KR20100021601A - 단일-쇄 Ｆｃ(ＳｃＦｃ) 부분, 이를 포함하는 결합 폴리펩타이드, 및 이에 관련된 방법 - Google Patents

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그레이엄 케이 패링톤
아므나 사에드-코더
엘렌 가버
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바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 특히, 유전적으로-융합된 Fc 부위를 포함하는 Fc 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 예를 들어, 본 발명의 결합 폴리펩타이드를 대상체에게 투여함으로써 대상체에게서 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
Figure P1020097026052
단일-쇄 Fc 폴리펩타이드, 유전적으로-융합된 Fc 부분, 단일-쇄 Fc 부분, 결합 폴리펩타이드.

Description

단일-쇄 Ｆｃ(ＳｃＦｃ) 부분, 이를 포함하는 결합 폴리펩타이드, 및 이에 관련된 방법{SINGLE-CHAIN FC (ScFc) REGIONS, BINDING POLYPEPTIDES COMPRISING SAME, AND METHODS RELATED THERETO}
관련 출원
본 출원은 본 명세서에 온전히 참고로 포함된 것으로, 2007년 5월 14일에 발명의 명칭을 "유전적으로-융합된 Fc 부분을 함유하는 결합 폴리펩타이드 및 이에 관련된 방법 (BINDING POLYPEPTIDES CONTAINING GENETICALLY-FUSED FC REGIONS AND METHODS RELATED THERETO)"로 하여 출원된 미국 가출원 제60/930,227호 (대리인 서류번호: BGN-A247-1)를 우선권으로 주장한다. 추가로, 본 명세서 전체에 걸쳐서 인용된 모든 특허, 특허출원 및 문헌의 내용은 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다.
면역글로불린의 Fc 부분은 두 가지 카테고리로 분류되는 효과기 기능을 매개한다. 첫 번째는 항원 결합과는 무관하게 나타나는 기능이며; 이들 기능은 순환 중에서의 존속 및 트랜스사이토시스 (transcytosis)에 의해서 세포 장벽을 가로질러서 전이되는 능력을 부여한다 [참조: Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94, 1995, Capon et al. Nature 1989]. 면역글로불린의 IgG 서브클래스 (subclass)의 순환 반감기는 신생아 Fc 수용체 또는 FcRn에 대한 Fc 부분의 친화성 에 의해서 조절된다 [참조: Ghetie et　al., Nature Biotechnol. 15:637-640, 1997; Kim et.　al., Eur. J. Immunol. 24:542-548, 1994; Dall'Acqua et al. (J. Immunol. 169:5171-5180, 2002)]. 효과기 기능의 두 번째 일반적인 카테고리는 면역글로불린이 항원을 결합시킨 후에 작용하는 것을 포함한다. IgG의 경우에, 이들 기능은 보체 캐스케이드 (cascade) 또는 Fc 감마 수용체 (FcγR)-보유 세포의 참여를 수반한다. FcγR에 대한 Fc 부분의 결합은 특정의 면역효과, 예를 들어, 면역 컴플렉스의 엔도사이토시스 (endocytosis), 면역글로불린-코팅된 입자 또는 미생물의 포획 또는 파괴 (또한, 항체 의존적 식작용, 또는 ADCP라고도 칭함), 면역 컴플렉스의 청소, 킬러 세포에 의한 면역글로불린-코팅된 표적세포의 용해 (항체 의존적 세포-매개된 세포독성, 또는 ADCC로 칭함), 염증 매개체의 방출, 면역계 세포 활성화의 조절, 및 면역글로불린 생성의 조절을 야기한다.
특정의 조작된 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, 항체 변이체 (예를 들어, scFvs) 또는 항체 단편 (예를 들어, Fab 단편))은 이들의 더 작은 분자 크기 및/또는 1가로 인한 이점이 있지만, 기능적 Fc 부분의 부재에 기인할 수 있는 몇 가지 단점을 갖는다. 예를 들어, Fab 단편은 이들이 FcRn 결합을 위해서 필요한 Fc 부분을 결여하고, 이들의 큰 크기로 인하여 신장에 의해 혈액으로부터 제거되기 때문에 생체내에서 짧은 반감기를 갖는다. 1가 Fc 함유 결합 단백질을 생성시키는 것이 가능할 수 있지만, 현행 방법은 이량체 Fc 부분의 2 개의 중쇄 부분의 공동발현 (coexpression) 또는 결합 부위 (예를 들어, Fab 영역)에 대한 이량체 Fc 부분의 컨쥬게이션 (conjugation)을 필요로 한다. 이들 방법은, 공동발현이 응집체를 불 활성 단백질 이외에도 출발물질의 모든 존재 가능한 쌍을 나타내는 복잡한 혼합물인 생성물을 수득하기 때문에 비효율적이다. 따라서, 바람직한 기능성 결합 폴리펩타이드의 수득률은 낮다. 추가로, 선행기술의 방법을 사용하여서는 헤테로이량체 Fc 부분 (즉, 이량체 Fc 부분의 중쇄 부분이 서열이 상이한 경우)을 갖는 결합 분자를 효율적으로 생성시키는 것이 불가능하였다.
따라서, 바람직한 Fc 효과기 기능(들)을 유지하면서 효율적이고 왕성하게 생성될 수 있는 Fc 함유 결합 폴리펩타이드에 대한 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 무엇보다도 하나 이상의 유전적으로-융합된 Fc 부분을 포함하는 Fc 폴리펩타이드 (예를 들어, Fc 결합 폴리펩타이드)를 특징으로 한다. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드는 성분 Fc 부위가, 이들이 기능적 이량체 Fc 부분을 형성하도록 단일 폴리펩타이드 쇄에 유전적으로-융합된 단일 쇄 Fc 부분 ("scFc")을 포함한다. 특정의 구체예에서, scFc의 성분 Fc 부위는 Fc 부위들 사이에 개재된 폴리펩타이드 링커 (예를 들어, Fc 접속 펩타이드)를 통해서 탠덤 (tandem) 형으로 유전적으로 융합된다. 따라서, 본 발명의 scFc 폴리펩타이드는 하나의 인접한 뉴클레오타이드 서열의 일부분으로서 단일 개방 판독 프레임 (open reading frame) 내에서 코드화된 단일의 인접한 아미노산 서열에 의해서 형성된 scFc 부분(들)을 포함한다. 이와는 대조적으로, 통상적인 Fc 폴리펩타이드 (예를 들어, 통상적인 면역글로불린)의 Fc 부분은 해독-후 이량체화하지만 탠덤형으로 공유적으로 결합되지 않는 별개의 폴리펩타이드 쇄 내에 별개의 (즉, 결합되지 않은) Fc 영역 또는 부위를 포함하는 편성 호모이량체 (obligate homodimers)이다.
본 발명의 단일-쇄 Fc (scFc) 폴리펩타이드는 통상적인 Fc 폴리펩타이드에 비해서 몇 가지 이점을 제공한다. 특정의 관점에서, scFc 폴리펩타이드의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)은 결합 폴리펩타이드의 결합 부위에 (예를 들어, 항원 결합 단편 (예를 들어, Fab) 또는 scFv 분자에) 작동적으로 결합되어 scFc 결합 폴리펩타이드를 형성함으로써 결합 폴리펩타이드에 효과기 기능을 부여하거나 기존의 효과기 기능을 변화시킬 수 있다. 본 발명의 scFc 결합 폴리펩타이드는 단량체(또는 모노머) 또는 다량체(또는 멀티머) (예를 들어, 이량체(또는 다이머)일 수 있다. 본 발명의 신규한 scFc 결합 폴리펩타이드는 1가 결합 폴리펩타이드의 이점 (예를 들어, 부적절한 세포 시그날링 및/또는 엔도사이토시스를 유도할 수 있는 세포-표면 수용체 교차결합의 결여)을 적어도 하나의 구체예에서는, Fc-매개된 효과기 기능 (예를 들어, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 결합 및 보체 활성화를 부여하는 FcRn에 의한 결합에 기인한 반감기의 증가), 및 하나의 구체예에서는, 이러한 효과기 기능을 미세-조정할 수 있는 이점과 연합시킨다. 더구나, 본 발명의 scFc 결합 폴리펩타이드는 고-산출 제조를 위해서 쉽게 증대되는 매우 균질한 제제로 쉽게 발현될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 표적 결합 부위 (예를 들어, 하나 이상의 scFv 또는 Fab 단편과 같은 항원 결합 부위)를 포함하는 결합 폴리펩타이드는 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 N- 또는 C-말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 결합되고, 단일 유전자 구조물로 코드화됨으로써 2개 이상의 쇄의 공동발현에 기인하는 분자의 복잡한 혼합물을 피할 수 있다.
본 발명의 scFc 폴리펩타이드는 또한, 매우 균질한 제제로 이종(또는 헤테로머)(heteromeric) scFc 부분을 갖는 분자를 생산할 기회를 제공한다. 현재, 통상적인 Fc 부분을 구성하는 2 개의 Fc 부위가 서로 상이한, 예를 들어, 2 개의 Fc 부위 중의 단지 하나가 아미노산 변형 (예를 들어, 단일 CH2 및/또는 CH3 영역 내의 단일점 돌연변이)을 포함하는 이종 Fc 함유 분자를 생성시키고 정제하는 것은 매우 어렵다. 본 출원의 교시내용을 고려하면, scFc 부분의 모든 Fc 부위보다 더 적은 수가 돌연변이를 포함하는 이종 scFc 결합 폴리펩타이드는 이제 단일 유전자 구조물로부터 쉽게 수득될 수 있다. 이러한 분자는 제조를 위해서 쉽게 증대된다.
하나의 관점에서, 본 발명은 (i) 제1 표적 결합 부위, 및 (ii) 적어도 2 개의 유전적으로-융합된 Fc 부위를 포함하는 제1 단일-쇄 Fc (scFc) 부분을 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기에서 scFc 부분의 Fc 부위는 상기 Fc 부위 사이에 개재된 폴리펩타이드 링커 서열을 통해서 유전적으로 융합되고, scFc 부분은 상기의 결합 폴리펩타이드에 적어도 하나의 효과기 기능을 부여한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 또한, FcRn 결합 부분, FcγR 결합 부분 및 보체 결합 부분으로 구성된 군으로부터 선택된 영역 (예를 들어, 효과기 영역)을 포함하는 scFc 부분을 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 영역은 단백질 A 또는 단백질 G 결합 부분이다.
특정의 구체예에서, 상기 scFc 부분은 이종 scFc 부분이다. 하나의 구체예에서, 상기 이종 Fc 부분은 헤미글리코실화된다.
하나의 구체예에서, scFc 부분은 이종 scFc 부분이다. 또 다른 구체예에서, scFc 부분은 동종(또는 호모머) (homomeric) scFc 부분이다.
하나의 구체예에서, scFc 부분은 완전히 글리코실화된다. 또 다른 구체예에서, scFc 부분은 비글리코실화된다. 또 다른 구체예에서, 상기의 scFc 부분은 비푸코실화된다.
특정의 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 scFc 부분은 키메라 Fc 부분이다. 예를 들어, scFc 부분은 IgG2 분자의 CH2 영역 및 IgG4 분자의 CH3 영역을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 scFc 부분은 IgG2 분자의 CH2 부분 및 IgG4 분자의 CH2 부분을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, scFc는 변형되거나 키메라성인 힌지 (hinge) 부분, 예를 들어, IgG4 분자로부터의 중간 힌지 부분 및 IgG1 분자로부터의 상부 및 하부 힌지 부분을 포함하는 키메라 힌지를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 힌지 부분의 하나 이상의 시스테인 잔기는 세린 잔기에 의해서 치환된다.
하나의 구체예에서, scFc 부분은 2개 이상의 Fc 영역 또는 부위를 포함한다.
하나의 구체예에서, 하나 이상의 상기 Fc 부위는 CH2 영역-결실된 Fc 부위, CH3 영역-결실된 Fc 부위, 및 힌지-결실된 Fc 부위로 구성된 군으로부터 선택된 영역-결실된 Fc 부위이다.
하나의 구체예에서, 상기 Fc 부분 중의 적어도 하나는 상기 Fc 부위 내의 EU 협약 (convention) 아미노산 위치에서 적어도 하나의 Fc 돌연변이를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 2개 이상의 상기 Fc 부위는 상기 Fc 부위 내의 EU 협약 아미노산 위치에서 하나 이상의 Fc 돌연변이를 포함한다.
하나의 구체예에서는, 234, 236, 239, 241, 246-252, 254-256, 275, 277-288, 294, 296-298, 301, 303-307, 309, 310, 312, 313, 315, 328, 332, 334, 338, 342, 343, 350, 355, 359, 360, 361, 374, 376, 378, 381-385, 387, 389, 413, 415, 418, 422, 426, 428, 430-432, 434, 435, 438, 및 441-446 (EU 넘버링 협약)으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치가 결합 분자의 적어도 하나의 Fc 부위에서 돌연변이된다.
하나의 구체예에서, 적어도 하나의 Fc 돌연변이는 결합 분자의 적어도 하나의 Fc 부위의 힌지 영역 내에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 Fc 돌연변이는 CH2 영역 내에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 Fc 돌연변이는 CH3 영역 내에 위치한다.
하나의 구체예에서, CH3 영역은 결합 분자의 적어도 하나의 Fc 부위의 350, 355, 361, 389, 415, 441, 443, 및 446b (EU 넘버링 인덱스에 따름)로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 그의 조작된 시스테인 또는 티올 함유 유사체를 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 EU 위치 297에서 적어도 하나의 Fc 부위의 환원된 글리코실화를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 EU 위치 297에서 비푸코실화된다.
하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 약 50 내지 약 500개의 아미노산의 길이를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 약 50 내지 약 200개의 아미노산의 길이를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 약 1 내지 약 50개의 아미노산의 길이를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 약 10 내지 약 20개의 아미노산의 길이를 갖는다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 그의 힌지 부분 또는 일부분을 포함한다. 하나의 구체예에서, 힌지 부분은 키메라 힌지 부분이다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 gly/ser 펩타이드를 포함한다. 하나의 구체예에서, gly/ser 펩타이드는 화학식 (Gly4Ser)n으로 표시되며, 여기에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 양의 정수이다.
하나의 구체예에서, (Gly4 Ser)n scFc 링커는 (Gly4 Ser)4이다. 또 다른 구체예에서, (Gly4 Ser)n scFc 링커는 (Gly4 Ser)3이다.
하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 상기 제1 표적 결합 부위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 생물학적으로 적절한 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 포함한다. 하나의 구체예에서, 생물학적으로 적절한 폴리펩타이드는 항-거부반응 (anti-rejection) 또는 항-염증성 펩타이드이다. 또 다른 구체예에서, 생물학적으로 적절한 폴리펩타이드는 사이토킨 억제성 펩타이드, 세포 유착 억제성 펩타이드, 트롬빈 억제성 펩타이드 및 혈소판 억제성 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 사이토킨 억제성 펩타이드는 IL-1 억제성 펩타이드이다.
하나의 구체예에서, 제1 결합 부위는 scFc 부분의 N-말단에 유전적으로 융합된다. 또 다른 구체예에서, 제1 결합 부위는 scFc 부분의 C-말단에 유전적으로 융합된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 제2 표적 결합 부위를 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 제2 표적 결합 부위는 scFc 부분의 N-말단에 작동적으로 결합된다. 또 다른 구체예에서, 제2 표적 결합 부위는 scFc 부분의 C-말단에 작동적으로 결합된다. 또 다른 구체예에서, 결합 부위는 scFc 부분의 Fc 부위 (예를 들어, 1, 2개 이상의 CH2 영역 및/또는 1, 2개 이상의 CH3 영역) 상에 베니어링 (veneering)된다.
하나의 구체예에서, 적어도 하나의 표적 결합 부위는 항원 결합 부위, 수용체의 리간드 결합 부분, 및 리간드의 수용체 결합 부분으로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, 항원 결합 부위는 항체로부터 유도된다. 하나의 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 및 인간화된 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 부위는 scFv, Fab, 미니바디 (minibody), 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 나노바디 (nanobody), 카멜리드 (camelid) 및 Dab으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 변이체로부터 유도된다. 또 다른 구체예에서, 결합 부위는 비-면역글로불린 결합 분자로부터 유도되며, 예를 들어, 비-면역글로불린 결합 분자는 아드넥틴, 아피바디 (affibody), 다르핀 (DARPin) 및 안티칼린으로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 CDR, 가변 부분, 또는 리툭시마브 (Rituximab), 다클리주마브 (Daclizumab), 갈릭시마브 (Galiximab), CB6, Li33, 5c8, CBE11, BDA8, 14A2, B3F6, 2B8, Lym 1, Lym 2, LL2, Her2, 5E8, B1, MB1, BH3, B4, B72.3, CC49, 및 5E10으로 구성된 군으로부터 선택된 항체로부터 유래하는 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 결합 부위 포함한다.
하나의 구체예에서, 수용체의 리간드 결합 부분은 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 (superfamily)의 수용체, TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 수용체, 타이로신 키나제 (TK) 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, 리간드-게이트 (LG) 슈퍼패밀리의 수용체, 케모킨 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, IL-1/Toll-유사 수용체 (TLR) 슈퍼패밀리, 신경교 유래 향신경성 인자 (glial-derived neurotrophic factor (GDNF)) 수용체 패밀리의 수용체, 및 사이토킨 수용체 슈퍼패밀리로 구성된 군으로부터 선택된 수용체로부터 유도된다. 하나의 구체예에서, 상기의 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체는 LTβR이다. 또 다른 구체예에서, 상기 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체는 TNFa를 결합시킨다. 또 다른 구체예에서, 상기의 GDNF 수용체 패밀리의 수용체는 GFRα3이다.
하나의 구체예에서, 리간드의 수용체 결합 부분은 억제성 리간드로부터 유도된다. 하나의 구체예에서, 리간드의 수용체 결합 부분은 활성화 리간드로부터 유도된다. 하나의 구체예에서, 리간드는 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 수용체, TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 수용체, 타이로신 키나제 (TK) 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, 리간드-게이트 (LG) 슈퍼패밀리의 수용체, 케모킨 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, IL-1/Toll-유사 수용체 (TLR) 슈퍼패밀리, 및 사이토킨 수용체 슈퍼패밀리로 구성된 군으로부터 선택된 수용체를 결합시킨다. 하나의 구체예에서, 사이토킨 수용체 슈퍼패밀리의 수용체를 결합시키는 리간드는 β-인터페론이다.
하나의 구체예에서, 제1 및 2 표적 결합 부위는 상이한 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 제1 및 2 표적 결합 부위는 동일한 결합 특이성을 갖는다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 2개 이상의 scFc 부분을 추가로 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 하나의 기능적 부위에 컨쥬게이트된다.
하나의 구체예에서, 기능적 부위는 차단성 부위, 검출가능 부위, 진단적 부위, 및 치료학적 부위로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, 차단성 부위는 시스테인 부가물 (adduct), 혼합된 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, 검출가능 부위는 형광 부위 및 동위원소 부위로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, 진단적 부위는 질병 또는 장애의 존재를 밝혀낼 수 있다.
하나의 구체예에서, 치료학적 부위는 소염제, 항암제, 항-신경변성제 및 항감염제로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, 기능적 부위는 상기 폴리펩타이드 링커에 컨쥬게이트된다.
하나의 구체예에서, 기능적 부위는 디설파이드 결합을 통해서 컨쥬게이트된다. 또 다른 구체예에서, 기능적 부위는 헤테로이작용성 (heterobi-functional) 링커를 통해서 컨쥬게이트된다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 scFc 결합 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 다량체 결합 폴리펩타이드에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 제2 폴리펩타이드는 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, scFc 결합 폴리펩타이드)이다. 하나의 구체예에서, 제2 결합 폴리펩타이드는 (i) 적어도 제1 항원 결합 부분, 및 (ii) 적어도 제1 scFc 부분 (여기에서, 상기 scFc 부분은 적어도 2 개의 Fc 부위를 포함하고, 여기에서 상기 scFc 부분은 상기 결합 폴리펩타이드에 적어도 하나의 효과기 기능을 부여한다)을 포함한다. 하나의 구체예에서, 제2 결합 폴리펩타이드의 scFc 부분은 scFc 부분의 2 개의 Fc 부위 사이에 개재된 링커 폴리펩타이드 (예를 들어, Fc 접속 폴리펩타이드)를 포함한다.
하나의 구체예에서, 다량체 결합 폴리펩타이드는 이량체 결합 폴리펩타이드이다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자의 제1 또는 2 결합 부분은 면역 세포 또는 종양 세포 상에 존재하는 항원에 결합한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자의 적어도 하나의 Fc 부위는 IgG 이소타입의 부위이다.
하나의 구체예에서, IgG 이소타입은 IgG1 서브클래스이다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자의 적어도 하나의 Fc 부위는 인간 항체로부터 유도된다.
하나의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 핵산 분자는 발현 벡터 내에 존재한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하여, 결합 폴리펩타이드를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자를 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 질병 또는 장애는 염증성 장애, 신경학적 장애, 자가면역 장애, 및 신생물성 장애로 구성된 군으로부터 선택된다.
도 1A-D는 본 발명의 예시적인 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 결합 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커를 통해서 결합된 2 개의 Fc 부위로 이루어진 유 전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, 단일 쇄 Fc 또는 "scFc" 부분)에 결합된 (예를 들어, 인간 IgG1 힌지에 의해서) 항원-결합 부위 (예를 들어, Fab 부분)를 포함한다 (도 1A). Fab 부분, 인간 IgG1 힌지, 및 scFc 부분은 모두 단일 인접 유전자 또는 유전자 구조물에서 코드화된다. 구조물의 발현은 scFc 결합 폴리펩타이드의 이량체 형태 ("dc"; 도 1B) 또는 단량체 형태 ("sc"; 도 1C) 둘 다를 제공할 수 있다. 단량체 scFc를 포함하는 중쇄 및 경쇄의 영역 조직화는 도 1D에 도시된다.
도 2A-D는 scFc 결합 폴리펩타이드의 단량체 ("sc") 및 이량체 형태 ("dc")를 분리하기 위한 2-단계 정제방법의 결과를 나타낸 것이다. 정제방법은 친화성 크로마토그래피에 이어서 겔 여과 크로마토그래피를 이용한다. 도 2A는 낮은 pH에서 단백질 A 친화성 칼럼으로부터 용출된 분획의 흡광도 프로필을 나타낸다. 도 2B는 비-환원성 조건 하에서 결합 폴리펩타이드의 이량체 ("dc") 및 단량체 ("sc") 형태 둘 다를 함유하는 이들 용출된 분획의 상응하는 SDS PAGE 분석을 나타낸다. 단량체 및 이량체 형태는 둘 다 본질적으로, 단백질 A 칼럼으로부터 단일 피크로서 용출된다. 도 2C는 슈퍼덱스 (Superdex) 200 겔 여과 칼럼 상에서의 풀링된 (pooled) 단백질 A 용출액의 크기-배제 크로마토그래피가 이 혼합물을 2 개의 별도의 피크로 분할함을 나타낸다. 도 2D는 겔 여과 분획의 상응하는 비-환원성 SDS PAGE 분석을 나타낸다. 피크는 각각 정제된 단량체 ("sc") 및 이량체 ("dc") 형태를 나타낸다.
도 3은 비-환원성 (패널 A) 및 환원성 (패널 B) 조건 하의 예비 스케일 (preparative scale)에서 scFc 결합 폴리펩타이드의 정제된 이량체 ("dc") 및 단량 체 ("sc") 형태의 SDS-PAGE를 나타낸다. 각각의 패널에 대해서, 레인 1 및 2는 각각 이량체 형태 ("ds"; 205 kDa) 및 단량체 ("sc"; 105 kDa) 형태를 함유한다. 레인 3은 대조용 인간 IgG1 항체 (Hu5c8; 150 kDa)를 함유한다.
도 4A-B는 호모트라이머성 (homotrimeric) shCD40L 항원에 결합된 단량체 (sc) 또는 이량체 (dc) scFc 폴리펩타이드의 컴플렉스의 특정화를 나타낸다. 도 4A는 각각의 개별적인 성분 및 형성된 각각의 컴플렉스의 분자량을 측정하기 위해서 수행된 SEC-LS 실험에 대해서 수득된 크기 배제 크로마토그램의 복합형을 나타낸다. 도 4B는 SEC-LS에 의해서 수득된 개별적인 질량 및 컴플렉스의 각각의 계산된 분자량을 기초로 하여, shCD40L에 대한 단량체 (i) 또는 이량체 (ii) scFc 폴리펩타이드 각각의 결합에 의해서 형성된 예상되는 컴플렉스를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 단량체 ("sc") scFc 폴리펩타이드 또는 통상적인 인간 IgG1 안티-CD40L mAb, hu5C8의 존재 하에서 형성된 shCD40L 함유 컴플렉스의 용출 프로필의 복합형을 나타낸다. 분자량은 온-라인 LS에 의해서 측정되었으며, 컴플렉스에 대해서 수득된 각각의 피크 상에 표시하였다. 단량체 scFc ("sc"), 5C8 IgG1, 및 shCD40L에 대해서 측정된 분자량은 각각 101.5 kDa, 150 kDa, 및 51 kDa이다.
도 6은 플레이트 상에 코팅된 항원, shCD40L에 대한 단량체 scFc (sc), 이량체 scFc (dc) 및 통상적인 인간 IgG1 안티-CD40L 항체 (Hu 5C8)의 겉보기 결합 친화성을 비교하는 ELISA 결합시험의 결과를 나타낸다. 일가 scFc는 2가로 리간드를 결합시키는 그의 능력으로 인하여 상당한 화합력 (avidity) 이점을 갖는 WT mAb에 비해서 약 2-배 더 약한 EC50을 갖는다.
도 7A는 scFc 결합 폴리펩타이드의 이량체 ("dc") 및 단량체 ("sc") 형태의 겉보기 FcRn 결합 친화성을 통상적인 IgG1 항체 (Hu 5C8)의 경우와 비교하는 ELISA 결합시험의 결과를 나타낸다. FcRn 결합은 인간 및 랫트 FcRn-Fc 융합 구조물 둘 다의 비오티닐화된 형태를 사용하여 측정되었다. 이 시험에서는, 각각의 Fc 함유 구조물을 플레이트 상에 코팅하고, 비오티닐화된 랫트 또는 인간 FcRn-Fc 구조물의 결합을 스트렙타비딘 HRP로 검출하였다. 단량체 scFc 폴리펩타이드 ("sc")에 대한 인간 FcRn-Fc (랫트 FcRn-Fc는 아님)의 결합에 대해서 측정된 c-값은 Hu5C8 또는 이량체 ("dc") scFc 폴리펩타이드의 경우보다 3- 내지 4-배 더 약하였다. 도 7B는 랫트 FcRn-Fc ("rFcRn-Fc"), 헤미글리코실화 ("Hemigly scFc") 및 완전히 글리코실화된 ("Fully gly scFc") 5c8 scFcs, 및 랫트 FcRn-Fc와 scFc의 혼합에 의해서 형성된 컴플렉스에 대한 분석적 SEC 용출 프로필을 나타낸다. 광산란 분석을 사용하여 피크 내에 함유된 개별적인 성분 및 컴플렉스의 각각의 분자질량을 측정하였다. 수득된 컴플렉스에 대해서 측정된 질량은, 각각의 scFc 상의 2 개의 FcRn 결합 부위는 모두 기능적이며, 도시된 바와 같이 2 FcRnFc : 2 scFc를 포함하는 컴플렉스를 형성하는 것으로 예상됨을 시사한다.
도 8은 링커 부분에 의해서 탠덤형으로 결합된 2 개의 Fc 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 예시적인 단량체 형태 (sc)의 분자 모델을 도시한 것이다. 모델은 이종 scFc 부분의 예를 제공한다. scFc 결합 폴리펩타이드는 하나의 Fc 부위 ("Fc 부위 #2")에서의 데글리코실화 및 제2 Fc 부위 ("Fc 부위 #1")의 CH2 영역에서의 글리코실화 ("슈가 (Sugar) #1")를 제공하는 단일 부위-특이적 Fc 돌연변이를 함유한다.
도 9는 3 해상도로 분해된 scFc의 결정 구조의 정면도 및 측면도의 로드 도면 (rod diagram)을 도시한 것이다. 결정은 F(ab) 영역의 부재 하에서 scFc 부위에 대해서 수득되었다. scFc는 푸코실화된 IgG1 Fc (pdb 코드 2DTQ; 흑색 (black)) 상에 중첩된 회색으로 나타낸다. 중첩 (superposition)은 417 알파-탄소 원자에 걸쳐서 0.489A rmsd의 편차를 나타내며, 이것은 본질적으로 동일한 골격구조 배좌이다. 유일한 유의적인 차이점은, scFc가 푸코실화된 IgG1 Fc 구조에 존재하지 않는 scFc 절반 상의 추가의 갈락토즈 및 부분적으로 정렬된 힌지 부분을 포함하는 것이다. scFc 구조는 35%의 R-부재 및 25%의 R-인자와 함께 3.0 Å의 해상도로 분해되었다.
도 10은 이중특이성 항체 기능에 대한 스크리닝 시에 본 발명의 scFc 폴리펩타이드를 사용하는 이점을 도시한 것이다. scFc 부분은 결합 영역의 바람직하지 않은 불균질 조합을 방지한다. 이러한 불균질성은 이중특이성 항체에 대해 독특한 활성에 대해서 스크리닝하도록 디자인된 시험을 복잡하게 만들 수 있다. "경로 1"은 3 개의 유전자가 진핵성 시스템 내에서 공동발현되어 이중특이성 항체를 형성하는 경우에 일반적으로 나타날 수 있는 불균질한 결합 영역 조합의 예이다: (A) Fc 영역의 N-말단에 융합된 단일 쇄 F(ac), scF(ab); (B) Fc의 CH3의 C-말단에 융합된 F(ab) 단편; (C) CL 및 VL 영역을 포함하는 경쇄. "경로 2"는 (A) 및 (B)가 개재된 링커 서열을 이용하여 어떻게 단일의 인접한 유전자 구조물로 융합하여 scFc 폴 리펩타이드 (D)를 형성하도록 유전적으로 융합되는 2 개의 Fc 부위를 제공하는지의 예를 도시한 것이다. (C)와 (D)의 공동발현은 단일 이중특이성 mAb의 균질한 발현을 제공한다.
도 11A-I는 본 발명의 예시적인 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11A는 N-말단에서 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11B는 C-말단에서 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11C는 N-말단 CH2-CH3 영역내 (interdomain) 부분에 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11D는 C-말단 CH2-CH3 영역내 부분에 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11E는 링커 폴리펩타이드 내에 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11F는 N-말단 CH2 영역 상에 베니어링된 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11G는 N-말단 CH3 영역 상에 베니어링된 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11H는 C-말단 CH2 영역 상에 베니어링된 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 도 11I는 C-말단 CH2 영역 상에 베니어링된 결합 부위를 포함하는 scFc 결합 폴리펩타이드의 개략도이다. 본 발명의 scFc 결합 폴리펩타이드가 도 11A-I에 도시된 특징 중의 어떤 조합이라도 포함할 수 있음은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인정된다.
도 12는 2 개의 상이한 길이의 G4S 링커 (1xG4S 대 3xG4S, 즉, 5 대 15 개의 아미노산)를 함유하는 scFc에 대해서 수득된 단백질 발현 프로필의 비교를 나타낸 것이다. 링커 길이는 scFc 수율과 직접적으로 상관관계가 있어서 더 긴 링커를 포 함하는 구조물로부터 발현된 단백질은 dcFc에 비해서 상당히 더 다량의 scFc를 산출하는 것으로 밝혀졌다.
도 13은 2 주일의 기간에 걸쳐 랫트에서 측정된 야생형 인간 IgG1 항체 (hu5c8)에 대비하여 1xG4S 및 3xG4S 결합된 scFc 폴리펩타이드의 혈청 농도를 도시한 것이다. 3xG4S scFc는 WT IgG1 (14 일)와 유사한 긴 β-상 반감기 (12 일)를 갖는다.
도 14A 및 B는 scFc 폴리펩타이드의 FcγR-결합 활성을 평가하기 위해서 수행된 알파스크린 (Alphascreen) 시험의 결과를 도시한 것이다. 표시된 인간 및 시노몰구스 (cynomolgus) Fcγ 수용체에 대한 헤미글리코실화 및 완전히 글리코실화된 5c8 scFcs의 결합을 WT 및 비글리코실화된 5c8 IgG1과 비교하였다. 시험관내에서 이들 수용체에 대한 scFc 및 WT IgG1의 결합은 매우 유사한 것으로 보이며, 이것은 scFcs가 유사하게 생체내에서 Fcg 수용체를 점유할 수 있음을 시사한다.
도 15는 단백질의 데글리코실화를 위한 3xG4S 결합된, 헤미글리코실화된 scFc 전- 및 후 PNGaseF 처리에 대해서 수득된 풀어진 (deconvoluted) 질량 스펙트럼 (deconvoluted mass spectra)을 나타낸다. 스펙트럼은 데글리코실화하기 전 (도 15A) 및 후 (도 15 B)의 scFc 경쇄에 대해서 생성되었다. 데글리코실화된 경쇄의 측정된 질량은 23,854 Da이다. 도 15C 및 D는 데글리코실화하기 전 (도 15C) 및 후 (도 15D)의 scFc 중쇄의 스펙트럼을 도시한 것이다. 데글리코실화된 scFc 중쇄의 측정된 질량은 75,703 Da이다.
도 16은 시차주사열량측정 (DSC)에 의해서 측정된 것으로서, WT huIgG1 mAb 및 Fc와 비교한 scFc 분자의 비교 열안정성을 나타낸다. 완전히 글리코실화된 scFc (ASK048)의 CH2 영역의 안정성은 아마도, 제2 Fc 부위의 비글리코실화된 CH2에 의해 기인하는 증가된 영역 유연성으로 인하여 다소 더 낮은 안정성을 갖는다.
도 17은 (G4S)1-결합된, 헤미글리코실화된 5C8 scFc IgG1 항체 구조물 (pEAG2066; SEQ ID NO:1)의 중쇄 아미노산 서열을 도시한 것이다. 구조물은 일반적인 구조 VH-CH1-힌지 영역-CH2(1)-CH3(1)-G4S 링커-힌지 영역-CH2(2)-CH3(2)를 갖는다. 제1의 추가의 N-말단 Fc 부위 (잔기 222-447, SEQ ID NO:2)는 그의 글리코실화 패턴에 관해서 야생형인 반면에, 제2의 추가의 C-말단 Fc 부위 (잔기 458-683,SEQ ID NO:3)는 비글리코실화된 Fc를 생성시키는 아미노산치환 (T299A, EU 넘버링)을 함유한다. 또한, scFc는 힌지 영역에서 C220S 치환 (EU 넘버링)을 함유한다. T299A 및 C220S 돌연변이의 위치는 볼드체로 나타낸다. 힌지 영역은 이탤릭체로 나타내며, CH1 및 CH3 불변 영역은 서열에서 밑줄을 쳤다.
도 18은 도 17에서의 pEAG2066의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:4)을 도시한 것이다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 19A는 예시적인 5C8 항체 구조물 (pEAG2027; SEQ ID NO:5)의 경쇄 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 19B는 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:6)을 도시한 것이다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 20은 N-말단 (잔기 22-447) 및 C-말단 (잔기 458-683) Fc 부위 둘 다가 글리코실화된 동종 scFc 부분을 포함하는 예시적인 완전히 글리코실화된 1xG4S-결합된 5C8 IgG1 scFc 항체 구조물의 중쇄 아미노산 서열 (pEAG2146; SEQ ID NO:7)을 도시한다. 구조물의 성분 Fc 부위는 도 17에서와 같이 주석이 붙여진다.
도 21은 도 17에서의 pEAG2146의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:8)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 22는 헤미글리코실화된, 1xG4S-결합된 scFc 부분 (여기에서, 제2의 추가의 C-말단 Fc 부위 (잔기 458-683; SEQ ID NO:10)는 변화된 힌지 영역 (GSEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLF, SEQ ID NO:11)을 포함하며, 여기에서 힌지 시스테인 잔기는 세린에 의해서 치환된다)을 포함하는 예시적인 scFc hu5C8 IgG1 항체 구조물의 중쇄 아미노산 서열 (pEAG2147; SEQ ID NO:9)을 도시한다. 서열은 도 17에서와 같이 주석이 붙여진다.
도 23은 도 22에서의 pEAG2147의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:12)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 24는 인간 IgG1 mAb, 5C8의 상황에서 헤미글리코실화된, (G4S)3 결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 scFc 항체 구조물의 중쇄 아미노산 서열 (pASK043; SEQ ID NO:13)을 도시한다. 구조물의 성분 영역은 별개의 서열 식별자에 의해 도면에 주석을 붙였다.
도 25는 도 24에서의 pASK043의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:14)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 26은 완전히 글리코실화된, (G4S)3 결합된 scFc 부분 (여기에서, 2 개의 Fc 부위는 모두 글리코실화된다)을 포함하는 예시적인 scFc 5C8 IgG1 항체의 중쇄 아미노산 서열 (ASK048; SEQ ID NO:15)을 도시한다. 구조물의 성분 영역은 별개의 서열 식별자에 의해 도면에 주석을 붙였다.
도 27은 도 26에서의 ASK048의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:16)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 28은 비글리코실화된, (G4S)3 결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 scFc 5C8 IgG1 항체 구조물의 중쇄 아미노산 서열 (ASK052; SEQ ID NO:17)을 도시한다. 구조물의 성분 영역은 별개의 서열 식별자에 의해 도면에 주석을 붙였다.
도 29는 도 29에서의 ASK052의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:18)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 30은 비글리코실화된, (G4S)1 결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 scFc 5C8 IgG1 항체 구조물의 중쇄 아미노산 서열 (pASK053; SEQ ID NO:19)을 도시한다. 구조물의 성분 영역은 별개의 서열 식별자에 의해 도면에 주석을 붙였다.
도 31은 도 30에서의 pASK053의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:20)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 32는 인간, 안티-LINGO IgG1 mAb, Li33의 상황에서 헤미글리코실화된, 1xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 안티-LINGO scFc 항체 구조물 (pEAG2148; SEQ ID NO:21)의 중쇄 아미노산 서열을 도시한다. 제1의 추가의 N-말단 Fc 부위 (잔기 223-448)는 그의 글리코실화된 패턴에 관하여 야생형인 반면에, 제2의 추가의 C-말단 Fc 부위 (잔기 549-684)는 비글리코실화된 Fc를 생성시키는 아미노산 치환을 함유한다. 구조물의 성분 영역은 도 17에서와 같이 주석을 붙였다.
도 33은 도 32에서의 pEAG2148의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:22)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 34A는 예시적인 Li33 scFc 항체 구조물 (pXW435; SEQ ID NO:23)의 경쇄 아미노산 서열을 도시한다. 도 34B는 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:24)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 35는 인간, 안티-LINGO IgG1 mAb, Li33의 상황에서 비글리코실화된, 3xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 안티-LINGO scFc 항체 구조물 (ASK050; SEQ ID NO:25)의 중쇄 아미노산 서열을 도시한다.
도 36은 도 35에서의 ASK050의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:26)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 37은 인간, 안티-LINGO IgG1 mAb, Li33의 상황에서 비글리코실화된, 1xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 안티-LINGO scFc 항체 구조물 (ASK051; SEQ ID NO:27)의 중쇄 아미노산 서열을 도시한다.
도 38은 도 37에서의 ASK051의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:28)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 39는 안티-LINGO, scFc 항체 분자 (EAG2148)의 개선된 단백질 농도 의존적 용해도 특징을 나타낸다.
도 40A는 안티-CD2, 키메라 IgG1 mAb, CB6의 상황에서 완전히 글리코실화된, 3xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 안티-CD2, 키메라 CB6 scFc IgG1 항체 구조물 (ASK058; SEQ ID NO:29)의 중쇄 아미노산 서열을 도시한다. 도 40B는 CB6 scFc IgG1 항체 구조물 (EAG2276; SEQ ID NO:56)의 경쇄 아미노산 서열을 도시한다.
도 41은 도 40에서의 ASK058의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:30)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다. 도 41b는 도 40B에서의 EAG2276의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO: )을 도시한다.
도 42는 안티-CD2, 키메라 IgG1 mAb, CB6의 상황에서 완전히 글리코실화된, 4xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 안티-CD2, 키메라 CB6 scFc IgG1 항체 구조물 (ASK062; SEQ ID NO:31)의 중쇄 아미노산 서열을 도시한다.
도 43은 도 42에서의 ASK062의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:32)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 44는 안티-CD2, 키메라 IgG1 mAb, CB6의 상황에서 완전히 글리코실화된, 5xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 안티-CD2, 키메라 CB6 scFc IgG1 항체 구조물 (ASK063; SEQ ID NO:33)의 중쇄 아미노산 서열을 도시한다.
도 45는 도 44에서의 ASK063의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:34)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 46은 안티-CD2, 키메라 IgG1 mAb, CB6의 상황에서 완전히 글리코실화된, 6xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 안티-CD2, 키메라 CB6 scFc IgG1 항 체 구조물 (ASK064; SEQ ID NO:35)의 중쇄 아미노산 서열을 도시한다.
도 47은 도 46에서의 ASK064의 중쇄 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:36)을 도시한다. 항체 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 48은 뉴블라스틴 수용체 GFRα3의 세포외 영역에 융합된 (G4S)3-결합되고, 완전히 글리코실화된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 GFRα3 이뮤노어드헤신 (immunoadhesin) 단백질 (ASK-057; SEQ ID NO:37)의 아미노산 서열을 도시한다.
도 49는 도 48에서의 ASK-057의 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:38)을 도시한다. 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 50은 2-단계 정제 후에 수득된 GFRα3:scFc 융합 단백질의 비-환원성 SDS-PAGE 및 분석적 SEC-LS 특정화를 나타낸다.
도 51은 인터페론-β (잔기 1-67)에 융합된 헤미글리코실화된, 1xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 인터페론-β 이뮤노어드헤신 구조물 (pEAG2149; SEQ ID NO:39)의 아미노산 서열을 도시한다. 제1의 추가의 N-말단 Fc 부위 (잔기 168-393)는 그의 글리코실화 패턴에 관해서 야생형인 반면에, 제2의 추가의 C-말단 Fc 부위 (잔기 404-629)는 비글리코실화된 Fc를 생성시키는 아미노산 치환을 함유한다. 구조물의 성분 영역은 도 17에서와 같이 주석을 붙인다.
도 52는 도 52에서의 pEAG2149의 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:40)을 도시한다. 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 53은 LTβR에 융합된 헤미글리코실화된, 3xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 LT 이뮤노어드헤신 구조물 (EAG2190; SEQ ID NO:41)의 아미노산 서 열을 도시한다.
도 54는 도 54에서의 EAG2190의 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:42)을 도시한다. 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 55는 LTβR에 융합된 헤미글리코실화된, 3xG4S-결합된 scFc 부분을 포함하는 예시적인 LTβR 이뮤노어드헤신 구조물 (EAG2191; SEQ ID NO:43)의 아미노산 서열을 도시한다.
도 56은 도 56에서의 EAG2191의 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:44)을 도시한다. 시그날 서열은 밑줄을 쳤다.
도 57은 SDS-PAGE (도 58A) 및 분석적 겔 여과 (도 58B)에 의한 LTβR:scFc 융합 폴리펩타이드 (EAG2190)의 특정화를 도시한 것이다. 도 58A에서 레인 1 및 2는 비-환원성이며, 1 및 2 ㎍ 단백질을 함유하는 반면에, 레인 4 및 5는 환원제 및 각각 2 및 1 ㎍s의 LI33 scFc를 함유한다. 레인 3은 분자량 표준물을 함유하며, 해당 표준물의 질량을 표시하였다.
도 58은 N-데글리코실화된, 환원된 LTβR:scFc의 질량 분석법 (MS)을 도시한 것이다.
도 59는 LTa1b2에 대한 단량체 LTβR:scFc의 결합 친화성을 평가하는 ELISA (도 59A) 및 FACS 분석 (도 59B)의 결과를 도시한다.
도 60은 본 발명의 예시적인 헤미글리코실화된, 1xG4S-결합된 scFc 부분 (EAG2181)의 아미노산 (도 60A; SEQ ID NO:45) 및 뉴클레오타이드 (도 60B; SEQ ID NO:46) 서열을 도시한 것이다. 상기 scFc 부분의 N 및/또는 C-말단은 본 기술분야 에서 인지된 어떤 결합 부위에라도 융합될 수 있다.
도 61은 본 발명의 예시적인 완전히 글리코실화된, 3xG4S-결합된 scFc 부분 (ASK054)의 아미노산 (도 61A; SEQ ID NO:47) 및 뉴클레오타이드 (도 61B; SEQ ID NO:48) 서열을 도시한 것이다. 상기 scFc 부분의 N 및/또는 C-말단은 본 기술분야에서 인지된 어떤 결합 부위에라도 융합될 수 있다.
도 62는 본 발명의 예시적인 완전히 글리코실화된, 1xG4S-결합된 scFc 부분 (ASK055)의 아미노산 (도 62A; SEQ ID NO:49) 및 뉴클레오타이드 (도 62B; SEQ ID NO:50) 서열을 도시한 것이다. 상기 scFc 부분의 N 및/또는 C-말단은 본 기술분야에서 인지된 어떤 결합 부위에라도 융합될 수 있다.
도 63은 예시적인 안티-LTβR 항체 (BDA8)의 중쇄 (ASK016)의 아미노산 (도 63A; SEQ ID NO:51) 및 뉴클레오타이드 (도 63B; SEQ ID NO:52) 서열을 도시한 것이다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 scFc 결합 폴리펩타이드는 BDA8의 결합 부위를 포함한다.
도 64는 FDA-승인된 항체 또는 그 밖의 다른 항체를 도시한 것이다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 scFc 결합 폴리펩타이드는 도시된 항체 중의 하나로부터 유도된 항원 결합 부위를 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 예를 들어, (i) 적어도 하나의 결합 부위 또는 결합 영역; 및 (ii) 적어도 하나의 유전적으로 융합된 Fc 부분 (즉, 단일-쇄 Fc ("scFc") 부분)을 포함하는 결합 폴리펩타이드를 제공함으로써 본 기술분야를 진보시킨다. 바람직한 구체예에서, scFc 부분은 상기의 Fc 부위 사이에 개재된 링커 폴리펩타이드 (예를 들어, Fc 접속 펩타이드)를 통해서 유전적으로 융합된 적어도 2 개의 Fc부위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 결합 부위는 scFc 부분의 N- 및 C-말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 융합된 (예를 들어, Fab 또는 scFv의 VH 또는 VL을 통해서) 항체 분자 (예를 들어, F(ab) 또는 scFv)의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 결합 영역은 유전적으로 융합된 Fc 부분의 N- 및 C-말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 융합된 수용체 융합 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 융합은 원하는 결합 부위에 대해서 C-말단 또는 N-말단적으로 이루어질 수 있다.
단일의 인접한 유전자 구조물로부터 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 발현은 2 개의 유전자 (여기에서, 하나는 제1 Fc 영역을 발현하고, 별개의 제2 유전자는 2 개의 폴리펩타이드 쇄를 결합시키는 디설파이드 결합에 의해서 제2 Fc 영역에 융합된 결합 부위로 구성된다)의 공동-발현을 수반하는 통상적인 단백질 발현방법에 비해서 다수의 이점을 갖는다. 이러한 통상적인 구조물의 문제는 생성된 분자의 집단 내에 상당한 불균질성이 있어서 바람직한 분자는 바람직하지 않은 분자로부터 정제되어야만 하며, 이에 의해서 원하는 분자의 총 수율의 저하를 야기한다는 점이다. 통상적인 Fc 부분을 사용하거나, 이러한 부분이 결여된 다른 분자에 비해서, 본 발명의 폴리펩타이드의 이점은 설명을 위해서 항체 분자 또는 그의 예시적인 단편을 사용하여 이하에서 검토한다:
scFc에 융합된 결합 영역의 발현시의 스크램블링 (scrambling)의 결여: 단지 하나의 F(ab) 팔 (arm)을 갖는 항체, 또는 단지 하나의 융합된 기능적 폴리펩타 이드를 가는 Fc 융합 단백질을 구성하는 것은 어렵다. 최신의 방법은 2 개의 유전자의 공동발현을 필요로 하며; 여기에서 하나는 제1 Fc 부위 (Fc1 예를 들어, VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 영역)를 포함하는 Ab의 하나의 중쇄를 코드화하고, 제2 유전자는 제2 Fc 부위 (Fc2 예를 들어, 힌지, CH2, 및 CH3 영역)를 코드화하여 원하는 분자를 수득한다. 공동-발현은 Fc1+Fc1: Fc1+Fc2: Fc2+Fc2의 1:2:1 혼합물인 것으로 예상되는 분자의 바람직하지 않은 복잡한 혼합물을 유도하지만, 비는 원하는 단백질의 최적하 수율을 제공하는 이러한 이론적 예상으로부터 크게 달라질 수 있다. 통상적인 이량체 Fc에 결합된 단일 융합 분자를 갖는 일가 융합 단백질의 발현은 특히, 2 개의 동일한 분자가 근접해서 폴딩 (folding)되는 경우에 일어날 수 있는 부적절한 폴딩 현상을 예방하는데 중요할 수 있다. 이들 미스폴딩된 (misfolded) Fc 융합 단백질은 적절하게 폴딩된 2가 Fc 단백질로부터 분리하는 것이 어려울 수 있는데, 이는 두 가지의 유일한 차이점이 흔히 불균질한 미스폴딩 현상이기 때문이다. 대상 scFc 융합 단백질은 단백질 영역의 스크램블링을 겪을 수 없는데, 이는 이 구조물이 분자를 폴딩 과정 중에 서로에 대해서 근접하여 고정시키지 않기 때문이다.
FcRn 결합의 첨가를 통한 항체 단편 (예를 들어, F(ab)) 반감기의 증진: 항체 단편 (예를 들어, F(ab)s)의 치료학적 적용은 종종 바람직한데, 이는 이것이 표적 수용체 교차결합이 없고, 따라서 2가 항체에 의한 수용체 점유 시에 나타날 수 있는 것과 같은 바람직하지 않은 후속 시그날링이 없이 세포 표면 수용체를 차단할 수 있기 때문이다. 이러한 표면 수용체의 교차결합은 수용체의 클러스터링 (clustering) 및 세포 표면으로부터 표적 수용체의 하향 조절을 야기할 수 있다. F(ab) 구조물은 고유적으로 일가이며, 따라서 수용체 교차-결합 또는 클러스터링을 야기할 수 없다.
생체내에서 F(ab)s와 같은 항체 단편의 적용에 대한 유의적인 장애 중의 하나는 그들의 열등한 혈청 지속성 또는 반감기이다. F(ab) 단편에 대한 Fc 부분의 첨가는 온전한 mAb와 유사한 약력학적 반감기를 제공한다. 일반적으로, F(ab)s의 반감기는 F(ab)의 제조 및 정제 후에 특정의 티올에 대한 PEG 부위의 화학적 첨가에 의해서 연장된다. 페질화 (PEGylation) 반응은 생성물의 제조를 상당히 복잡하게 한다. 페질화 화학은 각각의 F(ab)에 대해서 최적화되어야 하며, 생성물 수율을 감소시킨다. 페질화는 또한, 페질화된 물질이 불균질한 분자량을 갖기 때문에 최종 생성물 분석을 복잡하게 한다.
항체 단편 (예를 들어, F(ab))에 대한 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 작용기의 첨가: F(ab)s 및 페질화된 F(ab)s와 같은 항체 단편은 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII과 상호작용하는 능력이 결여되어 있다. Fc 수용체의 점유는 특정의 환경에서 바람직하다. 예를 들어, 안티-CD20 항체는 원치 않는 암성 B-세포의 ADCC 의존적 고갈을 위한 Fc 작용기에 따라 결정된다. 또한, 일가 F(ab)s는 항체에 의한 수용체의 교차결합이 수용체 내재화 (internalization)를 유도할 수 있는 경우에 2가 mAbs보다 바람직하다. 이러한 내재화는 약물의 효능이 Fc 의존적 ADCC 고갈기전에 따라 결정되는 경우에는 꽤 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 scFc 폴리펩타이드에 결합된 F(ab) 단편은 최적의 구조물을 나타내는데, 이는 이것이 일가 및 Fcγ 수용체 점유의 바람직한 특징을 구체적으로 나타내기 때문이다.
ScFc 분자는 이종 Fc 부분의 생성을 허용한다: Fc 부분 내에서의 부위-특이적 돌연변이는 개선된 Fc 작용성을 갖는 Fc-변이체 mAbs를 발생시키는데 유용하다. 그 예는 예를 들어, 다양한 FcγRI, FcγRII 및/또는 FcγRIII에 대한 친화성을 증진시키는 돌연변이이다. 본 발명의 단일 쇄 Fc (scFc) 분자는 단지 하나의 Fc 부위에서의 특이적인 점돌연변이 또는 scFc 부분의 2 개의 부위 모두에서의 점돌연변이의 다양한 조합을 함유하는 이종 scFc 부분을 발생시키기 위해서 사용될 수 있다. 그 예는 2 개의 Fc 부위 중의 단지 하나에서 Asn 297 글리코실화를 함유하는 scFc 구조물의 발현일 수 있다. 이 분자는 다소 감소된 FcR 친화성을 나타내지만, FcγRIII 결합에서는 불활성이 아니다.
명세서 및 특허청구범위의 명백한 이해를 제공하기 위해서, 이하에서는 편리하게 다음의 정의들이 제공된다.
I. 정의
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산의 폴리머를 의미한다.
용어 "아미노산"은 알라닌 (Ala 또는 A); 아르기닌 (Arg 또는 R); 아스파라긴 (Asn 또는 N); 아스파르트산 (Asp 또는 D); 시스테인 (Cys 또는 C); 글루타민 (Gln 또는 Q); 글루탐산 (Glu 또는 E); 글리신 (Gly 또는 G); 히스티딘 (His 또는 H); 이소로이신 (Ile 또는 I): 로이신 (Leu 또는 L); 리신 (Lys 또는 K); 메티오닌 (Met 또는 M); 페닐알라닌 (Phe 또는 F); 프롤린 (Pro 또는 P); 세린 (Ser 또는 S); 트레오닌 (Thr 또는 T); 트립토판 (Trp 또는 W); 타이로신 (Tyr 또는 Y); 및 발린 (Val 또는 V)을 포함한다. 비-전통적인 아미노산이 또한, 본 발명의 범주 내에 있으며, 노르로이신, 오미틴, 노르발린, 호모세린, 및 문헌 [Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기술된 것과 같은 그 밖의 다른 아미노산 잔기 유사체가 포함된다. 이러한 비-천연적으로 존재하는 아미노산 잔기를 생성시키기 위해서는, 문헌 [Noren et al. Science 244:182 (1989) 및 Ellman et al., 상기 참조]의 절차가 사용될 수 있다. 간략하면, 이들 절차는 억제자 tRNA를 비-천연적으로 존재하는 아미노산 잔기에 의해 화학적으로 활성화시키고, 이어서 시험관내에서 RNA를 전사 및 해독하는 것을 수반한다. 비-천연 아미노산의 도입은 또한, 본 기술분야에서 공지된 펩타이드 화학을 사용하여 달성될 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "극성 아미노산"은 순 영전하를 갖지만, 그들의 측쇄 (예를 들어, M, F, W, S, Y, N, Q, C)의 다양한 부분에서는 비-영 부분전하를 갖는 아미노산을 포함한다. 이들 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용에 참여할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "하전된 아미노산"은 그들의 측쇄 (예를 들어, R, K, H, E, D) 상에서 비-영 순전하를 가질 수 있는 아미노산을 포함한다. 이들 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용에 참여할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "충분한 입체적 벌크 (steric bulk)를 갖는 아미노산"은 더 큰 3차원적 공간을 차지하는 측쇄를 가는 아미노산을 포함한다. 충분한 입체적 벌크의 측쇄 화학을 갖는 아미노산의 예로는 타이로신, 트립토판, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민, 및 메티오닌, 또는 그의 유 사체 또는 모사체가 포함된다.
"아미노산 치환"은 미리 결정된 아미노산 서열 (출발 폴리펩타이드의 아미노산 서열)에서 적어도 하나의 기존의 아미노산 잔기를 제2의 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미한다. "아미노산 삽입"은 미리 결정된 아미노산 서열 내에 적어도 하나의 추가의 아미노산을 혼입시키는 것을 의미한다. 삽입은 통상적으로 1 또는 2 개의 아미노산 잔기의 삽입으로 구성될 수 있지만, 존재하는 더 큰 "펩타이드 삽입", 예를 들어, 약 3 내지 5개 또는 약 10, 15 또는 20 개까지라도 아미노산 잔기의 삽입이 이루어질 수 있다. 삽입된 잔기(들)는 상술한 바와 같이 천연적으로 존재하거나, 비-천연적으로 존재할 수 있다. "아미노산 결실"은 미리 결정된 아미노산 서열로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기를 제거하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "단백질"은 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 의미한다. 따라서, 단백질은 단량체이거나 다량체일 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 단백질은 이량체이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 이량체는 2 개의 동일한 단량체 서브유니트 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, 2 개의 동일한 scFc 폴리펩타이드)를 포함하는 호모이량체이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이량체는 2 개의 동일하지 않은 단량체 서브유니트 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, 2 개의 동일하지 않은 scFc 폴리펩타이드)를 포함하는 헤테로이량체이다. 이량체의 서브유니트는 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄 (예를 들어, scFc 분자를 포함하는 표적 결합 쇄)를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 이량체는 적어도 2 개의 폴리펩타이드 쇄 (예를 들어, 적어도 2 개의 scFc 폴리펩타이드 쇄)를 포함한다. 하나의 구체예에서, 이량체는 2 개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이량체는 3 개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이량체는 4 개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
특정의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 scFc 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 scFc 폴리펩타이드는 단일-쇄 Fc (scFc) 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 결합 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "결합 폴리펩타이드"는 표적 분자 (예를 들어, 항원 또는 결합 파트너)에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 표적 결합 부위 또는 결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 면역글로불린 항원 결합 부위 또는 리간드 결합의 책임이 있는 수용체 분자의 일부분 또는 수용체 결합의 책임이 있는 리간드 분자의 일부분을 포함한다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 또한, 하나 이상의 면역글로불린 (Ig) 분자로부터 유도된 적어도 2 개의 Fc 부위를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 유전적으로 융합된 적어도 2 개의 Fc 부위를 포함하는 scFc 폴리펩타이드이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 추가의 변형을 포함한다. 변형의 예는 이하에 더 상세하게 기술되어 있다. 예를 들어, 특정의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 임의로, 유전적으로 융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 적어도 2 개의 Fc 부위 사이에 개재된 유연성 폴리펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 기능적 부위 (예를 들어, PEG, 약물, 또는 표지물 (label))을 첨가하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 2 개의 결합 부위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 2 개의 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 3 개의 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 4 개의 결합 부위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 결합 부위는 서로 탠덤형으로 결합된다. 또 다른 구체예에서, 결합 부위는 결합 폴리펩타이드의 상이한 위치에 존재한다. 예를 들어, 하나 이상의 결합 부위는 유전적으로 융합된 Fc 부분 (즉, 단일-쇄 Fc (scFc) 부분)의 하나의 말단 또는 양 말단에 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "결합 영역" 또는 "결합 부위"는 표적 분자 (예를 들어, 항원, 리간드, 수용체, 기질 또는 억제제)와의 특정한 결합을 매개하는 결합 폴리펩타이드의 일부분, 부분 또는 부위를 의미하여야 한다. 결합 영역의 예로는 항원 결합 부위, 리간드의 수용체 결합 영역, 수용체의 리간드 결합 영역, 또는 효소적 영역이 포함된다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "리간드 결합 영역"은 천연 수용체 (예를 들어, 세포 표면 수용체), 또는 적어도 정성적 리간드 결합 능력 및 바람직하게는 상응하는 천연 수용체의 생물학적 활성을 보유 하는 그의 부분 또는 유도체를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "수용체 결합 영역"은 천연 리간드, 또는 적어도 정성적 수용체 결합 능력, 및 바람직하게는 상응하는 천연 리간드의 생물학적 활성을 보유하는 그의 부분 또는 유도체를 의미한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 분자, 예를 들어, 세포 표면 항원 또는 가용성 항원에 대해서 특이적인 적어도 하나의 결합 영역을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 결합 영역은 (예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열 또는 대체 골격구조 부분 (예를 들어, 임의로 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 골격구조 부분) 내에 위치하는 항체로부터의 6 개의 CDRs를 포함하는) 항원 결합 부위를 포함하거나 이것으로 구성된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "결합 친화성"은 결합 상호작용의 강도를 포함하며, 따라서 실제 결합 친화성뿐만 아니라 겉보기 결합 친화성 둘 다를 포함한다. 실제 결합 친화성은 해리율에 대한 회합율의 비이다. 따라서, 결합 친화성을 부여하거나 최적화하는 것에는 이들 성분 중의 어느 하나 또는 둘 다를 바람직한 결합 친화성의 레벨에 도달하도록 변화시키는 것이 포함된다. 겉보기 친화성은 예를 들어, 상호작용의 화합력을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "결합 자유 에너지" 또는 "결합의 자유 에너지"는 본 기술분야에서 인지되는 그의 의미, 및 특히 용매 중에서의 결합 부위-리간드 또는 Fc-FcR 상호작용에 대해 적용되는 것으로서 의미를 포함한다. 결합 자유 에너지의 감소는 친화성을 증진시키는 반면에, 결합 자유 에너지의 증가 는 친화성을 감소시킨다.
용어 "특이성"은 소정의 표적을 특이적으로 결합시키는 (예를 들어, 표적과 면역작용하는) 잠재적 결합 부위의 수를 포함한다. 결합 폴리펩타이드는 단일특이성이고, 동일한 표적 (예를 들어, 동일한 에피토프)을 특이적으로 결합시키는 하나 이상의 결합 부위를 함유할 수 있거나, 결합 폴리펩타이드는 다중특이성이고, 동일한 표적 (예를 들어, 상이한 에피토프) 또는 상이한 표적의 상이한 부분을 특이적으로 결합시키는 2개 이상의 결합 부위를 함유할 수 있다. 하나의 구체예에서, 하나 이상의 표적 분자 (예를 들어, 하나 이상의 항원, 또는 동일한 항원 상의 하나 이상의 에피토프)에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이성 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, 이중특이성 폴리펩타이드)가 만들어질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 다중특이성 결합 폴리펩타이드는 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 영역 및 세포 상의 표적 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 영역을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 다중특이성 결합 폴리펩타이드는 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 영역 및 약물에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 영역을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 다중특이성 결합 폴리펩타이드는 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 영역 및 프로드럭에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 영역을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 다중특이성 결합 폴리펩타이드는 하나의 표적 분자에 대해 특이적인 2 개의 결합 영역 및 제2 표적 분자에 대해 특이적인 2 개의 결합 부위를 갖는 4가 항체이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "결합가 (valency)"는 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 잠재적 결합 영역의 수를 의미한다. 각각의 결합 영역은 하나의 표적 분자를 특이적으로 결합시킨다. 결합 폴리펩타이드가 하나 이상의 결합 영역을 포함하는 경우에, 각각의 결합 영역은 동일하거나 상이한 분자를 특이적으로 결합시킬 수 있다 (예를 들어, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다). 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 일가이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다가이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 2가이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 3가이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 4가이다.
특정의 관점에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커를 사용한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "폴리펩타이드 링커"는 폴리펩타이드 쇄의 선형 아미노산 서열 내에서 2 개의 영역을 접속시키는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열 (예를 들어, 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열)을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 결합 부위를 유전적으로 융합된 Fc 부분에 접속시키기 위해서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩타이드 링커는 폴리펩타이드 분자에 대해 유연성을 제공한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, VH 영역 또는 VL 영역은 폴리펩타이드 링커를 통해서 유전적으로 융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)에 융합되거나 결합된다 (폴리펩타이드 링커의 N- 또는 C-말단이 유전적으로 융합된 Fc 부분의 C- 또는 N-말단에 부착되고, 폴리펩타이드 링커의 N-말단이 VH 또는 VL 영역의 N- 또는 C-말단에 부착된다).
특정의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 2 개의 Fc 부위 또는 영역을 접속시키기 (예를 들어, 유전적으로 융합시키기) 위해서 사용된다. 이러한 폴리펩타이드 링커는 또한, 여기에서 Fc 접속 폴리펩타이드라 칭한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "Fc 접속 폴리펩타이드"는 구체적으로 2 개의 Fc 부위 또는 영역을 접속시키는 (예를 들어, 유전적으로 융합시키는) 연결 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 펩타이드 링커를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "적절하게 폴딩된 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드를 포함하는 모든 기능적 영역이 명백하게 활성인 폴리펩타이드 (예를 들어, 본 발명의 결합 폴리펩타이드)를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "부적절하게 폴딩된 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드의 기능적 영역 중의 적어도 하나가 활성이 아닌 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, "적절하게 폴딩된 Fc 폴리펩타이드" 또는 "적절하게 폴딩된 Fc 부분"은 적어도 2 개의 성분 Fc 부위가 적절하게 폴딩되어 생성된 scFc 부분이 적어도 하나의 효과기 기능을 포함하는 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)을 포함한다.
지정된 폴리펩타이드 또는 단백질"로부터 유도된" 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 기원을 의미한다. 바람직하게는, 특정한 서열로부터 유도된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 그 서열, 또는 적어도 10-20 개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 20-30 개의 아미노산, 더 더욱 바람직하게는 적어도 30-50 개의 아미노산으로 구성되거나, 그렇지 않다면 서열 중에 그의 기원을 갖는 것 으로 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 확인될 수 있는 그의 일부분과 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 펩타이드로부터 유도된 폴리펩타이드는 출발 폴리펩타이드에 비해서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 또 다른 아미노산 잔기에 의해서 치환되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 또는 결실을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변이체는 반드시 출발 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 변이체는 변이체 분자의 길이에 걸쳐서 출발 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 더욱 바람직하게는 약 80% 내지 100% 미만, 더욱 바람직하게는 약 85% 내지 100% 미만, 더욱 바람직하게는 약 90% 내지 100% 미만 (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 및 가장 바람직하게는, 95% 내지 100% 미만을 가질 수 있다. 하나의 구체예에서, 출발 폴리펩타이드 서열과 이것으로부터 유도된 서열 사이에는 하나의 아미노산 차이가 있다. 이 서열에 관한 동일성 또는 유사성은 본 명세서에서, 최대 퍼센트의 서열 동일성이 달성되도록 서열 및, 필요한 경우, 도입성 갭 (gap)을 정렬한 후에 출발 아미노산 서열과 동일한 (즉, 동일한 잔기) 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
본 발명의 바람직한 결합 폴리펩타이드는 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (예를 들어, 적어도 하나의 Fc 부위 또는 영역)을 포함한다. 그러나, 폴리펩타이드는 또 다른 포유동물 종으로부터 유래하는 하나 이상의 아미 노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 영장류 Fc 영역 또는 결합 부위가 대상 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있다. 대신으로, 하나 이상의 쥐 아미노산이 폴리펩타이드 내에 존재할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 폴리펩타이드는 면역원성이 아니다.
또한, 본 발명의 결합 폴리펩타이드가, 이들이 천연 폴리펩타이드의 바람직한 활성은 유지하면서 이들이 유도된 천연적으로 존재하거나 천연인 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 달라지도록 변화될 수 있음은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 이해될 수 있을 것이다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 보존적 치환 또는 변화를 유도하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 면역글로불린 (예를 들어, Fc 영역, 부위, 또는 항원 결합 부위)로부터 유도된 결합 폴리펩타이드의 비-천연 변이체를 코드화한 분리된 핵산 분자는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 코드화된 단백질에 도입되도록 면역글로불린의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 도입시킴으로써 발생될 수 있다. 돌연변이는 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술에 의해서 도입될 수 있다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 잔기에서, 예를 들어, 필수 또는 비-필수 아미노산 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해서 대체된 것이다. 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리 신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소로이신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 집단은 본 기술분야에서 정의되어 있다. 따라서, 결합 폴리펩타이드 내의 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는, 동일한 측쇄 집단으로부터 유래하는 또 다른 아미노산 잔기에 의해서 대체된다. 또 다른 구체예에서, 아미노산의 단선 (string)은 측쇄 집단 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 단선에 의해서 대체될 수 있다. 대신으로, 또 다른 구체예에서, 돌연변이는 예를 들어, 포화 돌연변이유발에 의해서 코드화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위적으로 도입될 수 있으며, 생성된 돌연변이체는 본 발명의 결합 폴리펩타이드 내에 혼입되고, 바람직한 표적에 결합하는 그들의 능력에 대해서 스크리닝할 수 있다.
폴리펩타이드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 아미노에서 카복실 말단 방향으로 폴리펩타이드 내의 아미노산의 순서이며, 여기에서 서열 내에서 서로에 이웃하고 있는 잔기는 폴리펩타이드의 일차 구조에서 인접한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 컨쥬게이션 또는 재조합 방법을 포함한 어떤 방법에 의해서라도 2 개의 추가의 요소 또는 성분들이 함께 결합되는 것을 의미한다. 화학적 컨쥬게이션 (예를 들어, 헤테로 이작용성 교차결합제를 사용)의 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "유전적으로 융합된" 또는 "유전적 융합"은 2개 이상의 단백질, 폴리펩타이드 또는 그의 단편이 이들 단백질, 폴리펩타이드 또는 단편을 코드화한 단일 폴리뉴클레오타이드의 유전자 발현을 통해서, 그들의 개별적인 펩타이드 골격구조에 의해 동등-선형 (co-linear), 공유적 연결 또는 부착하는 것을 의미한다. 이러한 유전자 융합은 단일의 인접한 유전자 서열의 발현을 제공한다. 바람직한 유전자 융합은 프레임 내에서 이루어지며, 즉 2개 이상의 개방 판독 프레임 (ORFs)은 원래의 ORFs의 정확한 판독 프레임을 유지하는 방식으로 융합되어 연속적인 더 긴 ORF를 형성한다. 따라서, 생성된 재조합 융합 단백질은 원래의 ORFs에 의해서 코드화된 폴리펩타이드에 상응하는 2개 이상의 단백질 절편 (이 절편은 통상적으로 자연에서는 그렇게 결합되지 않는다)을 함유하는 단일 폴리펩타이드이다. 따라서, 비록 판독 프레임이 융합된 유전자 절편 전체에 걸쳐서 연속적으로 만들어지지만, 단백질 절편은 예를 들어, 프레임-내 폴리펩타이드 링커에 의해서 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "Fc 부분"은 그의 2 개의 중쇄의 각각의 Fc 영역 (또는 Fc 부위)에 의해서 형성된 천연 면역글로불린의 일부분으로서 정의되어야 한다. 천연 Fc 부분은 호모이량체이다. 그에 반해서, 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "유전적으로-융합된 Fc 부분" 또는 "단일-쇄 Fc 부분" (scFc 부분)은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 유전적으로 연결된 (즉, 단일의 인접한 유전자 서열에 코드화된) Fc 영역 (또는 Fc 부위)로 이루어진 합성 Fc 부분을 의미한다. 따라서, 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)은 단량체이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "Fc 영역"은 파파인 분열 부위 (즉, 중쇄 불변 부분의 첫 번째 잔기를 114로 하여 IgG 내의 잔기 216) 바로 상류의 힌지 부분에서 시작하여 항체의 C-말단에서 종료하는 단일 면역글로불린 중쇄의 일부분을 의미한다. 따라서, 완전한 Fc 영역은 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "Fc 영역 부분" 또는 "Fc 부위"는 Fc 영역의 또는 Fc 영역으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 구체예에서, Fc 부위는 힌지 (예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 부분) 영역, CH2 영역, CH3 영역, CH4 영역, 또는 이들의 변이체, 일부분 또는 단편 중의 적어도 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, Fc 부위는 완전한 Fc 영역 (즉, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역)을 포함한다. 하나의 구체예에서, Fc 부위는 CH3 영역 (또는 그의 일부분)에 융합된 힌지 영역 (또는 그의 일부분)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, Fc 부위는 CH3 영역 (또는 그의 일부분)에 융합된 CH2 영역 (또는 그의 일부분)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, Fc 부위는 CH3 영역 또는 그의 일부분으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, Fc 부위는 힌지 영역 (또는 그의 일부분) 및 CH3 영역 (또는 그의 일부분)으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, Fc 부위는 CH2 영역 (또는 그의 일부분) 및 CH3 영역으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, Fc 부위는 힌지 영역 (또는 그의 일부분) 및 CH2 영역 (또는 그의 일부분)으로 구성된다. 하나의 구체예에서, Fc 부위는 CH2 영역의 적어도 일부분 (예를 들어, CH2 영 역의 전부 또는 일부)을 결여한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 Fc 부분 (scFc 부분)은 적어도, FcRn 결합을 위해서 필요한 것으로 본 기술분야에서 공지된 Fc 분자의 일부분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 Fc 부분 (scFc 부분)은 적어도, FcγR 결합을 위해서 필요한 것으로 본 기술분야에서 공지된 Fc 분자의 일부분을 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 Fc 부분 (scFc 부분)은 적어도, 단백질 A 결합에 필요한 것으로 본 기술분야에서 공지된 Fc 분자의 일부분을 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 Fc 부분 (scFc 부분)은 적어도, 단백질 G 결합에 필요한 것으로 본 기술분야에서 공지된 Fc 분자의 일부분을 포함한다.
본 명세서에서 설명한 바와 같이, 어떤 Fc 영역이라도 이것이 천연적으로 존재하는 면역글로불린 분자의 천연 Fc 영역과는 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있음은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 이해될 수 있을 것이다. 특정의 예시적 구체예에서, Fc 부위는 효과기 기능 (예를 들어, FcγR 결합)을 보유한다.
본 발명의 폴리펩타이드의 Fc 영역 또는 부위는 다양한 면역글로불린 분자로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 Fc 영역 또는 부위는 IgG1 분자로부터 유도된 CH2 및/또는 CH3 영역 및 IgG3 분자로부터 유도된 힌지 부분을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, Fc 영역 또는 부위는 부분적으로 IgG1 분자로부터, 및 부분적으로 IgG3 분자로부터 유도된 키메라 힌지 부분을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, Fc 영역 도는 부위는 부분적으로 IgG1 분자로부터, 및 부분적으로 IgG4 분자로부터 유도된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "면역글로불린"은 이것이 어떤 적절한 특이적 면역반응성을 갖든지 아니든지 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄의 조합을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 흥미가 있는 항원 (예를 들어, 종양 연관된 항원)에 대해서 상당한 공지의 특이적 면역반응 활성을 갖는 이러한 조립체 (예를 들어, 온전한 항체 분자, 항체 단편, 또는 그의 변이체)를 의미한다. 항체 및 면역글로불린은 경쇄 및 중쇄를, 이들 사이의 쇄간 (interchain) 공유적 연결이 있거나 없이 포함한다. 척추동물 시스템에서 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다.
이하에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 일반적 용어 "항체"는 생물화학적으로 구분될 수 있는 항체의 5 개의 별개의 부류를 포함한다. 항체의 각각의 부류로부터의 Fc 부위는 분명히 본 발명의 범주 내에 포함되며, 이하의 설명은 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관한 것이다. IgG에 관해서, 면역글로불린은 분자량 약 23,000 달톤의 2 개의 동일한 폴리펩타이드 경쇄, 및 분자량 53,000-70,000의 2 개의 동일한 중쇄를 포함한다. 4 개의 쇄는 "Y" 배열로 디설파이드 결합에 의해서 결합되는데, 여기에서 경쇄는 "Y"의 입구에서 출발하여 가변 영역을 통해서 계속되는 중쇄를 받치고 있다.
면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다 (κ,λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로에 대해서 공유적으로 결합되며, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해서 생성되는 경우에 2 개의 중쇄의 "꼬리 (tail)" 부분은 공유적 디설파이드 연결 또는 비-공유적 연결에 의해서 서로에 대해 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열의 분기된 말단에서의 N-말단으로부터 각각의 쇄의 하부에서의 C-말단으로 걸쳐있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는, 중쇄가 감마, 뮤 (mu), 알파, 델타 또는 입실론 (γ,μ,α,δ,ε)으로 분류되며, 이들 중에는 일부의 서브클래스 (예를 들어, γ1-γ4)가 있음을 이해할 것이다. 이것은 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 결정하는 이 쇄의 본질이다. 면역글로불린 서브클래스 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 특정화되어 있으며, 기능적 전문화를 부여하는 것으로 공지되어 있다. 이들 부류 및 이소타입 각각의 변형된 형태는 본 설명에 비추어서 숙련된 전문가에게 쉽게 인식될 수 있으며, 따라서 본 발명의 범주 내에 포함된다.
경쇄 및 중쇄는 둘 다 구조적 및 기능적 상동성의 부분으로 구분된다. 용어 "부분"은 단일 면역글로불린 (용어 "Fc 부분"를 사용한 경우와 같음) 또는 단일 항체 쇄의 일부 또는 일부분을 의미하며, 불변 부분 또는 가변 부분뿐만 아니라 상기 영역의 더 분리된 일부 또는 일부분을 포함한다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 "골격구조 부분" 또는 "FRs" 사이에 산재된 "상보성 결정 부분" 또는 "CDRs"를 포함한다.
면역글로불린의 특정한 부분은 "불변 부분"의 경우에는 다양한 부류 구성원의 부분 내에서 서열 변이의 상대적 결여, 또는 "가변 부분"의 경우에는 다양한 부류 구성원의 부분 내에서의 상당한 변이를 기초로 하여 "불변" (C) 부분 또는 "가 변" (V) 부분으로 정의될 수 있다. 용어 "불변 부분" 및 "가변 부분"은 또한, 기능적으로 사용될 수 있다. 이에 관해서, 면역글로불린 또는 항체의 가변 부분은 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것으로 이해될 수 있다. 반대로, 면역글로불린 또는 항체의 불변 부분은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 효과기 기능을 부여한다. 다양한 면역글로불린의 불변 부분의 서브유니트 구조 및 삼차원적 배열은 잘 알려져 있다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 및 가변 부분은 영역 내로 폴딩된다. 용어 "영역"은 예를 들어, β-주름진 (pleated) 시트 및/또는 쇄내 디설파이드 결합에 의해서 안정화된 펩타이드 루프 (loops)를 포함하는 (예를 들어, 3 내지 4 개의 펩타이드 루프를 포함하는) 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드의 독립적으로 폴딩된 구형 부분을 의미한다. 면역글로불린의 경쇄 상의 불변 부분 영역은 "경쇄 불변 부분 영역", "CL 부분" 또는 "CL 영역"으로 상호교환하여 나타낸다. 중쇄 상의 불변 영역 (예를 들어, 힌지, CH1, CH2 또는 CH3 영역)은 "중쇄 불변 부분 영역", "CH" 부분 영역 또는 "CH 영역"으로 상호교환하여 나타낸다. 경쇄 상의 가변 영역은 "경쇄 가변 부분 영역", "VL 부분 영역" 또는 "VL 영역"으로 상호교환하여 나타낸다. 중쇄 상의 가변 영역은 "중쇄 가변 부분 영역", "VH 부분 영역" 또는 "VH 영역"으로 상호교환하여 나타낸다.
협약에 의해서, 가변 및 불변 부분 영역의 넘버링은 이들이 면역글로불린 또는 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 멀어지게 됨에 따라서 증가한다. 각각의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 N-말단은 가변 부분이고, C-말단은 불변 부분이며; CH3 및 CL 영역은 실제로 각각, 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단을 포함한다. 따라서, 경쇄 면역글로불린의 영역은 VL-CL 배향으로 정렬되는 반면에, 중쇄의 영역은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3 배향으로 정렬된다.
CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역 내에서의 아미노산 위치를 포함한 중쇄 불변 부분 내에서의 아미노산 위치는 본 명세서에서 EU 인덱스 넘버링 시스템에 따라 번호를 붙인다 [참조: Kabat et al., in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 5th edition, 1991]. 대조적으로, 경쇄 불변 부분 (예를 들어, CL 영역) 내에서의 아미노산 위치는 카바트 (Kabat) 인덱스 넘버링 시스템에 따라서 번호를 붙인다 [참조: Kabat et al., ibid].
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "VH 영역"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 영역을 포함하며, 용어 "VL 영역"은 카바트 인덱스 넘버링 시스템에 따라 면역글로불린 경쇄의 아미노 말단 가변 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "CH1 영역"은 예를 들어, 대략 EU 위치 118-215로 연장되는 면역글로불린 중쇄의 제1 (대부분 아미노 말단) 불변 부분 영역을 포함한다. CH1 영역은 면역글로불린 중쇄 분자의 VH 영역에, 아미노 말단은 힌지 부분에 인접하며, 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분의 일부를 형성하지 않는다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄 분자 (예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4 분자)로부터 유도된 CH1 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "힌지 부분"은 CH1 영역을 CH2 영역에 결합시키는 중쇄 분자의 일부분을 포함한다. 이 힌지 부분은 대략 25 개의 잔기를 포함하며, 유연성이 있고, 따라서 2 개의 N-말단 항원 결합 부분이 독립적으로 이동하도록 허용한다. 힌지 부분은 3 개의 별개의 영역, 즉 상부, 중간 및 하부 힌지 영역으로 세분될 수 있다 [Roux et al. J. Immunol. 1998, 161:4083].
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "CH2 영역"은 대략 EU 위치 231-340으로 연장되는 중쇄 면역글로불린 분자의 일부분을 포함한다. CH2 영역은 이것이 또 다른 영역과 근접하여 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2 개의 N-연결된, 분지된 탄수화물 쇄가 온전한 천연 IgG 분자의 2 개의 CH2 영역 사이에 개재된다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 IgG1 분자 (예를 들어, 인간 IgG1 분자)로부터 유도된 CH2 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 IgG4 분자 (예를 들어, 인간 IgG4 분자)로부터 유도된 CH2 영역을 포함한다. 예시적 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 CH2 영역 (EU 위치 231-340), 또는 그의 일부분을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "CH3 영역"은 CH2 영역의 N-말단으로부터 대략 110 개의 잔기, 예를 들어, 대략 위치 341-446b (EU 넘버링 시스템)로 연장되는 중쇄 면역글로불린 분자의 일부분을 포함한다. CH3 영역은 일반적으로, 항체의 C-말단 부분을 형성한다. 그러나, 일부의 면역글로불린에서는 추가의 영역이 CH3 영역으로부터 연장되어 분자의 C-말단 부분 (예를 들어, IgM의 μ쇄 내의 CH4 영역 및 IgE의 ε 영역)을 형성할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결 합 폴리펩타이드는 IgG1 분자 (예를 들어, 인간 IgG1 분자)로부터 유도된 CH3 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 IgG4 분자 (예를 들어, 인간 IgG4 분자)로부터 유도된 CH3 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "CL 영역"은 예를 들어, 대략 카바트 위치 107A-216으로 연장되는 면역글로불린 경쇄의 제1 (대부분 아미노 말단) 불변 부분 영역을 포함한다. CL 영역은 VL 영역에 인접한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 카파 경쇄 (예를 들어, 인간 카파 경쇄)로부터 유도된 CL 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "효과기 기능"은 면역계의 단백질 및/또는 세포를 결합시키고, 다양한 생물학적 효과를 매개하는 Fc 부분 또는 그의 일부분의 기능적 능력을 의미한다. 효과기 기능은 항원 의존적이거나, 항원-독립적일 수 있다. 효과기 기능의 감소는 항체 (또는 그의 단편)의 가변 부분의 항원 결합 활성은 유지하면서 하나 이상의 효과기 기능이 감소하는 것을 의미한다. 효과기 기능, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체 단백질에 대한 Fc 결합의 증가 또는 감소는 폴드 (fold) 변화 (예를 들어, 1-폴드, 2-폴드 등으로 변화됨)로 표현될 수 있으며, 예를 들어, 본 기술분야에서 잘 알려진 시험방법을 사용하여 측정된 결합 활성에 있어서의 변화율 퍼센트를 기초로 하여 계산될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "항원 의존적 효과기 기능"은 상응하는 항원에 대한 항체의 결합에 따라서 통상적으로 유도되는 효과기 기능을 의미한 다. 일반적인 항원 의존적 효과기 기능은 보체 단백질 (예를 들어, C1q)을 결합시키는 능력을 포함한다. 예를 들어, Fc 부분에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 의존적 세포독성 (CDCC)이라 칭하는 과정인 세포 병원체의 옵소닌작용 (opsonisation) 및 용해를 유도하는 고전적 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 또한, 염증반응을 자극하며, 자가면역 과민성에 연루될 수도 있다.
그 밖의 다른 항원 의존적 효과기 기능은 그들의 Fc 부위를 통한 세포 상의 특정한 Fc 수용체 ("FcRs")에 대한 항체의 결합에 의해서 매개된다. IgG (감마 수용체, 또는 IgγRs), IgE (입실론 수용체, 또는 IgεRs), IgA (알파 수용체, 또는 IgαRs) 및 IgM (뮤 수용체, 또는 IgμRs)을 포함한 다양한 부류의 항체에 대해 특이적인 다수의 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 면역 컴플렉스의 엔도사이토시스, 항체-코팅된 입자 또는 미생물의 포획 및 파괴 (또한, 항체 의존적 식작용, 또는 ADCP라 칭함), 면역 컴플렉스의 청소, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해 (항체 의존적 세포-매개된 세포독성, 또는 ADCC라 칭함), 염증 매개체의 방출, 면역계 세포 활성화의 조절, 태반 전이 및 면역글로불린 생성의 조절을 포함한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 유발한다.
특정의 Fc 수용체인 Fc 감마 수용체 (FcγRs)는 면역 동원을 저지하거나 증진시키는데 중요한 역할을 한다. FcγRs는 백혈구 상에서 발현되며, 3 개의 별개의 부류인 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII으로 구성된다 [Gessner et al., Ann. Hematol., (1998), 76: 231-48]. 구조적으로, FcγRs는 2개 또는 3 개의 Ig-유사 영역으로 구성된 세포외 부분과 함께 IgG-결합 α-쇄를 갖는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 모든 구성원이다. 인간 FcγRI (CD64)은 인간 단핵구 상에서 발현되며, 단량체 IgG1, IgG3, 및 IgG4에 대해서 높은 친화성 결합 (Ka=108-109 M-1)을 나타낸다. 인간 FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)은 IgG1 및 IgG3에 대해서 낮은 친화성을 가지며 (Ka <107 M-1), 단지 이들 IgG 이소타입의 컴플렉스 또는 폴리머 형태만을 결합시킬 수 있다. 더구나, FcγRII 및 FcγRIII 부류는 "A" 및 "B" 형태 둘 다를 포함한다. FcγRIIa (CD32a) 및 FcγRIIIa (CD16a)는 경막 영역에 의해서 대식세포, NK 세포 및 일부의 T 세포의 표면에 결합되는 반면에, FcγRIIb (CD32b) 및 FcγRIIIb (CD16b)는 포스파티딜 이노시톨 글리칸 (GPI) 고정자 (anchor)를 통해서 과립구 (예를 들어, 호중구)의 세포 표면에 선택적으로 결합된다. 인간 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII의 각각의 쥐 동족체는 FcγRIIa, FcγRIIb/1, 및 FcγRlo이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "항원-독립적 효과기 기능"은 항체가 그의 상응하는 항원에 결합하였는지 여부와는 무관하게 항체에 의해서 유도될 수 있는 효과기 기능을 의미한다. 일반적인 항원 의존적 효과기 기능에는 세포성 수송, 면역글로불린의 순환 반감기 및 청소율, 및 정제의 촉진이 포함된다. 구조 (salvage) 수용체로도 또한 공지되어 있는 구조적으로 독특한 Fc 수용체인 "신생아 (neonatal) Fc 수용체" 또는 "FcRn"은 반감기 및 세포성 수송에 중요한 역할을 한 다. 미생물 세포로부터 정제된 다른 Fc 수용체 (예를 들어, 스타필로코커스 단백질 A 또는 G)는 높은 친화성을 가지고 Fc 부분에 결합할 수 있으며, Fc 함유 폴리펩타이드의 정제를 촉진시키기 위해서 사용될 수 있다.
면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 FcγRs와는 달리, 인간 FcRns는 구조적으로 주요 조직부적합 컴플렉스 (Major Histoincompatibility Complex; MHC) 클래스 I의 폴리펩타이드과 유사하다 [Ghetie and Ward, Immunology Today, (1997), 18(12): 592-8]. FcRn은 일반적으로, 가용성 β 또는 경쇄 (β2 마이크로글로불린)과의 컴플렉스 내의 경막 α 또는 중쇄로 구성된 헤테로이량체로 발현된다. FcRn은 클래스 I MHC 분자와 22-29% 서열 동일성을 공유하며, MHC 펩타이드 결합 그루브 (groove)의 비-기능적 형태를 갖는다 [Simister and Mostov, Nature, (1989), 337: 184-7]. MHC와 마찬가지로, FcRn의 α 쇄는 3 개의 세포외 영역 (α1, α2, α3)으로 구성되며, 짧은 세포질 꼬리는 단백질을 세포 표면에 고정시킨다. α1 및 α2 영역은 항체의 Fc 부분 내의 FcR 결합 부위와 상호작용한다 [Raghavan et al., Immunity, (1994), 1: 303-15]. FcRn은 포유동물의 모체측 태반 또는 난황낭에서 발현되며, 이것은 모체로부터 태아에게로 IgGs를 전이시키는데 연루된다. FcRn은 또한, 설치류 신생아의 소장에서 발현되며, 여기에서 이것은 섭취된 초유 또는 밀크로부터 모체 IgG를 솔가장자리 상피를 가로질러서 전이시키는데 연루된다. FcRn은 또한, 무수한 종을 가로질러 다수의 다른 조직뿐만 아니라 다양한 내피 세포주에서도 발현된다. 이것은 또한, 인간 성숙 혈관 내피세포, 근육 맥관구조, 및 간 동양혈관 (sinusoids)에서도 발현된다. FcRn은 IgG를 결합시 키고, 이것을 혈청에 재순환시킴으로써 IgG의 순환 반감기 또는 혈청 레벨을 유지시키는데 추가의 역할을 하는 것으로 생각된다. IgG 분자에 대한 FcRn의 결합은 엄밀히 pH 의존적인데, 최적 결합은 7.0 미만의 pH에서 일어난다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "반감기"는 생체내에서 특정의 결합 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 의미한다. 반감기는 대상체에게 투여된 양의 절반이 순환 및/또는 동물 내의 다른 조직으로부터 청소되도록 하는데 필요한 시간으로 나타낼 수 있다. 소정의 결합 폴리펩타이드의 청소 곡선이 시간의 함수로서 작성되는 경우에, 곡선은 통상적으로 급속한 α-상 및 더 긴 β-상을 갖는 이상성 (biphasic)이다. α-상은 일반적으로 혈관-내 및 -외 공간 사이에서의 투여된 Fc 폴리펩타이드의 평형을 나타내며, 부분적으로 폴리펩타이드의 크기에 의해서 결정된다. β-상은 일반적으로, 혈관내 공간에서의 결합 폴리펩타이드의 이화작용을 나타낸다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 사용된 용어 반감기는 β-상에서의 결합 폴리펩타이드의 반감기를 의미한다. 인간에게서 인간 항체의 전형적인 β상 반감기는 21 일이다.
상기에 나타낸 바와 같이, 항체의 가변 부분은 이것이 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하도록 허용한다. 즉, 항체의 VL 영역 및 VH 영역은 결합하여 삼차원적 항원 결합 부위를 정의하는 가변 부분 (Fv)을 형성한다. 이 4차 항체 구조는 Y의 각각의 팔의 말단에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더욱 구체적으로, 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 가변 부분 각각 상의 3 개의 상 보성 결정 부분 (CDRs)에 의해서 정해진다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "항원 결합 부위"는 세포 표면 또는 가용성 항원과 같은 항원을 특이적으로 결합시키는 (항원과 면역반응하는) 부위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 결합 부위는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 부분을 포함하며, 이들 가변 부분에 의해서 형성된 결합 부위는 항체의 특이성을 결정한다. 항원 결합 부위는 폴리펩타이드 마다 서로 다른 가변 부위에 의해서 형성된다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 항체 분자 (예를 들어, 그의 서열이 본 기술분야에서 공지되어 있거나, 본 명세서에 기술된 것)의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 2 개의 CDRs를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 3 개의 CDRs를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 4 개의 CDRs를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 5 개의 CDRs를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 항체 분자로부터의 6 개의 CDRs를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 대상 결합 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항체 분자의 예는 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예시적인 분자는 본 명세서에 기술된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 부분"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 부분 내에 존재하는 비인접성 항원 결합 부위를 의미한다. 이들 특정의 부분은 문헌 [Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977); Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) (여기에서, 정의는 서로에 대해 비교하는 경우에 아미노산의 중복 또는 서브셋을 포함한다)]에 기술되어 있다. 상기 인용된 문헌 각각에 의해서 정의된 CDRs를 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해서 설명된다.
바람직하게는, 용어 "CDR"은 서열 비교를 기초로 하여 카바트에 의해서 정의된 바와 같은 CDR이다.
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본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "골격구조 부분" 또는 "FR 부분"은 가 변 부분의 일부이지만, CDRs의 일부는 아닌 (예를 들어, CDRs의 카바트 정의를 사용하여) 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 가변 부분 골격구조는 길이가 약 100-120개의 아미노산 사이이지만, 단지 CDRs 바깥쪽의 아미노산만을 포함한다. 중쇄 가변 부분의 구체적인 예, 및 카바트 등에 의해서 정의된 바와 같은 CDRs에 대하여, 골격구조 부분 1은 아미노산 1-30을 포함하는 가변 부분의 영역에 해당하며; 골격구조 부분 2는 아미노산 36-49를 포함하는 가변 부분의 영역에 해당하고; 골격구조 부분 3은 아미노산 66-94를 포함하는 가변 부분의 영역에 해당하며; 골격구조 부분 4는 아미노산 103에서 가변 부분의 말단까지의 가변 부분의 영역에 해당한다. 경쇄를 위한 골격구조 부분은 경쇄 가변 부분 CDRs 각각에 의해서 마찬가지로 분리된다. 마찬가지로, 클로티아 등 또는 맥칼럼 등에 의한 CDRs의 정의를 사용하여, 골격구조 부분 경계는 상술한 바와 같은 각각의 CDR 말단에 의해서 분리된다. 바람직한 구체예에서, CDRs는 카바트에 의해서 정의된 바와 같다.
천연적으로 존재하는 항체에서, 항체는 수성 환경에서 그의 삼차원적 배열을 취하기 때문에, 각각의 단량체 항체 상에 존재하는 6 개의 CDRs는 항체 결합 부위를 형성하도록 특별하게 위치하는 아미노산의 짧고 비-인접성인 서열이다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 나머지는 아미노산 서열에서 더 적은 분자간 가변성을 나타내며, 골격구조 부분이라 칭한다. 골격구조 부분은 대부분 β-시트 배열을 채택하며, CDRs은 β-시트 구조를 접속시키고, 일부의 경우에는 그의 일부분을 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 이들 골격구조 부분은 분자-간 비-공유적 상호작용에 의해서 정확한 배향으로 6 개의 CDRs의 배치를 제공하는 스캐폴드 (scaffold)를 형 성하도록 작용한다. 배치된 CDRs에 의해서 형성된 항원 결합 부위는 면역반응성 항원 상의 에피토프에 대한 표면 상보성을 규정한다. 이 상보적 표면은 면역반응성 항원 에피토프에 대한 항체의 비-공유적 결합을 촉진시킨다. CDRs의 위치는 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 쉽게 확인될 수 있다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 결합 폴리펩타이드와 선택된 항원과의 회합을 제공하는 (예를 들어, 동일한 결합 폴리펩타이드 내의 (예를 들어, 단일 폴리펩타이드의 N- 및 C-말단 둘 다에서), 또는 본 발명의 다량체 결합 단백질의 각각의 성분 결합 폴리펩타이드에 연결된) 적어도 2 개의 항원 결합 영역을 포함한다. 항원 결합 영역은 동일한 면역글로불린 분자로부터 유도될 필요가 없다. 이에 관해서, 가변 부분은 체액성 반응을 개시하고, 원하는 항원에 대한 면역글로불린을 생성하도록 유도될 수 있는 모든 유형의 동물로부터 유도될 수 있거나 없을 수 있다. 그 자체로서, 가변 부분은 예를 들어, 포유동물 기원의 것일 수 있으며, 예를 들어, 인간, 쥐, 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 마카크 (macaques) 등), 이리 (lupine), 카멜리드 (camelid) (예를 들어, 낙타, 야마 및 관련된 종) 기원의 것일 수 있다.
용어 "항체 변이체" 또는 "변형된 항체"는 천연에 존재하지 않으며, 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 또는 아미노산 변형에 의해서 천연적으로-유도된 항체와는 상이한 아미노산 서열 또는 아미노산 측쇄 화학을 갖는 항체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "항체 변이체"는 이들이 천연적으로 나타나지 않도록 변형된 항체의 합성 형태, 예를 들어, 적어도 2 개의 중 쇄 부분을 포함하지만 2 개의 완전한 중쇄를 포함하지는 않는 항체 (예를 들어, 영역 결실된 항체 또는 미니바디); 2개 이상의 상이한 항원에 또는 단일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하도록 변형된 항체의 다중특이성 형태 (예를 들어, 이중특이성, 삼중특이성 등); scFv 분자에 결합된 중쇄 분자; 단일-쇄 항체; 디아바디; 트리아바디; 및 변형된 효과기 기능을 갖는 항체 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "scFv 분자"는 하나의 경쇄 가변 영역 (VL) 또는 그의 일부분, 및 하나의 중쇄 가변 영역 (VH) 또는 그의 일부분으로 구성된 결합 분자를 포함하며, 여기에서 각각의 가변 영역 (또는 그의 일부분)은 동일하거나 상이한 항체로부터 유도된다. scFv 분자는 바람직하게는, VH 영역과 VL 영역 사이에 개재된 scFv 링커를 포함한다. ScFv 분자는 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [미국 특허 제5,892,019호; Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837]에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "scFv 링커"는 scFv의 VL 및 VH 영역 사이에 개재된 부위를 의미한다. scFv 링커는 바람직하게는, 항원 결합 배열에서 scFv 분자를 유지시킨다. 하나의 구체예에서, scFv 링커는 scFv 링커 펩타이드를 포함하거나, 이것으로 구성된다. 특정의 구체예에서, scFv 링커 펩타이드는 gly-ser 폴리펩타이드 링커를 포함하거나, 이것으로 구성된다. 다른 구체예에서, scFv 링커는 디설파이드 결합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "gly-ser 폴리펩타이드 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 구성된 펩타이드를 의미한다. 예시적인 gly/ser 폴리펩타이드 링커는 아미노산 서열 (Gly4 Ser)n을 포함한다. 하나의 구체예에서, n=1이다. 하나의 구체예에서, n=2이다. 하나의 구체예에서, n=3이며, 즉 (Gly4 Ser)3이다. 또 다른 구체예에서, n=4이며, 즉 (Gly4 Ser)4이다. 또 다른 구체예에서, n=5이다. 또 다른 구체예에서, n=6이다. 또 다른 구체예에서, n=7이다. 또 다른 구체예에서, n=8이다. 또 다른 구체예에서, n=9이다. 또 다른 구체예에서, n=10이다. 또 다른 예시적 gly/ser 폴리펩타이드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n을 포함한다. 하나의 구체예에서, n=1이다. 하나의 구체예에서, n=2이다. 바람직한 구체예에서, n=3이다. 또 다른 구체예에서, n=4이다. 또 다른 구체예에서, n=5이다. 또 다른 구체예에서, n=6이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "단백질 안정성"은 환경적 조건 (예를 들어, 상승하거나 저하된 온도)에 대한 반응으로 단백질의 하나 이상의 물리적 특성이 유지되는 것에 대한 본 기술분야에서 인지되는 척도이다. 하나의 구체예에서, 물리적 특성은 단백질의 공유적 구조의 유지이다 (예를 들어, 단백분해적 분열, 원치 않는 산화 또는 탈아미드화의 부재). 또 다른 구체예에서, 물리적 특성은 적절하게 폴딩된 상태로 단백질이 존재하는 것이다 (예를 들어, 가용성 또는 불용성 응집체 또는 침전물의 부재).
용어 "글리코실화"는 폴리펩타이드에 대한 하나 이상의 탄수화물의 공유적 연결을 의미한다. 일반적으로, 글리코실화는 세포 또는 그로부터의 추출물의 세포내 환경 내에서 나타날 수 있는 해독후 현상이다. 용어 글리코실화는 예를 들어, N-연결된 글리코실화 (하나 이상의 당이 아스파라긴 잔기에 연결된 경우) 및/또는 O-연결된 글리코실화 (하나 이상의 당이 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 세린 또는 트레오닌)에 연결된 경우)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "천연 시스테인"은 폴리펩타이드의 특정한 아미노산 위치에서 천연적으로 나타나며, 인간의 수작업에 의해서 변형되거나, 도입되거나 변화되지 않은 시스테인 아미노산을 의미한다. 용어 "조작된 시스테인 잔기 또는 그의 유사체" 또는 "조작된 시스테인 또는 그의 유사체"는 합성방법에 의해서 (예를 들어, 재조합 기술, 시험관내 펩타이드 합성, 펩타이드의 효소적 또는 화학적 커플링, 또는 이들 기술의 일부의 조합에 의해서), 천연적으로는 해당 위치에 시스테인 잔기 또는 그의 유사체를 함유하지 않는 폴리펩타이드의 아미노산 위치에 도입된 비-천연 시스테인 잔기 또는 시스테인 유사체 (예를 들어, 티아졸린-4-카복실산 및 티아졸리딘-4-카복실산 (티오프롤린, Th)과 같은 티올 함유 유사체)를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "디설파이드 결합"은 2개의 황 원자 사이에서 형성된 공유결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 그룹과 디설파이드 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있는 티올 그룹을 포함한다. 대부분의 천연적으로 존재하는 IgG 분자에서, CH1 및 CL 부분은 천연 디설파이드 결합에 의해 서 연결되며, 2 개의 중쇄는 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242에 상응하는 위치 (EU 넘버링 시스템에 따르면 위치 226 또는 229)에서 2 개의 천연 디설파이드 결합에 의해서 연결된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "결합된 시스테인"은 동일하거나 상이한 폴리펩타이드 내에 존재하는 제2의 천연 또는 조작된 시스테인 또는 다른 잔기와의 디설파이드 결합 또는 다른 공유결합을 형성하는 폴리펩타이드 내의 천연 또는 조작된 시스테인 잔기를 의미한다. "분자내 결합된 시스테인"은 동일한 폴리펩타이드 내에 존재하는 제2의 시스테인에 공유적으로 결합된 (즉, 분자내 디설파이드 결합), 결합된 시스테인을 의미한다. "분자간 결합된 시스테인"은 상이한 폴리펩타이드 내에 존재하는 제2의 시스테인에 공유적으로 결합된 (즉, 분자간 디설파이드 결합), 결합된 시스테인을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "유리 시스테인"은 실질적으로 환원된 형태로 존재하는 폴리펩타이드 서열 내의 천연 또는 조작된 시스테인 아미노산 잔기 (및 그의 유사체 또는 모사체, 예를 들어, 티아졸린-4-카복실산 및 티아졸리딘-4-카복실산 (티오프롤린, Th))를 의미한다. 유리 시스테인은 바람직하게는, 본 발명의 효과기 기능에 의해서 변형될 수 있다.
용어 "티올 변형시약"은 결합 폴리펩타이드 내의 (예를 들어, 결합 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 링커 내에서) 조작된 시스테인 잔기 또는 그의 유사체와 선택적으로 반응할 수 있고, 따라서 결합 폴리펩타이드에 대한 효과기 기능의 부위-특이적 화학적 첨가 또는 교차결합을 위한 수단을 제공함으로써 변형된 결합 폴리펩 타이드를 형성할 수 있는 화학제를 의미한다. 바람직하게는, 티올 변형시약은 유리 시스테인 잔기 내에 존재하는 티올 또는 설프하이드릴 작용기를 이용한다. 티올 변형시약의 예로는 말레이미드, 알킬 및 아릴 할라이드, α-할로아실 및 피리딜 디설파이드가 포함된다.
용어 "기능적 부위"는 바람직하게는, 결합 폴리펩타이드에 바람직한 기능을 부가하는 부위를 포함한다. 바람직하게는, 기능은 폴리펩타이드의 고유한 바람직한 활성, 예를 들어, 분자의 항원-결합 활성을 상당히 변화시킴이 없이 부가된다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 기능적 부위를 포함할 수 있다. 유용한 기능적 부위의 예로는 효과기 부위, 친화성 부위, 및 차단성 부위가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
차단성 부위의 예로는 예를 들어, 폴리펩타이드를 글리코실화시키는 글리코시다제의 능력을 차단함으로써, 환원된 글리코실화가 일어나도록 하는 충분한 입체적 벌크 및/또는 전하의 부위가 포함된다. 차단성 부위는 추가적으로 또는 대신으로, 예를 들어, 수용체 또는 보체 단백질을 결합시키는 Fc 부분의 능력을 억제함으로써 효과기 기능을 감소시킬 수 있다. 바람직한 차단성 부위는 시스테인 부가물, 시스틴, 혼합된 디설파이드 부가물, 및 PEG 부위를 포함한다. 검출가능 부위의 예로는 형광 부위, 방사성 동위원소 부위, 방사선 불투과성 부위 등이 포함된다.
화학적 부위의 컨쥬게이션과 관련하여, 용어 "연결 부위"는 기능적 부위를 결합 폴리펩타이드의 나머지에 연결시킬 수 있는 부위를 포함한다. 연결 부위는 이것이 분열가능하거나 분열할 수 없도록 선택될 수 있다. 분열할 수 없는 연결 부위는 일반적으로 높은 체계적 안정성을 갖지만, 바람직하지 않은 약력학을 가질 수도 있다.
용어 "스페이서 (spacer) 부위"는 분자에 공간을 도입시키도록 디자인된 비단백질 부위이다. 하나의 구체예에서, 스페이서 부위는 탄소, 산소, 질소, 황 등으로부터 선택된 0 내지 100 개의 원자의 임의로 치환된 쇄일 수 있다. 하나의 구체예에서, 스페이서 부위는 이것이 수용성이 되도록 선택된다. 또 다른 구체예에서, 스페이서 부위는 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜이다.
용어 "페질화 부위" 또는 "PEG 부위"는 커플링제, 또는 커플링 또는 활성화 부위에 의한 (예를 들어, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란 또는 바람직하게는, 말레이미드 부위, 예를 들어, PEG-말레이미드에 의한) 유도체화의 존재 또는 부재 하의 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 포함한다. 그 밖의 다른 적절한 폴리알킬렌 글리콜 화합물에는 말레이미도 모노메톡시 PEG, 활성화된 PEG, 폴리프로필렌 글리콜이 포함되며, 또한 다음 유형의 하전되거나 중성인 폴리머가 포함된다: 덱스트란, 콜로민산, 또는 다른 탄수화물 기본 폴리머, 아미노산의 폴리머 및 비오틴 유도체.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "작용기 부위" (E)는 생물학적 또는 다른 기능적 활성을 갖는 진단 및 치료제 (예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 약물 부위, 및 그의 단편)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드에 컨쥬게이트된 효과기 부위를 포함하는 결합 폴리펩타이드는 비컨쥬게이트된 폴리펩타이드 와 비교하여 적어도 하나의 추가의 기능 또는 특성을 갖는다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드에 대한 세포독성 약물 부위 (예를 들어, 효과기 부위)의 컨쥬게이션 (예를 들어, 그의 폴리펩타이드 링커를 통한)은 제2 기능으로서 (즉, 항원 결합에 더하여) 약물 세포독성을 갖는 변형된 폴리펩타이드의 형성을 제공한다. 또 다른 예로, 제1 결합 폴리펩타이드에 대한 제2 결합 폴리펩타이드의 컨쥬게이션은 추가의 결합 특성을 부여할 수 있다.
효과기 부위가 유전적으로 코드화된 치료학적 또는 진단적 단백질 또는 핵산인 하나의 관점에서, 효과기 부위는 본 기술분야에서 잘 알려진 펩타이드 합성 또는 재조합 DNA 방법에 의해서 합성되거나 발현될 수 있다. 효과기가 비-유전적으로 코드화된 펩타이드 또는 약물 부위인 또 다른 관점에서, 효과기 부위는 인공적으로 합성되거나 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "약물 부위"는 소염제, 항암제, 항감염제 (예를 들어, 항진균제, 항균제, 항기생충제, 항바이러스제 등), 및 마취성 치료제를 포함한다. 추가의 구체예에서, 약물 부위는 항암제 또는 세포독성제이다. 상화성 약물 부위는 또한, 프로드럭을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "프로드럭"은 모 약물에 비해서 덜 활성이고, 덜 반응성이며, 부작용의 경향이 적으며, 생체내에서 더 활성인 형태로 효소적으로 활성화되거나, 또는 다른 식으로 전환될 수 있는 약제학적 활성제의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 본 발명과 상화성인 프로드럭에는 포스페이트 함유 프로드럭, 아미노산 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩타이드 함유 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 더 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 그 밖의 다른 5-플루오로유리딘 프로드럭이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 그 화합물의 반응을 본 발명의 변형된 결합 단백질을 제조할 목적으로 더욱 편리하게 되도록 하기 위해서 바람직한 약물 부위 또는 그의 프로드럭에 대한 화학적 변형을 만들 수 있다. 약물 부위는 또한, 본 명세서에 기술된 약물 부위의 유도체, 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 아미드 및 에테르를 포함한다. 유도체는 특정한 약물의 바람직한 치료학적 활성을 개선시킬 수 있거나 상당히 저하시키지 않을 수 있는, 본 명세서에 명시된 약물에 대한 변형을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "항암제"는 신생물 또는 종양 세포의 성장 및/또는 증식에 유해하며, 악성 종양을 감소, 억제 또는 파괴시키는 작용을 할 수 있는 약제를 포함한다. 이러한 약제의 예로는 세포증식억제제, 알킬화제, 항생제, 세포독성 뉴클레오사이드, 튜불린 결합제, 호르몬 및 호르몬 길항제 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 면역반응성 세포 또는 악성 세포의 성장을 지연시키거나 느리게 하는 작용을 하는 어떤 약제라도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
"친화성 태그 (tag)" 또는 "친화성 부위"는 정제과정 중에 다른 성분으로부터 그의 분리를 용이하게 하기 위해서 결합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 링커 또는 효과기 중의 하나 이상에 부착된 화학적 부위이다. 친화성 영역의 예로는 His 태그, 키틴 결합 영역, 말토즈 결합 영역, 비오틴 등이 포함된다.
"친화성 수지"는 반응 혼합물의 다른 성분으로부터 친화성 영역에 결합된 단백질의 분리를 용이하게 하기 위해서 높은 친화성으로 친화성 영역을 결합시킬 수 있는 화학적 표면이다. 친화성 수지는 고체 지지체의 표면 또는 그의 일부분 상에 코팅될 수 있다. 대신으로, 친화성 수지는 고체 지지체를 포함할 수 있다. 이러한 고체 지지체는 적합하게 변형된 크로마토그래피 칼럼, 미량역가 플레이트, 비드 (bead) 또는 바이오칩 (biochip) (예를 들어, 유리 웨이퍼 (glass wafer))을 포함할 수 있다. 친화성 수지의 예는 니켈, 키틴, 아밀라제 등으로 이루어진다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본 명세서에서, 바람직한 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입시키고, 이를 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하도록 사용된다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파아지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 그룹으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 상화성인 벡터는 선택 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 부위, 및 진핵 또는 원핵 세포에 들어가고/거나 그 세포 내에서 복제하는 능력을 포함할 수 있다.
본 발명의 목적에 따라, 다수의 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 하나의 부류는 소 파필로마 바이러스 (bovine papilloma virus), 폴리오마 (polyoma) 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 (vaccinia) 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유도된 DNA 요소를 이용한다. 그 밖의 다른 것은 내부 리보좀 결합 부위를 갖는 폴리시스트론성 (polycistronic) 시스템의 사용을 수반한다. 벡터의 예로는 미국 특허 제6,159,730호 및 제6,413,777호, 및 미국 특허출원 제2003 0157641 A1호에 기술된 것이 포함된다. 추가로, DNA를 그들의 염색체 내에 통합시킨 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입시킴으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 프로토트로피 (prototrophy), 살생물제 저항성 (예를 들어, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 저항성을 위한 것일 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결될 수 있거나, 공동형질전환에 의해서 동일한 세포 내에 도입시킬 수 있다. 하나의 구체예에서는, 유도성 발현 시스템이 사용될 수 있다. mRNA의 최적 합성을 위해서 추가의 요소가 필요할 수도 있다. 이들 요소는 시그날 서열, 스플라이스 (splice) 시그날뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 (enhancers) 및 종결 시그날을 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서는, 분비 시그날, 예를 들어, 몇 가지 잘 특정화된 세균성 리더 (leader) 펩타이드 (예를 들어, pelB, phoA, 또는 ompA) 중의 어느 하나를 프레임 내에서 본 발명의 폴리펩타이드의 N 말단에 융합시켜 폴리펩타이드의 최적 분비를 수득할 수 있다 [Lei et al. (1988), Nature, 331:543; Better et al. (1988) Science, 240:1041; Mullinax et al., (1990). PNAS, 87:8095].
용어 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성되고, 적어도 하나의 이형 유전자를 코드화한 벡터에 의해서 형질전환된 세포를 의미한다. 재조합 숙주 로부터 단백질을 분리하기 위한 방법의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 다른 식으로 분명하게 명시되지 않는 한, 단백질의 공급원을 나타내기 위해서 상호교환하여 사용된다. 바꾸어 말하면, "세포"로부터 단백질의 회수는 스핀다운된 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다. 단백질 발현을 위해서 사용된 숙주 세포주는 가장 바람직하게는 포유동물 기원의 것이며; 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 그 안에서 발현될 원하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정의 숙주 세포주를 선택적으로 결정하는 능력을 갖는 것으로 믿어진다. 숙주 세포주의 예로는 DG44 및 DUXB11 (차이니즈 햄스터 (Chinese Hamster) 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA (인간 자궁경부암종), CVI (원숭이 신장 세포주), COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610 (차이니즈 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3 (마우스 섬유아세포), HAK (햄스터 신장 세포주), SP2/O (마우스 골수종), P3x63-Ag3.653 (마우스 골수종), BFA-1c1BPT (소 내피세포), RAJI (인간 림프구) 및 293 (인간 신장)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 일반적으로, 상업적 서비스, 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션 (American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 이용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한, 세균 또는 효모와 같은 비-포유동물 세포 또는 식물 세포에서 발현될 수도 있다. 이에 관해서, 세균과 같은 다양한 단세포성 비-포유동물 미생물, 즉 배양 또는 발효 시에 성장할 수 있는 것도 또한, 형질전환될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 형질전환이 가능한 세균에는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 살모넬라 (Salmonella)의 균주와 같은 엔테로박테리아세 (enterobacteri-aceae); 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실라세 (Bacillaceae); 뉴모코커스 (Pneumococcus); 스트렙토코커스 (Streptococcus), 및 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)의 구성원이 포함된다. 또한, 세균 내에서 발현되는 경우에, 폴리펩타이드는 일반적으로 봉입체 (inclusion bodies)의 일부가 되는 것으로 이해될 수 있다. 폴리펩타이드는 분리하고, 정제한 다음에 기능적 분자로 조립되어야 한다.
원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물이 사용될 수도 있다. 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 빵 효모 (baker's yeast)가 진핵성 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용되지만, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)를 포함하는 다른 균주의 구성원들도 통상적으로 이용될 수 있다. 사카로마이세스 내에서의 발현을 위해서는, 예를 들어, 플라스미드 YRp7 [Stinchcomb et al., (1979), Nature, 282:39; Kingsman et al., (1979), Gene, 7:141; Tschemper et al., (1980), Gene, 10:157]이 통상적으로 사용된다. 이 플라스미드는 이미, 트립토판 중에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 함유하며, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1이다 [Jones, (1977), Genetics, 85:12]. 그래서, 효모 숙주 세포 지놈의 특징으로서 trpl 병소의 존재는 트립토판 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
시험관내 생산은 본 발명의 원하는 변형된 결합 폴리펩타이드를 대량으로 제 공하도록 증대시키는 것을 허용한다. 조직 배양조건 하에서 포유동물 세포를 배양하기 위한 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 공기리프트 (airlift) 반응기 또는 연속 교반 반응기 내에서의 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어, 중공 섬유, 마이크로캅셀 내에서, 아가로즈 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정화 또는 포착 세포 배양을 포함한다. 필요하고/하거나 원하는 경우에, 폴리펩타이드의 용액은 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), DEAE-셀룰로즈 상에서의 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "종양-연관된 항원"은 일반적으로 종양 세포와 연관된, 즉 정상 세포와 비교하여 동일하거나 다소 더 큰 정도로 나타나는 모든 항원을 의미한다. 더욱 일반적으로, 종양 연관된 항원은 그의 비-악성 세포 상에서의 발현과는 무관하게 신생물 세포에서 면역반응성 항체의 국재화를 허용하는 모든 항원을 포함한다. 이러한 항원은 비교적 종양 특이성일 수 있으며, 그들의 발현에서 악성 세포의 표면으로 제한될 수 있다. 대신으로, 이러한 항원은 악성 및 비-악성 세포 둘 다 위에서 발견될 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 종양-연관된 항원에 결합한다. 따라서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 종양 연관된 분자와 반응하는 다수의 항체 중의 어느 하나로부터 유도되거나, 생성되거나, 제작될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "악성"은 비-양성 종양 또는 암을 의 미한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "암"은 규제완화되거나 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 악성 종양을 포함한다. 암의 예로는 다음이 포함된다: 암종, 육종, 백혈병, 및 림프종. 용어 "암"은 원발성 악성 종양 (예를 들어, 그의 세포가 대상체의 신체에서 원래의 종양 부위가 아닌 부위로 이동하지 않은 것) 및 이차성 악성 종양 (예를 들어, 전이로 인하여 발생한 것, 원래 종양의 위치와는 다른 이차 위치로 종양 세포의 이동)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 문구 "결합 폴리펩타이드의 투여가 유익할 수 있는 대상체"에는 예를 들어, 본 발명의 결합 폴리펩타이드에 의해서 인식되는 항원의 검출을 위해서 (예를 들어, 진단적 절차를 위해서) 사용된 결합 폴리펩타이드의 투여 및/또는 결합 폴리펩타이드에 의해서 인식되는 표적을 감소 또는 제거하기 위한 결합 폴리펩타이드에 의한 치료가 유익할 수 있는, 포유동물 대상체와 같은 대상체가 포함된다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 대상체는 순환 또는 혈청으로부터 가용성 또는 미립자 분자 (예를 들어, 독소 또는 병원체)를 감소 또는 제거하거나, 또는 표적을 발현하는 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 집단을 감소 또는 제거하는 것이 유익할 수 있다. 상기 거론한 바와 같이, 결합 폴리펩타이드는 비컨쥬게이트된 형태로 사용될 수 있거나, 예를 들어, 약물, 프로드럭 또는 동위원소에 컨쥬게이트되어 상기 대상체에게 투여하기 위한 변형된 결합 폴리펩타이드를 형성시킬 수 있다.
II. 단일-쇄 Fc ("scFc") 부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드
특정의 관점에서, 본 발명은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 적어도 하나의 유전 적으로 융합된 Fc 부분 또는 그의 일부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드 (즉, 단일-쇄 Fc (scFc) 부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드)를 제공한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩타이드는 동일한 선형 폴리펩타이드 쇄 내에 적어도 2 개의 Fc 부위 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 개, 또는 그 이상의 Fc 부위) 또는 Fc 부위를 포함한다. 바람직하게는, Fc 부위 중의 적어도 2개 (더욱 바람직하게는 모두)가 폴딩되어 (예를 들어, 분자내 또는 분자간에서 폴딩되어) 폴리펩타이드에 효과기 기능을 부여하는 적어도 하나의 기능적 scFc 부분을 형성할 수 있다. 예를 들어, 하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 면역 효과기 기능 (예를 들어, 항체 의존적 세포독성 (ADCC), 식균작용, 또는 보체 의존적 세포독성 (CDCC))을 유발시키기 위해서 그의 scFc 부분을 통해서 Fc 수용체 (예를 들어, FcRn, FcγR 수용체 (예를 들어, FcγRIII), 또는 보체 단백질 (예를 들어, C1q))에 결합할 수 있다.
특정의 구체예에서, 유전적으로 융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 적어도 2 개의 Fc 부위는 제1 Fc 부위의 C-말단과 제2 Fc 부위의 N-말단 사이에 끼어있는 아미노산 또는 펩타이드가 없도록 아미노산의 인접한 선형 서열에서 서로에 대해 직접적으로 융합된다. 그러나, 더욱 바람직한 구체예에서, 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 적어도 2 개의 Fc 부위 (더욱 바람직하게는 모두)는 적어도 2 개의 Fc 부위 사이에 개재된 폴리펩타이드 링커 (예를 들어, 합성 링커)를 통해서 유전적으로 융합된다. 폴리펩타이드 링커는, scFc 부분이 Fc 수용체에 적합한 친화성으로 결합함으로써 효과기 기능을 유발할 수 있도록 적어도 2 개의 Fc 부위 의 최적 폴딩, 정렬 및/또는 병렬 배치를 보장한다. 예를 들어, 특정의 구체예에서 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)은 분자내에서 폴딩될 수 있는 반면에 (참조: 예를 들어, 도 1에서의 단량체 ("sc") scFc 구조물), 다른 구체예에서 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)은 이량체 scFc 구조물을 형성할 수 있다. 특정의 구체예에서, 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)은 적어도 10-7 M (예를 들어, 적어도 10-8 M, 적어도 10-9 M, 적어도 10-10 M, 적어도 10-11 M, 또는 적어도 10-12 M)의 결합 친화성으로 Fc 수용체에 결합할 수 있다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 동일하거나 실질적으로 동일한 서열 조성의 Fc 부위를 포함하는 scFc 부분 (여기에서는 "동종 scFc 부분"이라 칭함)을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 상이한 서열 조성의 적어도 2 개의 Fc 부위를 포함하는 scFc 부분 (즉, 여기에서는 "이종 scFc 부분"이라 칭함)을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 삽입 또는 아미노산 치환을 포함하는 scFc 부분을 포함한다. 하나의 예시적 구체예에서, 이종 scFc 부분은 제1 Fc 부위에서 아미노산 치환 (예를 들어, EU 위치 297에서 아스파라긴의 아미노산 치환)을 포함하지만, 제2 Fc 부위에서는 그렇지 않다.
특정의 구체예에서, scFc 부분은 헤미-글리코실화된다. 예를 들어, 이종 scFc 부분은 제1 글리코실화된 Fc 부위 (예를 들어, 글리코실화된 CH2 부분) 및 제2 비글리코실화된 Fc 부위 (예를 들어, 비글리코실화된 CH2 부분)를 포함할 수 있 으며, 여기에서 링커는 글리코실화된 부위와 비글리코실화된 Fc 부위 사이에 개재된다. 다른 구체예에서, scFc 부분은 완전히 글리코실화되는데, 즉 모든 Fc 부위가 글리코실화된다. 또한, 추가의 구체예에서 scFc 부분은 비글리코실화되는데, 즉 Fc 부위 중의 어떤 것도 글리코실화되지 않는다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 함께, 또는 다른 폴리펩타이드와 조립되어 다량체 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 (또한, 여기에서는 "다량체"라 칭함)을 형성할 수 있다. 본 발명의 다량체 결합 폴리펩타이드 또는 단백질은 본 발명의 적어도 하나의 결합 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 본 발명은 제한이 없이, 단량체뿐만 아니라 다량체 (예를 들어, 이량체, 트라이머성, 테트라머성, 및 헥사머성) 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 등에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 상기 다량체의 구성성분 결합 폴리펩타이드는 동일하다 (즉, 동종 다량체, 예를 들어, 호모이량체, 호모트라이머, 호모테트라머). 다른 구체예에서, 본 발명의 다량체 단백질의 적어도 2 개의 구성성분 폴리펩타이드는 상이하다 (즉, 이종 다량체, 예를 들어, 헤테로이량체, 헤테로트라이머, 헤테로테트라머).
특정의 구체예에서, 본 발명의 적어도 2 개의 결합 폴리펩타이드는 이량체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 특정의 구체예에서, 결합 폴리펩타이드의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)은 그의 구성성분 Fc 부위가 서로 회합하지 않고, 또 다른 결합 폴리펩타이드 내의 상응하는 Fc 부위와 회합하도록 폴딩되지 않은 채로 남는다 (참조: 예를 들어, 도 1B에서의 이량체 ("dc") scFc 구조물).
대체 디자인의 다양한 결합 폴리펩타이드도 또한, 본 발명의 범주 내에 포함 된다. 예를 들어, 하나 이상의 결합 부위가 다중 배향으로 본 발명의 scFc 부분에 융합하거나, 그와 연결되거나, 또는 그 안에 혼입될 수 있다 (그 위에 베니어링될 수 있다). 도 11은 이러한 scFc 결합 폴리펩타이드의 다양한 비-제한적 예를 도시한다. 하나의 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 scFc 부분의 N-말단에 융합된 결합 부위를 포함한다 (도 11A). 또 다른 예시적 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 scFc 부분의 C-말단에 결합 부위를 포함한다 (도 11B). 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 scFc 부분의 C-말단 및 N-말단 둘 다에 결합 부위를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 scFc 부분의 N-말단 및/또는 C-말단 영역간 부분 (예를 들어, 제1, N-말단 Fc 부위 (도 11C) 또는 제2, C-말단 Fc 부위 (도 11D)의 CH2 및 CH3 영역 사이)에서 결합 부위를 포함할 수 있다. 대신으로, 결합 부위는 Fc 부위의 힌지와 CH2 영역 사이의 영역간 부분 내에 혼입될 수 있다. 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 scFc 부분의 링커 폴리펩타이드 내에 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다 (도 11E).
또한, 추가의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 scFc 부분의 Fc 부위에 도입된 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 결합 부위는 N-말단 CH2 영역 (도 1F), N-말단 CH3 영역 (도 1G), C-말단 CH2 영역 (도 1H), 및/또는 C-말단 CH3 영역 (도 1I) 내에 베니어링될 수 있다. 하나의 구체예에서, 항체의 CDR 루프는 CH3 영역 scFc 부분 하나 또는 둘 다 내에 베니어링될 수 있다. CDR 루프 및 그 밖의 다른 결합 부위를 Fc 부분의 CH2 및/또는 CH3 영역 내에 베니어링하는 방법은 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 국제 PCT 공개 제 WO 08/003116 호에 기술 되어 있다.
본 발명의 scFc 결합 폴리펩타이드가 도 11A-I에 도시된 배향의 어떤 조합이라도 사용하여 본 발명의 scFc 부분 내에 연결, 융합 또는 통합 (예를 들어, 베니어링)된 2개 이상의 결합 부위 (예를 들어, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 결합 부위)를 포함할 수 있음은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인지된다.
A. Fc 부위
본 발명의 결합 폴리펩타이드를 생성시키는데 유용한 Fc 부위는 다수의 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 결합 폴리펩타이드의 Fc 부위는 인간 면역글로불린으로부터 유도된다. 그러나, Fc 부위는 예를 들어, 설치류 (예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그) 또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 침팬지, 마카크) 종과 같은 또 다른 포유동물 종의 면역글로불린으로부터 유도될 수도 있는 것으로 이해된다. 더구나, 결합 폴리펩타이드 Fc 영역 또는 그의 일부분은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함한 모든 면역글로불린 부류, 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 모든 면역글로불린 이소타입으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서는, 인간 이소타입 IgG1이 사용된다.
다양한 Fc 부위 유전자 서열 (예를 들어, 인간 불변 부분 유전자 서열)은 공적으로 입수할 수 있는 기탁물의 형태로 이용할 수 있다. Fc 부위 서열을 포함하는 불변 부분 영역은 특정한 효과기 기능을 갖거나 (또는 특정한 효과기 기능이 결여되거나), 면역원성을 감소시키기 위해서 특정한 변형이 있도록 선택될 수 있다. 항체 및 항체-코드화 유전자의 다수의 서열은 공개되어 있으며, 적합한 Fc 부위 서 열 (예를 들어, 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열, 또는 그의 일부분)은 본 기술분야에서 인지되는 기술을 사용하여 이들 서열로부터 유도될 수 있다. 그 후, 전술한 방법 중의 어떤 것이라도 사용하여 수득된 유전자 물질을 변화시키거나 합성하여 본 발명의 폴리펩타이드를 수득할 수 있다. 추가로, 본 발명의 범위는 불변 부분 DNA 서열의 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포함하는 것으로 이해될 수 있을 것이다.
Fc 부위 서열은 예를 들어, 폴리머라제 연쇄반응 및 원하는 영역을 증폭시키기 위해서 선택된 프라이머 (primers)를 사용하여 클로닝될 수 있다. 항체로부터 Fc 부위 서열을 클로닝하기 위해서, mRNA를 하이브리도마, 비장 또는 림프 세포로부터 분리하고, DNA로 역전사하고, 항체 유전자를 PCR에 의해서 증폭시킬 수 있다. PCR 증폭방법은 미국 특허 제4,683,195호; 4,683,202호; 4,800,159호; 4,965,188호; 및 문헌 [예를 들어, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270]에 상세히 기술되어 있다. PCR은 공통 (consensus) 불변 부분 프라이머에 의해서, 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열을 기초로 한 더 특이적인 프라이머에 의해서 개시될 수 있다. 상기 거론한 바와 같이, PCR은 항체 경쇄 및 중쇄를 코드화한 DNA 클론을 분리하기 위해서 사용될 수도 있다. 이 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머, 또는 마우스 불변 부분 프로브 (probes)와 같은 더 큰 상동성 프로브에 의해서 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 다수의 프라이머 셋트는 본 기술분야에 서 공지되어 있다 (예를 들어, 정제된 항체의 N-말단 서열 상의 5' 프라이머 [Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509]; cDNA 말단의 빠른 증폭 [Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33]; 항체 리더 서열 [Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250]). 항체 서열의 클로닝은 추가로 본 명세서에 참고로 포함된 뉴만 (Newman) 등의 미국 특허 제5,658,570호 (1995년 1월 25일 출원됨)에 기술되어 있다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 2개 이상의 Fc 부위 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 Fc 부위)를 포함할 수 있다. 이들 2개 이상의 Fc 부위는 Fc 부분을 형성할 수 있다. 하나의 구체예에서, Fc 부위는 상이한 형태의 것일 수 있다. 하나의 구체예에서, 결합 폴리펩타이드 내에 존재하는 적어도 하나의 Fc 부위는 힌지 영역 또는 그의 일부분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 CH2 영역 또는 그의 일부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 CH3 영역 또는 그의 일부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 CH4 영역 또는 그의 일부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 힌지 영역 또는 그의 일부분 및 적어도 하나의 CH2 영역 또는 그의 일부분을 포함하는 (예를 들어, 힌지-CH2 배향으로) 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 CH2 영역 또는 그의 일부 분 및 적어도 하나의 CH3 영역 또는 그의 일부분을 포함하는 (예를 들어, CH2-CH3 배향으로) 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 힌지 영역 또는 그의 일부분, 적어도 하나의 CH2 영역 또는 그의 일부분, 및 적어도 하나의 CH3 영역 또는 그의 일부분을, 예를 들어, 힌지-CH2-CH3, 힌지-CH3-CH2, 또는 CH2-CH3-힌지 배향으로 포함하는 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다.
특정의 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 (예를 들어, 힌지, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역, 그러나 이들은 동일한 항체로부터 유도될 필요는 없다)로부터 유도된 적어도 하나의 완전한 Fc 부분을 포함한다. 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄로부터 유도된 적어도 2 개의 완전한 Fc 부분을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 완전한 Fc 부위는 인간 IgG 면역글로불린 중쇄 (예를 들어, 인간 IgG1)로부터 유도된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 완전한 CH3 영역 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 부분의 대략 아미노산 341-438)을 포함하는 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 완전한 CH2 영역 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 부분의 대략 아미노산 231-340)을 포함하는 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 CH3 영역, 및 힌지 부분 (EU 넘버링에 따라 항체 Fc 부분의 대략 아미노산 216-230) 및 CH2 영역 중의 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 Fc 부 위를 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 힌지 및 CH3 영역을 포함하는 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 힌지, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는 적어도 하나의 Fc 부위를 포함한다. 바람직한 구체예에서, Fc 부위는 인간 IgG 면역글로불린 중쇄 (예를 들어, 인간 IgG1)로부터 유도된다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드의 Fc 부위를 구성하는 불변 부분 영역 또는 그의 일부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 IgG1 분자로부터 유도된 CH2 영역 또는 그의 일부분, 및 IgG3 분자로부터 유도된 CH3 부분 또는 그의 일부분을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 결합 폴리펩타이드는 부분적으로 IgG1 분자로부터, 및 부분적으로 IgG3 분자로부터 유도된 힌지 영역을 포함하는 Fc 부위를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이, Fc 부위가 이것이 아미노산 서열에서 천연적으로 존재하는 항체 분자와는 다르도록 변화될 수 있음은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 이해될 수 있을 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는, 그럼에도 불구하고 Fc 부분에 Fc 수용체 (FcR) 결합 특성을 부여하기에 충분한 하나 이상의 절단된 Fc 부위를 포함하는 scFc 부분을 포함한다. 예를 들어, FcRn에 결합하는 Fc 영역의 부분 (즉, FcRn 결합 부분)은 EU 넘버링으로 IgG1의 대략 아미노산 282-438을 포함한다. 따라서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 Fc 부위는 FcRn 결합 부분을 포함하 거나, 이 부분으로 구성될 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 모든 이소타입의 중쇄로부터 유도될 수 있다. 하나의 구체예에서는, 인간 이소타입 IgG1의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다. 또 다른 구체예에서는, 인간 이소타입 IgG4의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 완전한 Fc 부분의 하나 이상의 불변 부분 영역을 결여하며, 즉 이들은 부분적으로 또는 완전히 결실된다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 전체 CH2 영역을 결여할 수 있다 (△CH2 구조물). 본 기술분야에서 숙련된 전문가는, 이러한 구조물이 항체의 이화율에 대한 CH2 영역의 조절특성으로 인하여 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 IgG1 인간 불변 부분 영역을 코드화한 벡터 (예를 들어, IDEC Pharmaceuticals, San Diego로부터)로부터 유도된 CH2 영역-결실된 Fc 부분을 포함한다 [참조: 예를 들어, WO 02/060955A2 및 WO02/096948A2]. 이러한 예시적 벡터는 CH2 영역을 결실하고, 영역-결실된 IgG1 불변 부분을 발현하는 합성 벡터를 제공하도록 조작된다. 이들 예시적 구조물은 바람직하게는, 결합 CH3 영역이 각각의 Fc 영역의 힌지 부분에 직접 융합하도록 조작된다는 것을 주목하여야 할 것이다.
다른 구조물에서는, 하나 이상의 구성성분 Fc 부위 사이에 펩타이드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 스페이서는 힌지 부분과 CH2 영역 사이 및/또는 CH2 및 CH3 영역 사이에 배치될 수 있다. 예를 들어, CH2 영역이 결실되고, 나머지 CH3 영역 (합성 또는 비합성)은 5-20개의 아미노산 펩타이드 스페이서를 두고 힌지 부분에 결합된 상화성 구조물이 발현될 수 있다. 이러한 펩타이드 스페이서를 첨가하여 예를 들어, 불변 부분 영역이 여전히 자유롭고 접근하기 쉽거나, 힌지 부분이 여전히 유연성이 있도록 보장할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명과 상화성인 어떤 링커 펩타이드라도 비교적 비-면역원성이며, scFc 부분의 적절한 폴딩을 방지하지 않을 것이다.
i) Fc 아미노산에 대한 변화
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드에서 사용된 Fc 부위는 예를 들어, 아미노산 돌연변이 (예를 들어, 첨가, 결실 또는 치환)에 의해서 변화된다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "Fc 부위 변이체"는 Fc 부위가 유도된 야생형 Fc 형태에 비해서 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 Fc 부위를 의미한다. 예를 들어, Fc 부위가 인간 IgG1 항체로부터 유도된 경우에, 변이체는 인간 IgG1 Fc 부분의 상응하는 위치에서 야생형 아미노산에 비해 적어도 하나의 아미노산 돌연변이 (예를 들어, 치환)를 포함한다.
Fc 변이체의 아미노산 치환(들)은, 항체 내의 Fc 부분 내에서 해당 잔기가 제공된 위치 번호에 상응하는 것으로 지칭되는 Fc 부위 내의 위치에 존재할 수 있다 (EU 넘버링 협약을 사용하여 설명됨). 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 어떤 EU 번호가 Fc 부위 내의 위치에 상응할 수 있는지를 결정하기 위한 정렬을 쉽게 만들 수 있다.
하나의 구체예에서, Fc 변이체는 힌지 영역 또는 그의 일부분에 위치하는 아 미노산 위치에 치환을 포함한다. 또 다른 구체예에서, Fc 변이체는 CH2 영역 또는 그의 일부분에 위치하는 아미노산 위치에 치환을 포함한다. 또 다른 구체예에서, Fc 변이체는 CH3 영역 또는 그의 일부분에 위치하는 아미노산 위치에 치환을 포함한다. 또 다른 구체예에서, Fc 변이체는 CH4 영역 또는 그의 일부분에 위치하는 아미노산 위치에 치환을 포함한다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함한다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 적어도 1 개의 아미노산 위치 또는 그 이상, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 아미노산 위치 또는 그 이상의 간격을 두고 서로 공간적으로 배치된다. 더욱 바람직하게는, 조작된 아미노산은 적어도 5, 10, 15, 20, 또는 25 개의 아미노산 위치 또는 그 이상의 간격을 두고 서로 떨어져서 공간적으로 배치된다.
특정의 구체예에서, Fc 변이체는 상기의 야생형 Fc 영역을 포함하는 Fc 부분에 의해서 부여된 적어도 하나의 효과기 기능에 있어서의 개선 (예를 들어, Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질 (예를 들어, C1q)에 결합하거나, 항체 의존적 세포독성 (ADCC), 식균작용 또는 보체 의존적 세포독성 (CDCC)을 유발하는 Fc 부분의 능력에 있어서의 개선)을 제공한다. 다른 구체예에서, Fc 변이체는 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 효과기 기능 및/또는 FcR 결합에 있어서의 개선을 부여하는 것으로 알려진 본 기술분야에서 인지된 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어, 각각이 본 명세서에 참고로 포함된 국제 PCT 공개 제WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, 및 WO06/085967A2호; 미국 특허공보 제US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056호; 또는 US 특허 제5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 및 7,317,091호에 기술된 아미노산 위치 중의 하나 이상에서의 변화 (예를 들어, 치환)를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 특정의 변화 (예를 들어, 본 기술분야에 기술된 하나 이상의 아미노산의 특정한 치환)는 기술된 아미노산 위치 중의 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 기술된 아미노산 위치 중의 하나 이상에서의 다양한 변화 (예를 들어, 본 기술분야에 기술된 하나 이상의 아미노산 위치의 다양한 치환)가 이루어질 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 Fc 부위의 "15 옹스트 롬 접촉 구역 (15 Angstrom Contact Zone)" 내에 있는, EU 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 위치를 포함하는 Fc 부위 변이체를 포함할 수 있다. 15 옹스트롬 구역에는 전체-길이 야생형 Fc 부위의 EU 위치 243 내지 261, 275 내지 280, 282-293, 302 내지 319, 336 내지 348, 367, 369, 372 내지 389, 391, 393, 408, 및 424-440에 위치하는 잔기가 포함된다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 항체의 항원-독립적 효과기 기능, 특히 항체의 순환 반감기를 변화시키는, Fc 부위에 대한 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 결합 폴리펩타이드는 이들 치환이 없는 결합 폴리펩타이드에 비해서 FcRn에 대해 증가하거나 감소된 결합을 나타내며, 따라서 혈청 내에서 각각 증가하거나 감소된 반감기를 갖는다. FcRn에 대한 개선된 친화성을 갖는 Fc 변이체는 더 긴 혈청 반감기를 갖는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 투여된 폴리펩타이드의 긴 반감기가 예를 들어, 만성 질병 또는 장애를 치료하기 위해서 바람직한 경우에 포유동물을 치료하는 방법에서 유용한 적합성을 갖는다. 이에 반해서, 감소된 FcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 더 짧은 반감기를 갖는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 또한 예를 들어, 단축된 순환시간이 유리할 수 있는 경우에, 예를 들어, 생체내 진단적 영상화를 위해서, 또는 출발 폴리펩타이드가 장기간 동안 순환계 중에 존재할 때에 독성 부작용을 갖는 경우에 포유동물에게 투여하는데 유용하다. 감소된 FcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 태반을 덜 횡단할 것 같으며, 따라서 임신한 여성에게서 질병 또는 장애를 치료하는데 유용하다. 또한, 감소된 FcRn 결합 친화성이 바람직할 수 있는 그 밖의 다른 적용으로는 뇌, 신장 및/ 또는 간에서의 국재화를 원하는 적용이 포함된다. 하나의 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 맥관구조로부터 신사구체의 상피를 가로질러서 감소된 수송을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 혈액 뇌장벽 (blood brain barrier; BBB)을 가로지르는 뇌로부터 혈관 공간 내로의 감소된 수송을 나타낸다. 하나의 구체예에서, 변화된 FcRn 결합을 갖는 결합 폴리펩타이드는 Fc 부위의 "FcRn 결합 루프" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 부위 (예를 들어, 1 또는 2 개의 Fc 부위)를 포함한다. FcRn 결합 루프는 야생형, 전체-길이 Fc 부위의 아미노산 잔기 280-299 (EU 넘버링에 따름)로 이루어진다. 다른 구체예에서, 변화된 FcRn 결합 친화성을 갖는 본 발명의 결합 친화성은 15 Å FcRn "접촉 구역" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 부위 (예를 들어, 1 또는 2 개의 Fc 부위)를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 15 Å FcRn "접촉 구역"은 야생형, 전체-길이 Fc 부위의 다음 위치에서의 잔기를 포함한다: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336-348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (EU 넘버링). 바람직한 구체예에서, 변화된 FcRn 결합 친화성을 갖는 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다음의 EU 위치 중의 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 부위 (예를 들어, 1 또는 2 개의 Fc 부위)를 포함한다: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (예를 들어, N434A 또는 N434K), 및 438. FcRn 결합 활성을 변화시키는 아미노산 치환의 예는 본 명세서에 참고로 포함된 국제 PCT 공개 제WO05/047327호에 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 예를 들어, 야생형 Fc 부분에 비해서 폴리펩타이드의 항체 의존적 효과기 기능, 특히 ADCC 또는 보체 활성화를 변화시킨 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함한다. 예시적 구체예에서, 상기 결합 폴리펩타이드는 Fc 감마 수용체 (예를 들어, CD16)에 대하여 변화된 결합을 나타낸다. 이러한 결합 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드와 비교하는 경우에, FcR 감마에 대하여 증가하거나 감소된 결합을 나타내며, 따라서 각각 증진되거나 감소된 효과기 기능을 매개한다. FcγRs에 대한 개선된 친화성을 갖는 Fc 변이체는 효과기 기능을 증진시키는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 표적 분자 파괴를 원하는 포유동물을 치료하는 방법에서, 예를 들어, 종양 요법에서 유용한 적용성을 갖는다. 이에 반해서, 감소된 FcγR 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 효과기 기능을 감소시키는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 또한 예를 들어, 표적 세포 파괴가 바람직하지 않은 상태의 치료에, 예를 들어, 정상 세포가 표적 분자를 발현하는 경우, 또는 폴리펩타이드의 만성적 투여가 원치 않는 면역계 활성화를 제공할 수 있는 경우에 유용하다. 하나의 구체예에서, scFc를 포함하는 폴리펩타이드는 야생형 Fc 부분을 포함하는 폴리펩타이드에 비해서 옵소닌작용, 식균작용, 보체 의존적 세포독성, 항원 의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 효과기 세포 변조로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변화된 항원 의존적 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 활성화 FcγR (예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, 또는 FcγRIIIa)에 대해서 변화된 결합을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 억제성 FcγR (예를 들어, FcγRIIb)에 대해서 변화된 결 합 친화성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 증가된 FcγR 결합 친화성 (예를 들어, 증가된 FcγRIIIa 결합 친화성)을 갖는 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다음의 위치 중의 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 부위 (예를 들어, 1 또는 2 개의 Fc 부위)를 포함한다: 239, 268, 298, 332, 334, 및 378 (EU 넘버링). 다른 구체예에서, 감소된 FcγR 결합 친화성 (예를 들어, 감소된 FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIIIa 결합 친화성)을 갖는 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다음의 위치 중의 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 부위 (예를 들어, 1 또는 2 개의 Fc 부위)를 포함한다: 234, 236, 239, 241, 251, 252, 261, 265, 268, 293, 294, 296, 298, 299, 301, 326, 328, 332, 334, 338, 376, 378, 및 435 (EU 넘버링). 다른 구체예에서, 증가된 보체 결합 친화성 (예를 들어, 증가된 C1q 결합 친화성)을 갖는 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다음의 위치 중의 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 부위 (예를 들어, 1 또는 2 개의 Fc 부위)를 포함한다: 251, 334, 378, 및 435 (EU 넘버링). 다른 구체예에서, 감소된 보체 결합 친화성 (예를 들어, 감소된 C1q 결합 친화성)을 갖는 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다음의 위치 중의 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 부위 (예를 들어, 1 또는 2 개의 Fc 부위)를 포함한다: 239, 294, 296, 301, 328, 333, 및 376 (EU 넘버링). FcγR 또는 보체 결합 활성을 변화시킨 아미노산 치환의 예는 본 명세서에 참고로 포함된 국제 PCT 공개 제WO05/063815호에 기술되어 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다음의 특 정한 치환 중의 하나 이상을 포함할 수 있다: S239D, S239E, M252T, H268D, H268E, I332D, I332E, N434A, 및 N434K (즉, 항체 Fc 부분에서 이들 EU 넘버링된 위치 중의 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서의 이들 치환 중의 하나 이상).
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 또한, 결합 폴리펩타이드의 글리코실화를 변화시키는 아미노산 치환을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드의 scFc 부분은 환원된 글리코실화 (예를 들어, N- 또는 O-연결된 글리코실화)를 유도하는 돌연변이를 갖는 Fc 부위를 포함할 수 있거나, 야생형 Fc 부위의 변화된 단백당형 (glycoform) (예를 들어, 낮은 푸코즈 또는 푸코즈-부재 글리칸)을 포함할 수 있다. 예시적 구체예에서, Fc 부위는 아미노산 위치 297 (EU 넘버링)에 통상적으로 존재하는 N-연결된 글리칸의 환원된 글리코실화를 포함한다. 또 다른 예시적 구체예에서, Fc 부위는 아미노산 위치 297 (EU 넘버링)에서 낮은 푸코즈 또는 푸코즈-부재 글리칸을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 글리코실화 모티프 (motif), 예를 들어, 아미노산 서열 NXT 또는 NXS를 함유하는 N-연결된 글리코실화 모티프에 근접하여, 또는 그 모티프 내에 아미노산 치환을 갖는다. 특정한 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 Fc의 299 (EU 넘버링)에 상응하는 아미노산 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 글리코실화를 감소시키거나 변화시키는 아미노산 치환의 예는 본 명세서에 참고로 포함된 국제 PCT 공개 제WO05/018572호 및 미국 특허공보 제2007/0111281호에 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 용매-노출된 표면에 위치하는 조작된 시스테인 잔기 또는 그의 유사체를 갖는 적어도 하나의 Fc 부위를 포 함한다. 바람직하게는, 조작된 시스테인 잔기 또는 그의 유사체는 scFc 부분에 의해서 부여된 효과기 기능을 저해하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 변화는 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질 (예를 들어, C1q)에 결합하거나, 면역 효과기 기능 (예를 들어, 항체 의존적 세포독성 (ADCC), 식균작용 또는 보체 의존적 세포독성 (CDCC))을 유발하는 scFc 부분의 능력을 저해하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 실질적으로 제2 시스테인 잔기와의 디설파이드 결합이 없는 적어도 하나의 조작된 유리 시스테인 잔기 또는 그의 유사체를 포함하는 Fc 부위를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 CH3 영역 내의 다음 위치 중의 하나 이상에서 조작된 시스테인 잔기 또는 그의 유사체를 갖는 Fc 부위를 포함할 수 있다: 349-371, 390, 392, 394-423, 441-446, 및 446b (EU 넘버링). 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다음의 위치 중의 어느 하나에서 조작된 시스테인 잔기 또는 그의 유사체를 갖는 Fc 변이체를 포함한다: 350, 355, 359, 360, 361, 389, 413, 415, 418, 422, 441, 443, 및 EU 위치 446b (EU 넘버링). 상기 조작된 시스테인 잔기 또는 그의 유사체 중의 어떤 것이라도 후속으로, 본 기술분야에서 인지된 기술을 사용하여 기능적 부위에 컨쥬게이트 (예를 들어, 티올-반응성 헤테로이작용성 링커와 컨쥬게이트)될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술된 Fc 부위들로부터 독립적으로 선택된 2개 이상의 그의 구성성분 Fc 부위를 갖는 유전적으로 융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)을 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, Fc 부위는 동일하다. 또 다른 구체예에서, Fc 부위 중의 적어도 2 개는 상이하다. 예를 들어, 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 Fc 부위는 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나, 이들은 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해서 (예를 들어, 약 5 개의 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 아미노산 잔기), 약 10 개의 잔기, 약 15 개의 잔기, 약 20 개의 잔기, 약 30 개의 잔기, 약 40 개의 잔기, 또는 약 50 개의 잔기에 의해서) 길이가 상이할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 Fc 부위는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열이 상이할 수 있다. 예를 들어, Fc 부위 중의 적어도 2 개는 약 5 개의 아미노산 위치 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 아미노산 위치), 약 10 개의 위치, 약 15 개의 위치, 약 20 개의 위치, 약 30 개의 위치, 약 40 개의 위치, 또는 약 50 개의 위치에서 상이할 수 있다.
B. 폴리펩타이드 링커
특정의 관점에서는, 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 scFc 부분의 2개 이상의 Fc 영역 또는 부위를 유전적으로 융합시키기 위하여 폴리펩타이드 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 폴리펩타이드 링커는 본 명세서에서 "Fc 접속 폴리펩타이드"라 칭한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 합성이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 폴리펩타이드 링커에 관한 용어 "합성"은 아미노산의 선형 서열에서 자연에서는 천연적으로 연결되지 않는 서열 (천연적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있다) (예를 들어, Fc 부위 서열)에 연결된 아미노산 서열 (천연적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있다)을 포함하는 펩타이드 (또는 폴리펩타이드) 를 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 링커는 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드의 변형된 형태 (예를 들어, 첨가, 치환 또는 결실과 같은 돌연변이를 포함)이거나, 제1 아미노산 서열 (천연적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있다)을 포함하는, 천연적으로 존재하지 않는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 예를 들어, 유전적으로 융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 Fc 부위 또는 영역이 기능적 scFc 부분의 적절한 폴딩 및 형성을 보장하도록 병렬 배치되는 것을 보장하기 위해서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명과 상화성인 폴리펩타이드 링커는 비교적 비-면역원성이며, 결합 단백질의 단량체 서브유니트 중에서 어떤 비-공유적 회합도 억제하지 않을 것이다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 쇄 내에서 프레임 내의 어떤 2개 이상의 Fc 부위 또는 영역이라도 결합시키기 위해서 폴리펩타이드 링커를 사용한다. 하나의 구체예에서, 2개 이상의 Fc 부위 또는 영역은 상기 항목 A에 언급된 모든 Fc 부위로부터도 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 특정의 구체예에서는 폴리펩타이드 링커를 사용하여 동일한 Fc 부위를 융합시킴으로써 동종 scFc 부분을 형성할 수 있다. 다른 구체예에서는, 폴리펩타이드 링커를 사용하여 상이한 Fc 부위 (예를 들어, 야생형 Fc 부위 및 Fc 부위 변이체)를 융합시킴으로써 이종 scFc 부분을 형성할 수 있다. 다른 구체예에서는, 본 발명의 폴리펩타이드 링커를 사용하여 제1 Fc 부위 (예를 들어, 힌지 영역 또는 그의 일부분, CH2 영역 또는 그의 일부분, 완전한 CH3 영역 또는 그의 일부분, FcRn 결합 부분, FcγR 결합 부분, 보체 결합 부분, 또는 그의 일부분)의 C-말단을 제2 Fc 부위 (예를 들어, 완전한 Fc 영역)의 N-말단에 유전적으로 융합시킬 수 있다.
하나의 구체예에서, 합성 폴리펩타이드 링커는 Fc 부위의 일부분을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서 폴리펩타이드 링커는 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4 항체의 면역글로불린 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4 항체의 CH2 영역을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4 항체의 CH3 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린 (예를 들어, 인간 면역글로불린)의 다른 부분들도 마찬가지로 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 CH1 영역 또는 그의 일부분, CL 영역 또는 그의 일부분, VH 영역 또는 그의 일부분, 또는 VL 영역 또는 그의 일부분을 포함할 수 있다. 상기의 부분들은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4 항체를 포함하는 모든 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다.
예시적인 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 면역글로불린 힌지 부분의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 상부 힌지 영역 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 상부 힌지 영역)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 중간 힌지 영역 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중간 힌지 영역)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 하부 힌지 영역 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하부 힌지 영역)을 포함한다. 예시적인 힌지 영역 부분들은 이하의 표 1에 열거하였다. 또한, 이들 예시적인 힌지의 어떤 서브-부분이라도 사용될 수 있다 (예를 들어, IgG3 중간 부분의 반복 부분 (즉, EPKSCDTPPPCPRCP)).
Figure 112009077057212-PCT00002
다른 구체예에서는, 동일하거나 상이한 항체 이소타입으로부터 유도된 힌지 요소를 결합시킨 폴리펩타이드 링커가 제작될 수 있다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1 힌지 부분의 적어도 일부분 및 IgG2 힌지 부분의 적어도 일부분을 포함하는 키메라 힌지를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1 힌지 부분의 적어도 일부분 및 IgG3 힌지 부분의 적어도 일부분을 포함하는 키메라 힌지를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1 힌지 부분의 적어도 일부분 및 IgG4 힌지 부분의 적어도 일부분을 포함하는 키메라 힌지를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG2 힌지 부분의 적어도 일부분 및 IgG3 힌지 부분의 적어도 일부분을 포함하는 키메라 힌지를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG2 힌지 부분의 적어도 일부분 및 IgG4 힌지 부분의 적어도 일부분을 포함하는 키메라 힌지를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1 힌지 부분의 적어도 일부분, IgG2 힌지 부분의 적어도 일부분, 및 IgG4 힌지 부분의 적어도 일부분을 포함하는 키메라 힌지를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1 상부 및 중간 힌지 및 단일 IgG3 중간 힌지 반복 모티프를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG4 상부 힌지, IgG1 중간 힌지 및 IgG2 하부 힌지를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 gly-ser 링커를 포함하거나, 이것으로 구성된다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "gly-ser 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 구성된 펩타이드를 의미한다. 예시적인 gly/ser 링커는 화학식 (Gly4Ser)n (여기에서, n은 양의 정수 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다)이다)의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 gly/ser 링커는 (Gly4Ser)4이다. 또 다른 바람직한 gly/ser 링커는 (Gly4Ser)3이다. 또 다른 예시적인 gly-ser 링커는 GGGSSGGGSG (SEQ ID NO:24)이다. 특정의 구체예에서, 상기 gly-ser 링커는 폴리펩타이드 링커의 2 개의 다른 서열 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드 링커 서열 중의 어떤 것) 사이에 삽입될 수 있다. 다른 구체예에서, gly-ser 링커는 폴리펩타이드 링커의 또 다른 서열 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드 링커 서열 중의 어떤 것)의 하나의 말단 또는 양 말단에 부착된다. 또 다른 구체예에서, 2개 이상의 gly-ser 링커는 폴리펩타이드 링커 내에 직렬로 혼입된다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 상부 힌지 부분 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유도됨)의 적어도 일부분, 중간 힌지 부분 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유도됨)의 적어도 일부분, 및 일련의 gly/ser 아미노산 잔기 (예를 들어, (Gly4Ser)n과 같은 gly/ser 링커)를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 WO 02/060955에 기술된 것과 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 아미노산 서열 IGKTISKKAK를 포함한다. 또 다른 예시적인 폴리펩타이드 링커는 서열 (G4S)4GGGAS를 포함한다.
특별히 바람직한 폴리펩타이드 링커는 아미노산 서열 SLSLSPGGGGGSEPKSS를 포함한다. 또 다른 바람직한 폴리펩타이드 링커는 인간 IgG1 힌지 서열, 예를 들어, DKTHTCPPCPAPELLGG를 포함한다. 또 다른 바람직한 폴리펩타이드 링커는 두 가지 서열 모두를 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 비-천연적으로 존재하는 면역글로불린 힌지 부분 영역, 예를 들어, 힌지 부분 영역을 포함하는 폴리펩타이드 내에 천연적으로 존재하지 않는 힌지 부분 영역 및/또는 천연적으로 존재하는 면역글로불린 힌지 부분 영역과 아미노산 서열이 다르도록 변화된 힌지 부분 영역을 포함한다. 하나의 구체예에서, 돌연변이가 힌지 부분 영역에 대하여 이루어져 본 발명의 폴리펩타이드 링커가 만들어질 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 천연적으로 존재하는 수의 시스테인을 포함하지 않는 힌지 영역을 포함하는데, 즉 폴리펩타이드 링커는 천연적으로 존재하는 힌지 분자보다 더 적은 수의 시스테인 또는 더 많은 수의 시스테인을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 아미노산 위치 230 (EU 넘버링 시스템)에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린 잔기를 포함하는 힌지 부분 영역을 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 위치 231 (EU 넘버링 시스템)에 상응하는 아미노산 위치에 알라닌 잔기를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 위치 232 (EU 넘버링 시스템)에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린 잔기를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 위치 226 (EU 넘버링 시스템)에 상응하는 아미노산 위치에 시스테인 잔기를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 위치 226 (EU 넘버링 시스템)에 상응하는 위치에 세린 잔기를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 위치 229 (EU 넘버링 시스템)에 상응하는 아미노산 위치에 시스테인 잔기를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 위치 229 (EU 넘버링 시스템)에 상응하는 아미노산 위치에 세린 잔기를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 생물학적으로 적절한 펩타이드 서열 또는 그의 서열 일부분을 포함한다. 예를 들어, 생물학적으로 적절한 펩타이드 서열에는 항-거부반응 또는 항-염증성 펩타이드로부터 유도된 서열이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 상기의 항-거부반응 또는 항-염증성 펩타이드는 사이토킨 억제성 펩타이드, 세포 유착 억제성 펩타이드, 트롬빈 억제성 펩타이드 및 혈소판 억제성 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 IL-1 억제성 또는 길항제 펩타이드 서열, 에리트로포이에틴 (EPO)-모사성 펩타이드 서열, 트롬보포이에틴 (TPO)-모사성 펩타이드 서열, G-CSF 모사성 펩타이드 서열, TNF-길항제 펩타이드 서열, 인테그린-결합 펩타이드 서열, 셀렉틴 길항제 펩타이드 서열, 항-병원체성 펩타이드 서열, 혈관작용성 장 펩타이드 (VIP) 모사성 펩타이드 서열, 칼모듈린 길항제 펩타이드 서열, 비만세포 길항제, SH3 길항제 펩타이드 서열, 유로키나제 수용체 (UKR) 길항제 펩타이드 서열, 소마토스타틴 또는 코르티스타틴 모사성 펩타이드 서열, 및 대식세포 및/또는 T-세포 억제성 펩타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드 서열을 포함한다. 예시적인 펩타이드 서열 (이들 중의 어느 하나라도 폴리펩타이드 링커로서 사용될 수 있다)은 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,660,843호에 기술되었다.
다른 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 하나 이상의 이하에 기술된 결합 부위 중의 어느 하나 (예를 들어, Fab, scFv 분자, 리간드의 수용체 결합 부분, 수용체의 리간드 결합 부분 등)를 포함한다.
이들 예시적인 폴리펩타이드 링커의 변이체 형태는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 폴리펩타이드 링커에 도입되도록 폴리펩타이드 링커를 코드화한 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 도입시킴으로써 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술에 의해서 도입될 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해서 대체된 것이다. 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소로이신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 집단은 본 기술분야에서 정의되어 있다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드 내의 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는, 동일한 측쇄 집단으로부터 유래하는 또 다른 아미노산 잔기에 의해서 대체된다. 또 다른 구체예에서, 아미노산의 단선은 측쇄 집단 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 단선에 의해서 대체될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 링커는 길이가 적어도 하나의 아미노산이고, 다양한 길이의 것일 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 길이가 약 1 내지 약 50개의 아미노산이다. 이와 관련하여 사용된 것으로서, 용어 "약"은 +/- 2 아미노산 잔기를 나타낸다. 링커 길이는 반드시 양의 정수이기 때문에, 길이가 약 1 내지 약 50개의 아미노산이란 길이는 길이가 1 내지 48-52 아미노산인 길이를 의미한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 길이가 약 10-20개의 아미노산이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 길이가 약 15 내지 약 50개의 아미노산이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 길이가 약 20 내지 약 45 아미노산이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 길이가 약 15 내지 약 25 아미노산이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 링커는 길이가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 또는 60개의 아미노산이다.
폴리펩타이드 링커는 본 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 폴리펩타이드 링커 내에 도입될 수 있다. 변형은 DNA 서열 분석에 의해서 확인될 수 있디. 플라스미드 DNA를 사용하여 생산될 폴리펩타이드의 안정적인 생산을 위한 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다.
C. 표적 결합 부위
특정의 관점에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 표적 결합 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 일반적으로, 적어도 하나의 결합 부위 및 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)을 포함한다.
하나의 구체예에서, 결합 부위는 유전적으로-융합된 Fc 부분의 N-말단에 작동적으로 연결된다 (예를 들어, 화학적으로 컨쥬게이트되거나 유전적으로 융합된다 (예를 들어, 직접적으로 또는 폴리펩타이드 링커를 통해서)). 또 다른 구체예에서, 결합 부위는 유전적으로-융합된 Fc 부분의 C-말단에 작동적으로 연결된다 (예를 들어, 화학적으로 컨쥬게이트되거나 유전적으로 융합된다 (예를 들어, 직접적으로 또는 폴리펩타이드 링커를 통해서)). 다른 구체예에서, 결합 부위는 유전적으로-융합된 Fc 부분의 아미노산 측쇄를 통해서 작동적으로 연결된다 (예를 들어, 화학적으로 컨쥬게이트되거나 유전적으로 융합된다 (예를 들어, 직접적으로 또는 폴리펩타이드 링커를 통해서)). 특정의 예시적 구체예에서, 결합 부위는 인간 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 일부분 (예를 들어, 인간 IgG1 서열, 예를 들어, DKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 81))을 통해서 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)에 융합된다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 2 개의 결합 부위 및 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 부위는 단일의 유전적으로-융합된 Fc 부분의 N-말단 및 C-말단 둘 다에 작동적으로 연결될 수 있다. 다른 예시적 구체예에서, 결합 부위는 함께 일렬로 연결되어 유전적으로-융합된 Fc 부분의 탠덤 어레이 (tandem array)를 형성하는 다수의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 scFc 부분)의 N- 및 C-말단 둘 다에 작동적으로 연결될 수 있다.
다른 구체예에서, 2개 이상의 결합 부위는 서로 (예를 들어, 폴리펩타이드 링커를 통해서) 일렬로 연결되고, 결합 부위의 탠덤 어레이는 단일의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, 단일 scFc 부분) 또는 유전적으로-융합된 Fc 부분의 탠덤 어레이 (즉, 탠덤 scGc 부분)의 C-말단 또는 N-말단에 작동적으로 연결된다 (예를 들어, 화학적으로 컨쥬게이트되거나 유전적으로 융합된다 (예를 들어, 직접적으로 또는 폴리펩타이드 링커를 통해서)). 다른 구체예에서, 결합 부위의 탠덤 어레이는 단일의 유전적으로-융합된 Fc 부분 또는 유전적으로-융합된 Fc 부분의 탠덤 어레이의 C-말단 및 N-말단 둘 다에 작동적으로 연결된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 3 개의 결합 부위를 포함하는 3가 결합 폴리펩타이드이다. 본 발명의 예시적인 3가 결합 폴리펩타이드는 이중특이성이거나 삼중특이성이다. 예를 들어, 3가 결합 폴리펩타이드는 하나의 특이성에 대해서 2가이고 (즉, 2 개의 결합 부위를 갖고), 제2 특이성에 대해서 1가일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 4 개의 결합 부위를 포함하는 4가 결합 폴리펩타이드이다. 본 발명의 예시적인 4가 결합 폴리펩타이드는 이중특이성이다. 예를 들어, 4가 결합 폴리펩타이드는 각각의 특이성에 대해서 2가일 수 있다 (즉, 2 개의 결합 부위를 갖는다).
상기 언급한 바와 같이, 다른 구체예에서 하나 이상의 결합 부위는 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 2 개의 Fc 부위 사이에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 결합 부위는 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 링커 중의 일부 또는 전부를 형성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 결합 폴리펩타이드는 항원 결합 부위 (예를 들어, 항체, 항체 변이체 또는 항체 단편의 항원 결합 부위), 리간드의 수용체 결합 부분, 또는 수용체의 리간드 결합 부분 중의 적어도 하나를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 상기 언급된 생물학적으로-적절한 펩타이드 중의 어느 하나를 포함하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 생물학적 효과를 매개하는 표적 분자에 대해서 특이적인 적어도 하나의 결합 부위를 갖는다. 하나의 구체예에서, 결합 부위는 세포성 활성화 또는 억제를 변조시킨다 (예를 들어, 세포 표면 수용체에 결합시키고, 활성화 또는 억제성 시그날의 전달을 제공함으로써). 하나의 구체예에서, 결합 부위는 (예를 들어, 세포 시그날 유도 경로에 의해서, 결합 분자 상에 존재하는 페이로드 (payload) (예를 들어, 독성 페이로드)에 대한 보체 고정화 또는 노출에 의해서) 세포의 사망을 제공하거나, (예를 들어, 세포 사멸을 매개하거나 촉진시킴으로써, 섬유소 응괴의 용해를 촉진시키거나 응괴 형성을 촉진시킴으로써, 또는 생물학적으로 이용할 수 있는 성분의 양을 변조시킴으로써 (예를 들어, 대상체에서 TNFa와 같은 리간드의 양을 증가시키거나 감소시킴으로써) 대상체에서 질병 또는 장애를 변조시키는 시그날의 형질도입을 개시시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)과 함께, 감소 또는 제거에 대해서 표적화된 항원, 예를 들어, 세포 표면 항원 또는 가용성 항원에 대해 특이적인적어도 하나의 결합 부위를 갖는다.
또 다른 구체예에서, 표적 분자 (예를 들어, 항원)에 대한 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 결합은 예를 들어, 조직 또는 순환으로부터 표적 분자의 감소 또는 제거를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 표적 분자의 존재를 검출하기 위해서 (예를 들어, 오염물질을 검출하거나, 상태 또는 질병을 진단하기 위해서) 사용될 수 있는, 표적 분자에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 부위를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 분자를 대상체 내의 특정 부위 (예를 들어, 종양 세포, 면역 세포 또는 혈병)에 대해서 표적화한 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 2개 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 결합 부위는 동일하다. 또 다른 구체예에서, 결합 부위는 상이하다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 함께 또는 다른 폴리펩타이드와 조립되어 2개 이상의 폴리펩타이드를 갖는 결합 단백질 ("결합 단백질" 또는 "다량체")을 형성할 수 있는데, 여기에서 다량체의 적어도 하나의 폴리펩타이드는 본 발명의 결합 폴리펩타이드이다. 다량체 형태의 예로는 이량체, 트라이머성, 테트라머성, 및 헥사머성의 변화된 결합 단백질 등이 포함된다. 하나의 구체예에서, 결합 단백질의 폴리펩타이드는 동일하다 (즉, 동종의 변화된 결합 단백질, 예를 들어, 호모이량체, 호모테트라머). 또 다른 구체예에서, 결합 단백질의 폴리펩타이드는 상이하다 (예를 들어, 이종).
i. 항원 결합 부위
(a) 항체
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 항체의 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 본 기술분야에서 인지된 프로토콜을 사용하여 항체로부터 유도된 가변 부분 또는 그의 일부분 (예를 들어, VL 및/또는 VH 영역)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가변 부분은 포유동물을 항원 또는 그의 단편으로 면역시킴으로써 비-인간 포유동물, 예를 들어, 쥐, 기니아 피그, 영장류, 토끼 또는 랫트에서 생산된 항체로부터 유도될 수 있다 [참조: Harlow & Lane, supra; 모든 목적으로 참고로 포함됨]. 면역글로불린은 적절한 항원 (예를 들어, 정제된 종양 연관된 항원 또는 이러한 항원을 포함하는 세포 또는 세포성 추출물) 및 보조제의 수회 피하 또는 복강내 주사에 의해서 생성될 수 있다. 이 면역화는 일반적으로, 활성화된 비장세포 또는 림프구로부터 항원-반응성 항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 야기한다.
가변 부분은 면역화된 포유동물의 혈청으로부터 수확된 폴리클로날 항체로부터 유도될 수 있지만, 비장, 림프절 또는 말초 혈액으로부터 개개 림프구를 분리하여 원하는 가변 부분이 유도되는 모노클로날 항체 (MAbs)의 균질한 제제를 제공하는 것이 종종 바람직하다. 토끼 또는 기니아 피그가 일반적으로, 폴리클로날 항체를 만들기 위해서 사용된다. 마우스는 일반적으로, 모노클로날 항체를 만들기 위해서 사용된다. 모노클로날 항체는 항원 단편을 마우스에게 주사하고, "하이브리도마"를 제조하고, 하이브리도마를 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 대하여 스크리닝함으로써 단편에 대항하여 제조될 수 있다. 이 잘 알려진 방법 [Kohler et al., (1975), Nature, 256:495]에서는, 항원을 주사한 마우스로부터 유래하는 비교적 단명하거나 치사성인 림프구를 불명성 종양 세포주 (예를 들어, 골수종 세포주)와 융합시키고, 이렇게 하여 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마" (이들은 둘 다 불멸성이며, B 세포에 의해서 유전적으로 코드화된 항체를 생성시킬 수 있다)를 생성시킨다. 생성된 하이브리드는 선택, 희석 및 재성장에 의해서 단일의 유전적 스트레인으로 분리시키는데, 여기에서 각각의 개별적인 스트레인은 단일 항체의 형성을 위한 특정의 유전자를 포함한다. 이들은 원하는 항체에 대해서 균질이며, 이들의 순수한 유전적 혈통에 관하여 "모노클로날"이라고 불리는 항체를 생산한다.
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 비융합된 어버이 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 내에서 접종하고 성장시킨다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 하이브리도마의 형성, 선택 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지를 다수의 공급원으로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 표준화된 프로토콜은 잘 설정되어 있음을 이해할 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포를 성장시키는 배양 배지는 원하는 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해서 시험한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해서 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강에 의해서, 또는 방사성면역측정법 (RIA) 또는 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA)과 같은 시험관내 시험에 의해서 결정된다. 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론은 희석절차를 제한함으로써 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해서 성장시킬 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986)]. 또한, 서브클론에 의해서 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질-A, 단백질-G 또는 단백질-L 친화성 크로마토그래피), 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동 또는 투석과 같은 통상적인 정제방법에 의해서 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
임의로, 항체는 항원의 다른 비중첩성 단편에 대한 결합이 없이 항원의 특정한 부분 또는 원하는 단편에 대한 결합에 관하여 스크리닝될 수 있다. 후자의 스크리닝은 항원의 결실 돌연변이체의 수집물에 대한 항체의 결합을 측정하고, 어떤 결실 돌연변이체가 항체에 결합하는지를 측정함으로써 수행될 수 있다. 결합은 예를 들어, 웨스턴 블럿 (Western blot) 또는 ELISA에 의해서 평가될 수 있다. 항체에 대해서 특이적인 결합을 나타내는 가장 작은 단편은 항체의 에피토프를 규정한다. 대신으로, 에피토프 특이성은 시험 및 참조 항체가 항원에 대한 결합에 관하여 경쟁하는 경쟁시험에 의해서 결정될 수 있다. 시험 및 참조 항체가 경쟁한다면, 이들은 하나의 항체의 결합이 다른 것의 결합을 저해하도록 동일한 에피토프 또는 충분히 근접한 에피토프들에 결합한다.
원하는 모노클로날 항체를 코드화한 DNA는 불변 부분 영역 서열의 분리에 대하여 상술한 통상적인 절차 중의 어떤 것이라도 사용하여 (예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드화한 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 쉽게 분리 및 서열화될 수 있다. 분리 및 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 더욱 특히, 분리된 DNA (본 명세서에 기술된 바와 같이 합성일 수도 있다)를 사용하여 본 발명의 결합 폴리펩타이드 내에 혼입시키기 위한 원하는 가변 부분 서열을 클로닝할 수 있다.
다른 구체예에서, 결합 부위는 완전한 인간 항체로부터 유도된다. 인간 또는 실질적으로 인간 항체는 내인성 면역글로불린 생산을 할 수 없는 유전자이식 (transgenic) 동물 (예를 들어, 마우스)에서 생성될 수 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,075,181, 5,939,598, 5,591,669 및 5,589,369호, 이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다]. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 접합 부분의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 제공하는 것으로 기술되었다. 이러한 배선 돌연변이체 마우스에 대한 인간 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 공격시에 인간 항체의 생산을 제공할 것이다. SCID 마우스를 사용하여 인간 항체를 생성시키는 또 다른 바람직한 방법은 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,811,524호에 기술되어 있다. 이들 인간 항체와 연관된 유전자 물질이 또한 본 명세서에 기술된 바와 같이 분리 및 조작될 수 있다는 것은 이해될 것이다.
재조합 항체를 생성시키는 또 다른 매우 효율적인 방법은 문헌 [Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992)]에 기술되어 있다. 구체적으로, 이 기술은 원숭이 가변 영역 및 인간 불변 서열을 함유하는 영장류화된 (primatized) 항체의 생성을 제공한다. 이 문헌은 본 명세서에 온전히 참고로 포함된. 더구나, 이 기술은 또한, 각각 본 명세서에 참고로 포함된 것으로 공통 양도된 미국 특허 제5,658,570, 5,693,780 및 5,756,096호에 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, 림프구는 미세조작 및 분리된 가변 유전자에 의해서 선택될 수 있다. 예를 들어, 말초혈액 단핵 세포는 면역화된 포유동물로부터 분리하여 시험관내에서 약 7일 동안 배양할 수 있다. 배양물은 스크리닝 기준에 부합하는 특정의 IgGs에 대해서 스크리닝할 수 있다. 양성 웰로부터의 세포를 분리할 수 있다. 개개의 Ig-생산 B 세포는 FACS에 의해서, 또는 보체-매개된 용혈성 플라크 시험에서 이들을 확인함으로써 분리될 수 있다. Ig-생산 B 세포는 튜브 내에서 미세조작하고, VH 및 VL 유전자는 예를 들어, RT-PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터 내에 클로닝하고, 발현을 위해서 세포 (예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포) 내에 형질감염시킬 수 있다.
대신으로, 가변 (V) 영역은 선택된 동물로부터의 가변 유전자 서열의 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 영역, 예를 들어, VH 및 VL 영역의 무작위 조합을 발현하는 라이브러리는 원하는 항원에 의해서 스크리닝하여 원하는 결합 특징을 갖는 요소를 확인할 수 있다. 이러한 스크리닝의 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항체 유전자 레퍼토리는 λ 박테리오파아지 발현 벡터 내에 클로닝할 수 있다 [Huse, WD et al. (1989). Science, 2476:1275]. 또한, 그들의 표면 상에서 항체를 발현하는 세포 [Francisco et al. (1994), PNAS, 90:10444; Georgiou et al. (1997), Nat. Biotech., 15:29; Boder and Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15:553; Boder et al.(2000), PNAS, 97:10701; Daugtherty, P. et al. (2000) J. Immunol. Methods. 243:211] 또는 바이러스 [예를 들어, Hoogenboom, HR. (1998), Immunotechnology 4:1; Winter et al. (1994). Annu. Rev. Immunol. 12:433; Griffiths, AD. (1998). Curr. Opin. Biotechnol. 9:102]를 스크리닝할 수 있다.
본 기술분야에서 숙련된 전문가는 또한, 항체 가변 영역을 코드화하는 DNA가 또한 본 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 파아지, 효모, 또는 세균에서 발현된 항체 라이브러리로부터 유도될 수 있음을 이해할 것이다. 예시적인 방법은 예를 들어, 각각 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 문헌 [EP 368 684 B1; 미국 특허 제5,969,108호; Hoogenboom et al., (2000) Immunol. Today 21:371; Nagy et al. (2002) Nat. Med. 8:801; Huie et al. (2001), PNAS, 98:2682; Lui et al. (2002), J. Mol. Biol. 315:1063]에 설명되어 있다. 몇 가지의 문헌 [예를 들어, Marks et al. (1992), Bio/Technology 10:779-783]은 쇄 셔플링 (chain shuffling)뿐만 아니라 큰 파아지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서 조합 감염 (combinatorial infection) 및 생체내 재조합에 의한 높은 친화성의 인간 항체의 생산을 기술하였다. 또 다른 구체예에서는, 리보좀 디스플레이 (ribosomal display)를 사용하여 디스플레이 플랫폼 (platform)으로서 박테리오파아지를 대체시킬 수 있다 [참조: 예를 들어, Hanes, et al. (1998), PNAS 95:14130; Hanes and Pluckthun. (1999), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 243:107; He and Taussig. (1997), Nuc. Acids Res., 25:5132; Hanes et al. (2000), Nat. Biotechnol. 18:1287; Wilson et al. (2001), PNAS, 98:3750; 또는 Irving et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:31].
스크리닝을 위해서 바람직한 라이브러리는 인간 가변 유전자 라이브러리이다. 비-인간 공급원으로부터의 VL 및 VH 영역이 또한 사용될 수도 있다. 라이브러리는 나이브 (naive)하거나, 면역된 대상체로부터 유래하거나, 반-합성적일 수 있다 [Hoogenboom and Winter. (1992). J. Mol. Biol. 227:381; Griffiths et al. (1995) EMBO J. 13:3245; de Kruif et al. (1995). J. Mol. Biol. 248:97; Barbas et al. (1992), PNAS, 89:4457]. 하나의 구체예에서, 돌연변이는 면역글로불린 영역에 대해서 만들어져서 더 큰 불균질성을 갖는 핵산 분자의 라이브러리를 발생시킬 수 있다 [Thompson et al. (1996), J. Mol. Biol. 256:77; Lamminmaki et al. (1999), J. Mol. Biol. 291:589; Caldwell and Joyce. (1992), PCR Methods Appl. 2:28; Caldwell and Joyce. (1994), PCR Methods Appl. 3:S136]. 표준 스크리닝 절차를 사용하여 높은 친화성의 변이체를 선택할 수 있다. 또 다른 구체예에서, VH 및 VL 서열에 대한 변화를 일으켜서, 예를 들어, 본 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 결정 구조로부터 수득된 정보를 사용하여 항체 화합력을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 결합 폴리펩타이드를 생산하는데 유용한 가변 부분 서열은 다수의 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급한 바와 같이, 다양한 인간 유전자 서열은 공적으로 입수할 수 있는 기탁물의 형태로 이용할 수 있다. 항체 및 항체-코드화 유전자의 다수의 서열은 공개되어 있으며, 적합한 가변 부분 서열 (예를 들어, VL 및 VH 서열)은 본 기술분야에서 인지된 기술을 사용하여 이들 서열로부터 화학적으로 합성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드 내에 존재하는 적어도 하나의 가변 부분 영역은 촉매적이다 [Shokat and Schultz.(1990). Annu. Rev. Immunol. 8:335]. 촉매적 결합 특이성을 갖는 가변 부분 영역은 본 기술분야에서 인지된 기술을 사용하여 만들어질 수 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,590,080호, 미국 특허 제5,658,753호]. 촉매적 결합 특이성은 전이 상태를 안정화시키는 효소에 대해서 확인된 것과 유사한 다수의 기본적 기전에 의해서 작용함으로써 활성화의 자유 에너지를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 일반적인 산 및 염기 잔기는 촉매적 활성 부위 내에서 촉매작용에 참여하기 위하여 최적으로 배치될 수 있으며; 공유적 효소-기질 중간체가 형성될 수 있고; 촉매적 항체는 또한, 반응에 적절한 배향으로 존재하고, 반응물의 효과적인 농도를 적어도 7 차수까지 증가시키고 [Fersht et al., (1968), J. Am. Chem. Soc. 90:5833], 이렇게 함으로써 화학반응의 엔트로피를 크게 감소시킬 수 있다. 마지막으로, 촉매적 항체는 기질 결합 및/또는 이후의 전이상태의 안정화 시에 수득된 에너지를 전환시켜 반응을 구동시킬 수 있다.
산 또는 염기 잔기는 면역원으로서 상보적으로 하전된 분자를 사용함으로써 항원 결합 부위 내로 들어갈 수 있다. 이 기술은 양으로-하전된 암모늄 이온을 함유하는 합텐 (hapten)에 의해 항체를 유발하는데 성공적인 것으로 입증되었다 [Shokat, et al., (1988), Chem. Int. Ed. Engl. 27:269-271]. 또 다른 접근법으로, 항체는 원하는 반응의 전이상태 중간체의 크기, 형상 및 전하와 비슷한 안정한 화합물 (즉, 전이상태 유사체)에 대해서 유발될 수 있다. 동물을 면역시키기 위한 전이상태 유사체의 용도 및 촉매적 항체의 생산을 기술하는 미국 특허 제4,792,446호 및 미국 특허 제4,963,355호를 참고로 한다. 이들 특허는 둘 다 이에 의해서 참고로 포함된다. 이러한 분자는 면역컨쥬게이트의 일부분으로서, 예를 들어, KLH와 같은 면역원성 담체 분자와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체의 가변 부분 영역은 예를 들어, VL 쇄의 부재 하에서 안정한 카멜리드로부터 유도된 VH 영역으로 구성된다 [Hamers-Casterman et al. (1993). Nature, 363:446; Desmyter et al. (1996). Nat. Struct. Biol. 3: 803; Decanniere et al. (1999). Structure, 7:361; Davies et al. (1996). Protein Eng., 9:531; Kortt et al. (1995). J. Protein Chem., 14:167].
추가로, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 완전한 쥐, 완전한 인간, 키메라, 인간화된, 비-인간 영장류 또는 영장류화된 항체로부터 유도된 가변 영역 또는 CDR을 포함할 수 있다. 비-인간 항체, 또는 그의 단편 또는 영역은 본 기술분야에서 인지된 기술을 사용하여 그들의 면역원성이 감소하도록 변화될 수 있다. 인간화된 항체는 비-인간 항체로부터 유도된 항체이며, 이것은 모 항체의 결합 특성을 보유하거나, 실질적으로 보유하도록 변형되었지만 모, 비-인간 항체보다 인간에게서 덜 면역원성이다. 인간화된 표적 항체의 경우에, 이것은 (a) 전체 비-인간 가변 영역을 인간 불변 부분 상에 그래프트하여 키메라 표적 항체를 생성시키거나; (b) 하나 이상의 비-인간 상보성 결정 부분 (CDRs)의 적어도 일부분을 결정적인 골격구조 잔가의 보존이 있거나 없이 인간 골격구조 및 불변 부분에 그래프트시키거나; (c) 전체 비-인간 가변 영역을 이식하지만, 표면 잔기를 대체시킴으로써 이들을 인간-유사 절편으로 "은폐 (cloaking)"시키는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해서 달성될 수 있다. 이러한 방법은 문헌 [Morrison et　al., (1984), PNAS. 81: 6851-5; Morrison et al., (1988), Adv. Immunol. 44: 65-92; Verhoeyen et　al., (1988), Science 239: 1534-1536; Padlan, (1991), Molec. Immun. 28: 489-498; Padlan, (1994), Molec. Immun. 31: 169-217; 및 미국 특허 제5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762호: 이들은 모두 이에 의해서 본 명세서에 온전히 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
또한, 탈-면역화 (de-immunization)를 사용하여 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "탈-면역화"는 T 세포 에피토프의 변형을 포함한다 [참조: 예를 들어, WO9852976A1, WO0034317A2]. 예를 들어, VH 및 VL 서열을 분석하고, 서열 내에서 상보성 결정 부분 (CDRs) 및 그 밖의 다른 주요 잔기에 관하여 에피토프의 위치를 나타내는 각각의 V 부분으로부터 인간 T 세포 에피토프 "지도 (map)"를 생성시킨다. 최종 항체의 활성을 변화시킬 위험이 적은 대체 아미노산 치환을 확인하기 위하여 T 세포 에피토프 지도로부터 각각의 T 세포 에피토프를 분석한다. 대체 VH 및 VL 서열의 범위는 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 디자인되고, 이들 서열은 이어서 기능에 대해서 시험한 본 발명의 폴리펩타이드의 범위 내에 포함시킨다. 일반적으로, 12 내지 24개 사이의 변이체 항체를 생성시키고, 시험한다. 그 후, 변형된 V 및 인간 C 부분을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현 벡터 내에 클로닝시키고, 이어서 플라스미드를 전체 항체의 생산을 위한 세포주 내에 도입시킨다. 그 후, 항체를 적절한 생화학적 및 생물학적 시험에서 비교하고, 최적 변이체를 확인한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드에서 사용된 가변 영역은 하나 이상의 CDRs의 적어도 부분적인 대체에 의해서 변화된다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 예를 들어, 부분 골격구조 부분 대체 및 서열 교환에 의해서 임의로 변화될 수 있다. 인간화된 가변 부분을 제조할 때에, CDRs는 동일한 부류의 항체, 또는 골격구조 부분이 유도되는 항체로서의 서브클래스로부터도 유도될 수 있지만, CDRs는 상이한 부류의 항체로부터, 바람직하게는 상이한 종으로부터 항체로부터 유도될 것으로 예상된다. 하나의 가변 영역의 항원 결합능을 또 다른 것에 전이시키기 위하여 모든 CDRs를 공여체 가변 부분으로부터의 완전한 CDRs로 대체시키는 것은 필요하지 않을 수 있다. 오히려, 단지 결합 영역의 활성을 유지시키는 것이 필요한 이들 잔기를 전이시키는 것이 필요할 수 있다. 미국 특허 제5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762호에 기술된 설명을 고려하면, 이것은 일상적인 실험을 수행하거나, 감소된 면역원성을 갖는 기능적 항원 결합 부위를 수득하기 위한 시행착오 시험을 함으로써 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 능력 내에서 잘 이루어질 것이다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 원하는 표적을 인식하는 항체로부터의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체는 원하는 표적을 인식하는 항체로부터의 적어도 2 개의 CDRs를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체는 원하는 표적을 인식하는 항체로부터의 적어도 3 개의 CDRs를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체는 원하는 표적을 인식하는 항체로부터의 적어도 4 개의 CDRs를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체는 원하는 표적을 인식하는 항체로부터의 적어도 5 개의 CDRs를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체는 원하는 표적을 인식하는 항체로부터의 모두 6 개의 CDRs를 포함한다.
결합 부위가 유도될 수 있는, 본 발명의 결합 분자에서 사용하기 위한 항체의 예는 본 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 현재 FDA에 의해서 승인된 항체가 결합 부위를 유도하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 항체의 예는 도 64에 설명되어 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드에서 사용된 항원 결합 부위는 하나 이상의 종양-연관된 항원과 면역반응성일 수 있다. 예를 들어, 암 또는 신생물을 치료하기 위해서 결합 폴리펩타이드의 항원 결합 영역은 바람직하게는, 선택된 종양 연관된 항원에 결합한다. 신생물과 연관된 보고된 항원의 수, 및 관련된 항체의 수를 고려하면, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 본 발명의 결합 폴리펩타이드가 다수의 전체 항체 중의 어느 하나로부터 유도된 가변 부분 서열 또는 그의 일부분을 포함할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 더욱 일반적으로, 이러한 가변 부분 서열은 선택된 조건과 연관된 항원 또는 마커와 반응하는 항체 (문헌에 이미 보고된 것을 포함)로부터 수득되거나 유도될 수 있다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드에 의해서 결합된, 종양-연관된 항원의 예로는 예를 들어, 팬 (pan) B 항원 (예를 들어, 비-호지킨 림프종 내의 것과 같은 악성 및 비-악성 B 세포 둘 다의 표면 상에 존재하는 CD20) 및 팬 T 세포 항원 (예를 들어, CD2, CD3, CD5, CD6, CD7)이 포함된다. 그 밖의 다른 예시적인 종양 연관된 항원은 MAGE-1, MAGE-3, MUC-1, HPV 16, HPV E6 및 E7, TAG-72, CEA, a-루이스y (Lewisy), L6-항원, CD19, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD44, CD52, CD56, CD80, 메소텔린, PSMA, HLA-DR, EGF 수용체, VEGF, VEGF 수용체, 크립토 (Cripto) 항원, 및 HER2 수용체를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 종양-연관된 반응하는 것으로 이전에 보고된 항체로부터의 완전한 항원 결합 부위 (또는 그의 가변 부분 또는 CDR 서열)를 포함할 수 있다. 종양-연관된 항원과 반응할 수 있는 항체의 예로는 다음의 것이 포함된다: 2B8, Lym 1, Lym 2, LL2, Her2, B1, BR96, MB1, BH3, B4, B72.3, 5E8, B3F6, 5E10, α-CD33, α-CanAg, α-CD56, α-CD44v6, α-루이스, 및 α-CD30. 더욱 구체적으로, 이들 예시적인 항체에는 2B8 및 C2B8 (제발린 (Zevalin®) 및 리툭산 (Rituxan®), Biogen Idec, Cambridge), Lym 1 및 Lym 2 (Techniclone), LL2 (Immunomedics Corp., New Jersey), 트라스투주마브 (Trastuzumab; 헤르셉틴 (Herceptin®), Genentech Inc., South San Francisco), 토시투모마브 (Tositumomab; 벡사르 (Bexxar®), Coulter Pharm., San Francisco), 알렘트주마브 (Alemtzumab; 캄패스 (Campath®), Millennium Pharmaceuticals, Cambridge), 젬투주마브 오조가미신 (Gemtu-zumab ozogamicin; 마일로타그 (Mylotarg®), Wyeth-Ayerst, Philadelphia), 아바고보마브 (Abagovomab; Menarini, Italy), CEA-ScanTM(Immunomedics, Morris Plains, NJ), 카프로마브 (Capromab; 프로스타신트 (Prostascint®), Cytogen Corp.), 에드레콜로마브 (Edrecolomab; 파노렉스 (Panorex®), Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ), 이고보마브 (Igovomab; CIS Bio Intl., France), 미투모마브 (Mitumomab; BEC2, Imclone Systems, Somerville, NJ), 노페투모마브 (Nofetumomab; 베를루마 (Verluma®), Boehringer Ingleheim, dgefield, CT), 오바렉스 (OvaRex; Altarex Corp., Waltham, MA), 사투모마브 (Satumomab; 오노신트 (Onoscint®), Cytogen Corp.), 아폴리주마브 (Apolizumab; 레미토젠 (REMITOGEN®), Protein Design Labs, Fremont, CA), 라베투주마브 (Labetuzumab; 시아사이드 (CEACIDE®), Immunomedics Inc., Morris Plains, NJ), 페르투주마브 (Pertuzumab; 옴니타르그 (OMNITARG TM , Genentech Inc., S. San Francisco, CA), 패니투무마브 (Panitumumab; 벡티빅스 (Vectibix®), Amgen, Thousand Oaks, CA), 세툭시마브 (Cetuximab; 에르비툭스 (Erbitux®), Imclone Systems, New York), 베바시주마브 (Bevacizumab; 아바스틴 (Avastin®), Genentech Inc., South San Francisco), BR96, BL22, LMB9, LMB2, MB1, BH3, B4, B72.3 (Cytogen Corp.), SS1 (NeoPharm), CC49 (National Cancer Institute), 칸투주마브 메르탄신 (Cantuzumab mertansine; ImmunoGen, Cambridge), MNL 2704 (Milleneum Pharmaceuticals, Cambridge), 비바투주마브 (Bivatuzumab) 메르산틴 (Boehringer Ingelheim, Germany), 트라스투주마브-DM1 (Genentech, South San Francisco), My9-6-DM1 (ImmunoGen, Cabridge), SGN-10, -15, -25, 및 -35 (Seattle Genetics, Seattle), 및 5E10 (University of Iowa). 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 안티-CD23 항체 (예를 들어, 루밀릭시마브 (Lumiliximab)), 안티-CD80 항체 (예를 들어, 갈릭시마브 (Galiximab)), 또는 안티-VL5/α5β1-인테그린 항체 (예를 들어, 볼로식시마브 (Volociximab))의 결합 부위를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 바로 위에 열거한 항체와 동일한 종양-연관된 항원에 결합할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리펩타이드는 Y2B8, C2B8, CC49 및 C5E10과 동일한 항원으로부터 유도되거나, 이들을 결합시킬 수 있다.
본 발명의 결합 분자에 혼입될 수 있는 다른 결합 부위는 다음에 존재하는 것을 포함한다: 오르토클론 (Orthoclone) OKT3 (안티-CD3) (Johnson & Johnson, Brunswick, NJ), 레오프로 (ReoPro®) (안티-GpIIb/gIIa) (Centocor, Horsham, PA), 제나팍스 (Zenapax®) (안티-CD25) (Roche, Basel, Switzer-land), 레미케이드 (Remicade®) (안티-TNFa) (Centocor, Horsham, PA), 시뮬렉트 (Simulect®) (안티-CD25) (Novartis, Basel, Switzerland), 시나지스 (Synagis®) (안티-RSV) (Medimmune, Gaithersburg, MD), 휴미라 (Humira®) (안티-TNFa) (Abbott, Abbott Park, IL), 졸레어 (Xolair®) (안티-IgE) (Genentech, South San Francisco, CA), 랍티바 (Raptiva®) (안티-CD11a) (Genentech), 타이사브리 (Tysabri®)(BiogenIdec, Cambridge, MA), 루센티스 (Lucentis®) (안티-VEGF) (Genentech), 및 솔리리스 (Soliris®) (Alexion Pharmaceuticals, Cheshire, CT).
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 이하의 항체 중의 하나 이상으로부터 유도된 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다: 토시투모마브 (tositumomab; 벡사르 (BEXXAR®)), 뮤로모나브 (muromonab; 오르토클론 (ORTHOCLONE®) 및 이브리투모마브 (ibritumomab; 제발린 (ZEVALIN®)), 세툭시마브 (cetuximab; 얼비툭스 (ERBITUX®)), 리툭시마브 (rituximab; 맙테라 (MABTHERA®)/리툭산 (RITUXAN®)), 인플릭시마브 (infliximab; 레미케이드 (REMICADE®)), 앱식시마브 (abciximab; 레오프로 (REOPRO®)) 및 바실릭시마브 (basiliximab; 시물렉트 (SIMULECT®)), 에팔리주마브 (efalizumab; 랍티바 (RAPTIVA®)), 베바시주마브 (bevacizumab; 아바스틴 (AVASTIN®)), 알렘투주마브 (alemtuzumab; 캄패스 (CAMPATH®)), 트라스투주마브 (trastuzumab; 헤르셉틴 (HERCEPTIN®)), 젬투주마브 (gemtuzumab; 마일로타그 (MYLOTARG®)), 팔리비주마브 (palivizumab; 시나지스 (SYNAGIS®)), 오말리주마브 (omalizumab; 졸레어 (XOLAIR®)), 다클리주마브 (daclizumab; 제나팍스 (ZENAPAX®)), 나탈리주마브 (natalizumab; 타이사브리 (TYSABRI®)) 및 라니비주마브 (ranibizumab; 루벤티스 (LUVENTIS®)), 아달리무마브 (adalimumab; 휴미라 (HUMIRA®)) 및 파니투무마브 (panitumumab; 벡티빅스 (VECTIBIX®)).
하나의 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 리툭산 (Rituxan®)과 동일한 종양-연관된 항원에 결합할 수 있다. 리툭산 (또한 리툭시마브, IDEC-C2B8 및 C2B8로도 공지됨)은 인간 B-세포 림프종의 치료를 위한 첫 번째로 FDA-승인된 모노클로날 항체였다 [참조: 미국 특허 제5,843,439; 5,776,456 및 5,736,137호; 이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다]. Y2B8 (90Y 표지된 2B8; 제발린 (Zevalin®), 이브리투모마브 티욱세탄 (ibritumomab tiuxetan))은 C2B8의 쥐의 모 항체이다. 리툭산은 성장 억제성이며, 보고에 의하면 시험관내에서 화학요법제에 의한 세포소멸에 대하여 특정의 림프종 세포주를 감작시키는 키메라, 안티-CD20 모노클로날 항체이다. 항체는 인간 보체를 효율적으로 결합시키며, 강력한 FcR 결합을 가지고, 시험관내에서 보체 의존적 (CDC) 및 항체 의존적 (ADCC) 기전 둘 다를 통해 인간 림프구를 효과적으로 사멸시킬 수 있다 [Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)]. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는, CD20+ 악성종양을 표현하는 환자를 치료하는데 더 더욱 효과적인 결합 폴리펩타이드를 제공하기 위해서 본 발명의 결합 폴리펩타이드가 C2B8 또는 2B8의 가변 부분 또는 CDRs를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 CC49와 동일한 종양-연관된 항원에 결합할 수 있다. CC49는 인간 기원의 특정한 종양 세포, 특히 LS174T 종양 세포주의 표면과 결합하는 인간 종양-연관된 항원 TAG-72를 결합시킨다. LS174T는 LS180 결장 선암 세포주의 변이체이다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 TAG-72에 대한 결합 특이성을 갖는, 개발된 다수의 쥐 모노클로날 항체로부터 유도된 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. B72.3으로 지정된 이들 모노클로날 항체 중의 하나는 하이브리도마 B72.3에 의해서 생산된 쥐 IgG1이다. B72.3은 면역원으로서 인간 유방암종 추출물을 사용하여 개발된 제1 세대 모노클로날 항체이다 [참조: Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78:3199-3203 (1981); 및 미국 특허 제4,522,918 및 4,612,282호, 이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다]. TAG-72에 대해서 지시된 그 밖의 다른 모노클로날 항체는 "CC" (결장암에 대해서)로 지정된다. 슐롬 (Schlom) 등에 의해서 기술된 바와 같이 (본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,512,443호), CC 모노클로날 항체는 B72.3에 의해서 정제된 TAG-72를 사용하여 제조된 제2 세대 쥐 모노클로날 항체의 집단이다. TAG-72에 대한 이들의 상대적으로 우수한 결합 친화성으로 인하여, 이하의 CC 항체가 바람직하다: CC49, CC 83, CC46, CC92, CC30, CC11, 및 CC15. 슐롬 등은 또한, PCT/US99/25552에 기술된 바와 같은 인간화된 CC49 항체의 변이체, 및 미국 특허 제5,892,019호에 기술된 바와 같은 단일 쇄 Fv (scFv) 구조물을 생산하였다 (이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다). 본 기술분야에서 숙련된 전문가는, 전술한 항체, 구조물 또는 재조합체 각각, 및 이들의 변이는 합성일 수 있으며, 본 발명에 따라 결합 폴리펩타이드를 생산하기 위한 결합 부위를 제공하기 위해서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
상기 언급한 안티-TAG-72 항체 이외에도, 다양한 그룹이 또한, 영역-결실된 CC49 및 B72.3 하체의 제작 및 부분적 특정화를 보고하였다 [예를 들어, Calvo et al. Cancer Biotherapy, 8(1):95-109 (1993), Slavin-Chiorini et al. Int. J. Cancer 53:97-103 (1993), 및 Slavin-Chiorini et al. Cancer. Res. 55:5957-5967 (1995)]. 따라서, 결합 폴리펩타이드는 마찬가지로 이들 항체로부터 유도된 항원 결합 부위, 가변 부분, 또는 CDRs를 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 CD23 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다 [미국 특허 제6,011,138호]. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 5E8 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 안티-CD23 항체, 예를 들어, 5E8 항체 (예를 들어, 루밀릭시마브 (Lumiliximab))로부터의 적어도 하나의 CDR (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 CDRs)을 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 크립토 (CRIPTO)-I 항원에 결합한다 (WO02/088170A2 또는 WO03/083041A2). 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 B3F6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체는 안티-크립토-1 항체, 예를 들어, B3F6 항체로부터의 적어도 하나의 CDR (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 CDRs) 또는 가변 부분을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 수용체의 TNF 슈퍼패밀리 ("TNFRs")의 구성원인 항원에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는, 예를 들어, TNF 패밀리 수용체와 같은 세포 표면 수용체에 결합함으로써 세포에 시그날을 전달하는 적어도 하나의 표적을 결합시킨다. "시그날을 전달한다"는 것은, 세포에 결합함으로써 결합 분자가 세포 표면 수용체에 대한 세포외 영향을 예를 들어, 시그날 전달경로를 변조시킴으로써 세포성 반응으로 전환시키는 것을 의미한다. 용어 "TNF 수용체" 또는 "TNF 수용체 패밀리 구성원"은 수용체의 종양 괴사인자 ("TNF") 슈퍼패밀리에 속하는 모든 수용체를 의미한다. TNF 수용체 슈퍼패밀리 ("TNFRSF")의 시스테인 노트 (knots)로서 정렬된 2개 이상의 시스테인-풍부 영역 (각각 ~40개의 아미노산)을 특징으로 한다 [참조: Dempsey et al.,Cytokine Growth Factor Rev. (2003). 14(3-4):193-209]. 이들의 동족성 TNF 리간드를 결합시키면, TNF 수용체는 직접 또는 간접적으로 TRAFs (TNF 수용체 연관 인자)로 공지된 세포질 어댑터 (adapter) 단백질과 상호작용함으로써 시그날을 전달한다. TRAFs는 궁극적으로, 면역 기능 및 조직 분화로부터 세포소멸까지의 범위의 세포성 과정을 조절하는 NF-카파B, JNK, ERK, p38 및 PI3K과 같은 시그날 전달경로의 활성화를 유도하는 몇 가지 키나제 캐스케이드의 활성화를 유도할 수 있다. 몇 가지 TNF 수용체 패밀리 구성원의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 다음의 적어도 29 개의 인간 유전자를 포함한다: TNFRSF1A (DR1, CD120a, TNF-R-I p55, TNF-R, TNFRI, TNFAR, TNF-R55, p55TNFR, p55R, 또는 TNFR60으로 또한 공지된 TNFR1, GenBank GI No. 4507575; US 5,395,760를 또한 참조한다), TNFRSF1B (p75, TNF-R, TNF-R-II, TNFR80, TNFR2, TNF-R75, TNFBR, 또는 p75TNFR로 또한 공지된 CD120b; GenBank GI No. 4507577), TNFRSF3 (TNFR2-RP, CD18, TNFR-RP, TNFCR, 또는 TNF-R-III로 또한 공지된 림포톡신 베타 수용체 (LTβR); GI Nos. 4505038 및 20072212), TNFRSF4 (ACT35, TXGP1L, 또는 CD134 항원으로 또한 공지된 OX40; GI Nos. 4507579 및 8926702), TNFRSF5 (p50 또는 Bp50으로 또한 공지된 CD40; GI Nos. 4507581 및 23312371), TNFRSF6 (FAS-R, DcR-2, DR2, CD95, APO-1, 또는 APT1로 또한 공지된 FAS; GenBank GI Nos. 4507583, 23510421, 23510423, 23510425, 23510427, 23510429, 23510431, 및 23510434)), TNFRSF6B (DcR3, DR3; GenBank GI Nos. 4507569, 23200021, 23200023, 23200025, 23200027, 23200029, 23200031, 23200033, 23200035, 23200037, 및 23200039), TNFRSF7 (Tp55 또는 S152로 또한 공지된 CD27; GenBank GI No. 4507587), TNFRSF8 (Ki-1, 또는 D1S166E로 또한 공지된 CD30; GenBank GI Nos. 4507589 및 23510437), TNFRSF9 (CD137 또는 ILA로 또한 공지된 4-1-BB; GI Nos. 5730095 및 728738), TNFRSF10A (DR4 또는 Apo2로 또한 공지된 TRAIL-R1; GenBank GI No. 21361086), TNFRSF10B (DR5, KILLER, TRICK2A, 또는 TRICKB로 또한 공지된 TRAIL-R2; GenBank GI Nos. 22547116 및 22547119), TNFRSF10C (DcR1, LIT, 또는 TRID로 또한 공지된 TRAIL-R3; GenBank GI No. 22547121), TNFRSF10D (DcR2 또는 TRUNDD로 또한 공지된 TRAIL-R4), TNFRSF11A (RANK; GenBank GI No. 4507565; 미국 특허 제6,562,948; 6,537,763; 6,528,482; 6,479,635; 6,271,349; 6,017,729호를 참조), TNFRSF11B (OCIF 또는 TR1로 또한 공지된 오스테오프로테게린 (Osteoprotegerin; OPG); GI Nos. 38530116, 22547122 및 33878056), TNFRSF12 (DR3, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3, Fn14, 또는 TWEAKR로 또한 공지된 전좌성 쇄-회합 막 단백질 (TRAMP); GenBank GI No. 7706186; 미국 특허출원 공개 제2004/0033225A1호), TNFRSF12L (DR3L), TNFRSF13B (TACI; GI No. 6912694), TNFRSF13C (BAFFR; GI No. 16445027), TNFRSF14 (ATAR, TR2, LIGHTR, 또는 HVEA로 또한 공지된 헤르페스 바이러스 도입 매개체 (HVEM); GenBank GI Nos. 23200041, 12803895, 및 3878821), TNFRSF16 (뉴트로핀 수용체 또는 p75(NTR)로 또한 공지된 저-친화성 신경성장인자 수용체 (LNGFR); GenBank GI Nos. 128156 및 4505393), TNFRSF17 (BCMA로 또한 공지된 BCM; GI No. 23238192), TNFRSF18 (GITR로 또한 공지된 AITR; GenBank GI Nos. 4759246, 23238194 및 23238197), TNFRSF19 (TAJ로 또한 공지된 Troy/Trade; GenBank GI Nos. 23238202 및 23238204), TNFRSF20 (FLJ14993으로 또한 공지된 RELT; GI Nos. 21361873 및 23238200), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (Tnfrh2 또는 2810028K06Rik으로 또한 공지된 SOBa), 및 TNFRSF23 (Tnfrh1로 또한 공지된 mSOB). 그 밖의 다른 TNF 패밀리 구성원에는 EDAR1 (다운레스 (Downless) (DL), ED3, ED5, ED1R, EDA3, EDA1R, EDA-A1R로 또한 공지된 엑토디스플라신 (ectodysplasin) A 수용체; GenBank GI No. 11641231; US 특허 제6,355,782호), XEDAR (EDA-A2R로 또한 공지됨; GenBank GI No. 11140823); 및 CD39 (GI Nos. 2135580 및 765256)가 포함된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체는 사망 영역 (death domain)을 결여한 TNF 수용체 패밀리 구성원에 결합한다. 하나의 구체예에서, 사망 영역을 결여한 TNF 수용체는 조직 분화에 수반된다. 더욱 특정한 구체예에서, 조직 분화에 수반된 TNF 수용체는 LTbR, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn14, Troy/Trade, 및 NGFR로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 사망 영역을 결여한 TNF 수용체는 면역 조절에 수반된다. 더욱 특정한 구체예에서, 면역 조절에 수반된 TNF 수용체 패밀리 구성원은 TNFR2, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, 및 GITR로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 TNF 리간드 슈퍼패밀리에 속하는 TNF 리간드에 결합한다. TNF 리간드는 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 별개의 수용체에 결합하며, 서로 15-25% 아미노산 서열 상동성을 나타낸다 [Gaur et al., Biochem. Pharmacol. (2003), 66(8):1403-8]. 몇 가지의 TNF 수용체 (리간드) 슈퍼패밀리 ("TNFSF")의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 적어도 16 개의 다음의 인간 유전자를 포함한다: TNFSF1 (림포톡신-α (LTA), TNFβ 또는 LT로 또한 공지됨, GI No.: 34444 및 6806893), TNFSF2 (TNF, TNFα 또는 DIF로 또한 공지됨; GI No. 25952111), TNFSF3 (림포톡신-β(LTB), TNFC, 또는 p33으로 또한 공지됨), TNFSF4 (OX-40L, gp34, CD134L, 또는 tax-전사적으로 활성화된 당단백질 1, 34kD (TXGP1); GI No. 4507603), TNFSF5 (CD40LG, IMD3, HIGM1, CD40L, hCD40L, TRAP, CD154, 또는 gp39로 또한 공지됨; GI No. 4557433), TNFSF6 (FasL 또는 APT1LG1로 또한 공지됨; GenBank GI No. 4557329), TNFSF7 (CD70, CD27L, 또는 CD27LG로 또한 공지됨; GI No. 4507605), TNFSF8 (CD30LG, CD30L, 또는 CD153으로 또한 공지됨; GI No. 4507607), TNFSF9 (4-1BB-L 또는 ILA 리간드로 또한 공지됨; GI No. 4507609), TNFSF10 (TRAIL, Apo-2L, 또는 TL2로 또한 공지됨; GI No. 4507593), TNFSF11 (TRANCE, RANKL, OPGL, 또는 ODF로 또한 공지됨; GI Nos. 4507595 및 14790152), TNFSF12 (Fn14L, TWEAK, DR3LG, 또는 APO3L로 또한 공지됨; GI Nos. 4507597 및 23510441), TNFSF13 (APRIL로 또한 공지됨), TNFSF14 (LIGHT, LTg, 또는 HVEM-L로 또한 공지됨; GI Nos. 25952144 및 25952147), TNFSF15 (TL1 또는 VEGI로 또한 공지됨), 또는 TNFSF16 (AITRL, TL6, hGITRL, 또는 GITRL로 또한 공지됨; GI No. 4827034). 그 밖의 다른 TNF 리간드 패밀리 구성원에는 EDAR1 및 XEDAR 리간드 (ED1; GI No. 4503449; Monreal et al. (1998) Am J Hum Genet. 63:380), Troy/Trade 리간드, BAFF (TALL1로 또한 공지됨; GI No. 5730097), 및 NGF 리간드 (예를 들어, NGF-β(GI No. 4505391), NGF-2/NTF3; GI No. 4505469), NTF5 (GI No. 5453808), BDNF (GI Nos. 25306267, 25306235, 25306253, 25306257, 25306261, 25306264; IFRD1 (GI No. 4504607))가 포함된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 LTβR 항체에 (예를 들어, CBE11 또는 BDA8 항체 (즉, 이것과 경쟁한다)와 동일한 에피토프에) 결합한다. 안티-LTβR 항체의 예는 본 명세서에 참고로 포함된 WO 98/017313 및 WO 02/30986에 설명되어 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변화된 항체는 안티-LTLTβR 항체, 예를 들어, CBE11 항체 또는 BDA8 항체로부터의 적어도 하나의 CDR (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 CDRs)을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 TRAIL-R2에 (예를 들어, 14A2 항체 (즉, 이것과 경쟁한다)와 동일한 에피토프에) 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 안티-TRAIL-R2 항체, 예를 들어, 14A2 항체로부터의 적어도 하나의 CDR (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 CDRs)을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 안티-CD2 항체 (예를 들어, 키메라 CB6 ("chB6") 항체)와 동일한 에피토프에 결합한다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드가 유도될 수 있는 안티-CD2 항체의 예는 마우스 항체 CB6뿐만 아니라 그의 키메라 변형, 예를 들어, 실시예에 기술된 IgG1 chCB6 항체를 포함한다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 안티-CD2 결합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:29 (ASK058), SEQ ID NO:31 (ASK062), SEQ ID NO:33 (ASK063), 및 SEQ ID NO:35 (ASK064)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 C5E10과 동일한 종양 연관 항원으로부터 유도되거나 여기에 결합하는 변화된 항체를 포함한다. 공동-계류 중인 출원 제09/104,717호에 기술된 바와 같이, C5E10은 전립선 종양 세포주 (예를 들어, DU145, PC3, 또는 ND1)에 대해서 특이적인 것으로 보이는 약 115 kDa의 당단백질 결정자 (determinant)를 인식하는 항체이다. 따라서, 본 발명과 관련하여 C5E10 항체에 의해서 인식된 동일한 종양-연관 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 단독으로 사용되거나, 본 발명의 방법에 의해서 효과기 부위와 컨쥬게이트됨으로써 신생물성 장애의 개선된 치료에 유용한 변형된 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 출발 폴리펩타이드는 ATCC 기탁 번호 PTA-865를 갖는 하이브리도마 세포주로부터 분비된 것으로서 C5E10 항체의 항원 결합 부분의 전부 또는 일부분을 포함하거나 유도될 수 있다. 그 후, 생성된 폴리펩타이드를 이하에 기술하는 바와 같은 치료학적 효과기 부위에 컨쥬게이트시키고, 본 발명에서의 방법에 따라 전립선암을 앓고 있는 환자에게 투여할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 자가면역 또는 염증성 질병 또는 장애를 치료하는데 유용한 분자에 결합한다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드는 면역 세포 (예를 들어, B 또는 T 세포) 상에 존재하는 항원 또는 자가면역 질병 또는 장애의 원인이 되는 자가항원 (autoantigen)에 결합할 수 있다. 자가면역 또는 염증성 장애와 연관된 항원은 상술한 종양-연관된 항원일 수 있다. 따라서, 종양 연관된 항원은 또한 자가면역 또는 염증성 연관된 장애일 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "자가면역 질병 또는 장애"는 면역계가 신체 자체의 세포를 공격하여 조직 파괴를 야기하는 대상체에서의 장애 또는 상태를 의미한다. 자가면역 질병에는 범발성 자가면역 질병, 즉 자가면역 반응이 다수의 조직에서 동시에 일어나는 질병, 또는 기관 특이적 자가면역 질병, 즉 자가면역 반응이 단일 기관을 표적으로 하는 질병이 포함된다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해서 진단, 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역 질병의 예로는 크론병; 염증성 장질환 (IBD); 전신 홍반성 루푸스; 궤양성 대장염; 류마티스성 관절염; 굿파스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome); 그레이브스병 (Grave's disease); 하시모도 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis); 심상성 천포창; 중증근무력증; 공피증; 자가면역 용혈성 빈혈; 자가면역 혈소판감소성 자반증; 다발성근염 및 피부근염; 악성 빈혈; 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome); 강직성 척추염; 맥관염; 제I형 당뇨병; 신경학적 장애; 다발성 경화증; 및 자가면역 질병의 결과로 야기된 이차 질병이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 염증성 질병 또는 장애와 연관된 표적 분자에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "염증성 질병 또는 장애"는 적어도 부분적으로 염증, 예를 들어, 증가된 혈류, 부종, 면역 세포의 활성화 (예를 들어, 증식, 사이토킨 생산, 또는 증진된 식균작용)에 의해서 야기되거나, 악화되는 질병 또는 장애를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 비정상적인 양으로, 예를 들어, 대상체를 변화시키는데, 예를 들어, 대상체에게 이익이 되도록 하는데 유리할 수 있는 양으로 영역 내에 존재하거나 포함되는 염증성 인자 (예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), TNFa, 인터로이킨, 혈장 단백질, 사이토킨, 지질 대사산물, 프로테아제, 독성 래디칼, 미토콘드리아 단백질, 세포소멸성 단백질, 유착 분자 등)에 결합할 수 있다. 염증성 과정은 손상에 대한 생체 조직의 반응이다. 염증의 원인은 물리적 손상, 화학적 물질, 미생물, 조직 괴사, 암 또다른 작용제에 기인할 수 있다. 급성 염증은 단기간-지속성이며, 예를 들어, 단지 며칠 동안 지속한다. 그러나, 만일 이것이 더 장시간 지속성이라면, 이것은 만성 염증이라 칭할 수 있다.
염증성 장애에는 급성 염증성 장애, 만성 염증성 장애, 및 재발성 염증성 장애가 포함된다. 급성 염증성 장애는 일반적으로, 비교적 짧은 지속시간을 가지며, 약 몇 분 내지 약 1 내지 2일 동안 지속하지만, 이들은 몇 주일 동안 지속할 수도 있다. 급성 염증성 장애의 주된 특징은 증가된 혈류, 체액 및 혈장 단백질의 삼출 (부종) 및 호중구와 같은 백혈구의 유주를 포함한다. 만성 염증성 장애는 일반적으로, 더 긴 지속시간, 예를 들어, 몇 주일 내지 몇 개월 내지는 몇 년 또는 더 긴 지속시간까지를 가지며, 조직학적으로 림프구 및 대식세포의 존재 및 혈관 및 결합조직의 증식과 연관된다. 재발성 염증성 장애는 일정 시간 후에 재발하거나, 주기적인 증상의 발현이 있는 장애를 포함한다. 재발성 염증성 장애의 예로는 천식 및 다발성 경화증이 포함된다. 일부의 장애는 하나 이상의 카테고리에 속할 수 있다. 염증성 장애는 일반적으로 열, 발적 (redness), 팽윤, 통증 및 기능의 상실을 특징으로 한다. 염증성 장애의 원인의 예로는 미생물 감염 (예를 들어, 세균, 바이러스 및 진균 감염), 물리적 작용제 (예를 들어, 화상, 방사선 및 외상), 화학적 작용제 (예를 들어, 독소 및 부식성 물질), 조직 괴사 및 다양한 유형의 면역학적 반응이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 염증성 장애의 예로는 골관절염, 류마티스성 관절염, 급성 및 만성 감염 (세균성, 바이러스성 및 진균성); 급성 및 만성 기관지염, 부비동염, 및 감기를 포함하는 그 밖의 다른 호흡기 감염; 급성 및 만성 위장염 및 대장염; 급성 및 만성 방광염 및 요도염; 급성 호흡장애 증후군; 낭포성 섬유증; 급성 및 만성 피부염; 급성 및 만성 결막염; 급성 및 만성 장막염 (심막염, 복막염, 활막염, 흉막염 및 건염); 요독성 심막염; 급성 및 만성 담낭염; 급성 및 만성 질염; 급성 및 만성 포도막염; 약물 반응; 및 화상 (열성, 화학적 및 전기적)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 CD40L 항체에 (예를 들어, 5C8 항체 (즉, 이것과 경쟁한다)와 동일한 에피토프에) 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 안티-CD40L 항체 (예를 들어, 5C8 항체)로부터의 적어도 하나의 항원 결합 부위, 하나 이상의 CDRs (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 CDRs), 또는 하나 이상의 가변 부분 (VH 또는 VL)을 포함한다. 경막 (transmembrane) 단백질인 CD40L (CD154, gp39)은 활성화된 CD4+ T 세포, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 활성화된 혈소판 상에서 발현된다. CD40L은 T-세포 의존적 B-세포 반응에 중요하다. CD40L의 현저한 기능인 이소타입 스위칭 (isotype switching)은 CD40L이 선천적으로 결핍되어 있는 과-면역글로불린 M (IgM) 증후군에 의해서 증명된다. CD40L-CD40의 상호작용 (수지상 세포와 같은 항원-표시 세포 상에서)은 T-세포 프라이밍 (priming) 및 T-세포 의존적 체액성 면역반응에 필수적이다. 따라서, 안티-CD40L 모노클로날 항체 (mAb)에 의한 CD40-CD40L 상호작용의 중단은 상기의 정보 및 동물에서의 시험을 기초로 하여, 인간 자가면역 질병에서의 이용가능한 치료학적 전략이 될 것으로 생각된다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드가 유도될 수 있는 안티-CD40L 항체의 예로는 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,474,771호에 기술된 마우스 항체 5C8뿐만 아니라 그의 인간화된 변형체, 예를 들어, 실시예에 기술된 IgG1 Hu5C8 항체가 포함된다. 다른 안티-CD40L 항체는 본 기술분야에서 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,961,974호 및 국제 공개 제WO 96/23071호). 특정한 구체예에서, 본 발명의 안티-CD40L 결합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1 (EAG2066), SEQ ID NO:7 (EAG2146), SEQ ID NO:9 (EAG2147), SEQ ID NO:13 (ASK043), SEQ ID NO:15 (ASK048), SEQ ID NO:17 (ASK052), 및 SEQ ID NO:19 (ASK053)으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 신경학적 질병 또는 장애를 치료하는데 유용한 분자에 결합한다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드는 신경 세포 (예를 들어, 뉴론, 신경교 세포 등) 상에 존재하는 항원에 결합할 수 있다. 특정의 구체예에서, 신경학적 장애와 연관된 항원은 상기에 기술한 자가면역 또는 염증성 장애일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "신경학적 질병 또는 장애"는 대상체에서 신경계가 변성하거나 (예를 들어, 신경변성 장애뿐만 아니라 신경계가 적절하게 발달하지 못한 경우의 장애), 손상, 예를 들어, 척수 손상을 입은 후에 재생하지 못한 장애 또는 상태를 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해서 진단, 예방 또는 치료될 수 있는 신경학적 장애의 예로는 다발성 경화증, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 신경병성 통증, 외상성 뇌손상, 귈랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 안티-LINGO 항체 (예를 들어, Li33 항체)와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 안티-LINGO 항체 (예를 들어, Li33 항체)로부터의 적어도 하나의 항원 결합 부위, 하나 이상의 CDRs, 또는 하나 이상의 가변 부분 (VH 또는 VL)을 포함한다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 안티-LINGO 결합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO 21 (EAG2148), SEQ ID NO:22 (ASK050) 및 SEQ ID NO:23 (ASK051)으로부터 선택된 중쇄 서열을 포함한다.
(b) 항원 결합 단편
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 결합 부위는 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 용어 "항원-결합 단편"은 항원을 결합시키거나, 항원 결합 (즉, 특이적 결합)에 대해서 온전한 항체와 (즉, 이들이 유도된 온전한 항체와) 경쟁하는 면역글로불린, 항체 또는 항체 변이체의 폴리펩타이드 단편을 의미한다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단편은 상기에 기술한 항체 또는 항체 변이체 중의 어떤 것으로부터도 유도될 수 있다. 항원 결합 단편은 본 기술분야에서 잘 공지된 재조합 또는 생화학적 방법에 의해서 생산될 수 있다. 항원-결합 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab' 및 (Fab')2가 포함된다.
예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 C-말단 및/또는 N-말단에 작동적으로 연결되는 (예를 들어, 화학적으로 컨쥬게이트되거나, 유전적으로-융합된다 (직접적으로 융합되거나, 폴리펩타이드 링커를 통해서 융합된다)) 적어도 하나의 항원 결합 단편을 포함한다. 하나의 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 힌지 영역 또는 그의 일부분 (예를 들어, IgG1 힌지 또는 그의 일부분, 예를 들어, 인간 IgG1 힌지)을 통해서 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분의 N-말단 (또는 C-말단)에 작동적으로 연결된 항원 결합 단편 (예를 들어, Fab)을 포함한다. 예시적인 힌지 영역 부분은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGG를 포함한다.
(c) 단일 쇄 결합 분자
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 단일 쇄 결합 분자로부터의 결합 부위 (예를 들어, 단일 쇄 가변 부분 또는 scFv)를 포함할 수 있다. 단일 쇄 항체의 생산을 위해서 설명된 기술 [미국 특허 제4,694,778호; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)]은 단일 쇄 결합 분자를 생산하도록 조정될 수 있다. 단일 쇄 항체는 Fv 부분의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 브릿지를 통해서 연결시켜 단일 쇄 항체를 제공함으로써 형성된다. 이. 콜라이 내에서 기능적 Fv 단편의 조립을 위한 기술이 또한 사용될 수 있다 [Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)].
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 단일 쇄 가변 부분 서열 (scFv)을 포함하거나 이것으로 구성되는 하나 이상의 결합 부위 또는 부분을 포함한다. 단일 쇄 가변 부분 서열은 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들어, 유연성 링커에 의해서 VH 영역에 연결된 VL 영역을 갖는 단일 폴리펩타이드를 포함한다. VL 및/또는 VH 영역은 상기에 기술한 항체 또는 항체 변이체 중의 어떤 것으로부터도 유도될 수 있다. ScFv 분자는 VH-링커-VL 배향 또는 VL-링커-VH 배향으로 구성될 수 있다. 항원 결합 부위를 구성하는 VL 및 VH 영역을 연결시키는 유연성 링커는 바람직하게는 약 10 내지 약 50 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리펩타이드 링커는 gly-ser 폴리펩타이드 링커이다. 예시적인 gly/ser 폴리펩타이드 링커는 화학식 (Gly4Ser)n의 링커이며, 여기에서 n은 양의 정수 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)이다. 그 밖의 다른 폴리펩타이드 링커도 본 기술분야에서 공지되어 있다. 단일 쇄 가변 부분 서열을 갖는 항체 (예를 들어, 단일 쇄 Fv 항체) 및 상기의 단일 쇄 항체를 제조하는 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다 [참조: 예를 들어, Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837].
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드에서 사용된 scFv 분자는 안정화된 scFv 분자이다. 하나의 구체예에서, 안정화된 cFv 분자는 VH 영역과 VL 영역 사이에 개재된 scFv 링커를 포함할 수 있으며, 여기에서 VH 및 VL 영역은 VH 내의 아미노산과 VL 영역 내의 아미노산 사이의 디설파이드 결합에 의해서 연결된다. 다른 구체예에서, 안정화된 scFv 분자는 최적화된 길이 또는 조성을 갖는 scFv 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 안정화된 scFv 분자는 적어도 하나의 안정화 아미노산 치환(들)을 갖는 VH 또는 VL 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 안정화된 scFv 분자는 적어도 2 개의 상기 열거된 안정화 특징을 가질 수 있다. 안정화된 scFv 분자는 개선된 단백질 안정성을 갖거나, 개선된 단백질 안정성을 이것이 작동적으로 연결된 결합 폴리펩타이드에 부여한다. 본 발명의 바람직한 scFv 링커는 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 열안정성을 통상적인 결합 폴리펩타이드에 비해서 적어도 약 2℃ 또는 3℃까지 개선시킨다. 비교는 예를 들어, 본 발명의 scFv 분자들 사이에서 이루어질 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 안정화된 scFv 분자는 (Gly4Ser)4 scFv 링커, 및 VH 아미노산 44와 VL 아미노산 100을 연결시키는 디설파이드 결합을 포함한다. 본 발명의 결합 폴리펩타이드에서 사용될 수 있는 그 밖의 다른 예시적인 안정화된 scFv 분자는 각각 본 명세서에 온전히 참고로 포함되어 있는 2006년 12월 8일에 출원된 미국 가특허출원 제60/873,996호 또는 2007년 3월 19일에 출원된 미국 특허출원 제11/725,970호에 기술되어 있다.
특정한 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 C-말단 및/또는 N-말단에 작동적으로 연결된 (예를 들어, 화학적으로 컨쥬게이트되거나, 유전적으로-융합된 (예를 들어, 직접 융합되거나, 폴리펩타이드 링커를 통해서 융합된)) 적어도 하나의 scFv 분자를 포함한다. 하나의 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 힌지 영역 또는 그의 일부분 (예를 들어, IgG1 힌지 또는 그의 일부분, 예를 들어, 인간 IgG1 힌지)을 통해서 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분의 N-말단 (또는 C-말단)에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 scFv 분자 (예를 들어, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자)를 포함한다. 예시적인 힌지 영역 부분은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGG를 포함한다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 2개 이상의 scFv 분자가 연속하여 융합함으로써 형성된 4가 결합 부위 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, scFv 분자는 제1 scFv 분자가 그의 N-말단에서 (예를 들어, 폴리펩타이드 링커 (예를 들어, gly/ser 폴리펩타이드 링커)를 통해서) 동일하거나 상이한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 추가의 scFv 분자에 작동적으로 연합되도록 조합된다. scFv 분자의 탠덤 어레이는 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 N-말단 및/또는 C-말단에 작동적으로 연결되어 본 발명의 결합 폴리펩타이드를 형성한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 scFv 분자가 (예를 들어, 폴리펩타이드 링커를 통해서) 항원 결합 단편 (예를 들어, Fab 단편)에 작동적으로 연결함으로써 형성된 4가 결합 부위 또는 부분을 포함한다. 상기의 4가 결합 부위 또는 부분은 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 N-말단 및/또는 C-말단에 작동적으로 연결되어 본 발명의 결합 폴리펩타이드를 형성한다.
(d) 변형된 항체
다른 관점에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 항체의 변형된 형태로부터 유도된 항원 결합 부위 또는 그의 일부분을 포함할 수 있다. 이러한 형태의 예로는 예를 들어, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 나노바디, 카멜리드, Dabs, 4가 항체, 인트라디아바디 (intradiabodies) [예를 들어, Jendreyko et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:47813], 융합 단백질 (예를 들어, 항체 사이토킨 융합 단백질, Fc 수용체의 적어도 일부분에 융합된 단백질), 및 이중특이성 항체가 포함된다. 그 밖의 다른 변형된 항체는 예를 들어, 문헌 [미국 특허 제4,745,055호; EP 256,654; Faulkner et al., Nature 298:286 (1982); EP 120,694; EP 125,023; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979); Kohler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); EP 255,694; EP 266,663; 및 WO 88/03559]에 기술되어 있다. 재집합된 (reassorted) 면역글로불린 쇄도 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,444,878호; WO 88/03565; 및 EP 68,763 및 여기에 인용된 문헌을 참고로 한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 미니바디 또는 그로부터 유도된 항원 결합 부위인 항원 결합 부위 또는 부분을 포함한다. 미니바디는 각각 폴리펩타이드 링커를 통해서 CH3 영역 또는 그의 일부분에 융합된 scFv 분자를 포함하는 2 개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 이량체 분자이다. 미니바디는 본 기술분야에서 설명된 방법 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,837,821호 또는 WO 94/09817A1]을 사용하여 scFv 성분 및 폴리펩타이드 링커-CH3 성분을 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 이들 성분은 별개의 플라스미드로부터 제한 단편으로서 분리된 다음에, 결찰하고 적절한 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 내에서 재클로닝할 수 있다. 적절한 조립체 (예를 들어, 단량체 미니바디 폴리펩타이드 쇄를 코드화한 개방 판독 프레임 (ORF)의)는 제한 분해 및 DNA 서열 분석에 의해서 확인될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)에 작동적으로 연결된 미니바디의 scFv 성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 결합 부위 또는 부분으로서 4가 미니바디를 포함한다. 4가 미니다비는 2 개의 scFv 분자를 폴리펩타이드 링커를 사용하여 연결시키는 것을 제외하고는 미니바디와 동일한 방식으로 구성될 수 있다. 연결된 scFv-scFv 구조물은 그 후에, 유전적으로-융합된 Fc 부분에 (즉, scFc 부분에) 작동적으로 연결되어 본 발명의 결합 폴리펩타이드를 형성한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 디아바디 또는 그로부터 유도된 항원 결합 부위인 항원 결합 부위 또는 부분을 포함한다. 디아바디는 동일한 폴리펩타이드 쇄 상의 VL 및 VH 영역이 상호작용할 수 없도록 각각 scFv 분자와 유사한 폴리펩타이드를 갖지만, 일반적으로 가변 영역 둘 다를 접속시키는 더 짧은 (예를 들어, 10개 미만, 바람직하게는 1-5 개) 아미노산 잔기 링커를 갖는 이량체 4가 분자이다. 대신에, 하나의 폴리펩타이드 쇄의 VL 및 VH 영역은 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VH 및 VL 영역 (각각)과 상호작용한다 [참조: 예를 들어, WO 02/02781]. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 N-말단 및/또는 C-말단에 작동적으로 연결된 디아바디를 포함한다.
특정의 구체예에서, 결합 분자는 scFc에 연결된 단일 영역 결합 분자 (예를 들어, 단일 영역 항체)를 포함한다. 예시적인 단일 영역 분자에는 경쇄 가변 영역이 없는 항체의 분리된 중쇄 가변 영역 (VH), 즉, 중쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역이 없는 항체의 분리된 경쇄 가변 영역 (VL), 즉, 경쇄 가변 영역이 포함된다. 본 발명의 결합 분자에서 사용된 단일-영역 항체의 예로는 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), 및 Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)]에 기술된 바와 같은 카멜리드 중쇄 가변 영역 (약 118 내지 136 개의 아미노산 잔기)이 포함된다. 그 밖의 다른 예시적인 단일 영역 항체에는 Dabs®(Domantis Ltd., Cambridge, UK)로 또한 공지되어 있는 단일 VH 또는 VL 영역이 포함된다. 또 다른 단일 영역 항체에는 상어 항체 (예를 들어, 상어 Ig-NARs)가 포함된다. 상어 Ig-NARs는 하나의 가변 영역 (V-NAR) 및 5 개의 C-유사 불변 영역 (C-NAR)을 포함하며, 여기에서 다양성은 길이가 5 내지 23 개의 잔기로 변하는 연장된 CDR3 부분에 집중된다. 카멜리드 종 (예를 들어, 야마)에서, VHH로 불리는 중쇄 가변 부분은 전체 항원-결합 영역을 형성한다. 카멜리드 VHH 부분과 통상적인 항체로부터 유도된 영역 (VH) 사이의 주된 차이점에는 (a) VHH 내의 상응하는 부분과 비교하여 VH의 경쇄 접촉 표면에서의 더 소수성인 아미노산, (b) VHH 내의 더 긴 CDR3, 및 (c) VHH 내에서 CDR1과 CDR3 사이의 디설파이드 결합의 빈번한 출현이 포함된다. 단일 영역 결합 분자를 제조하는 방법은 미국 특허 제6.005,079 및 6,765,087호에 기술되어 있으며, 이 두 가지는 모두 본 명세서에 참고로 포함된다. VHH 영역을 포함하는 예시적인 단일 영역 항체에는 나노바디 (Nanobodies®)(Ablynx NV, Ghent, Belgium)가 포함된다.
(e) 비-면역글로불린 결합 분자
특정한 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 비-면역글로불린 결합 분자로부터 유도된 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "비-면역글로불린 결합 분자"는 그의 결합 부위가 면역글로불린 이외의 폴리펩타이드로부터 유도되며, 원하는 결합 특이성을 부여하도록 조작 (예를 들어, 돌연변이유발)될 수 있는 부분 (예를 들어, 스캐폴드 또는 골격구조)를 포함하는 결합 분자이다.
항체 분자로부터 유도되지 않은 결합 부위를 포함하는 결합 분자의 다른 예로는 이하에 더 상세히 언급되는 수용체 결합 부위 및 리간드 결합 부위가 포함된다.
비-면역글로불린 결합 분자는 면역글로불린이 아닌 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원 (예를 들어, T-세포 수용체 또는 세포-유착 부분 (예를 들어, CTLA-4, N-CAM, 텔로킨 (telokin)))으로부터 유도된 결합 부위 부분을 포함할 수 있다. 이러한 결합 면역글로불린 폴드의 배치를 유지하며, IGF1-R 에피토프를 특이적으로 결합시킬 수 있는 결합 부위 부분을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 비-면역글로불린 결합 분자는 또한, 면역글로불린 폴드를 기초로 하지 않지만 (예를 들어, 안키린 (ankyrin) 반복 단백질 또는 피브로넥틴과 같음), 그럼에도 불구하고 표적 (예를 들어, IGF-1R 에피토프)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 토폴로지를 갖는 결합 부위를 포함한다.
비-면역글로불린 결합 분자는 인공적으로 다양화된 결합 부위를 갖는 결합 분자의 라이브러리로부터 표적-결합 변이체를 선택 또는 분리함으로써 확인될 수 있다. 다양화된 라이브러리는 완전히 무작위적인 접근방법 (예를 들어, 실수-유발 (error-prone) PCR, 엑손 셔플링, 또는 유도 진화)을 사용하거나, 본 기술분야에서 인지된 디자인 전략의 도움을 받아 생성될 수 있다. 예를 들어, 결합 부위가 그의 동족성 표적 분자와 상호작용하는 경우에 통상적으로 수반되는 아미노산 위치는 결합 부위를 코드화한 핵산 내의 상응하는 위치에 퇴화 코돈, 트리뉴클레오타이드, 무작위 펩타이드, 또는 완전한 루프를 삽입함으로써 무작위화될 수 있다 [참조: 예를 들어, 미국 공개 제20040132028호]. 아미노산 위치의 지역은 표적 분자와의 컴플렉스 내에서 결합 부위의 결정 구조를 조사함으로써 확인될 수 있다. 무작위화를 위한 후보 위치에는 결합 부위의 루프, 평평한 표면, 나선 및 결합 공간이 포함된다. 특정의 구체예에서, 다양화를 위해서 유망한 후보인 결합 부위 내의 아미노산은 그의 면역글로불린 폴드와의 상동성에 의해서 확인될 수 있다. 예를 들어, 피브로넥틴의 CDR-유사 루프 내의 잔기를 무작위화시켜 피브로넥틴 결합 분자의 라이브러리를 생성시킬 수 있다 [참조: 예를 들어, Koide et al., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151 (1998)]. 무작위화될 수 있는 결합 부위의 다른 부분에는 평평한 표면이 포함된다. 무작위화시킨 후에, 다양화된 라이브러리는 이어서 원하는 결합 특징, 예를 들어, 상기에 기술한 IGF-1R 에피토프에 대한 특이적 결합을 갖는 결합 분자를 수득하기 위한 선택 또는 스크리닝 절차에 적용할 수 있다. 예를 들어, 선택은 파아지 디스플레이, 효모 디스플레이, 또는 리보좀 디스플레이와 같은 본 기술분야에서 인지된 방법에 의해서 이루어질 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 피브로넥틴 결합 분자로부터의 결합 부위를 포함한다. 피브로넥틴 결합 분자 (예를 들어, 피브로넥틴 I, II, 또는 III 형 영역을 포함하는 분자)는 면역글로불린과는 대조적으로 쇄-내 디설파이드 결합에 의존하지 않는 CDR-유사 루프를 나타낸다. 피브로넥틴 결합 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 WO 01/64942 및 미국 특허 제6,673,901, 6,703,199, 7,078,490, 및 7,119,171호에 기술되어 있다. 하나의 예시적인 구체예에서, 피브로넥틴 결합 폴리펩타이드는 애드넥틴 (AdNectin®)(Adnexus Therpaeutics, Waltham, MA)이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 아피바디 (Affibody®)(Abcam, Cambridge, MA)로부터의 결합 부위를 포함한다. 아피바디는 스타필로코커스 단백질 A (SPA)의 면역글로불린 결합 영역으로부터 유도된다 [참조: 예를 들어, Nord et al., Nat. Biotechnol., 15: 772-777 (1997)]. 본 발명에서 사용된 아피바디 결합 부위는 SPA의 영역 (예를 들어, 영역 B)으로부터 유도된 SPA-관련된 단백질 (예를 들어, 단백질 Z)을 돌연변이유발하고, IGF-1R 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 돌연변이체 SPA-관련된 폴리펩타이드에 대해서 선택함으로써 합성될 수 있다. 아피바디 결합 부위를 제조하는 다른 방법은 각각 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,740,734 및 6,602,977호 및 WO 00/63243에 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 안티칼린 (Anticalin®)(Pieris AG, Friesing, Germany)으로부터의 결합 부위를 포함한다. 안티칼린 (또한, 리포칼린 (lipocalins)으로도 공지됨)은 그의 기능이 그들의 배럴 (barrel)/루프 부분에서 표적 분자를 결합시키는 것인 다양한 β-배럴 단백질 패밀리의 구성원이다. 리포칼린 결합 부위는 배럴의 스트랜드를 접속시키는 루프 서열을 무작위화시킴으로써 IGF-1R 에피토프를 결합시키도록 조작될 수 있다 [참조: 예를 들어, Schlehuber et al., Drug Discov. Today, 10: 23-33 (2005); Beste et al., PNAS, 96: 1898-1903 (1999)]. 본 발명의 결합 분자에서 사용된 안티칼린 결합 부위는 피에리스 브라시카 (Pieris brassica)의 빌린-결합 단백질 (BBP)의 아미노산 위치 28 내지 45, 58 내지 69, 86 내지 99 및 114 내지 129에 상응하는 선형 폴리펩타이드 서열의 서열 위치에 상응하는 4 개의 절편 내에서 돌연변이된 리포칼린의 폴리펩타이드로부터 출발하여 수득될 수 있다. 안티칼린 결합 부위를 제조하는 다른 방법은 각각 본 명세서에 참고로 포함된 WO99/16873 및 WO 05/019254에 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 시스테인-풍부 폴리펩타이드로부터의 결합 부위를 포함한다. 본 발명의 실시에 사용된 시스테인-풍부 영역은 일반적으로 α-나선, β 시트 또는 β-배럴 구조를 형성하지 않는다. 일반적으로, 디설파이드 결합은 영역이 삼차원 구조로 폴딩하는 것을 촉진시킨다. 통상적으로, 시스테인-풍부 영역은 적어도 2 개의 디설파이드 결합, 더욱 일반적으로 적어도 3 개의 디설파이드 결합을 갖는다. 예시적인 시스테인-풍부 폴리펩타이드는 A 영역 단백질이다. A-영역 (때때로, "보체-유형 반복체"라 불림)은 약 30-50 또는 30-65 개의 아미노산을 함유한다. 일부의 구체예에서, 이 영역은 약 35-45 개의 아미노산, 일부의 경우에는 약 40 개의 아미노산을 포함한다. 30-50 개의 아미노산 내에는 약 6 개의 시스테인 잔기가 존재한다. 6 개의 시스테인 중에서, 디설파이드 결합은 일반적으로 다음의 시스테인 사이에서 발견된다: C1 및 C3, C2 및 C5, C4 및 C6. A 영역은 리간드 결합 부위를 구성한다. 영역의 시스테인 잔기는 디설파이드 연결되어 콤팩트 (compact)하고, 안정하며, 기능적으로 독립적인 부위를 형성한다. 이들 반복체의 클러스터는 리간드 결합 영역을 구성하며, 차등적 클러스터링은 리간드 결합에 관하여 특이성을 부여할 수 있다. A-영역을 함유하는 단백질의 예로는 예를 들어, 보체 성분 (예를 들어, C6, C7, C8, C9, 및 인자 I), 세린 프로테아제 (예를 들어, 엔테로펩티다제, 마트립타제 및 코린), 경막 단백질 (예를 들어, ST7, LRP3, LRP5 및 LRP6) 및 세포내이입성 수용체 (예를 들어, 소르틸린-관련된 수용체, LDL-수용체, VLDLR, LRP1, LRP2, 및 ApoER2)가 포함된다. 원하는 결합 특이성의 A 영역 단백질을 제조하는 방법은 예를 들어, 각각 본 명세서에 참고로 포함된 WO 02/088171 및 WO 04/044011에 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 반복 단백질로부터의 결합 부위를 포함한다. 반복 단백질은 인접하는 영역을 형성하도록 함께 스태킹된 (stack) 작은 (예를 들어, 약 20 내지 약 40 개의 아미노산 잔기) 구조적 단위 또는 반복체의 연속적인 카피 (copies)를 포함한다. 반복 단백질은 단백질 내의 반복체의 수를 조정함으로써 특정한 표적 결합 부위에 적합하도록 변형될 수 있다. 반복 단백질의 예로는 디자인된 안키린 반복 단백질 (즉, 다르핀즈 (DARPins®), Molecular Partners, Zurich, Switzerland) [참조: 예를 들어, Binz et al., Nat. Biotechnol., 22: 575-582 (2004)] 또는 로이신-풍부 반복 단백질 (즉, LRRPs) [참조: 예를 들어, Pancer et al., Nature, 430: 174-180 (2004)]이 포함된다. 안키린 반복 단위의 지금까지 측정된 모든 삼차 구조는 2 개의 역평행 α-나선으로 이어지며, 반복 단위를 다음 단위와 접속시키는 루프에 의해서 코드화한 β-헤어핀으로 구성된 특징을 분담한다. 안키린 반복 단위로 구성된 영역은 반복 단위를 연장되고 만곡된 구조에 스태킹함으로써 형성된다. LRRP 결합 부위는 바다칠성장어 및 그 밖의 다른 무악류 물고기의 적응성 면역계의 일부분으로부터 유래하며, 이들이 림프구 성숙 중에 한 조의 로이신-풍부 반복 유전자의 재조합에 의해서 형성된 항체와 유사하다. 다르핀 또는 LRRP 결합 부위를 제조하는 방법은 각각 본 명세서에 참고로 포함된 WO 02/20565 및 WO 06/083275에 기술되어 있다.
본 발명의 결합 분자에서 사용될 수 있는 다른 비-면역글로불린 결합 부위는 Src 상동상 영역 (예를 들어, SH2 또는 SH3 영역), PDZ 영역, 베타-락타마제, 고친화성 프로테아제 억제제, 또는 스코르핀 독소와 같은 작은 디설파이드 결합 단백질 스캐폴드로부터 유도된 결합 부위를 포함한다. 이들 분자로부터 유도된 결합 부위를 제조하는 방법은 본 기술분야에서 공개되어 있다 [참조: 예를 들어, Silverman et al., Nat. Biotechnol., 23(12): 1493-4 (2005); Panni et al, J. Biol. Chem., 277: 21666-21674 (2002), Schneider et al., Nat. Biotechnol., 17: 170-175 (1999); Legendre et al., Protein Sci., 11:1506-1518 (2002); Stoop et al., Nat. Biotechnol., 21: 1063-1068 (2003); 및 Vita et al., PNAS, 92: 6404-6408 (1995)]. 또 다른 결합 부위는 EGF-유사 영역, 크링글 (Kringle)-영역, PAN 영역, Gla 영역, SRCR 영역, 쿠니츠 (Kunitz)/소 췌장 트립신 억제제 영역, 카잘 (Kazal)-형 세린 프로테아제 억제제 영역, 트레포일 (Trefoil) (P-형) 영역, 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자 C 형 영역, 아나필라톡신-유사 영역, CUB 영역, 티로글로불린 I형 반복체, LDL-수용체 클래스 A 영역, 수시 (Sushi) 영역, 링크 (Link) 영역, 트롬보스폰딘 I형 영역, 면역글로불린-유사 영역, C-형 렉틴 영역, MAM 영역, 본 빌레브란트 인자 A형 영역, 소마토메딘 (Somatomedin) B 영역, WAP-형 4 디설파이드 코어 영역, F5/8 C형 영역, 헤모펙신 (Hemopexin) 영역, 라미닌 (Laminin)-형 EGF-유사 영역, C2 영역, CTLA-4 영역, 및 그 밖의 다른 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 공지된 이러한 영역뿐만 아니라 이들의 유도체 및/또는 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 결합 영역으로부터 유도될 수 있다. 추가의 비-면역글로불린 결합 폴리펩타이드에는 아비머스 (Avimers®)(Avidia, Inc., Mountain View, CA - 참조: 국제 PCT 공개 제WO 06/055689호 및 미국 특허공개 제 2006/0234299호), 텔로바디스 (Telobodies®)(Biotech Studio, Cambridge, MA), 에비바디스 (Evibodies®)(Evogenix, Sydney, Australia - 참조: 미국 특허 제7,166,697호), 및 마이크로바디스 (Microbodies®)(Nascacell Technologies, Munich, Germany)가 포함된다.
ii. 수용체 및 리단드의 결합 부분
다른 관점에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 수용체의 리간드 결합 부위 및/또는 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분에 작동적으로 연결된 리간드의 수용체 결합 부분을 포함한다.
특정의 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 수용체의 리간드 결합 부분 및/또는 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)을 갖는 리간드의 수용체 결합 부분의 융합물이다. 리간드 결합 수용체의 모든 경막 부분 또는 지질 또는 인지질 고정자 인식서열은 바람직하게는, 융합하기 전에 불활성화되거나 결실된다. 리간드 또는 리간드 결합 파트너를 코드화한 DNA는 원하는 ORF 절편을 코드화한 DNA의 5' 및 3' 말단에서, 또는 그에 근접하여 제한 효소에 의해 분열된다. 그 후, 생성된 DNA 단편은 유전적으로-융합된 Fc 부분을 코드화한 DNA 내에 쉽게 삽입된다 (예를 들어, 프레임 내에서 결찰된다). 융합이 이루어지는 정확한 부위는 가용성 융합 단백질의 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위하여 경험적으로 선택될 수 있다. 융합 단백질을 코드화한 DNA는 그 후에, 발현을 위한 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있는 적절한 발현 벡터 내에 서브클로닝한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 리간드 또는 수용체 (예를 들어, 수용체의 세포외 영역 (ECD))를 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)과 조합시킨다. 하나의 구체예에서, 리간드 또는 수용체 영역의 결합 영역은 유전적으로-융합된 Fc 부분에 작동적으로 연결될 수 있다 (예를 들어, 폴리펩타이드 링커를 통해서 융합될 수 있다). N-말단 융합도 또한 가능하다. 예시적 구체예에서, 융합은 유전적으로-융합된 Fc 부분의 C-말단에 대해서, 또는 바로 접하여 N-말단은 유전적으로-융합된 Fc 부분의 힌지 영역에 대해서 이루어질 수 있다.
특정의 구체예에서, 수용체의 리간드-결합 부분의 결합 부위 또는 영역은 상기에 기술한 항체 또는 항체 변이체에 의해서 결합된 수용체로부터 유도될 수 있다. 다른 구체예에서, 수용체의 리간드 결합 부분은 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 수용체 (예를 들어, 가용성 T-세포 수용체, 예를 들어, mTCR®(Medigene AG, Munich, Germany), 상기에 기술한 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체 (예를 들어, 이뮤노어드헤신의 가용성 TNFa 수용체, 예를 들어, 엔브렐 (Enbrel®)(Wyeth, Madison, NJ)), 신경교-유래 향신경성 인자 (GDNF) 수용체 패밀리의 수용체 (예를 들어, GFRα3), G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 수용체, 타이로신 키나제 (TK) 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, 리간드-게이트 (LG) 슈퍼패밀리의 수용체, 케모킨 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, IL-1/Toll-유사 수용체 (TLR) 슈퍼패밀리, 및 사이토킨 수용체 슈퍼패밀리로 구성된 군으로부터 선택된 수용체로부터 유도된다.
다른 구체예에서, 리간드의 수용체-결합 부분의 결합 부위 또는 영역은 상기에 기술한 항체 또는 항체 변이체에 의해서 결합된 리간드로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 리간드는 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 수용체, TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 수용체, 타이로신 키나제 (TK) 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, 리간드-게이트 (LG) 슈퍼패밀리의 수용체, 케모킨 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, IL-1/Toll-유사 수용체 (TLR) 슈퍼패밀리, 및 사이토킨 수용체 슈퍼패밀리로 구성된 군으로부터 선택된 수용체를 결합시킬 수 있다. 하나의 예시적인 구체예에서, 리간드의 수용체-결합 부분의 결합 부위는 상기에 기술한 TNF 리간드 슈퍼패밀리에 속하는 리간드 (예를 들어, CD40L)로부터 유도된다.
다른 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 이하의 단백질로부터 유도된 하나 이상의 리간드 결합 영역 또는 수용체 결합 영역을 포함할 수 있다:
1. 사이토킨 및 사이토킨 수용체
사이토킨은 림프구의 증식, 분화 및 기능적 활성화에 대한 다면발현성 효과를 갖는다. 다양한 사이토킨, 또는 그의 수용체 결합 부분이 본 발명의 융합 단백질에서 이용될 수 있다. 예시적인 사이토킨에는 인터로이킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, 및 IL-18), 콜로니 자극인자 (CSFs) (예를 들어, 과립구 CSF (G-CSF), 과립구-대식세포 CSF (GM-CSF), 및 단핵구 대식세포 CSF (M-CSF)), 종양 괴사 인자 (TNF) 알파 및 베타, 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA-4), 및 인터페론-α, β 또는 γ와 같은 인터페론 [미국 특허 제4,925,793 및 4,929,554호]이 포함된다.
사이토킨 수용체는 일반적으로, 리간드-특이적 알파 쇄 및 공통 베타 쇄로 구성된다. 예시적인 사이토킨 수용체에는 GM-CSF, IL-3 (미국 특허 제5,639,605호), IL-4 (미국 특허 제5,599,905호), IL-5 (미국 특허 제5,453,491호), IL10 수용체, IFNα (EP0240975), 및 수용체의 TNF 패밀리 (예를 들어, TNFa (예를 들어, TNFR-1 (EP 417, 563), TNFR-2 (EP 417,014) 림포톡신 베타 수용체)가 포함된다.
2. 유착 단백질
유착 분자는 세포가 서로 상호작용하도록 허용하는 막-결합된 단백질이다. 백혈구 귀환 (homing) 수용체 및 세포 유착 분자를 포함하는 다양한 유착 단백질, 또는 그의 수용체 결합 부분이 본 발명의 융합 단백질 내에 혼입될 수 있다. 백혈구 귀환 수용체는 염증과정 중에 백혈구 세포 표면 상에서 발현되며, 세포외 매트릭스 성분에 대한 결합을 매개하는 β-1 인테그린 (예를 들어, VLA-1, 2, 3, 4, 5, 및 6), 및 혈관 내피 상에서 세포 유착 분자 (CAMs)를 결합시키는 β2-인테그린 (예를 들어, LFA-1, LPAM-1, CR3, 및 CR4)을 포함한다. 예시적인 CAMs에는 ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, 및 MAdCAM-1이 포함된다. 그 밖의 다른 CAMs은 E-셀렉틴, L-셀렉틴, 및 P-셀렉틴을 포함하는 셀렉틴 패밀리의 구성원을 포함한다.
3. 케모킨
감염 부위 쪽으로 백혈구의 이동을 자극하는 화학주성 단백질인 케모킨이 또한, 본 발명의 융합 단백질 내에 혼입될 수도 있다. 예시적인 케모킨에는 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-α 및 MIP-1-β 호중구 화학주성 인자, 및 RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)가 포함된다.
4. 성장 인자 및 성장 인자 수용체
성장 인자 또는 이들의 수용체 (또는 그의 수용체 결합 또는 리간드 결합 부분)는 본 발명의 융합 단백질 내에 혼입될 수 있다. 예시적인 성장 인자에는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 그의 이소형태 (미국 특허 제5,194,596호); aFGF 및 bFGF를 포함하는 섬유아세포 성장 인자 (FGF); 심방 나트륨이뇨성 인자 (ANF); 간성 성장 인자 (HGFs; 미국 특허 제5,227,158 및 6,099,841호), 골-유도된 신경영양성 인자 (BDNF)와 같은 신경영양성 인자, 신경교세포 유도된 신경영양성 인자 리간드 (예를 들어, GDNF, 뉴투린, 아르테민 및 페르세핀), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 NGF-β 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF) (미국 특허 제4,889,919, 4,845,075, 5,910,574, 및 5,877,016호)와 같은 신경 성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타 (WO 90/14359)와 같은 변형 성장 인자 (TGF), 골 형태형성 단백질 (BMP)을 포함하는 골유도성 인자; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II; 미국 특허 제6,403,764 및 6,506,874호); 에리트로포이에틴 (EPO); 트롬보포이에틴 (TPO; 줄기-세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO, c-Mpl 리간드), 및 Wnt 폴리펩타이드 (미국 특허 제6,159,462호)이 포함된다.
본 발명의 표적화 수용체 영역으로 사용될 수 있는 성장 인자 수용체의 예로는 EGF 수용체; VEGF 수용체 (예를 들어, Flt1 또는 Flk1/KDR), PDGF 수용체 (WO 90/14425); HGF 수용체 (미국 특허 제5,648,273 및 5,686,292호), 및 NGF, BDNF, 및 NT-3을 결합시키는, p75NTR 또는 p75로 불리는 저친화성 수용체 (LNGFR), 및 수용체 타이로신 키나제의 trk 패밀리의 구성원인 고친화성 수용체 (예를 들어, trkA, trkB (EP 455,460), trkC (EP 522,530))를 포함하는 신경영양성 수용체가 포함된다.
5. 호르몬
본 발명의 융합 단백질에서 표적화제로 사용하기 위한 예시적인 성장 호르몬에는 레닌, 인간 성장 호르몬 (HGH; 미국 특허 제5,834,598호), N-메티오닐 인간 성장 인자; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬 (PTH); 갑상선 자극 호르몬 (TSH); 티록신; 프로인슐린 및 인슐린 (미국 특허 제5,157,021 및 6,576,608호); 난포 자극 호르몬 (FSH); 칼시토닌, 황체형성 호르몬 (LH), 렙틴, 글루카곤; 봄베신; 소마트로핀; 뮬러-억제성 (mullerian-inhibiting) 물질; 릴랙신 및 프로릴랙신; 고나도트로핀-연관된 펩타이드; 프로락틴; 태반성 락토겐; OB 단백질; 또는 뮬러-억제성 물질이 포함된다.
6. 응고 인자
본 발명의 융합 단백질에서 표적화제로 사용하기 위한 혈액 응고 인자의 예로는 응고 인자 (예를 들어, 인자 V, VII, VIII, IX, X, XI, XII 및 XIII, 폰 빌레브란트 인자); 조직 인자 (미국 특허 제5,346,991, 5,349,991, 5,726,147 및 6,596,84호); 트롬빈 및 프로트롬빈; 피브린 및 피브리노겐; 플라즈민 및 플라즈미노겐; 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-형 플라즈미노겐 활성화제 (t-PA)와 같은 플라즈미노겐 활성화제가 포함된다.
하나의 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 가용성 LTβR 수용체 및 scFc 부분을 포함하는 융합 단백질 또는 이뮤노어드헤신이다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 37 (ASK057)의 중쇄 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 인터페론 (예를 들어, β-인터페론) 및 scFc 부분을 포함하는 융합 단백질 또는 이뮤노어드헤신이다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 39 (EAG2149)의 중쇄 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 가용성 LTβR 수용체 및 scFc 부분을 포함하는 융합 단백질 또는 이뮤노어드헤신이다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 41 (EAG2190) 또는 SEQ ID NO:43 (EAG2191)의 중쇄 서열을 포함할 수 있다.
III. 다중특이성 결합 폴리펩타이드
어떤 특정한 관점에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다중특이성이며, 즉 제1 분자 또는 분자의 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 결합 부위, 및 제2 분자 또는 제1 분자의 제2 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 제2 결합 부위를 갖는다. 본 발명의 다중특이성 결합 분자는 적어도 2 개의 결합 부위를 포함할 수 있으며, 여기에서 결합 부위 중의 적어도 하나는 상기에 기술한 결합 분자 중의 하나로부터의 결합 부위로부터 유도되거나, 이 결합 부위를 포함한다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 다중특이성 결합 분자의 적어도 하나의 결합 부위는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 상기에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편)의 항원 결합 부분이다.
(a) 이중특이성 분자
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 이중특이성이다. 이중특이성 결합 폴리펩타이드는 예를 들어, 동일한 표적 분자 상의, 또는 상이한 표적 분자 상의 2 개의 상이한 표적 부위에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 경우에, 그의 이중특이성 변이체는 예를 들어, 동일한 항원 상의 또는 2 개의 상이한 항원 상의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 결합 폴리펩타이드는 예를 들어, 진단적 및 치료학적 적용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들을 사용하여 면역학적검정법에서 사용하기 위한 효소를 고정화시킬 수 있다. 이들은 또한, 둘 다를 종양 연관된 분자 및 검출가능한 마커 (예를 들어, 방사성 핵종을 단단하게 결합시키는 킬레이터)에 결합시킴으로써 암의 진단 및 치료에 사용될 수도 있다. 이중특이성 결합 폴리펩타이드는 또한 예를 들어, 세포독성이 특정의 표적에 향하도록 함으로써 (예를 들어, 병원체 또는 종양 세포에, 그리고 T 세포 수용체 또는 Fcγ 수용체와 같은 세포독성 유발 분자에 결합시킴으로써) 인간 치료를 위해서 사용될 수도 있다. 이중특이성 결합 폴리펩타이드는 또한, 예를 들어, 섬유소 용해제 또는 백신 보조제로서 사용될 수 있다.
이중특이성 결합 폴리펩타이드의 예로는 상이한 종양 세포 항원 쪽으로 향하는 적어도 2 개의 팔을 갖는 것; 종양 세포 항원 쪽으로 향하는 적어도 하나의 팔과 세포독성 유발 분자 쪽으로 향하는 적어도 하나의 팔을 갖는 이중특이성의 변화된 결합 단백질 (예를 들어, 안티-Fc.감마.RI/안티-CD15, 안티-p185.sup.HER2/Fc.감마.RIII (CD16), 안티-CD3/항-악성 B-세포 (1D10), 안티-CD3/안티-p185.sup.HER2, 안티-CD3/안티-p97, 안티-CD3/항-신세포 암종, 안티-CD3/안티-OVCAR-3, 안티-CD3/L-D1 (항-결장 암종), 안티-CD3/항-멜라닌세포 자극 호르몬 유사체, 안티-EGF 수용체/안티-CD3, 안티-CD3/안티-CAMA1, 안티-CD3/안티-CD19, 안티-CD3/MoV18, 항-신경 세포 유착 분자 (NCAM)/안티-CD3, 항-폴레이트 결합 단백질 (FBP)/안티-CD3, 항-팬 암종 (pan carcinoma) 연관된 항원 (AMOC-31)/안티-CD3); 종양 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔 및 독소에 결합하는 적어도 하나의 팔을 갖는 이중특이성 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, 안티-사포린/안티-Id-1, 안티-CD22/안티-사포린, 안티-CD7/안티-사포린, 안티-CD38/안티-사포린, 안티-CEA/안티-리신 A 쇄, 안티-인터페론-.알파.(IFN-.알파.)/안티-하이브리도마 이디오타입 (idiotype), 안티-CEA/항-빈카 알칼로이드); 효소 활성화된 프로드럭을 전환시키기 위한 이중특이성 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, 안티-CD30/항-알칼리성 포스파타제 (미토마이신 포스페이트 프로드럭의 미토마이신 알콜로의 전환반응을 촉진시킴)); 섬유소 용해제로 사용될 수 있는 이중특이성 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, 항-피브린/항-조직 플라즈미노겐 활성화제 (tPA), 항-피브린/항-유로키나제-형 플라즈미노겐 활성화제 (uPA)); 면역 컴플렉스를 세포 표면 수용체에 표적화시키기 위한 이중특이성 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, 항-저밀도 리포단백질 (LDL)/안티-Fc 수용체 (예를 들어, Fc.감마.RI, Fc.감마.RII 또는 Fc.감마.RIII)); 감염성 질병의 치료에 사용하기 위한 이중특이성 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, 안티-CD3/항-단순포진 바이러스 (HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 컴플렉스/항-인플루엔자, 안티-Fc.감마.R/안티-HIV; 안티-CEA/안티-EOTUBE, 안티-CEA/안티-DPTA, 안티-p185HER2/안티- -합텐과 같은 시험관내 또는 생체내에서 종양을 검출하기 위한 이중특이성 결합 폴리펩타이드); 백신 보조제와 같은 이중특이성 결합 폴리펩타이드 [참조: Fanger et al., supra]; 및 진단적 도구로서 이중특이성 결합 폴리펩타이드 (예를 들어, 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-호스래디쉬 (horse radish) 퍼옥시다제 (HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-물질 P, 안티-HRP/안티-FITC, 안티-CEA/안티-.베타.-갈락토시다제 [참조: Nolan et al., supra])가 포함된다. 삼중특이성 폴리펩타이드의 예로는 안티-CD3/안티-CD4/안티-CD37, 안티-CD3/안티-CD5/안티-CD37 및 안티-CD3/안티-CD8/안티-CD37이 포함된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 이중특이성 결합 폴리펩타이드는 CRIPTO-I에 결합하는 하나의 팔을 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 이중특이성 결합 폴리펩타이드는 LTβR에 결합하는 하나의 팔을 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 이중특이성 결합 폴리펩타이드는 TRAIL-R2에 결합하는 하나의 팔을 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 이중특이성 결합 폴리펩타이드는 LTβR에 결합하는 하나의 팔 및 TRAIL-R2에 결합하는 하나의 팔을 갖는다.
본 발명의 다중특이성 결합 폴리펩타이드는 각각의 특이성에 대해서 일가일 수 있거나, 각각의 특이성에 대해서 다가일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 제1 표적 분자와 반응하는 하나의 결합 부위 및 제2 표적 분자와 반응하는 하나의 결합 부위를 포함할 수 있거나, 이것은 제1 표적 분자와 반응하는 2 개의 결합 부위 및 제2 표적 분자와 반응하는 2 개의 결합 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 리간드 또는 수용체의 2개 이상의 결합 영역으로부터의 적어도 2 개의 결합 특이성을 가질 수 있다. 이들은 본질적으로 WO 89/02922 (1989년 4월 6일에 공개됨), EP 314, 317 (1989년 5월 3일에 공개됨), 및 미국 특허 제5,116,964호 (1992년 5월 2일에 허여됨)에 기술된 것과 같은 헤테로이량체, 헤테로트라이머 또는 헤테로테트라머로 조립될 수 있다. 예로는 CD4-IgG/TNF수용체-IgG 및 CD4-IgG/L-셀렉틴-IgG가 포함된다. 마지막에 언급된 분자는 림프구 귀환 수용체 (LHR, L-셀렉틴)의 림프절 결합 기능 및 CD4의 HIV 결합 기능을 조합하며, HIV 감염, 관련된 상태의 예방 또는 치료에, 또는 진단제로서 잠재적 적용성을 나타낸다.
(b) scFv 함유 다중특이성 결합 분자
하나의 구체예에서, 본 발명의 다중특이성 결합 분자는 적어도 하나의 scFv 분자, 예를 들어, 상기에 기술한 scFv 분자를 포함하는 다중특이성 결합 분자이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 다중특이성 결합 분자는 2 개의 scFv 분자, 예를 들어, 이중특이성 scFv (Bis-scFv)를 포함한다. 특정의 구체예에서, scFv 분자는 통상적인 scFv 분자이다. 다른 구체예에서, scFv 분자는 상기에 기술한 안정화된 scFv 분자이다. 특정의 구체예에서, 다중특이성 결합 분자는 scFv 분자 (예를 들어, 안정화된 scFv 분자)를 scFc 분자를 포함하는 결합 분자 스캐폴드와 연결시킴으로써 생성될 수 있다. 하나의 구체예에서, 출발 분자는 상기에 기술한 결합 분자로부터 선택되며, scFv 분자와 출발 결합 분자는 상이한 결합 부위를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 제2 결합 특이성을 부여하는 제2 scFv 분자 또는 비-scFv 결합 분자에 연결된 제1 결합 특이성을 갖는 scFv 분자를 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 안정화된 scFv 분자가 융합된 천연적으로 존재하는 항체이다.
안정화된 scFv가 모 결합 분자에 연결되는 경우에, 안정화된 scFv 분자의 연결은 바람직하게는, 결합 분자의 열안정성을 적어도 약 2℃ 또는 3℃까지 개선시킨다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 scFv 함유 결합 분자는 통상적인 결합 분자에 비해서 1℃ 개선된 열안정성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 통상적인 결합 분자에 비해서 2℃ 개선된 열안정성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 통상적인 결합 분자에 비해서 4, 5, 6℃ 개선된 열안정성을 갖는다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 다중특이성 결합 분자는 적어도 하나의 scFv (예를 들어, 2, 3, 또는 4 개의 scFvs, 예를 들어, 안정화된 scFvs)를 포함한다. scFv 분자에 관한 더 상세한 사항은 본 명세서에 참고로 포함된 USSN 11/725,970에서 볼 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 제1 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 scFv 단편 및 제2 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 scFv를 갖는 다중특이성 다가 결합 분자이다. 바람직한 구체예에서, scFv 분자 중의 적어도 하나는 안정화된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 scFv 4가 결합 분자이다. 바람직한 구체예에서, scFv 분자 중의 적어도 하나는 안정화된다.
(c) 다중특이성 결합 분자 단편
특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 다중특이성 결합 분자 단편으로부터의 결합 부위를 포함할 수 있다. 다중특이성 결합 분자 단편은 이중특이성 Fab2 또는 다중특이성 (예를 들어, 삼중특이성) Fab3 분자를 포함한다. 예를 들어, 다중특이성 결합 분자 단편은 상이한 특이성을 갖는 Fab 또는 scFv 분자의 화학적으로 컨쥬게이트된 다량체 (예를 들어, 이량체, 트라이머, 또는 테트라머)를 포함할 수 있다.
(d) 탠덤 가변 영역 결합 분자
다른 구체예에서, 본 발명의 다중특이성 결합 분자는 탠덤 항원 결합 부위를 포함하는 결합 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 직접 융합되거나 일렬로 연결된 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4개 또는 그 이상)의 가변 중쇄 영역 (VH 영역)을 포함하도록 조작된 항체 중쇄, 및 직접 융합되거나 일렬로 연결된 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4개 또는 그 이상)의 가변 경쇄 영역 (VL 영역)을 포함하도록 조작된 항체 경쇄를 포함할 수 있다. VH 영역은 해당하는 VL 영역과 상호작용하여 일련의 항원 결합 부위를 형성하는데, 여기에서 결합 부위 중의 적어도 2 개는 상이한 에피토프를 결합시킨다. 탠덤 가변 영역 결합 분자는 2개 이상의 중쇄 또는 경쇄를 포함할 수 있으며, 더 높은 차수의 결합가 (예를 들어, 2가 또는 4가)를 갖는다. 탠덤 가변 영역 결합 분자를 제조하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 2007/024715를 참고한다.
(e) 이원적 (dual) 특이성 결합 분자
다른 구체예에서, 본 발명의 다중특이성 결합 분자는 이원적 결합 특이성을 갖는 단일 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이원적 특이성 결합 분자는 2 개의 에피토프와 교차-반응하는 결합 부위를 포함할 수 있다. 이원적 특이성 결합 분자를 생산하기 위한 본 기술분야에서 인지된 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 이원적 특이성 결합 분자는 제1 에피토프 둘 다를 결합시키는 결합 분자에 대해서 스크리닝하고, 분리된 결합 분자를 제2 에피토프에 결합하는 능력에 대해서 스크리닝함으로써 분리될 수 있다.
(f) 다중특이성 융합 단백질
또 다른 구체예에서, 본 발명의 다중특이성 결합 분자는 다중특이성 융합 단백질이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 문구 "다중특이성 융합 단백질"은 적어도 2 개의 결합 특이성을 가지며, 추가로 scFc를 포함하는 융합 단백질 (상기에서 정의한 바와 같음)을 나타낸다. 다중특이성 융합 단백질은 예를 들어, 본질적으로 WO 89/02922 (1989년 4월 6일에 공개됨), EP 314, 317 (1989년 5월 3일에 공개됨), 및 미국 특허 제5,116,964호 (1992년 5월 2일에 허여됨)에 기술된 바와 같은 헤테로이량체, 헤테로트라이머 또는 헤테로테트라머로서 조립될 수 있다. 바람직한 다중특이성 융합 단백질은 이중특이성이다. 특정의 구체예에서, 다중특이성 융합 단백질의 적어도 하나의 결합 특이성은 scFv, 예를 들어, 안정화된 scFv를 포함한다.
그 밖의 다른 다양한 다가 항체 구조물은 예를 들어, PCT 국제출원 제PCT/US86/02269호; 유럽 특허출원 제184,187호; 유럽 특허출원 제171,496호; 유럽 특허출원 제173,494호; PCT 국제공개 제WO 86/01533호; 미국 특허 제4,816,567호; 유럽 특허출원 제125,023호; 문헌 [Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; U.S. Pat. No. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060; 및 Winter and Milstein, Nature, 349, pp. 293-99 (1991)]에 기술된 바와 같이, 일상적인 DNA 재조합 DNA 기술을 사용하여 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 개발될 수 있다. 바람직하게는, 비-인간 항체는 비-인간 항원 결합 영역을 인간 불변 영역과 연결시킴으로써 "인간화"된다 [예를 들어, Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851-55 (1984)].
다가 항체 구조물을 제조하기 위해서 사용될 수 있는 그 밖의 다른 방법은 이하의 문헌에 기술되어 있다: Ghetie, Maria-Ana et al. (2001) Blood 97:1392-1398; Wolff, Edith A. et al. (1993) Cancer Research 53:2560-2565; Ghetie, Maria-Ana et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:7509-7514; Kim, J.C. et al. (2002) Int. J. Cancer 97(4):542-547; Todorovska, Aneta et al. (2001) Journal of Immunological Methods 248:47-66; Coloma M.J. et al. (1997) Nature Biotechnology 15:159-163; Zuo, Zhuang et al. (2000) Protein Engineering (Suppl.) 13(5):361-367; Santos A.D., et al. (1999) Clinical Cancer Research 5:3118s-3123s; Presta, Leonard G. (2002) Current Pharmaceutical Biotechnology 3:237-256; van Spriel, Annemiek et al., (2000) Review Immunology Today 21(8) 391-397.
IV. 결합 폴리펩타이드의 제조
scFc 스캐폴드 내에 혼입시키기 위한 결합 부위를 선택함으로써 본 발명의 결합 분자를 생산하기 위하여 다양한 방법을 이용할 수 있다. 항체로부터 유도되었든, 다른 분자로부터 유도되었든지 원하는 표적 결합 분자를 scFc 스캐폴드에 연결시키는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다.
코드의 변성으로 인하여, 다양한 핵산 서열이 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 코드화할 수 있는 것으로 이해될 수 있을 것이다. 원하는 폴리뉴클레오타이드는 새로운 고체상 DNA 합성에 의해서, 또는 표적 폴리펩타이드를 코드화한 미리 제조된 폴리뉴클레오타이드의 PCR 돌연변이유발에 의해서 생산될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드-매개된 돌연변이유발은 (예를 들어, Fc 변이체 부위 내로) 아미노산 치환을 코드화한 코돈을 도입시키기 위한 치환, 프레임-내 삽입 또는 변화 (예를 들어, 변화된 코돈)을 제조하는 하나의 방법이다. 예를 들어, 출발 폴리펩타이드 DNA는 단일-스트랜드 DNA 원형판 (template)에 대해 원하는 돌연변이를 코드화한 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화시킴으로써 변화된다. 하이브리드화 후에, DNA 폴리머라제를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (primer)를 혼입시키는 원형판의 전체 제2 상보적 스트랜드를 합성한다. 하나의 구체예에서는, 유전적 조작, 예를 들어, 프라이머-기본 PCR 돌연변이유발이 본 발명의 결합 폴리펩타이드를 코드화한 폴리뉴클레오타이드를 생산하기 위하여 본 명세서에서 정의한 바와 같은 변화를 혼입시키는데 충분하다.
그 후, 결합 폴리펩타이드를 코드화한 폴리뉴클레오타이드 서열을 적합한 발현 벡터 내에 삽입하고, 재조합체 발현을 위해서, 다른 식으로는 상기 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에 형질감염시킬 수 있다.
본 발명의 목적에 따라, 다수의 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 이들 발현 벡터는 일반적으로, 에피좀 (episome)으로서, 또는 숙주 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 숙주 유기체 내에서 복제할 수 있다. 발현 벡터는 프로모터 (예를 들어, 천연적으로-연관되거나 이형인 프로모터), 인핸서 (enhancers), 시그날 서열, 스플라이스 (splice) 시그날, 인핸서 요소, 및 전사 종결서열을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵성 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵성 프로모터 시스템이다. 발현 벡터는 또한, 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유도된다. 그 밖의 다른 것은 내부 리보좀 결합 부위를 갖는 폴리시스트론성 시스템의 사용을 수반한다.
통상적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 이들 세포의 검출을 허용하는 선택 마커 (예를 들어, 앰피실린-저항성, 하이그로마이신-저항성, 테트라사이클린 저항성 또는 네오마이신 저항성)를 함유한다 [참조: 예를 들어, Itakura et al., US Patent 4,704,362]. DNA를 그들의 염색체 내에 통합시킨 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입시킴으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 프로토트로피, 살생물제 저항성 (예를 들어, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 저항성에 대하여 제공될 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결될 수 있거나, 공동형질전환에 의해서 동일한 세포 내에 도입시킬 수 있다.
바람직한 발현 벡터는 NEOSPLA (미국 특허 제6,159,730호)이다. 이 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, 복제의 SV40 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 리더 서열을 함유한다. 이 벡터는 불변 및 가변 부분 유전자의 혼입, CHO 세포 내의 형질감염, 이어서 G418 함유 배지 내에서의 선택 및 메토트렉세이트 증폭에 의해서 매우 높은 레벨의 항체 발현을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 벡터 시스템은 또한, 각각 본 명세서에 온전히 참고로 포함된 미국 특허 제5,736,137 및 5,658,570호에 교시되어 있다. 이 시스템은 높은 발현 레벨, 예를 들어, >30 pg/세포/일을 제공한다. 그 밖의 다른 예시적인 벡터 시스템은 예를 들어, 미국 특허 제6,413,777호에 기술되어 있다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드가 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 경우에, 임의로 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)에 연결된 추가의 경쇄 및 중쇄 가변 부분을 코드화한 폴리뉴클레오타이드는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 면역글로불린 쇄를 코드화한 DNA 절편은 면역글로불린 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 조절 서열에 작동적으로 연결된다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 폴리시스트론성 구조물을 사용하여 발현될 수 있다. 이들 발현 시스템에서, 다량체 결합 단백질의 다수의 결합 폴리펩타이드와 같은 관심이 있는 다수의 유전자 생성물이 단일 폴리시스트론성 구조물로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는, 내부 리보좀 이입 부위 (internal ribosome entry site; IRES)를 사용하여 진핵성 숙주 세포 내에서 본 발명의 폴리펩타이드의 비교적 높은 레벨을 제공한다. 상화성 IRES 서열은 또한, 본 명세서에 포함되어 있는 미국 특허 제6,193,980호에 기술되어 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 이러한 발현 시스템을 사용하여 본 발명에 기술된 폴리펩타이드의 전체 범위를 효과적으로 생산할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
더욱 일반적으로, 일단 결합 폴리펩타이드를 코드화한 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 즉, 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 숙주 세포 내로 플라스미드의 도입은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 다양한 기술에 의해서 이루어질 수 있다. 이들에는 형질감염 (전기영동 및 전기천공을 포함), 원형질 융합, 칼슘 포스페이트 침전, 엔벨로프형 (enveloped) DNA와의 세포 융합, 미량주사, 및 온전한 바이러스에 의한 감염이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다 [참조: Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)]. 가장 바람직하게는, 숙주 내로의 플라스미드 도입은 전기천공에 의해서 이루어진다. 형질전환된 세포를 경쇄 및 중쇄의 생산에 적절한 조건 하에서 성장시키고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해서 시험한다. 시험기술의 예로는 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA), 방사성면역측정법 (RIA) 또는 형광-활성화 세포 분류 분석 (FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "형질전환"은 광범한 의미로서, 유전자형을 변화시키며, 따라서 수용주 세포 내에서 변화를 야기하는 수용주 숙주 세포 내로의 DNA의 도입을 나타내기 위해서 사용된다.
이들 동일한 세포주와 함께, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성되고, 적어도 하나의 이형 유전자를 코드화한 벡터에 의해서 형질전환된 세포를 의미한다. 재조합 숙주로부터 결합 폴리펩타이드를 분리하기 위한 방법의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 다른 식으로 분명하게 명시되지 않는 한, 결합 폴리펩타이드의 공급원을 나타내기 위해서 상호교환하여 사용된다. 바꾸어 말하면, "세포"로부터 폴리펩타이드의 회수는 스핀다운된 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다.
단백질 발현을 위해서 사용된 숙주 세포주는 가장 바람직하게는 포유동물 기원의 것이며; 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 그 안에서 발현될 원하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정의 숙주 세포주를 선택적으로 결정하는 능력을 갖는 것으로 믿어진다. 숙주 세포주의 예로는 DG44 및 DUXB11 (차이니즈 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA (인간 자궁경부암종), CVI (원숭이 신장 세포주), COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610 (차이니즈 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3 (마우스 섬유아세포), HAK (햄스터 신장 세포주), SP2/O (마우스 골수종), P3x63-Ag3.653 (마우스 골수종), BFA-1c1BPT (소 내피세포), RAJI (인간 림프구) 및 293 (인간 신장)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 일반적으로, 상업적 서비스, 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션, 또는 공개된 문헌으로부터 이용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드를 코드화한 유전자는 또한, 세균 또는 효모와 같은 비-포유동물 세포 또는 식물 세포에서 발현될 수도 있다. 이에 관해서, 세균과 같은 다양한 단세포성 비-포유동물 미생물, 즉 배양 또는 발효 시에 성장할 수 있는 것도 또한, 형질전환될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 형질전환이 가능한 세균에는 에스케리키아 콜라이 또는 살모넬라의 균주와 같은 엔테로박테리아세; 바실루스 서브틸리스와 같은 바실라세; 뉴모코커스; 스트렙토코커스, 및 헤모필루스 인플루엔자의 구성원이 포함된다. 또한, 세균 내에서 발현되는 경우에, 폴리펩타이드는 일반적으로 봉입체의 일부가 되는 것으로 이해될 수 있다. 폴리펩타이드는 분리하고, 정제한 다음에 기능적 분자로 조립되어야 한다.
원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물이 사용될 수도 있다. 사카로마이세스 세레비지에, 또는 통상적인 빵 효모가 진핵성 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용되지만, 다수의 다른 균주들도 통상적으로 이용될 수 있다. 사카로마이세스 내에서의 발현을 위해서는, 예를 들어, 플라스미드 YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]이 통상적으로 사용된다. 이 플라스미드는 이미, 트립토판 중에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 함유하며, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1이다 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 그래서, 효모 숙주 세포 지놈의 특징으로서 trpl 병소의 존재는 트립토판 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 피치아 (Pichia)와 같은 다른 효소 숙주도 또한 사용될 수 있다. 효모 발현 벡터는 원하는 것으로서 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제의 기원, 종결 서열 등을 갖는다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 그 밖의 다른 당분해성 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 다른 것들 중에서도 특히, 알콜 데하이드로게나제, 이소사이토크롬 C, 및 메탄올, 말토즈 및 갈락토즈 이용에 책임이 있는 효소를 포함한다.
대신으로, 폴리펩타이드-코드화 뉴클레오타이드 서열은 유전자이식 동물의 지놈 내로의 도입 및 이어서, 유전자이식 동물의 밀크에서의 발현을 위해서 이식유전자 (transgenes)에 혼입시킬 수 있다 [참조: 예를 들어, Deboer et al., US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489, 및 Meade et al., US 5,849,992]. 적합한 이식유전자는 카제인 또는 베타 락토글로불린과 같은 유선 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서에 의한 작동적 연결로 결합 폴리펩타이드에 대한 코드화 서열을 포함한다.
시험관내 생산은 원하는 폴리펩타이드를 대량으로 제공하도록 증대시키는 것을 허용한다. 조직 배양조건 하에서 포유동물 세포를 배양하기 위한 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 공기리프트 반응기 또는 연속 교반 반응기 내에서의 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어, 중공 섬유, 마이크로캅셀 내에서, 아가로즈 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정화 또는 포착 세포 배양을 포함한다. 필요하고/하거나 원하는 경우에, 폴리펩타이드의 용액은 예를 들어, 합성 힌지 부분 폴리펩타이드의 선택적 생합성 후에, 또는 본 명세서에 기술된 HIC 크로마토그래피 단계 전 또는 후에, 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로즈 상에서의 크로마토그래피 또는 (저-)친화성 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있다. 친화성 태그 서열 (예를 들어, His(6) 태그)을 임의로 폴리펩타이드 내에 부착시키거나 포함시켜 하류에서의 정제를 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 결합 폴리펩타이드가 다량체 단백질 또는 다량체 (예 이량체 결합 폴리펩타이드)를 형성하는 경우에, 다량체 단백질은 단일 벡터 또는 2 개의 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 결합 폴리펩타이드가 별개의 발현 벡터 상에서 클로닝되는 경우에는, 벡터를 공동-형질감염시켜 완전한 전체 단백질의 발현 및 조립을 수득한다. 일단 발현되면, 전체 단백질, 이들의 이량체, 개개 폴리펩타이드 (예를 들어, 결합 폴리펩타이드), 또는 그 밖의 다른 형태를 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등을 포함하는 본 기술분야에서의 표준 절차에 따라서 정제될 수 있다 [참조: 일반적으로, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)]. 약제학적 용도를 위해서는 적어도 약 90 내지 95% 동종성 (homogeneity)의 실질적으로 순수한 단백질이 바람직하며, 98 내지 99% 또는 그 이상의 동종성이 가장 바람직하다.
V. 결합 분자의 정제
하나의 구체예에서, 본 발명은 유전적으로-융합된 Fc 부분을 포함하는 단일-쇄 (즉, 단량체) scFc 결합 분자로부터 떼어내어 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)을 포함하는 이중-쇄 (즉, 이량체) scFc 결합 분자로 발현되는 본 발명의 결합 분자를 정제하는 방법에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 단일-쇄 scFc 결합 분자로부터 떼어내어 이중-쇄 scFc 결합 분자를 정제하는 방법을 제공한다.
하나의 구체예에서, 단일- 및 이중-쇄 scFc 단백질 둘 다를 포함하는 집단은 크기-배제 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있다. 예를 들어, 단일-쇄 scFc 결합 분자는 예를 들어, 슈퍼덱스 (Superdex) 200 겔 여과 칼럼을 사용하여 응집체 및 이중-쇄 scFc 분자로부터 분리될 수 있다. 겔 여과 분획은 예를 들어, 환원 및 비-환원성 SDS-PAGE에 의해서 분석할 수 있으며, 적절한 분획을 합하여 단일- 및 이중-쇄 Fc 집단의 균질한 풀 (pool)을 수득한다. 이들 풀은 예를 들어, 온-라인 (on-line) 광산란 분석을 사용한 분석적 SEC (TSK-겔 G3000 SWXL 칼럼)에 의해서 분자의 동종성 및 분자 질량을 측정하여 더 특정화시킬 수 있다. 본 발명은 또한, 유전적으로-융합된 Fc 영역을 포함하는 이중-쇄 scFc 결합 분자 (즉, 이량체 scFc 결합 분자)의 정제된 집단뿐만 아니라 유전적으로 융합된 Fc 영역을 포함하는 단일-쇄 scFc 결합 분자 (즉, 단량체 scFc 결합 분자)의 정제된 집단에 관한 것이다.
VI. 기능적 부위의 표지 또는 컨쥬게이션
본 발명의 결합 폴리펩타이드는 비-컨쥬게이트된 형태로 사용될 수 있거나, 예를 들어, 표적 검출을 용이하게 하거나 환자의 영상화 또는 치료를 위해서 다양한 기능적 부위 중의 적어도 하나에 컨쥬게이트될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 정제가 수행되는 경우에, 정제하기 전 또는 후에 표지되거나 컨쥬게이트될 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드는 기능적 부위에 컨쥬게이트될 수 있다 (예를 들어, 조작된 시스테인 잔기를 통해서). 기능적 부위는 바람직하게는, 결합 부위 (예를 들어, 폴리펩타이드 링커 또는 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)의 Fc 부위) 이외의 다른 결합 폴리펩타이드의 일부분에 부착된다.
예시적인 기능적 부위에는 친화성 부위, 및 효과기 부위가 포함된다. 효과기 부위의 예로는 사이토톡신 (예를 들어, 방사성 동위원소, 세포독성 약물, 또는 독소), 치료학적 작용제, 세포증식억제제, 생물학적 독소, 프로드럭, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약제학적 작용제, 면역학적 활성 리간드 (예를 들어, 림포킨 또는 그 밖의 다른 항체, 여기에서 생성된 분자는 신생물 세포 및 T 세포와 같은 효과기 세포 둘 다에 결합한다), PEG, 또는 영상화에 유용한 검출가능한 분자가 포함된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 종양의 혈관신생을 감소시키는 분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 다른 구체예에서, 기술된 조성물은 약물 또는 프로드럭에 커플링된 본 발명의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예는 리신, 젤로닌, 슈도모나스 내독소 또는 디프테리아 독소와 같은 특정의 생물독소 또는 그들의 세포독성 단편에 컨쥬게이트된 본 발명의 폴리펩타이드의 용도를 포함한다. 사용하기 위하여 어떤 컨쥬게이트되거나 비컨쥬게이트된 폴리펩타이드를 선택하느냐 하는 것은 암의 유형 및 단계, 보조 치료 (예를 들어, 화학요법 또는 이부 방사선) 및 환자 조건에 따라서 좌우될 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 본 명세서의 교시 내용에 비추어 이러한 선택을 쉽게 할 수 있다는 것은 이해될 수 있을 것이다.
이전의 연구에서, 동위원소로 표지한 항-종양 항체가 동물 모델에서, 및 일부의 경우에는 인간에게서 고체 종양뿐만 아니라 림프종/백혈병에서의 세포를 파괴하는데 성공적으로 사용되었음을 이해할 수 있을 것이다. 방사성 동위원소의 예로는 다음의 원소가 포함된다: 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re. 방사성 핵종은 핵 DNA에서 다수의 스트랜드 파괴를 야기하여 세포사를 유도하는 이온화 방사선을 생성시킴으로써 작용한다. 치료학적 컨쥬게이트를 생산하기 위해서 사용된 동위원소는 일반적으로, 짧은 경로 길이를 갖는 고에너지 α- 또는 β-입자를 생성시킨다. 이러한 방사성 핵종은 이들이 근접한 세포, 예를 들어, 컨쥬게이트가 부착되거나 이입되는 신생물 세포를 사멸시킨다. 이들은 비-국재화된 세포에 대해서는 거의 또는 전혀 효과를 갖지 않는다. 방사성 핵종은 본질적으로는 비-면역원성이다.
본 발명과 관련한 방사성 표지된 컨쥬게이트의 사용에 관해서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 직접 표지될 수 있거나 (예를 들어, 요오드화를 통해서), 킬레이트화제를 사용함으로써 간접적으로 표지될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 문구 "간접적인 표지" 및 "간접적인 표지 시도"는 둘 다, 킬레이트화제가 결합 폴리펩타이드에 공유적으로 부착되고, 적어도 하나의 방사성 핵종이 킬레이트화제와 회합된 것을 의미한다. 이러한 킬레이트화제는 일반적으로, 이들이 폴리펩타이드 및 방사성 동위원소 둘 다를 결합시키기 때문에 이작용성 킬레이트화제로 불린다. 특히 바람직한 킬레이트화제는 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 ("MX-DTPA") 및 사이클로헥실 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 ("CHX-DTPA") 유도체를 포함한다. 그 밖의 다른 킬레이트화제는 P-DOTA 및 EDTA 유도체를 포함한다. 간접적인 표지를 위한 특히 바람직한 방사성 핵종에는 111In 및 90Y가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 문구 "직접적인 표지" 및 "직접적인 표지 시도"는 둘 다, 방사성 핵종이 폴리펩타이드에 직접 (일반적으로는, 아미노산 잔기를 통해서) 공유적으로 부착된 것을 의미한다. 더욱 구체적으로, 이들 연결 기술은 무작위 표지 및 부위-지시된 표지를 포함한다. 후자의 경우에, 표지는 단지 컨쥬게이트의 Fc 영역 내에 존재하는 N-연결된 당 잔기와 같은 폴리펩타이드 상의 특정한 부위에 대해 지시된다. 추가로, 다양한 직접적인 표지 기술 및 프로토콜이 본 발명에 적합하다. 예를 들어, 테크네튬-99m 표지된 폴리펩타이드는 리간드 교환 방법에 의해서, 또는 퍼테크네이트 (TcO4 -)를 제1 주석 이온 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼 상에 킬레이트화시키고, 폴리펩타이드를 이 칼럼에 적용함으로써, 또는 배취 (batch) 표지 기술에 의해서, 예를 들어, 퍼테크네이트, SnCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트-용액과 같은 완충제 용액, 및 항체를 배양함으로써 제조될 수 있다. 어떤 경우든지, 항체를 직접적으로 표지하는데 바람직한 방사성 핵종은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 직접적인 표지를 위해서 특히 바람직한 방사성 핵종은 타이로신 잔기를 통해서 공유적으로 부착된 131I이다. 본 발명에 따르는 폴리펩타이드는 예를 들어, 방사성 요오드화 나트륨 또는 칼륨, 및 차아염소산 나트륨, 클로라민 T 등과 같은 화학적 산화제, 또는 락토퍼옥시다제, 글루코즈 옥시다제 및 글루코즈와 같은 효소적 산화제에 의해서 유도될 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서는 간접적인 표지 시도가 특히 바람직하다.
킬레이터 (chelators) 및 킬레이터 컨쥬게이트에 관한 특허는 본 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 간소우 (Gansow)의 미국 특허 제4,831,175호는 다치환된 디에틸렌트리아민펜타아세트산 킬레이트 및 이를 함유하는 단백질 컨쥬게이트, 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 간소우의 미국 특허 제5,099,069, 5,246,692, 5,286,850, 5,434,287 및 5,124,471호는 또한, 다치환된 DTPA 킬레이트에 관한 것이다. 이들 특허는 본 명세서에 온전히 포함된다. 상화성 금속 킬레이터의 다른 예는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DPTA), 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸, 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산, 1-옥사-4,7,12,15-테트라아자헵타데칸-4,7,12,15-테트라아세트산 등이다. 사이클로헥실-DTPA 또는 CHX-DTPA가 특히 바람직하며, 이하에 광범하게 예시된다. 아직 발견되지 않은 것을 포함한 또 다른 상화성 킬레이터는 숙련된 전문가에 의해서 쉽게 식별될 수 있으며, 분명하게 본 발명의 범주 내에 포함된다.
공동-계류 중인 미국 출원번호 제08/475,813, 08/475,815 및 08/478,967호에서 킬레이트화를 촉진시키기 위해서 사용된 특이적 이작용성 킬레이터를 포함한 상화성 킬레이터는 바람직하게는, 3가 금속에 대해서 높은 친화성을 제공하고, 증가된 종양-대-비-종양 비 및 감소된 골 섭취뿐만 아니라 표적 부위, 즉 B-세포 림프종 종양 부위에서 방사성 핵종의 더 큰 생체내 체류를 나타내도록 선택된다. 그러나, 이들 특징 모두를 가질 수 있거나 없는 다른 이작용성 킬레이터가 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 종양 치료에 또한 유익할 수 있다.
또한, 본 명세서의 교시 내용에 따라, 결합 폴리펩타이드는 진단적 및 치료적 목적으로 다양한 방사성표지물에 컨쥬게이트될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이를 위하여, 본 명세서에 온전히 참고로 포함된 전술한 공동-계류 중인 출원에는 치료학적 항체를 투여하기 전에 종양의 진단적 "영상화"를 위한 방사성표지된 치료학적 컨쥬게이트가 기술되어 있다. "In2B8" 컨쥬게이트는 이작용성 킬레이터, 즉 1-이소티오시아나토-벤질-3-메틸-DTPA와 1-메틸-3-이소티오시아나토-벤질-DTPA의 1:1 혼합물인 MX-DTPA (디에틸렌-트리아민펜타아세트산)를 통해서 111In에 부착된, 인간 CD20 항원에 대해서 특이적인 쥐 모노클로날 항체, 2B8을 포함한다. 111In은 약 1 내지 약 10 mCi 사이가 검출가능한 독성이 없이 안전하게 투여될 수 있고; 영상화 데이타가 일반적으로 후속 90Y-표지된 항체 분포의 전조가 때문에, 111In이 진단적 방사성 핵종으로 특히 바람직하다. 대부분의 영상화 시험은 5 mCi 111In-표지된 항체를 이용하는데, 이는 이 용량이 안전할 뿐만 아니라 더 낮은 용량에 비해서 증가된 영상화 효율 (최적 영상화는 항체 투여한 후 3 내지 6일 후에 나타난다)을 갖기 때문이다 [참조: 예를 들어, Murray, J. Nuc. Med. 26: 3328 (1985); 및 Carraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67 (1985)].
상기 언급한 바와 같이, 다양한 방사성 핵종이 본 발명에 적용될 수 있으며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 어떤 방사성 핵종이 다양한 환경 하에서 가장 적절한지를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 131I는 표적화된 면역요법을 위해서 사용된 잘 알려진 방사성 핵종이다. 그러나, 131I의 임상적 유용성은 8-일의 물리적 반감기; 혈액 내 및 종양 부위 둘 다에서 요오드화된 항체의 탈할로겐화; 및 종양 내에서의 국재화된 용량 침착에 최적 이하일 수 있는 방출 특징 (예를 들어, 큰 감마 성분)을 포함한 몇 가지의 인자에 의해서 제한될 수 있다. 우수한 킬레이트화제의 출현과 함께, 금속 킬레이트화 그룹을 단백질에 부착시키기 위한 기회는 111In 및 90Y과 같은 다른 방사성 핵종을 이용하는 기회를 증가시켰다. 90Y는 방사성면역요법 적용 시에 이용하는데 몇 가지의 이점을 제공한다: 90Y의 64 시간 반감기는 종양에 의한 항체 축적을 허용하기에 충분히 길며, 예를 들어, 131I과는 달리, 90Y은 조직 내에서 100 내지 1,000 세포 직경의 범위를 가지고, 그의 붕괴 시에 수반되는 감마 조사가 없는 고에너지의 순수한 베타 방출제이다. 더구나, 침투하는 방사선의 최소량은 90Y-표지된 항체의 외래환자 투여를 가능하게 한다. 추가로, 표지된 항체의 내재화가 세포 사멸을 위해서 필요하지는 않으며, 이온화 방사선의 국소적 방출은 표적 분자가 없는 인접한 종양 세포에 대해서 치명적이어야 한다.
본 기술분야에서 숙련된 전문가는 이들 비-방사성 컨쥬게이트가 또한, 컨쥬게이트되는 선택된 작용제에 따라서 다양한 기술을 사용하여 조립될 수도 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 비오틴과의 컨쥬게이트는 예를 들어, 폴리펩타이드를 비오틴 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 같은 비오틴의 활성화된 에스테르와 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커와의 컨쥬게이트는 커플링제, 예를 들어, 상기 열거한 것의 존재 하에서, 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레신-이소티오시아네이트와의 반응에 의해서 제조될 수 있다. 세포증식억제성/세포독성 물질 및 금속 킬레이트와 본 발명의 폴리펩타이드의 컨쥬게이트는 유사한 방식으로 제조된다.
다수의 효과기 분자는 결합 폴리펩타이드가 연결될 수 있는 적합한 기능적 그룹이 없다. 하나의 구체예에서, 효과기 분자, 예를 들어, 약물 또는 프로드럭은 연결 분자를 통해서 결합 폴리펩타이드에 부착된다. 하나의 구체예에서, 연결 분자는 특정한 부위에서 세포독성의 활성화를 허용하는 화학적 결합을 함유한다. 적합한 화학적 결합은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 디설파이드 결합, 산 불안정성 결합, 광불안정성 결합, 펩티다제 불안정성 결합, 설프하이드릴과 말레이미드 그룹 사이에서 형성된 티오에테르 결합, 및 에스테라제 불안정성 결합을 포함한다. 가장 바람직하게는, 연결 분자는 디설파이드 결합 또는 티오에테르 결합을 포함한다. 본 발명에 따르면, 연결 분자는 바람직하게는 반응성 화학적 그룹을 포함한다. 특히 바람직한 반응성 화학적 그룹은 N-석신이미딜 에스테르 및 N-설포석신이미딜 에스테르이다. 바람직한 구체예에서, 반응성 화학적 그룹은 티올 그룹 사이의 디설파이드 결합을 통해서 효과기에 공유적으로 결합될 수 있다. 하나의 구체예에서, 효과기 분자는 티올 그룹을 포함하도록 변형된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는, 티올 그룹이 수소 원자에 결합된 황 원자를 함유하고, 본 기술분야에서는 일반적으로 또한, "--SH" 또는 "RSH"로 표시될 수 있는 설프하이드릴 그룹으로 불린다는 것을 이해할 것이다.
하나의 구체예에서, 연결 분자는 효과기 분자를 본 발명의 결합 폴리펩타이드와 결합시키기 위해서 사용될 수 있다. 연결 분자는 분열가능하거나 분열할 수 없을 수 있다. 하나의 구체예에서, 분열가능한 연결 분자는, 연결 분자가 세포질 및 유리 설프하이드릴 그룹을 갖는 분자의 더 높은 농도를 갖는 다른 부분과 같은 더 낮은 산화환원 전위를 갖는 환경에서 분열가능하도록, 산화환원-분열가능한 연결 분자이다. 산화환원 전위에서의 변화로 인하여 분열될 수 있는 연결 분자의 예로는 디설파이드를 함유하는 것이 포함된다. 분열성 자극은 본 발명의 결합 단백질의 세포내 섭취에 의해서 제공될 수 있으며, 여기에서 세포질의 더 낮은 산화환원 전위는 연결 분자의 분열을 촉진시킨다. 또 다른 구체예에서, pH의 감소는 메이탄시노이드 카고 (maytansinoid cargo)의 표적 세포 내로의 방출을 유발한다. pH의 감소는 엔도좀 트래피킹 (endosome trafficking), 종양 성장, 염증 및 심근 허혈과 같은 다수의 생리적 및 병리적 과정에 연루된다. pH는 생리학적인 7.4로부터 엔도좀에서는 5-6으로, 또는 라이소좀에서는 4-5로 떨어진다. 암 세포의 라이소좀 또는 엔도좀을 표적화하기 위해서 사용될 수 있는 산 민감성 연결 분자의 예로는 아세탈, 케탈, 오르토에스테르, 하이드라존, 트리틸, 시스-아코니틸, 또는 티오카바모일과 같은 산-분열가능한 결합이 포함된다 [참조: 예를 들어, Willner et al., (1993), Bioconj. Chem., 4: 521-7; 미국 특허 제4,569,789, 4,631,190, 5,306,809, 및 5,665,358호]. 그 밖의 다른 예시적인 산-민감성 연결 분자는 디펩타이드 서열 Phe-Lys 및 Val-Lys를 포함한다 [King et al., (2002), J. Med. Chem., 45: 4336-43]. 분열성 자극은 낮은 pH의 엔도좀 구획 (예를 들어, 라이소좀)으로의 세포내 섭취 트래피킹에 의해서 제공될 수 있다. 그 밖의 다른 예시적인 산-분열가능한 연결 분자는 2개 이상의 메이탄시노이드의 부착을 위한 2개 이상의 산 분열가능한 결합을 함유하는 분자이다 [King et al., (1999), Bioconj. Chem., 10: 279-88; WO 98/19705].
분열가능한 연결 분자는 특정한 표적 세포와 연관된 생물학적으로 공급된 분열제, 예를 들어, 라이소좀성 또는 종양-연관된 효소에 민감할 수 있다. 효소적으로 분열될 수 있는 연결 분자의 예로는 펩타이드 및 에스테르가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 효소 분열가능한 연결 분자의 예로는 카텝신 (Cathepsin) B 또는 플라즈민과 같은 종양-연관된 프로테아제에 민감한 것이 포함된다 [Dubowchik et al., (1999), Pharm. Ther., 83: 67-123; Dubowchik et al., (1998), Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 3341-52; de Groot et al., (2000), J. Med. Chem., 43: 3093-102; de Groot et al., (1999)m 42: 5277-83]. 카텝신 B-분열가능한 부위에는 디펩타이드 서열 발린-시트룰린 및 페닐알라닌-리신이 포함된다 [Doronina et al., (2003), Nat. Biotech., 21(7): 778-84); Dubowchik et al., (2002), Bioconjug. Chem., 13: 855-69]. 그 밖의 다른 예시적인 효소-분열가능한 부위에는 호중구, 대식세포 및 그 밖의 다른 과립구에 의해서 선택적으로 방출되는 효소인 티메트 올리고펩티다제 (Thimet Oliogopeptidase; TOP)와 같은 트라우즈 (trouse) 프로테아제에 의해서 인식되는 4 내지 16 개의 아미노산의 올리고펩타이드 서열 (예를 들어, Suc-β-Ala-Leu-Ala-Leu)에 의해서 형성된 것이 포함된다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 하기 화학식의 연결 분자와 반응한다:
X-Y-Z
여기에서,
X는 부착 분자이고;
Y는 스페이서 분자이며;
Z는 효과기 부착 부위이다.
용어 "부착 분자"는 본 발명의 결합 폴리펩타이드에 대한 연결 분자의 공유적 부착을 허용하는 분자이다. 부착 분자는 예를 들어, 수소 원자, 및 결합 분자가 그의 의도된 기능을 수행하도록 하는 다른 치환체에 의해서 임의로 치환된 1-60 개의 탄소, 산소, 질소, 황 원자의 공유결합 쇄를 포함할 수 있다. 부착 분자는 펩타이드, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 에테르, 티오에테르 등의 기능적 그룹을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 부착 분자는 이것이 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩타이드 상의 반응성 기능적 그룹과 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성할 수 있도록 선택된다. 부착 분자의 예로는 예를 들어, 아미노, 카복실레이트, 및 티올 부착 분자가 포함된다.
아미노 부착 분자는 변형된 폴리펩타이드가 형성되도록 결합 폴리펩타이드 상의 아미노 그룹과 반응하는 분자를 포함한다. 아미노 부착 분자는 본 기술분야에서 공지되어 있다. 아미노 부착 분자의 예로는 활성화된 카바미드 (예를 들어, 결합 분자 상의 아미노 그룹과 반응하여 우레아 그룹을 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있다), 알데히드 (예를 들어, 결합 분자 상의 아미노 그룹과 반응할 수 있다), 및 활성화된 이소시아네이트 (결합 분자 상의 아미노 그룹과 반응하여 우레아 그룹을 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있다)가 포함된다. 아미노 부착 분자의 예로는 N-석신이미딜, N-설포석신이미딜, N-프탈이미딜, N-설포프탈이미딜, 2-니트로페닐, 4-니트로페닐, 2,4-디니트로페닐, 3-설포닐-4-니트로페닐, 또는 3-카복시-4-니트로페닐 분자가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
카복실레이트 부착 분자는 본 발명의 변형된 결합 폴리펩타이드가 형성되도록 결합 폴리펩타이드 상의 카복실레이트 그룹과 반응하는 분자를 포함한다. 카복실레이트 부착 분자는 본 기술분야에서 공지되어 있다. 카복실레이트 부착 분자의 예로는 결합 폴리펩타이드 상의 COOH 그룹과 반응하여 에스테르, 티오에스테르 또는 아미드 그룹을 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있는 활성화된 에스테르 중간체 및 활성화된 카보닐 중간체가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
티올 부착 분자는 본 발명의 결합 분자가 형성되도록 폴리펩타이드 상에 존재하는 티올 그룹과 반응하는 분자를 포함한다. 티올 부착 분자는 본 기술분야에서 공지되어 있다. 티올 부착 분자의 예로는 활성화된 아실 그룹 (결합 분자 상의 설프하이드릴과 반응하여 티오에스테르를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있다), 활성화된 알킬 그룹 (결합 분자 상의 설프하이드릴과 반응하여 티오에스테르 분자를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있다), 말레이미드 또는 아크릴 그룹과 같은 미카엘 (Michael) 수용체 (결합 분자 상의 설프하이드릴과 반응하여 미카엘-형 부가 생성물을 형성할 수 있다), 산화환원 반응에 의해서 설프하이드릴 그룹과 반응하는 그룹, 활성화된 디설파이드 그룹 (결합 분자 상의 설프하이드릴과 반응하여 예를 들어, 디설파이드 분자를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있다)이 포함된다. 그 밖의 다른 티올 부착 분자에는 아크릴아미드, 알파-요오도아세트아미드, 및 사이클로프로판-1,1-디카보닐 화합물이 포함된다. 또한, 티올 부착 분자는 연결 분자가 부착되어 본 발명의 결합 분자를 형성할 수 있는 또 다른 반응성 종을 형성하도록 결합 분자 상의 티올을 변형시킨 분자를 포함할 수 있다.
스페이서 분자 Y는 공유 결합, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유할 수 있는 원자의 공유결합 쇄이다. 이것은 또한, 수소 원자, 또는 생성된 결합 분자가 그의 의도된 기능을 수행하도록 하는 다른 치환체에 의해서 임의로 치환된 1-60 개의 탄소, 산소, 황 또는 질소 원자를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, Y는 알킬, 알케닐, 알키닐, 에스테르, 카보닐, 또는 아미드 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드 상의 티올 그룹은 케톤 또는 알데히드와 같은 반응성 카보닐 그룹 등의 반응성 그룹으로 전환된다. 그 후, 부착 분자는 케톤 또는 알데히드와 반응하여 변형된 결합 폴리펩타이드를 형성시킨다. 카보닐 반응성 부착 분자의 예로는 하이드라진, 하이드라지드, O-치환된 하이드록실아민, 알파-베타-불포화된 케톤, 및 H2C=CH-CO-NH-NH2가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 부착 분자의 다른 예, 및 변형된 결합 폴리펩타이드를 형성시키기 위해서 사용될 수 있는 티올 분자를 변형시키는 방법은 문헌 [Pratt, M. L. et al. J Am Chem Soc. 2003 May 21;125(20):6149-59; 및 Saxon, E. Science. 2000 Mar 17;287(5460):2007-10]에 기술되어 있다.
연결 분자는 효과기 분자 또는 그의 유도체와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성시킬 수 있는 분자일 수 있다. 예를 들어, 효과기 분자는 디설파이드 결합을 통해서 분자의 나머지 부분에 연결될 수 있다. 이러한 경우에, 연결 분자는 이것이 적절한 효과기 부위 유도체와 반응함으로써 효과기 분자가 본 발명의 결합 폴리펩타이드에 부착하게 할 수 있도록 선택된다.
본 발명에서 사용하기에 바람직한 세포독성 효과기 분자는 세포독성 약물, 특히 암 치료를 위해서 사용되는 것이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, "세포독소 또는 세포독성 작용제"는 세포의 성장 및 증식에 유해하며, 세포 또는 악성 종양을 감소, 억제 또는 파괴하도록 작용할 수 있는 모든 작용제를 의미한다. 예시적인 세포독소에는 방사성 핵종, 생물독소, 효소적 활성 독소, 세포증식억제성 또는 세포독성 치료제, 프로드럭, 면역학적 활성 리간드, 및 사이토킨과 같은 생물학적 반응 변형제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 면역반응성 세포 또는 악성 세포의 성장을 지연시키거나 느리게 하는 작용을 하는 모든 세포독소가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
예시적인 세포독소에는 일반적으로, 세포증식억제제, 알킬화제, 항대사산물제, 항증식제, 튜불린 결합제, 호르몬 및 호르몬 길항제 등이 포함된다. 본 발명과 상화성인 세포증식억제제의 예로는 메클로레타민, 트리에틸렌포스포르아미드, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 클로람부실, 부설판, 멜파란 또는 트리아지쿠온과 같은 알킬화 물질, 및 또한 카무스틴, 로무스틴 또는 세무스틴과 같은 니트로소우레아 화합물이 포함된다.
컨쥬게이션을 위한 예시적인 분자는 메이탄시노이드이다. 메이탄시노이드는 최초로, 메이테누스 (Maytenus) 속에 속하는 동아프리카 관목으로부터 분리되었지만, 이후에는 액티노신네마 프레티오숨 (Actinosynnema pretiosum) (참조: 예를 들어, 미국 특허 제3,896,111호)과 같은 토양 세균의 대사산물인 것으로 발견되었다. 메이탄시노이드는 본 기술분야에서 메이탄신, 메이탄시놀, 메이탄시놀의 C-3 에스테르, 및 그 밖의 다른 메이탄시놀 유사체 및 유도체를 포함하는 것으로 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020 및 6,441,163호]. 메이탄시놀의 C-3 에스테르는 천연적으로 존재할 수 있거나, 합성적으로 유도될 수 있다. 더우기, 천연적으로 존재 및 합성 C-3 메이탄시놀은 둘 다 단순 카복실산과의 C-3 에스테르, 또는 N-메틸-L-알라닌의 유도체와의 C-3 에스테로 분류될 수 있으며, 후자가 전자보다 더 세포독성이 크다. 합성 메이탄시노이드 유사체도 또한, 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Kupchan et al., J. Med. Chem., 21, 31-37 (1978)]에 기술되어 있다. 메이탄시놀 및 그의 유사체 및 유도체를 생성시키는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제4,151,042호에 기술되어 있다.
컨쥬게이트로서 사용하기에 적합한 메이탄시노이드는 천연 공급원으로부터 분리되거나, 합성적으로 생산되건, 본 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 반-합성적으로 생산될 수 있다. 또한, 충분한 세포독성이 최종적인 컨쥬게이트 분자에 보존되는 한, 메이탄시노이드는 어떤 적합한 방식으로도 변형될 수 있다.
반응성 화학적 그룹을 함유하는 연결 분자를 포함한 특히 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀의 C-3 에스테르 및 그의 유사체이며, 여기에서 연결 분자는 디설파이드 결합을 함유하고, 부착 분자는 N-석신이미딜 또는 N-설포석신이미딜 에스테르를 포함한다. 메이탄시노이드 상의 다수의 위치가 예를 들어, 효과기 부착 분자를 통해서 연결 분자를 화학적으로 연결시키는 위치로 작용할 수 있다. 예를 들어, 하이드록실 그룹을 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록시로 변형된 C-15 위치 및 하이드록시 그룹을 갖는 C-20 위치가 모두 유용하다. 연결 분자는 가장 바람직하게는 메이탄시놀의 C-3 위치에 연결된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물과 관련하여 사용된 메이탄시노이드는 N.sup.2'-데아세틸-N.sup.2'-(- 3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신 (DM1) 또는 N.sup.2'-데아세틸-N.sup.2'-(4-- 머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM4)이다.
다른 메이탄시노이드와 같이 다른 화학적 결합을 갖는 연결 분자도 또한 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 연결 분자 내에 혼입될 수 있는 다른 화학적 결합의 구체적인 예로는 예를 들어, 산 불안정성 결합, 티오에테르 결합, 광불안정성 결합, 펩티다제 불안정성 결합 및 에스테라제 불안정성 결합과 같은 상술한 것이 포함된다. 연결 분자 및/또는 효과기 부착 분자를 갖는 메이탄시노이드를 생산하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020, 5,416,064, 및 6,333,410호에 기술되어 있다.
메이탄시노이드의 연결 분자 (및/또는 효과기 부착 분자)는 일반적이고, 바람직하게는 결합 폴리펩타이드를 메이탄시노이드에 결합시키기 위해서 사용되는 더 큰 펩타이드 분자의 일부분이다. 연결 분자가 메이탄시노이드 및 항체 각각의 세포독성 및 표적화 특징의 보존을 제공하는 한은, 어떤 적합한 펩타이드 분자라도 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 연결 분자는 메이탄시노이드와 결합 폴리펩타이드가 서로 화학적으로 커플링되도록 (예를 들어, 공유적으로 결합되도록) 화학적 결합 (상술한 바와 같음)을 통해서 메이탄시노이드를 결합 폴리펩타이드에 결합시킨다. 바람직하게는, 연결 분자는 디설파이드 결합 또는 티오에테르 결합을 통해서 메이탄시노이드를 결합 폴리펩타이드에 화학적으로 커플링시킨다. 가장 바람직하게는, 결합 폴리펩타이드는 디설파이드 결합을 통해서 메이탄시노이드에 화학적으로 커플링된다.
세포독성 작용제의 다른 바람직한 부류에는 예를 들어, 약물의 안트라사이클린 패밀리, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오사이드, 약물의 프테리딘 패밀리, 디이넨, 및 포도필로톡신이 포함된다. 이들 부류의 특히 유용한 구성원은 예를 들어, 아드리아마이신, 카미노마이신, 다우노루비신 (다우노마이신), 독소루비신, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 메토프테린, 미트라마이신, 스트렙토니그린, 디클로로메토트렉세이트, 미토마이신 C, 액티노마이신-D, 포르피로마이신, 5-플루오로우라실, 플록스유리딘, 프토라푸르, 6-머캅토퓨린, 시타라빈, 시토신 아라비노사이드, 포도필로톡신, 또는 에토포사이드 또는 에토포사이드 포스페이트와 같은 포도필로톡신 유도체, 멜파란, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 로이로시딘, 빈데신, 로이로신 등을 포함한다. 본 명세서의 교시 내용과 상화성인 또 다른 세포독소에는 탁솔, 탁산, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 테노포사이드, 콜히친, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 코르티코스테로이드, 예를 들어, 프레드니손, 프로제스틴, 예를 들어, 하이드록시프로게스테론 또는 메드로게스테론, 에스트로겐, 예를 들어, 디에틸스틸베스트롤, 안티에스트로겐, 예를 들어, 타목시펜, 안드로겐, 예를 들어, 테스토스테론, 및 아로마타제 억제제, 예를 들어, 아미노글루테트이미드와 같은 호르몬 및 호르몬 길항제도 본 명세서의 교시 내용과 또한 상화적이다. 전술한 바와 같이, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 원하는 화합물의 반응이 본 발명의 컨쥬게이트를 제조할 목적에 더 편리하게 되도록 하기 위하여 이 화합물에 대한 화학적 변형을 만들 수 있다.
그 밖의 다른 예시적인 세포독소는 칼리케아미신, 에스페라미신 또는 다이네미신을 포함한 항종양 항생제의 엔다이인 (enediyne) 패밀리의 구성원 또는 유도체를 포함한다. 이들 독소는 매우 강력하며, 핵 DNA를 분열시킴으로써 세포사를 유도하는 작용을 한다. 생체내에서 분열되어 다수의 불활성이지만 면역원성인 폴리펩타이드 단편을 제공할 수 있는 단백질 독소와는 달리, 칼리케아미신, 에스페라미신 및 그 밖의 다른 엔다이인과 같은 독소는 본질적으로 비-면역원성인 소분자이다. 이들 비-펩타이드 독소는 이전에 모노클로날 항체 및 그 밖의 다른 항체를 표지하기 위해서 사용된 기술에 의해서 이량체 또는 테트라머에 화학적으로-연결된다. 이들 연결 기술에는 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 Fc 부위 상에 존재하는 N-연결된 당 잔기를 통한 부위-특이적 연결이 포함된다. 이러한 부위-지시된 연결방법은 구조물의 결합 특성에 대한 연결의 가능한 영향을 감소시키는 이점을 갖는다.
다른 세포독소 중에서, 폴리펩타이드가 또한 리신 서브유니트 A, 애브린, 디프테리아 독소, 보툴리눔, 시안지노신, 삭시톡신, 시가톡신, 테타누스, 테트로도톡신, 트리코테센, 베루콜로겐 또는 독성 효소와 같은 생물독소와 회합될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 이러한 구조물은 항체-독소 구조물의 직접적인 발현을 허용하는 유전자 조작기술을 사용하여 만들어질 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드와 회합될 수 있는 다른 생물학적 반응 변형제에는 림포킨 및 인터페론과 같은 사이토킨이 포함된다. 본 발명의 기술내용에 비추어, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 통상적인 기술을 사용하여 이러한 구조물을 쉽게 형성시킬 수 있는 것으로 제시된다.
기술된 폴리펩타이드와 함께 사용될 수 있는 상화성 세포독소의 또 다른 부류는 종양 또는 면역반응성 세포 쪽으로 효과적으로 유도될 수 있는 방사선감작성 약물이다. 이러한 약물은 이온화 방사선에 대한 감수성을 증진시킴으로써 방사선요법의 효능을 상승시킨다. 종양 세포에 의해서 내재화된 결합 폴리펩타이드 컨쥬게이트는 방사선감작제를 방사선감작이 최대로 일어날 수 있는 핵에 더 가깝게 송달할 수 있다. 본 발명의 결합되지 않은 방사선감작제-연결된 폴리펩타이드는 혈액으로부터 빠르게 청소되고, 나머지 방사선감작제는 표적 종양에 국재화하고, 정상 조직에서는 최소 섭취를 제공할 수 있다. 혈액으로부터의 빠른 청소 후에, 보조 방사선요법을 다음 3가지 방법 중의 하나로 투여될 수 있다: 1) 종양에 대해 특이적으로 유도되는 외부 빔 방사선; 2) 종양에 직접 이식되는 방사성; 또는 3) 동일한 표적화 항체에 의한 전신적 방사선면역요법. 이러한 시도의 잠재적으로 매력적인 변형법은 치료학적 방사성 동위원소를 방사선감작된 면역컨쥬게이트에 부착시킴으로써 환자에게 단일 약물을 투여하는 편이성을 제공할 수 있다.
하나의 구체예에서, 폴리펩타이드의 안정성 또는 효능을 증진시키는 분자를 컨쥬게이트시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서는, PEG를 본 발명의 폴리펩타이드에 컨쥬게이트시켜 그들의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다 [Leong, S.R., et al. 2001. Cytokine 16:106; 2002; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531; 또는 Weir et al. 2002. Biochem. Soc. Transactions 30:512].
이전에 언급한 바와 같이, 상화성 세포독소는 프로드럭을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "프로드럭"은 모 약물에 비해서 종양 세포에 대해서 덜 세포독성이고, 더 활성인 모 형태로 효소적으로 활성화되거나, 전환될 수 있는 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 본 발명과 상화성인 프로드럭에는 포스페이트 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩타이드 함유 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 더 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 그 밖의 다른 5-플루오로유리딘 프로드럭이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 하나의 구체예에서, 메이탄시노이드와 같은 세포독성 작용제는 디설파이드 결합의 가수분해에 의해서 방출된 프로드럭으로서 투여된다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 추가의 예는 상술한 이들 화학요법제를 포함한다.
VI. 본 발명의 폴리펩타이드의 사용방법
본 발명의 폴리펩타이드는 다수의 적용예에서, 예를 들어, 스크리닝 시험에서뿐만 아니라, 진단적 또는 치료학적 목적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 치료가 필요한 포유동물 대상체에서 장애, 예를 들어, 신생물성 장애를 진단 및/또는 치료하기 위한 키트 및 방법을 제공한다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
A. 스크리닝 방법
본 발명의 결합 분자는 또한, 스크리닝 방법에서 유용하다. 이중특이성 분자로 합성되는 경우에, 본 발명의 결합 분자는 스크리닝 시험에서 사용하기 위한 작용제로의 경우를 포함하여, 선행기술의 이중특이성 분자에 비해 다수의 이점을 갖는다. 도 9는 이중특이성 항체 기능에 대한 스크리닝시에, 통상적인 이중특이성 항체의 사용에 비해 본 발명의 scFc 결합 분자를 사용하는 이점을 도시한 것이다. scFc 부분의 사용은 결합 영역의 원치 않는 불균질성을 방지한다. 이러한 불균질성은 이중특이성 항체에 대해서 독특한 활성에 대해서 스크리닝하도록 디자인된 시험을 복잡하게 만들 수 있다. "경로 1"은 일반적으로 3 개의 유전자가 진핵성 시스템에서 발현되어 이중특이성 항체를 형성하는 경우에 나타날 수 있는 불균질한 결합 단백질 조합의 예이다: (A) Fc의 N-말단에 융합된 scF(ab); (B) Fc의 CH3 영역의 C-말단에 융합된 F(ab) 중쇄; 및 (C) CL 및 VL 영역을 포함하는 경쇄. "경로 2"는 2 개의 유전자 ((A) 및 (B))가 어떻게 단일 유전자 구조물로 융합하여 폴리펩타이드 링커에 의해서 연결된 Fc 부위, scFc (D)를 제공하는지의 예이다. (C) 및 (D)의 공동-발현은 단일 이중특이성 mAb의 균질한 발현을 제공한다. 따라서, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어, 본 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 하나 이상의 그의 표적에 결합하는 이중특이성 항체의 능력에 대해서 스크리닝하는 경우에 이점을 나타낸다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 표적 단백질의 활성화를 활성화시키거나 억제하는 다중특이성 결합 단백질 (예를 들어, 이중특이성 항체와 같은 이중특이성 결합 단백질)에 대해서 스크리닝하는 방법을 제공한다. 특히, 제1 결합특이성을 갖는 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 상이한 특이성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드와 공동-발현되거나, 공유적으로 결합되어 다중-특이성 결합 단백질을 형성시킬 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 그의 N- 및 C-말단에서 상이한 특이성의 결합 부위 (예를 들어, scFv 또는 Fabs)를 갖는 유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, scFc 부분)을 포함하는 단일 유전자 구조물로서 발현될 수 있다. 결합 단백질은 관심이 있는 한 또는 그 이상의 표적 단백질에 대한 상대적 활성을 측정하는 시험 (예를 들어, 세포-기본 시험)에서 스크리닝될 수 있다. 일반적으로, 이러한 스크리닝 절차는 본 발명의 다중-특이성 결합 폴리펩타이드를 표적 단백질과 접촉시켜 기능적 반응의 결합, 자극 또는 억제를 관찰하는 단계를 포함한다. 다중-특이성 결합 단백질은, 이것이 상응하는 단일-특이성 결합 폴리펩타이드에 대비하여 자극 또는 억제를 나타내는 경우에 선택될 수 있다.
표적 단백질의 활성 (예를 들어, 생화학적 또는 생물학적 활성)을 측정하는데 적절한 본 기술분야에서 인지된 시험방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 단백질이 키나제인 경우에, 적절한 시험은 키나제의 기질의 포스포릴화 상태의 억제 또는 활성화를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 다른 예시적 구체예에서, 표적 단백질이 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)인 경우에, 적절한 시험은 다중특이성 결합 폴리펩타이드가 수용체를 활성화시키는지 또는 억제하는지 여부를 결정하기 위하여 세포외 pH 변화를 측정할 수 있다. 표적 단백질이 수용체인 경우에, 스크리닝 시험은 그의 표면 상에 수용체를 갖는 세포에 대한 표지된 리간드의 상대적 결합을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 리간드는 예를 들어, 방사성에 의해서 표지될 수 있다. 수용체에 결합된 표지된 리간드의 양은 예를 들어, 수용체의 방사능을 측정함으로써 측정될 수 있다. 화합물이 수용체에 결합하는 표지된 리간드의 감소에 의해서 측정되는 바와 같이 수용체에 결합한다면, 수용체에 대한 표지된 리간드의 결합은 억제된다.
하나의 예시적인 구체예에서, 시험은 LTβR 단백질 (예를 들어, LTα1β2 단백질)의 억제를 포함한다. LTβR 분자는 3 개의 개열부 (cleft)에 의해서 분리된 3 개의 비-동일성 서브유니트로 이루어진 트라이머이기 때문에, 3 개의 개별부 중의 한개 이상을 차단시켜 LTβR 활성을 최적으로 불활성화시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, LTβR의 제1 개열부에 대한 제1 특이성 및 LTβR의 제2 개열부에 대한 제2 특이성을 갖는 다중-특이성 결합 폴리펩타이드를 수득하는 것이 바람직하다. 따라서, LTβR에 대한 하나 이상의 결합 특이성을 갖는 다중-특이성 결합 단백질은, 이것이 상응하는 단일특이성 항체에 비해서 개선된 활성을 나타내는지 여부를 측정하기 위한 LTβR 활성의 시험에서 스크리닝할 수 있다.
B. 항-종양 요법
본 발명의 폴리펩타이드는 다수의 상이한 적용예에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 결합 폴리펩타이드에 의해서 인식되는 에피토프를 보유하는 세포를 감소시키거나 제거하는데 유용하여야 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 순환계에서 가용성 항원의 농도를 감소시키거나, 그 항원을 제거하는데 효과적이다.
하나의 구체예에서, 종양-연관된 항원을 인식하는 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 억제하고/하거나, 종양-보유 동물의 생존시간을 연장시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 인간 또는 동물에게 상기의 결합 폴리펩타이드의 비독성 유효량을 투여함으로써 인간 또는 다른 동물에게서 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 일상적인 실험에 의해서, 악성종양을 치료할 목적에 따른 변형된 결합 폴리펩타이드의 비독성 유효량은 어떤지를 측정할 수 있다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드의 치료학적으로 활성적인 양은 질병 단계 (예를 들어, 단계 I 대 단계 IV), 대상체의 연령, 성별, 의학적 합병증 (예를 들어, 면역억제된 상태 또는 질병) 및 체중, 및 대상체에서 원하는 반응을 유도하는 결합 폴리펩타이드의 능력과 같은 인자들에 따라서 달라질 수 있다. 투약량 레지멘은 최적의 치료학적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇 개의 분할된 용량을 매일 투여할 수 있거나, 용량을 치료학적 상황의 긴박한 필요성에 의해서 나타내는 바와 같이 비례적으로 감소시킬 수 있다. 그러나, 일반적으로 유효 투약량은 1일에 체중 ㎏당, 약 0.05 내지 100 ㎎, 더욱 바람직하게는 1일에 체중 ㎏당, 약 0.5 내지 10 ㎎의 범위일 것으로 예상된다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형된 항체에 의한 암성 세포의 표적화를 가능하게 하는 항원성 마커를 포함하는 어떤 신생물이라도 예방적으로 또는 치료학적으로 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암의 예로는 전립선암, 결장암과 같은 위의 암종, 피부암, 유방암, 난소암, 폐암 및 췌장암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 더욱 특히, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 카포시 육종, CNS 신생물 (모세혈관 혈관아세포종, 수막종 및 뇌 전이), 흑색종, 위장 및 신장 육종, 횡문근육종, 교아세포종 (바람직하게는, 다형성 교아세포종), 평활근육종, 망막아세포종, 난소의 유두상 낭선암, 빌름스 종양 (Wilm's tumor) 또는 소세포 폐암을 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 적절한 표적 결합 폴리펩타이드가 본 발명의 기술내용에 비추어 과도한 실험이 없이도 전술한 신생물 각각과 관련된 종양 연관 항체에 대해서 유도될 수 있다는 것은 이해될 것이다.
본 발명에 의한 치료에 적용될 수 있는 예시적인 혈액학적 악성종양에는 호지킨 및 비-호지킨 림프종뿐만 아니라 ALL-L3 (버키트-형 (Burkitt's type) 백혈병), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 단핵구성 백혈병을 포함한 백혈병이 포함된다. 본 발명의 화합물 및 방법은 저등급/ 여포성 비-호지킨 림프종 (NHL), 세포 림프종 (FCC), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 미만성 거대세포 림프종 (DLCL), 소림프구성 (SL) NHL, 중간 등급/ 여포성 NHL, 중간 등급의 미만성 NHL, 고등급의 면역아세포성 NHL, 고등급의 림프아구성 NHL, 고등급의 분열되지 않은 소세포 NHL, 벌키한 (bulky) 질병 NHL 및 발덴스트룀 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's Macroglobulinemia)을 포함한 다양한 B-세포 림프종을 치료하는데 특히 효과적인 것으로 이해될 수 있다. 이들 림프종이 분류 시스템의 변화로 인하여 종종 상이한 이름을 가질 수 있고, 상이한 이름으로 분류된 림프종을 갖는 환자도 또한 본 발명의 조합된 치료학적 레지멘에 의한 효과를 볼 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 상기 언급한 신생물성 장애 이외에도, 본 발명의 폴리펩타이드는 상화성의 종양 연관된 항원을 보유하는 추가의 악성종양을 치료하기 위해서 유익하게 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있을 것이다.
C. 면역 장애 치료법
신생물성 장애 이외에도, 본 발명의 폴리펩타이드는 자가면역 장애 또는 비정상적인 면역반응의 치료에 특히 효과적이다. 이에 관해서, 본 발명의 폴리펩타이드가 외부 및 자가항원 둘 다에 대한 원치 않는 면역반응을 조절하거나, 억제하거나, 변조시키거나, 제거하기 위해서 사용될 수 있다는 것은 이해될 것이다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 항원은 자가항원이다. 또 다른 구체예에서, 항원은 알레르기 항원이다. 또 다른 구체예에서, 항원은 동종항원 (alloantigen) 또는 이종항원 (xenoantigen)이다. 동종항원 및 이종항원에 대한 면역반응을 감소시키기 위한 본 발명의 결합 폴리펩타이드의 사용은 예를 들어, 공여체 이식편, 예를 들어, 조직 또는 기관 이식편 또는 골수 이식물의 이식 수용주에 의한 거부반응을 억제하기 위해 이식술에서 특히 유용하다. 추가로, 골수 이식편 내에서 공여체 T 세포의 억제 또는 제거는 이식편 대 숙주 질병을 억제하는데 유용하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 알레르기성 기관지폐 아스페르질루스증; 알레르기성 비염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 흑색 극세포증; 알레르기성 접촉 피부염; 아디슨병 (Addison's disease); 아토피성 피부염; 원형 탈모증; 전신 탈모증; 유전분증; 과민증양 자반병; 과민증양 반응; 재생불량성 빈혈; 유전성 혈관부종; 특발성 혈관부종; 강직성 척추염; 두개 동맥염; 거대세포성 동맥염; 다카야수 (Takayasu's) 동맥염; 측두 동맥염; 천식; 모세혈관확장성 운동실조증; 자가면역성 난소염; 자가면역성 고환염; 자가면역성 다내분비부전; 베세트병 (Behcet's disease); 베르게르병 (Berger's disease); 뷰르거병 (Buerger's disease); 기관지염; 수포성 천포창; 만성 점액피부성 칸디다증; 카플란 (Caplan) 증후군; 심근경색후 증후군; 심막절개후 증후군; 심장염; 복강 스프루후 (Celiac sprue); 샤가스병 (Chagas's disease); 체디아크-히가시 (Chediak-Higashi) 증후군; 처그-스트라우스 (Churg-Strauss)병; 코오간 (Cogan) 증후군; 한랭 응집소병; CREST 증후군; 크론 (Crohn)병; 한랭 글로불린혈증; 특발성 섬유성 폐포염; 포진성 피부염; 피부근염; 당뇨병; 다이아몬드-블랙판 (Diamond-Blackfan) 증후군; 디죠지 (DiGeorge) 증후군; 원판상 홍반성 루푸스; 호산성 근막염; 상공막염; 장기 융기성 홍반; 윤곽성 홍반; 다형 홍반; 결절성 홍반; 가족성 지중해열; 펠티 (Felty) 증후군; 폐섬유증; 과민증양 사구체신염; 자가면역성 사구체신염; 스트렙토코커스 감염-후 사구체신염; 이식-후 사구체신염; 막성 신사구체병증; 굿파스튜어 (Goodpasture) 증후군; 면역-매개된 과립구감소증; 환상 육아종; 알레르기성 육아종증; 육아종성 근염; 그레이브스병 (Grave's disease); 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염; 신생아의 용혈성 질병; 특발성 혈색소증; 헤노흐-쉔라인 (Henoch-Schoenlein) 자반병; 만성 활성 및 만성 진행성 간염; 엑스 조직구증식증; 호산구과다 증후군; 특발성 혈소판감소성 자반병; 죠브 (Job) 증후군; 소아 피부근염; 소아 류마티스성 관절염 (소아 만성 관절염); 카와사키 (Kawasaki)병; 각막염; 건성 각결막염; 랑드리-귈랑-바레-스트롤 (Landry-Guillain-Barre-Strohl) 증후군; 나종성 나병; 뢰플러 (Loeffler) 증후군; 루푸스; 라이엘 (Lyell) 증후군; 라임병 (Lyme disease); 림프종양 육아종증; 전신성 비만세포증; 혼합형 결합조직 질병; 다발성 단신경염; 무클-웰즈 (Muckle-Wells) 증후군; 점막피부 림프절 증후군; 다중심성 망내조직구증; 다발성 경화증; 중증 근무력증; 균상 식육종; 전신적 괴사성 맥관염; 신증후군; 중복 증후군; 지방층염; 발작성 한랭 혈색소뇨증; 발작성 야간 혈색소뇨증; 유천포창; 천포창; 홍반성 천포창; 낙엽성 천포창; 심상성 천포창; 비둘기 사육사병; 과민성 폐염; 결절성 다발성동맥염; 류마티스성 다발성근육통; 다발성근염; 특발성 다발성신경염; 포르투갈 가족성 다발성신경병증; 자간전증/자간증; 원발성 담즙성 간경변증; 진행형 전신성 경피증 (경피증); 건선; 건선성 관절염; 폐포 단백질증; 폐섬유증; 레이노드 (Raynaud) 현상/증후군; 라이델 (Reidel) 갑상선염; 라이터 (Reiter) 증후군; 재발성 다연골염; 류마티스성 열; 류마티스성 관절염; 유육종증; 공막염; 경화성 담관염; 혈청병; 세자리 (Sezary) 증후군; 쇼그렌 (Sjogren) 증후군; 스티븐스-죤슨 (Stevens-Johnson) 증후군; 스틸 (Still)병; 아급성 경화성 범뇌염; 교감성 안염; 전신성 홍반성 루푸스; 이식 거부반응; 궤양성 대장염; 미분화된 결합조직 질병; 만성 담마진; 한랭 담마진; 포도막염; 백반; 웨버-크리스찬 (Weber-Christian)병; 베게너 (Wegener) 육아종증 및 비스코트-올드리치 (Wiskott-Aldrich) 증후군을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 면역 장애를 치료하기 위해서 사용될 수 있다.
D. 항-염증성 치료법
또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 염증, 예를 들어, 증가된 혈류, 부종, 면역세포의 활성화 (예를 들어, 증식, 사이토킨 생산, 또는 증진된 식균작용)에 의해서 부분적으로 야기되거나, 악화되는 염증성 장애를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 염증성 장애의 예로는 염증 또는 염증성 인자 (예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMPs), 산화질소 (NO), TNF, 인터로이킨, 혈장 단백질, 세포성 방어 시스템, 사이토킨, 지질 대사산물, 프로테아제, 독성 래디칼, 미토콘드리아, 세포소멸, 유착분자 등)가 비정상적인 양으로, 예를 들어, 대상체를 변화시키는데, 예를 들어, 대상체를 이롭게 하는데 유익할 수 있는 양으로 영역 내에 포함되거나, 존재하는 경우가 포함된다. 염증성 고정은 손상에 대한 생체 조직의 반응이다. 염증의 원인은 물리적 손상, 화학적 물질, 미생물, 조직 괴사, 암 또는 다른 작용제에 기인할 수 있다. 급성 염증은 단지 며칠간 지속하는 단기간-지속형이다. 그러나, 이것이 더 장기간 동안 지속한다면, 이것은 만성 염증으로 불릴 수 있다.
염증성 장애는 급성 염증성 장애, 만성 염증성 장애 및 재발성 염증성 장애를 포함한다. 급성 염증성 장애는 몇 주일 동안 지속할 수도 있지만, 일반적으로는 비교적 짧은 지속시간을 가지며, 약 몇 분 내지 약 1 내지 2일 동안 지속한다. 급성 염증성 장애의 주된 특징은 증가된 혈류, 체액 및 혈장 단백질의 삼출 (부종), 및 호중구와 같은 백혈구의 유주를 포함한다. 만성 염증성 장애는 일반적으로, 더 긴 지속시간, 예를 들어, 몇 주일 내지 몇 개월 내지는 몇 년 또는 더 긴 지속시간, 예를 들어, 몇 주일 내지 몇 개월 내지는 몇 년 동안, 또는 더 길게 지속하며, 조직학적으로 림프구 및 대식세포의 존재 및 혈관 및 결합조직의 증식과 연관된다. 재발성 염증성 장애는 일정 시간 후에 재발하거나, 주기적인 증상의 발현이 있는 장애를 포함한다. 재발성 염증성 장애의 예로는 천식 및 다발성 경화증이 포함된다. 일부의 장애는 하나 이상의 카테고리에 속할 수 있다.
염증성 장애는 일반적으로 열, 발적, 팽윤, 통증 및 기능의 상실을 특징으로 한다. 염증성 장애의 원인의 예로는 미생물 감염 (예를 들어, 세균, 바이러스 및 진균 감염), 물리적 작용제 (예를 들어, 화상, 방사선 및 외상), 화학적 작용제 (예를 들어, 독소 및 부식성 물질), 조직 괴사 및 다양한 유형의 면역학적 반응이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 염증성 장애의 예로는 골관절염, 류마티스성 관절염, 급성 및 만성 감염 (세균성, 바이러스성 및 진균성); 급성 및 만성 기관지염, 부비동염, 및 감기를 포함하는 그 밖의 다른 호흡기 감염; 급성 및 만성 위장염 및 대장염; 급성 및 만성 방광염 및 요도염; 급성 호흡장애 증후군; 낭포성 섬유증; 급성 및 만성 피부염; 급성 및 만성 결막염; 급성 및 만성 장막염 (심막염, 복막염, 활막염, 흉막염 및 건염); 요독성 심막염; 급성 및 만성 담낭염; 급성 및 만성 질염; 급성 및 만성 포도막염; 약물 반응; 및 화상 (열성, 화학적 및 전기적)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
E. 신경학적 장애
또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 신경학적 질병 또는 장애를 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 상술한 바와 같이, 결합 폴리펩타이드는 신경 세포 (예를 들어, 뉴론 또는 신경교 세포) 상에 존재하는 항원에 결합할 수 있다. 특정의 구체예에서, 신경학적 장애와 연관된 항원은 상기에 기술한 자가면역 또는 염증성 장애일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "신경학적 질병 또는 장애"는 대상체에서 신경계가 변성하거나 (예를 들어, 신경변성 장애뿐만 아니라 신경계가 적절하게 발달하지 못한 경우의 장애), 손상, 예를 들어, 척수 손상을 입은 후에 재생하지 못한 장애 또는 상태를 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해서 진단, 예방 또는 치료될 수 있는 신경학적 장애의 예로는 다발성 경화증, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 신경병성 통증, 외상성 뇌손상, 귈랑-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP), 뇌혈관 질병 및 뇌염이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
VIII. 본 발명의 폴리펩타이드를 투여하는 방법
본 발명의 폴리펩타이드를 제조하고, 대상체에게 투여하는 방법은 잘 알려져 있으며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 쉽게 결정된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 비경구는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질내 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내, 동맥내, 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다. 투여의 이들 모든 형태가 명백히 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주되지만, 투여를 위한 형태는 주사용, 특히 정맥내 또는 정맥내 주사용 용액 또는 점적제일 수 있다. 통상적으로, 주사에 적합한 약제학적 조성물은 완충제 (예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트), 임의로 안정화제 (예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 교시내용과 상화적인 다른 방법에서는 폴리펩타이드를 유해한 세포 집단의 부위에 직접 송달함으로써 치료학적 작용제에 대한 질병에 걸린 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체에는 식염수 및 완충된 매질을 포함한 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 본 발명에서, 약제학적으로 허용되는 담체에는 0.01-0.1 M, 바람직하게는 0.05 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 식염수가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 통상적인 비경구용 비히클은 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 용액, 또는 고정화 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 체액 및 영양소 보충물, 링거 덱스크로즈를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충물 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 그 밖의 다른 첨가제가 또한 존재할 수도 있다.
더욱 특히, 주사용 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수성 용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 반드시 멸균되어야 하며, 용이한 시린지 주입성 (syringability)이 존재할 정도로 유체 상태이어야 한다. 이것은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정하여야 하며, 바람직하게는 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염작용으로부터 보존될 수 있어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해서, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다.
미생물의 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해서 달성될 수 있다. 대부분의 경우에, 조성물 내에 등장화제, 예를 들어, 당류, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유도될 수 있다.
어떤 경우든지, 멸균 주사용 용액은 활성 화합물 (예를 들어, 결합 폴리펩타이드 그 자체, 또는 다른 활성 작용제와의 함께)을 필요한 양으로 적절한 용매 내에, 필요에 따라 본 명세서에 열거된 성분들 중의 하나 또는 조합물과 함께 혼입시키고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 열거한 성분들로부터 선택된 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 미리 멸균-여과된 그의 용액으로부터 활성 성분과 함께 추가의 원하는 어떤 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 동결-건조이다. 주사를 위한 제제는 가공하고, 앰플, 백, 병, 시린지 또는 바이알과 같은 용기 내에 충진시키고, 본 기술분야에서 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에서 밀봉시킨다. 또한, 제제는 각각 본 명세서에 참고로 포함된, 공동-계류 중인 U.S.S.N. 09/259,337 및 U.S.S.N. 09/259,338에 기술된 것과 같은 키트의 형태로 포장 및 판매할 수 있다. 이러한 제조품은 바람직하게는, 조합된 조성물이 자가면역 또는 신생물 장애를 앓고 있거나, 이에 걸리기 쉬운 대상체를 치료하는데 유용한 것을 나타내는 라벨 또는 포장 인서트 (insert)를 가질 수 있다.
상술한 상태의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여의 방법, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 치료학적인지 여부를 포함한 다수의 상이한 인자들에 따라서 달라진다. 통상적으로, 환자는 인간이지만, 유전자이식 포유동물을 포함한 비-인간 포유동물도 치료될 수 있다. 치료 투약량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해서 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
결합 폴리펩타이드에 의한 수동 면역을 위해서, 투약량은 예를 들어, 숙주 체중에 대해서 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 더욱 통상적으로는 0.01 내지 5 ㎎/㎏ (예를 들어, 0.02 ㎎/㎏, 0.25 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 0.75 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏ 등)의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투약량은 1 ㎎/㎏ (체중) 또는 10 ㎎/㎏ (체중) 또는 1-10 ㎎/㎏의 범위 이내, 바람직하게는 적어도 1 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 범위 내의 중간 용량도 또한 본 발명의 범주 내에 포함시키고자 한다. 대상체는 이러한 용량을 매일, 격일로, 주 1 회, 또는 실험적 분석에 의해서 결정된 어떤 다른 스케줄에 따라서 투여할 수 있다. 예시적인 치료는 예를 들어, 적어도 6 개월의 장기간에 걸쳐서 수회 투약량을 투여하는 것을 수반한다. 추가의 예시적인 치료 레지멘은 매 2 주일 마다 한번 또는 1 개월에 한번, 또는 매 3 내지 6 개월마다 한번 투여하는 것을 수반한다. 예시적인 투약 스케줄은 매일 1-10 ㎎/㎏ 또는 15 ㎎/㎏, 격일로 30 ㎎/㎏ 또는 주 1 회씩 60 ㎎/㎏을 포함한다. 일부의 방법에서는, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 결합 폴리펩타이드를 동시에 투여하는데, 이러한 경우에 각각의 투여된 결합 폴리펩타이드의 투약량은 언급된 범위에 들어간다.
본 발명의 폴리펩타이드는 수회 필요할 때에 투여될 수 있다. 단일 투약량 사이의 간격은 주 1 회, 월 1 회 또는 연 1 회일 수 있다. 간격은 또한 환자에게서 변형된 결합 폴리펩타이드 또는 항원의 혈중 레벨을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부의 방법에서, 투약량은 1-1000 ㎍/㎖, 일부의 방법에서는 25-300 ㎍/㎖의 변형된 결합 폴리펩타이드의 혈장 농도가 달성되도록 조정된다. 대신으로, 폴리펩타이드는 서방출형 제제로 투여될 수 있는데, 이 경우에는 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투약량 및 빈도는 환자에게서 폴리펩타이드의 반감기에 따라서 달라진다.
투약량 및 투여의 빈도는 치료가 예방적인지, 치료학적인지 여부에 따라서 달라질 수 있다. 예방적 적용예에서는, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 칵테일을 함유하는 조성물을 아직 질병 상태에 있지 않은 환자에게 환자의 저항성을 증진시키기 위해서 투여한다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 이 용도에서, 정확한 양은 또한, 환자의 건강 상태 및 일반적인 면역성에 따라 좌우되지만, 일반적으로는 용량당 0.1 내지 25 ㎎, 특히 용량당 0.5 내지 2.5 ㎎의 범위이다. 비교적 작은 투약량을 장기간에 걸쳐서 비교적 드문 간격으로 투여한다. 일부의 환자는 그들의 생애의 남은 기간 동안 치료를 계속 받는다.
치료학적 적용예에서는, 질병의 진행이 감소 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병의 증상의 부분적이거나 완전한 개선을 나타낼 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투약량 (예를 들어, 용량당 약 1 내지 400 ㎎/㎏의 결합 폴리펩타이드, 방사성면역컨쥬게이트에 대해서는 5 내지 25 ㎎의 투약량, 세포독성-약물 변형된 결합 폴리펩타이드에 대해서는 더 고용량이 통상적으로 사용된다)이 때때로 필요하다. 그 후에, 환자에게 예방적 레지멘을 투여할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 임의로, 치료 (예를 들어, 예방적 또는 치료학적)가 필요한 장애 또는 상태를 치료하는데 효과적인 다른 작용제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 90Y-표지된 변형된 결합 폴리펩타이드의 효과적인 단일 치료 투약량 (즉, 치료학적 유효량)은 약 5 내지 약 75 mCi, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi의 범위이다. 131I-변형된 항체의 효과적인 단일 치료 비-골수 침윤성 (ablative) 투약량은 약 5 내지 약 70 mCi, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 40 mCi 범위이다. 131I-표지된 항체의 효과적인 단일 치료 침윤성 투약량 (즉, 자가유래 골수 이식을 필요로 할 수 있다)은 약 30 내지 약 600 mCi, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mCi 미만의 범위이다. 키메라 항체와 관해서는 쥐 항체에 비해서 더 긴 순환 반감기로 인하여, 요오드-131 표지된 키메라 항체의 효과적인 단일 치료 비-골수 침윤성 투약량은 약 5 내지 약 40 mCi, 더욱 바람직하게는 약 30 mCi 미만의 범위이다. 예를 들어, 111In 표지물에 대한 영상화 기준은 일반적으로 약 5 mCi 미만이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바로 위에 기술한 바와 같이 투여될 수 있지만, 다른 구체예에서 폴리펩타이드는 다른 점에서는 건강한 환자에게 제1선 치료법으로 투여될 수 있다는 것이 역설되어야 한다. 이러한 구체예에서, 폴리펩타이드는 정상적이거나 평균적인 적색 골수 저장을 갖는 환자 및/또는 경험하지 않았거나, 경험하고 있지 않은 환자에게 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 보조 치료법과 함께 또는 그와 조합한 본 발명의 폴리펩타이드의 투여는 그 치료법과 기술된 결합 폴리펩타이드를 순차적으로, 동시에, 동일한 시간에 걸쳐, 병용하여, 부수적으로, 또는 동시기에 투여 또는 적용하는 것을 의미한다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는, 조합된 치료학적 레지멘의 다양한 성분의 투여 또는 적용이 치료의 전반적인 유효성을 증진시키도록 시간을 조절할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 화학요법제 또는 생물학적 작용제는 본 발명의 결합 분자와 함께 치료의 잘 알려진 표준 과정으로 투여될 수 있다. 숙련된 전문가 (예를 들어, 의사)는 선택된 보조 치료법 및 본 명세서의 교시 내용에 비추어 과도한 실험이 없이도 효과적인 조합된 치료학적 레지멘을 쉽게 식별할 수 있을 것이다.
이에 관해서, 폴리펩타이드와 작용제의 조합은 환자에게 치료학적 효과를 제공하는 어떤 시간 프레임 내에서라도 어떤 순서로든 투여될 수 있다는 것은 이해될 수 있을 것이다. 즉, 작용제와 결합 폴리펩타이드는 어떤 순서로든, 또는 병용하여 투여될 수 있다. 선택된 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 미리 화학요법을 받은 환자에게 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드 및 화학요법제 치료는 실질적으로 동시에, 또는 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자가 화학요법의 과정을 받는 중에 결합 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 어떤 작용제 또는 치료의 1 년 이내에 투여될 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 어떤 작용제 또는 치료의 10, 8, 6, 4 또는 2 개월 이내에 투여될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 어떤 작용제 또는 치료의 4, 3, 2 또는 1 주일 이내에 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩타이드는 어떤 작용제 또는 치료의 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 투여될 수 있다. 추가로, 2 개의 작용제 또는 치료는 약 몇 시간 또는 분 이내에 (즉, 실질적으로 동시에) 환자에게 투여될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 생체내에서 신생물의 성장을 제거, 감소, 억제 또는 조절하는 어떤 작용제 또는 작용제와 함께 또는 조합하여 (예를 들어, 조합된 치료학적 레지멘을 제공) 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명과 상화적인 화학요법제의 예로는 알킬화제, 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴), 프로카르바진, 메토트렉세이트 및 프레드니손이 포함된다. 4-약물 조합물인 MOPP (메클레타민 (질소 머스타드), 빈크리스틴 (온코빈), 프로카르바진 및 프레드니손)는 다양한 유형의 림프종을 치료하는데 매우 효과적이며, 본 발명의 바람직한 구체예를 구성한다. MOPP-저항성 환자에게서는, ABVD (예를 들어, 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), ChlVPP (클로람부실, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손), CABS (로무스틴, 독소루비신, 블레오마이신 및 스트렙토조토신), MOPP + ABVD, MOPP + ABV (독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴) 또는 BCVPP (카르무스틴, 사이클로포스파마이드, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손) 조합물이 사용될 수 있다. 표준 투약 및 스케줄에 대해서는 문헌 [Arnold S. Freedman and Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in Harrison's Principles of Internal Medicine 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al., eds., 13th ed. 1994) 및 V. T. DeVita et al., (1997)] 및 이들에서 인용된 문헌을 참고로 한다. 이들 치료법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드와 조합하여 변화없이, 또는 특정한 환자에 대해서 필요에 따라 변화시켜 사용될 수 있다.
본 발명과 관련하여 유용한 추가의 레지멘은 사이클로포스파마이드 또는 클로람부실과 같은 단일 알킬화제, 또는 CVP (사이클로포스파마이드, 빈크리스틴 및 프레드니손), CHOP (CVP 및 독소루비신), C-MOPP (사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진), CAP-BOP (CHOP + 프로카르바진 및 블레오마이신), m-BACOD (CHOP + 메토트렉세이트, 블레오마이신 및 로이코보린), ProMACE-MOPP (프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 에토포사이드 및 로이코보린 + 표준 MOPP), ProMACE-CytaBOM (프레드니손, 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 에토포사이드, 사이타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 로이코보린) 및 MACOP-B (메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 고정화 용량 프레드니손, 블레오마이신 및 로이코보린)와 같은 조합물의 사용을 포함한다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 이들 레지멘 각각에 대한 표준 투약량 및 스케줄을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. CHOP은 또한, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 프로카르바진, 질소 머스타드, 시토신 아라비노사이드 및 에토포사이드와 조합된다. 그 밖의 다른 상화성 화학요법제에는 2-클로로데옥시아데노신 (2-CDA), 2'-데옥시코포르마이신 및 플루다라빈이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
완화에 도달하는데 실패하였거나 재발한 중간- 및 고-등급 NHL을 갖는 환자에 대해서는, 구제 치료법 (salvage therapy)이 사용된다. 구제 치료법은 단독으로, 또는 조합물로 제공되는 시토신 아라비노사이드, 카보플라틴, 시스플라틴, 에토포사이드 및 이포스파마이드와 같은 약물을 사용한다. 특정의 신생물성 장애의 재발되거나, 공격적인 형태의 경우에는, 종종 다음의 프로토콜이 사용된다: 각각 잘 알려진 투약율 및 스케줄로 IMVP-16 (이포스파마이드, 메토트렉세이트 및 에토포사이드), MIME (메틸-gag, 이포스파마이드, 메토트렉세이트 및 에토포사이드), DHAP (덱사메타존, 고용량 사이타라빈 및 시스플라틴), ESHAP (에토포사이드, 메틸프레드니손, HD 사이타라빈, 시스플라틴), CEPP(B) (사이클로포스파마이드, 에토포사이드, 프로카르바진, 프레드니손 및 블레오마이신) 및 CAMP (로무스틴, 미토크산트론, 사이타라빈 및 프레드니손).
하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 폴리펩타이드는 생물학적 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 용어 "생물학적 제제" 또는 "생물학적 작용제"는 치료학적으로 사용하고자 하는, 생존 유기체로부터 만들어진 모든 약제학적으로 활성인 작용제 및/또는 그들의 생성물을 나타낸다. 본 발명의 하나의 구체예에서, scFc를 포함하는 결합 분자와 조합하여 사용될 수 있는 생물학적 작용제에는 예를 들어, 항체, 핵산 분자, 예를 들어, 안티센스 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 단백질이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 생물학적 제제는, 예를 들어, 결합 분자를 투여하기 전에, 결합 분자와 병용하여, 또는 결합 분자를 투여한 후에 생물학적 작용제를 투여함으로써 결합 분자와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드와 함께 사용되는 작용제의 양은 대상체에 따라서 달라질 수 있거나, 본 기술분야에서 공지된 것에 따라서 투여될 수 있다 [참조: 예를 들어, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 (Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996)]. 또 다른 구체예에서는, 표준 관리방법과 일치하는 이러한 작용제의 양이 투여된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 포유동물 장애의 생체내 치료를 위해서 약제학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이에 관해서, 본 발명의 폴리펩타이드는 투여를 용이하게 하고, 활성 작용제의 안정성을 촉진시키도록 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 생리학적 식염수, 비독성 완충제, 보존제 등과 같은 약제학적으로 허용되는, 비독성 멸균 담체를 포함한다. 본 출원의 목적에 따라, 치료학적 작용제와 컨쥬게이트되거나 비컨쥬게이트된 본 발명의 폴리펩타이드의 약제학적 유효량은 항원에 대한 유효 결합을 달성하고, 효과를 달성하는, 예를 들어, 질병 또는 장애의 증상을 개선시키거나, 물질 또는 세포를 검출하기에 충분한 양을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 종양 세포의 경우에, 폴리펩타이드는 바람직하게는 신생물성 또는 면역반응성 세포 상의 선택된 면역반응성 항원과 상호작용할 수 있으며, 이들 세포의 사멸의 증가를 제공할 수 있다. 물론, 본 발명의 약제학적 조성물은 폴리펩타이드의 약제학적 유효량을 제공하는 단일 또는 수회 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 기술내용의 범주에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 치료학적 또는 예방적 효과를 생성시키는데 충분한 양으로 상기 언급한 치료의 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 공지된 기술에 따라서 폴리펩타이드를 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 조합함으로써 제조된 통상적인 투약형으로 이러한 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특성은 조합되는 활성 성분의 양, 투여의 경로, 및 그 밖의 다른 잘 알려진 변수에 의해서 결정된다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 하나 이상의 종을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 하는 이하의 실시예에 의해서 더 설명된다. 본 출원 전체에 걸쳐서 인용된 모든 문헌, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예 전체에 걸쳐서, 다른 식으로 언급되지 않는 한, 이하의 재료 및 방법이 사용되었다.
일반적인 재료 및 방법
일반적으로, 본 발명의 실시는 다른 식으로 나타내지 않는 한, 화학, 생물물리학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학 (특히, 예를 들어, 항체 기술)의 통상적인 기술, 및 전기영동에 있어서의 표준 기술을 사용한다 [참조: 예를 들어, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)].
실시예 1. scFc의 발현 및 정제
유전적으로-융합된 Fc 부분 (즉, 단일-쇄 (scFc) 부분)을 포함하는 인간 5C8 IgG1 항체는 이전에 기술된 방법에 따라 DG44 CHO 세포에서 발현되었다. 생성된 재조합적으로-발현된 단일- 및 이중-쇄 scFc 단백질을 친화성 정제하기 위해서 (참조: 개략적으로 도 1), CHO 세포 발효 매질 (1 L)을 pH 7.0으로 조정하고, 단백질을 결합 완충액 (100 mM NaPO4, pH 7, 150 mM NaCl) 중에서 미리 평형화된 5 ㎖ 하이트랩 감마단백질A (HiTrap rProteinA) FF 칼럼 (GE Healthcare) 상에서 친화성 포획하였다. 칼럼을 A280 트레이스 (trace)가 기준선에 도달할 때까지 결합 완충액 중에서 세척하고, 결합된 단백질을 25 mM 글리신 pH 2.8, 100 mM 염화나트륨 중에서 용출시켰다. 분획을, 0.1 용적의 1 M 트리스 (Tris) 완충액, pH 8을 첨가함으로써 즉시 중화시켰다. A280 흡수성 분획 내의 단백질은 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE에 의해서 분석하고, 풀링하고, 추가의 정제를 위해서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 농축시켰다. 단일-쇄 (즉, 단량체) scFc 폴리펩타이드는 PBS, pH 7 중에서 슈퍼덱스 (Superdex) 200 겔 여과 칼럼 상의 응집체 및 이중-쇄 (즉, 이량 체) scFc 폴리펩타이드로부터 분리되었다. 겔 여과 분획은 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE에 의해서 분석하고, 적절한 분획을 합하여 단일- 및 이중-쇄 scFc 항체 집단의 균질한 풀을 수득하였다. 이들 풀을 온-라인 광산란 분석과 함께 분석적 SEC (TSK-겔 G3000 SWXL 칼럼)에 의해서 단백질의 균질성 및 분자 질량을 측정하여 더 특정화시켰다. 온전한 질량 측정 및 세포간 및 세폰 디설파이드 결합의 지도작성 (mapping)은 비-환원된, 데글리코실화 sc- 및 dc-Fc 풀에 대한 질량 분광법에 의해서 이루어졌다.
도 2A-D는 단량체 ("sc") 및 이량체 ("dc") scFc 단백질을 분리하기 위한 2-단계 정제방법의 결과를 나타낸 것이다. 정제방법은 친화성 크로마토그래피에 이어서 겔 여과 크로마토그래피를 이용하였다. 도 2A는 낮은 pH에서 단백질 A 친화성 칼럼으로부터 용출된 칼럼 분획의 흡광도 프로필을 나타낸다. 도 2B는 scFc 결합 폴리펩타이드의 이량체 ("dc") 및 단량체 ("sc") 형태 둘 다를 함유하는 이들 용출된 분획의 상응하는 SD-PAGE 분석을 나타낸다. 단량체 및 이량체 형태는 둘 다 본질적으로, 단백질 A 칼럼으로부터 단일 피크로서 용출되었다. 도 2C는 슈퍼덱스 200 겔 여과 칼럼 용출액이 이 혼합물을 2 개의 별도의 피크로 분리시킬 수 있음을 나타낸다. 도 2D는 겔 여과 용출액의 상응하는 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 피크는 각각 인간 5C8 scFc IgG1 항체의 정제된 단량체 ("sc") 및 이량체 ("dc") 형태를 나타낸다.
도 3은 비-환원성 (패널 A) 및 환원성 (패널 B) 조건 하의 예비 스케일에서 scFc 결합 폴리펩타이드의 이량체 ("dc") 및 단량체 ("sc") 형태의 SDS-PAGE를 나타낸다. 각각의 패널에 대해서, 레인 1 및 2는 각각 이량체 형태 ("dc"; 205 kDa) 및 단량체 ("sc"; 105 kDa) 형태를 함유한다. 레인 3은 대조용 인간 5C8 IgG1 항체 (5C8; 150 kDa)를 함유한다.
실시예 2. 단량체 및 이량체 scFc 항체의 기능적 상호작용을 측정하기 위한 시험
(a) shCD40L 결합시험
단량체 ("sc") 및 이량체 ("dc") scFc 항체의 직접적인 항원 결합을 검출하기 위해서, 가용성 인간 CD40L (CD154)을 웰당 100 ㎕로, 4℃에서 ON으로 PBS (pH 7) 중의 2 ㎍/㎖로 눈크 맥시솝 (Nunc MaxiSorp) 96-웰 플레이트 상에 코팅하였다. IgG 용액을 플레이트로부터 진탕시키고, 웰을 실온에서 10 mM NaPi, 0.362 M NaCl, 0.05% 트윈-20, 0.1% 카제인, 5% FBS을 함유하는 차단 완충액 (pH 7) (웰당 300 ㎕) 중에서 2 시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 비우고, 비오티닐화된 WT 5c8 hIgG1, sc 또는 dc scFcs를 1 ㎍/㎖로부터 적정하고, 웰당 100 ㎕의 차단 완충액 중에서 플레이트를 가로질러서 1:3으로 희석하였다. 실온에서 2 시간 동안 배양한 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈-20 중에서 4 회 세척하였다. 호스-래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 스트렙타비딘을 차단 완충액 중에서 1:10,000으로 희석하고, 웰당 100 ㎖를 실온에서 1 시간 동안 플레이트에 첨가하여 결합된 scFcs를 검출하였다. 플레이트를 세척하고, 발색이 기질 테트라메틸 벤지딘 (TMB, 웰당 100 ㎕) 의 존재 하에서 약 5 분 동안 진행하도록 하였다. 0.5 M H2SO4를 웰당 100 ㎕로 첨가함으로써 반응을 급랭시키고, 450 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 도 6은 단량체 ("sc") scFc 항체, 이량체 ("dc") scFc 항체, 및 통상적인 인간 IgG1 항체 (Hu 5C8)의 항원 결합 친화성을 비교하는 ELISA 결합시험의 결과를 나타낸다.
비아코어 (biacore) 분석도 또한, 항원 CD40L에 대한 5c8 IgG1 2가 mAb, 일가 Fab 및 일가 3xG4S-연결된 헤미글리코실화 scFc의 결합에 대해서 비아코어에 의해 측정된 친화성 및 오프율 (off-rates)을 측정하기 위해서 수행되었다 (참조: 표 2). scFc의 그의 표적 항원에 대한 친화성은 mAb의 경우보다 더 약하고, Fab의 경우와는 동등한 것으로 확인되었다.
Figure 112009077057212-PCT00003
(b) FcRn 결합 ELISA
인간 및 랫트 FcRn에 대한 직접적인 결합을 검출하기 위해서, 야생형 (WT) 5C8 hIgG1 및 단량체 ("sc") 및 이량체 ("dc") scFc 항체를 4℃에서 ON으로 PBS (pH 6) 중의 5 ㎍/㎖로 눈크 맥시솝 96-웰 플레이트 상에 코팅하였다. IgG 용액을 플레이트로부터 진탕시키고, 웰을 실온에서 0.1 M 인산나트륨, 0.1 M 염화나트륨, 0.05% 트윈 20 및 0.1% 젤라틴을 함유하는 차단 완충액 (pH 6)중에서 2 시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 PBS (pH 6) 중에서 세척하고, 차단 완충액 중의 비오티닐화된 인간 또는 랫트 FcRn-Fc를 1 ㎍/㎖의 출발 농도에서 적정하고, 플레이트를 따라서 1:3으로 계열 희석하였다. 실온에서 2 시간 동안 배양한 후에, 플레이트를 PBS (pH 6) 중에서 세척하고, 차단 완충액 중에서 1:10,000으로 희석된 호스-래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 스트렙타비딘을 실온에서 1.5 시간 동안 웰에 첨가하여 결합된 비오티닐화된 FcRn-Fc을 검출하였다. 플레이트를 세척하고, 발색이 기질 테트라메틸 벤지딘 (TMB)의 존재 하에서 약 15 분 동안 진행하도록 하였다. 0.5 M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 급랭시키고, 플레이트를 450 ㎚에서 판독하였다.
도 7은 scFc 결합 폴리펩타이드의 이량체 및 단량체 형태의 FcRn 결합 친화성을 통상적인 IgG1 항체 (Hu 5C8)의 경우와 비교하는 FcRn 결합시험의 결과를 나타낸다. FcRn 결합은 인간 및 랫트 FcRn-Fc 구조물 둘 다의 비오티닐화된 형태를 사용하여 측정되었다. 이 시험에서는, 각각의 Fc 함유 구조물을 플레이트 상에 코팅하고, 비오티닐화된 랫트 또는 인간 FcRn-Fc 구조물의 결합을 스트렙타비딘 HRP로 검출하였다. 인간 FcRn (랫트 FcRn은 아님)에 대한 단량체 scFc의 결합에 대해서 측정된 c-값은 Hu5C8 또는 이량체 scFc 항체의 경우보다 대략 4-배 더 낮았다.
(c) FcγR 결합시험
FcγRI (CD64)에 대한 WT 5C8 hIgG1 항체 및 단량체 ("sc") 및 이량체 ("sc") scFc 항체의 결합은 이전에 기술된 세포-기본 브릿지화 시험 (cell-based bridging assay) [Ferrant JL et al., International Immunology, 2004]에서 측정되었다. FcγRI (CD64) 브릿지화 (bridging) 시험은 시험 항체를 포획하기 위하여 10 ㎍/㎖의 인간 재조합 가용성 CD40L (CD154)로 코팅된 96-웰 맥시소르브 (Maxisorb) ELISA 플레이트 (Nalge-Nunc, Rochester, NY, USA) 상에서 수행하였다. 시험 항체는 1 ㎍/㎖로부터 출발하여 웰 내에서 적정하고, 플레이트를 따라서 1:3으로 계열 희석하였다. 형광 표지된 CD64+CD32+ U937 세포 (ATCC)의 항체 의존적 결합은 ex. 485 ㎚/em. 530n ㎚에서 측정되었다.
Fcγ 수용체를 점유하는 GGGGS ("1x-G4S") 또는 (GGGS)3 ("3x-G4S") 링커를 포함하는 scFc 항체의 능력은 또한, 증폭된 발광 근접 균질적 분석법 (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay; 알파스크린 (Alphascreen®), Perkin Elmer)에서 평가되었다. 공여체 비드의 레이저 여기 (680 ㎚)는 단일상태 (singlet) 산소를 발생시키는데, 이것은 수용체 비드에 근접하면 궁극적으로 520-620 ㎚에서 형광 방출을 유도하는 현상의 캐스케이드를 개시한다. 단지 수용체와 리간드가 기능적으로 연관되는 경우에만, 각각 리간드 및 수용체 단백질로 장식된 공여체 및 수용체 비드는 원하는 근접도로 유도된다.
알파스크린 시험은 경쟁적 체제로 수행되었으며, 여기에서는 시험 항체 (WT IgG1 또는 scFc)의 계열 희석액을 인간 FcγRIII-GST (CD16a, V158) 및 안티-GST 수용체 비드와 함께 96-웰 화이트 플레이트 (white plate) 내에서 4℃에서 밤새 배양하였다. 스트렙타비딘 공여체 비드 및 비오티닐화된 야생형 IgG1을 또한, 별도의 튜브 내에서 4℃에서 밤새 배양한 다음에, 다음날에 시험 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 온화하게 진탕하면서 2-시간 배양한 후에, 플레이트를 엔비존 (Envision®) 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)에서 판독하였다. 완전히 글리코실화된 WT 인간 IgG1에 비해서, 헤미-글리코실화된 3x- 및 1x-G4S 연결된 scFcs는 각각 저친화성 인간 FcγRIII의 고친화성 변이체 (V158)에 대해 대략 4-배 및 57-배 더 낮은 친화성을 갖는 것으로 나타났다 (참조: 도 14A).
알파스크린 시험을 수행하여 야생형 인간 IgG1 항체 (5c8), 및 Fcγ 수용체에 대하여 상당히 약화된 결합을 나타내는 것으로 예상되는 인간 IgG1의 조작된 비글리코실화된 변이체 ("Agly 5c8 scFc")의 경우에 대비하여 헤미글리코실화되거나 완전히 글리코실화된 scFc 폴리펩타이드의 FcγR-결합 활성을 평가하였다. 인간 및 시노몰구스 FcγR IIa (CD32a), IIb (CD32b) 및 III (CD16a)에 대한 결합은 이 시험에서 측정되었다. 헤미글리코실화된 것뿐만 아니라 완전히 글리코실화된 3xG4S 연결된 scFc 변이체는 모두 WT IgG1에 비길만한 겉보기 친화성을 가지고 수용체에 결합한 반면에, FcγRIII에 대한 1x G4S 연결된 scFc의 결합은 WT IgG1에 대해서 측정된 값에 비해서 약 60-배 더 약하였다 (참조: 도 14B).
(d) 인간 CD40L과의 scFc 항체 컴플렉스의 SEC-LS
온-라인 광산란 실험과 함께 비-평형 분석적 겔 여과는, 단일-쇄 ("sc"; 즉, 단량체) 또는 이중-쇄 ("dc"; 즉, 이량체) scFc 항체 및 트라이머성 리간드, CD40L을 다양한 몰비로 혼합시킨 경우에 형성된 컴플렉스의 크기 및 화학량론을 측정하기 위해서 설정되었다. WT 인간 IgG1 안티-인간 CD40L mAb (5C8)가 이들 시험에서 대조 분자로 사용되었다. 각각의 scFc 항체를 리간드와 혼합시켜 결합 부위의 거의 동몰비(1:1)뿐만 아니라 트라이머성 리간드가 3-배 과량으로 존재하는 경우의 비 (1:3)를 수득하였다. 단백질을 혼합시키고, PBS 중에서 최종 용적까지 만들고, ≥4 시간 동안 평형화시키도록 하였다. 가용성 인간 CD40L 농도는 동몰 결합 부위를 나타내는 혼합물에 대해서 3 μM로 일정하게 유지시키고, 리간드 결합 부위의 3-배 과량을 나타내는 혼합물에 6 μM로 첨가하였다. 컴플렉스를 40 ㎕ 용적으로 TSK-GEL G4000 SWXL 칼럼 (7.8 ㎜ 〉30 ㎝, Tosoh) 상에 0.6 ㎖/분으로 주입하였다. 이들 시험을 위해서 사용된 HPLC 시스템 (Waters 2690)은 온-라인 UV, 광산란 (PD2000 DLS, Precision Detectors) 및 RI 검출기와 함께 준비하여 컴플렉스의 분자량 및 화학량론이 쉽게 측정될 수 있도록 하였다.
도 4A-B는 호모트라이머성 shCD40L 항원에 결합된 단일-쇄 ("sc") 또는 이중-쇄 ("dc") scFc 항체의 컴플렉스의 특정화를 나타낸다. 도 4A는 각각의 컴플렉스의 분자량을 측정하기 위해서 수행된 SEC-LS 실험에 대해서 수득된 크기 배제 크로마토그램의 복합형을 나타낸다. 도 4B는 shCD40L에 대한 (i) 단일-쇄 ("sc") 및 (ii) 이중-쇄 ("dc") scFc 항체 각각의 결합에 의해서 형성된 예상되는 컴플렉스뿐만 아니라 이들 컴플렉스의 이론적 분자량을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 단일-쇄 ("sc") scFc 항체 또는 통상적인 인간 IgG1 안티-CD40L mAb (5C8)의 존재 하에서 형성된 shCD40L 함유 컴플렉스의 비교를 나타낸다. 각각의 컴플렉스의 측정된 분자량은 각각의 피크 상에 표시하였다. 단일-쇄 ("sc") scFc, 5C8 및 shCD40L의 예상되는 분자량은 각각 105 kDa, 150 kDa, 및 51 kDa이다.
실시예 3. 특이적 폴리펩타이드 링커에 의한 scFc 폴리펩타이드의 증진된 발현
특이적 폴리펩타이드 링커의 사용은 단일- (즉, 단량체) 또는 이중-쇄 (즉, 이량체 ) scFc 구조물의 선택적 발현에 대해서 선택하기 위해서 사용될 수 있다. 도 12는 그들의 scFc 부분의 Fc 부위 사이에 개재된 1xG4S 또는 3xG4S 링커를 함유하는 단백질-A 친화성 정제된 scFc 구조물의 특정화를 나타낸다. 1x G4S (도 12A) 및 3xG4S (도 12B) scFc에 대해서 수득된 단백질A 풀의 예비 스케일 크기 배제 크로마토그래피는 증가된 링커 길이와 단량체 ("sc") 대 이량체 ("dc") scFc로 발현된 단백질 퍼센트 사이의 명백한 상관관계를 나타낸다. 용출된 물질 내에 함유된 sc- 및 dc- scFc 집단은 지시된 분획의 SDS-PAGE에 의해서 확인되었다. 1xG4S 또는 3xG4S 링커를 포함하는 단백질A 친화성 정제된 scFc 구조물에 대해서 수득된 분석적 크기 배제 크로마토그래피 트레이스의 오버레이 (overlay)는 또한, 1x G4S 연결된 scFc 구조물이 원하는 단량체 scFc ("sc") 이외에도 이량체 scFc 폴리펩타이드 ("dc")의 인지가능한 양을 갖는 혼합된 집단을 포함하는 반면에, 3xG4S 링커 구조물은 단량체 scFc 집단에 대해서 상당히 풍부함을 나타낸다 (도 12C i 및 ii). 2-단계 정제 프로토콜에 따라서 수득된 1x 및 3x G4S 연결된 scFc 단백질의 분석적 SEC-LS 분석은 두 가지 scFc 단백질이 모두 균질하게 제조될 수 있으며, 제제는 예상된 분자 질량 (100 kDa)의 물질을 함유한다는 것을 나타낸다. 따라서, 1x G4S 링커에 의해서 유전적으로 융합된 Fc 부위를 포함하는 scFc 폴리펩타이드는 원하는 단일-쇄 ("sc") scFc 폴리펩타이드 이외에도 이중-쇄 ("dc") scFc 폴리펩타이드 의 인지가능한 양을 갖는 분자의 혼합된 집단을 포함한다. 이에 반해서, 3x-G4S 연결된 scFc 구조물은 단일-쇄 ("sc") scFc 폴리펩타이드 집단에 대해서 상당히 풍부하다.
실시예 4. scFc 폴리펩타이드의 약력학적 (PK) 특징의 측정
WT 인간 IgG1 (5C8), 및 1x- 및 3x-G4S 링커를 함유하는 scFc 구조물의 종결 반감기는 랫트에서 측정되었다. 각각의 구조물을 3 마리의 동물에게 PBS (pH 7) 중의 2.5 ㎎/㎏로 정맥내 투여하였다. 혈청 샘플을 미리 결정된 시점에 수집하고, 분석을 위해서 -80℃에서 동결시켜 저장하였다. 각각의 구조물의 혈청 농도에 대한 시간 과정은 ELISA에 의해서 측정되었다. 간략하게, 재조합 가용성 인간 CD40L (CD154)을 4℃에서 ON으로 눈크 맥시솝 96-웰 플레이트 상에 PBS (pH 7) 중의 5 ㎍/㎖으로 코팅하였다. 플레이트를 차단 완충액 (10 mM PBS (pH 7) 중의 1% 카제인 가수분해물, 300 ㎕/웰, RT에서 2 시간)으로 차단시켰다. 다양한 시점에 수득된 혈청 샘플의 계열 희석액은 10 mM PBS (pH 7), 0.362 M NaCl, 0.05% 트윈-20, 0.1% 카제인, 5% FBS 중에서 제조하고, RT에서 2 시간 동안 적절한 웰에 적용하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 중에서 4 회 세척하고, 포획된 IgG 및 scFc 폴리펩타이드를 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 당나귀 안티-인간 IgG 이차 항체 (Jackson Immunoresearch 709-035-149)와 2 시간 동안 배양한 후에 450 ㎚에서 검출하였다. WT 및 scFc 폴리펩타이드의 혈청 농도에서의 시간 의존적 변화는 윈논린 (WinNonLin®) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. WT 인간 IgG1 및 3x-G4S 연결된 scFc 폴리펩타이드는 각각 14일 및 12일의 유사한 베타-상 반감기를 나타내었다. 1x-G4S 연결된 scFc의 반감기는 WT mAb보다 상당히 더 짧은 4.2일이었다 (참조: 도 13).
실시예 5. 헤미글리코실화된 scFc 폴리펩타이드의 제조
본 발명의 예시적인 scFc 폴리펩타이드는 그의 scFc 부분의 2 개의 Fc 부위 중의 하나에서 단일 글리칸을 갖는 3xG4S-연결된 헤미글리코실화된 5c8 scFc 폴리펩타이드이다. 헤미글리코실화가 있어났음을 확인하기 위하여, scFc 폴리펩타이드를 헤미글리칸의 효소적 제거 전 및 후에 풀어진 질량분석법 (MS)에 적용하였다. 도 15는 단백질의 PNGaseF 데글리코실화 전 및 후에 수득된 풀어진 질량 스펙트럼을 나타낸다. scFc 폴리펩타이드의 데글리코실화된 (및 환원된) 중쇄 및 경쇄에 대해서 측정된 질량은 각각 75,703 Da 및 23,854 Da이다. 따라서, 온전한 데글리코실화된 분자는 99,557 Da의 질량을 가져야 하고, 이것은 100 kDa의 계산된 질량과 잘 일치한다. 따라서, 데글리코실화된 scFc 폴리펩타이드의 분자량은 헤미글리코실화와 일치한다.
실시예 6. scFc 폴리펩타이드의 생물물리학적 분석
본 발명의 scFc 폴리펩타이드는 바람직하게는, 통상적인 폴리펩타이드와 동등한 생물물리학적 특성 (예를 들어, 열안정성)을 갖는다. 5c8 scFc 폴리펩타이드의 열안정성은 시차주사열량분석 (DSC)에 의해서 WT huIgG1 mAb 및 Fc의 열안정성과 동등하였다. scFc의 Fab 및 CH3 영역에 대한 융점 프로필은 IgG1의 mAb 및 Fc 단편에 대해서 수득된 것과 잘 일치하는 것으로 밝혀졌다 (참조: 도 16). 특히, 헤미글리코실화된 scFc (ASK043)의 CH2 영역은 비글리코실화된 IgG1의 영역과 유사한 Tm (각각 61.9℃ 대 61℃)을 갖는 반면에, 완전히 글리코실화된 scFc (ASK048)는 WT IgG1의 CH2 영역에 대해서 측정된 것과 등동한 개선된 안정성을 갖는다.
실시예 7. 개선된 용해도를 갖는 안티-LINGO scFc 항체
LINGO-1은 NgR1/p75 및 NgR1/TAJ (TROY)와 함께 마이엘린 억제제를 결합시키고, 축삭 성장 (axonal outgrowth)을 매개하는 시그날링 컴플렉스를 형성하는 CNS-특이적이고 막 회합된 당단백질이다. LINGO-1 결합에 대해 길항하는 가용성 LINGO-1 (LINGO-1-Fc)는 척수로 (spinal tract) 손상 모델에서 기능적 회복을 상당히 개선시킬 수 있다.
몇 개의 안티-LINGO scFc 항체를 본 발명의 방법에 따라서 합성하였다. 예시적인 안티-LINGO 항체 (EAG2148)의 중쇄의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도 32, 33 및 도 35-38에 나타낸다. 각각의 항체의 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도 34에 나타낸다. 도 39는 분석적 SEC (A 및 B) 및 초원심분리 (C)에 의해서 측정된 것으로서 안티-Lingo, scFc 항체 분자의 단백질 농도 의존적 용해도 특징의 분석을 나타낸다. 안티-LINGO 인간 IgG1 항체인 Li33은 응집하는 경향이 있으며, 따라서 더 가용성인 인간 IgG2 버전이 생성되었다. 그러나, 더 가용성인 IgG2 구조물 (B)과 비교하더라도, 1xG4S 연결된, 헤미글리코실화된 Li33 scFc (A)는 상당히 더 우수한 용해도 특징을 나타내는데, 이는 단백질 농도가 증가함에 따라 곡선하 면적은 IgG2 단량체에 대해서는 감소하지만 scFc에 대해서는 그렇지 않기 때문이다. (C) 20 mM 트리스, 150 mM NaCl (pH 8) 중의 0.7 ㎎/㎖에서 안티-LINGO Li33scFc의 균질성의 평가는 침강속도 측정을 사용한 분석적 초원심분리에 의해서 이루어졌다. 이 농도에서 Li33 scFc 제제에서는 1% 이하의 응집된 물질이 검출될 수 있었던 반면에, PBS (pH 7) 중의 0.3 ㎎/㎖ 정도의 낮은 농도에서 Li33 IgG2 mAb 제제는 4%-16% 응집된 단백질을 포함하였다.
실시예 8. 안티-CD2 scFc 항체
CD2는 특정의 자가면역 장애 (예를 들어, 이식편 대 숙주 질병, 건선, 신장 이식) 및 T-세포 암 (예를 들어, 비-호지킨 림프종)을 포함하는 다수의 T-세포 연관된 장애와 관련된 T-세포 및 천연 킬러 (NK) 세포 상에서 발견되는 종양-연관된 팬 T 세포 항원이다. 예시적인 안티-CD2 scFc 항체는 본 발명에 따라 합성될 수 있다. chCB6은 인간 CD2-특이적 키메라 모노클로날 항체 (IgG1, kappa)이다. 3xG4S, 4xG4S, 5xG4S, 또는 6xG4S 링커를 포함하는 완전히 글리코실화된 chCB6 키메라 scFc 항체는 본 발명에 따라서 합성되었다. 예시적인 중쇄 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도 40-47에 나타내었다.
실시예 9. 안티-LTβR scFc 항체
림프독소 β 수용체 (LTβR)는 수용체의 종양 괴사인자 (TNF) 패밀리의 구성원이며, 세포소멸 및 암에 연루되어 있다. 예시적인 안티-LTβR scFc 항체는 본 발명의 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, BDA8의 결합 부위는 본 발명의 scFc 부위에 융합될 수 있다. BDA8 항체의 예시적인 중쇄 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도 64에 나타낸다.
실시예 10. GFRα3: scFc 융합 폴리펩타이드
GFRα3은 신경교-유래 향신경성 인자 (GDNF) 수용체 패밀리의 구성원이다. 그들의 생리학적 역할로 인하여, 가용성 향신경성 인자는 다양한 신경변성 질병에서 나타나는 신경세포의 변성 및 차별화된 기능의 상실을 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합, 바람직하게는 GDNF 결합, 및 수용체 시그날링 기능 (Ret 수용체 타이로신 키나제를 통해서) 둘 다를 보유하는 가용성 GDNFRa는 뉴론 또는 다른 세포에 대한 GDNFRa-리간드 (바람직하게는, GDNF) 반응성을 부여하거나, 복원시키거나, 증진시키기 위해서 사용될 수 있다.
예시적인 GFRα3:scFc 융합 단백질 (ASK057)은 본 발명의 방법에 따라 합성되었다. ASK057의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도 48 및 도 49에 나타낸다. 도 50은 융합 단백질의 발현 이후의 비-환원성 SDS-PAGE 및 분석적 SEC-LS 특정화를 나타낸다. 단백질A 칼럼으로부터 용출된 물질을 풀링하고 (L), 단량체 (sc) 및 이량체 (dc) scFc 집단 (겔의 레인 1)의 분리를 위해서 슈퍼덱스 200 겔 여과 칼럼 상에 부하시키고, 이어서 레인 2에 분자량 표준물 (M)을 부하시켰다. GFRα3:scFc에 대해서 풀링된 SEC 분획은 2 개의 점선 사이에 괄호로 묶었다. 2-단계 정제 후에 수득된 GFRα3:scFc의 SEC-LS 분석은 114.8 kDa의 분자 질량을 갖는 균질한 제제를 나타내었다. 호모이량체 뉴블라스틴 (neublastin)네 대한 GFRα3:scFc 결합의 화학량론은 2 GFRα3 : scFc : 1 뉴블라스틴 이량체에 대한 용액상 비아코어 실험에 의해서 측정되었다.
실시예 11. IFN-β:scFc 융합 폴리펩타이드
인터페론 베타-1a (예를 들어, 아보넥스 (AVONEX®))는 다발성 경화증의 치료에 유용하다. 예시적인 IFN-β:scFc 이뮤노어드헤신 (EAG2149)은 본 발명의 방법에 따라 합성되었다. EAG2149 분자는 1xG4S 링커를 함유하였으며, 헤미글리코실화를 용이하게 하기 위해서 변형되었다. ASK057의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도 51 및 도 52에 나타낸다.
실시예 12. LTβR:scFc 융합 폴리펩타이드
예시적인 LTβR:scFc 이뮤노어드헤신 (EAG2190 및 EAG2191)은 본 발명의 방법에 따라 합성되었다. EAG2190 분자는 3xG4S 링커를 함유하였으며, 헤미글리코실화를 용이하게 하기 위해서 변형되었다. 이들 분자의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도 53-56에 나타낸다. 정제된 LTβR:scFc 융합 단백질의 4-12% 구배 SDS-PAGE를 수행하여 DLI33scFc에 대한 75 kD의 예상된 분자량에 상응하는 단일 밴드를 밝혀내었다. 정제된 단백질의 분석적 겔 여과는 20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 150 mM NaCl (PBS) 중의 페노멕스 바이오셉 (Phenomonex Biosep)-S-3000 칼럼 상에서 0.5 ㎖/분으로 수행되었다. 용출액은 280 nM에서 모니터하였다. 그 후, 정제된 LTβR:scFc를 균질성 및 공지의 리간드 LTa1에 대한 결합 활성에 대해서 특정화되었다. 정제된 LTβR:scFc의 환원성 및 비환원성 SDS PAGE는 도 57A에 나타낸다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피는 정제된 LTβR:scFc에 대한 높은 균질성의 단일 피크를 나타낸다 (도 57B).
LTBR:scFc는 DTT로 환원시킴으로써 PNGaseF로 데글리코실화하고, 실온에서 12 시간 동안 배양한 후에 LCZ 질량분석계 상에서 질량분석하였다 (참조: 도 58). 환원 및 N-데글리코실화된 분자의 질량분석법은 73,844.5의 이론적 분자 질량이 73,846의 측정값과 일치하였음을 나타내었다. N-말단 단백분해적 뷸균질성이 발현된 LTβR:scFc의 처음 4 개의 아미노산에서 관찰되었으며, N-1 및 N-3 성분 둘 다의 첫 번째 잔기는 피로글루타메이트이다. 낮은 레벨의 O-글리코실화는 74726 및 74820에서의 피크로 반영된 질량분석법에서 관찰되었다.
도 59A는 LTα1β2에 대한 단량체 LTβR:scFc의 결합 친화성을 평가하는 ELISA의 결과를 도시한다. ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중의 5 ㎍/㎖ LTα1β2로 코팅하였다. 그 후, 플레이트를 10 mM PBS (pH 7.0) 중의 1% 카제인으로 차단한 후, 10 mM PBS (pH 7.0), 0.1% 트윈 20 (세척 완충액)으로 3 회 세척하였다. LTβR:IgG 또는 LTBβscFc를 10 mM PBS, 362 mM NaCl, 0.055 트윈-20, 0.1% 카제인, 5% FBS pH 7.0 (시험 희석제)으로 계열 희석하고, 1 시간 동안 배양한 다음에, 세척 완충액으로 세척하였다. 각각의 웰에 시험 희석제 중에서 1:5000으로 희석된 당나귀 안티-인간 중쇄 및 경쇄 특이적 HRP (Jackson Labs) 컨쥬게이트된 이차 항체를 첨가한 다음에, PBS로 세척하였다. 몇 분 후에, 100 mM Na 아세테이트 (pH 4.0) 중의 테트라메틸벤지딘 및 과산화수소를 사용하여 HRP를 발색시키고, 100 ㎕의 1 N 황산을 첨가하여 시험을 중지시키고, 샘플 흡광도를 450 ㎚에서 판독하였다. ELISA 분석은 LTβR:scFc가 LTβR:IgG에 비해서 감소된 결합 친화성을 갖는 것을 나타낸다. 이 결과는 이량체 LTβR:IgG에 비해서 단량체 LTβR:scFc의 감소된 화합력으로 반영되었다. 이량체 LTβRIgG (<0.10 nM) 및 단량체 LTβR (40 nM)의 Kd 값은 이미 400 배 이상까지 상이한 것으로 나타났다 [Eldredge, Berkowitz et al. 2006].
단량체 LTβR:scFc의 결합 친화성은 또한, FACS 분석에 의해서 평가되었다 (도 59B). FACS는 엘드렛지 (Eldredge)의 방법 [Eldredge, Berkowitz et al. 2006]에 따라 II-23 세포 상에서 수행되었다. 유동 세포분석을 사용한 FACS 결합시험은 이전에 기술된 방법 [Force, Walter et al. 1995]에 따라 수행되었다. 간략하면, 직접 결합시험에서 인간 LTα1β2는 다양한 농도의 LTβRIgG 또는 비오티닐화된 LTβRIgG (bLTβRIgG)를 함유하는 FACS 완충액 중의 포르볼 미리스테이트 아세테이트 활성화된 II-23 세포 (American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA) 상에서 검출되었다. 세포를 얼음 상에서 1-2 시간 동안 배양한 다음에, PBS로 세척하고, 원심분리시켰다. FACS 완충액 중의 적절한 스트렙타비딘 피코에리트린 또는 안티-hFc 피코에리트린 표지된 이차 항체 (Molecular Probes, Eugene, OR)를 첨가하고, 추가로 1 시간 동안 세포와 함께 배양하고, 다시 세척하였다. II-23 세포 상의 세포성 결합된 LTLTβRIgG의 형광 염색은 FACS에 의해서 평균 채널 형광을 측정함으로써 정량화되었다. FACS 및 ELISA는 둘 다 LTβRscFc가 LTβRIgG에 비해 감소된 결합 친화성을 갖는 것을 나타낸다. 이 결과는 단량체 단백질이 LTβRIgG의 화합력을 결여하고 있기 때문에, 예상되었다. 이량체 LTβRIgG (<0.10 nM) 및 단량체 LTβR (40 nM)의 Kd 값은 이미 400 배 이상까지 상이한 것으로 나타났다 [Eldredge, Berkowitz et al. 2006].
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Claims (88)

  1. (i) 제1 결합 부위(binding site), 및 (ii) 단일의 인접한 유전자 서열에서 코딩된 제1 Fc 부분을 포함하며, 여기에서
    a. 상기 Fc 부분(Fc region)은 2개 이상의 Fc 부위(Fc moiety)를 포함하고;
    b. 상기 Fc 부분은 상기 Fc 부위 사이에 개재된 폴리펩타이드 링커 서열을 통해서 융합되며;
    c. 상기 Fc 부분은 상기 결합 폴리펩타이드에 하나 이상의 효과기 기능을 부여하는 결합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Fc 부분이 FcRn 결합 부분(binding portion), FcγR 결합 부분, 보체 결합 부분, 단백질 G 결합 부분, 및 단백질 A 결합 부분으로 구성된 군으로부터 선택된 영역(domain)을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 부분이 이종(heteromeric) Fc 부분인 결합 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이종 Fc 부분이 헤미글리코실화된 결합 폴리펩타이드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 부분이 동종 Fc 부분인 결합 폴리펩타 이드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 부분이 완전히 글리코실화된 결합 폴리펩타이드.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 부분이 비글리코실화된(aglycosylated) 결합 폴리펩타이드.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 부분이 비푸코실화된(afucosylated) 결합 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 부분이 키메라 Fc 부분인 결합 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 Fc 부분이 IgG2 분자로부터의 CH2 영역 및 IgG4 분자로부터의 CH3 영역을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  11. 제9항에 있어서, 상기 Fc 부분이 IgG2 분자로부터의 CH2 부분 및 IgG4 분자로부터의 CH2 부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  12. 제9항에 있어서, 변형된 힌지 부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  13. 제9항에 있어서, IgG4 분자로부터의 중간 힌지 부분 및 IgG1 분자로부터의 상부 및 하부 힌지 부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  14. 제9항에 있어서, 힌지 부분의 하나 이상의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 결합 폴리펩타이드.
  15. 제1항에 있어서, 상기 Fc 부분이 2개 이상의 Fc 부위를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  16. 제1항에 있어서, Fc 부분이, CH2 영역, CH3 영역, 및 힌지 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 부위(moeity)가 결여된 Fc 영역을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  17. 제1항에 있어서, 상기 Fc 부위 중의 하나 이상이 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 Fc 부위 중의 2개 이상이 아미노산 돌연변이를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 돌연변이가 EU 넘버링 인덱스에 따르는 234, 236, 239, 241, 246-252, 254-256, 275, 277-288, 294, 296-298, 301, 303-307, 309, 310, 312, 313, 315, 328, 332, 334, 338, 342, 343, 350, 355, 359, 360, 361, 374, 376, 378, 381-385, 387, 389, 413, 415, 418, 422, 426, 428, 430-432, 434, 435, 438, 및 441-446으로 구성된 군에 제시된 Fc 아미노산 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에 있는 결합 폴리펩타이드.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 돌연변이가 CH2 영역 내에 위치하는 결합 폴리펩타이드.
  21. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 돌연변이가 CH3 영역 내에 위치하는 결합 폴리펩타이드.
  22. 제21항에 있어서, CH3 영역이 EU 넘버링 인덱스에 따르는 350, 355, 361, 389, 415, 441, 443, 및 446b로 구성된 군으로부터 선택된 Fc 아미노산 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 조작된 시스테인 또는 티올 함유 유사체를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  23. 제17항에 있어서, EU 위치 297에서 환원된 글리코실화를 갖는 결합 폴리펩타이드.
  24. 제23항에 있어서, EU 위치 297에서 비푸코실화된 결합 폴리펩타이드.
  25. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커가 약 50 내지 약 500개의 아미노산의 길이를 갖는 결합 폴리펩타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커가 약 50 내지 약 200개의 아미노산의 길이를 갖는 결합 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커가 약 1 내지 약 50개의 아미노산의 길이를 갖는 결합 폴리펩타이드.
  28. 제27항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커가 약 10 내지 약 20개의 아미노산의 길이를 갖는 결합 폴리펩타이드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커가 힌지 부분 또는 그의 일부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 힌지 부분이 키메라 힌지 부분인 결합 폴리펩타이드.
  31. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커가 gly/ser 펩타이드를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  32. 제31항에 있어서, 상기 gly/ser 펩타이드가 식 (Gly4Ser)n의 것이며, 여기에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 양의 정수인 결합 폴리펩타이드.
  33. 제31항에 있어서, (Gly4 Ser)n 링커가 (Gly4 Ser)3인 결합 폴리펩타이드.
  34. 제1항에 있어서, 상기 제1 결합 부위가 Fc 부분의 N-말단에 유전적으로 융합된 결합 폴리펩타이드.
  35. 제1항에 있어서, 상기 제1 결합 부위가 Fc 부분의 C-말단에 유전적으로 융합된 결합 폴리펩타이드.
  36. 제1항에 있어서, 상기 제1 결합 부위가 Fc 부분의 Fc 부위 상에 합쳐진(veneered) 결합 폴리펩타이드.
  37. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커가 상기 제1 결합 부위를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  38. 제1항에 있어서, 결합 부위가 상기 Fc 부분의 하나 이상의 Fc 부위에 혼입되는 결합 폴리펩타이드.
  39. 제1항에 있어서, 제2 결합 부위를 추가로 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 제2 결합 부위가 Fc 부분의 N-말단에 작동적으로 연결된 결합 폴리펩타이드.
  41. 제39항에 있어서, 상기 제2 결합 부위가 Fc 부분의 C-말단에 작동적으로 연결된 결합 폴리펩타이드.
  42. 제1항에 있어서, 3개 이상의 결합 부위를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  43. 제42항에 있어서, 4개 이상의 결합 부위를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  44. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커가 생물학적으로 적절한 펩타이드 또는 그의 일부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  45. 제44항에 있어서, 상기 생물학적으로 적절한 폴리펩타이드가 항-거부반응 또는 항-염증성 펩타이드인 결합 폴리펩타이드.
  46. 제44항에 있어서, 상기 생물학적으로 적절한 폴리펩타이드가 사이토킨 억제성 펩타이드, 세포 유착 억제성 펩타이드, 트롬빈 억제성 펩타이드 및 혈소판 억제성 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 결합 폴리펩타이드.
  47. 제46항에 있어서, 상기 사이토킨 억제성 펩타이드가 IL-1 억제성 펩타이드인 결합 폴리펩타이드.
  48. 제1항에 있어서, 하나 이상의 결합 부위가 항원 결합 부위, 수용체의 리간드 결합 부분, 및 리간드의 수용체 결합 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 결합 폴리펩타이드.
  49. 제48항에 있어서, 상기 결합 부위가 항체로부터 유도된 항원 결합 부위인 결합 폴리펩타이드.
  50. 제49항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화된 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 결합 폴리펩타이드.
  51. 제50항에 있어서, 상기 결합 부위가 scFv, Fab, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 나노바디, 카멜리드 및 Dab로 구성된 군으로부터 선택된 변형된 항체로부터 유도되는 결합 폴리펩타이드.
  52. 제1항에 있어서, 상기 결합 부위가 비-면역글로불린 결합 분자로부터 유도되는 결합 폴리펩타이드.
  53. 제52항에 있어서, 상기 비-면역글로불린 결합 분자가 아드넥틴, 아피바디, 다르핀(DARPin) 및 안티칼린으로 구성된 군으로부터 선택되는 결합 폴리펩타이드.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 결합 부위가 6 개의 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 부분, 또는 리툭시마브, 다클리주마브, 갈릭시마브, CB6, Li33, 5c8, CBE11, BDA8, 14A2, B3F6, 2B8, Lym 1, Lym 2, LL2, Her2, 5E8, B1, MB1, BH3, B4, B72.3, CC49, 및 5E10으로 구성된 군으로부터 선택된 항체로부터의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  55. 제48항에 있어서, 상기 수용체의 리간드 결합 부분이 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 수용체, TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 수용체, 타이로신 키나제 (TK) 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, 리간드-게이트 (LG) 슈퍼패밀리의 수용체, 케모킨 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, IL-1/Toll-유사 수용체 (TLR) 슈퍼패밀리, 신경교-유래 향신경성 인자 (GDNF) 수용체 패밀리의 수용체, 및 사이토킨 수용체 슈퍼패밀리로 구성된 군으로부터 선택된 수용체로부터 유도되는 결합 폴리펩타이드.
  56. 제55항에 있어서, 상기 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체가 LTβR인 결합 폴리펩타이드.
  57. 제55항에 있어서, 상기 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체가 TNFa와 결합하는 결합 폴리펩타이드.
  58. 제55항에 있어서, 상기 GDNF 수용체 패밀리의 수용체가 GFRα3인 결합 폴리펩타이드.
  59. 제45항에 있어서, 상기 리간드의 수용체 결합 부분이 억제성 리간드로부터 유도되는 결합 폴리펩타이드.
  60. 제48항에 있어서, 상기 리간드의 수용체 결합 부분이 활성화 리간드로부터 유도되는 결합 폴리펩타이드.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 리간드가 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 의 수용체, TNF 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 수용체, 타이로신 키나제 (TK) 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, 리간드-게이트 (LG) 슈퍼패밀리의 수용체, 케모킨 수용체 슈퍼패밀리의 수용체, IL-1/Toll-유사 수용체 (TLR) 슈퍼패밀리, 및 사이토킨 수용체 슈퍼패밀리로 구성된 군으로부터 선택된 수용체와 결합하는 결합 폴리펩타이드.
  62. 제61항에 있어서, 사이토킨 수용체 슈퍼패밀리의 수용체와 결합하는 리간드가 β-인터페론인 결합 폴리펩타이드.
  63. 제28항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 부위가 상이한 결합 특이성을 갖는 결합 폴리펩타이드.
  64. 제28항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 부위가 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 폴리펩타이드.
  65. 제1항에 있어서, 결합 분자가 2개 이상의 유전적으로 융합된 Fc 부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드.
  66. 제1항에 있어서, 하나 이상의 기능적 부위에 컨쥬게이트된 결합 폴리펩타이드.
  67. 제66항에 있어서, 기능적 부위가 차단성 부위, 검출가능 부위, 진단적 부위, 및 치료학적 부위로 구성된 군으로부터 선택되는 결합 폴리펩타이드.
  68. 제67항에 있어서, 차단성 부위가 시스테인 부가물, 혼합된 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드로 구성된 군으로부터 선택되는 결합 폴리펩타이드.
  69. 제67항에 있어서, 검출가능 부위는 형광 부위 및 동위원소 부위로 구성된 군으로부터 선택되는 결합 폴리펩타이드.
  70. 제67항에 있어서, 진단적 부위가 질병 또는 장애의 존재를 밝혀낼 수 있는 결합 폴리펩타이드.
  71. 제67항에 있어서, 치료학적 부위가 소염제, 항암제, 항-신경변성제 및 항감염제로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드.
  72. 제66항에 있어서, 상기 기능적 부위가 상기 폴리펩타이드 링커에 컨쥬게이트되는 결합 폴리펩타이드.
  73. 제66항에 있어서, 상기 기능적 부위가 디설파이드 결합을 통해서 컨쥬게이트되는 결합 폴리펩타이드.
  74. 제66항에 있어서, 상기 기능적 부위가 헤테로이작용성 링커를 통해서 컨쥬게이트되는 결합 폴리펩타이드.
  75. 제1항에 있어서, 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함하고, 다량체인 결합 폴리펩타이드.
  76. 제75항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드가 (i) 적어도 제2 결합 부위, 및 (ii) 2개 이상의 Fc 부위를 포함하고, 결합 폴리펩타이드에 하나 이상의 효과기 기능을 부여하는, 적어도 제2 유전적으로 융합된 Fc 부분을 포함하는 결합 폴리펩타이드인 결합 폴리펩타이드.
  77. 제76항에 있어서, 이량체 결합 폴리펩타이드인 다량체 결합 폴리펩타이드.
  78. 제77항에 있어서, 상기 제1 또는 2 결합 부위가 면역 세포 또는 종양 세포 상에 존재하는 항원에 결합하는 결합 폴리펩타이드.
  79. 제1항에 있어서, 하나 이상의 Fc 부위가 IgG 이소타입의 부위인 결합 폴리펩 타이드.
  80. 제79항에 있어서, IgG 이소타입이 IgG1 서브클래스인 결합 폴리펩타이드.
  81. 제1항에 있어서, 하나 이상의 Fc 부위가 인간 항체로부터 유도되는 결합 폴리펩타이드.
  82. 제1항의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
  83. 제1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  84. 제83항에 있어서, 발현 벡터 내에 존재하는 핵산 분자.
  85. 제84항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  86. 결합 폴리펩타이드가 생산되도록 배양물에서 제85항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 결합 폴리펩타이드의 생산 방법.
  87. 제86항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 질병 또 는 장애의 치료 또는 예방 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 질병 또는 장애가 신경학적 장애, 염증성 장애, 자가면역 장애, 및 신생물성 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 치료 또는 예방 방법.
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