JP6936808B2 - 融合タンパク質、核酸分子、宿主細胞、医薬組成物、及び医薬組成物の使用方法 - Google Patents
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Description
本願は2015年12月3日出願の米国特許仮出願第62/262,630号に基づく優先権を主張し、その内容の全体が本明細書に援用される。
第1のアイソフォームはVEGF 121 及びVEGF 165 の一方であり、第2のアイソフォームはVEGF121及びVEGF165 の他方である。VEGF121は、配列識別番号2の配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、90%又は85%)同じアミノ酸配列を有し得る。VEGF165は、配列識別番号4の配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、90%又は85%)同じアミノ酸配列を有し得る。
他の実施形態において、融合タンパク質は、N末端からC末端の方向へ、VEGF165、2つのFc領域の一方、リンカー、2つのFc領域の他方及びVEGF121を含む。
一実施形態において、核酸配列は、配列識別番号11の配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、90%又は85%)同じアミノ酸配列をコードする。
私どもは、強力な抗血管新生モジュレータとしてヒトIgG1の2つのFc領域と融合されるVEGF121−VEGF165の新規なキメラ二量体を生成した。キメラVEGF121−VEGF165組み換えタンパク質は3B−11の内皮細胞の管形成を減少させ、HCT−15がん細胞の浸潤を抑制することが分かった。更に私どもは、VEGF121−VEGF165タンパク質が、がん細胞のPI3K−AKT−mTOR経路を介したVEGFR2−HIF−1αシグナル伝達を減衰させることが分かった。データが示すには、キメラVEGF121−VEGF165タンパク質は血管新生及びHIF−1αシグナル伝達に拮抗し、抗血管新生治療に対する薬物耐性に効果があると示唆した。
VEGF121−VEGF165の融合は、ヒトIgG1 Fc核酸配列をVEGF121配列の3’末端及びVEGF165配列の5’末端にそれぞれ融合することにより生成され、2つのFc配列がリンカー配列により連結された。VEGF121−VEGF165融合核酸配列はpcDNA3.1ベクターにクローニングされ、VEGF121−VEGF165の発現ベクターを産出する。最終構築物の完全性はDNA配列により確認された。推定されたタンパク質は推定上の26−aaシグナルペプチドを含む。図2を参照。
VEGF121−VEGF165融合を含むプラスミド遺伝子は298T細胞株にトランスフェクトされた。VEGF121−VEGF165融合タンパク質の発現及び分泌はウエスタンブロットにより確認された。
内皮細胞増殖は初期の血管新生反応に必要であるため、私どもは、VEGF121−VEGF165タンパク質が、菅形成分析のための便利な内皮細胞モデルであるVEGF165刺激性の3B−11セルの増殖に影響したかどうかを調べた。ジョーら、メソッド、2008年、第44巻第2号、190から195頁を参照。
3B−11セル増殖に関する濃度222pMのVEGF165の効果は42pMの組み換えVEGF121−VEGF165により容易に抑制され、VEGF121−VEGF165タンパク質がVEGF165誘導性増殖の活動を効果的に阻止出来たことを示唆する。更に、VEGF121−VEGF165タンパク質は、HCT−15がん細胞のVEGF165誘導性増殖の抑制において同様の効力を示した。図3のパネルBを参照。
血管新生の後の段階は内皮細胞の形態学的変化を必要とし、それは管腔形成となる。私どもはVEGF121−VEGF165タンパク質の存在下で生体外の(in vitro)管形成を調べた。生体外の管形成分析は、毛細管状の管のネットワークを形成した場合に3次元のコラーゲンゲルに浸潤するよう誘導された3B−11内皮細胞を使用することにより採用された。ジョーら、メソッド、2008年、第44巻第2号、190から195頁を参照。
しかし、3B−11セルの管状構造形成の数は、VEGF121−VEGF165タンパク質を濃度依存性の方法で加えることにより抑制された。図4のパネルAを参照。
更に、VEGF121−VEGF165タンパク質は、傍分泌(図4、A)及び自己分泌(図4、B)でVEGF165誘導性管形成を有意に抑制した。これらの結果は、VEGF121−VEGF165キメラタンパク質はVEGF165誘導性血管新生を生体外で抑制できることを示した。
セル移動は血管新生及び腫瘍転移における重要なプロセスである。私どもはセル移動がVEGF121−VEGF165キメラタンパク質により影響されたかどうかを調べた。セル移動はギャップクロージャー移行アッセイにより調べられた。一貫して、VEGF121−VEGF165タンパク質は3B−11セルの移動を自己分泌で有意に抑制した。図5を参照。
VEGF121−VEGF165タンパク質は、傍分泌(図6、A)及び自己分泌(図6、B)でセル移動を有意に抑制した。これらのデータは、VEGF121−VEGF165キメラタンパク質が内皮細胞及び腫瘍細胞の移動を抑制できることを示唆した。
腫瘍細胞の転移のVEGF121−VEGF165キメラタンパク質の効果を有効にするため、私どもはトランズウェルアッセイを使用することにより細胞浸潤に関するタンパク質の効果を調べた。VEGF121−VEGF165が無いと、VEGF165は集中的な浸透により示されるように浸潤能力を誘発した。図7を参照。
しかし、VEGF165誘導性細胞浸潤は、HCT−15がん細胞の濃度依存性の方法でVEGF121−VEGF165を加えることにより抑制された。浸透された細胞の数は、VEGF121−VEGF165タンパク質の濃度を高めて処理すると、VEGF165のみの場合と比べて有意に減少した。図7を参照。
これらの結果は、がん細胞の浸潤がVEGF121−VEGF165タンパク質の追加により著しく抑制され、がん転移を抑制するタンパク質の役割を示唆することを示した。
VEGF121−VEGF165が抗血管新生治療に対する耐性を減ずるためのHIF−1αシグナル伝達を減衰させるかどうかをチェックするため、私どもは最初に腫瘍細胞におけるVEGFR2−HIF−1α−VEGF165軸に関するVEGF121−VEGF165の効果を調べた。Lonは低酸素誘導因子−1α(HIF−1α)により上方制御され、がん細胞を低酸素環境に適応させる低酸素利用性に反応して含まれる。
私どものデータは、VEGF121−VEGF165キメラタンパク質が内皮細胞の管形成を停止させ、腫瘍細胞の増殖、移動及び生体内での浸潤に干渉し得ると示した。VEGF121−VEGF165タンパク質の生体内での腫瘍に対する抑制効果を示すために異種移植腫瘍形成分析が行われた。分析にはBALB/cヌードマウス(6から8週間)が使用された。0.2mlのマトリゲルに懸濁された1×106のHCT−15セルがヌードマウスの背面の脇腹に皮下注射された(マウスに付き1箇所)。
マウスは腫瘍形成のため2日おきに調べられた。異なる濃度のVEGF121−VEGF165タンパク質(10、50、又は250ng/ml)又はリン酸緩衝生理食塩水の対照群がマウスの腫瘍に直接注射された。図8のパネルBを参照。
マウスの体重が監視された。図8のパネルAを参照。
マウスはその後二酸化炭素安楽死により犠牲になった。
キメラタンパク質は用量依存性の方法でマウスの腫瘍増殖を減じた。図8のパネルBを参照。よって、研究によりVEGF121−VEGF165キメラタンパク質が生体内で腫瘍増殖を抑制できると示された。
細胞株及び細胞培養:3B−11セルはアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(#CRL−2160、マナサス、バージニア、米国)から購入した。3B−11セルはダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に保持され、HCT−15セルは、37℃、5%二酸化炭素の加湿培養器において、10%の(v/v)加熱不活性化したFBS(正規のウシ胎仔血清、インビトロジェン)及び1%のPSA(ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンB懸濁液、バイオロジカルインダストリーズ、ニューヨーク、米国)を付加したRPMI−1640補足培地に保持された。
本明細書に記載される特徴の全ては、任意の組合せで組み合わされ得る。本明細書に開示された各特徴は同一、同等又は同様の目的に供する他の特徴に置き換えられても良い。よって、特に明記しない限り、開示された各特徴は、単に一般的な、連続した同等の又は同様の特徴の例である。
Claims (15)
- 融合タンパク質であって、
血管内皮増殖因子(以下「VEGF」)のアイソフォームについて、
(i)第1のアイソフォームと、
(ii)第2のアイソフォームと、
(iii)前記第1のアイソフォームと前記第2のアイソフォームとの間の二量化ドメインと、
を含み、
前記第1のアイソフォームはVEGF 121 及びVEGF 165 の一方であり、前記第2のアイソフォームはVEGF121及びVEGF165 の他方であり、
前記二量化ドメインは2つのFc領域を含み、前記Fc領域のそれぞれはヒトIgG1 Fc領域である、融合タンパク質。 - 前記2つのFc領域の間のリンカーを更に含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、N末端からC末端の方向へ、
VEGF121、前記2つのFc領域の一方、前記リンカー、前記2つのFc領域の他方、及びVEGF165を含む、請求項2に記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質は、N末端からC末端の方向へ、
VEGF165、前記2つのFc領域の一方、前記リンカー、前記2つのFc領域の他方、及びVEGF121を含む、請求項2に記載の融合タンパク質。 - 前記リンカーは15から30のアミノ酸からなるフレキシブルリンカーである、請求項2から4の何れか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーは(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)nであり、nは3である、請求項5に記載の融合タンパク質。
- ペプチドタグを更に含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチドタグはC末端6X−Hisタグである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- N末端シグナルペプチドを更に含む、請求項8に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は配列識別番号11の配列と少なくとも90%同じアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は配列識別番号11の配列を有する、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 請求項1から11の何れか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子。
- 請求項12に記載の核酸分子を備える宿主細胞。
- 請求項1から11の何れか一項に記載の融合タンパク質、及び、薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
- 被験体(ヒトを除く)のがんを治療する方法であって、請求項14に記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む医薬組成物の使用方法。
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