cttctggcgt cccatcacgg 180
ttttctggtt caggttccgg tacagatttt acgctgacaa tcagctctct ccaaccggaa 240
gatttcgcaa cctattactg tcaacaatgg tcaagaaatc cgccgacatt cgggcaggga 300
acaaaagtcg agataaaagg cggaggcgga agcggaggtg ggggctccgg aggcggggga 360
agcggcggag gtggctctca agtacaactc gttcaaagtg gcgcagaagt aaagaagcca 420
ggcgccagtg ttaaggtgag ctgcaaggca agcgggtaca ccttcacccg gtctacaatg 480
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tctgcataca ccaactacgc tcaaaagttc cagggccgcg ttactttgac agcggataaa 600
tctacatcca cggcctatat ggaactgtca agcctcagga gcgaggacac agcggtatat 660
tactgtgcat ctccccaggt ccattatgac tacaacgggt ttccgtactg gggacaagga 720
actctggtta cagtcagtag c 741
<210> 110
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 scFv
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
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100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser Thr Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
165 170 175
Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
180 185 190
Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
210 215 220
Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 111
<211> 2187
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA x Fc节x 抗CD3 scFv
(链1)
<400> 111
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat ttcaaccctt ataatgatta cacacgctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatctgac 300
ggctactacg acgctatgga ctactggggg caagggacca cggtcaccgt ctcctcggga 360
ggcggtggat caggcggtgg aggcagcgga ggaggtggct ccggtggcgg agggagcgac 420
atccagatga cccagtctcc ttcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 480
acttgccggg ccagtaagag tattagtaag tacttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 540
aaagccccta agctcctgat ccattctggc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 600
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc actctcacca tcagcagcct gcagcctgat 660
gattttgcaa cttattactg ccaacagcat attgaatatc cttggacgtt cggccaaggg 720
accaaggtgg aaatcaaaga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 780
ccagcacctc cagccgctgc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020
caggactggc tgaatggcaa ggaatacaag tgcgcggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa 1200
ggcttctatc caagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1320
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggcgg cgggggatcc 1440
ccgtcagata tccagatgac ccaaagtccg agctcgttga gtgcaagtgt aggagaccgc 1500
gtaacgatta cttgcagagc ttcaagttcc gtatcctaca tgaattggta tcagcaaaag 1560
cctggaaaag cccctaagcg ctggatatac gattcaagta agttggcttc tggcgtccca 1620
tcacggtttt ctggttcagg ttccggtaca gattttacgc tgacaatcag ctctctccaa 1680
ccggaagatt tcgcaaccta ttactgtcaa caatggtcaa gaaatccgcc gacattcggg 1740
cagggaacaa aagtcgagat aaaaggcgga ggcggaagcg gaggtggggg ctccggaggc 1800
gggggaagcg gcggaggtgg ctctcaagta caactcgttc aaagtggcgc agaagtaaag 1860
aagccaggcg ccagtgttaa ggtgagctgc aaggcaagcg ggtacacctt cacccggtct 1920
acaatgcact gggtaagaca agcaccaggg caaggactcg aatggattgg ttacatcaac 1980
ccttcctctg catacaccaa ctacgctcaa aagttccagg gccgcgttac tttgacagcg 2040
gataaatcta catccacggc ctatatggaa ctgtcaagcc tcaggagcga ggacacagcg 2100
gtatattact gtgcatctcc ccaggtccat tatgactaca acgggtttcc gtactgggga 2160
caaggaactc tggttacagt cagtagc 2187
<210> 112
<211> 729
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA x Fc节x 抗CD3 scFv
(链1)
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
245 250 255
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Pro Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
485 490 495
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
500 505 510
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp
515 520 525
Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
530 535 540
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
545 550 555 560
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro
565 570 575
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
580 585 590
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
595 600 605
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
610 615 620
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
625 630 635 640
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
645 650 655
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
660 665 670
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
675 680 685
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
690 695 700
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
705 710 715 720
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
725
<210> 113
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01012 VH结构域
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caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactactaca tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat tttaatcctt ataatgatta tactagatac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtctatcag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc aagatcggat 300
ggttactacg atgctatgga ctactggggt caaggaacca cagtcaccgt ctcctcg 357
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01012 VH结构域
<400> 114
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01012 VL结构域
<400> 115
gatatccaga tgacccagtc tccatccgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtttca gcagaaacca 120
gggaaagttc ctaagctccg catccattct ggatctactt tgcaatcagg ggtcccatct 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag catattgaat acccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acga 324
<210> 116
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01012 VL结构域
<400> 116
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Arg Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 117
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 107-1A4 VH结构域
<400> 117
gagatccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
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aaccagaatt tcaatggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcattct attactgtgc aagatcggat 300
ggttactacg atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcg 357
<210> 118
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 107-1A4 VH结构域
<400> 118
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Asn Asn Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 119
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 107-1A4 VL结构域
<400> 119
gatgtccaga taacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60
attaattgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtatca agagaaacct 120
gggaaagcta ataagctact tatccattct ggatccactt tgcaatctgg aataccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240
gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag catattgaat acccgtggac gttcggtggt 300
ggcaccaaac tggaaattaa acgggcc 327
<210> 120
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 107-1A4 VL结构域
<400> 120
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 121
<400> 121
000
<210> 122
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS-7 VH结构域
<400> 122
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr
115
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<400> 123
000
<210> 124
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS-7 VL结构域
<400> 124
Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Phe Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
100 105
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<400> 125
000
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DRA222 VH结构域(TSC266 CD3 VH结构域)
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
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<400> 127
000
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DRA222VL结构域(TSC266 CD3 VL结构域)
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
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<400> 129
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC456 VH结构域
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<400> 131
000
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC456 VL结构域
<400> 132
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<400> 133
000
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS7H14 VH结构域
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<400> 135
000
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS7H14 VL结构域
<400> 136
Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala
65 70 75 80
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Met Pro Pro Thr Phe Gly Gln
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Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
100
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<400> 137
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS7H15 VH结构域
<400> 138
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Arg
50 55 60
Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<400> 139
000
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS7H15 VL结构域
<400> 140
Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
100 105
<210> 141
<400> 141
000
<210> 142
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS7H16 VH结构域
<400> 142
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 143
<400> 143
000
<210> 144
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS7H16 VL结构域
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 145
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> csc(s)-hIgG1铰链
<400> 146
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 147
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 148
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> css(s)-hIgG1铰链
<400> 149
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scs(s)-hIgG1铰链
<400> 150
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ccc(s)-hIgG1铰链
<400> 151
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ccc(p)-hIgG1铰链
<400> 152
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 153
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sss(p)-hIgG1铰链
<400> 153
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 154
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> csc(p)-hIgG1铰链
<400> 154
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 155
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ssc(p)-hIgG1铰链
<400> 155
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 156
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scc(p)-hIgG1铰链
<400> 156
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 157
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> css(p)-hIgG1铰链
<400> 157
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 158
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scs(p)-hIgG1铰链
<400> 158
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 159
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Scppcp
<400> 159
Ser Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 160
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> STD1
<400> 160
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asn Ser
20
<210> 161
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> STD2
<400> 161
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Asn Ser
35
<210> 162
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H1
<400> 162
Asn Ser
1
<210> 163
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H2
<400> 163
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H3
<400> 164
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10
<210> 165
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H4
<400> 165
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10
<210> 166
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H5
<400> 166
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10 15
<210> 167
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H6
<400> 167
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Asn Ser
<210> 168
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H7
<400> 168
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser
1 5
<210> 169
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (G4S)3
<400> 169
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 170
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H105
<400> 170
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 171
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (G4S)4
<400> 171
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 172
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H94
<400> 172
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Asn Ser
<210> 173
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H111
<400> 173
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Gly Ser
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H114
<400> 174
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro
1 5 10 15
Ser
<210> 175
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G4S
<400> 175
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 176
<400> 176
000
<210> 177
<211> 2187
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA x Fc节x 抗CD3 scFv (链1)
<400> 177
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat ttcaaccctt ataatgatta cacacgctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatctgac 300
ggctactacg acgctatgga ctactggggg caagggacca cggtcaccgt ctcctcggga 360
ggcggtggat caggcggtgg aggcagcgga ggaggtggct ccggtggcgg agggagcgac 420
atccagatga cccagtctcc ttcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 480
acttgccggg ccagtaagag tattagtaag tacttggcct ggtatcagca gaaaccaggg 540
aaagccccta agctcctgat ccattctggc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 600
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc actctcacca tcagcagcct gcagcctgat 660
gattttgcaa cttattactg ccaacagcat attgaatatc cttggacgtt cggccaaggg 720
accaaggtgg aaatcaaaga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 780
ccagcacctc cagccgctgc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020
caggactggc tgaatggcaa ggaatacaag tgcgcggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa 1200
ggcttctatc caagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1320
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggcgg cgggggatcc 1440
ccgtcacaag tacaactcgt tcaaagtggc gcagaagtaa agaagccagg cgccagtgtt 1500
aaggtgagct gcaaggcaag cgggtacacc ttcacccggt ctacaatgca ctgggtaaga 1560
caagcaccag ggcaaggact cgaatggatt ggttacatca acccttcctc tgcatacacc 1620
aactacgctc aaaagttcca gggccgcgtt actttgacag cggataaatc tacatccacg 1680
gcctatatgg aactgtcaag cctcaggagc gaggacacag cggtatatta ctgtgcatct 1740
ccccaggtcc attatgacta caacgggttt ccgtactggg gacaaggaac tctggttaca 1800
gtcagtagcg gcggaggcgg aagcggaggt gggggctccg gaggcggggg aagcggcgga 1860
ggtggctctg atatccagat gacccaaagt ccgagctcgt tgagtgcaag tgtaggagac 1920
cgcgtaacga ttacttgcag agcttcaagt tccgtatcct acatgaattg gtatcagcaa 1980
aagcctggaa aagcccctaa gcgctggata tacgattcaa gtaagttggc ttctggcgtc 2040
ccatcacggt tttctggttc aggttccggt acagatttta cgctgacaat cagctctctc 2100
caaccggaag atttcgcaac ctattactgt caacaatggt caagaaatcc gccgacattc 2160
gggcagggaa caaaagtcga gataaaa 2187
<210> 178
<211> 729
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗PSMA x Fc节x 抗CD3 scFv (链1)
<400> 178
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
245 250 255
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Pro Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
485 490 495
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
500 505 510
Arg Ser Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
515 520 525
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln
530 535 540
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr
545 550 555 560
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
565 570 575
Tyr Cys Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr
580 585 590
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
595 600 605
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
610 615 620
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
625 630 635 640
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
645 650 655
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp
660 665 670
Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
675 680 685
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
690 695 700
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe
705 710 715 720
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
725
<210> 179
<211> 2820
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mIgG Fc-人PSMA ECD
<400> 179
tcgagtgagc ccagagggcc cacaatcaag ccctgtcctc catgcaaatg cccggctcca 60
aatgctgcag gtggtccatc cgtcttcatc ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg 120
atctccctga gccccatagt cacatgtgtg gtggtggatg tgagcgagga cgacccagat 180
gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat 240
agagaggatt acaacagtac tctccgggtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 300
tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca aagacctcgc tgcgcccatc 360
gagagaacca tctcaaaacc caaagggtca gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct 420
ccaccagaag aagagatgac taagaaacag gtcactctga cctgcatggt cacagacttc 480
atgcctgaag acatttacgt ggagtggact aacaacggga aaacagagct aaactacaag 540
aacactgaac cagtcctgga ctctgatggt tcttacttca tgtacagcaa gctgagagtg 600
gaaaagaaga actgggtgga aagaaatagc tactcctgtt cagtggtcca cgagggtctg 660
cacaatcacc acacgactaa gagcttctcc cggactccgg gctcctccaa tgaagctact 720
aacattactc caaagcataa tatgaaagca tttttggatg aattgaaagc tgagaacatc 780
aagaagttct tatataattt tacacagata ccacatttag caggaacaga acaaaacttt 840
cagcttgcaa agcaaattca atcccagtgg aaagaatttg gcctggattc tgttgagcta 900
gcacattatg atgtcctgtt gtcctaccca aataagactc atcccaacta catctcaata 960
attaatgaag atggaaatga gattttcaac acatcattat ttgaaccacc tcctccagga 1020
tatgaaaatg tttcggatat tgtaccacct ttcagtgctt tctctcctca aggaatgcca 1080
gagggcgatc tagtgtatgt taactatgca cgaactgaag acttctttaa attggaacgg 1140
gacatgaaaa tcaattgctc tgggaaaatt gtaattgcca gatatgggaa agttttcaga 1200
ggaaataagg ttaaaaatgc ccagctggca ggggccaaag gagtcattct ctactccgac 1260
cctgctgact actttgctcc tggggtgaag tcctatccag atggttggaa tcttcctgga 1320
ggtggtgtcc agcgtggaaa tatcctaaat ctgaatggtg caggagaccc tctcacacca 1380
ggttacccag caaatgaata tgcttatagg cgtggaattg cagaggctgt tggtcttcca 1440
agtattcctg ttcatccaat tggatactat gatgcacaga agctcctaga aaaaatgggt 1500
ggctcagcac caccagatag cagctggaga ggaagtctca aagtgcccta caatgttgga 1560
cctggcttta ctggaaactt ttctacacaa aaagtcaaga tgcacatcca ctctaccaat 1620
gaagtgacaa gaatttacaa tgtgataggt actctcagag gagcagtgga accagacaga 1680
tatgtcattc tgggaggtca ccgggactca tgggtgtttg gtggtattga ccctcagagt 1740
ggagcagctg ttgttcatga aattgtgagg agctttggaa cactgaaaaa ggaagggtgg 1800
agacctagaa gaacaatttt gtttgcaagc tgggatgcag aagaatttgg tcttcttggt 1860
tctactgagt gggcagagga gaactcaaga ctccttcaag agcgtggcgt ggcttatatt 1920
aatgctgact catctataga aggaaactac actctgagag ttgattgtac accgctgatg 1980
tacagcttgg tacacaacct aacaaaagag ctgaaaagcc ctgatgaagg ctttgaaggc 2040
aaatctcttt atgaaagttg gactaaaaaa agtccttccc cagagttcag tggcatgccc 2100
aggataagca aattgggatc tggaaatgat tttgaggtgt tcttccaacg acttggaatt 2160
gcttcaggca gagcacggta tactaaaaat tgggaaacaa acaaattcag cggctatcca 2220
ctgtatcaca gtgtctatga aacatatgag ttggtggaaa agttttatga tccaatgttt 2280
aaatatcacc tcactgtggc ccaggttcga ggagggatgg tgtttgagct agccaattcc 2340
atagtgctcc cttttgattg tcgagattat gctgtagttt taagaaagta tgctgacaaa 2400
atctacagta tttctatgaa acatccacag gaaatgaaga catacagtgt atcatttgat 2460
tcactttttt ctgcagtaaa gaattttaca gaaattgctt ccaagttcag tgagagactc 2520
caggactttg acaaaagcaa cccaatagta ttaagaatga tgaatgatca actcatgttt 2580
ctggaaagag catttattga tccattaggg ttaccagaca ggccttttta taggcatgtc 2640
atctatgctc caagcagcca caacaagtat gcaggggagt cattcccagg aatttatgat 2700
gctctgtttg atattgaaag caaagtggac ccttccaagg cctggggaga agtgaagaga 2760
cagatttatg ttgcagcctt cacagtgcag gcagctgcag agactttgag tgaagtagcc 2820
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mIgG Fc- 人PSMA ECD氨基酸序列
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50 55 60
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<223> mIgG Fc-食蟹猴PSMA ECD
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atctacaata tttctatgaa acatccacag gaaatgaaga catacagtgt atcatttgat 2460
tcactttttt ctgcagtaaa gaattttaca gaaattgctt ccaagttcag tgagagactc 2520
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ctggaaagag catttattga tccattaggg ttaccagaca gaccttttta taggcatgtc 2640
atctatgctc caagcagcca caacaagtat gcaggggagt cattcccagg aatttatgat 2700
gctctgtttg atatcgaaag caaagtggac ccttcccagg cctggggaga agtgaagaga 2760
cagatttcta ttgcaacctt cacagtgcaa gcagctgcag agactttgag tgaagtggcc 2820
<210> 182
<211> 940
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mIgG Fc-食蟹猴PSMA ECD氨基酸序列
<400> 182
Ser Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys
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Cys Pro Ala Pro Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
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Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu
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Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe
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Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile Gln Ser
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Pro Pro Ala Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro Phe Ser
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Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg
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Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Thr Gly Val Ile
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Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys Leu Leu
485 490 495
Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Ser Pro Asp Ser Ser Trp Arg Gly Ser
500 505 510
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580 585 590
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595 600 605
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01022VH氨基酸序列
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115
<210> 188
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01023VH氨基酸序列
<400> 188
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 189
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01024VH氨基酸序列
<400> 189
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01025VH氨基酸序列
<400> 190
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 191
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01071VH氨基酸序列
<400> 191
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 192
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGVH1-46+J6氨基酸序列
<400> 192
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 193
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tsc189VL氨基酸序列
<400> 193
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 194
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01019VL氨基酸序列
<400> 194
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 195
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01020VL氨基酸序列
<400> 195
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 196
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01021VL氨基酸序列
<400> 196
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 197
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01022VL氨基酸序列
<400> 197
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 198
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01023VL氨基酸序列
<400> 198
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 199
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01024VL氨基酸序列
<400> 199
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 200
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01025VL氨基酸序列
<400> 200
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Gly Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 201
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PSMA01071VL氨基酸序列
<400> 201
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 202
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGKV1-5+J1氨基酸序列
<400> 202
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 203
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS7VH氨基酸序列
<400> 203
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 204
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH1-46+J4氨基酸序列
<400> 204
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 205
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRIS7VL氨基酸序列
<400> 205
Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Phe Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105
<210> 206
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VK1-39+J1氨基酸序列
<400> 206
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
Claims (107)
1.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至肿瘤相关抗原(TAA)的第一单链可变片段(scFv)、(ii)免疫球蛋白恒定区和(iii)结合至CD3的scFv；以及
(b)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含(i)结合至所述TAA的第二scFv和(ii)免疫球蛋白恒定区，
其中所述双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述TAA是PSMA、HER2或BCMA。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述TAA是PSMA。
4.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽与所述第二多肽通过至少一个二硫键接合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至所述TAA的所述第一scFv呈VH-VL取向。
6.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至所述TAA的所述第一scFv呈VL-VH取向。
7.如权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至所述TAA的所述第二scFv呈VH-VL取向。
8.如权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至所述TAA的所述第二scFv呈VL-VH取向。
9.如权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至所述TAA的所述第一scFv与结合至所述TAA的所述第二scFv是相同的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至CD3的所述scFv呈VH-VL取向。
11.如权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至CD3的所述scFv呈VL-VH取向。
12.如权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽中的所述免疫球蛋白恒定区包含节突变和/或所述第二多肽中的所述免疫球蛋白恒定区包含孔突变。
13.如权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽中的所述免疫球蛋白恒定区包含孔突变和/或所述第二多肽中的所述免疫球蛋白恒定区包含结突变。
14.如权利要求12或13所述的双特异性抗体，其中包含结突变的免疫球蛋白恒定区包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列和/或包含孔突变的所述免疫球蛋白恒定区包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体，其中与野生型免疫球蛋白恒定区相比，所述免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止FcγR1和/或FcγRIIIb的结合。
16.如权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体，其中与野生型免疫球蛋白恒定区相比，所述免疫球蛋白恒定区包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代和/或缺失以防止或降低CDC活性。
17.如权利要求1-16中任一项所述的双特异性抗体，其中所述免疫球蛋白恒定区包含IgG1 CH2结构域，根据EU编号系统，所述IgG1 CH2结构域包含E233P、L234A、L235A、G237A和K322A取代以及G236缺失。
18.如权利要求1-17中任一项所述的双特异性抗体，其中所述免疫球蛋白恒定区包含IgG1的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。
19.如权利要求1-18中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体不含CH1结构域。
20.如权利要求1-19中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至所述TAA的所述第一scFv、结合至CD3的所述scFv和/或结合至所述TAA的所述第二scFv包含甘氨酸-丝氨酸接头。
21.如权利要求1-19中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至所述TAA的所述第一scFv、结合至CD3的所述scFv和/或结合至所述TAA的所述第二scFv包括含氨基酸序列(Gly4Ser)n的甘氨酸-丝氨酸接头，其中n＝1-5。
22.如权利要求21所述的双特异性抗体，其中n＝4。
23.如权利要求1-22中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽还在scFv与免疫球蛋白恒定结构域之间包含至少一个接头。
24.如权利要求23所述的双特异性抗体，其中所述接头包含铰链区。
25.如权利要求24所述的双特异性抗体，其中所述铰链是IgG1铰链区。
26.如权利要求25所述的双特异性抗体，其中所述铰链包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。
27.如权利要求3-26中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至PSMA的所述第一scFv和/或结合至PSMA的所述第二scFv能够结合至食蟹猴PSMA。
28.如权利要求27所述的双特异性抗体，其中结合至PSMA的所述第一scFv和/或结合至食蟹猴PSMA的所述第二scFv具有比结合至人PSMA的EC50高不超过5倍的EC50。
29.如权利要求1-28中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体能够同时结合至所述TAA和CD3。
30.如权利要求1-29所述的双特异性抗体，其中结合至CD3的所述scFv结合至CD3ε。
31.如权利要求3-30中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至PSMA的所述第一scFv包含可变重链(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2和VH CDR3，所述VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3分别包含SEQ ID NO:70、72和74的氨基酸序列，并且包含可变轻链(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:76、78和80的氨基酸序列。
32.如权利要求3-31中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至PSMA的所述第一scFv包括含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH结构域，并且包括含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL结构域。
33.如权利要求3-32中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至PSMA的所述第一scFv包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
34.如权利要求1-33中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至CD3的所述scFv包含VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:88、90和92的氨基酸序列，并且包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:94、96和98的氨基酸序列。
35.如权利要求1-34中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至CD3的所述scFv包括含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH结构域，并且包括含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VL结构域。
36.如权利要求1-35中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至CD3的所述scFv包含SEQ ID NO:104或110的氨基酸序列。
37.如权利要求3-36中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至PSMA的所述第二scFv包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:70、72和74的氨基酸序列，并且包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:76、78和80的氨基酸序列。
38.如权利要求3-37中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至PSMA的所述第二scFv包括含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH结构域，并且包括含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL结构域。
39.如权利要求3-38中任一项所述的双特异性抗体，其中结合至PSMA的所述第二scFv包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
40.如权利要求3-39中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽包含SEQ IDNO:106、178或112的氨基酸序列。
41.如权利要求3-39中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二多肽包含SEQ IDNO:108的氨基酸序列。
42.如权利要求1-41中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体能够促进CD8+T细胞和/或CD4+T细胞的扩增。
43.如权利要求1-42中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体能够活化CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。
44.如权利要求1-43中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体能够增加中央记忆T细胞(TCM)和/或效应记忆T细胞(TEM)。
45.如权利要求1-44中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体能够减少原始和/或终末分化T细胞(Teff)。
46.如权利要求1-45中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体能够减少IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α、颗粒酶B、IL-10和/或GM-CSF的分泌。
47.如权利要求1-46中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体能够增加NFκB、NFAT和/或ERK信号传导路径的信号传导。
48.一种包含PSMA结合结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述PSMA结合结构域包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
49.一种包含PSMA结合结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述PSMA结合结构域包含VH和VL，其中所述VL包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
50.如权利要求48或49所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
51.一种包含CD3抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD3抗原结合结构域包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。
52.一种包含CD3抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD3抗原结合结构域包含VH和VL，其中所述VL包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
53.如权利要求51或52所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
54.如权利要求48-53中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG抗体，任选地其中所述IgG抗体是IgG1抗体。
55.如权利要求54所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区，任选地其中所述重链恒定区是人IgG1重链恒定区，并且任选地其中所述轻链恒定区是人IgGκ轻链恒定区。
56.如权利要求48-53中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv，或scFv-Fc。
57.如权利要求56所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含scFv。
58.如权利要求48-50和56中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
59.如权利要求48-53和56中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。
60.如权利要求48-59中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段是双特异性的。
61.如权利要求60所述的抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或片段包含特异性结合PSMA的抗原结合结构域和特异性结合CD3的抗原结合结构域。
62.如权利要求61所述的抗体或其抗原结合片段，其中(i)特异性结合PSMA的所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:82和84的氨基酸序列，和/或(ii)特异性结合CD3的所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:100和102的氨基酸序列。
63.如权利要求61或62所述的抗体或其抗原结合片段，其中特异性结合PSMA的所述抗原结合结构域包含呈VH-VL取向的VH和VL。
64.如权利要求61或62所述的抗体或抗原结合片段，其中特异性结合PSMA的所述抗原结合结构域包含呈VL-VH取向的VH和VL。
65.如权利要求61-64中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中特异性结合CD3的所述抗原结合结构域包含呈VH-VL取向的VH和VL。
66.如权利要求61-64中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中特异性结合CD3的所述抗原结合结构域包含呈VL-VH取向的VH和VL。
67.如权利要求61或62所述的抗体或其抗原结合片段，其中特异性结合PSMA的所述抗原结合结构域包括含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的scFv。
68.如权利要求61或62所述的抗体或其抗原结合片段，其中特异性结合CD3的所述抗原结合结构域包括含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的scFv。
69.如权利要求51-68中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对于CD3是单价的。
70.如权利要求51-68中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对于CD3是二价的。
71.如权利要求48-50和48-70中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对于PSMA是二价的。
72.如权利要求48-50和48-70中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对于PSMA是单价的。
73.如权利要求48-68中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含多肽，所述多肽按从氨基末端到羧基末端的顺序包含(i)第一单链可变片段(scFv)；(ii)接头，任选地其中所述接头是铰链区；(iii)免疫球蛋白恒定区；以及(iv)第二scFv，其中(a)所述第一scFv包含人CD3抗原结合结构域，并且所述第二scFv包含人PSMA抗原结合结构域，或者(b)所述第一scFv包含人PSMA抗原结合结构域并且所述第二scFv包含人CD3抗原结合结构域。
74.如权利要求48-72中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含节突变和孔突变。
75.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(a)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含(i)结合至PSMA的第一单链可变片段(scFv)，所述第一scFv包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；(ii)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的接头；(iii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定区；和(iv)结合至CD3的scFv，所述scFv包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；以及
(b)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含(i)结合至PSMA的第二scFv，所述第二scFv包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；(ii)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的接头；和(iii)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定区，
其中所述双特异性抗体不含第二CD3结合结构域。
76.一种结合至PSMA和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:106、178或112的氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列，并且其中所述双特异性抗体仅含一个CD3结合结构域。
77.一种结合至PSMA和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体由包含SEQ ID NO:106、178或112的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第二多肽组成。
78.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体或权利要求48-74中任一项所述的抗体。
79.一种载体，所述载体包含权利要求78所述的多核苷酸，任选地其中所述载体是表达载体。
80.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求78所述的多核苷酸或权利要求79所述的载体。
81.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含编码权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体或权利要求48-74中任一项所述的抗体的多核苷酸的组合。
82.如权利要求81所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸在单一载体上编码。
83.如权利要求81所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸在多个载体上编码。
84.如权利要求81-83中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞选自由CHO、HEK293或COS细胞组成的组。
85.一种产生特异性结合至人PSMA和人CD3的双特异性抗体的方法，所述方法包括培养权利要求81-84中任一项所述的宿主细胞以产生所述抗体，任选地还包括回收所述抗体。
86.一种用于检测样品中的PSMA和CD3的方法，所述方法包括使所述样品与权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体接触，任选地其中所述样品包含细胞。
87.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体或权利要求48-74中任一项所述的抗体，以及药学上可接受的赋形剂。
88.一种用于增加T细胞增殖的方法，所述方法包括使T细胞与权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体或权利要求78所述的药物组合物接触。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
90.如权利要求88所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
91.如权利要求88-90中任一项所述的方法，其中所述细胞在受试者体内并且所述接触包括向所述受试者施用所述抗体或所述药物组合物。
92.一种用于增强受试者体内的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体或权利要求87所述的药物组合物。
93.一种用于诱导针对表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)的细胞的重定向T细胞的细胞毒性(RTCC)的方法，所述方法包括
使所述表达PSMA的细胞与权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体或权利要求87所述的组合物接触，并且其中所述接触是在诱导针对所述表达PSMA的细胞的RTCC的条件下进行的。
94.一种用于治疗受试者的病症的方法，其中所述疾病以前列腺特异性膜抗原(PSMA)的过表达为特征，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体或权利要求87所述的组合物。
95.如权利要求94所述的方法，其中权利要求1-47和75-77中任一项所述的双特异性抗体或权利要求87所述的组合物在所述受试者体内诱导重定向T细胞的细胞毒性(RTCC)。
96.如权利要求94或95所述的方法，其中所述双特异性抗体促进CD8+和/或CD4+T细胞的扩增或增殖。
97.如权利要求94或95所述的方法，其中所述双特异性抗体活化CD8+和/或CD4+T细胞。
98.如权利要求94或95所述的方法，其中所述双特异性抗体增加中央记忆T细胞(TCM)和/或效应记忆T细胞(TEM)。
99.如权利要求94或95所述的方法，其中所述双特异性抗体减少原始和/或终末分化T细胞(Teff)。
100.如权利要求94或95所述的方法，其中所述双特异性抗体减少IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α、颗粒酶B、IL-10和/或GM-CSF的分泌。
101.如权利要求94或95所述的方法，其中所述双特异性抗体增加NFκB、NFAT和/或ERK信号传导路径的信号传导。
102.如权利要求94所述的方法，其中所述病症是癌症。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、PSMA(+)癌症、转移性前列腺癌、透明细胞肾癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌和胃癌。
104.如权利要求102所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。
106.如权利要求94所述的方法，其中所述病症是前列腺病症。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述前列腺病症选自由前列腺癌和良性前列腺增生组成的组。
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