CN112159470B - 一种抗wnv感染的结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗WNV感染的结合分子，该结合分子是针对WNV E蛋白的单克隆抗体。体外实验证明该单克隆抗体能够与WNV E蛋白特异性结合，有较强的亲和活性，能够中和WNV病毒。本发明的研究成果一方面为临床诊断提供了新的方法，另一方面为临床抗WNV感染提供了候选药物。

Description

一种抗WNV感染的结合分子
技术领域
本发明属于分子免疫学领域，涉及一种抗WNV感染的结合分子。
背景技术
西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)感染可引起西尼罗热、西尼罗病毒性脑炎和脑膜炎，是一种人畜共患、自然疫源性、急性传染病。自1999年WNV在美国纽约爆发以来，该病毒已经迅速传播到世界多个国家和地区，成为严重威胁人类健康的病毒性疾病，引起了全球公共卫生界的关注。WNV可以感染多种蚊虫和鸟类，并通过蚊虫和鸟类的交替感染将病毒沿着鸟类迁徙的路径进行传播；蚊虫还可以通过叮咬被WNV感染的鸟类将WNV传染给多种哺乳动物，如人类、马、狗、猫和家禽如鸡、鹅等；该病毒还可以通过输血、器官移植、哺乳及胎盘垂直传播。截至目前全球已有两万多人感染WNV，发病率在20％以上，与以前的WNV感染相比，重症病例明显增加，死亡率上升为5-15％。
目前对WNV感染的治疗还没有特效药物，早期发现是控制WNV传播的主要措施。WNV已经在世界多个国家和地区发生多次的反复流行，虽然我国目前还没有WNV感染的报道，根据美国CDC发布的WNV在全球的地理分布图显示，我国西部的部分地区已经受到WNV入侵的威胁；而且，与我国毗邻的俄罗斯在1999年就爆发过WNV。由于WNV可以通过迁徙的鸟类进行远距离传播，同时也可能通过牲畜的进口贸易进入我国，且我国存在WNV流行的自然和社会因素，因此我国需尽快发展有效的WNV检测试剂和检测方法，及时建立WNV监测体系，防止WNV的传入和流行。
目前，可用于治疗或预防WNV感染的药物并不多，需要的加强抗感染药物的科研力度，做好相关知识和药物的储备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对WNV E蛋白的结合分子，该结合分子对WNV E蛋白具有显著的亲和作用，对WNV具有较强的中和作用，可用于WNV的诊断和治疗。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种分离的抗WNV感染的结合分子，所述结合分子包括：
(1)SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；和/或
(2)SEQ ID NO:5所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:6所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:7所示的轻链CDR3。
作为本发明的一个方面，本发明的结合分子包括：
(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；和/或
(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，还可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与WNV E蛋白结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。
作为本发明的另一方面，本发明的结合分子还包括前面所述的结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合WNV E蛋白或其片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合WNV E蛋白或其蛋白片段。
功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酰化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。
所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。
保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。
此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合WNV E蛋白或其片段。
所述功能变体还包含对高变区的修饰，高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。
本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。
本发明的功能变体对于WNV E蛋白具有亲和活性。所述亲和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语“结合分子”时，其也涵盖所述结合分子的功能变体。
本发明还提供了前面所述的结合分子的核酸分子。
优选地，所述核酸分子序列如SEQ IDNO:9-16所示；其中，重链CDR1对应的多核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示，重链CDR2对应的多核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示，重链CDR3对应的多核苷酸序列如SEQ IDNO:11所示，重链可变区对应的多核苷酸序列如SEQ IDNO:12所示，轻链CDR1对应的多核苷酸序列如SEQ IDNO:13所示，轻链CDR2对应的多核苷酸序列如SEQ IDNO:14所示，轻链CDR3对应的多核苷酸序列如SEQ IDNO:15所示，轻链可变区对应的多核苷酸序列如SEQ IDNO:16所示。
本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。
一旦获得了有关的序列信息，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。
本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的表达载体，除了前面所述的核酸分子之外，表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
这些表达载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的表达载体的宿主细胞。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS,293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是293细胞。
用重组DNA转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，以表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。
本发明还提供了一种包括前面所述的结合分子的药物组合物。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质的分子。
本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。
包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经患有WNV感染诱导的疾病或者作为临床实验程序的一部分监测WNV感染诱导的疾病的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。
为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。
本发明还提供了一种包含前面所述的结合分子或前面所述的免疫缀合物的检测产品。所述检测产品可以检测WNV E蛋白的表达。
进一步，所述检测产品或所述诊断产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出WNV水平的检测产品或诊断产品均包括在本发明的范围之内。
一种非诊断目的的检测WNV或其E蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取含有WNV或其E蛋白的样品；
(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的结合分子接触；
(3)检测样品与前面所述的结合分子的免疫反应。
本发明还提供给了一种利用前面所述的宿主细胞产生本发明的结合分子的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的宿主细胞并回收所述结合分子。
本发明还提供了一种通过上述方法产生的结合分子。所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了前面所述的结合分子在制备检测产品中的应用；所述检测产品是检测WNV或其E蛋白的产品。
所述检测产品或诊断产品包括前面所述的结合分子；所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的结合分子能够检测出WNV或其E蛋白水平的检测产品或诊断产品均包括在本发明的范围之内。
本发明还提供了前面所述的结合分子的用途，所述用途包括以下任一项所述的用途：
(1)制备用于检测WNV或其E蛋白的产品中的用途；
(2)制备抗WNV感染的药物中的用途；
(3)制备预防或治疗WNV感染导致的疾病的药物中的用途。
本发明的公开的抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。
本发明的抗体可以被设计为在Fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。
本发明的抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(PEG)集团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与PEG反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。
本发明的结合分子可以单独应用或者于包含本发明的结合分子的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。
本发明的结合分子还可以与其他具有相同或者互补功能的药物联合应用，联合应用的效果可以是结合分子与其他药物功能之和，还可以远远大于结合分子与其他药物功能之和，这种情况表明该结合分子与其他药物之间产生了协同作用。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“载体”是指表达载体和非表达载体，并包括病毒和非病毒载体，其包括染色体外载体(如，多拷贝质粒)和整合载体(其设计为可并入宿主染色体)。
本文所述的“样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。
如本文所用，术语“分离的”是指从其天然环境中分离出的蛋白质(即，从至少一种其天然伴随的其它组分中分离)。
本发明的优点和有益效果：
本发明制备了一种新的高效价、高特异性及高亲和力、高中和活性的抗WNV的单克隆抗体。由于该抗体效价高、特异性好、亲和力强，中和活性强，可直接作为抗WNV感染的药物。
附图说明
图1显示本发明的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图，其中A：非还原，B：还原；
图2显示利用ELISA检测本发明的单克隆抗体的抗原结合特异性的结果图；
图3显示利用假病毒中和实验检测本发明的单克隆抗体中和活性的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1 WN-XH2单克隆抗体制备
1、实验材料
PRT/KIgG1载体(参见专利文献：一种特异性结合PD-1的单克隆抗体，申请号：201810273628.7)
2、步骤
(1)利用基因合成的方法合成抗体重链可变区序列(序列如SEQ ID NO：4所示)、轻链可变区序列(序列如SEQ ID NO:8所示)，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入PRT/KIgGl中。
(2)将步骤1构建的抗体表达重组载体转染对数生长期的293T细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃8％CO2培养箱中培养96小时。收集转染上清，4000rpm离心1小时，利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。利用SDS-PAGE和Western Blot实验检验抗体的表达及纯化情况。
3、结果
结果见图1A-B，证实得到较纯蛋白，并可清察到解链后的抗体轻、重链。
实施例2 WN-XH2单克隆抗体结合活性和中和活性测定
1、单克隆抗体结合活性测定
包被液稀释WNV的EDIII抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1xPBS稀释抗体到不同浓度，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(Fab')2-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H2SO4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。
结果如图2所示，本发明制备的单克隆抗体够特异性识别固相载体上的WNV的EDIII抗原分子，且随着抗体浓度的增加抗原一抗体之间结合具有良好的剂量依赖性。图中的Neg为无关抗体(抗甲型流感病毒H2N2单克隆抗体)作为对照。
2、单克隆抗体中和活性测定
用假病毒在感染BHK21细胞的过程中分别加入WN-XH2抗体进行中和实验，用无关抗体Neg作为对照。具体步骤如下：
1、假病毒包装：
接种293T细胞于6孔板。80％融片后，按照Lipo3000转染试剂说明书，将prWNV-Rluc以及pcDNA3.1-CME以1：1的比例共转染进293T细胞。72hr后收取培养上清。3000rmp,4℃离心10min后，上清经0.45μm的滤膜过滤，添加20％的血清，置-80℃保存。
2、假病毒感染
接种BHK21细胞于96孔细胞培养板，细胞密度为1X105/ml，放置细胞培养箱过夜。将含有WN病毒样颗粒的上清预先与相应浓度的抗体孵育，室温1hr。之后将病毒样颗粒上清+抗体混合液感染BHK21细胞，同时设置未加抗体的病毒上清和加入无关抗体的病毒上清做为对照。48h后，裂解细胞测荧光素酶活性(RLU)。
结果如图3所示，本发明的单克隆抗体具有中和病毒的中和活性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种抗WNV感染的结合分子
<141> 2020-10-09
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Tyr Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val His Ile Ser Cys Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Tyr Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Leu
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly His Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gattattgga ttgaa 15
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatattctct atggcaacgg ccgcacccgc tataacgaaa aactgaaagg c 51
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcgcgagct atggcgatta tgcggattat 30
<210> 12
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggtgcagc tgcagcagag cggcagcgaa ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgcatatt 60
agctgcaaag cgaatggcta tacctacagc gattattgga ttgaatgggt gaaacagcgc 120
ccgggccacg gcctggaatg gattggcgat attctctatg gcaacggccg cacccgctat 180
aacgaaaaac tgaaaggcaa ggcgaccttt accgcggata ccagcagcaa caccgcgttt 240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt attattgcgc gcgcagcgcg 300
agctatggcg attatgcgga ttattggggc catggcacca ccctgaccgt gagcagc 357
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaagcgagcc aggatattag caccgcggtg gcg 33
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgggcgagca cccgccatac c 21
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagcagcatt atagcacccc gctgacc 27
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gatattgtga tgacccagag ccataaattt atgagcacca gcgtgggcga tcgcgtgagc 60
attacctgca aagcgagcca ggatattagc accgcggtgg cgtggtatca gcagaaaccg 120
ggccagagcc cgaaactgct gattagctgg gcgagcaccc gccataccgg cgtgccggat 180
cgctttaccg gcagcggcag cggcaccgat tataccctga ccattagcag cgtgcaggcg 240
gaagatctgg cgctgtatta ttgccagcag cattatagca ccccgctgac ctttggcgcg 300
ggcaccaaac tggaactgaa a 321

Claims (11)

1.一种分离的抗WNV感染的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括：
(1)SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；和，
(2)SEQ ID NO:5所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:6所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:7所示的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括：
(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；和，
(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子如SEQ ID NO:9-16所示；其中，重链CDR1对应的核酸分子如SEQ ID NO:9所示，重链CDR2对应的核酸分子如SEQ IDNO:10所示，重链CDR3对应的核酸分子如SEQ ID NO:11所示，重链可变区对应的核酸分子如SEQ ID NO:12所示，轻链CDR1对应的核酸分子如SEQ ID NO:13所示，轻链CDR2对应的核酸分子如SEQ ID NO:14所示，轻链CDR3对应的核酸分子如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区对应的核酸分子如SEQ ID NO:16所示。
5.一种包括权利要求3或4所述的核酸分子的表达载体。
6.一种包括权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。
7.一种生产权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求6所述的宿主细胞。
8.一种包括权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物或免疫缀合物。
9.一种包括权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求8所述的免疫缀合物的检测产品。
10.一种非诊断目的的检测WNV或其E蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取含有WNV或其E蛋白的样品；
(2)将步骤(1)获取的样品与权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段接触；
(3)检测样品与权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的免疫反应。
11.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的用途，其特征在于，所述用途包括以下任一项所述的用途：
(1)制备用于检测WNV或其E蛋白的产品中的用途；
(2)制备抗WNV感染的药物中的用途；
(3)制备预防或治疗WNV感染导致的疾病的药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116751289B (zh) * 2023-08-03 2023-10-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种降低ade效应的抗西尼罗病毒中和性抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101235085A (zh) * 2008-01-24 2008-08-06 中国科学院微生物研究所 抗西尼罗病毒膜蛋白e的单克隆抗体及其应用
CN104498438A (zh) * 2013-11-25 2015-04-08 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒
CN105693852A (zh) * 2014-11-28 2016-06-22 方端 一种西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体的制备方法及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7572456B2 (en) * 2004-09-13 2009-08-11 Macrogenics, Inc. Humanized antibodies against West Nile Virus and therapeutic and prophylactic uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101235085A (zh) * 2008-01-24 2008-08-06 中国科学院微生物研究所 抗西尼罗病毒膜蛋白e的单克隆抗体及其应用
CN104498438A (zh) * 2013-11-25 2015-04-08 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒
CN105693852A (zh) * 2014-11-28 2016-06-22 方端 一种西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体的制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody;Grant E Nybakken，等;《Nature》;20050929;第437卷(第7059期);全文 *
抗西尼罗病毒抗体类药物的体外筛选;卢星，等;《国际药学研究杂志》;20200730;第47卷(第7期);全文 *
西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ特异性单克隆抗体的研制;陈义平，等;《全国人畜共患病学术研讨会论文集》;20060518;全文 *

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