CN104031148A - 针对人PrPc的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

针对人PrPc的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种针对人PrPc蛋白的单克隆抗体及其应用，所述的抗体能够高靶向性的降低转录因子Twist1的表达水平，从而抑制直肠癌细胞的迁移和转移，并诱导巨噬细胞及NK细胞靶向直肠癌肿瘤细胞，从而通过ADPC及ADCC效应抑制肿瘤细胞的增殖，同时，所述抗体在与cetuximab联合用药中，也取得了相比于二者单独使用更好的抑瘤效果。

Description

针对人PrPc的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种针对人PrPc蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，是全球位居第三的致死性肿瘤。在西方发达国家结直肠癌发病率仅次于肺癌居于第二位，在我国结直肠癌的发病率和死亡率也呈现出上升趋势，已由80年代的第六位上升至第四位。
肿瘤的靶向治疗是近些年发展起来的治疗癌症的新方法，它很大程度上避免了传统癌症疗法如手术治疗、化疗和放疗所带来的肿瘤细胞扩散和严重毒副作用的产生。而针对肿瘤细胞表面抗原而进行的单克隆抗体治疗是肿瘤靶向治疗的主要方式，表现出了良好的肿瘤治疗效果。
细胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPc)，是一种广泛表达于真核生物细胞表面的糖蛋白，一共有253个氨基酸，在C末端有一个GPI结合位点，用于锚定在细胞外膜上，在181和197位有两个天门冬氨酸残基糖基化位点。在哺乳动物体内，PrPc主要表达于神经系统，在淋巴细胞、胃上皮细胞、肾脏心脏、和肌肉等非神经组织中也有表达。有报道表明，PrPc与肿瘤发生及抗药性有关，其在结直肠癌、前列腺癌、胃癌等多种癌症组织中高表达，本发明人的前期工作也表明CD44与PrPc共表达的细胞具有肿瘤干细胞的特性。此外，有报道表明PrPc对结直肠癌干细胞的肝转移也起到重要作用，因此，针对PrPc进行以单克隆抗体为基础的靶向性治疗研究，有望为癌症的治疗提供新的方案。
发明内容
本发明首先涉及一种特异性结合人细胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPc)的单克隆抗体Ab-5。
所述的Ab-5抗体的轻链可变区(VL)氨基酸结构如SEQ ID NO.1所示，重链可变区(VH)的氨基酸结构如SEQ ID NO.2所示，恒定区为鼠源恒定区。
SEQ ID NO.1.：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK-NGLMLHQLYPSSHHPVLD
SEQ ID NO.2.：
MECSWVILFLLSGTGGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAKPGRTYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGGSRP
本发明还涉及所述的Ab-5抗体的编码核苷酸序列。所述的ab-5抗体的轻链编码序列优选为SEQ ID NO.3、所述的Ab-5抗体的重链编码序列优选为SEQ ID NO.4
SEQ ID NO.3:
CACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTTCTAGACGC
SEQ ID NO.4：
CACCATGGAATGCAGCTGGGTCATCCTCTTTCTCTTGTCAGGAACTGGAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAACTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGATACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAAACCTGGGCGGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGGTTCTAGACCT
本发明还进一步涉及在所述Ab-5抗体的Fab片段基础上对抗体进行人源化改进或全人化改进的抗PrPc抗体。
本发明还涉及所述的ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因在制备检测PrPc蛋白的检测或诊断试剂中的应用。
本发明还涉及以所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因为主要成分的PrPc蛋白的检测试剂盒。
本发明还涉及所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因在制备药物中的应用，所述的药物为抗肿瘤药物或抑制肿瘤转移的药物，所述的肿瘤为优选实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌。
本发明还涉及以所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因为活性成分的抗肿瘤药物，所述的肿瘤为优选实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌。
本发明还涉及以所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因作为现有抗肿瘤药物增效辅助制剂的应用，所述的肿瘤为优选实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌，所述的抗肿瘤药物优选为cetuximab。
本发明还涉及以所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因与现有抗肿瘤药物组成的抗肿瘤复方制剂，所述的肿瘤为优选实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌，所述的抗肿瘤药物优选为cetuximab。
附图说明
图1：电泳及抗体Western Blot法检测His标签PrPc蛋白的凝胶图：A.电泳检测图谱，B.经抗体12F10做western blot实验鉴定。
图2：Ab-3、5、25及12F10与PrPc的抗原结合表位：A.细胞免疫荧光法检测各个抗体与9种PrPc的结合；B.免疫印迹法检测各个抗体与9种PrPc的结合；C.9种PrPc突变体的示意图；D.抗体结合区域定位示意图。
图3：不同细胞系中PrPc的表达情况：A.P6C细胞；B.SW480细胞；C.HCT116细胞。
图4：抗体对不同细胞活力的影响：A.处理时间24h；B.处理时间48h。
图5：不同抗体与抗原的亲和及解离动力学曲线：A.Ab-3抗体；B.Ab-5抗体；C.Ab-25抗体；D.12F10抗体。
图6：Ab-5抗体在小鼠体内的代谢曲线：A.抗体浓度随注射浓度变化标准曲线；B.抗体浓度随时间变化曲线。
图7：Ab-5抗体对荷瘤小鼠的治疗效果：A.活体肿瘤细胞荧光成像；B.原位肿瘤体积；C.不同脏器的解剖图及肿瘤荧光信号定位；D.肿瘤细胞转移指数。
图8：Ab-5抗体能有效抑制裸鼠皮下肿瘤的生长：A～B.治疗组与对照组P6C原位肿瘤体积；C.治疗组与对照组小鼠体重；D～E.治疗组与对照组SW480原位肿瘤体积；F.治疗组与对照组小鼠体重。.
图9：Ab-5与cetuximab联合治疗能更好地抑制原位肿瘤的生长及肿瘤转移能力：A.单独或联合治疗的小鼠腹部肿瘤荧光与脏器荧光；B.单独或联合治疗的小鼠肿瘤体积；C.单独或联合治疗的小鼠肿瘤转移；D.肿瘤细胞分型。
图10：转录因子Twist1在Ab-5处理的肿瘤细胞中表达量降低：A.多个肿瘤细胞系中转录因子Twist1的表达水平；B.P6C细胞PrPc蛋白与Twist1表达量正相关；C.P6C细胞中Twist1及间叶细胞及上皮细胞状态因子随Ab-5抗体处理的变化；D.SW480细胞中Twist1及间叶细胞及上皮细胞状态因子随Ab-5抗体处理的变化。
具体实施方式
以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。
细胞系及主要试剂：
本发明所使用的细胞系包括：P6C(该细胞系由本实验室自行自结肠癌病人肿瘤组织中分离得到)、SW480CCL-228TM)、HCT116CCL-247TM)、MCF7HTB-22TM)、MDA-MB-231HTB-26TM)、HeLa、Human normal blood cell
本发明所使用的主要试剂及其来源为：
Actin单克隆抗体(A-5441)、a-tubulin单克隆抗体、Triton-X100、PAGE凝胶配制试剂、Tetracycline、Pipes、Digitonin购自Sigma；
Calreticulin单克隆抗体购自Abcam；
Myc单克隆抗体、Cytochrome C单克隆抗体(65981A)、Tim23单克隆抗体(611222)、GM130单克隆抗体(610822)、FITC、Cy5、Cy3购自BD PharMingen；
C-myc单克隆抗体(SC-40)购自Santa Cruz；
Western blotting用醋酸纤维素膜、Sucrose、Hepes购自Gibcol BRL
Coomassie Blue G250,R250、NP-40、Tween20、Proteinase K、DMSO购自Merck
West Pico Chemiluminescent substrate、Disuccinimidyl suberate(DSS)购自Pierce
X-OMAT BT Scientific Film购自Kodak
PfuUltra High-Fidelity DNA PolymerasesⅡ购自Stratagene
限制性内切酶购自Biolabs
dNTP、Pyrobest DNA Polymerases购自Takara
Lipofectemin2000、OPTI-MEM、MitotrackerRedCMXROS购自Invitrogen
FBS(Fetal bovine serum)购自Hyclone
其他试剂若无特别说明，均为国产分析纯。
实施例1.His标签PrPc蛋白的表达与纯化
一、His标签PrPc原核表达质粒的构建
1.pET-30a(+)载体的酶切回收
酶切位点为BamH I和Xho I，双酶切
酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，并回收。
2.PrPc全长基因的获取，酶切回收
PCR引物序列：
SEQ ID NO.5：正义链：5’-GGATCCATGGCGAACCTTGGCTG-3’
SEQ ID NO.6：反义链：5’-CTCGAGTCCCACTATCAGGAAGA-3’
PrPc cDNA全长序列：SEQ ID NO.7：
ATGGCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCACCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGC TGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
PrPc氨基酸序列：SEQ ID NO.8：
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
利用上述引物经PCR扩增，产物经BamH I和Xho I双酶切胶回收，然后用T4DNA连接酶与酶切好的pET-30a(+)载体进行连接。
3.连接产物的转化及克隆扩大培养
取Top10感受态细胞，于冰浴中融化；取1～5μL的连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；(注意：DNA溶液体积不可超过使感受态细胞悬液10％。)；42℃热休克30s，期间不要晃动；迅速转移至冰浴2min以上；每管加入1000μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃150rpm震荡培养1h，以使细菌复苏，并表达质粒的抗性基因；4000rpm离心2min，弃上清，沉淀用100μL LB重悬，均匀涂布于含卡那霉素的LB固体平板上，放置通风橱中，至液体被吸收；37℃倒置过夜培养；挑选克隆至添加有卡那霉素的1～5mL LB液体培养基中进行扩大培养，等细菌摇起后，送菌液测序(也可小提后送质粒测序)。
测序结果正确：SEQ ID NO.9：
TCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCACGCTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCACCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCAACAAGCA
PrPc基因序列及HIS标签的序列信息由下划线标注。
4.蛋白在Rosetta细菌之中的大量表达
His标签PrPc表达质粒转化Rosetta细菌；挑取含重组质粒的菌体单克隆至5mL LB(含卡那霉素50μg/mL)中37℃220rpm，过夜培养；按1∶100比例将过夜菌，加入到含500mL LB培养基的2000mL培养瓶中，37℃220rpm，培养至OD600为0.4-1.0(最好0.6)，降温至16-20℃；取菌液2～5mL，至无菌摇菌管，作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.1～0.4mM作为实验组，两组继续在16-20℃震荡培养16h；分别取菌体1mL，离心12000g，30s收获沉淀，用100μL2×蛋白loading buffer重悬，混匀，煮样10min，剩余大量菌液5000rpm离心10min，去上清，冻于-80℃待用；离心12000g，5min，取上清作为样品，可做SDS-PAGE等分析，并用WB和R-250法鉴定目的蛋白是否表达。
5.原核表达His标签蛋白的纯化
取4中所收获的菌体超声破碎，变性条件下用镍柱法提取蛋白；收集的蛋白可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分电泳检测纯度；
在Rosetta细菌之中大量表达之后，我们发现蛋白几乎只存在于沉淀中，所以采用变性条件，进行蛋白的纯化，采用的洗脱液PH为6.0。经SDS-Page电泳，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色鉴定蛋白纯度，目标蛋白约34kD，其他位置几乎没有杂带，纯化效果良好，经抗体12F10做western blot实验鉴定蛋白的特异性，结果只有一条带，特异性良好(见图1)。
实施例2.小鼠抗人PrPc抗体的获得
1.免疫动物
将His-PrPc纯化蛋白，皮下初次免疫3只SPF级Balb/c雌性小鼠，编号为：1，2，3；免疫量为60μg蛋白/只。两周后，皮下第一次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。再两周后，第二次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。又两周后，皮下第三次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。再隔一周后，眼眶取血，测多抗血清效价。
2.效价检测
步骤：2μg/mL，4oC包被过夜；1％BSA，37oC封闭2h；多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。
3.细胞融合实验
取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。
4.挑克隆
挑5×93个细胞单克隆，培养于5块96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100μL/孔)；
5.单克隆细胞第一次筛选
用免疫原包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选。
6.单克隆细胞第二次筛选
ELISA抗原包被抗原为免疫原及带his-tag的其它蛋白；
实验步骤及过程与第一次筛选一致，得到20株阳性杂交瘤细胞株。
7.单克隆细胞亚类鉴定
将二筛完的20株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到16株阳性抗体(15株IgG，1株IgA)。
8.冻存
冻存液配制，FBS：IMDM：DMSO(体积比)＝7:2:1；
每一株冻存三管，过3天后再冻存三管，冻存方法为冻存盒冻存法，-80℃过夜后，移于液氮柜中保存。
对其中抗体分泌能力较强的细胞株进行RNA提取反转录及抗体可变区PCR扩增与测序，我们获得了anti-PrPc mAb-3、anti-PrPc mAb-5、anti-PrPc mAb-25，其中anti-PrPc mAb-5的可变区cDNA序列如下：
PrPc Ab-5VH：SEQ ID NO.4
1-CACCATGGAATGCAGCTGGGTCATCCTCTTTCTCTTGTCAGGAACTGGAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAACTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGATACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAAACCTGGGCGGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGGTTCTAGACCT-463
PrPc Ab-5VL：SEQ ID NO.3
1-CACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGAC AGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTTCTAGACGC-447
相对应的氨基酸序列如下：
PrPc Ab-5VH：SEQ ID NO.2
MECSWVILFLLSGTGGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAKPGRTYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGGSRP
PrPc Ab-L5VL：SEQ ID NO.1
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK-NGLMLHQLYPSSHHPVLD
实施例3.Ab-3、5、25,12F10与PrPc抗原结合表位的确定
1.截短型PrPc表达质粒构建
Wt本实验室原来已构建好(将PrPc野生型基因全序列克隆到质粒pCDNA4.0TO/MYC.HIS.B中构建获得)，不同的截短型表达质粒，利用上述突变引物以wt质粒为模板，经pyrobest高保真酶PCR反应，PCR产物经1％琼脂糖电泳鉴定之后，用DpnI消化，以便将原始含有甲基化的双链DNA模板除去，然后转化细菌(大肠杆菌感受态Top10)，并测序验证，若结果正确，即可得到截短型PrPc表达质粒。测序成功后，按实验需要，可进行扩大培养，大量提取质粒，备用。
所用质粒：pCDNA4.0TO/myc.HIS.B，酶切位点：Kpn I and Xho I
WT引物：
SEQ ID NO.10：wtPrPc F:5’-GG GGTACC ATGGCGAACCTTGGCTGC-3’
SEQ ID NO.11：wtPrPc R:5’-CCG CTCGAG CC TCCCACTATCAGGAAGATGA-3’
wt相对分子量～34k(8k tag)
2.依据PrPc功能区及氨基酸序列信息设计突变体类型，设计的突变体的序列结构及截短突变引物如下：
(1)PrPc-1:N-signal peptide(1-50)
Base：SEQ ID NO.12：
ATGGCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCC TGGAGGCAACCGCTACCCA
AA：SEQ ID NO.13：
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYP
截短突变引物：
SEQ ID NO.14：PrPc-1F:5’-GGCAACCGCTACCCAGGACGAGCTCAGATCTCCCGGGCGC-3’
SEQ ID NO.15：mPrPc-1R:5’-CTAGACTCGAGCTCCTGGGTAGCGGTTGCCTCCAGGGCTG-3’
(2)PrPc-2:five octapeptide repeats–C terminal(51-253)
Base：SEQ ID NO.16：
CCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
AA：SEQ ID NO.17：
PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
截短突变引物：
SEQ ID NO.18：PrPc-2F:5’-AAGCTTGGTACCATGCCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGC-3’
SEQ ID NO.19：PrPc-2R:5’-ACCACCGCCCTGAGGCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
(3)PrPc-3:hydrophobic domain–C terminal(106-253)
Base：SEQ ID NO.20：
AAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACC AGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
AA：SEQ ID NO.21：
KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
截短突变引物：
SEQ ID NO.22：PrPc-3F:5’-AAGCTTGGTACCATGAAAACCAACATGAAGCACATGGCTG-3’
SEQ ID NO.23：PrPc-3R:5’-CTTCATGTTGGTTTTCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
(4)PrPc-4:β1–C terminal(127-253)
Base：SEQ ID NO.24：
GGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
AA：SEQ ID NO.25：
GYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
截短突变引物：
SEQ ID NO.26：PrPc-4F:5’-AAGCTTGGTACCATG GGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGA-3’
SEQ ID NO.27：PrPc-4R:5’-TCCCAGCATGTAGCC CATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
(5)PrPc-5:α1–C terminal(144-253)
Base：SEQ ID NO.28：
GACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCAT GGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
AA：SEQ ID NO.29：
DYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
截短突变引物：
SEQ ID NO.30：PrPc-5F:5’-AAGCTTGGTACCATGGACTATGAGGACCGTTACTATCGTG-3’
SEQ ID NO.31：PrPc-5R:5’-ACGGTCCTCATAGTCCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
(6)PrPc-6:β2–C terminal(162-253)
Base：SEQ ID NO.32：
CAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
AA：SEQ ID NO.33：
QVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
截短突变引物：
SEQ ID NO.34：PrPc-6F:5’-AAGCTTGGTACCATGCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATG-3’
SEQ ID NO.35：PrPc-6R:5’-CCTGTAGTACACTTGCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
(7)PrPc-7:α2–C terminal(173-253)
Base：SEQ ID NO.36：
CAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
AA：SEQ ID NO.37：
QNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
截短突变引物：
SEQ ID NO.38：PrPc-7F:5’-AAGCTTGGTACCATGCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCG-3’
SEQ ID NO.39：PrPc-7R:5’-CACAAAGTTGTTCTGCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
(8)PrPc-8:α3–C terminal(195-253)
Base：SEQ ID NO.40：
GGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
AA：SEQ ID NO.41：
GENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
截短突变引物：
SEQ ID NO.42：PrPc-8F:5’-AAGCTTGGTACCATGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACG-3’
SEQ ID NO.43：PrPc-8R:5’-GGTGAAGTTCTCCCCCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
(9)PrPc-9:C-ancre peptide(231-253)
Base：SEQ ID NO.44：
AGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
AA：SEQ ID NO.45：
SMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
截短突变引物：
SEQ ID NO.46：
PrPc-9F:5’-AAGCTTGGTACCATGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCAC-3’
SEQ ID NO.47：
PrPc-9R:5’-GAAGAGGACCATGCTCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
如上所述，我们构建了9种PrPc突变体(图2C)，利用脂质体法转染Hela细胞，经细胞免疫荧光法及免疫印迹法验证了各Ab-3、5、25及商业化抗体12F10抗体与PrPc蛋白突变体之间的相互作用关系，并根据实验结果，得出各抗体与PrPc蛋白相互作用的表位。两种抗体与PrPc抗原结合表位位置相同，与PrPc突变体的结合都止于突变体四(图2A和B)，而不与突变体五及以后的突变体结合，说明它们的结合位点位于β1α1区域(图2D)，此区域AA位点是从127到161位，共35个氨基酸，其序列结构为：
SEQ ID NO.48：GYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQV。
实施例4.PrPc抗体对PrPc阳性结直肠癌细胞系有明显抑制迁移的能力
用已验证过的PrPc抗体Ab-3作为一抗鉴定不同结直肠癌细胞系(P6C、SW480与HCT116)及乳腺癌细胞系(MCF7)(前述细胞的培养基为含10％FBS的HDMEM)PrPc的表达情况，经流式细胞仪分 析而知这几种细胞系，均有不同程度的表达率，P6C、SW480与HCT116分别为53.6％、24.6％及66.8％(图3)，因此这三种细胞系可以用于PrPc抗体与肿瘤治疗关系的研究中，而MCF7可作为阴性对照。
利用细胞迁移transwell技术测定PrPc阳性细胞经抗体处理后迁移能力的变化。Transwell计数法具体步骤为：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗2遍，用无血清培养基重悬。调整细胞密度至1×106，取细胞悬液100μl(1×105)加入不同浓度PrPc抗体，混匀后加入24孔板配套的8μm孔径Transwell小室中；下层用含10％FBS及不同浓度PrPc抗体的培养基，600μL/孔，常规培养24h后，固定细胞，R-250染色，显微镜下观察，拍照，并计数，统计穿过小孔的细胞数。
所用抗体浓度为10μg/mL，处理时间为24小时，结果发现，跟IgG对照组比较，在光学显微镜下可以看到，所有加PrPc抗体的实验组，细胞迁移能力都受到了明显的抑制。在同一视野下计数穿过transwell小室隔膜的细胞数平均数，统计抗体对于细胞迁移的抑制率，其中，对于细胞迁移抑制效果最佳的Ab-5抗体的抑制率结果见表1。
表1.Ab-5抗体对于PrPc阳性结直肠癌细胞的迁移抑制影响
实施例5.PrPc抗体对癌症细胞活力无明显影响，Ab-5与抗原之间的亲和力大于Ab-3,25及12F10
细胞加抗体处理24h及48h后，经MTT法检测细胞活力，然后进行数据分析得知，与IgG对照组相比，PrPc阳性或非阳性癌症细胞，经PrPc抗体处理后24h(图4A)和48h(图4B)后细胞活力没有明显变化，说明本发明所述的PrPc抗体对细胞活力没有影响。
依据抗体与PrPc的结合表位，尽可能缩短PrPc蛋白的长度，以使表达的蛋白可溶，用于Biacore实验，我们设计了带GST标签的突变体，GST-PrPc(β1α1)，加上GST，总蛋白分子量约为32kD，经表达纯化，我们得到了可溶性很好纯度也很高的GST-PrPc(β1α1)蛋白。
利用Biacore实验，检测了Ab-3,5,25及12F10与可溶性GST-PrPc(β1α1)蛋白之间亲和与解离的动力学常数，并计算彼此之间的亲和力大小。结果表明，在不同抗原浓度下，如600uM，200uM，67uM，22.3uM，7.4uM浓度下，Ab-3,5,25及12F10表现出了不同的与抗原之间的亲和力，其中Ab-25亲和力最低，不能很好检测到与抗原相互之间的动力学常数，而Ab-3,5及12F10表现出了良好的亲和与解离的动力学曲线(图5)，并经过计算得知，这三种抗体与抗原之间的亲和力分别为5.67E-09M、3.05E-09M与1.64E-08M。Ab-5与抗原的亲和力是Ab-3的1.87倍，是12F10的5.38倍，亲和力最强。
实施例6.PrPc抗体在小鼠体内能长时间保持较高浓度
按NOD/SCID小鼠每10g体重100μg抗体，将Ab-5抗体(浓度2mg/mL)注入小鼠腹腔，分别于 6h，12h，24h，48h，72h，96h，d5，d6，d7，d8，d9后鼠尾采血后，按1:1000稀释血液，经ELISA实验，根据标准曲线分析(图6)，小鼠血液中的抗体浓度在6h即可达到较高水平，浓度约为5.8μg/mL，且这一浓度一直能持续144个小时，然后开始降低，在我们所检测的时间内，到第216h(第九天)时，抗体浓度依旧在6h浓度的80.4％，仍未到半衰期(图6)。
实施例7.PrPc抗体对小鼠盲肠肿瘤有良好的治疗作用
在用IgG与Ab-5，腹腔注射野生型C57小鼠6周后，称重，解剖小鼠，并观察肝脾主要脏器，发现看两组之间差别不明显，肝脾在颜色大小上并未有明显区别，小鼠平均体重基本一致，都在29g左右，区别不明显。说明本发明所述的抗体对正常鼠的毒性较低，具有很好的生物安全性。
在小鼠NOD/SCID鼠盲肠原位接种2x106个DeRed-P6C细胞，所述的具有荧光标记基团的DeRed-P6C细胞的制备方法为：P6C细胞接种于6孔板，待细胞长至80-90％满时，用lipofectemin2000试剂盒转染pDsRed2-N1野生型质粒，5h后换液(含10％FBS的HDMEM)，常规培养24h，消化细胞，制成单细胞悬液，利用流式细胞技术分选DeRed阳性细胞，激发光为556nm，发射光为586nm，然后将DsRed阳性细胞扩大培养，连续分选10次以上，当DsRed阳性细胞率稳定于95％以上时，即获得了DsRed-P6C稳定细胞株。接种后后的第三周，利用小动物活体成像技术，观察肿瘤是否接种成功，发现大部分肿瘤接种成功。随后分组进行抗体治疗实验(图7A第一排小鼠)，实验分为四组，分别为IgG对照组，Ab-3实验组，Ab-5实验组和Ab-25实验组。
在给药持续到5周后，也即肿瘤接种后8周，IgG对照组小鼠腹部开始有明显腹水产生，这是原位肿瘤体积增大并引起肝部转移的结果，相反抗体治疗组小鼠腹部没有变大，没有明显腹水产生(图5A第二排小鼠)，活体成像数据也表明在腹腔内的荧光信号，抗体治疗组比IgG对照组明显要少，数据有非常显著性差别，其中Ab-5治疗组平均荧光信号最小(图7B)。通过解剖观察及离体器官荧光成像数据采集，我们发现，抗体治疗组小鼠腹水很少或没有，原位肿瘤体积较小，肝脏肿瘤病灶很少，但IgG对照组腹部产生很多腹水，原位肿瘤体积较大，肝脏肿瘤灶点也很多(图7C)，经过体视镜观察肝脏肿瘤转移灶点数，与原位肿瘤质量相除，得到每组的肿瘤转移指数，分析得知，PrPc抗体治疗组的肿瘤转移指数比IgG对照组明显要低，数据区别非常显著性，且三种PrPc抗体分组中，Ab-5治疗组的肿瘤转移指数最低，说明Ab-5具有更好的肿瘤治疗效果(图7D)。
在裸鼠前肢背部左右两侧皮下各接种细胞2×106个肿瘤细胞(P6C与SW480，每种细胞又各分两组，IgG对照组及Ab-5治疗组，每组10只鼠)，约10天后肿瘤明显可见(～0.3mm直径)，开始腹腔注射抗体进行治疗(10mg/kg体重，一周注射两次)，从注射抗体当天开始(d0)，每两天测定一次肿瘤大小及体重，按照公式计算肿瘤体积，制作体积增长曲线。两周后解剖小鼠(留一部分用于观测生存曲线)，获取皮下肿瘤，拍照后，固定保存用于下游实验。通过连续的肿瘤体积测定，我们发现，P6C模型中，Ab-5治疗组肿瘤体积比IgG对照组在第8天以后有了明显的差别，到第12天时差别更显著，肿瘤体积约是对照 组的60％，但两组之间体重差别不大(图8A,B,C)；同样，在SW480模型中，Ab-5治疗组肿瘤体积比IgG对照组也在第8天以后有了明显的差别，到第12天时差别更为显著，肿瘤体积约是对照组的36.2％，最终体重IgG组比Ab-5组平均要小1.5g左右，但统计学没有显著差别(图8D,E,F)。
实施例8.Ab-5与cetuximab联合治疗能更好地抑制原位肿瘤的生长及肿瘤转移
联合治疗的动物实验共分7组：①IgG Cont10mg/kg，②PrPc Ab-510mg/kg，③Cetuximab10mg/kg，④combination:PrPc Ab-5+cetuximab10mg/kg each，⑤PrPc Ab-540mg/kg，⑥Cetuximab40mg/kg，⑦combination:PrPc Ab-5+cetuximab40mg/kg each。
在肿瘤接种3周后，我们开始进行注射抗体进行治疗，在治疗8周后，对照组已开始有明显腹水产生，用活体成像仪采集小鼠腹部肿瘤荧光信息及解剖后离体器官荧光数据。治疗8周后，6组经抗体单独或联合治疗的小鼠腹部肿瘤荧光(图9，A第一排)、离体盲肠原位肿瘤荧光及肝脏转移瘤荧光强度及点数(图9，A第二排)都比IgG对照组明显要低，数据差别特别显著(P<0.01)；此外，不同剂量联合治疗的两组小鼠，原位肿瘤的净光子数也有显著性差异(P<0.01)，这说明高剂量用药比低剂量效果更好(图9，B)。经肿瘤转移指数分析，治疗组②～⑦均要比IgG对照组低，数据差别特别显著(P<0.01)，同剂量给药的Ab-5组肿瘤转移指数比Cetuximab组低(P<0.01)，说明了Ab-5能很好地抑制肿瘤干细胞的转移。此外，不同剂量联合治疗的两组小鼠，肿瘤转移指数也有显著性差异(P<0.01)(图9，C)。
对荷瘤治疗组小鼠眼球取血700μL，并经PrPc及CD44抗体染色，进行流式分析。数据显示，所有治疗组DsRed阳性细胞比例均要比IgG对照组低，同剂量给药的Ab-5组DsRed阳性细胞比例比Cetuximab组低(P<0.01)，此外，不同剂量联合治疗的两组小鼠，DsRed阳性细胞数量都有明显降低(图9，D-DsRed+)。
进一步对DsRed+细胞群进行分析得知：
(1)PrPc+CD44-细胞比例在IgG对照组中为最高，其余各治疗组与对照组结果差别非常显著(P<0.01)，且趋势与DsRed+细胞比例相似，这说明DsRed+细胞绝大多数为PrPc+CD44-细胞，同剂量给药的Ab-5组PrPc+CD44-细胞比例比Cetuximab组低(P<0.01)，说明Ab-5在控制原位肿瘤向外周血系统转移能力上更强(图9，D-PrPc+CD44-)；
(2)DsRed+细胞群中PrPc-CD44+细胞比例在IgG对照组中非常少，统计结果显示，所有抗体治疗组PrPc-CD44+细胞比例都比对照组低，结果差别非常显著(P<0.01)，同剂量(10mg/kg)给药的Ab-5组PrPc-CD44+细胞比例比Cetuximab组低(P<0.01)，这跟之前两群细胞的趋势一致(图9，D-PrPc-CD44+)；
(3)PrPc+CD44+细胞比例亦非常少，所有抗体治疗组PrPc+CD44+细胞比例都比对照组低，结果差别亦非常显著(P<0.01)，且同剂量(10mg/kg)给药的Ab-5组PrPc+CD44+细胞比例比Cetuximab组低(P<0.01)，这说明在控制原位肿瘤PrPc+CD44+干性细胞转移上Ab5能力更强(图9，D-PrPc+CD44+)。
上述结果说明，本发明所述的Ab-5抗体在联合cetuximab时，能够更好的抑制肿瘤的生长和转移。
实施例9.转录因子Twist1在Ab-5处理的肿瘤细胞中表达量降低
为了进一步验证Ab-5抗体对于PrPc阳性细胞的迁移抑制作用的具体作用机理，我们检测了多个肿瘤细胞系中与迁移有关的转录因子Twist1的表达，发现在大多数细胞系中，该蛋白有较高水平表达，且与PrPc表达水平成正相关(图10，A，HT29及MCF7等PrPc阴性细胞，以及MD231等Twist1阴性细胞除外)。
为了验证两者之间的关系，我们构建了PrPc siRNA质粒，该质粒的构建方法为：
利用在线(http://i.cs.hku.hk/～sirna/software/sirna.php)程序设计合成了针对特异的PrP基因的RNAi引物及相应的Scramble引物：
PrP-RNAi:S:SEQ ID NO.49：
5'-GATCCGCCGAGTAAGCCAAAAACCTTCAAGAGAGGTTTTTGGCTTACTCGGCTTTTTTGGAAA-3'
AS:SEQ ID NO.50：
5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCTCTCTTGAAGGTTTTTGGCTTACTCGGCG-3'
PrPc-Scramble:S:SEQ ID NO.51：
5'-GATCCGCGCAGGATACGCAACACACCTCAAGAGAGTGTGTTGCGTATCCTGCGTTTTTTGGAAA-3'
AS:SEQ ID NO.52：
5'-AGCTTTTCCAAAAAACGCAGGATACGCAACACACTCTCTTGAGGTGTGTTGCGTATCCTGCGCG-3'
1.两对短发卡结构RNA编码互补单链寡核苷引物，分别进行梯度退火配对；
2.退火配对后的引物与pSilencer2.1-U6载体(已经被BamHI和HindIII内切酶消化回收)连接；
3.连接产物进行转化，测序正确后，扩大培养，提取质粒，备用。
利用RNAi作用降低了P6C细胞PrPc蛋白的表达，发现Twist1表达水平也随即降低，当PrPc表达水平被恢复后，Twist1又恢复表达，所以两者之间存在表达调控关系，Twist1表达水平随PrPc水平成正相关变化(图10，B)。同时，对P6C细胞在体外进行Ab-5不同浓度的处理，发现24小时后，Twist1蛋白表达水平降低，且跟Ab-5的使用剂量成正比，Twist1下游的信号蛋白P-ERK也随着Ab-5浓度的升高而表达水平下降，与此同时上皮细胞标志E-cadherin上升表达，间叶细胞标志N-cadherin下降表达，这说明随着Twist1表达水平的降低，细胞倾向于从间叶细胞状态转变为上皮细胞状态，从而自身迁移能力下降(图10，C)，这在一定程度上解释了Ab-5处理后，PrPc阳性的细胞迁移能力下降的原因。同样的结果，在另外一株PrPc阳性的肿瘤细胞SW480细胞中也得到了验证(图10，D)。
最后，需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员能够根据一般技术知识和公知常识获得的相关技术方案，都属于本发明要求保护的范围。
。

Claims (10)

1.一种特异性结合人细胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPc)的单克隆抗体Ab-5。
2.如权利要求1所述的Ab-5抗体，其特征在于，所述的抗体的的轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.针对权利要求1或2所述的Ab-5抗体进行人源化改进或全人化改进后所获得的抗PrPc抗体。
4.权利要求1-3所述的抗体的活性片段，所述的活性片段包括：单链抗体、抗体Fab区、抗原结合片段。
5.编码权利要求1-4所述抗体或其活性片段的基因片段。
6.根据权利要求5所述的基因片段，其特征在于，所述的基因片段中：编码抗体轻链的核苷酸序列为SEQID NO.3、编码抗体重链的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
7.权利要求1-4所述的抗体或抗体活性片段、权利要求5-6所述的编码基因在制备检测PrPc蛋白的检测或诊断试剂中的应用。
8.包含权利要求1-4所述的抗体或抗体活性片段、权利要求5-6所述的编码基因的检测PrPc蛋白的试剂盒。
9.权利要求1-4所述的抗体或抗体活性片段、权利要求5-6所述的编码基因在制备药物中的应用，所述的药物为抗肿瘤药物或抑制肿瘤转移的药物，所述的肿瘤优选为实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌。
10.权利要求1-4所述的抗体或抗体活性片段、权利要求5-6所述的编码基因作为现有抗肿瘤药物增效辅助制剂的应用，所述的抗肿瘤药物优选为cetuximab。
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