CN101591396B

CN101591396B - 一种抗erbB2人源抗体MIL-5及其应用

Info

Publication number: CN101591396B
Application number: CN 200910131354
Authority: CN
Inventors: 吕明; 乔春霞; 冯健男; 黎燕; 沈倍奋; 白敏姿
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS; Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Current assignee: Zhuhai Lizhu Sheet Resistance To Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2009-04-15
Filing date: 2009-04-15
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2029-04-15
Also published as: CN101591396A

Abstract

本发明公开了一种抗erbB2人源抗体，它的重链可变区具有SEQ_ID NO：1、SEQ_ID NO：3或SEQ_ID NO：5所示的氨基酸序列；它的轻链可变区具有SEQ_ID NO：2、SEQ_ID NO：4或SEQ_ID NO：6所示的氨基酸序列。该抗体在哺乳动物细胞中具有较高的表达量，并且具有明显的杀伤erbB2阳性肿瘤细胞等生物学活性。本发明还提供该抗体的设计及制备方法。

Description

一种抗erbB2人源抗体MIL-5及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗erbB2人源抗体以及其制备方法和用途。

背景技术

erbB2基因定位于人17号染色体的17q21位置，该基因转录的mRNA全长为4.8kbp，其开放阅读框架全长为3765bp，编码1255个氨基酸。其中，第1～21位氨基酸为信号肽序列，胞外区有632个氨基酸，跨膜区由高度疏水的22个氨基酸组成，C-末端的580个氨基酸位于胞质内。erbB2胞外区四个结构域分类模式为：D1(第22～195位氨基酸)、D2(第196～320位氨基酸)、D3(第321～488位氨基酸)、D4(第489～632位氨基酸)。其中，D1和D3主要由疏水性的氨基酸组成，特别是亮氨酸，三个平行的β片层构成β螺旋结构。D2和D4由二硫键模块构成，1～2个二硫键组成小的结构单位，为富含半胱氨酸区，分别含26和21个半胱氨酸。迄今为止，尚未发现与erbB2高亲和力、高特异性结合的配体。

ErbB2同源或异源二聚体的形成伴随着细胞内的C末端酪氨酸残基的磷酸化，引起细胞内含SH2、SH3和PTB结构域的蛋白活化，募集、激活下游相关蛋白，通过信号级联反应，导致细胞增殖及分化。临床研究发现，ErbB2高表达的肿瘤患者往往对放化疗不敏感，且易发生肿瘤的转移，患者预后不佳。ErbB2在多种肿瘤组织中过表达，包括乳腺癌(25～30％)、卵巢癌(18～43％)、非小细胞肺癌(13～55％)、前列腺癌(5-46％)、胃癌(21-64％)、头颈部肿瘤(16-50％)等上皮细胞来源的恶性肿瘤^[21]，而在成人正常组织中表达水平很低或不表达，因而成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子，也是目前肿瘤治疗研究的热点。

2003年，临床用抗erbB2抗体Herceptin与erbB2相互作用复合物晶体结构得到解析，结果提示，Herceptin识别erbB2的功能表位位于D4结构域N端557～561、570～573、593～603位氨基酸残基。同时，临床试验表明，人源化抗erbB2单抗Herceptin仅用于ErbB2过表达乳腺癌的临床治疗，而且，单独应用的疗效有限，其有效率仅为11.6～16％。

随着erbB2晶体结构的精确解析，其结构特征受到人们的广泛关注。尽管同属于EGFR(Epidermal growth factor receptor)超家族，与EGFR、erbB3结构相比，非激活状态时erbB2分子的D1和D3间接近的程度超过了激活状态(即EGFR、erbB3与其配体结合状态)下EGFR、erbB3的D1和D3的接近程度。由于该结构特征，与EGFR、erbB3不同，erbB2较难与配体结合，使其成为“孤受体”。在上述结构特征的维持下，非激活状态的erbB2以一种“开放”(open)的结构模拟激活状态受体(EGFR、erbB3)的构象，D2区更为凸出、暴露，使其成为EGFR家族其他成员首选的异源二聚体伴侣分子。大量的实验表明，D2区的C末端在形成异源二聚体的过程中发挥重要的作用。功能性抗体2C4能特异性识别erbB2的D2结构域，阻断erbB2功能的抗体。目前，该抗体已进入临床前研究。

虽然抗erbB2抗体Herceptin已经应用于临床治疗乳腺癌，功能性抗体2C4也已经进入临床前研究，但是这些抗体的生物学活性有待进一步提高。

本发明即基于上面的研究背景，通过人源抗体库筛选高亲和力的新型抗erbB2人源抗体，并通过实验验证其生物学活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有临床应用价值的抗erbB2人源抗体。

本发明提供了一种抗erbB2人源抗体，其结构包括人源恒定区和可变区；其重链可变区选自：SEQ_ID NO：1、SEQ_ID NO：3或SEQ_ID NO：5；其轻链可变区选自：SEQ_ID NO：2、SEQ_ID NO：4或SEQ_ID NO：6。

本发明提供了这种抗体的制备方法，主要包括以下步骤：

a、构建天然的人源噬菌体抗体库；

b、构建表达人erbB2胞外段全长基因的重组细胞株；

c、从人源噬菌体抗体库中筛选抗erbB2的噬菌体抗体；

d、利用基因工程手段，获得人源抗体；

e、对获得的抗体的结合活性、特异性、亲和力以及生物学功能等进行鉴定。

上述步骤a中，取正常人外周血，分离淋巴细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，扩增得到人免疫球蛋白G重轻链可变区基因，够建人免疫球蛋白G Fab抗体库。

上述步骤b中，根据人erbB2基因(SwissProt注册号：P04626)序列，收集erbB2阳性细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，扩增得到编码erbB2信号肽、胞外段以及跨膜区的基因；经过DNA克隆技术将其克隆入载体pEGFP-N1(Clonetech公司产品)中，转染293T细胞后，筛选阳性重组细胞。

上述步骤c中，将抗体库用不表达靶抗原的“空白”细胞293T细胞吸附，除去非目的抗体(阴性选择)；再用经阴性选择的抗体库与步骤b获得的表达靶抗原的阳性重组细胞结合，得到与靶细胞结合的抗体(阳性筛选)；经过3-8轮的“阴性选择-阳性选择-扩增”，获得具有较好结合活性的抗erbB2噬菌体抗体，得到其基因序列。

上述步骤d中，将步骤c中获得的抗体基因，通过DNA克隆等基因工程手段，克隆入含有人抗体恒定区基因的真核表达载体中，通过脂质体转染、电穿孔等方法转染真核表达细胞，培养足够长时候后收获上清，其中含有表达的目的抗体。

上述步骤e中，包括人源抗体的纯化以及生物学功能鉴定，具体包括以下实验：

实验1)双夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)：以合适的抗体包被后作为捕获抗体，经过封闭后，加入待测样品以及标准样品进行捕获反应；随后利用合适的酶标二抗进行显色反应，测定样品中目的蛋白的含量。

实验2)用硫酸铵沉淀法或者亲和层析等方法从步骤d获得的培养上清中直接分离纯化抗体。通过十二烷基硫酸纳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化产物的纯度、分子量。

实验3)利用间接免疫荧光以及流式细胞分析鉴定抗体的结合活性、识别位点以及亲和力：收集目的细胞，缓冲液(PBS+2％胎牛血清)洗涤后，加入一抗，4℃反应30mins；缓冲液洗涤2次，加入相应的二抗，4℃避光反应30mins，缓冲液洗涤2次后重悬在PBS中直接进行流式细胞分析或者以1％的多聚甲醛固定，4℃避光保存。

实验4)抑制生长实验：以erbB2阳性细胞作为靶细胞，加入不同浓度的抗体作用于靶细胞，设立阴性对照、阳性对照及实验组；作用24h后，以MTT法测定抗体对靶细胞生长抑制活性。

实验5)抗体依赖的细胞毒试验(ADCC)：标记erbB2阳性细胞作为靶细胞，用淋巴细胞分离液从外周血中分离出外周血单个核细胞作为效应细胞；根据相应比例混合后，加入不等量的抗体，于圆底96孔培养板上进行杀伤实验，设立实验孔、靶细胞自发释放孔、最大释放孔及背景孔；37℃孵育2h。利用多功能酶标仪进行检测，计算杀伤率。

本发明通过天然抗体库筛选获得抗erbB2人源抗体，通过方法获得的抗体是全人源性抗体，避免了鼠源性抗体在人体应用时诱发的人抗鼠抗体的不良反应。

本发明获得的抗体具有特异性结合erbB2阳性细胞；该抗体能抑制erbB2阳性细胞增殖；该抗体能介导ADCC活性杀伤erbB2阳性细胞。

附图说明

图1：重组膜表达的人erbB2可以被Herceptin(罗氏公司产品，注射用曲妥珠单抗，又称赫赛汀，英文名Trastuzumab)识别。调取人erbB2基因，将编码erbB2信号肽、胞外段以及跨膜区的基因克隆入pEGFP-N1载体；转染293T细胞后用Herceptin抗体进行间接免疫荧光检测，流式细胞仪检测结果显示重组表达的人erbB2可被Herceptin抗体特异性识别。(A：293T细胞；B：293T细胞转染含erbB2信号肽、胞外段以及跨膜区基因的pEGFP-N1载体；C：转染阳性293T细胞后用Herceptin抗体进行间接免疫荧光检测(细线图形表示对照；粗线图形表示实验结果))。

图2：表达产物SDS-PAGE分析。A图显示非还原的SDS-PAGE分析结果，表达产物分子量为155KDa，提示表达产物与抗体分子量一致；B图结果显示，表达产物在还原条件下的SDS-PAGE分析呈现55KDa及25KDa两个条带，具有典型的抗体特征；提示获得的表达产物为抗体。

图3利用erbB2阳性细胞系测定抗体的结合活性。结果显示，MIL5-2和MIL5-3的结合活性明显高于阳性对照2C4抗体，而MIL5-1的结合活性略低于阳性对照2C4抗体。

图4：抗体体外抑制erbB2阳性细胞增殖。A：抗体抑制SKOV3细胞增殖，B；抗体抑制MCF7细胞增殖，C：抗体抑制SKBR3细胞增殖。结果显示，MIL5-2和MIL5-3的抑制活性明显高于阳性对照2C4抗体，而MIL5-1的抑制活性与阳性对照2C4抗体相似。

图5：抗体体外通过介导ADCC效应杀伤erbB2阳性细胞。A：抗体介导ADCC效应杀伤SKOV3细胞，B；抗体介导ADCC效应杀伤MCF7细胞，C：抗体介导ADCC效应杀伤SKBR3细胞。结果显示，MIL5-2和MIL5-3介导的细胞毒作用明显高于阳性对照2C4抗体，而MIL5-1介导的细胞毒作用与阳性对照2C4抗体相似。

发明详述

本发明的抗erbB2人源抗体，其结构包括人源恒定区和可变区；其重链可变区选自：SEQ_ID NO：1、SEQ_ID NO：3或SEQ_ID NO：5；其轻链可变区选自：SEQ_ID NO：2、SEQ_ID NO：4或SEQ_ID NO：6。制备方法为：首先根据美国Scripps研究所设计的人免疫球蛋白(Ig)通用引物及简并引物序列合成引物，取正常人的血液分离淋巴细胞，从淋巴细胞中提取总RNA，以总RNA为模板反转录成cDNA，用人Ig特异性引物扩增所有免疫球蛋白轻链和重链Fd段基因；常规制备感受态细菌(XL1-blue)，将经过纯化的轻链PCR产物用Xba I和Sac I限制性内切酶消化后进行电泳分离纯化，将载体(pComb3)用同样的酶消化后电泳分离纯化，将载体和轻链进行连接反应，连接产物采用电穿孔的方法转入感受态细胞，构建轻链库；从轻链库中抽提纯化后的轻链库质粒DNA和重链Fd段PCR产物用Xho I和Spe I酶消化后进行连接反应并电穿孔转化感受态细胞，建立人Ig Fab抗体库；抽提含有IgFab的重组载体，与辅助噬菌体(VCSM13)共同转染受体菌，建立噬菌体抗体库。

根据人erbB2基因(SwissProt注册号：P04626)序列，收集erbB2阳性细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，扩增得到编码erbB2信号肽、胞外段以及跨膜区的基因；经过DNA克隆技术将其克隆入载体pEGFP-N1(Clonetech公司产品)中，转染293T细胞后，筛选获得阳性重组细胞。将抗体库用不表达靶抗原的“空白”细胞293T细胞吸附，除去非目的抗体(阴性选择)；再用经阴性选择的抗体库与表达靶抗原的阳性重组细胞结合，得到与靶细胞结合的抗体(阳性筛选)；经过3-8轮的“阴性选择-阳性选择-扩增”，获得具有较好结合活性的抗erbB2噬菌体抗体，得到其基因序列。

将获得的阳性抗体基因，通过DNA克隆等基因工程手段，克隆入含有人抗体恒定区基因的真核表达载体中，通过脂质体转染、电穿孔等方法转染表达细胞，培养足够长时候后收获上清，通过亲和纯化等方法获得人源抗体，进一步对获得的人源抗体进行生物学活性鉴定。

实施例1.人源噬菌体抗体库的构建

取健康人外周血200份，每份5mL(北京市血液中心)，以人淋巴细胞分离液(TBD)分离淋巴细胞，用TRIZOL reagent(Promega)提取总RNA。将总RNA用MMLV试剂盒(Promega)逆转录成cDNA，并以人IgG轻重链可变区保守序列的上、下游引物进行免疫球蛋白轻重链基因的PCR扩增。引物序列如下(Invitrogen合成)：

重链可变区5’端引物

VH_1a：5’-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3’(SEQ_NO：7)

VH_1f：5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’(SEQ_NO：8)

VH_2f：5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3’(SEQ_NO：9)

VH_3a：5’-GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3’(SEQ_NO：10)

VH_3f：5’-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’(SEQ_NO：11)

VH_4f：5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3’(SEQ_NO：12)

VH_6f：5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3’(SEQ_NO：13)

VH_6a：5’-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3’(SEQ_NO：14)

重链可变区3’端引物

IgG₁：5’-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACAAGA TTT GGG-3’(SEQ_NO：15)

IgG₂：5’-CTC GAC ACT AGT TTT GCG CTC AAC TGT CTT-3’(SEQ_NO：16)

IgG₃：5’-TGT GTG ACT AGT GTC ACC AAG TGG GGT TTT-3’(SEQ-_NO：17)

IgG₄：5’-GCA TGA ACT AGT TGG GGG ACC ATA TTT GGA-3’(SEQ-_NO：18)

κ链可变区5’端引物

VK_1a：5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’(SEQ_NO：19)

VK_1s：5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CC-3’(SEQ_NO：20)

VK_2a：5’-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3’(SEQ_NO：21)

VK_3a：5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3’(SEQ_NO：22)

VK_3b：5’-GAAATT GAG CTC AC(G/A)CAG TCT CCA-3’(SEQ_NO：23)

λ链可变区5’端引物

VL₁：5’-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC-3’(SEQ_NO：24)

VL₂：5’-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3’(SEQ_NO：25)

VL₃：5’-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3’(SEQ_NO：26)

VL₄：5’-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3’(SEQ-_NO：27)

VL₅：5’-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3’(SEQ_NO：28)

VL₆：5’-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3’(SEQ_NO：29)

VL₇：5’-CAG GTT GAG CTC ACT CAA CCG CCC-3’(SEQ_NO：30)

VL₈：5’-CAG GCT GAG CTC ACT CAG CCG TCT TCC-3’(SEQ_NO：31)

κ链3’端引物

CK_1b：5’-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCTTTG TGA CGG GCG AAC TCA G-3’(SEQ_NO：32)

λ链3’端引物

CL₂：5’-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’(SEQ-_NO：33)

PCR条件为94℃1分钟，54℃(或55℃、56℃、58℃、60℃)1分钟，72℃2分钟，35循环，72℃延伸10分钟，Taq酶为TAKARA公司产品。

上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收(回收试剂盒为promega公司产品)纯化后，将轻链产物和重链产物分别混合。混合后的轻链产物用Xba I和SacI限制性内切酶(NEB)消化后进行电泳分离纯化，将载体pComb3(美国Scripps研究所)用同样的酶消化后电泳分离纯化，将载体和轻链进行连接反应，连接产物10μL采用电穿孔的方法转入200μL XL1-Blue感受态细胞，构建轻链库，电穿孔条件为：Bio-Red电转仪，0.2厘米电转杯，2.5kv；从轻链库中抽提纯化后的轻链库质粒DNA和混合后的重链产物用Xho I和Spe I酶消化后进行连接反应并以同样的方法电穿孔转化XL1-Blue感受态细胞，电穿孔后加入10mL SOC培养基，37℃培养1小时，加入80mL SB-A⁺T⁺培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素及10μg四环素)，37℃培养2小时，加入辅助噬菌体VCSM13(1×10¹³pfu/mL)(Stratagene公司)37℃感染1小时，加入卡那霉素(70μg/mL)37℃摇床培养过夜，收集上清，用4％PEG(聚乙二醇)和3％NaCl沉淀噬菌体上清，离心后用0.02mol/L pH7.4PBS缓冲溶液重悬沉淀，再次离心得到的上清即为噬菌体抗体库。

SOC培养配制如下：

蛋白胨 20g

酵母提取物 5g

氯化钠 0.5g

1mol/L氯化钾 2.5mL

蒸馏水补足至1L

制备方法：摇动容器使得溶质完全溶解，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100mL培养基中加入1mL无菌的1mol/L氯化镁和2mL无菌的1mol/L葡萄糖。

SB培养基配制如下：

蛋白胨 30g

酵母提取物 10g

MOPS(3-吗啉丙磺酸) 10g

蒸馏水补足至1L

调整至pH7.0。

实施例2.表达人erbB2胞外段全长基因的重组细胞株的构建

收集erbB2阳性细胞SKBR3，用TRIZOL reagent(Promega)提取总RNA。将总RNA用MMLV试剂盒(Promega)逆转录成cDNA，根据人erbB2基因(SwissProt注册号：P04626)序列，设计引物，扩增得到编码erbB2信号肽、胞外段以及跨膜区的基因，并且在上下游分别引入限制性内切酶位点Xho I和Hind III，引物如下(由Invitrogen公司合成)：

erbB2-Pup：ccg ctc gag agt gag cac cat g(SEQ_NO：34)

erbB2-Pdown：ccc aag ctt ctg ccg tcg ctt gat(SEQ_NO：35)

PCR条件为94℃1分钟，58℃1分钟，72℃2分钟，35循环，72℃延伸10分钟，Taq酶为TAKARA公司产品。

PCR产物经琼脂糖凝胶回收(回收试剂盒为promega公司产品)纯化后，加入限制性内切酶Xho I和Hind III进行消化，消化产物经琼脂糖凝胶回收纯化后与用相同限制性内切酶消化的载体pEGFP-N1(Clonetech公司产品)进行连接反应；室温连接2h或者4℃连接过夜，连接产物转化JM109大肠杆菌，涂布在含有100μg/mL卡那霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL卡那霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒(博大泰克公司)提取阳性克隆质粒。利用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将获得的阳性质粒DNA转染293T细胞。

转染后的293T细胞在含有G418的DMEM培养基中进行连续5周的选择培养后，在96孔细胞培养板中进行稀释克隆化培养，获得的单克隆细胞继续3轮稀释克隆化培养。筛选获得的单克隆细胞株利用间接免疫荧光检测，结果显示人erbB2胞外段基因可以在293T细胞上表达。用Herceptin抗体以及GAH-IgG-PE进行间接免疫荧光染色，结果显示，重组表达的人erbB2可以被Herceptin识别。(图1)

实施例3.噬菌体抗体库的筛选

将100μL(10⁶细胞)不表达人erbB2的293T细胞作为空白细胞加入V形底的微孔板，加入80μL抗体库，混匀，室温反应30分钟。室温750g离心2-3分钟，将上清转到实施例2中获得的表达人erbB2的阳性细胞100μL(10⁶细胞)中，混匀，室温反应30分钟。室温750g离心2-3分钟，弃去上清，用180μL洗涤液(PBS含20mmol/L Hepes(pH7.4)，1％BSA，0.03％叠氮钠，过滤除菌)重悬细胞，反复洗涤5-8次。用180μL PBS重悬细胞，转到试管中，加入1mL PBS，室温750g离心2-3分钟。用150μL TBS-胰蛋白酶(10mg/mL)重悬细胞，在摇床上200～300转/分钟37℃摇动30mins以洗脱噬菌体。将洗脱的噬菌体加入到2mL XL1-Blue(培养至A₆₀₀＝1)中，室温孵育15分钟后转入200mL三角烧瓶中，加入10mL SB-A⁺T⁺培养基(含有20μg/mL氨苄青霉素及10μg四环素)，37℃培养1小时。再加入SB-A⁺T⁺培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素及10μg四环素)，37℃培养1小时。加入辅助噬菌体VCSM13(1×10¹²pfu/mL)，37℃反应2小时。加入卡那霉素(70μg/mL)37℃摇床培养过夜。收集上清，用4％PEG(聚乙二醇)和3％NaCl沉淀噬菌体上清，离心后用0.02mol/L pH7.4PBS缓冲溶液重悬沉淀，再次离心得到的上清进行下一轮筛选。

经过4-8轮富集筛选后，获得阳性克隆三株：MIL5-1、MIL5-2及MIL5-3，测序翻译后获得抗体可变区序列。MIL5-1重链可变区氨基酸序列为SEQ_ID：1，轻链可变区氨基酸序列为SEQ_ID：2；MIL5-2重链可变区氨基酸序列为SEQ_ID：3，轻链可变区氨基酸序列为SEQ_ID：4；MIL5-3重链可变区氨基酸序列为SEQ_ID：5，轻链可变区氨基酸序列为SEQ_ID：6。这三株抗体的序列与Herceptin完全不同。MIL5-1及MIL5-2与2C4序列也完成不同；而MIL5-3的轻链与2C4的轻链氨基酸序列相同，但其重链与2C4的重链氨基酸序列在CDR1区以及框架区有3个氨基酸不同。

实施例4.人源抗体的构建和表达

采用PCR反应分别给以上三株抗体可变区基因引入适当的酶切位点，其中在抗体轻链可变区基因5’端及3’端分别引入EcoR V和Xho I酶切位点；在抗体重链链可变区基因5’端及3’端分别引入Pvu II和BstE II酶切位点。进行普通PCR后，将PCR产物经琼脂糖凝胶回收(回收试剂盒为promega公司产品)纯化。轻链可变区基因加入限制性内切酶EcoR V和Xho I进行消化，消化产物经琼脂糖凝胶回收纯化后与用相同限制性内切酶消化的载体pTGS-FRT-DHFR(由本公司构建并申请国家专利专利，授权号：ZL200510064335.0)进行连接反应；室温连接2h或者4℃连接过夜，连接产物转化JM109大肠杆菌，涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL卡那霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒(博大泰克公司)提取阳性克隆质粒。阳性克隆经限制性内切酶Pvu II和BstE II消化后，与用相同限制性内切酶消化的抗体重链基因连接，经过相同的转化等实验后，获得阳性质粒pTGS-MIL5-1、pTGS-MIL5-2、pTGS-MIL5-3。

利用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将获得的阳性质粒DNA转染CHO细胞。转染后的CHO细胞在含有G418的选择培养基中进行连续4～8周的选择培养后，在96孔细胞培养板中进行稀释克隆化培养，获得的单克隆细胞继续3轮稀释克隆化培养。

获得的单克隆细胞系在RPMI 1640培养基中进行培养，利用羊抗人IgG以及辣根酶标记的羊抗人IgG进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量，以未转染上清作为阴性对照，人IgG纯品作为标准品。实验结果显示，表达获得的目的蛋白可以被羊抗人IgG抗体识别，含有人IgG抗体的恒定区，具有人IgG抗体特征；并且构建的人源抗体具有较高的表达水平。

采用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化本发明的人源抗体MIL5-1、MIL5-2、MIL5-3。以非还原的形式进行SDS-PAGE实验，结果显示表达的目的蛋白约为155KDa，符合抗体的分子量(图2A)。还原形式进行的SDS-PAGE实验结果显示，目的蛋白在还原条件下呈两条特异性条带，分别为55KDa和25KDa(图2B)，具有典型的抗体特征。提示表达获得的蛋白为抗体分子，具有典型的IgG抗体结构特征。

实施例5.人源抗体的功能鉴定

以2C4抗体为阳性对照(其序列参照PDB：1s78，根据实施例4中的方法，对其进行表达纯化获得)，以人IgG为阴性对照，对本发明获得的抗erbB2人源抗体进行功能验证：

a)抗体的识别活性鉴定

SKOV3细胞为乳腺癌细胞系，细胞表面表达大量的erbB2抗原，利用该细胞对获得的抗体进行鉴定。以各人源抗体以及GAH-IgG-FITC对SKOV3细胞进行间接免疫荧光染色后，通过流式细胞术对结果进行分析。结果显示，本发明获得的抗erbB2人源抗体都能特异性结合靶细胞，其中MIL5-2和MIL5-3的结合活性明显优于阳性对照2C4抗体，而MIL5-1的结合活性略低于阳性对照2C4抗体。(图3)

b)抗体抑制及杀伤肿瘤细胞功能鉴定

利用SKVO3、MCF7、SKBR3等肿瘤细胞系对获得的抗体抑制肿瘤细胞生长及杀伤肿瘤细胞的功能进行验证。

利用SKVO3、MCF7、SKBR3进行生长抑制实验，加入细胞和抗体后常规培养2～4天进行细胞记数及MTT检测。与人IgG对照组相比较，本发明获得的人源抗体具有明显的抑制SKVO3、MCF7及SKBR3细胞生长的活性；其中MIL5-2和MIL5-3的抑制活性明显高于阳性对照2C4抗体，而MIL5-1的抑制活性与阳性对照2C4抗体相似(图4)。

采用PerkinElmer公司的DELFIA EuTDA Cytotoxicity reagents进行抗体依赖的细胞毒实验，以利用试剂盒中的标记试剂标记SKVO3、MCF7、SKBR3细胞后作为靶细胞，以人外周血单个核细胞为效应细胞，当效靶比为50∶1时，本发明获得的人源抗体都能有效杀伤靶细胞。其中MIL5-2和MIL5-3介导的细胞毒作用明显高于阳性对照2C4抗体，而MIL5-1介导的细胞毒作用与阳性对照2C4抗体相似(图5，表1)。

表1：抗体介导ADCC杀伤靶细胞

IC50比较结果显示，MIL5-2和MIL5-3介导的细胞毒作用明显高于阳性对照2C4抗体，而MIL5-1介导的细胞毒作用与阳性对照2C4抗体相似。

序列表

<110>北京天广实生物技术有限公司

中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120>一种抗erbB2人源抗体MIL-5及其应用

<160>35

<210>1

<211>119

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>抗体MIL5-1重链可变区氨基酸序列

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Gln Pro Ser

1 5 10 15

Glu Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Ala Tyr Ser Val Ser

20 25 30

Ser Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Ser Gln Ala Leu

35 40 45

Gln Ser Met Ser Tyr Val Gln Pro Gln Thr Gly Gly Asn Leu Phe

50 55 60

Ser Gln Arg Val Gln Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser

65 70 75

Thr Ser Gln Ala Ser Met Glu Leu Ser Asn Val Thr Ser Ala Asp

80 85 90

Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Gln Ile Gly Pro Thr Tyr Ser

95 100 105

Tyr Glu Phe Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

110 115

<210>2

<211>107

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>抗体MIL5-1轻链可变区氨基酸序列

<400>2

Asp Ile Val Met Ser Glu Thr Pro Ser Ser Met Pro Val Ser Leu

1 5 10 15

Gly Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser

20 25 30

Leu Gly Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Arg Ser Gly Gln Ser Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Val Tyr Asp Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Glu Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Arg Tyr Gly Gln Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

65 70 75

Asn Arg Leu Glu Ala Asp Val Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Ser Phe Ile Tyr His Tyr Ser Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

95 100 105

Ile Arg

107

<210>3

<211>119

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>抗体MIL5-2重链可变区氨基酸序列

<400>3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115

<210>4

<211>107

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>抗体MIL5-2轻链可变区氨基酸序列

<400>4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

95 100 105

Ile Lys

107

<210>5

<211>119

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>抗体MIL5-3重链可变区氨基酸序列

<400>5

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Gln Pro Ser

1 5 10 15

Ala Thr Val Arg Val Thr Cys Lys Val Ser Ala Tyr Ser Phe Thr

20 25 30

Glu Tyr Ser Met Asp Trp Ile Arg Thr Pro Ser Gly Arg Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Met Ser Asp Ile Gln Pro Gln Ser Gly Gly Ser Ile Phe

50 55 60

Ser Asn Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Asp Ser

65 70 75

Thr Ser Gln Ala Phe Met Glu Met Asn Ser Leu Lys Ser Ala Asp

80 85 90

Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Asn Leu Gly Pro Ser Tyr Tyr

95 100 105

Tyr Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115

<210>6

<211>107

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>抗体MIL5-3轻链可变区氨基酸序列

<400>6

Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Thr Val

1 5 10 15

Gly Asp Thr Ile Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Asn Glu Ile Ser

20 25 30

Ile Gly Val Ala Trp Phe Gln Gln Glu Ser Glu Thr Ala Ile Lys

35 40 45

Arg Leu Trp Val Ser Ala Thr Phe Arg Phe Ser Glu Val Pro Ser

50 55 60

Arg Leu Thr Asp Gly Ala Tyr Arg Thr Ser Tyr Thr Phe Thr Val

65 70 75

Ser Arg Met Lys Pro Asp Asn Phe Val Ile Phe Phe Cys Leu His

80 85 90

Tyr Tyr Leu Phe Pro Phe Ser Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

95 100 105

Ile Arg

107

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>7

CAGGTGCAGC TCGAGCAGTC TGGG 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>8

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGGG 24

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>9

CAGGTGCAGC TACTCGAGTC GGG 23

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>10

GAGGTGCAGC TCGAGGAGTC TGGG 24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>11

GAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGGG 24

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>12

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 23

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>13

CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG 23

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>14

CAGGTACAGC TCGAGCAGTC AGG 23

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>15

GCATGTACTA GTTTTGTCAC AAGATTTGGG 30

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>16

CTCGACACTA GTTTTGCGCT CAACTGTCTT 30

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>17

TGTGTGACTA GTGTCACCAA GTGGGGTTTT 30

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>18

GCATGAACTA GTTGGGGGAC CATATTTGGA 30

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>19

GACATCGAGC TCACCCAGTC TCCA 24

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>20

GACATCGAGC TCACCCAGTC TCC 23

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>21

GATATTGAGC TCACTCAGTC TCCA 24

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>22

GAAATTGAGC TCACGCAGTC TCCA 24

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>23

GAAATTGAGC TCACGACAGT CTCCA 25

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>24

AATTTTGAGC TCACTCAGCC CCAC 24

<210>25

<211>27

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>25

TCTGCCGAGC TCCAGCCTGC CTCCGTG 27

<210>26

<211>27

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>26

TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG 27

<210>27

<211>33

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>27

TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG 33

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>28

CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC 24

<210>29

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>29

CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC 24

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>30

CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC 24

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>31

CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC 27

<210>32

<211>58

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>32

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC GAACTCAG 58

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>33

CGCCGTCTAG AATTATGAAC ATTCTGTAGG 30

<210>34

<211>22

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>34

ccgctcgaga gtgagcaccatg 22

<210>35

<211>23

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>引物

<400>35

cccaagcttc tgccgtcgct tga 23

Claims

1.一种抗erbB2人源抗体MIL5，它包含重链可变区、轻链可变区；重链可变区选自SEQ_ID NO：3所示的氨基酸序列；它的轻链可变区选自SEQ_IDNO：4所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述抗体在制备诊断或治疗erbB2高表达细胞不当存活或者不当增殖相关疾病的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其中不当增殖相关疾病为肿瘤。