CN111961135A - 一种用于预防或治疗癌症的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体技术领域，提供了一种用于预防或治疗癌症的抗体，所述抗体特异性结合人密蛋白18.2，本发明还提供了包含该抗体的药物组合物及其用途、编码该抗体的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞，以及制备该抗体的方法。

Description

一种用于预防或治疗癌症的抗体
技术领域
本发明涉及一种用于预防或治疗癌症，尤其是晚期胃癌的抗体，属于生物技术领域。
背景技术
胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤。据2017年4月在北京召开的第12届国际胃癌大会上披露，中国胃癌每年新发现病例约为68万例，占全球发病总数的一半左右，同比2012年公布的44.65万例，年平均增长率超过了13％。中国胃癌死亡率是欧美发达国家的4～8倍，约每2～3分钟就有1名中国人死于胃癌。相比其他国家，中国的胃癌形势更加严峻。
中国大部分胃癌患者确诊时，病情已经进入中晚期，手术后效果极不理想，且预后极差，是临床上极为棘手的恶性肿瘤。
细胞间紧密连接(tight junction，TJs)是一种跨膜蛋白复合体，紧密连接的稳定需要几种不同蛋白的协调活动来维持，而Claudin蛋白是保证紧密连接渗透性具有特异性的主要蛋白。迄今在哺乳动物中已发现27个Claudin家族成员。Claudin蛋白家族分子量为20～27KD，结构中包括4个跨膜区域、两个细胞外环和一个细胞内环，其N端和C末端在胞浆内。两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。Claudin蛋白是构成紧密连接结构的骨架蛋白，位于相临细胞间隙顶侧，其分布具有组织器官特异性，功能主要为细胞间粘附、维持细胞极性、调节细胞旁通透性及参与细胞增殖、分化调节。
Claudin18蛋白分子量约为26KD，可以通过选择性剪切使Claudin蛋白变成具有不同特性的Claudin亚型：Claudin18.1和Claudin18.2。Claudin18.1和Claudin18.2的第一胞外结构域之间虽然只有八个氨基酸的差异，但表达分布却不同，Claudin18.1在正常肺和胃的上皮中选择性表达，Claudin18.2只在短暂分化的胃上皮细胞上表达，在任何其他正常人器官中完全检测不到，但是Claudin18.2在多种恶性肿瘤中有显著上调，包括80％的胃肠道腺瘤、60％的胰腺肿瘤、30％食道癌以及25％非小细胞肺癌。在肿瘤中，细胞间的紧密连接遭到破坏，Claudin18.2无法发挥其正常功能。因此，Claudin18.2是一个合适的肿瘤治疗靶标。
发明内容
本发明的第一方面，提供一种抗体，所述抗体可以结合紧密蛋白18.2(Claudin18.2)，所述抗体包括重链高变区(HCDR)和轻链高变区(LCDR)，所述重链高变区包括：
氨基酸序列为GYSFTNYG的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2，以及氨基酸序列为AX1X2GX3GNAMX4Y的HCDR3；
所述轻链高变区包括：
氨基酸序列为X5X6LX7NX8GNQKXY的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2，以及氨基酸序列为QNDYX9YPX10T的LCDR3，
其中所述HCDR3中氨基酸X1选自K或R，X2选自I或L，X3选自Y或F，X4选自E或D；
所述LCDR1中氨基酸X5选自N、Q或T，X6选自T或N，X7选自I或L，所述X8选自T、N或S；
所述LCDR3中氨基酸X9选自T或S，X10选自I或L。
一个优选的实施方案中，所述重链高变区包括：
氨基酸序列为GYSFTNYG的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2，以及氨基酸序列为AX1X2GX3GNAMX4Y的HCDR3；
所述轻链高变区包括：
氨基酸序列为X5X6LX7NX8GNQKXY的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2，以及氨基酸序列为QNDYX9YPX10T的LCDR3，
其中所述HCDR3中氨基酸X1为R，X2为L，X3为F，X4为D；
所述LCDR1中氨基酸X5选自N或Q，X6为T，X7选自I或L，所述X8选自T或S；
所述LCDR3中氨基酸X9选自T或S，X10为L。
一个更为具体的实施方案中，所述抗体包含如下所述的HCDR和LCDR：
(1)氨基酸序列为GYSFTNYG(NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2(NO：2)，氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(NO：3)的HCDR3；以及氨基酸序列为NTLINTGNQKNY(NO：4)的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2(NO：5)，氨基酸序列为QNDYTYPLT(NO：6)的LCDR3；
(2)氨基酸序列为GYSFTNYG(NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP(NO：2)的HCDR2，氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(NO：3)的HCDR3；以及氨基酸序列为QTLLNTGNQKNY(7)的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2(NO：5)，氨基酸序列为QNDYTYPLT(NO：6)的LCDR3；
(3)氨基酸序列为GYSFTNYG(NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP(NO：2)的HCDR2，氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(NO：3)的HCDR3；以及氨基酸序列为QTLLNSGNQKNY(NO：8)的LCDR1，氨基酸序列为WAT(NO：5)的LCDR2，氨基酸序列为QNDYSYPLT(NO：9)的LCDR3。
具体地，所述结合Claudin18.2的抗体，具有如下所述的VH和VL序列：
(1)氨基酸序列为SEQ ID NO：10所述的VH，以及SEQ ID NO：11所述的VL；
(2)氨基酸序列为SEQ ID NO：10所述的VH，以及SEQ ID NO：12所述的VL；
(3)氨基酸序列为SEQ ID NO：10所述的VH，以及SEQ ID NO：13所述的VL。
一个具体的实施方案中，本发明所述抗体名称、对应序列如下表：
重链：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTNTGEPTYAEEFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAX1X2GX3GNAMX4YWGQGTSVTVSS；
轻链：
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSX5X6LX7NX8GNQKXYLTWYQQKPGQPPKLLIYWATTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYX9YPX10TFGAGTKLELK
表1结合Claudin18.2的人源化抗体名称及对应的VH、VL序列
Figure BDA0002580607910000031
BY0-0的VH及VL氨基酸序列(VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)
VH高变区(或称互补决定区)：CDR1:GYTFTNYG，CDR2:INTNTGEP；CDR3:ARLGFGNAMDY
VH框架区：FR1：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAS；FR2：MNWVKQAPGKGLKWMGW；FR3：TYAEEFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC；FR4：WGQGTSVTVSS
VL高变区(或称互补决定区)：CDR1：QSLLNSGNQKNY；CDR2：WAS；CDR3：QNDYSYPLT。
VL框架区：FR1：DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSS；FR2：LTWYQQKPGQPPKLLIY；FR3：TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC；FR4：FGAGTKLELK。
本发明所述的抗体或抗原结合片段，其中所述HVR的恒定区选自人IgG系列，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG1；所述LVR的恒定区选自κ或λ链，优选κ链。
本发明的第三方面，提供了及一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段和可药用载体。
适合的可药用载体，包括但不限于：抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、羟基苯酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、载体、稀释剂和/或佐剂。例如，适合的载体可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，其可能补充了在肠外施用药物组合物中常见的其它材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它的示例性载体。本领域那些技术人员将容易地分辨可以在本发明中使用的药物组合物和剂量形式中使用的多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于，药物可用的弱酸、弱碱或其混合物。缓冲液组分还包括水溶性材料，如磷酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血栓、门冬氨酸、谷氨酸及其盐。
药物组合物和可以作为溶液、混悬液、凝胶、乳浊液、固体或者脱水或冷冻干燥的粉末保存在无菌小瓶中。这些组合物可以作为即可使用的形式、使用前需要复原的冷冻干燥形式、使用前需要稀释的液体形式或其它可用形式存储。
本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段；一种表达载体，含有本发明所述核酸分子，以及包含本发明所述的表达载体的宿主细胞，优选真核细胞。
本发明第四方面，提供了一种制备与Claudin18.2特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在有利于本发明所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下表达本发明所述的核酸分子，并回收表达的抗体或其抗原结合片段。
用来培养细胞的培养基可以是用于培养该宿主细胞的任何常规培养基，如基本培养基或含有适宜添加物的复合培养基。可以通过市售得到适宜的培养基，或根据已公开的制法制备适宜的培养基。然后可以通过常规方法从培养基中回收由所述宿主细胞产生的多肽，例如用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分，根据目的肽的种类而选用各种层析方法如例子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行进一步纯化。
可以将上述编码DNA序列插入任何适当的载体中。通常，载体的选择常常取决于该载体将要被引入的宿主细胞，因此，载体可以是一种自主复制型载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当将其引入宿主细胞时，它将整合到宿主细胞基因组中，并与它所整合入的染色体一起复制。
载体优选是一种表达载体，其内编码所述肽的DNA序列与该DNA转录所需的其它区段(如启动子)有效相连。本领域熟知适合于在多种宿主细胞中指导编码本发明肽的DNA进行转录的启动子例子，参见例如Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，分子克隆：实验操作指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1989中所述。
载体还可以含有选择标记，如可以是这样的一种基因，其基因产物将弥补宿主细胞内的一个缺陷，或者能赋予对药物如氨苄青霉素、阿霉素、四环素、氯霉素、新霉素、链霉素或氨甲喋呤等的抗性。
为将本发明表达的肽引入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称之为前导序列)。分泌信号序列以正确读框与编码该肽的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码该肽的DNA序列的5’侧。分泌信号序列可以是正常地与该肽连接的分泌信号序列，或可以源于编码另一种分泌蛋白质的基因。
用于分别连接编码本发明肽的DNA序列，启动子和可选择的终止子和/或分泌信号肽序列，并将其插入到适宜的含有复制所必需的信息的载体中的方法，对本领域的技术人员是已知的。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的成核细胞)中的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所需的序列，这种个序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和(偶尔的)3’末翻译区获得。这些区域包含作为编码结合Claudin18.2的人源化抗体的mRNA的未翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。
将导入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够产生本发明肽的任何细胞，包括细菌、病毒、酵母、真菌和高等真核生物细胞。本领域技术人员熟知并使用的适宜的宿主的例子包括但不限病毒。
可以从培养基或宿主细胞裂解液回收多种形式的本发明抗体或抗原结合片段，如果是膜结合的，则可以使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶切来使其从膜释放，可以通过多种物理或化学方法如冻融循环、超声、机械破碎或细胞裂解试剂来破裂用于表达本发明所述结合Claudin18.2的抗体的细胞。
可能需要的是从重组细胞蛋白纯化本发明抗体或抗原结合片段，以下方法是合适纯化方法的示例：通过在离子交换柱上的分部分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或在阳离子交换树脂如DEAE上的层析；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；除去污染物如IgG的蛋白A Sepharose柱。
另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗癌症相关疾病或病症。
本发明的第五方面，提供了一种预防或治疗癌症药的方法，包括给药受试本发明所述的结合Claudin18.2的抗体；其中所述癌症例如可以是包括胃肠道癌、胰腺癌、食道癌或非小细胞肺癌；所述胃肠道癌优选为晚期胃癌。
本发明的第六方面，提供了一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者本发明所述的药物组合物，所述包装插页上载有药物的使用说明书。在一个优选实施方案中，该制品或药盒进一步包含一个或多个容器，该容器中装有一种或多种预防或治疗癌症的其它药物。在一个优选实施方案中，所述其它药物为核苷类抗病毒药物、干扰素或核酸类药物。
合适的容器包括例如安瓿、针剂药水瓶、注射器等。容器可由多种物质(如玻璃或塑料)形成，容器盛有或容纳对于治疗由小的组合物并且可以具有无菌接入端(例如该容器可以是静脉溶液包或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶)。组合物中的至少一种活性药剂是本发明抗体或抗原结合片段。标签或药品说明书表明该组合物在关于抗体和提供的任何其它药物的用药量的间隔时间的具体指导下被用于治疗遭受代谢相关的疾病、病症或症状的个体的代谢相关疾病、病症或症状。该制品还可以包括第二容器、所述第二容器包含药用稀释缓冲液、加注射用抑菌水、磷酸盐缓冲液、Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。该制品还可以包括从商业和使用者角度看是需要的其它物质，包括其它缓冲、稀释剂、过滤器、针头和注射器。使用“药品说明书”通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于指示、用法、剂量、给药、禁忌、与所包装产品结合的其它治疗产品和/或关于使用这些治疗产品的警告等的信息。
制品还可以包括其它组分，制品的每种组分可以包装在单个容器内并且可以将所有多个容器放置在单个包装内。
本发明筛选得到的抗体，发现BY4-6、BY4-7、BY4-8的结合活性较好，尤其是BY4-8抗体，其结合活性药显著优于Ganymed Pharmaceuticals AG公司的Claudin18.2抗体IMAB362(本发明中为BY0-0)。抗体BY4-1至BY4-5的结合活性，则表现不佳。
附图说明
图1(1A-1D)为抗Claudin18.2抗体筛选-细胞ELISA结合活性S型曲线图。。
图2为各抗Claudin18.2抗体的相对结合活性比较柱状图。
图3为候选抗体的体外细胞增殖抑制活性抑制图。
具体实施方式
实施例1表达Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞的构建
将编码人Claudin18.1及Claudin18.2抗原基因的pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)转染HEK293细胞(购自ATCC)，采用200μg/mL的遗传霉素作为筛选压力得到稳定表达Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞。以Ganymed公司的Claudin18.2抗体IMAB362为阳性抗体(自制，CHO-S细胞(Invitrogen)瞬转表达和一步亲和层析纯化，具体方法参考实施例2和3，即其中的BY0-0为阳性抗体)，通过FACS方法筛选稳定表达人Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞。
实施例2候选抗体BY4-8表达载体的构建
将HindIII酶切位点(AAGCTT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因GAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和抗体的重链编码基因(包括重链可变区编码基因SEQ ID NO：18和恒定区IgG1编码基因SEQ ID NO：20)、终止码TAA和EcoRI编码基因GAATCC依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段插入真核表达质粒pCDNA 3.4(+)(购自Invitrogen公司)中并测序验证，得到抗体重链的表达质粒PCDNA3.4(+)-BY4-7。
将HindIII酶切位点(AAGCTT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因GAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和抗体的轻链编码基因(包括轻链可变区编码基因SEQ ID NO：19和恒定区κ编码基因SEQ ID NO：21)、终止码TAA和EcoRI编码基因GAATCC依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段插入真核表达质粒pCDNA 3.4(+)中并测序验证，得到抗体轻链的表达质粒PCDNA3.4(+)-BY4-7。
SEQ ID NO：16及17为BY4-7的重链和轻链编码基因。在知道所述抗体氨基酸序列的情况下，获得这些抗体的编码基因是本领域所熟知的。
依据上述同样方法，根据不同候选抗体氨基酸序列，可以得到一系列候选抗体的表达质粒：BY4-1、BY4-2、BY4-3、BY4-4、BY4-5、BY4-6、BY4-7、BY0-0的重链及轻链表达质粒。
各候选抗体的重链恒定区均为IgG1，轻链恒定区为κ。
实施例3抗Claudin18.2抗体的表达、纯化
使用实施例2所述DNA构建体，分别瞬转至CHO-S细胞(购自Invitrogen公司)，表达目的抗体，按照厂家提供的CHO-S细胞操作手册(FreedomTM CHO-STMKitUSER GUIDE)，在质粒转染前一天将细胞密度调整至1x106个/毫升。在质粒转染当天，与转染试剂混合后加入EXPICHO EXPRESSION MEDIUM细胞培养基中(购自Invitrogen公司)，37℃，8％CO2持续培养至第8天后收集细胞液，采用离心方式去除细胞，0.2μm过滤后，ProteinA亲和层析纯化，收集的样品的pH调至5.5，2～8℃保存。纯化后的抗体进行SDS-PAGE、SEC-HPLC检测，纯度在95％以上。
实施例4特异性与亲和力鉴定
以Claudin18.2 N端胞外结构域的合成肽部分为抗原，通过ELISA包被稳转Claudin18.2及Claudin18.1的HEK293细胞对抗体进行ELISA筛选，采用双抗体夹心法检测(以0.1mg/mL的多聚赖氨酸包被96孔细胞培养板，5min后，除去包被液，加入5×104/孔HEK293-Claudin18.2或HEK293-Claudin18.1细胞，细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养24h贴壁后，去上清，每孔加PBST洗涤细胞3次，以100μl/孔加入梯度稀释抗体溶液，37℃2小时，用洗涤液洗板3次；稀释液(使用洗涤液配置2％牛血清白蛋白溶液)1/5000稀释HRP标记二抗(编号ab6858，产品来源于Abcam公司)，以100μl/孔加至酶标板内，37℃1小时；用洗涤液洗板3次；以100μ1/孔加入TMB显色液，置室温避光反应5～10分钟，以50μl/孔加人终止液终止反应，并在波长4 5 0 nm处测定吸光度)，测定各候选抗体与Claudin18.2的EC50值，并以BY0-0的EC50值为基准，计算各候选抗体的相对结合活性(结构见表2)。计算方法如下，相对结合活性＝参考品BY0-0的EC50/各候选抗体的EC50值。
表2各候选抗体的相对结合活性
样品 相对结合活性 样品 相对结合活性
BY0-0 100％ BY4-5 0.65％
BY4-1 0.21％ BY4-6 23.2％
BY4-2 1.64％ BY4-7 79.4％
BY4-3 0.82％ BY4-8 160.2％
BY4-4 0.24％
细胞ELISA结合活性结果表明，候选抗体的特异性较好，与Claudin18.1均不结合，但是与Claudin18.2结合活性有显著差异，其中BY4-7及BY4-8与Claudin18.2的结合活性较优，而BY4-1、BY4-2、BY4-3、BY4-4、BY4-5及BY4-6与Claudin18.2结合活性则较差。
实施例5体外对细胞增殖抑制活性测试
利用CCK8法研究抗Claudin18.2抗体对KATOIII细胞(购自ATCC)的增值抑制作用：取对数期生长的KATO III细胞，用IMDM(购自Invitrogen)+10％FBS培养基调整细胞浓度到2×105/ml，37℃，5％CO2培养箱中待用。将样品及参考品(Ch163，或称BY0-0)用IMDM+5％FBS培养基预稀释终浓度为400μg/ml，然后进行2倍稀释，共14个梯度：400ug/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml、0.19μg/ml、0.097μg/ml、0μg/ml。在平底96孔板中每孔加入60ul细胞悬液，再依次加入梯度稀释好的抗CLDN18.2抗体60μl。轻轻震荡，混匀。细胞培养板置含5％CO2的37℃的培养箱孵育72h。孵育结束后，加入CCK-8显色液，12μl/孔，置含5％CO2的37℃的培养箱孵育2-4h。在450nm波长处读取各孔吸光度值。
数据处理使用GraphPad.Prism.v5.01软件，记录IC50值，并计算(样品/参考品(BY0-0))的相对活性。试验结果如图3所示。
增殖抑制活性结果表明，候选抗体BY4-8的抗体的体外细胞增殖抑制效果明显。
实施例6体内抑瘤活性
使用表达Claudin18.2的人胃癌KATO(购自：ATCC)，构建裸鼠(购自：北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下移植瘤模型，采用瘤块接种法。
无菌条件下收集KATO细胞，用灭菌生理盐水调整细胞密度至1×107vc/ml，取0.2ml接种于裸鼠腋窝皮下，待肿瘤生长至直径1000mm3大小，无菌条件下取出，切成1mm×1mm大小的瘤块，均匀接种于裸鼠腋窝皮下。待肿瘤体积长至100～300mm3大小时，按肿瘤体积大小进行筛选，瘤体积过大及未成瘤者不予入选，随机分5组每组10只，分别腹腔注射给药BY0-0、BY4-6、BY4-7、BY4-8，给药剂量为10mg/kg/只，阴性对照组给予PBS，在4周中，每周周一、周四给药两次，连续给药7次，首次给药当天计为D0，每周两次检测小鼠的肿瘤生长(测小鼠体重、游标卡尺测量肿瘤长短计算体积(对照组肿瘤体积超过1000mm3即可结束实验))。
肿瘤瘤重抑制率(％)＝(对照组肿瘤瘤重-给药组肿瘤瘤重)/对照组肿瘤瘤重×100％
试验结果如表3所示。
表3抗Claudin18.2抗体对KATO细胞裸鼠移植瘤生长的影响
Figure BDA0002580607910000091
胃癌细胞系小鼠异种移植模型试验结果表明，候选抗体抑制人胃癌KATO细胞裸鼠异体移植瘤生长的作用与剂量呈正相关。在一定的剂量和给药时间内对人胃癌KATO细胞裸鼠异体移植瘤的生长有明显的抑制作用。在BY4-8在胃癌细胞的裸鼠异体移植瘤中效果最优。
实施例7稳定性实验
考察候选抗体在高温、反复冻融、强酸条件等因素影响下的稳定性并按照检验重点考察项目进行检测。具体实验设计、检测项目如表4-1、表4-2所示；稳定性结果见表4-3。
表4-1候选抗体成药性分析实验设计
Figure BDA0002580607910000092
*每个考察条件放置相同包装的buffer，用于空白对照。
表4-2候选抗体成药性分析检测方法
Figure BDA0002580607910000101
表4-3候选抗体稳定性实验结果
Figure BDA0002580607910000102
高温稳定性实验结果显示：1)SEC检测：3种抗体高温稳定性的SEC检测无显著性差异，20天50℃高温检测的SEC结果均等于或优于对照抗体BY0-0；2)相对结合活性：3种抗体的相对结合活性随着50℃高温孵育时间的延长均呈下降趋势，其中BY4-8和BY4-7的相对结合活性优于BY0-0。
强酸稳定性实验结果显示：1)各抗体的SEC单体纯度呈下降趋势；2)各抗体的相对结合活性在稳定性研究期间无显著变化趋势。
反复冻融稳定性实验结果显示：1)SEC研究表明在稳定性研究期间，各抗体无显著变化趋势；2)相对结合活性：各相对活性均显著降低，但BY4-8的相对活性保持还较高，高于对照抗体BY0-0。
序列表
<110> 北京亦庄国际蛋白药物技术有限公司
<120> 一种用于预防或治疗癌症的抗体
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Thr Leu Ile Asn Thr Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Ala Thr
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Thr Leu Leu Asn Thr Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Thr Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Asn Thr Leu Ile Asn Thr
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asn Thr
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 16
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagatccagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgagac cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactacggca tgaactgggt gaagcaggcc 120
cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180
gccgaggagt tcaagggcag gttcgccttc agcctggaga ccagcgccag caccgcctac 240
ctgcagatca acaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggctgggc 300
ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagc 354
<210> 17
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gacatcgtga tgacccagag ccccagcagc ctgaccgtga ccgccggcga gaaggtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gaccctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc caccaccagg 180
gagagcggcg tgcccgacag gttcaccggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300
cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagctgaag 339
<210> 18
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagatccagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgagac cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactacggca tgaactgggt gaagcaggcc 120
cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180
gccgaggagt tcaagggcag gttcgccttc agcctggaga ccagcgccag caccgcctac 240
ctgcagatca acaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggctgggc 300
ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagc 354
<210> 19
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gacatcgtga tgacccagag ccccagcagc ctgaccgtga ccgccggcga gaaggtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gaccctgctg aacaccggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc caccaccagg 180
gagagcggcg tgcccgacag gttcaccggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactact gccagaacga ctacacctac 300
cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagctgaag 339
<210> 20
<211> 990
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60
ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 120
tggaacagcg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 180
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300
aagagctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 360
cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc 420
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 540
agcacctaca gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 660
aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag cagggacgag 720
ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 840
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960
cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 990
<210> 21
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
aggaccgtgg ccgcccccag cgtgttcatc ttccccccca gcgacgagca gctgaagagc 60
ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc ccagggaggc caaggtgcag 120
tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtgac cgagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgagcagccc cgtgaccaag 300
agcttcaaca ggggcgagtg c 321

Claims (9)

1.一种预防或治疗癌症的抗体，所述抗体包括重链高变区(HCDR)和轻链高变区(LCDR)，所述重链高变区包括：
氨基酸序列为GYSFTNYG的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2，以及氨基酸序列为AX1X2GX3GNAMX4Y的HCDR3；所述轻链高变区包括：
氨基酸序列为X5X6LX7NX8GNQKXY的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2，以及氨基酸序列为QNDYX9YPX10T的LCDR3，
其中所述HCDR3中氨基酸X1选自K或R，X2选自I或L，X3选自Y或F，X4选自E或D；
所述LCDR1中氨基酸X5选自N、Q或T，X6选自T或N，X7选自I或L，所述X8选自T、N或S；
所述LCDR3中氨基酸X9选自T或S，X10选自I或L。
2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体包括重链高变区(HCDR)和轻链高变区(LCDR)，所述重链高变区包括：
氨基酸序列为GYSFTNYG的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2，以及氨基酸序列为AX1X2GX3GNAMX4Y的HCDR3；所述轻链高变区包括：
氨基酸序列为X5X6LX7NX8GNQKXY的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2，以及氨基酸序列为QNDYX9YPX10T的LCDR3，
其中所述HCDR3中氨基酸X1为R，X2为L，X3为F，X4为D；
所述LCDR1中氨基酸X5选自N或Q，X6为T，X7选自I或L，所述X8选自T或S；
所述LCDR3中氨基酸X9选自T或S，X10为L。
3.根据权利要求2所述的抗体，所述抗体包含如下所述的HCDR和LCDR：
(1)氨基酸序列为GYSFTNYG(NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2(NO：2)，氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(NO：3)的HCDR3；以及氨基酸序列为NTLINTGNQKNY(NO：4)的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2(NO：5)，氨基酸序列为QNDYTYPLT(NO：6)的LCDR3；
(2)氨基酸序列为GYSFTNYG(NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP(NO：2)的HCDR2，氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(NO：3)的HCDR3；以及氨基酸序列为QTLLNTGNQKNY(7)的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2(NO：5)，氨基酸序列为QNDYTYPLT(NO：6)的LCDR3；
(3)氨基酸序列为GYSFTNYG(NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP(NO：2)的HCDR2，氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(NO：3)的HCDR3；以及氨基酸序列为QTLLNSGNQKNY(NO：8)的LCDR1，氨基酸序列为WAT(NO：5)的LCDR2，氨基酸序列为QNDYSYPLT(NO：9)的LCDR3。
4.根据权利要求1-3任意一权利要求所述的抗体，其中所述抗体具有如下所述的VH和VL序列，
(1)氨基酸序列为SEQ ID NO：10所述的VH，以及SEQ ID NO：11所述的VL；
(2)氨基酸序列为SEQ ID NO：10所述的VH，以及SEQ ID NO：12所述的VL；
(3)氨基酸序列为SEQ ID NO：10所述的VH，以及SEQ ID NO：13所述的VL。
5.根据权利要求4中任意权利要求所述的抗体，其中所述重链的恒定区选自人IgG系列，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；所述轻链的恒定区选自κ或λ链。
6.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-5中任一权利要求所述的抗体。
7.药物组合物，其包含权利要求1-5中任意一权利要求所述的抗体，以及制药上可接受的赋形剂。
8.权利要求1-7中任一项所述的人源化抗体在制备具有治疗和/或预防癌症药物中的应用；其中所述癌症例如可以是包括胃肠道癌、胰腺癌、食道癌或非小细胞肺癌；所述胃肠道癌优选为晚期胃癌。
9.一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有权利要求1-5中任意一权利要求所述的抗体，或者权利要求7所述的药物组合物，所述包装插页上载有药物的使用说明书。
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