CN101260155A

CN101260155A - 抗牛成熟朊蛋白的单克隆抗体mab-mPrP-N59及其应用

Info

Publication number: CN101260155A
Application number: CNA2008100905501A
Authority: CN
Inventors: 刘永生; 张�杰; 陈豪泰; 孙德惠; 马丽娜
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2008-09-10

Abstract

本发明公开抗牛成熟朊蛋白的单克隆抗体mab－mPrP－N59及其应用。本发明的单抗是mab－mPrP－N59；其制备方法是以牛mPrP编码基因为目的产物选择模板与引物，用聚合酶链式反应扩增出牛mPrP编码基因，经酶切后将酶切产物与原核表达载体连接，再转入E.Coli JM109感受态细胞中培养，提取含有牛mPrP编码基因的重组表达质粒转入E.Coli JM109(DE3)中诱导表达，以经纯化复性的表达产物为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出杂交瘤细胞株，并克隆出阳性杂交瘤细胞株，在鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，取出腹水进行纯化得到抗牛成熟朊蛋白的单抗。

Description

抗牛成熟朊蛋白的单克隆抗体mab-mPrP-N59及其应用

技术领域

本发明涉及采用基因工程制备一种单克隆抗体(以下简称为单抗)及其制备方法和用途。

背景技术

“唯蛋白”理论认为疯牛病、痒病、人变异性克雅氏病等传染性海绵状脑病是由一种不含有核酸的蛋白质----朊病毒(Scrapie Prion Protein，PrPSc，痒病型朊蛋白)引起的。PrPSc是由牛、羊、人等宿主体内一种正常存在的朊蛋白(CellularPrion Protein，PrPC，细胞型朊蛋白)构像转变后生成的。PrPSc与PrPc在自然界是不可分割存在的，PrPc堪称是PrPSc形成的原料，存在的载体。PrPc广泛存在于哺乳动物体内，主要分布在脑组织、脊髓、淋巴组织中。大量的研究证实了疯牛病的主要传播途径是通过食用被PrPSc污染的肉骨粉饲料蛋白引起的。肉骨粉是以牛、羊等动物的下脚料为原料，加工成的一种动物蛋白饲料。由于肉骨粉价格低廉，蛋白含量高，所以，在上个世纪的80年代和90年代被一些西方国家广泛采纳，这导致了疯牛病的大暴发。最初，通过食用被痒病因子污染的肉骨粉，使得英国等一些欧洲国家的牛感染上了疯牛病，人通过食用用病牛加工的食品而感染上变异性克雅氏病。而今，肉骨粉在许多国家被禁止用于动物饲料。控制动物饲料，禁止PrPC风险成分进入动物和人的食物链是防止疯牛病侵入和传播，保证人身安全的关键措施。我国颁布了有关公告和禁令，但是能否很好地执行这些规定在很大程度上取决于检测进口饲料和食品中PrPC的存在。检测饲料和食品中PrPC存在的方法除了DNA杂交、PCR扩增等DNA方法外，还有蛋白质分析和组织鉴定两大类方法。在这两大类分析方法中，以酶联免疫吸附分析(Enzyme Linked Immunosorbant Assay，ELISA)、免疫印迹(Western Blotting)和生物传感器技术为主要内容的免疫学方法是其主体技术。检测饲料和食品中PrPC存在的各种免疫学方法的关键试剂就是针对PrPC的多抗和单抗，由于PrPC蛋白在哺乳动物中非常保守，氨基酸变化小，所以，以单抗作为诊断试剂比多抗更优越。

PrPC是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白，由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPI锚结合区三部分组成。PrPC经过翻译后修饰，最终是以被GPI锚定的成熟蛋白形式展现在细胞表面。所以，制备出针对成熟PrPC(mature prion protein，mPrP)的单抗，在此基础上开发出免疫印迹、双抗体夹心ELISA、免疫实时PCR等各种免疫诊断试剂盒，可以用于检测食品和饲料中是否存在PrPC。此外，这些单抗还可以作为研究PrPC蛋白结构与功能的有力工具。各种单抗的制备目前仍然以淋巴细胞杂交瘤技术为主，因为该技术成熟、稳定、制作成本较为低廉。而今，用于动物免疫的免疫原越来越趋向于以重组蛋白取代天然蛋白，这样易化了材料来源。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗牛mPrP的单抗，同时给出该单抗的轻链和重链可变区编码基因；本发明的目的之二是提供这种单抗的一种制备方法；本发明的目的之三是提供该单抗的用途。

本发明所涉及的抗牛成熟朊蛋白mPrP的单抗被命名为：“mab-mPrP-N59”，其轻链可变区基因见后附的序列表<400>2，其重链可变区基因见后附的序列表<400>3。

Mab-mPrP-N59的制备方法如下：是以牛mPrP编码基因为目的产物选择模板与引物，用聚合酶链式反应(PCR)扩增出牛mPrP编码基因，用EcoRI和XhoI双酶切扩增产物和原核表达载体，回收酶切产物，在连接酶的作用下将酶切后的mPrP编码基因和原核表达载体连接，将连接产物转入E.Coli JM109感受态细胞中进行培养，然后将培养菌液涂布于含相应抗生素的培养基上培养，挑取单菌落经鉴定后扩大培养，提取含有牛mPrP编码基因的重组表达质粒，将此重组表达质粒转入E.Coli JM109(DE3)中，经鉴定正确后，进行诱导表达，纯化、复性表达产物，以经纯化复性的表达产物为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出杂交瘤细胞株，并克隆出阳性杂交瘤细胞株，在鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，取出腹水进行纯化得到抗牛成熟朊蛋白的单抗。

本发明的mab-mPrP-N59的制备方法中还可以是下述方法：即采用含有牛PrP编码基因ORF的克隆质粒boPrP-T为模板(克隆质粒boPrP-T为公开于张杰，刘永生，陈豪泰，姜海霞，路伟，朱小玲，谢庆阁等在《中国兽医科学》.2006，36(30)：193-198发表的“三种哺乳动物朊蛋白基因Prnp的分析比较”一文中的bopmp-T)，采用的上游引物F-NEPrP为：

5-ccggaattcaagaagcgaccaaaacctg-3(下画线表示EcoRI酶切位点)

采用的下游引物R-bnPrP3为：

5-ccgctcgagacttgcccctcgttggta-3(下画线表示XhoI酶切位点)

用EcoRI和XhoI双酶切克隆的mPrP编码基因和pET-30a(+)表达载体，连接双酶切产物，将连接产物转化至E.Coli JM109感受态细胞中，然后将转化后菌液涂布于含卡那霉素的培养基上培养，挑取单菌落后扩大培养，得到含有牛mPrP编码基因的重组表达质粒pET-PrP(25-242aa)的E.Coli JM109菌株pET-mPrP-JM 109。从菌株pET-mPrP-JM 109中提出质粒pET-PrP(25-242aa)，再转化至表达用菌株E.Coli JM109(DE3)感受态细胞中，用转化后菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂粉平板培养，获得含有质粒pET-PrP(25-242aa)的E.ColiJM109(DE3)菌株----pET-mPrP-JDE3，再将此菌株接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中震荡培养，使重组牛mPrP被E.Coli JM109(DE3)在IPTG诱导下进行高效表达，用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达产物，以此纯化的重组牛mPrP蛋白为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，采用间接ELISA方法筛选融合的杂交瘤细胞株，再用有限稀释法克隆筛选的阳性杂交瘤细胞株，获得了能够稳定分泌抗重组牛mPrP的阳性杂交瘤细胞株----csPrP-N59，在鼠体内接种杂交瘤细胞csPrP-N59，生产腹水抗体，抽取腹水，离心收集上清液，进行纯化得到抗牛成熟朊蛋白mPrP的mab-mPrP-N59。

本发明的上述抗牛mPrP的mab-mPrP-N59的制备方法中得到的重组质粒pET-PrP(25-242aa)，其基因序列见后附基因表的<400>1。

本发明的mab-mPrP-N59可用于制备检测饲料和食品中PrPC的诊断试剂，也可用于检测研究成熟朊蛋白结构与功能的实验试剂。

本发明是以大肠杆菌表达的重组mPrP为免疫原，以清洁级Balb/C小鼠为免疫对象，采用淋巴细胞杂交瘤技术和间接ELISA筛选方法获得稳定分泌抗mPrP的阳性杂交瘤细胞株，纯化制备出腹水单抗boPrP-N59。(制备方法参见“秦川黄牛成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定”朱小玲，刘永生，张杰，吴润，陈豪泰，姜海霞，路伟，谢庆阁.《中国人畜共患病杂志》.2006，22(9)：851-854.)。进一步采用PCR扩增法，扩增出编码单抗boPrP-N59轻、重链可变区编码基因的序列，在此基础上可以进一步制备出相应的单链抗体。单链抗体由于一些独特的优势，在诊断、治疗以及基础科学研究方面越来越发挥重要作用。

本发明获得的mab-mPrP-N59的轻链和重链可变区编码基因为制备相应的单链抗体提供了材料。单链抗体在替代单抗作为诊断试剂方面具有较广阔的前景。

附图说明

图1为重组表达质粒pET-PrP(25-242aa)的双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图谱，图中1为DL-2000Marker，2为PCR扩增的mPrP片段，3为线性化的表达载体pET-30a(+)，4为EcoRI和XhoI双酶切重组表达质粒。

图2为牛mPrP重组表达产物的SDS-PAGE图谱，图中1为蛋白质分子质量标准，2为IPTG诱导的含有pET-30a(+)空载体的E.Coli BL21(DE3)对照菌液，3为IPTG诱导表达的未纯化的重组牛mPrP，4为纯化的重组牛mPrP。

图3为以SAF-70为检测抗体，Western Blot分析牛重组mPrP及其蛋白酶K消化产物，图中1为含有pET-30a(+)空载体的E.Coli BL21(DE3)菌体蛋白；2为牛的重组mPrP；3为蛋白酶K消化的牛重组mPrP。

图4为mab-mPrP-N59与重组牛、羊、人成熟PrP和成熟叠朊以及与pET-30a(+)空载体的E.Coli菌体蛋白反应的Western blotting图谱，1为空载体的E.Coli菌体蛋白，2，4，6分别为纯化的重组牛、羊、人成熟PrP，3，5，7分别为重组牛、羊、人成熟叠朊蛋白。

图5为mab-mPrP-N59与从正常牛脑组织中提取的PrP反应的Western blotting图谱，M为蛋白质分子质量标准，1为牛脑组织裂解液上清，2为蛋白酶K消化的牛脑组织裂解液上清。

具体实施方式

实施例<一>抗牛mPrP的单抗mab-mPrP-N59的制备及其特性鉴定

1.牛mPrP的E.Coli表达及表达产物纯化

1.1构建牛mPrP重组表达质粒pET-PrP(25-242aa)

1.1.1PCR扩增牛mPrP编码基因

PCR扩增的模板是本发明申请单位保存的含有牛PrP编码基因ORF的克隆质粒boPrP-T。牛mPrP的氨基酸残基序列是从第25位氨基酸残基至第242位氨基酸残基，根据其编码基因序列设计表达引物，并在上游引物引入EcoRI酶切位点，在下游引物引入XhoI酶切位点，前面添加相应的酶切保护碱基，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用公司合成的上、下游引物和boPrP-T质粒模板，进行PCR扩增。PCR扩增程序如下：95℃预变性5min后，进行如下循环：94℃ 1min s、55℃ 1min、72℃ 1min，30个循环之后，72℃延伸8min结束。

上游引物F-NEPrP：

5-ccggaattcaagaagcgaccaaaacctg-3(下画线表示EcoRI酶切位点)

下游引物R-bnPrP3：

5-ccgctcgagacttgcccctcgttggta-3(下画线表示XhoI酶切位点)

1.1.2重组表达质粒pET-PrP(25-242aa)的构建

将实施例<一>1.1.1的PCR产物用PCR清洁试剂盒纯化后进行EcoRI和XhoI双酶切，同时也用这两个酶双切商品化的pET-30a(+)表达载体，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收双酶切产物，之后在T₄DNA连接酶的作用下16℃连接。将连接产物转入Takara公司生产的E.Coli JM109感受态细胞中，37℃震荡培养50分钟，然后将菌液涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB琼脂粉平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落扩大培养，提取其质粒进行双酶切和测序分析。质粒双酶切鉴定结果如附图1所示，结果表明从单菌落提取的质粒经EcoRI和XhoI双酶切后释放出同预计片段654bp大小相符的DNA片段。进一步的质粒测序结果表明，实验获得的质粒为含有牛PrP27-30编码基因的重组质粒，测序结果如后附的序列表1。将该质粒命名为pET-PrP(25-242aa)，将含有该质粒的E.Coli JM109菌株命名为pET-mPrP-JM 109。

1.2牛mPrP的E.Coli高效表达

1.2.1表达菌株pET-mPrP-JDE3的筛选

将实施例<一>中1.1.2获得的质粒pET-PrP(25-242aa)转化至Takara公司生产的E.Coli JM109(DE3)感受态细胞，转化后菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂粉平板上，挑选生长好的单菌落，提取其质粒进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定，双酶切鉴定结果与附图1相一致，这表明pET-PrP(25-242aa)质粒被转入E.Coli JM109(DE3)中，将获得该质粒的菌株命名为pET-mPrP-JDE3。

1.2.2重组菌株pET-mPrP-JDE3的表达

将pET-mPrP-JDE3菌株和含有pET-30a(+)空载体的E.Coli BL21(DE3)菌株分别同时接种至含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃振荡过夜培养。取过夜培养物5mL接种到500mL的含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD_590nm值约0.6时，加入IPTG，使其终浓度为1.0mM，继续振摇，37℃诱导6h后，离心收获菌体，用10mL去离子水悬浮沉淀，冰浴超声。取少量(200μL左右)超声后的匀浆物离心，收集沉淀，将沉淀再用200μL去离子水悬浮，然后按等体积加入2倍蛋白质上样缓冲液，煮沸5分钟后12000转/分钟离心，取上清液进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果如附图2第3条泳道所示。电泳结果表明，重组牛mPrP被E.Coli JM109(DE3)在IPTG诱导下高效表达，表达产物以包涵体形式存在，其分子量大小为27KDa，与预计大小相一致。

1.3牛mPrP的E.Coli表达产物纯化和复性

因为构建的重组表达质粒在氨基端和羧基端都含有组氨酸标签，所以，可以采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达产物。Ni-NTA树脂购自Novagen公司，按照公司说明书关于E.Coli表达的以包涵体形式存在的表达产物纯化步骤纯化重组牛mPrP，并进一步按照Novagen公司的复性试剂盒对包涵体进行复性。取少许样品进行SDS-PAGE分析，并用分光光度法测定浓缩后的目的蛋白浓度。SDS-PAGE结果如附图2第4泳道所示。

1.4重组牛mPrP的反应原性和抗蛋白酶K消化能力分析

将重组牛mPrP及其蛋白酶K(PK使用的终浓度为50μg/ml)消化产物用SDS-PAGE分离后，转印至硝酸纤维素膜表面，以Cayman公司生产的针对痒病相关纤维(SAF)的单抗SAF-70为检测抗体，对重组mPrP及其PK消化产物进行Western Blotting，确定其反应原性和抗PK消化能力，结果如附图3所示。结果显示，重组牛mPrP(包括单体和二聚体)都能与SAF-70抗体发生反应，但是其PK消化产物不与抗体发生反应，这表明获得的重组牛mPrP具有很好的反应原性，而不具有朊病毒PrPSc的抗PK消化的抗性，可以作为免疫原制备针对PrP的抗体。

2.Mab-mPrP-N59的制备

2.1动物免疫、细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA筛选

实验组是以前述亲和层析纯化的复性重组牛mPrP蛋白为免疫原，免疫Balb/C小鼠，100μg/只。首次以弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，背部皮下3-4点注射，分别间隔15天以后进行第二、三次免疫，此时采用弗氏不完全佐剂(Sigma公司)乳化，第三次免疫结束15天后进行加强免疫，直接腹腔注射重组牛mPrP蛋白。同时设立对照组，即将免疫原由重组牛mPrP改换为pET-30a(+)空载体菌体蛋白，免疫程序同实验组。加强免疫三天后，收集实验组Balb/C鼠的脾细胞，在50％聚乙二醇1500(Rochi公司)的作用下与鼠骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1进行室温融合。以间接ELISA方法筛选出能够稳定分泌针对重组mPrP的单抗的阳性杂交瘤细胞株。间接ELISA筛选方法的建立以及阳性杂交瘤判断标准同“秦川黄牛成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定”文中的1.2.2所述。通过三次有限稀释法的亚克隆和间接ELISA筛选，获得了能够稳定分泌抗重组牛mPrP的阳性杂交瘤细胞株----csPrP-N59。

2.2Mab-mPrP-N59的大量生产及纯化

采用腹水制备法大量生产mab-mPrP-N59，采用葡萄球菌蛋白A亲和层析法纯化腹水抗体。

先腹腔注射0.5mL无菌矿物油于F1代小鼠，1～2周后向其腹腔注射1×10⁶个csPrP-N59杂交瘤细胞(用生理盐水稀释，体积为0.2mL左右)，接种杂交瘤细胞7～10天后，产生腹水，当小鼠频于死亡之前，拉颈处死小鼠，打开腹腔，用滴管将腹水吸入离心管中，离心收集上清夜，即获得腹水抗体。采用CALBIOCHEM公司生产的葡萄球菌蛋白A纯化收集的腹水抗体，按照公司提供的说明书操作。

3.Mab-mPrP-N59的生物学特性鉴定

Mab-mPrP-N59的生物学特性鉴定包括免疫球蛋白(Ig)类与亚类、效价、特异性、交叉反应性、抗原表位以及与牛脑组织PrPC的Western-Blot反应。

(1)Ig类与亚类的鉴定：采用Sigma公司鼠源单抗亚类鉴定试剂盒对纯化的腹水mab-mPrP-N59进行测定，测定方法采用抗体双夹心ELISA法，操作按Sigma公司的说明书进行。结果显示mab-mPrP-N59属于IgG2a。

(2)效价测定：采用间接ELISA法测定腹水mab-mPrP-N59的效价。以纯化的重组牛mPrP为包被抗原，将腹水抗体从1∶10倍开始稀释，然后加入辣根过氧化物酶标记的IgG，读取OD_492nm光吸收值，当OD_492nm值接近0.8时的稀释倍数为此单抗的效价。结果表明腹水mab-mPrP-N59的效价为1×10^-6。

(3)特异性分析：因为本专利申请的mab-mPrP-N59制备的免疫原是E.Coli表达的重组蛋白，所以，首先考虑是否与含有pET-30a(+)空载体的E.coli JM109(DE3)菌体蛋白发生反应。此外，由于成熟朊蛋白mPrP^C与Dopple(叠朊)的结构接近，而且两者关系密切，所以还检测了获得的mab-mPrP-N59与重组牛、羊、人成熟叠朊(重组成熟叠朊蛋白由本专利申请单位的实验室制备保存)的反应性。检测方法采用Western Blotting。Western Blotting的操作过程如《分子克隆实验指南》所述，首先将含有pET-30a(+)空载体的E.Coli菌体蛋白、重组mPrP、重组成熟叠朊进行12％SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，以纯化的mab-mPrP-N59为检测抗体进行Western Blotting分析，结果如附图4所示。分析结果表明mab-mPrP-N59仅与重组mPrP的单体和二聚体发生反应，而不与重组成熟叠朊和空载体菌体蛋白反应，这显示本发明获得的mab-mPrP-N59能够特异地识别和结合mPrP。

(4)交叉反应性：通过Western Blotting确定mab-mPrP-N59与重组羊、人的mPrP(由本专利申请单位的实验室制备保存)的反应性，以确定获得单抗的交叉反应性。实验结果如附图4所示，结果表明mab-mPrP-N59能够识别和结合重组羊、人的mPrP(包括单体和二聚体)，与其发生了交叉反应，这为扩大mab-mPrP-N59的应用范围奠定了基础。

(5)抗原表位分析：采用基因片段表达作图法分析mab-mPrP-N59针对的抗原表位所在的区段。将牛mPrP的氨基酸残基序列分成3个区段进行表达，即PrP25-145，PrP146-242，PrP102-241(3个不同的PrP片段表达物由本专利申请单位制备保存)，然后以3个不同的表达产物作为抗原，包被ELISA板，以mab-mPrP-N59作为抗体进行间接ELISA反应。结果表明，mab-mPrP-N59不与分段表达的PrP反应，这意味着mab-mPrP-N59识别的可能是成熟PrP的空间构象表位。

(6)Mab-mPrP-N59与牛脑组织PrP的Western Blotting反应

以制备的健康黄牛脑组织为检测对象，以mab-mPrP-N59为检测抗体进行Western Blotting，目的是检测制备的单抗在脑组织Western Blotting中的应用。脑组织的取材部位在脑闩区，以预冷的裂解液(10mM Tris-HCl pH7.4，100mMNaCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，10mM EDTA)将脑组织制成10％(wt/vol)的匀浆，经过二次冻溶和超声波冰浴破碎后12000转/分钟离心10min，去除细胞碎片。取部分上清液，按50μg/mL加入蛋白酶K(PK)，37℃消化1h后，立刻加入5mM苯甲基磺酰(PMSF)终止反应。经12％SDS-PAGE后进行Western Blotting，结果如附图5所示。图谱显示，mab-mPrP-N59与牛脑组织中的PrP发生了反应，而不与脑组织PrP的PK消化产物反应。

实施例<二>Mab-PrP102-6轻、重链可变区编码基因克隆测序与分析

本发明通过对GenbanK登录的鼠源单抗轻、重链可变区编码基因序列的分析和比较，设计了两对克隆引物，通过PCR扩增获得了mab-mPrP-N59轻链和重链可变区编码基因。具体操作过程如下：

1.RNA提取

细胞RNA的提取采用Qiagen公司的RNA提取试剂盒进行提取。首先培养分泌mab-mPrP-N59的杂交瘤细胞csPrP-N59，采用1640培养基(日水公司)，20％胎牛血清(杭州四季青公司产品)，在5％CO2，37℃条件下培养。离心收集细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞沉淀2次，之后按照RNA提取试剂盒操作说明书进行。

2.合成cDNA第一链

采用Qiagen公司的cDNA第一链合成试剂盒进行。在上述提取的RNA基础上，以oliga dT(15)为引物，在反转录酶的作用下合成了cDNA第一链，具体操作按照说明书进行。

3.PCR扩增轻链和重链可变区编码基因

以合成的cDNA第一链为模板，扩增轻链可变区编码基因时以自行设计的VKLfor3和VKLback1为上、下游引物，扩增重链可变区编码基因时以VH1For和VH1Back为上、下游引物(直接采用文章中VH1For和VH1Back的引物序列“Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chainreaction”Proc Natl Acad Sci，1989，86：3833-3837.)，在Taq DNA聚合酶(Takara公司)的作用进行PCR扩增。扩增程序为95℃变性5min；之后进行如下循环94℃1min，55℃1min，72℃40Sec，30个循环；最后72℃延伸8分钟。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得了预计大小的DNA片段。

VKLfor3：5-GACATTGTGATGACCCAGTC-3

VKLback1：5-GATGGATACAGTTGGTGCAG-3

VH1FOR：5-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3

VH1BACK：5-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3

S＝C or G，M＝A or C，R＝A or G，and W＝A or T

4.测序PCR扩增的轻链和重链可变区编码基因

分别采用凝胶回收试剂盒(V-gene公司)纯化PCR扩增的mab-mPrP-N59轻链和重链的DNA片段，然后与pMD-18T载体(Takara公司)连接，Cacl₂法将连接产物转入E.Coli JM109感受态细胞(Takara公司)中，转化结束后37℃震摇50分钟，然后取适量菌液均匀地涂布在含有200μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂粉平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定并扩大培养，提取相应质粒，送至公司进行测序，测序结果的轻链可变区基因见后附的序列表<400>2，重链可变区基因见后附的序列表<400>3。对测定序列运用Blast软件进行分析比对，结果表明，采用PCR扩增法获得了mab-mPrP-N59轻、重链可变区编码基因，其中mab-mPrP-N59的轻链可变区编码基因与Genbank登录的单抗轻链可变区序列最高同源性为99％，mab-mPrP-N59的重链可变区编码基因与Genbank登录的单抗重链可变区序列最高同源性为96％。

实施例<三>Mab-mPrP-N59及其轻、重链可变区编码基因的用途

本发明制备的抗mPrP的mab-mPrP-N59可以作为检测牛、羊和人等哺乳动物的全长PrP和成熟PrP被大肠杆菌、酵母菌或者其它真核细胞表达的检测试剂；可以作为研究哺乳动物全长PrP和成熟PrP与其自身或者与PrP^Sc或者与37Kda/67Kda层粘连蛋白受体、脂筏蛋白等相关因子相互作用关系的试剂；可以作为检测牛、羊、人等一些哺乳动物健康脑组织中成熟PrP^C存在的检测试剂；有可能作为检测动物蛋白饲料中存在PrP^c的检测试剂。总之，mab-mPrP-N59可以作为成熟PrP的研究试剂和诊断试剂，可以应用于Western Blotting、ELISA和免疫组化等免疫学研究和诊断方法中。

在本发明获得的mab-mPrP-N59轻、重链可变区编码基因基础上，通过添加合适的酶切位点和短的连接肽，可以将两者连接起来，插入表达载体，导入大肠杆菌、酵母菌或者其它真核细胞中，进行诱导表达，从而获得相应的单链抗体。这些单链抗体可以代替mab-mPrP-N59作为哺乳动物成熟PrP的研究和诊断试剂。

附：基因序列表

重组质粒pET-PrP(25-242aa)编码序列<400>1

gaattcaaga agcgaccaaa acctggagga ggatggaaca ctggggggag 50

ccgataccca ggacagggca gtcctggagg caaccgttat ccacctcagg 100

gagggggtgg ctggggtcag ccccatggag gtggctgggg ccagcctcat 150

ggaggtggct ggggccaacc tcatggaggt ggctggggtc agccccatgg 200

tggtggctgg ggacagccac atggtggtgg aggctggggt caaggtggta 250

cccacggtca atggaacaaa cccagtaagc caaaaaccaa catgaagcat 300

gtggcaggag ctgctgcagc tggagcagtg gtagggggcc ttggtggcta 350

catgctggga agtgccatga gcaggcctct tatacatttt ggcagtgact 400

atgaggaccg ttactatcgt gaaaacatgc accgttaccc caaccaagtg 450

tactacaggc cagtggatca gtatagtaac cagaacaatt ttgtgcttga 500

ctgtgtcaac atcacagtca aggaacacac agtcaccacc accaccaagg 550

gggagaactt caccgaaact gacaccaaga tgatggagcg agtggtggag 600

caaatgtgca ttacccagta ccagagagaa tcccaggctt attaccaacg 650

aggggcaagt ctcgag 666

mab-mPrP-N59的轻链可变区编码基因序列<400>2

gacattgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca 50

gagggccacc atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct 100

atagttatat gcactggaac caacagaaac caggacagcc acccagactc 150

ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct ggggtccctg ccaggttcag 200

tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg 250

aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gggctgatgc tgcaccaact 350

gtatccatc 359

mab-mPrP-N59的重链可变区编码基因序列<400>3

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccagtagtcg gtcccctctc 50

ttgcacagta atagaccgca gagtcctcag atgtcagact gctgaggtgc 100

atgtaggctg tgttggagga ttcgtctaca gtcaatgtgg ccttgccctt 150

gaacttttga ttgtagtttg cataattatc agaagtatca atcgctccga 200

tccactcaag gccttgtcca ggcctctgct tcacccagtg catccagtag 250

tcagtgaatg tgtagccaga agccttgcag gacatcttca ctgaagcccc 300

aggcatcaca acctcagccc cggactcctg cagctccacc t 341

Claims

1、抗牛成熟朊蛋白mPrP的单克隆抗体mab-mPrP-N59，其特征在于其轻链可变区基因为序列表<400>2，其重链可变区基因为序列表<400>3。

2、权利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的单克隆抗体mab-mPrP-N59的制备方法，其特征是以牛mPrP编码基因为目的产物选择模板与引物，用聚合酶链式反应扩增出牛mPrP编码基因，用EcoRI和XhoI双酶切扩增产物和原核表达载体，回收酶切产物，在连接酶的作用下将酶切后的mPrP编码基因和原核表达载体连接，将连接产物转入E.Coli JM109感受态细胞中进行培养，然后将培养菌液涂布于含相应抗生素的培养基上培养，挑取单菌落经鉴定后扩大培养，提取获得含有牛mPrP编码基因的重组表达质粒，将此重组表达质粒转入E.ColiJM109(DE3)中，经鉴定正确后，进行诱导表达，纯化、复性表达产物，以经纯化复性的表达产物为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出杂交瘤细胞株，并克隆出阳性杂交瘤细胞株，在鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，取出腹水进行纯化得到抗牛成熟朊蛋白的单抗。

3、权利要求2所述的制备方法，其特征是采用含有牛PrP编码基因ORF的克隆质粒boPrP-T为模板，采用的上游引物F-NEPrP为：

5-ccggaattcaagaagcgaccaaaacctg-3

采用的下游引物R-bnPrP3为：

5-ccgctcgagacttgcccctcgttggta-3

用EcoRI和XhoI双酶切克隆的mPrP编码基因和pET-30a(+)表达载体，连接双酶切产物，将连接产物转化至E.Coli JM109感受态细胞中，然后将转化后菌液涂布于含卡那霉素的培养基上培养，挑取单菌落后扩大培养，得到含有牛mPrP编码基因的重组表达质粒pET-PrP(25-242aa)的E.Coli JM 109菌株pET-mPrP-JM109，从菌株pET-mPrP-JM109中提出质粒pET-PrP(25-242aa)，再转化至表达用菌株E.Coli JM109(DE3)感受态细胞中，用转化后菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂粉平板培养，获得含有质粒pET-PrP(25-242aa)的E.Coli JM109(DE3)菌株----pET-mPrP-JDE3，再将此菌株接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中震荡培养，使重组牛mPrP被E.Coli JM109(DE3)在IPTG诱导下进行高效表达，纯化表达产物，以此纯化的重组牛mPrP蛋白为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，采用间接ELISA方法筛选融合的杂交瘤细胞株，再用有限稀释法克隆筛选的阳性杂交瘤细胞株，获得了能够稳定分泌抗重组牛mPrP的阳性杂交瘤细胞株----csPrP-N59，在鼠体内接种杂交瘤细胞csPrP-N59，生产腹水抗体，抽取腹水，离心收集上清液，进行纯化得到抗牛成熟朊蛋白mPrP的mab-mPrP-N59。

4、权利要求3所述的方法制备的重组质粒pET-PrP(25-242aa)，其基因序列为序列表<400>1。

5、权利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的单克隆抗体mab-mPrP-N59用于制备检测动物蛋白饲料中存在的PrPC或者动物脑组织中存在的PrPC的诊断试剂。

6、权利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的单克隆抗体mab-mPrP-N59的轻链和重链的编码基因用来制备抗牛朊蛋白PrP27-30的单链抗体。

7、权利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的单克隆抗体mab-mPrP-N59制备的单链抗体用于制备检测动物蛋白饲料中存在的PrPC或者动物脑组织中存在的PrPC的诊断试剂。