CN117700534A

CN117700534A - 一种抗猴痘病毒a35r蛋白的抗体及其应用

Info

Publication number: CN117700534A
Application number: CN202311810262.XA
Authority: CN
Inventors: 黄亚杰; 胡振阳; 王雷
Original assignee: Suzhou Dongkang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Dongkang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-12-27
Filing date: 2023-12-27
Publication date: 2024-03-15

Abstract

本发明公开了一种抗猴痘病毒A35R蛋白的抗体及其应用，所述抗体的重链可变区HCDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2‑4所示，所述抗体的轻链可变区LCDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6‑8所示，其能够特异性结合猴痘病毒A35R蛋白，且具有较好的结合活性，能够用于猴痘病毒感染相关疾病的早期诊断和筛查中，应用前景广阔。

Description

一种抗猴痘病毒A35R蛋白的抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种抗猴痘病毒A35R蛋白的抗体及其应用。

背景技术

猴痘(monkeypox)是一种由猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)感染引起的人畜共患病。在1970年首例感染MPXV的病例发生在非洲刚果，从一名疑似天花患者的标本中分离得到MPXV。猴痘病毒属痘病毒科(Poxviridae)，有脂蛋白外膜。其基因组为线性双链DNA。在电子显微镜下观察，猴痘病毒为200-250nm的卵形或砖形颗粒。除了依赖宿主细胞的核糖体完成mRNA翻译外，猴痘病毒的基因组元件能指导完成所有的复制、转录、组装和出胞等过程。A35R是猴痘病毒EV表面的包膜糖蛋白，在病毒粒子的细胞间传播中发挥重要作用。是开发猴痘病毒相关诊断性或治疗性抗体的潜在靶点。

目前实验室诊断猴痘病毒的方法分为三类，第一类是培养分离的方法，通过细胞培养，然后分离出猴痘病毒；第二类是电镜检查，检测待检样本中是否有与正痘病毒形态一致的病毒存在；第三类是分子诊断的方法，采用荧光PCR方法特异性检测待检样本中的猴痘病毒核酸。然而，培养分离法虽然结果准确，但检测周期长，容易出现假阴性结果，而且由于进行活病毒操作，对实验室生物安全要求极高；电镜检查方法灵敏度不高，样本准备复杂周期长，而且电镜昂贵且操作复杂，不适合大范围推广；分子诊断法要求较高的灵敏度，存在污染的可能，并且相关分子诊断产品较少。

因此，寻找靶向猴痘病毒A35R蛋白的有效抗体对早期诊断猴痘病毒感染性疾病、治疗和/或预防猴痘病毒的感染均具有重要意义。

发明内容

为了解决目前本领域存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6及其应用，进而为本领域提供用于早期检测或筛查猴痘病毒感染的相关产品。

本发明采用如下技术方案实现上述目的：

本发明的第一方面提供了一种抗猴痘病毒A35R蛋白的抗体。

进一步，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区中HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2-4所示；

所述轻链可变区中LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示。

进一步，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在本发明中，所述抗体是指能够非共价地、可逆地并以特异性方式结合对应抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是一种包括通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的四聚体。每个重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。其中，重链的三个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的三个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

在本发明中，采用任何CDR编号方案(现有的CDR编号方案或将来产生的新的CDR编号方案)分别对如SEQ ID NO:5所示的重链可变区中的HCDR1-3进行定义、对如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区中的LCDR1-3进行定义得到的HCDR1-3、LCDR1-3对应的抗体均在本发明的保护范围内。

在一些实施方案中，所述CDR编号方案包括但不限于：IMGT编号方案、Kabat编号方案、Chothia编号方案、Martin(增强型Chothia)编号方案、AbM编号方案、Aho编号方案、Contact编号方案中的任意一种或任意多种(两种或两种以上)的组合，本领域技术人员可根据实际需求进行多种选择。

在一些实施方案中，本发明第一方面提供的抗体的功能性变体同样包含在本发明的保护范围内，所述功能性变体是指与亲本抗体(本发明第一方面提供的抗体)相比具有明显或显著序列同一性或相似性的蛋白，所述功能性变体保留了亲本抗体的生物活性。功能性变体涵盖例如本文中所述抗体(亲本抗体)的以下变体，其与亲本抗体相比在类似程度上、在相同程度上或在更高程度上保留识别靶抗原(猴痘病毒A35R蛋白)的能力。参考亲本抗体，功能性变体可例如与亲本抗体在氨基酸序列方面具有至少约30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同源性。

在一些实施方案中，功能性变体可例如包含具有至少一个保守性氨基酸替换的亲本抗体的氨基酸序列。作为替选或补充，功能性变体可包含具有至少一个非保守性氨基酸替换的亲本抗体的氨基酸序列。在这种情况下，非保守性氨基酸替换优选不干扰或抑制功能性变体的生物活性。非保守性氨基酸替换可增强功能性变体的生物活性，使得与亲本抗体相比，功能性变体的生物活性提高。

在一些实施方案中，保守性氨基酸替换是本领域已知的，并且包括其中将一个具有特定物理和/或化学特性的氨基酸替换为另一个具有相同或相似化学或物理特性的氨基酸。

在一些实施方案中，所述保守性氨基酸替换可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸替换另一个酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸替换另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、碱性/带正电荷的极性氨基酸替换另一个碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如，Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电荷氨基酸替换另一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gin、Ser、Thr、Tyr等)、具有β支化侧链的氨基酸替换另一个具有β支化侧链的氨基酸(例如，He、Thr和Val)、具有芳香族侧链的氨基酸替换另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)。

本发明的第二方面提供了一种双特异性抗体。

进一步，所述双特异性抗体包含本发明第一方面所述的抗体，以及一个与其他抗原特异性结合的第二抗体。

在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含针对两种不同抗原的结合特异性(其中一种抗原为本发明第一方面中所述的猴痘病毒A35R蛋白，另外一种抗原为除猴痘病毒A35R蛋白之外的任何一种抗原)。在另一些实施方案中，所述双特异性抗体包含针对同一抗原(例如猴痘病毒A35R蛋白)的两种不同的结合特异性(例如，针对同一抗原具有不同的结合亲和力和/或特异性表位)。

本发明的第三方面提供了一种核酸分子。

进一步，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体。

在一些实施方案中，所述核酸分子包括如下任一种核酸分子：编码本发明第一方面所述抗体的核酸分子、编码本发明第二方面所述双特异性抗体的核酸分子、编码本发明第一方面所述抗体的重链可变区的核酸分子、编码本发明第一方面所述抗体的轻链可变区的核酸分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如采用定向进化和点突变的方法，对本发明第一方面提供的抗体或本发明第二方面提供的双特异性抗体对应的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明所述抗体或双特异性抗体对应的核苷酸序列80％或80％以上同源性的核苷酸，只要编码本发明第一方面所述的抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列，同样包含在本发明的保护范围内。

本发明的第四方面提供了一种重组载体。

进一步，所述重组载体包含本发明第三方面所述的核酸分子。

在一些实施方案中，任何能够递送核酸的载体都可以适用于本发明。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(AAV)、慢病毒载体或其任何组合。

本发明的第五方面提供了一种重组宿主细胞。

进一步，所述重组宿主细胞包含本发明第四方面所述的重组载体。

在一些实施方案中，所述宿主细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其他任何细胞。在一些实施方案中，合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主细胞。

在本发明中，能够用作表达抗体的宿主细胞是本领域技术人员公知的，并且许多宿主细胞可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得。这些宿主细胞包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、海拉细胞(HeLacell)、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他多种类型的细胞系。

本发明的第六方面提供了一种抗体偶联物。

进一步，所述抗体偶联物为本发明第一方面所述的抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体直接或间接偶联至可检测标记物上形成的复合物。

在一些实施方案中，所述可检测标记物是指任何能够用于辅助所述抗体或双特异性抗体检测猴痘病毒A35R蛋白的物质。在另一些实施方案中，所述可检测标记物包括但不限于：荧光素酶、荧光素、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、原卟啉、血卟啉、辣根过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、水母发光蛋白、亚甲基蓝等。

本发明的第七方面提供了如下任一种产品：

(1)一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体和/或本发明第六方面所述的抗体偶联物；

(2)一种检测产品，所述检测产品包含本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第六方面所述的抗体偶联物或所述检测试剂。

在一些实施方案中，所述检测产品包括但不限于：检测试剂盒、检测试纸条、检测芯片。在另一些实施方案中，所述检测试剂盒包括但不限于：ELISA检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、放射免疫检测试剂盒、流式分选检测试剂盒、IHC检测试剂盒、胶体金免疫检测试剂盒。

在一些实施方案中，所述试剂盒中还包括固相载体，本发明提供的抗体或双特异性抗体被固定于固相载体(例如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在。所述试剂盒中还包括：能与所述抗体或双特异性抗体连接的可检测部分，可检测部分可分离地存在于试剂盒中；和/或与可检测部分相对应的底物；和/或酶联免疫反应试剂，所述反应试剂包括但不限于：包被液、洗涤液、封闭液、固定液、终止液、显色液；和/或说明检测猴痘病毒A35R蛋白的方法的使用说明书。

本发明的第八方面提供了如下任一种方法：

(1)一种生产本发明第一方面所述的抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤：培养本发明第五方面所述的重组宿主细胞，从重组宿主细胞培养产物中分离得到本发明第一方面所述的抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体；

(2)一种制备本发明第五方面所述的重组宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第四方面所述的重组载体引入到宿主细胞中，得到本发明第五方面所述的重组宿主细胞；

(3)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中A35R蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第六方面所述的抗体偶联物或本发明第七方面中所述的检测试剂或检测产品接触，检测A35R蛋白与所述抗体免疫复合物的形成。

在一些实施方案中，本发明所述的待测样品包括但不限于液体类，比如尿、唾液、脑脊髓液、血液、血清及类似物，或者固体或半固体类，比如组织、粪便及类似物，或者，可以是如那些常用于组织学诊断的固体组织。本发明对待测样品并无特别限制，只要有猴痘病毒A35R蛋白检测需要的待测样品，其均将落入本发明的保护范围内。

在一些实施方案中，对所述猴痘病毒A35R蛋白进行检测的方法包括定量检测或定性检测。在另一些实施方案中，所述检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法。在一些实施方式中，本发明提供的抗体或双特异性抗体可以偶联荧光素酶、生物素酶等可检测标记，在液相或固相中用于FACS、IHC、ELISA等直接或间接的免疫测定，包括竞争性或非竞争性等。

在一些实施方案中，可以使用本领域熟知的技术将所述重组载体引入到宿主细胞中。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染，以及使用逆转录病毒或其他病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。引入后可以引起或允许核酸表达，例如通过在基因表达的条件下培养宿主细胞。

此外，本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断受试者是否患有猴痘病毒感染性疾病的方法，所述方法包括：将本发明第一方面所述的抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第六方面所述的抗体偶联物和/或本发明第七方面中所述的检测试剂或检测产品与受试者来源的待测样品接触，检测受试者来源的待测样品中是否存在A35R蛋白，进而判断受试者是否患有猴痘病毒感染性疾病或患猴痘病毒感染性疾病的风险。

本发明的第九方面提供了如下任一方面应用：

(1)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组载体和/或本发明第五方面所述的重组宿主细胞在制备用于检测猴痘病毒的抗体偶联物中的应用；

(2)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞和/或本发明第六方面所述的抗体偶联物在制备用于检测猴痘病毒的检测试剂中的应用；

(3)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的抗体偶联物和/或本发明第七方面中所述的检测试剂在制备用于检测猴痘病毒的检测产品中的应用；

(4)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的抗体偶联物和/或本发明第七方面中所述的检测试剂或检测产品在非诊断和非治疗目的地检测A35R蛋白中的应用；

(5)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的抗体偶联物和/或本发明第七方面中所述的检测试剂或检测产品在制备用于诊断猴痘病毒感染性疾病的诊断产品中的应用。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

本发明提供了一种抗猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6，所述抗体4E6能够特异性结合猴痘病毒A35R蛋白，且具有较好的结合活性，能够用于猴痘病毒感染相关疾病的早期诊断和筛查中，本发明为猴痘病毒感染的防控奠定了基础，应用前景广阔。

附图说明

图1为检测靶向A35R蛋白的单克隆抗体4E6的电泳结果图；

图2为检测靶向A35R蛋白的单克隆抗体4E6的HPLC结果图；

图3为ELISA检测靶向A35R蛋白的单克隆抗体4E6的结合活性结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体的筛选

1、免疫原重组表达

首先，本申请合成了猴痘病毒细胞外囊膜病毒的A35R蛋白序列，并将其构建至pEM5.1载体；抽提转染用质粒；转染至HEK293细胞，培养细胞7天；收获上清，Ni柱纯化，经过浓缩置换缓冲液，得到重组猴痘病毒A35R蛋白。

所述重组猴痘病毒A35R蛋白序列来源Uniprot，其序列如SEQ ID NO:1所示，序列信息见下表1。

表1重组猴痘病毒A35R蛋白的序列

2、免疫小鼠、SP2/0融合、筛选、亚克隆

第一次用福氏完全佐剂，每只100μg，腹腔注射，总剂量0.5mL/只，间隔3周进行第二次免疫；第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为50μg/0.5mL/只，间隔2周进行第三次免疫；第三次注射后10天准备细胞融合。

取饲养细胞，可按10⁵个/孔使用，于融合前一天铺板10⁵个/100μL/孔；取小鼠免疫脾细胞与准备好的骨髓瘤细胞用融合剂PEG进行融合，铺入已经加入饲养细胞的96细胞培养板，100μL/孔。

通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，铺重组猴痘病毒A35R蛋白过夜；洗板，加脱脂奶粉封闭，37℃，1h；洗板，加入100μL 96孔培养液上清，37℃，孵育1h；洗板，加入HRP标记羊抗鼠二抗，37℃，孵育30min；洗板，加入显色液，显色10min，加入终止液，读取OD₄₅₀的数值；筛选高表达量细胞株进行亚克隆培养。

3、序列钓取

收集细胞，采用Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)20为引物，反转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入载体，进行转化，挑选阳性克隆送测序。

4、实验结果

筛选出靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6，经测序其对应的序列信息如表2所示。

表2靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6的序列信息

实施例2靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6的功能性研究

1、靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6的表达和纯化

对筛选出的靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6的序列进行化学合成，并克隆至真核表达载体中，对质粒扩增提取，将编码所述抗体的质粒瞬时转染入哺乳动物细胞HEK293(PEI转染)，收集上清，利用亲和层析方法，纯化获得单克隆抗体。

结果显示，纯化后的抗体4E6表达量为278mg/L。

2、靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6的理化性质检测

(1)凝胶电泳检测抗体的纯度

①仪器设备

实验所使用到的仪器设备如表3所示。

表3仪器设备

名称	生产厂家	型号
			化学发光成像仪	Tanon	Tanon-5200
电泳仪	BIO-RAD	poweerpac basic
			电泳槽	BIO-RAD	DYC-Mini4

②主要试剂

实验所使用到的主要试剂如表4所示。

表4主要试剂

名称	生产厂家	规格	货号
				1M Tris-HCl缓冲液	北京索莱宝科技有限公司	60mL/瓶	20200911
1.5M Tris-HCl缓冲液	北京索莱宝科技有限公司	100mL/瓶	20200911
				10％SDS	北京索莱宝科技有限公司	10mL/瓶	20200911
FastStain	Gene Universal	1000mL/瓶	21DA
				30％制胶液(29:1)	北京索莱宝科技有限公司	500mL/瓶	20210414
彩虹180广谱蛋白Marker	北京索莱宝科技有限公司	250μL(50T)	1202F021

③样品制备

样品制备的过程：取20μL的样品与5μL的5×还原buffer混合均匀，在95℃中加热5min，冷却；取20μL的样品与5μL的5×非还原buffer混合均匀。

④电泳

配置胶，加适量的电泳缓冲液，加样，进行电泳。

⑤染色与脱色

电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，室温染色1h或更长时间；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，室温脱色4-24h。完成脱色后，用ddH₂O浸泡，参照Marker蛋白，与未染色凝胶对比，切下所需蛋白成分的凝胶，收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。

⑥实验结果

结果如图1所示，从左至右条带分别是marker、还原条带；电泳结果图显示靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6的检测纯度大于95％。

(2)HPLC检测单克隆抗体的纯度

①仪器设备

实验所使用到的仪器设备如表5所示。

表5仪器设备

②主要试剂

实验所使用到的主要试剂如表6所示。

表6主要试剂

名称	生产厂家	规格	货号
				磷酸氢二钾三水	国药集团化学试剂有限公司	500g/瓶	10017592
磷酸二氢钾	国药集团化学试剂有限公司	500g/瓶	10017692
				氯化钾	国药集团化学试剂有限公司	500g/瓶	10016392

③流动相配制

将磷酸氢二钾三水、磷酸二氢钾和氯化钾加入到约900mL纯化水中，搅拌溶解，定容至1L，用pH计测量，确定其pH在6.2±0.1之间。0.22μm滤膜过滤，室温保存。

④样品制备

系统适用性样品：MIL62标准品用流动相稀释至2mg/mL；

供试品：待测样品用流动相稀释至2mg/mL。

⑤色谱条件

具体色谱条件如表7所示。

表7色谱条件

⑥实验结果

结果如图2所示，液相检测结果显示靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6的检测纯度大于95％。

3、靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6的结合活性检测

(1)包被：用包被液将抗原A35R蛋白稀释成2μg/mL，混匀，加入96孔包被板，100μL/孔，封膜封闭，4℃过夜。

(2)洗板机洗涤3次，最后一次不能有液体残留在板子上，用吸水纸拍干板子表面的液体。

(3)封闭：加入5％奶粉(0.5g奶粉溶于10mL DPBS)，300μL/孔，37℃孵育1h，按照步骤(2)中所述的方法)洗板3次。

(4)将抗体进行梯度稀释，100μL/孔，37℃反应1h，按照步骤(2)洗板3次。

(5)加二抗：用DPBS按照1:2000稀释，加入96孔板，100μL/孔，37℃反应1h，按照步骤(2)洗板3次。

(6)显色：加入TMB，100μL/孔，室温避光显色10min。

(7)终止：加入2N H₂SO₄，100μL/孔。

(8)酶标仪测OD₄₅₀，10min内检测。

(9)实验结果

结果如图3所示，结果显示，靶向猴痘病毒A35R蛋白的抗体4E6能够与A35R蛋白发生特异性的结合，并且呈现浓度依赖性，EC₅₀为0.1380μg/mL。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种抗猴痘病毒A35R蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含权利要求1或2所述的抗体，以及一个与其他抗原特异性结合的第二抗体。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗体或权利要求3所述的双特异性抗体。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求4所述的核酸分子。

6.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含权利要求5所述的重组载体。

7.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物为权利要求1或2所述的抗体或权利要求3所述的双特异性抗体直接或间接偶联至可检测标记物上形成的复合物。

8.如下任一种产品，其特征在于，所述产品包括：

(1)一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的双特异性抗体和/或权利要求7所述的抗体偶联物；

(2)一种检测产品，所述检测产品包含权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的双特异性抗体、权利要求7所述的抗体偶联物或所述检测试剂。

9.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)一种生产权利要求1或2所述的抗体或权利要求3所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤：培养权利要求6所述的重组宿主细胞，从重组宿主细胞培养产物中分离得到权利要求1或2所述的抗体或权利要求3所述的双特异性抗体；

(2)一种制备权利要求6所述的重组宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将权利要求5所述的重组载体引入到宿主细胞中，得到权利要求6所述的重组宿主细胞；

(3)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中A35R蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的双特异性抗体、权利要求7所述的抗体偶联物或权利要求8中所述的检测试剂或检测产品接触，检测A35R蛋白与所述抗体免疫复合物的形成。

10.如下任一方面应用，其特征在于，所述应用包括：

(1)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的双特异性抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体和/或权利要求6所述的重组宿主细胞在制备用于检测猴痘病毒的抗体偶联物中的应用；

(2)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的双特异性抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组宿主细胞和/或权利要求7所述的抗体偶联物在制备用于检测猴痘病毒的检测试剂中的应用；

(3)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的双特异性抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组宿主细胞、权利要求7所述的抗体偶联物和/或权利要求8中所述的检测试剂在制备用于检测猴痘病毒的检测产品中的应用；

(4)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的双特异性抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组宿主细胞、权利要求7所述的抗体偶联物和/或权利要求8中所述的检测试剂或检测产品在非诊断和非治疗目的地检测A35R蛋白中的应用；

(5)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的双特异性抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组宿主细胞、权利要求7所述的抗体偶联物和/或权利要求8中所述的检测试剂或检测产品在制备用于诊断猴痘病毒感染性疾病的诊断产品中的应用。