CN114316046A - 一种稳定的抗体组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种稳定的抗体组合物，包含结合密蛋白18.2的用于治疗癌症的人源化抗体，所述组合物由治疗有效量的抗体、等渗调节剂、pH调节剂及吐温‑80组成，所述组合物长期存放稳定。

Description

一种稳定的抗体组合物

技术领域

本发明涉及一种结合密蛋白18.2的用于治疗癌症的人源化抗体，属于抗体药物技术领域。

背景技术

胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤。据2017年4月在北京召开的第12届国际胃癌大会上披露，中国胃癌每年新发现病例约为68万例，占全球发病总数的一半左右，同比2012年公布的44.65万例，年平均增长率超过了13％。中国胃癌死亡率是欧美发达国家的4～8倍，约每2～3分钟就有1名中国人死于胃癌。相比其他国家，中国的胃癌形势更加严峻。

中国大部分胃癌患者确诊时，病情已经进入中晚期，手术后效果极不理想，且预后极差，是临床上极为棘手的恶性肿瘤。

细胞间紧密连接(tight junction，TJs)是一种跨膜蛋白复合体，紧密连接的稳定需要几种不同蛋白的协调活动来维持，而Claudin蛋白是保证紧密连接渗透性具有特异性的主要蛋白。迄今在哺乳动物中已发现27个Claudin家族成员。Claudin蛋白家族分子量为20～27KD，结构中包括4个跨膜区域、两个细胞外环和一个细胞内环，其N端和C末端在胞浆内。两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。Claudin蛋白是构成紧密连接结构的骨架蛋白，位于相临细胞间隙顶侧，其分布具有组织器官特异性，功能主要为细胞间粘附、维持细胞极性、调节细胞旁通透性及参与细胞增殖、分化调节。

Claudin18蛋白分子量约为26KD，可以通过选择性剪切使Claudin蛋白变成具有不同特性的Claudin亚型：Claudin18.1和Claudin18.2。Claudin18.1和Claudin18.2的第一胞外结构域之间虽然只有八个氨基酸的差异，但表达分布却不同，Claudin18.1在正常肺和胃的上皮中选择性表达，Claudin18.2只在短暂分化的胃上皮细胞上表达，在任何其他正常人器官中完全检测不到，但是Claudin18.2在多种恶性肿瘤中有显著上调，包括80％的胃肠道腺瘤、60％的胰腺肿瘤、30％食道癌以及25％非小细胞肺癌。在肿瘤中，细胞间的紧密连接遭到破坏，Claudin18.2无法发挥其正常功能。因此，Claudin18.2是一个合适的肿瘤治疗靶标。

发明内容

本发明的第一方面，提供一种结合Claudin18.2人源化抗体，所述抗体包括重链高变区(HCDR，或称重链互补决定区)和轻链高变区(LCDR，或称轻链互补决定区)，所述重链高变区包括：

氨基酸序列为GYSFTNYG(SEQ ID NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP(SEQ IDNO：2)的HCDR2，氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(SEQ ID NO：3)的HCDR3；

所述轻链高变区包括：

氨基酸序列为QTLLNX₄GNX₆KNY的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2，氨基酸序列为QNDYX₉YPLT的LCDR3

其中

X₄选自T或S；X₆选自Q或N；X₉选自T或S。

比如，氨基酸序列为QTLLNTGNQKNY(SEQ ID NO:4)、QTLLNSGNQKNY(SEQ ID NO:5)或QTLLNSGNNKNY(SEQ ID NO:6)的CDR1(LCDR1)；氨基酸序列为WAT(SEQ ID NO：7)的CDR2(LCDR2)；氨基酸序列为QNDYTYPLT(SEQ ID NO:8)或QNDYSYPLT(SEQ ID NO:9)的CDR3(LCDR3)。

本发明所述抗体，与CN1013129A公开了用于治疗癌症的针对密蛋白-18的单克隆抗体ch-163E12(即德国Ganymed Pharmaceuticals AG公司的嵌合抗Claudin18.2抗体IMAB362，本发明中也称做BY0-0)相比，无论是体外ADCC、CDC，或者体内抗肿瘤活性，均具有更为明显的优势。

本发明技术人员在进行抗体筛选时，为了获得效果更优的抗体，进行了大量的结构筛选，得到了其中本发明中几种较优的选择，具体为，本发明所述抗体名称、对应序列如下表：

VH序列：

QVQLVQSGX_a1ELKKPGASVKISCKASGYX₁FTNYGMNWVRQAPGQGLKWMGINTNTGEPTYAEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYX_a2CARLGFGNAMDYWGQGTLVTVSS；

VL序列：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQX₂X₃LNX₄X₅NX₆KNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWAX₇TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQX₈DYX₉YPLTFGAGTKLEIK所示的VL，

表1 结合Claudin18.2的人源化抗体名称及对应的VH、VL序列

ch-163E12(或称BY0-0)的VH及VL氨基酸序列(SEQ ID NO：10及11)

VH互补决定区：CDR1:GYTFTNYG，CDR2:INTNTGEP；CDR3:ARLGFGNAMDY

VH框架区：FR1：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAS；FR2：MNWVKQAPGKGLKWMGW；FR3：TYAEEFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC；FR4：WGQGTSVTVSS

VL高变区/互补决定区：CDR1：QSLLNSGNQKNY；CDR2：WAS；CDR3：QNDYSYPLT。

VL框架区：FR1：DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSS；FR2：LTWYQQKPGQPPKLLIY；FR3：TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC；FR4：FGAGTKLELK。

本发明所述的抗体或抗原结合片段，其中所述HVR的恒定区选自人IgG系列，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG1；所述LVR的恒定区选自κ或λ链，优选κ链。

本发明第二方面，提供了一种包含治疗有效量的本发明第一方面所述人源化抗体的组合物，所述组合物还包含制药上可接受的赋形剂，所述赋形剂包含等渗调节剂，以及pH为5.0-7.5的缓冲调剂剂，所述等渗剂调节组合物溶液至血浆等渗。

在此所使用的术语“治疗有效量”当单独或联合给药本发明抗体治疗癌症(如胃癌)时，该剂量是有效的，是足以减轻患者症状从而达到临床治疗效果的含量。

术语“单位剂型”是指含有预定含量的活性化合物的物理上分开的单位。优选的单位剂型是含有日剂量或单位日剂量。

术语“药学上可接受的”是指对应于合理收益/风险比的那些化合物、组合物和/或剂型，其在正确医学判断的范围内，适合与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它疑难并发症。

术语“药学上可接受的赋形剂”是指用于制备药物组合物的并且通常是安全、无毒并且在生物上或其它方面没有不合需要的化合物。

本发明中，等渗剂还可选自氯化钠，氯化镁，溴化钠，溴化镁，氯化钙和溴化钙的盐，术语“等渗”是依据给药方式的不同而达到不同的等渗的目的，比如注射给药，通常是要求与人体血浆等渗。

本发明所述缓冲调节剂的非限制性实例包括但不限于甲酸盐(pKa 3.77)，苹果酸盐(pKa25.13)，吡啶(pKa 5.23)，哌嗪((pKal)5.33)，琥珀酸酯((pKa2)5.64)，组氨酸(pKa6.04)，马来酸酯((pKa2)6.24)，柠檬酸盐((pKa3)6.40)，Bis-Tris(pKa 6.46)，焦磷酸盐((pKa3)6.70)，PIPES(pKa 6.76)，ACES(pKa 6.78)，组氨酸(pKa 6.80)，MES(pKa 6.15)，衣藻酸(pKa 6.27)，H2CO3/NaHCO3(pKal)(6.37)，ADA(N-(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸)(pKa 6.60)。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包括柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包括柠檬酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含磷酸盐缓冲剂。优选的是柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。

本发明中，表面活性剂可以是选自聚山梨酯80或十六烷基溴化吡啶鎓，优选为聚山梨酯80(或称吐温-80)，所述表面活性剂用量为组合物中抗体量的0.1％-1％(w/w)。

本发明中，还可含有选自以下中的任意一种或多种的赋形剂，比如包含选自L-蛋氨酸、蔗糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖中的任意一种或多种，L-蛋氨酸为抗体总量的0.1％-1％(w/w)，蔗糖、甘露醇、山梨醇或海藻糖的量为抗体总量的30％-200％。

本发明的第三方面，涉及一种更为具体的合密蛋白18.2的人源化抗体组合物，其中所述组合物包含

(1)治疗有效量的具有如下可变区的抗体，

氨基酸序列为QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASZ_H1MNWVRQAPGQGLKWMGZ_H2T YAEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCZ_H3WGQGTLVTVSS所示的重链可变区(VH)；以及

氨基酸序列为DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSZ_L1LTWYQQKPGQPPKLLIYZ_L2TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCZ_L3FGAGTKLEIK所示的轻链可变区(VL)，

其中Z_H1、Z_H2及Z_H3分别为重链的三个CDR区，Z_L1、Z_L2及Z_L3为轻链的三个CDR区，

Z_H1的氨基酸序列为GYSFTNYG，Z_H2的氨基酸序列为INTNTGEP，Z_H3的氨基酸序列为ARLGFGNAMDY，

Z_L1的氨基酸序列为QTLLNX₄GNX₆KNY，Z_L2的氨基酸序列为WAT，Z_L3的氨基酸序列为QNDYX₉YPLT的LCDR3，其中

X₄选自T或S；X₆选自Q或N；X₉选自T或S；和

(2)至少一种制药上可接受的赋形剂

所述赋形剂包含等渗调节剂，以及pH为6.0-6.5的缓冲调节剂，以及抗体总量0.1％-1％(w/w)的表面活性剂，所述等渗剂调节组合物溶液至血浆等渗。

更为具体地，本发明涉及一种结合密蛋白18.2的人源化抗体组合物，其中所述组合物，所述组合物为注射用溶液，每毫升注射液中包含：

(1)5-200mg的具有如下可变区的抗体，

氨基酸序列为QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASZ_H1MNWVRQAPGQGLKWMGZ_H2T YAEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCZ_H3WGQGTLVTVSS所示的重链可变区(VH)；以及

氨基酸序列为DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSZ_L1LTWYQQKPGQPPKLLIYZ_L2TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCZ_L3FGAGTKLEIK所示的轻链可变区(VL)

其中Z_H1、Z_H2及Z_H3分别为重链的三个CDR区，Z_L1、Z_L2及Z_L3为轻链的三个CDR区，

Z_H1的氨基酸序列为GYSFTNYG，Z_H2的氨基酸序列为INTNTGEP，Z_H3的氨基酸序列为ARLGFGNAMDY，

Z_L1的氨基酸序列为QTLLNX₄GNX₆KNY，Z_L2的氨基酸序列为WAT，Z_L3的氨基酸序列为QNDYX₉YPLT的LCDR3，其中

X₄选自T或S；X₆选自Q或N；X₉选自T或S；和

(2)等渗调节剂氯化钠，以调整注射液与血浆等渗；

(3)调节注射液pH值为5.5-6.5二水合柠檬酸钠缓冲剂，以及

(4)抗体总量约0.1％-0.5％的吐温-80。

本发明的第四方面，涉及本发明所述的组合物在制备具有治疗和/或预防癌症药物中的应用；其中所述癌症例如可以是包括胃肠道癌、胰腺癌、食道癌或非小细胞肺癌；所述胃肠道癌优选为晚期胃癌。

本发明的第五方面，涉及一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有本发明所述的组合物，所述包装插页上载有药物的使用说明书。在一个优选实施方案中，该制品或药盒进一步包含一个或多个容器，该容器中装有一种或多种预防或治疗人体癌症的其它药物。在一个优选实施方案中，所述其它药物为免疫调节剂或其它癌症抗体类药物。

合适的容器包括例如安瓿、针剂药水瓶、注射器等。容器可由多种物质(如玻璃或塑料)形成，容器盛有或容纳对于治疗由小的组合物并且可以具有无菌接入端(例如该容器可以是静脉溶液包或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶)。组合物中的至少一种活性药剂是本发明抗体或抗原结合片段。标签或药品说明书表明该组合物在关于抗体和提供的任何其它药物的用药量的间隔时间的具体指导下被用于治疗遭受代谢相关的疾病、病症或症状的个体的代谢相关疾病、病症或症状。该制品还可以包括第二容器、所述第二容器包含药用稀释缓冲液、加注射用抑菌水、磷酸盐缓冲液、Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。该制品还可以包括从商业和使用者角度看是需要的其它物质，包括其它缓冲、稀释剂、过滤器、针头和注射器。使用“药品说明书”通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于指示、用法、剂量、给药、禁忌、与所包装产品结合的其它治疗产品和/或关于使用这些治疗产品的警告等的信息。

制品还可以包括其它组分，制品的每种组分可以包装在单个容器内并且可以将所有多个容器放置在单个包装内。

本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段；一种表达载体，含有本发明所述核酸分子，以及包含本发明所述的表达载体的宿主细胞，优选真核细胞。

本发明还提供了一种制备与Claudin18.2特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在有利于本发明所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下表达本发明所述的核酸分子，并回收表达的抗体或其抗原结合片段。

用来培养细胞的培养基可以是用于培养该宿主细胞的任何常规培养基，如基本培养基或含有适宜添加物的复合培养基。可以通过市售得到适宜的培养基，或根据已公开的制法制备适宜的培养基。然后可以通过常规方法从培养基中回收由所述宿主细胞产生的多肽，例如用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分，根据目的肽的种类而选用各种层析方法如例子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行进一步纯化。

可以将上述编码DNA序列插入任何适当的载体中。通常，载体的选择常常取决于该载体将要被引入的宿主细胞，因此，载体可以是一种自主复制型载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当将其引入宿主细胞时，它将整合到宿主细胞基因组中，并与它所整合入的染色体一起复制。

载体优选是一种表达载体，其内编码所述肽的DNA序列与该DNA转录所需的其它区段(如启动子)有效相连。本领域熟知适合于在多种宿主细胞中指导编码本发明肽的DNA进行转录的启动子例子，参见例如Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，分子克隆：实验操作指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1989中所述。

载体还可以含有选择标记，如可以是这样的一种基因，其基因产物将弥补宿主细胞内的一个缺陷，或者能赋予对药物如氨苄青霉素、阿霉素、四环素、氯霉素、新霉素、链霉素或氨甲喋呤等的抗性。

为将本发明表达的肽引入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称之为前导序列)。分泌信号序列以正确读框与编码该肽的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码该肽的DNA序列的5’侧。分泌信号序列可以是正常地与该肽连接的分泌信号序列，或可以源于编码另一种分泌蛋白质的基因。

用于分别连接编码本发明肽的DNA序列，启动子和可选择的终止子和/或分泌信号肽序列，并将其插入到适宜的含有复制所必需的信息的载体中的方法，对本领域的技术人员是已知的。

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的成核细胞)中的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所需的序列，这种个序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和(偶尔的)3’末翻译区获得。这些区域包含作为编码结合Claudin18.2的人源化抗体的mRNA的未翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。

将导入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够产生本发明肽的任何细胞，包括细菌、病毒、酵母、真菌和高等真核生物细胞。本领域技术人员熟知并使用的适宜的宿主的例子包括但不限病毒。

可以从培养基或宿主细胞裂解液回收多种形式的本发明抗体或抗原结合片段，如果是膜结合的，则可以使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶切来使其从膜释放，可以通过多种物理或化学方法如冻融循环、超声、机械破碎或细胞裂解试剂来破裂用于表达本发明所述结合Claudin18.2的抗体的细胞。

可能需要的是从重组细胞蛋白纯化本发明抗体或抗原结合片段，以下方法是合适纯化方法的示例：通过在离子交换柱上的分部分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或在阳离子交换树脂如DEAE上的层析；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；除去污染物如IgG的蛋白A Sepharose柱。

另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗癌症相关的疾病，尤其是胃癌。

本发明的第五方面，提供了一种预防或治疗癌症药的方法，包括给药受试本发明所述的结合Claudin18.2的抗体；其中所述癌症例如可以是包括胃肠道癌、胰腺癌、食道癌或非小细胞肺癌；所述胃肠道癌优选为晚期胃癌。

附图说明

图1为抗Claudin18.2抗体筛选-细胞ELISA结合活性图。

图2为抗Claudin18.2抗体筛选-增殖抑制活性图。

图3为抗Claudin18.2抗体筛选-抗体依赖性细胞毒性图。

图4为抗Claudin18.2抗体筛选-补体依赖性细胞毒性图。

图5(5-1,5-2)为候选抗体对KATO细胞裸鼠移植瘤模型相对肿瘤体积(RTV)的影响图。

图6(6-1,6-2)为候选抗体对NUGC细胞裸鼠移植瘤模型相对肿瘤体积(RTV)的影响图。

具体实施方式

实施例1表达Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞的构建

将编码人Claudin18.1及Claudin18.2抗原的pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)转染HEK293细胞(购自ATCC)，采用200μg/mL的遗传霉素作为筛选压力得到稳定表达Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞。以Ganymed公司的Claudin18.2抗体IMAB362(自制，CHO-S细胞瞬转表达，并进一步层析纯化，参考实施例2及3，本发明中为ch-163E12)为阳性抗体，通过FACS方法筛选稳定表达人Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞。

实施例2候选抗体BY6-4表达载体的构建

将HindIII酶切位点(AAGCTT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因GAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和抗体的重链编码基因(包括重链可变区编码基因SEQ ID NO：12和恒定区IgG1编码基因SEQ ID NO：16)、终止码TAA和EcoRI编码基因GAATTC依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段插入真核表达质粒pCDNA 3.4(+)((购自Invitrogen公司))中并测序验证，得到抗体重链的表达质粒PCDNA3.4(+)-BY6-4。

将HindIII酶切位点(AAGCTT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因GAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和抗体的轻链编码基因(包括轻链可变区编码基因SEQ ID NO：13和恒定区κ编码基因SEQ ID NO:17)、终止码TAA和EcoRI编码基因GAATTC依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段插入真核表达质粒pCDNA 3.4(+)中并测序验证，得到抗体轻链的表达质粒PCDNA3.4(+)-BY6-4。

将BY6-1、BY6-2及BY6-3的重链编码基因和轻链编码基因、以及对照ch-163E12(BY0-0)的重链编码基因(SEQ ID NO：14)和轻链编码基因(SEQ ID NO：15)，替换BY6-4的重轻链编码基因，可得到相应的重轻链表达质粒，在知道各重轻链的情况下，设计其编码基因对本领域技术人员来说是常规性的操作。

在知道所述抗体氨基酸序列的情况下，获得这些抗体的编码基因是本领域所熟知的。依据上述同样方法，根据不同候选抗体氨基酸序列，可以得到一系列候选抗体的表达质粒：BY5-1、BY5-2、BY5-3、BY5-4、BY5-5、BY5-6、BY5-7、BY5-8、BY5-9、BY6-5、BY6-6、BY6-7、BY6-8、BY6-9、BY6-10、BY6-11、BY6-12、BY6-13、BY6-14、BY6-15、BY6-16、BY6-17、BY6-18、BY6-19的重链及轻链表达质粒

各候选抗体的重链恒定区均为IgG1，轻链恒定区为κ。

实施例3抗Claudin18.2抗体的表达、纯化

使用实施例2所述DNA构建体，分别瞬转至CHO-S细胞(购自Invitrogen公司)，表达目的抗体，按照CHO-S细胞操作手册(Freedom^TMCHO-S^TMKitUSER GUIDE)，在质粒转染前一天将细胞密度调整至1x10⁶个/毫升。在质粒转染当天，与转染试剂混合后加入EXPICHOEXPRESSION MEDIUM细胞培养基(购自Invitrogen公司)中，37℃，8％CO2持续培养至第8天后收集细胞液，采用离心方式去除细胞，0.2μm过滤后，ProteinA亲和层析纯化，收集的样品的pH调至5.5，2～8℃保存。纯化后的抗体进行SDS PAGE、SEC检测，纯度在95％以上。

实施例4

表2抗体制剂处方(每毫升溶液处方组成)

实施例5特异性与亲和力鉴定

以Claudin18.2 N端胞外结构域的合成肽部分为抗原，通过ELISA包被稳转Claudin18.2及Claudin18.1的HEK293细胞对抗体进行ELISA筛选，采用双抗体夹心法检测(以0.1mg/mL的多聚赖氨酸包被96孔细胞培养板，5min后，除去包被液，加入5×10⁴/孔HEK293-Claudin18.2或HEK293-Claudin18.1细胞，细胞在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h贴壁后，去上清，每孔加PBST洗涤细胞3次，以100μl/孔加入梯度稀释抗体溶液，37℃2小时，用洗涤液洗板3次；稀释液(使用洗涤液配置2％牛血清白蛋白溶液)1/5000稀释HRP标记二抗(编号ab6858，产品来源于Abcam公司)，以100μl/孔加至酶标板内，37℃1小时；用洗涤液洗板3次；以100μ1/孔加入TMB显色液，置室温避光反应5～10分钟，以50μl/孔加人终止液终止反应，并在波长450nm处测定吸光度)，测定各候选抗体与Claudin18.2的EC50值，并以BY0-0的EC50值为基准，计算各候选抗体的相对结合活性(结构见表3)。计算方法如下，相对结合活性＝参考品BY0-0的EC50/各候选抗体的EC50值。

表3各候选抗体的相对结合活性

样品	相对结合活性	样品	相对结合活性
				BY0-0	100％	BY6-6	51.5％
BY5-1	56.7％	BY6-7	106.1％
				BY5-2	0.38％	BY6-8	73.7％
BY5-3	11.7％	BY6-9	103.5％
				BY5-4	0.64％	BY6-10	0.7％
BY5-5	42.0％	BY6-11	24.9％
				BY5-6	2.1％	BY6-12	0.7％
BY5-7	0.2％	BY6-13	78.7％
				BY5-8	0.82％	BY6-14	0.1％
BY5-9	26.4％	BY6-15	88.2％
				BY6-1	144.1％	BY6-16	16.1％
BY6-2	183.7％	BY6-17	0.1％
				BY6-3	198.3％	BY6-18	0.1％
BY6-4	248.4％	BY6-19	45.7％
				BY6-5	60.9％

细胞ELISA结合活性结果表明，候选抗体的特异性较好，与Claudin18.1均不结合，但是与Claudin18.2结合活性有显著差异，其中BY6-1、BY6-2、BY6-3、BY6-4、BY6-6、BY6-7、BY6-8、BY6-9、BY6-13及BY6-19与Claudin18.2的结合活性较优，而BY5-2、BY5-3、BY5-4、BY5-6、BY5-7、BY5-8、BY6-10、BY6-12、BY6-14、BY6-17、BY6-18与Claudin18.2结合活性则较差。

实施例6细胞体外功能活性

抗Claudin18.2抗体介导四种独立的高度有效的作用机制来诱导肿瘤细胞的杀伤和凋亡：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导肿瘤细胞表面上的靶标交联诱导的凋亡和直接抑制增殖。第二轮抗体筛选是对第一轮全人源抗体库筛选出来的亲和力较高的7个抗体(BY6-1、BY6-2、BY6-3、BY6-4、BY6-6、BY6-7、及BY6-9)进行进一步的细胞模型上的功能性(ADCC、CDC、增殖抑制)鉴定，为临床候选药物的确定提供依据。

(1)增殖抑制活性

利用CCK8法研究抗Claudin18.2抗体对KATOIII细胞(购自ATCC)的增值抑制作用：取对数期生长的KATO III细胞，用IMDM(购自Invitrogen)+10％FBS培养基调整细胞浓度到2×10⁵/ml，37℃，5％CO2培养箱中待用。将样品及参考品(Ch163，或称BY0-0)用IMDM+5％FBS培养基预稀释终浓度为400μg/ml，然后进行2倍稀释，共14个梯度：400ug/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml、0.19μg/ml、0.097μg/ml、0μg/ml。在平底96孔板中每孔加入60ul细胞悬液，再依次加入梯度稀释好的抗CLDN18.2抗体60μl。轻轻震荡，混匀。细胞培养板置含5％CO₂的37℃的培养箱孵育72h。孵育结束后，加入CCK-8显色液，12μl/孔，置含5％CO₂的37℃的培养箱孵育2-4h。在450nm波长处读取各孔吸光度值。

数据处理使用GraphPad.Prism.v5.01软件，计算样品和参考品的IC50值。试验结果如图2所示。

增殖抑制活性结果表明，候选抗体BY6-2、BY6-3、BY6-4的抗体的体外细胞增殖抑制效果明显。

(2)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)

以稳转HEK18.2细胞作为靶细胞，从新鲜的人外周血中分离出来的PBMC细胞作为效应细胞检测待检抗体的ADCC活性。分别采用胰酶消化的NUGC细胞(购自JCRB)和HEK18.2细胞作为靶细胞对7种抗体进行检测，每孔5000个细胞。

试验前一天分别提取2个健康自愿者各30ml血液中的PBMC，以RPMI-1640(购自Invitrogen)+10％FBS培养过夜，效应细胞每孔使用2.5×10⁵个。受试药初始浓度为10μg/ml(使用前稀释到40μg/ml)，以5倍稀释法稀释至8个样品。采用RPMI-1640+2％FBS(灭活血清)为ADCC的实验培养基。

结果计算方法

ER＝ER孔吸光度-CMB孔吸光度

ESR＝ESR孔吸光度-CMB孔吸光度

TSR＝TSR孔吸光度-CMB孔吸光度

TMR＝TMR孔吸光度-VCC孔吸光度

细胞毒性(％)＝(ER-ESR-TSR)/(TMR-TSR)×100％)

死细胞和受损细胞的量通过Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST试剂盒(购自日本同仁化学)进行检测。该试剂盒是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活性进而测定细胞损害。试验结果如图3所示。

ADCC活性结果表明，候选抗体BY6-1、BY6-2、BY6-3、BY6-4的抗体的体外ADCC活性抑制效果明显。

(3)补体依赖性细胞毒性

利用CCK8方法检测抗Claudin18.2抗体、人血清与HEK8.2细胞作用后的CDC效应。补体裂解试验用血清取自于健康自愿者，600g离心20min，收获血清，并保存在-20℃。HEK18.2细胞用RPMI-1640完全培养基于37℃、5％CO₂条件下培养至对数生长期。消化HEK18.2细胞，使用无血清RPMI-1640培养基洗两遍。细胞计数，并用无血清RPMI-1640培养基配制成含5×10⁵/ml的细胞悬液。筛选抗体常规稀释1000μg/mL(用RPMI-1640培养基)，5倍梯度继续稀释(1000、300、100、30、10μg/mL)；阳性对照抗体Rituxan(购自罗氏)常规稀释500μg/mL(用RPMI-1640培养基)，5倍梯度稀释(500、100、20、4μg/mL)。每孔100μl，其中；RPMI-1640培养液悬浮的HEK18.2细胞的体积85μL，其细胞数量为5.0×10⁴/孔，人血清(补体)5μL(1:30稀释)；不同浓度的抗体10μL(阳性对照加稀释抗体用的RPMI-1640培养基，同时设立无细胞的培养基对照孔)；筛选抗体的终浓度为(100、30、10、3、1μg/mL)，Rituxan单抗的终浓度为(50、10、2、0.4μg/mL)。上述96孔细胞培养板置于5％CO₂，于37℃培养4小时，加入10微升CCK8。4小时后，检测吸光度：放入酶标仪内测读：波长为450nm；

计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数－无细胞培养基对照孔吸光读数。

细胞死亡率(％)计算：

[(未加抗体药物孔最大实际吸光值－处理样品实际吸光值)÷未加抗体药物孔最大实际吸光值]×100％

试验结果如图4所示。

CDC活性结果表明，候选抗体BY6-1、BY6-3、BY6-4的抗体的体外细胞CDC活性效果明显。

实施例7体内抑瘤活性

使用表达Claudin18.2的人胃癌KATO(购自：ATCC)及NUGC细胞系(购自：JCRB)构建裸鼠(购自：北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下移植瘤模型，采用瘤块接种法。

无菌条件下收集KATO及NUGC细胞，用灭菌生理盐水调整细胞密度至1×10⁷vc/ml，取0.2ml接种于裸鼠腋窝皮下，待肿瘤生长至直径1000mm³大小，无菌条件下取出，切成1mm×1mm大小的瘤块，均匀接种于裸鼠腋窝皮下。待肿瘤体积长至100～300mm³大小时，按肿瘤体积大小进行筛选，瘤体积过大及未成瘤者不予入选，随机分组每组10只，KATO细胞、NUGC细胞各5组，分别腹腔注射给药BY0-0、BY6-1、BY6-2、BY6-4，给药剂量为10mg/kg/只，阴性对照组给予PBS，在4周中，每周周一、周四给药两次，连续给药7次，首次给药当天计为D0，每周两次检测小鼠的肿瘤生长(测小鼠体重、游标卡尺测量肿瘤长短计算体积(对照组肿瘤体积超过1000mm³即可结束实验))。

肿瘤瘤重抑制率(％)＝(对照组肿瘤瘤重-给药组肿瘤瘤重)/对照组肿瘤瘤重×100％

试验结果如表4-1、4-2，图5-1、5-2及6-1/6-2所示。

表4-1抗Claudin18.2抗体对KATO细胞裸鼠移植瘤生长的影响

表4-2抗Claudin18.2抗体对NUGC细胞裸鼠移植瘤生长的影响

两种人胃癌细胞系小鼠异种移植模型试验结果表明，候选抗体抑制人胃癌KATO及NUGC细胞裸鼠异体移植瘤生长的作用与剂量呈正相关。在一定的剂量和给药时间内对人胃癌KATO及NUGC细胞裸鼠异体移植瘤的生长有明显的抑制作用。在BY6-1、BY6-2、BY6-4三种候选抗体中，BY6-4在两种胃癌细胞的裸鼠异体移植瘤中效果最优。

实施例8不同组成处方稳定性实验

通过设计不同的存储条件，采用SEC-HPLC方法(简称SEC)检测抗体储放后的主峰纯度，以及ELISA方法检测抗体储放后的相对活性，比较各不同处方的稳定性及活性变化。

SEC-HPLC检测：利用凝胶过滤色谱分离不同分子量物质，来定量分析样品的纯度，色谱柱为TSK G3000SWXL，流动相：0.2mol/L磷酸钾缓冲液、0.25mol/L氯化钾pH6.2±0.1，流速为0.5ml/min，洗过时间30min。

ELISA方法(酶标仪检测)：2μg/ml的IL-4R包被酶标板，检测样品500ng/ml为初始浓度5倍稀释8个浓度梯度，转移到酶标板与IL-4R结合，加羊抗人Fab段二抗(JacksonImmuno公司产品)，显色，读板，计算本发明抗体的相对活性(相对活性是指：将各个测试点中同板样品的ch-163E12均作为1时本发明抗体的相对活性)。

储存条件包括高温、强光照射、反复冻融、强酸。具体操作、检测点、以及检测项目见下表：

表5处方稳定性实验条件及方法

表6抗体不同处方稳定性实验结果

高温试验：50℃恒温培养箱放置20天，检测0点、第5天、第10天、第15天、第20天的样品。SEC-HPLC实验结果显示各主要处方稳定性变化趋势基本一致，随着高温放置时间延长，都发生不到5％的降低，热稳定性无显著差异，但未加入吐温80的处方(处方8)则随着时间的延长，有超过10％的降低。ELISA结果表明本发明抗体的活性始终高于ch-163E12，且随高温放置时间延长，差距变大，说明本发明抗体的结合活性的热稳定性优于ch-163E12；而且，相对于未加入吐温80的处方，相对结合活性差别更大。

反复冻融：-80℃、室温反复冻融3次、5次，检测本发明各处方的变化趋势。从SEC-HPLC结果看出随冻融次数增多，各处方的纯度变化相似，反复冻融后主峰纯度仅有不到5％的降低(处方8除外)。然而，反复冻融后对活性影响方面，ELISA显示，本发明抗体在抗御反复冻融导致的活性降低方面优于ch-163E12，本发明抗体同条件下经过冻融，其具有较高的相对活性，但未加入吐温80的相对结合活性下降较为明显。

强酸影响：用柠檬酸调样品pH至3.0，25℃放置3天，分别在零点、第一天、第三天观察检测。实验结果可以看出，强酸对各处方的稳定性影响有一定差别，处方1、处方3及处方7的纯度降低8％左右，处方5、处方9及处方10下降超过10％，未加入吐温80的处方降低则更为显著。强酸处理后本发明抗体的结合活性要显著高于同等条件下的ch-163E12。

光照影响：将样品于25℃，4500lx光强的药物稳定性试验箱放置10天，分别在0点、第五天、第十天检测样品。从SEC结果看出各处方抗体的目的峰纯度都变化极小(处方8除外)，ELISA结果则说明本发明抗体活性随光照时间延长没有下降趋势，说明本发明抗体光稳定性略优于ch-163E12。

综合以上高温、强酸、光照和反复冻融的实验结果可以看出，各因素对抗体的稳定性影响差别不大，但在活性方面，本发明抗体相对于ch-163E12有更好的耐受性，这在后期储放过程中更为有利。

序列表

<110> 北京凯因科技股份有限公司

<120> 一种稳定的抗体组合物

<130> 背景技术中

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Gln Thr Leu Leu Asn Thr Gly Asn Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Gln Thr Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Gln Thr Leu Leu Asn Ser Gly Asn Asn Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Trp Ala Thr

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 10

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 12

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

caggtgcagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgccag cgtgaagatc 60

agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120

cccggccagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180

gccgaggagt tcaagggcag gttcgtgttc agcctggaca ccagcgtgag caccgcctac 240

ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt acttctgcgc caggctgggc 300

ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354

<210> 13

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60

atgaactgca agagcagcca gaccctgctg aacagcggca acaacaagaa ctacctgacc 120

tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc caccaccagg 180

gagagcggcg tgcccgacag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240

atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300

cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagatcaag 339

<210> 14

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cagatccagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgagac cgtgaagatc 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180

gccgaggagt tcaagggcag gttcgccttc agcctggaga ccagcgccag caccgcctac 240

ctgcagatca acaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggctgggc 300

ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagc 354

<210> 15

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120

tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180

gagagcggcg tgcccgacag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240

atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300

cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagctgaag 339

<210> 16

<211> 990

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60

ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 120

tggaacagcg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 180

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300

aagagctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 360

cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc 420

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 540

agcacctaca gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 660

aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag cagggacgag 720

ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 840

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960

cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 990

<210> 17

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

aggaccgtgg ccgcccccag cgtgttcatc ttccccccca gcgacgagca gctgaagagc 60

ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc ccagggaggc caaggtgcag 120

tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtgac cgagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240

aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgagcagccc cgtgaccaag 300

agcttcaaca ggggcgagtg c 321

Claims (10)

1.一种稳定的抗体组合物，所述组合物包含：

(1)治疗有效量的结合密蛋白18.2的人源化抗体，所述抗体具有如下高变区序列，

氨基酸序列为GYSFTNYG的HCDR1，氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2，氨基酸序列为ARLGFGNAMDY的HCDR3，以及

氨基酸序列为QTLLNX₄GNX₆KNY的LCDR1，氨基酸序列为WAT的LCDR2，氨基酸序列为QNDYX₉YPLT的LCDR3

其中

X₄选自T或S；X₆选自Q或N；X₉选自T或S；和

(2)和至少一种制药上可接受的赋形剂，

所述赋形剂包含等渗调节剂，以及pH为5.0-7.5的缓冲调节剂。

2.根据权利要求1所述的抗体组合物，其中所述等渗剂选自氯化钠、精氨酸盐酸盐或组氨酸盐酸盐，所述缓冲剂选自柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。

3.根据权利要求3所述的抗体组合物，其中柠檬酸缓冲剂为柠檬酸-柠檬酸钠或二水合柠檬酸钠，乙酸盐缓冲剂为乙酸-乙酸钠，磷酸盐缓冲剂为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠。

4.根据权利要求2所述的抗体组合物，所述组合物进一步包含表面活性剂，表面活性剂的含量为抗体总量的0.1％-1％(w/w)，所述表面活性剂选自聚山梨酯类，如吐温-80。

5.根据权利要求4所述的抗体组合物，其中所述组合物还包含选自L-蛋氨酸、蔗糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖中的任意一种或多种，L-蛋氨酸为抗体总量的0.1％-1％(w/w)，蔗糖、甘露醇、山梨醇或海藻糖的量为抗体总量的30％-200％。

6.一种稳定的抗体组合物，其中所述组合物包含：

(1)治疗有效量的结合密蛋白18.2的人源化抗体，所述抗体具有如下可变区序列，

氨基酸序列为QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASZ_H1MNWVRQAPGQGLK

WMGZ_H2T YAEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCZ_H3WGQGT

LVTVSS所示的重链可变区(VH)；以及

氨基酸序列为DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSZ_L1LTWYQQKPGQPPKL

LIYZ_L2TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCZ_L3FGAGTKLEIK所示的轻链可变区(VL)

其中Z_H1、Z_H2及Z_H3分别为重链的三个CDR区，Z_L1、Z_L2及Z_L3为轻链的三个CDR区，Z_H1的氨基酸序列为GYSFTNYG，Z_H2的氨基酸序列为INTNTGEP，Z_H3的氨基酸序列为ARLGFGNAMDY，

Z_L1的氨基酸序列为QTLLNX₄GNX₆KNY，Z_L2的氨基酸序列为WAT，Z_L3的氨基酸序列为QNDYX₉YPLT的LCDR3，其中

X₄选自T或S；X₆选自Q或N；X₉选自T或S；和

(2)以及至少一种制药上可接受的赋形剂，

所述赋形剂包含等渗调节剂、pH为5.5-6.5的缓冲调节剂、以及抗体总量0.1％-1％(w/w)的表面活性剂，所述等渗剂调节组合物溶液至血浆等渗。

7.根据权利要求6所述的抗体组合物，其中所述等渗调节剂为氯化钠，所述缓冲调节剂为二水合柠檬酸钠，pH为6.0，所述表面活性剂为吐温-80，吐温-80的量为抗体总量的0.1％-0.5％(w/w)。

8.一种稳定的抗体组合物，所述组合物为注射用溶液，每毫升注射液中包含：

(1)5-200mg的具有如下可变区的抗体，

氨基酸序列为QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASZ_H1MNWVRQAPGQGLK

WMGZ_H2T YAEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCZ_H3WGQGT

LVTVSS所示的重链可变区(VH)；以及

氨基酸序列为DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSZ_L1LTWYQQKPGQPPKL

LIYZ_L2TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCZ_L3FGAGTKLEIK所示的轻链可变区(VL)

其中Z_H1、Z_H2及Z_H3分别为重链的三个CDR区，Z_L1、Z_L2及Z_L3为轻链的三个CDR区，Z_H1的氨基酸序列为GYSFTNYG，Z_H2的氨基酸序列为INTNTGEP，Z_H3的氨基酸序列为ARLGFGNAMDY，

Z_L1的氨基酸序列为QTLLNX₄GNX₆KNY，Z_L2的氨基酸序列为WAT，Z_L3的氨基酸序列为QNDYX₉YPLT的LCDR3，其中

X₄选自T或S；X₆选自Q或N；X₉选自T或S；和

(2)等渗调节剂氯化钠，以调整注射液与血浆等渗；

(3)调节注射液pH值为5.5-6.5二水合柠檬酸钠缓冲剂，以及

(4)抗体总量约0.1％-0.5％的吐温-80。

9.权利要求1-8中任一项权利要求所述的抗体组合物在制备具有治疗和/或预防癌症药物中的应用；其中所述癌症例如可以是包括胃肠道癌、胰腺癌、食道癌或非小细胞肺癌；所述胃肠道癌优选为晚期胃癌。

10.一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有权力要求1-8中任意一权利要求所述的抗体组合物，所述包装插页上载有药物的使用说明书；优选地，所述组合物进一步包含一个或多个容器，该容器中装有一种或多种预防或治疗人体癌症的其它药物。

Images