CN102924604A - 重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用。本发明所提供的重组血管内皮生长因子受体为一种融合蛋白，自氨基端至羧基端依次为血管内皮生长因子受体1的结构域1-3、人IgG1的Fc片段。实验证明，本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc与VEGF有较高的亲合力，KD值达到了265pM；VEGFR-1/Fc对血管内皮细胞的增殖与迁移有明显的抑制效应；对于鸡胚绒毛尿囊膜以及裸鼠体内的血管生成都有明显的抑制作用。本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc在肿瘤治疗中具有很大的应用前景。

Description

重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用，特别涉及一种由血管内皮生长因子受体VEGFR-1的结构域1-3与人源IgG1的Fc片段融合后所得的重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用。

背景技术

恶性肿瘤是当前严重威胁人类健康的一类疾病，每年全球因恶性肿瘤而死亡的人数达700万以上，新增恶性肿瘤患者1000万以上，WHO预计，到2020年，全世界肿瘤发病率将是现在的两倍。在过去的几十年中，化疗药物治疗肿瘤取得显著成效，但是，化疗药物存在毒副作用大以及易产生耐药等现象，因此，人们一直在努力寻找新一代的抗肿瘤药物。其中，抗血管生成疗法治疗肿瘤成为大家关注的焦点。

抗血管生成治疗具有很多优越性：①正常组织很少发生血管生成，而肿瘤生长对血管生成的依赖性使抗血管生成治疗具有特异性。②内皮细胞容易暴露于药物。③内皮细胞基因型稳定，突变率很低，以内皮细胞为靶标不易产生耐药。④破坏一条微血管即可抑制众多癌细胞的生长。⑤可抑制原发肿瘤的播散转移，控制转移瘤生长。⑥毒副作用小。⑦这种治疗方法理论上适合于各种实体肿瘤，不论其起源。

血管生成贯穿胚胎发育期，在成人，血管生成降到较低水平，主要存在于创伤愈合及女性月经周期。在肿瘤血管前期，肿瘤细胞主要依赖弥散作用获取营养，当实体瘤达到1～2mm³、细胞数达到10⁷左右时，其继续生长就必须要由新生血管来提供足够的氧及营养物质。新血管生成是在一系列调控因子的作用下，内皮细胞激活，基底膜降解，细胞迁移，侵入胞外基质，内皮细胞增殖，最终血管腔形成。

在发现的一系列调控血管生成的因子中，血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)是其中作用最强的一个。

现已发现的VEGF家族有六个成员：VEGF(即通常所指的VEGF-A)、胎盘生长因子(placenta growth factor，PIGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E。VEGFR家族成员目前已发现有5种，其中有3种属于酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosinekinases，RTKs)超家族，命名为VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)。另两种受体是Npn-1(neuropillin-1)和Npn-2(neuropillin-2)^[2]。此外，尚存在可溶性的VEGFR(sVEGFR)，它是由VEGFR-1的mRNA不同剪接而产生的，仅有胞外区序列而无跨膜和胞内序列。它可在周围血液中检测到，是VEGF的高亲和力受体（Kd=1-5pM）。VEGFR-1可与VEGF、VEGF-B和PIGF结合，对血管生成主要起调节作用；VEGFR-2可与VEGF、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E结合，是引起内皮细胞增殖转移的最主要受体，VEGF促进瘤细胞生长、侵袭和转移的作用也是通过VEGF与瘤细胞上的KDR结合，调控下游基因的表达而实现的^[7]；VEGFR-3只能与VEGF-C和VEGF-D结合，调节淋巴内皮细胞的增殖、移行、存活和淋巴管的生成，促进肿瘤淋巴转移。Npn-1可与VEGF165、PIGF-2和VEGF-E结合，Npn-2可与VEGF165和VEGF145结合，是配体与VEGFR2结合的辅助受体。

VEGFR1和VEGF结合的关键部位是第2、3结构域（R1D2-3），缺失第二结构域的VEGFR1几乎完全失去与VEGF的结合能力，但单独的第二结构域与VEGF的结合能力只有野生型的1/60。

在血管生成的过程中，VEGF在多个阶段具有重要作用：①VEGF是强大的血管内皮细胞有丝分裂原；②VEGF能够调节多种激活内皮细胞、降解胞外基质的酶，如纤溶酶的激活剂与抑制剂；③抑制内皮细胞的凋亡；④诱导骨髓来源的前体内皮细胞成熟并迁移到血管生成位点；⑤为肿瘤细胞和循环内皮细胞前体细胞的到达提供一个适宜环境，并通过分泌一些趋向性因子，促进肿瘤细胞和循环内皮细胞前体细胞向此部位的转移^[15]；⑥增加血管通透性，抑制DC细胞分化成熟，促进己糖向内皮细胞的转运，诱导组织因子及单核细胞转运等。

肿瘤细胞分泌VEGF促进血管生长，血管生长支持了肿瘤的进一步生长并分泌更多的VEGF，在VEGF的诱导下，肿瘤细胞还可通过上调VEGFR的表达来增强这种正反馈效应。

大多数肿瘤，包括血液系统肿瘤，都有较高水平的VEGF表达，包括结直肠癌，肝癌，肺癌，甲状腺癌，乳腺癌，胃肠道癌，膀胱癌，卵巢癌和宫颈癌，血管肉瘤，生殖细胞瘤，颅内肿瘤。体内VEGF的表达水平与肿瘤的生长速度、微血管密度、增值、肿瘤的恶性程度和病人预后等有密切关系，成为判断肿瘤复发与预后的标志之一，并成为放、化疗与激素治疗的有效靶标。

VEGF作为具有吸引力的肿瘤治疗的靶标具有两大优势：VEGF处于调控肿瘤生长的关键节点，连接一系列上下游调控信号，并直接刺激内皮细胞；VEGF作用于基因型稳定的内皮细胞，而不是易突变的肿瘤细胞。最近研究还发现，对于产生基因突变的细胞，直接拮抗肿瘤来源的VEGF，治疗效果要优于抑制VEGF信号传导的药物。传统药物难以在肿瘤组织中达到足够浓度，这是因为：第一，肿瘤组织的血管大多崎岖弯折，并存在盲端；第二，由于严重血管渗漏造成的组织间液过多，较高的组织内压极大的阻碍了药物的渗透。这些因素和放化疗引起的局部缺氧一起，引起VEGF的高表达，进一步增加了血管渗液与组织内压，并且VEGF还有保护肿瘤细胞抗调亡的作用。

针对VEGF和VEGFR治疗恶性肿瘤的药物正在研发之中，包括抗VEGF和VEGFR的单抗，阻断受体信号传导的酪氨酸激酶抑制剂，VEGFR-1核酶，VEGF-毒素偶联物，可溶性VEGF受体。

国内对VEGF/VEGFR的研究多集中在VEGF/VEGFR在各种肿瘤组织中的表达及意义研究，也有对VEGF/VEGFR家族成员进行克隆、表达的，但未见有抗VEGF药物的研究报道。因此，构建能够拮抗VEGF的诱捕性、可溶性受体，用于发现新的抗肿瘤药物极有意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白是一种重组血管内皮生长因子受体。

本发明所提供的融合蛋白名称为VEGFR-1/Fc，自氨基端至羧基端依次为血管内皮生长因子受体1（VEGFR-1）的结构域1-3、人IgG1的Fc片段。

所述融合蛋白是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制血管生成活性的由序列1衍生的蛋白。

其中，序列1由563个氨基酸组成，其中第1-331位为血管内皮生长因子受体1（VEGFR-1）的结构域1-3，第332-563位为人IgG1的Fc片段。

上述（a）和（b）中的VEGFR-1/Fc蛋白均可人工合成，也均可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述融合蛋白VEGFR-1/Fc的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子为编码所述融合蛋白VEGFR-1/Fc的基因（命名为VEGFR-1/Fc）；所述基因是如下1）-5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）序列表中序列3所示的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90％以上同源性，且编码具有抑制血管生成活性的蛋白的DNA分子；

5）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA分子杂交，且编码具有抑制血管生成活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列2由1692个核苷酸组成，整个序列2即为编码序列，编码序列表中序列1所示的VEGFR-1/Fc蛋白。序列3由2530个核苷酸组成，其所有外显子序列如下：

第13-1005位（序列2的第1-993位）为VEGFR-1结构域1-3基因的编码序列，编码序列表中序列1的第1-331位氨基酸，第1396-1440位为IgG1 Fc片段的铰链区的编码序列（序列2的第994-1038位）；第1559-1891位为IgG1 Fc片段的CH2区的编码序列（序列2的第1039-1371位）；第1989-2309位为IgG1 Fc片段的CH3区的编码序列（序列2的第1372-1692位）。序列3编码序列表中序列1所示的蛋白。与序列2相比，序列3包含酶切位点，内含子及相关功能序列。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述VEGFR-1/Fc基因转录的启动子具体为CMV启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在pIRES2-EGFP载体的多克隆位点处插入所述VEGFR-1/Fc基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为EcoR I和Not I。

所述表达盒由能够启动所述VEGFR-1/Fc基因表达的启动子，所述VEGFR-1/Fc基因，以及转录终止序列组成。

上述融合蛋白VEGFR-1/Fc，或核酸分子，或重组载体，或表达盒，或重组细胞，或重组菌，或重组病毒在制备下述任一产品中的应用也属于本发明的保护范围：

（1）抑制内皮细胞增殖的产品；

（2）抑制内皮细胞迁移的产品；

（3）抑制血管生成的产品；

（4）抗肿瘤产品；

所述内皮细胞具体为血管内皮细胞；在本发明的一个实施例中，所述血管内皮细胞具体为人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cell-1，HMEC-1）。

活性成分为上述融合蛋白VEGFR-1/Fc，或核酸分子，或重组载体，或表达盒，或重组细胞，或重组菌，或重组病毒的如下产品也属于本发明的保护范围：

（1）抑制内皮细胞增殖的产品；

（2）抑制内皮细胞迁移的产品；

（3）抑制血管生成的产品；

（4）抗肿瘤产品；

所述内皮细胞具体为血管内皮细胞；在本发明的一个实施例中，所述血管内皮细胞具体为人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cell-1，HMEC-1）。

本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述融合蛋白VEGFR-1/Fc的制备方法具体可包括如下步骤：将所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述融合蛋白；所述生物细胞为非人动物细胞、微生物细胞或植物细胞；在本发明的一个实施例中，所述生物细胞具体为CHO-K1细胞。

在上述方法中，所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2所示。

实验证明，本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc与VEGF有较高的亲合力，KD值达到了265pM；VEGFR-1/Fc对血管内皮细胞的增殖与迁移有明显的抑制效应；对于鸡胚绒毛尿囊膜以及裸鼠体内的血管生成都有明显的抑制作用。本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc在肿瘤治疗中具有很大的应用前景。

附图说明

图1为总RNA电泳结果。其中，泳道M为分子量标准；泳道1为总RNA电泳结果。

图2为VEGFR-1结构域1-3基因的PCR扩增结果。其中，泳道M为分子量标准；泳道1为VEGFR-1结构域1-3基因的PCR扩增结果。

图3为IgG1 Fc片段的PCR扩增结果。其中，泳道M为分子量标准；泳道1为含有内含子的IgG1 Fc片段的PCR扩增结果。

图4为重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-1/Fc转染CHO-K1细胞前后的细胞形态。其中，A为转染前野生型CHO细胞；B-D为重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-1/Fc转染后筛选得到CHO-K1单克隆细胞；E-G重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-1/Fc转染后筛选得到CHO-K1单克隆细胞的荧光图。

图5为BCA法蛋白定量时的蛋白标准曲线。

图6为VEGFR-1/Fc融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。其中，A为VEGFR1/Fc单体（还原电泳）的检测结果；B为VEGFR-1/Fc融合蛋白的二聚体（非还原电泳）的检测结果。A和B中，泳道M均为蛋白分子量标准；泳道2均为VEGFR-1/Fc融合蛋白的检测结果。

图7为预结合试验测定VEGF与CM5结合的最佳pH值。四个峰从左至右依次代表pH4.0，pH4.5，pH5.0，pH5.5四种pH值。

图8为BIAcore测定VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165结合常数结合解离曲线。其中，1表示200nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；2表示100nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；3表示50nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；4表示25nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；5表示12.5nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线。

图9为Mg离子对VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF结合的影响。其中，A为Mg离子存在时的结合解离曲线；B为Mg离子不存在时的结合解离曲线。A和B中，1均表示200nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；2均表示100nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；3均表示50nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；4均表示25nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；5均表示12.5nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线。

图10为VEGFR-1/Fc融合蛋白对HMEC-1增殖的影响。

图11为VEGFR-1/Fc融合蛋白对HMEC-1迁移的影响—荧光图片。其中，a-d中VEGFR-1/Fc的工作浓度依次为800、200、50、0ng/ml。

图12为VEGFR-1/Fc融合蛋白对HMEC-1迁移的影响—统计结果。

图13为VEGFR-1/Fc融合蛋白抑制鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）血管生长试验结果。其中，a为PBS；b-d中VEGFR-1/Fc融合蛋白的用量依次为5pmol、10pmol和25pmol。

图14为VEGFR-1/Fc融合蛋白对裸鼠血管生成的影响。其中，a-d中VEGFR-1/Fc融合蛋白的工作浓度依次为10^-7，10^-8，10^-9，10^-10mol/L；e为阳性对照；f为阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、VEGFR-1/Fc融合基因的克隆及表达载体的构建

乳腺癌细胞MCF-7：协和基础所细胞库；pUC19载体：TaKaRa公司；pIRES2-EGFP载体：Invitrogen公司；pIG1质粒：记载在刘荷中，毛宁，侯春梅等.阻断CD40/CD40L相互作用延长移植物抗宿主病小鼠存活时间.中国临床药理学与治疗学，2003，8（1）：6-10中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得；Top10感受态大肠杆菌：Transgen公司；Taq酶、Pyrobest酶、DNA连接酶均为TaKaRa产品，限制性内切酶均为NEB公司产品；质粒提取、PCR产物回收、酶切产物回收分别采用Promega公司Wizard Plus SV Minipreps DNA purification System、Wizard PCR prepsDNA purification system、Wizard DNA clean-up试剂盒；RNA提取试剂Trizol：Invitrogen公司。

一、VEGFR-1/Fc融合基因的克隆

（一）VEGFR-1结构域1-3基因的获得

1、引物的设计与合成

为了提高扩增含有VEGFR-1结构域1-3的特定片段的成功率，采用嵌套PCR，设计内外两组引物（1代表外部，2代表内部），在内部引物首尾加EcoR I GGAATTCC和Xba I GCTCTAGAGC酶切位点（含保护碱基），引物序列如下：

Flt-1RT1U：5′-GGGAAGTGGTTGTCTCCTGG-3'（GenBank：NM_001160031的第138-157位）；

Flt-1RT1D：5′-CCTTTTCGTAAATCTGGGGTT-3'（GenBank：NM_001160031的第1565-1585位的反向互补序列）；

Flt-1RT2U：5′-GGAATTCCAGAGGACGGACTCTGGCG-3'（下划线处为EcoR I的识别位点序列，其后的序列为GenBank：NM_001160031的第208-225位）；

Flt-1RT2D：5′-GCTCTAGAGCCTGGAAACGATGACACGG-3'（下划线处为Xba I的识别位点序列，其后的序列为GenBank：NM_001160031的第1586-1603位的反向互补序列）。

为从RT-PCR扩增获得片断中扩增VEGFR-1结构域1-3，设计引物如下：引物5’端加Nhe I CTAGCTAGC（含保护碱基）；3’端加BamH I CGGGATCCCG（含保护碱基）、剪接供体序列ACTTACCTGT（以便人IgG1 Fc片段（含有内含子及剪接配体）序列）转录过程的正确剪接）：

Flt-1 R1-3U：5’CTAGCTAGCACCATGGTCAGCTACTGGGAC-3'（下划线处为Nhe I的识别位点序列，其后的序列为GenBank：NM_001160031的第283-303位）

Flt-1 R1-3D：5’-CGGGATCCCGACTTACCTGT TTTATCATATATATGCACTGAG-3'（下划线处为BamH I的识别位点序列和剪接供体序列，其后的序列为GenBank：NM_001160031的第1257-1278位的反向互补序列）

2、从乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA

采用RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）提取乳腺癌细胞MCF-7中的总RNA。具体操作如下：（1）裂解：在细胞培养瓶中移去全部培养基，加3.5ml Trizol，用移液器吹打，使充分裂解，（每10cm²培养面积用1ml Trizol）。（2）分离：在15℃-30℃温育匀浆5min，加0.2ml氯仿（每1ml Trizol）盖好盖子，剧烈摇动管子15s，15℃-30℃温育2-3min。以转速<12000g，温度4℃离心15min。（3）将水相（无色，在氯仿上层，RNA存在于水相）移至新管，加0.5ml异丙醇（每1ml Trizol）温育15℃-30℃10min。离心，转速<12000g，4℃离心10min。（4）移去上清，加至少1ml 75%乙醇洗涤，漩涡混匀，以转速<7500g，4℃离心5min。（5）倒掉上清，置超净台中待其自然干燥，（切勿离心）用无RNase的水200μl溶解，55℃-60℃温育10min，-20℃冻存，备用。（6）进行RNA电泳检测。

结果如图1所示，所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28SRNA和18SRNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

3、RT-PCR

以步骤2获得的总RNA为模板，利用步骤1设计的引物Flt-1RT1U、Flt-1RT1D、Flt-1RT2U和Flt-1RT2D进行嵌套PCR扩增。

反应体系：2×反应混合液25μl；RNA1μl；5’引物1μl；3’引物1μl；RT/Taq酶1μl；Mg²⁺(50mM)1.8μl；水补充至50μl。

循环参数：50℃30min→94℃2min→(94℃30s→52℃30s→72℃60s)×40→72℃5min→4℃

4、VEGFR-1结构域1-3基因的获得

以步骤3获得的RT-PCR扩增片断为模板，利用步骤1设计的引物Flt-1RT3U和Flt-1RT3D进行PCR扩增。

反应体系（100μl）：dNTP 8μl；pyrobest 0.5μl；10×buffer 10μl；模板10μl；5’引物2μl；3’引物2μl；水67.5μl。

循环参数：94℃2min→(94℃30s→60℃30s→72℃60s)×30→72℃5min→4℃。

以低融点琼脂糖（LMP）凝胶电泳（Promega,Agarose LMP，Cat No.V2111，胶浓度为1%，缓冲液TAE，电压6V/cm）电泳分离目的基因。采用Promega公司WizardPCR preps DNA purification system纯化回收扩增的可变区片段。用琼脂糖凝胶电泳验证回收产物。（100mL的胶中加1μl溴化乙锭EB）电泳缓冲液为TAE，电压6V/cm。

PCR扩增结果如图2所示，结果表明扩增得到大小约为1000bp的目的条带（VEGFR-1结构域1-3基因）。并对其进行测序鉴定，结果表明，该片段的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-1028位+CG。其中序列3的第13-1005位对应序列2的第1-993位（GenBank：NM_001160031的第286-1278位），为VEGFR-1结构域1-3基因的编码序列，编码序列表中序列1的第1-331位氨基酸。

（二）IgG1Fc片段基因的获得

鉴于含有内含子的基因在体内具有更高的表达水平，在构建融合蛋白时，以pIG1质粒为模板，以引物FcU与FcD扩增获得含有内含子的IgG1Fc片段基因。引物序列如下：

FcU：5’-CGGGATCCGGAGGGAGGGTG-3’

FcD：5’-AAGGAAAAAAGGTACCCTATTACTGCCTCCCTCATGCCAC-3’

首尾加BamH I GGATCC和Kpn I GGTACC酶切位点（含保护碱基）以及终止密码子CTATTA。

反应体系（100μl）：dNTP 8μl；pyrobest 0.5μl；10×buffer 10μl；模板1μl；5’引物2μl；3’引物2μl；水76.5μl。

循环参数：94℃2min→(94℃30s→60℃30s→72℃120s)×30→72℃5min→4℃。

以低融点琼脂糖（LMP）凝胶电泳（Promega,Agarose LMP，Cat No.V2111，胶浓度为1%，缓冲液TAE，电压6V/cm）电泳分离目的基因。采用Promega公司WizardPCR preps DNA purification system纯化回收扩增的可变区片段。用琼脂糖凝胶电泳验证回收产物。（100mL的胶中加1μl溴化乙锭EB）电泳缓冲液为TAE，电压6V/cm。

PCR扩增结果如图3所示，结果表明扩增得到大小约为1500bp的目的条带（包含内含子的IgG1Fc片段）。并对其进行测序鉴定，结果表明，该片断核苷酸序列如序列表中序列3的第1016-2530位所示，共由1515个核苷酸组成，其中第1016-1023位为BamH I的识别位点及保护性碱基；第1396-1440位为IgG1Fc片段的铰链区的编码序列（序列2的第994-1038位）；第1559-1891位为IgG1Fc片段的CH2区的编码序列（序列2的第1039-1371位）；第1989-2309位为IgG1Fc片段的CH3区的编码序列（序列2的第1372-1692位）。

二、VEGFR-1/Fc融合基因的重组表达载体的构建

用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切步骤一（一）获得的VEGFR-1结构域1-3基因，用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切步骤一（二）获得的IgG1Fc片段基因，用限制性内切酶Nhe I和Kpn I双酶切pIRES2-EGFP载体。采用Promega WizardDNA clean-up试剂盒回收酶切产物。将酶切回收的三个片段进行共连接，连接体系如下：T4连接酶1μl；10×Buffer 2.5μl；经酶切的VEGFR-1结构域1-3基因和IgG1Fc片段基因各5μl；经酶切的pIRES2-EGFP载体2μl；水补充至25μl。16℃水浴连接过夜。

将连接产物转化至大肠杆菌Top10感受态。摇菌后，提取质粒，采用内切酶Nhe I和Kpn I进行酶切鉴定，将经鉴定得到大小约为2500bp目的条带的重组质粒送样测序，将经测序表明在pIRES2-EGFP载体的酶切位点Nhe I和Kpn I之间插入了序列表中序列3所示的DNA片段的重组载体命名为pIRES2-EGFP-VEGFR-1/Fc。其中，序列3为VEGFR-1结构域1-3基因与含有内含子的IgG1Fc片段基因的融合基因序列。序列3中的所有外显子序列如下：第13-1005位（序列2的第1-993位）为VEGFR-1结构域1-3基因的编码序列，编码序列表中序列1的第1-331位氨基酸，第1396-1440位为IgG1Fc片段的铰链区的编码序列（序列2的第994-1038位）；第1559-1891位为IgG1Fc片段的CH2区的编码序列（序列2的第1039-1371位）；第1989-2309位为IgG1Fc片段的CH3区的编码序列（序列2的第1372-1692位）。序列3编码序列表中序列1所示的蛋白。重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-1/Fc中启动VEGFR-1/Fc基因转录的启动子为CMV启动子。

实施例2、VEGFR-1/Fc融合蛋白的表达、纯化及鉴定

质粒转染及加压筛选所用材料：CHO-K1细胞：ATCC Number CCL-61，培养条件为DMEM/F12培养基（Gibco），含5%（v/v）新生牛血清（FBS）(Hyclone)，培养于5%CO₂37℃温箱（Thermo Forma）。Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体转染试剂盒，及

I低血清培养基（Invitrogen）。G418（Roche）。

ELISA筛选高表达克隆所用材料：牛血清白蛋白（BSA）（Sigma）。PBS-T（KCl0.2g/l；KH₂PO₄ 0.2g/L；NaCl 8.0g/L；Na₂HPO₄·7H₂O 1.56g/L；Tween 20 0.05%(v/v)；pH7.4）。96孔酶联板（Nunc^TM）。辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG(H+L)（中山生物技术公司进口分装）。TMB显色液（欣经科生物技术公司）。酶标板读板机（Thermo Labsystems）。

纯化用填料及设备：rProtein A Sepharose Fast Flow（GE healthcare）。低温离心机（Sigma 2K15C）。8823A紫外检测仪（北京新技术应用研究所），3057记录仪（YOKOGAWA）。

其他材料：BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京赛驰生物科技有限公司），SDS-PAGE电泳设备（北京六一仪器厂），低分子量蛋白标准（Tiangen），高分子量蛋白标准（Takara），广谱分子量蛋白标准（NEB）。Western电转仪（北京六一仪器厂），PVDF膜（Millipore），TBST（10mM Tris-HCl，100mM NaCl，0.2%Tween-20，pH7.4），脱脂奶粉（北京普利来），HRP标记的goat anti-human IgG抗体（北京莱博公司），化学发光底物Immunobilon HRP substrate（Millipore）。

一、VEGFR-1/Fc融合蛋白的表达

1、稳定转染细胞系的筛选

（1）转染前一天，胰酶消化CHO-K1细胞并计数，24孔板每个孔中加1.2×10⁵个细胞铺板，使其在转染日密度为90%，不要使细胞保持融合超过24小时。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长培养基中。

（2）对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA（实施例1构建的重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-1/Fc）。多孔操作可以批量制备。

（3）对于每孔细胞，使用50μl的OPTI-MEM Ⅰ培养基稀释1μl-3μlLIPOFECTAMINE 2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。

（4）室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

（5）直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

（6）在37℃，5％的CO₂中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基，在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

（7）在开始转染一天后将细胞按1：10以上比例传代至新鲜培养基中，24h后换用含G418 500mg/L的筛选培养基加压筛选，每3d换液一次，加压筛选7-10d，见到细胞形成一个个集落以后，原位消化一次，促进死亡细胞从底部脱落，再继续加压筛选2-3d，即可进行单克隆化培养。

（8）单克隆化培养：用有限稀释法进行单克隆化培养。将细胞消化成单细胞悬液后计数，用含G418400mg/L生长培养基稀释至20、10和5个细胞/ml，100μl/孔接种于96孔培养板，置37℃培养。7-10天后，即可见单细胞克隆生长，逐孔观察，挑出单克隆，待其生长数目达10³以上后，取上清用ELISA检测蛋白表达量，选取表达水平较高的克隆，消化传代至24孔板培养，至长满孔底，换无血清DMEM/F12培养基培养24h，取上清用ELISA再次检测蛋白表达量。

其中，ELISA法测定VEGFR-1/Fc融合蛋白表达水平的方法如下：1）包被：将待检孔的上清各50μl直接加入酶联板孔，37℃孵育2h，PBS-T（含0.05%吐温20的PBS）洗涤1次；2）封闭：1%（1g/100ml）牛血清白蛋白(BSA)（溶于PBS-T），250μl/孔，37℃孵育2h，PBS-T洗涤1次；3）标记：加入辣根酶标记山羊抗人IgG(H+L)，用封闭液按照体积比1：8000的比例稀释，50μl/孔，37℃孵育1h，PBS-T洗涤3次；4）显色：加入TMB A、B试剂各一滴/孔，室温放置约5-20min，显蓝色后每孔加入1mol/L H2SO4 50μl终止，这时蓝色变为亮黄色；5）450nm测OD值。

（9）结果：重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-1/Fc转染CHO-K1细胞（图4中A）后，经过G418加压筛选3d后细胞开始死亡，并在5-7d左右达到死亡高峰期，此时应1-2d即换液一次，1周左右可见细胞成集落生长。经原位消化后，又有大量细胞不能再贴壁，2-3d后，消化收集细胞，有限稀释法进行单克隆化培养，3d后，即可在孔中观察到细胞克隆；约7-10d后，每克隆细胞数即可达到约10³（图4中B-D、E-G）。无血清培养条件下，收集上清通过ELISA挑选阳性克隆，挑选出的阳性克隆传代至24孔板培养后，再次ELISA检测。经过两轮筛选，VEGFR-1/Fc得到A5、D2、E6、F5四株表达水平较高的克隆，其中以VEGFR-1/Fc-A5表达水平最高，经BCA法测定纯化蛋白浓度达到5.2μg/（10⁶cell·24h）。

2、VEGFR-1/Fc融合蛋白的表达

将通过上述步骤1得到的高表达VEGFR-1/Fc融合蛋白的稳定转染细胞株A5，按6孔板-方瓶-转瓶逐级扩大培养，其间注意冻存高表达的细胞株。方瓶-转瓶传代培养时，将一个方瓶中的细胞以0.25%的胰酶消化下来，加入100ml生长培养基，接种至1000ml的转瓶中，于37℃转瓶机培养3～4d，至细胞铺满90%以上瓶壁，换无血清DF培养基，每培养24h后，收获上清，更换新的无血清DF培养基。可连续收液直至细胞从瓶壁脱落。4℃存放收获上清。所得上清中即含有大量的VEGFR-1/Fc融合蛋白。

二、VEGFR-1/Fc融合蛋白的纯化及浓度测定

1、VEGFR-1/Fc融合蛋白的纯化

结合缓冲液：50mM Tris-HCL，pH7.0；洗脱缓冲液：0.1M Gly-HCl，pH3.0；中和缓冲液：1M Tris-HCL，pH9.0。

采用rProtein A Sepharose Fast Flow对步骤一得到的含有大量的VEGFR-1/Fc融合蛋白的上清进行纯化，具体如下：

（1）装柱：保持所有装柱物品等温。装柱前，应先用双蒸水和结合缓冲液清洗柱子，排尽介质以及柱子中的气泡，关闭流出孔，在柱中装入1-2cm深的结合缓冲液，将20ml rProtein A亲合层析介质匀浆沿玻璃棒匀速注入柱子，迅速用结合缓冲液充满剩余空间，放上顶膜，接上进样管。打开流出孔，用200ml（5-10倍体积）结合缓冲液以最高2ml/min的速度流洗柱子。用100ml（5-10倍体积）洗脱缓冲液洗去柱内污染物。再以100ml结合缓冲液流洗柱子。

（2）上样：将样品溶液经4000g离心10分钟，再以0.8μm混合纤维素滤膜过滤以除去细胞、聚合物等杂质，调节上清pH至6.5左右。流速设为5ml/min，直至样品流完，用结合缓冲液流洗柱子。直至A280值回归基线（所有未结合蛋白都被洗脱）。

（3）洗脱：用洗脱缓冲液流洗柱子，承接流洗液的容器中预先注入约为洗脱液1/10体积的中和缓冲液。洗下的溶液立即使用时，可存放于4℃，长期存放于-20℃，最好-70℃。所洗下的溶液即为纯化后的VEGFR-1/Fc融合蛋白。

（4）储存：用3倍柱体积洗脱缓冲液流洗柱子，再用5倍柱体积20%乙醇流洗柱子，存放4℃。

2、VEGFR-1/Fc融合蛋白的浓度测定

A粗测蛋白浓度：采用280nm紫外光吸收法来测定。直接将样品加入石英比色皿测定。为排除核酸的干扰，可采用以下公式计算蛋白含量：蛋白含量（mg/ml）=OD280值×1.45-OD260值×0.74。

B准确定量蛋白浓度采用二喹啉甲酸（BCA）检测法：（1）配制工作液：根据标准品和样品数量，按BCA试剂A（BCA 1%，Na₂CO₃·H₂O 2%，Na₂C₄H₄O₆·H₂O 0.16%，NaOH 0.4%，NaHCO₃0.95%。用NaOH调节pH至11.25。其中“%”均表示g/100ml）与BCA试剂B（浓度为4g/100ml的CuSO₄·5H₂O溶液）体积比50：1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。（2）稀释标准品：取10μl标准品用PBS稀释至100μl，使终浓度为1mg/ml。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20μl。（3）根据粗测蛋白浓度结果加适当体积步骤1纯化后的VEGFR-1/Fc融合蛋白样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20μl。（4）各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。（5）冷却到室温，用酶标仪测定OD570，根据标准品OD值绘制标准曲线，依据标准曲线计算出目的蛋白浓度。实验重复三次，结果取平均值。

蛋白标准浓度曲线如图5所示，其R²值达到0.99以上。步骤1得到的纯化后的VEGFR-1/Fc融合蛋白浓度达到2.47mg/ml，三次测定结果如表1所示。

表1VEGFR-1/Fc融合蛋白浓度的三次测定结果（单位：mg/ml）

	重复1	重复2	重复3	平均值
					浓度（mg/ml）	2.56	2.41	2.44	2.47

三、VEGFR-1/Fc融合蛋白的鉴定

1、SDS-PAGE蛋白电泳

取20μl纯化后的VEGFR-1/Fc融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，还原电泳分离胶浓度取10%，非还原电泳分离胶浓度取6%。具体操作步骤详见《分子克隆》第二版及蛋白质电泳实验技术。

SDS-PAGE检测结果如图6所示，VEGFR-1/Fc单体（还原电泳）分子量81kD，二聚体（非还原电泳）分子量162kD，纯度91%；和理论分子量120kD相比，测定分子量较大，说明它们在翻译后又经过了进一步的修饰，根据其分子结构推断，主要是糖基化修饰；和抗体分子相比，VEGFR-1蛋白结构域平均分子量大于抗体，IgG1结构域平均分子量为12.5kD，而VEGFR-1的结构域1-3平均分子量为19kD，也进一步说明我们纯化获得的分子虽然带有Fc段，但并不是IgG1型抗体分子，没有受到血清IgG1的影响。

2、质谱鉴定

将SDS-PAGE电泳结束后的凝胶，运用nanoLC-MS/MS(Waters,Milford,MA)测序分析（由军事医学科学院仪器分析测试中心测定）。测得的蛋白序列用MASCOT数据搜索引擎(Matrix Science,London,UK)对照NCBI nr蛋白序列数据库进行分析。

从MASCOT网站分析的测序结果可看出，样品对应蛋白分数都远超过37（大于37分即有显著性差别），序列覆盖率也都较高，因此可以确认VEGFR-1/Fc融合蛋白分子序列与设计一致，为下一步活性测定提供了保障。

四、VEGFR-1/Fc融合蛋白样品的浓缩与保存

（1）将VEGFR-1/Fc融合蛋白溶液置

Ultra-15离心超滤管（Millipore），低温离心机（Sigma 2K15C）4℃不超过5000g离心25min，量大者可以分数次加入。

（2）将全部蛋白溶液离心至最小体积后（蛋白达到一定浓度，离心浓缩的效果就大大下降，体积减少不明显，此时可认为是最小体积），可先用去离子水稀释至15ml，离心一次，之后再加入需要的缓冲液，离心至最小体积即基本完成缓冲液置换。

（3）将浓缩后的蛋白用0.22μm的一次性无菌针头滤器过滤除菌。

（4）用高压灭菌的离心管分装浓缩、除菌后的蛋白溶液。存放于-70℃。

实施例3、VEGFR-1/Fc融合蛋白生物活性的检测

一、VEGFR-1/Fc融合蛋白亲和常数的测定

采用表面等离子体共振(SPR)技术测定实施例2所得VEGFR-1/Fc融合蛋白的亲和常数。

仪器和试剂：BIAcore 3000型表面等离子体共振仪(GE healthcare)，CM5型传感片(GE healthcare)，SPR专用HBS-P缓冲液(10mmol/L HEPES pH 7.4、150mmol/L NaCl和0.005%(v/v)表面活性剂P20)，Amine Coupling Kit，BIAcore Maitenance Kit，10mmol/LNaAc，50mmol/L NaOH，10mmol/L Glycine HCl pH1.5均购自GE healthcare。

BIACORE操作程序：

（1）预结合试验：芯片（CM5型传感片）表面带有负电，因此要偶联到芯片上的分子必须带上正电，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共价偶联反应的完成。采用pH4.0，pH4.5，pH5.0，pH5.5四种pH值10mmol/L NaAc溶液，以体积比4：1的比例稀释0.1mg/ml0的VEGF165样品（PeProTech,UK,Cat.100-20），然后，将样品以5μl/min的流速流过芯片表面，观察它与芯片的结合曲线，判断出合适结合的条件。

结果显示，预结合试验测定VEGFR-1/Fc融合蛋白与CM5结合的最佳pH值为4.5（图7）。四个峰从左至右依次代表pH4.0，pH4.5，pH5.0，pH5.5四种pH值，第一个峰表明在pH4.0条件下，吸附很快达到饱和，这样吸附的量有限，后三种一直呈上升趋势，有利于在芯片上偶联较多的蛋白。从峰的高度来看，第二峰高度最高，吸附的蛋白量最大，因此在正式包被时即选用pH4.5稀释样品。

（2）偶联蛋白：取20μl浓度为0.1mg/ml的VEGF165样品，加入190μl pH4.5的10mmol/LNaAc溶液中。EDC/NHS（碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺）按照体积比1:1混合后取70μl活化通道4，注射溶于NaAC溶液的VEGF165样品，目标值1000RU，用70μl浓度为1mol/L乙醇胺封闭。3池作为空白对照，并加以活化和封闭。实验条件均为25℃，流速20μl/min，缓冲液为HBS-EP(pH7.4)。

（3）亲和结合：将待测物（实施例2所得VEGFR-1/Fc融合蛋白）用HBS-P稀释成200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM，流过通道3和4，流速20μl/min，结合时间3分钟，稳定时间1分钟，解离时间15分钟，每一个循环后的再生条件为10mmol/L Glycine HCl（pH1.5），再生30秒，BORATE8.5（10mM硼酸二钠，1M NaCl，pH 8.5；Biacore AB,Uppsala,Sweden），再生30秒。

（4）亲和常数测定：所得传感图用BIAevaluation分析软件4进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165动力学常数（取五个不同浓度VEGFR-1/Fc融合蛋白检测结果的平均值）。

结果如图8及表2所示。从图中可以看出，结合解离曲线饱满平滑，因此测得数据可靠性高。由于内皮细胞的生长环境需要高浓度的Mg离子，本发明同时检验了Mg离子对VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165结合的影响，实验表明Mg离子对VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165结合并无显著影响，甚至有轻微的干扰作用（图9和表3）。另外，两次无Mg离子条件下对VEGFR-1/Fc融合蛋白亲和常数的测定也显示，间隔72小时后，测得数据仍然具有良好重复性。

表2VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165动力学常数检测结果

表3Mg²⁺对VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165动力学常数的影响

二、体内试验

1、VEGFR-1/Fc融合蛋白抑制HMEC-1增殖试验

（1）人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cell-1，HMEC-1）细胞购自ADCC No.CRL10636，培养条件为MCDB-131培养基（Gibco），含10%胎牛血清（FBS）（杭州四季青），培养于5%CO₂37℃温箱。

（2）HMEC-1细胞预先用无血清培养基培养（血清饥饿）24小时，实验时将细胞稀释至2×10⁵cells/ml，在96孔板（BD Falcon）中每孔加入50μl。

（3）不同浓度的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165预先混合（2倍终浓度，VEGFR-1/Fc融合蛋白的终浓度为0ng/ml或50ng/ml或100ng/ml或200ng/ml或400ng/ml或800ng/ml，VEGF165的终浓度为28ng/ml。），每个剂量三个复孔，37℃孵育2h，每孔加入50μl。

（4）然后再加入细胞孔中，于37℃，5%CO₂温箱连续培养5d。

（5）最后用50μl浓度为5μg/ml的Calcein AM（Invitrogen）在37℃，5%CO₂温箱温育30-60min。

（6）胰酶逐孔消化，消化后用荧光读板机（Thermo）485/530nm读取荧光数值，进行分析。

实验进行三次重复，结果取平均值。

结果如图10所示，从图可以看出，VEGFR-1/Fc分子对于HMEC-1增殖均有较明显的抑制作用，有效抑制浓度在200ng/ml以上，200ng/ml以下无明显抑制作用。

2、VEGFR-1/Fc融合蛋白抑制HMEC-1迁移试验

（1）实验前HMEC-1细胞预先用无血清培养基培养（血清饥饿）24小时，进一步去除血清的影响。

（2）取对数生长期（70-80%汇合度）的HMEC-1细胞，胰酶消化，以有血清培养基中和，离心去除胰酶，以无血清培养基稀释至细胞浓度至4×10⁵cells/ml。

（3）取400μl细胞悬液（8×10⁴cells）至Millicell小室（Millipore），外孔加入含有不同浓度的VEGFR-1/Fc融合蛋白（0ng/ml或50ng/ml或200ng/ml或800ng/ml）与VEGF165（28ng/ml）的培养基600μL，于37℃，5%CO₂温箱温育6－24h。注意外液面略高于内液面。

（4）准备5μg/ml的Calcein AM。在每1μl的Calcein AM中加20μl的DMSO，再加入180μl 37℃的HBSS（Gibco,24020-117）。

（5）吸出上下培养基，内室先用干棉签有力而均匀的抹一遍，再用沾湿培养基的棉签擦一遍，以彻底擦去未迁移细胞。

（6）用HBSS洗涤，再将其放入预装有500μl 5μg/ml Calcein AM的24孔板孔中，37℃，5%CO₂温育30-60min。

（7）荧光读板机读数，激发/发射光波长（excitation/emission wavelengths）为485/530nm。

结果如图11和图12所示，从图可以看出，VEGFR-1/Fc对于HMEC-1迁移均有较明显的抑制作用，在50ng/ml即显著抑制细胞迁移，在800ng/ml抑制效应趋于饱和。

三、在鸡胚绒毛尿囊膜上检测VEGFR-1/Fc融合蛋白对于血管生成的影响

（1）材料：甲基纤维素（SIGMAM-0512），混合纤维素滤膜（PALL C700710），新洁尔灭（山东利尔康），75%(v/v)医用乙醇，PBS，VEGF165、实施例2得到的VEGFR-1/Fc融合蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，博大泰克）、受精鸡蛋（前辛庄鸡场），模具板（模具板孔为球面，直径6mm，深2mm），打孔器，眼科镊，眼科剪，电动微型砂轮，蛋托，照蛋器，隔水式电热恒温培养箱，吹风式电热干燥箱，超净工作台，摄影器材等。

（2）甲基纤维素碟制备：0.5%（0.5g/100ml）甲基纤维素溶解后，置4℃备用。制碟时，取120μl甲基纤维素溶液分4次加入模具板凹孔内，每次均在60℃烤干。最后用眼科镊将甲基纤维素碟取出，置无菌平皿内，90℃烤箱烤4h，备用。

（3）胚蛋消毒：购买孵育第7天受精鸡蛋，于38℃，体积比1:1000的新洁尔灭液中浸泡3-5min，清洗、擦干放入消毒蛋托（体积比1:1000的新洁尔灭液中浸泡消毒）。在照蛋器照射下，用铅笔将气室轮廓画出。

（4）孵育：隔水式电热恒温培养箱温度（37.8±0.5）℃，湿度在50%～60%。种蛋气室端向上，呈45°倾斜，早、中、晚各开箱门1次，以排除二氧化氮和多余的水蒸气。为防止胎膜和蛋壳发生粘连，促进羊膜运动，同时使各部位的蛋受热均匀，应每天转蛋至少2～4次。翻蛋的时候以垂直线为中线，由前倾45度角转到后倾45度角，转幅为90度，种蛋钝端（大头端）向上。

（5）暴露鸡胚胎绒毛尿囊膜（CAM）：孵蛋第8天，用微型电动砂轮在气室区域内磨出直径1.5cm左右的一个圆环，75%（v/v）酒精消毒后，用眼科镊揭去蛋壳及外壳膜。用1ml温热无菌PBS润洗内壳膜，静置1min，PBS即可将包裹鸡胚的内壳膜湿透，这时再用眼科镊小心将内壳膜揭去，湿透的膜可以很轻易的与CAM分离，而干燥的膜会与CAM粘得很紧，强行揭除时会造成CAM严重的渗血甚至出血，这将会引起明显的非特异性血管增生，注意在揭膜时切勿使存留在膜上的蛋壳碎屑（可能有）掉在CAM上，否则也会引起非特异性血管增生。上述操作一定要严格遵守无菌术。

（6）上药：将甲基纤维素碟载体置于CAM表面的合适位置，然后将不同含量（5pmol、10pmol、25pmol，对应体积为5μl、10μl、25μl）的VEGFR-1/Fc融合蛋白溶液（每含量为一组，一组含10只蛋）分别滴加于载体上，用透明胶带纸（75%酒精浸泡灭菌）封口，继续孵育。

（7）取下CAM：加药72h后，撕开透明胶带纸，检查弃去死亡胚蛋，在健康胚蛋CAM上直接加入甲醇：丙酮=1：1（体积比）的固定液（乙醛亦可）固定15min，用眼科剪沿气室边缘剪开CAM，眼科镊取出CAM，将CAM平铺在滤纸上。

（8）记录分析：将标本拍照，记数载体周围1cm²血管数量。t检验分析计数结果。

结果如图13所示，从图可以看出，VEGFR-1/Fc分子对于鸡胚绒毛尿囊膜血管生成均有较明显的抑制作用。VEGFR-1/Fc在5pmol即显著抑制CAM血管生成，在5pmol-25pmol抑制效应呈明显的量效依赖关系。

四、VEGFR-1/Fc融合蛋白对裸鼠血管生成的影响

采用Directed In Vivo Angiogenesis Assay试剂盒检测VEGFR-1/Fc融合蛋白对裸鼠血管生成的影响。具体如下：

（1）器械（试剂盒中不包括的）：鼠笼，层流室，微量移液器，移液管与吸球，CO₂温箱，荧光读板机，黑色96孔荧光检测板（Greiner），量筒，尖嘴钳，尖嘴软骨镊，解剖剪，解剖刀，外科剪，皮肤缝合器。

（2）试剂（试剂盒中不包括的）：北京维通利华实验动物技术有限公司Nu/Nu裸鼠，专业名称：Crl:NU-Foxn1nu，去离子水，DMEM/F12（Hyclone），10%FBS（杭州四季青），100mg/mL Ketamine HCL（Invitrogen），20mg/mL Xylazine（Sigma），CalceinAM（Invitrogen），FITC-Dextran（Sigma），VEGFR-1/Fc融合蛋白。

（3）试剂准备：Wash Buffer：用225ml无菌去离子水稀释25ml10×Wash Buffer；纤维母细胞生长因子2（FGF-2）(100ng)/heparin混合物：在准备立即加入基底膜提取物（Basement Membrane Extract，BME）之前，加1μl肝素溶液至10μl FGF-2(100ng)，轻柔混合；FGF-2(1.8μg)/VEGF165(600ng)/heparin混合物：在准备立即加入BME之前，加6μl肝素溶液至60μl FGF-2(1.8μg)/VEGF165(600ng)，轻柔混合；FITC-LectinDiluent：用9.6ml无菌去离子水稀释400μl 25×FITC-Lectin；FITC-Lectin：用10ml1×FITC-Lectin Diluent稀释50μl 200×FITC-Lectin。

（4）Angioreactors的准备

a）4℃冰上融化BME过夜，第6步以前，一直保持BME在冰上。

b）预冷所有的枪头、吸管、AngioRack，以及VEGFR-1/Fc融合蛋白于0℃，保持BME在冰上。

c）在冰上，加11μl的FGF-2(1.8μg)/VEGF165(600ng)/heparin混合物至每管（200μl）BME作为阳性对照；加11μl无菌PBS至每管BME作为阴性对照。

d）仍然在冰上，将VEGFR-1/Fc融合蛋白加至其它管BME（200μl/管），使VEGFR-1/Fc融合蛋白形成如下不同终浓度：10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M，加入液体不能超过10%BME总体积，（过度稀释会降低它的聚合能力），轻柔混合，勿使产生气泡，气泡可通过250g 4℃离心5min去除。

e）准备装Angioreactors。Angioreactors必须存放于冰上，置于架上，用预冷无菌加样枪头将20μl含或不含刺激因子的BME注入，勿引入气泡，每管足够8个反应。（为防止气泡产生，起始用量25μl，枪头直插底部，边放边撤，一直加满，一次只能加8管，以防止不成熟的凝固）。

f）装8管后，迅速颠倒，装入无菌EP管，置37℃1h促凝，（倒置可防止开口端出现凹面）。依次完成其它管。

（5）植入Angioreactors

a）麻醉小鼠：50mg/ml盐酸氯胺酮（Ketamine HCL）（麻醉药，Sigma,K2753），16mg/ml二甲苯胺噻嗪（Xylazine）（肌松药Sigma,X1251），1ml/kg·BW腹腔注射。

b）超净台中用钳子取出Angioreactors。

c）切开位置宜选在裸鼠背侧髋关节上约1cm处，捏起皮肤用解剖剪切一小口，然后扩展至约0.5-1cm长，注意不要伤及皮下组织。

d）开口端朝向切口植入，可将Angioreactors用1×PBS润滑，注意鼠的标记，置裸鼠于热灯下15min帮助其恢复。

e）继续饲养9-15天，天数越长，血管新生越明显。

（6）结果观测：

a）首先处死小鼠，置于高于70%CO₂5min。

b）用解剖剪取下angioreactors外部皮肤，周长约2cm，用解剖刀沿硅胶管开口边缘整齐切下，以保留全部长入的血管。

c）将所有angioreactors排列整齐，拍照。

结果如图14所示，从图可以看出，VEGFR-1/Fc分子对于裸鼠体内血管生成均有较明显的抑制作用。VEGFR-1/Fc在10^-10M即部分抑制裸鼠体内血管生成，在10^-7M基本完全抑制裸鼠体内血管生成，在10^-10M-10^-7M抑制效应呈明显的量效依赖关系。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白自氨基端至羧基端依次为血管内皮生长因子受体1的结构域1-3、人IgG1的Fc片段。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制血管生成活性的由序列1衍生的蛋白。

3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因；所述基因是如下1）-5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）序列表中序列3所示的DNA分子

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90％以上同源性，且编码权利要求1或2所述融合蛋白的DNA分子；

5）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA分子杂交，且编码权利要求1或2所述融合蛋白的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：在所述重组表达载体中，启动所述基因转录的启动子为CMV启动子。

8.权利要求1或2所述融合蛋白，或权利要求3或4所述核酸分子，或权利要求5-7中任一所述的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒在制备下述任一产品中的应用：

（1）抑制内皮细胞增殖的产品；

（2）抑制内皮细胞迁移的产品；

（3）抑制血管生成的产品；

（4）抗肿瘤产品；

所述内皮细胞具体为血管内皮细胞。

9.活性成分为权利要求1或2所述融合蛋白，或权利要求3或4所述核酸分子，或权利要求5-7中任一所述的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒的如下产品：

（1）抑制内皮细胞增殖的产品；

（2）抑制内皮细胞迁移的产品；

（3）抑制血管生成的产品；

（4）抗肿瘤产品；

所述内皮细胞具体为血管内皮细胞。

10.权利要求1或2所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：将所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述多肽；所述生物细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞；

所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2所示。

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