KR20210056398A - 항 인간 심근 트로포닌 i의 항체 및 그 사용 - Google Patents

항 인간 심근 트로포닌 i의 항체 및 그 사용 Download PDF

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펑 추이
쥐창 허
위엔 멍
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광동 페이펭 바이오로지컬 코퍼레이션, 엘티디.
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Abstract

본 발명은 심근 트로포닌 I（cTnI）항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질, 및 상기 결합 단백질의 제조, 사용 등을 제공한다. 상기 항원 결합 도메인은 본문에 한정된 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하거나; 또는 상기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 최소 80％의 서열 동일성을 구비하고 cTnI와 KD ≤ 7.51×10-8 ㏖/ℓ의 친화력을 구비한다. 상기 결합 단백질은 cTnI 단백질의 검출 분야에 사용될 수 있다.

Description

항 인간 심근 트로포닌 I의 항체 및 그 사용
[관련 출원의 교차 인용]
본 발명은 2018년 10월 10일자로 중국 특허청에 제출한 출원번호가 201811183025.4이고 발명의 명칭이 "항 인간 심근 트로포닌 I의 항체 및 그 사용"인 중국 특허출원의 우선권을 주장하며, 그 모든 내용은 참조로서 본 발명에 인용된다.
[기술분야]
본 발명은 생물 기술 및 의학 기술분야에 관한 것으로, 특히 항 인간 심근 트로포닌 I의 항체 및 그 사용에 관한 것이다.
1980년대 이전에 세계보건기구(WHO)는 항상 급성 심근경색증(AMI)의 진단 기준 중 하나로 심근 지모그램 활성을 사용하였다. 1980년대 후반에는 연구자들은 트로포닌(troponin, Tn)의 민감성 및 특이성이 크레아틴 키나아제(CK), 크레아틴 키나아제 동종효소(CK-MB), 젖산 탈수소 효소 및 아스파트산 아미노기 전달효소 등 바이오 마커보다 높다는 것을 발견했다. 심근 트로포닌 I(cTnI)는 심근에만 존재하며 심근 세포의 마커로서 이의 비정상적인 변화는 심장의 이완 및 수축 기능에 영향을 미칠 수 있고, 심근 괴사를 진단하고 심근 손상을 판단하는데 사용할 수 있으며, 심근 세포 손상 민감성 및 특이성이 가장 강한 마커 중 하나로서 AMI 및 급성 코로나 증후군(acute coronary syndromes: ACS)의 신속한 진단, ACS 위험 계층화 지원, 및 예후를 반영하는 공인된 주요한 바이오 마커이다.
정상인의 혈액 내 cTnI 함량은 일반적으로 0.3 ㎍/ℓ 미만이다. 허혈 또는 저산소증으로 인해 심근 세포막의 완전성이 손상되면 유리된 cTnI가 세포막을 빠르게 침투하여 혈류로 들어갈 수 있다. 따라서, 발병 초기에 인간 혈액 내 cTnI 및 그 변화 추세를 신속하고 민감하며 정확하게 측정하는 것은 급성 심근경색증의 진단, 급성 관상동맥 증후군의 위험 계층화 및 다양한 원인으로 초래된 심근 손상 등에 중요한 임상 의의가 있다. cTnI 수준을 검출하는데 사용되는 임상 방법에는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA), 화학 발광, 콜로이드 금 등이 있고, 방법에 따라서는 각자의 장점과 단점이 있지만, 모두 cTnI에 대한 특이적 단일 클론 항체가 필요하다.
기존의 cTnI 항체는 활성이 낮고 친화력이 낮아 cTnI 단백질 검출에 잘 적용할 수 없기 때문에, 효과적이고 특이적으로 결합하여 cTnI를 검출하는 항체가 당 업계에 강하게 요구되고 있다.
본 발명은 새로운 심근 트로포닌 I(cTnI) 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백에 관한 것이고, 상기 결합 단백질의 제조, 사용 등 방면에 대해 연구하였다.
상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열에서 선택되는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하거나, 또는 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 최소 80％의 서열 동일성을 구비하고 cTnI와 KD ≤ 7.51×10-8 ㏖/ℓ의 친화력을 구비하며;
상보성 결정 영역 CDR-VH1은 A-S-X1-Y-T-F-X2-X3-Y-W-M-Y이고,
X1은 G 또는 D, X2는 S 또는 T, X3은 T 또는 S이며;
상보성 결정 영역 CDR-VH2는 Y-X1-N-P-S-X2-G-H-T-X3-Y-N-Q-X4-F-K-D이고,
X1은 I 또는 L, X2는 S 또는 T, X3은 D 또는 E, X4는 R 또는 K이며;
상보성 결정 영역 CDR-VH3은 A-R-X1-Y-X2-G-P-F-X3-M-D이고,
X1은 K 또는 R, X2는 F, Y 또는 W, X3은 G 또는 A이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL1은 S-A-S-X1-X2-V-S-Y-X3-H이고,
X1은 S 또는 T, X2는 T 또는 S, X3은 A 또는 V이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL2는 W-X1-Y-D-X2-S-K-X3-A-S이고,
X1은 I 또는 L, X2는 T 또는 S, X3은 L 또는 I이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-W-S-X2-X3-P-Y-T이고,
X1은 Q 또는 N, X2는 T 또는 S, X3은 Q 또는 N이다.
하나의 중요한 장점은 상기 결합 단백질이 활성이 강하고 인간 cTnI와 아주 높은 친화력을 구비한다는 것이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서,
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X1은 G이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X3은 D이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X3은 G이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X3은 V이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X2는 T이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X1은 Q이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 S, X3은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 S, X3은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 T, X3은 T이고;
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 T, X3은 S이며다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 S, X4는 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 T, X4는 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 S, X4는 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 T, X4는 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 S, X4는 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 T, X4는 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 S, X4는 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 T, X4는 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 F이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 W이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 F이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 W이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 S, X2는 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 S, X2는 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 T, X2는 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 T, X2는 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 I, X3은 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 I, X3은 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 L, X3은 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 L, X3은 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 T, X3은 Q이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 T, X3은 N이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 S, X3은 Q이고;
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 S, X3은 N이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서,각 상보성 결정 영역의 돌연변이 부위는 하기 돌연변이 조합에서 선택되는 어느 하나이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 또는, 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 완전한 항체이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위 중 하나이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 서열번호 1-4로 표시되는 경쇄 프레임워크 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 서열번호 5 내지 8로 표시되는 중쇄 프레임워크 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 항체 불변 영역 서열을 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역 서열에서 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역의 종속 기원은 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 산양, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 싸움닭 또는 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역 기원은 마우스이며;
경쇄 불변 영역 서열은 서열번호 9로 표시되고;
중쇄 불변 영역 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
본 발명은 분리된 핵산을 더 제공하고, 상기 핵산은 상술한 결합 단백질을 암호화한다.
본 발명은 벡터를 더 제공하고, 상기 벡터는 상술한 핵산을 포함한다.
본 발명은 숙주 세포를 더 제공하고, 상기 숙주 세포는 상기 핵산 또는 벡터를 포함한다.
본 발명은 상기 결합 단백질의 제조 방법을 더 제공하고, 이는
배지에서 상술한 숙주 세포를 배양하고, 배지 또는 배양된 숙주 세포로부터 생성된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 급성 심근경색증, 급성 관상동맥증후군, 폐색전증, 불안정 가슴조임증, 심근 손상을 진단하기 위한 진단제 또는 키트 제조중의 상기 결합 단백질의 사용을 더 제공한다.
본 발명의 일 방면에 따르면, 본 발명은 측정 샘플 중의 트로포닌 I 항원의 검출 방법을 더 제공하고, 이는
항체/항원 결합 반응이 발생하기에 충분한 조건에서, 상기 측정 샘플 중의 트로포닌 I 항원과 청구항에서 상술한 결합 단백질을 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계 a); 및
상기 측정 샘플 중 상기 트로포닌 I 항원의 존재를 지시하는 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계 b)를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 트로포닌 I 항원은 심근 트로포닌 I 항원이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 결합 단백질에 결합된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 트로포닌 I 항원 결합에 결합된다.
본 발명의 다른 방면에 따르면, 본 발명은 키트를 더 제공하고, 상기 키트는 상술한 결합 단백질, 상술한 분리된 핵산 또는 상술한 벡터 중 하나 또는 다수를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 키트는 상기 결합 단백질을 표지하기 위한 마커를 더 포함한다.
본 발명은 또한 심근 트로포닌 I 관련 질병의 진단에 있어서의 본문에 따른 결합 단백질의 사용을 더 제공한다.
본 발명은 또한 심근 트로포닌 I 관련 질병의 진단 방법을 더 제공하고, 이는
결합 반응이 발생하기에 충분한 조건에서, 피험자의 샘플과 본 발명에 따른 결합 단백질을 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계 A); 및
결합 반응을 통해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계 B)를 포함하고,
상기 면역 복합체의 존재는 심근 트로포닌 I 관련 질병의 존재를 지시한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 결합 면역 기술에 기반한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 샘플은 전혈, 외주혈, 혈청, 혈장 또는 심근 조직 중 적어도 하나에서 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 피험자는 포유 동물이고, 예를 들면 영장류 동물이며, 예를 들면 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 심근 트로포닌 I 관련 질병은 심혈관 질병이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 심근 트로포닌 I 관련 질병은 급성 심근경색증, 급성 관상동맥증후군, 폐색전증, 불안정 가슴조임증, 심근 손상 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 이하의 본 발명의 일부 실시 형태에 대한 설명 및 그 중에 포함된 실시예의 상세한 내용을 통해 보다 명확해질 것이다.
본 발명을 더 설명하기 전에, 본 발명이 상기 특정 실시형태에 의해 한정되지 않으며 이런 실시형태는 필연적으로 다양하게 구성될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것일 뿐 한정을 위한 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 정해져야 한다.
다른 설명이 없는 한 본 발명에 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가진다. 용어의 의미 및 범위는 명확해야 하지만 잠재적인 불명확성이 존재하는 상황에서 본 발명에 따른 정의는 사전 또는 외래 정의보다 우선적으로 고려되어야 한다. 본원 발명에서 다른 설명이 없는 한 "또는"의 사용은 "및/또는"의 뜻을 가진다. 이밖에, 용어 "포함" 및 다른 형식의 사용은 비한정적이다.
일반적으로, 본문에서 설명된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학 및 이형접합에 사용된 명명법 및 그 기술은 본 기술분야에 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 다른 설명이 없는 한 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 본 기술분야에 공지된 것으로, 다른 일반적이고 더 구체적인 참고문헌의 통상적인 방법으로 진행되며, 상기 참고문헌은 본 명세서 전반에서 인용 및 토론된다. 효소 촉매 반응 및 정제 기술은 제조업체의 명세서, 본 기술분야에서 통상적으로 사용되거나 본문에 따른 방법으로 진행된다. 본문에 설명된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학과 약물 화학에 사용된 명명법, 그 실험실 프로그램 및 기술은 본 기술분야에 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명을 더 잘 이해할 수 있도록, 선택된 용어는 다음과 같이 정의된다.
용어 "아미노산"은 천연적으로 존재하거나 비 천연적으로 존재하는 카복실기 α-아미노산을 의미한다. 용어 "아미노산"은 본원 발명에서 천연적으로 존재하는 아미노산 및 비 천연적으로 존재하는 아미노산을 포함할 수 있다. 천연적으로 존재하는 아미노산은 알라닌(삼알파벳 암호: Ala, 일알파벳 암호: A), 아르기닌(Arg, R), 아스파라긴(Asn, N), 아스파르트산(Asp, D), 시스테인(Cys, c), 글루타민(Gln, Q), 글루타민산(Glu, E), 글리신(Gly, G), 히스티딘(His, H), 아이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 라이신(Lys, K), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 트립토판(Trp, W), 타이로신(Tyr, Y), 및 발린(Val, V)을 포함한다. 비 천연적으로 존재하는 아미노산은 α-아미노아디프산, 아미노부티르산, 시트룰린, 호모시트룰린, 호모류신, 호모아르기닌, 히드록실기프롤린, 노르류신, 피리딜 알라닌, 사르코신 등을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "분리된 결합 단백질"은 유도 기원 또는 유래가 천연적으로 결합되는 성분과 결합되지 않고 상기 천연적으로 조합되는 성분은 그 천연 상태에서 동반되지 않는 단백질을 말하며, 동일한 종의 다른 단백질을 거의 포함하지 않고 상이한 종의 세포에 의해 발현되거나 또는 자연계에 존재하지 않는다. 따라서 화학적으로 합성되거나 또는 그 천연 기원과 다른 세포 계통에서 합성된 단백질이 그 천연적으로 결합되는 성분과 "분리된"다. 또는 분리를 통해, 예를 들면 본 기술분야에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여 단백질이 천연적으로 결합되는 성분을 거의 포함하지 않도록 할 수도 있다.
용어 "항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질"은 CDR 영역을 포함하는 모든 단백질/단백질 단편을 광범위하게 의미한다. "항체"라는 용어는 다중 클론 항체 및 단일 클론 항체, 및 이런 항체의 항원 화합물 결합 단편을 포함하고, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, scFv, 이중특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위, 및 이런 항체 및 단편의 단일 가닥 유도체를 포함한다. 항체의 타입은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD를 선택할 수 있다. 이밖에, "항체"라는 용어는 천연적으로 존재하는 항체 및 비 천연적으로 존재하는 항체를 포함하고, 예를 들면 키메라(chimeric), 이중 기능성(bifunctional) 및 인간화(humanized) 항체, 및 관련된 합성 아이소폼(isoform)를 포함한다. "항체"라는 용어 및 "면역글로불린"은 호환 사용 가능하다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄 아미노기 말단 도메인을 의미한다. 중쇄 가변 도메인은 "VH"라고 할 수 있고 경쇄 가변 도메인은 "VL"라고 할 수 있다. 이런 도메인은 통상적으로 항체의 가장 잘 변할 수 있는 부분으로서, 항원 결합 부위를 포함한다. 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 초가변 영역 및 이를 분리시킨 프레임워크 영역(framework region)이라 불리는 3가지로 구성된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 경쇄 및 중쇄 조합을 구성하는 골격 영역은 CDR에 대해 위치결정 및 정렬 작용을 하고, 상기 CDR는 주로 항원과의 결합을 담당한다.
본문에 사용된 "프레임워크 영역 ", "골격 영역" 또는 "FR"은 항체의 가변 도메인의 제거를 CDR의 그 영역을 제외한 영역으로 정의함을 의미한다. 각 항체의 가변 도메인, 프레임워크 영역은 또한 CDR에 의해 분리된 인접 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 더 세분화될 수 있다.
일반적으로, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VL/VH은 이하 번호의 CDR과 FR이 이하의 조합 배열에 따라 연결되어 획득된 것일 수 있다.
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
본문에 사용된 폴리펩타이드 또는 핵산 관련 용어 "정제된" 또는 "분리된"은 폴리펩타이드 또는 핵산이 천연적인 매질에 존재하거나 천연적인 형식으로 존재하지 않음을 의미한다. 따라서 용어 "분리된"은 그 원시 환경, 예를 들어 천연적으로 존재하면 천연적인 환경에서 추출한 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함한다. 예를 들면, 분리된 폴리펩타이드는 통상적으로 이와 결합되거나 또는 통상적으로 이와 혼합되거나 또는 용액 중의 적어도 일부 단백질 또는 다른 세포 성분을 통상적으로 포함하지 않는다. 분리된 폴리펩타이드는 세포 용해물에 포함된 천연적으로 생성된 상기 폴리펩타이드, 정제 또는 일부 분화된 형식의 상기 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 세포에 의해 발현 또는 분비된 상기 폴리펩타이드, 및 이질 숙주 세포 또는 배양물 중의 상기 폴리펩타이드를 포함한다. 핵산과 관련하여 용어 "분리된" 또는 "정제된"은 예를 들어 상기 핵산이 천연적인 게놈 배경에 존재하지 않음을 의미한다(예를 들면 벡터에서 발현 카세트로서 프로모터에 연결되거나 또는 이질 숙주 세포에 수동으로 인입됨).
본문에 사용된 용어 "이중특이성 항체" 또는 "이중기능성 항체"는 2쌍의 상이한 중/경쇄 및 2개의 상이한 결합 부위를 구비하는 수동으로 이형접합된 결합 단백질을 의미한다. 이중특이성 결합 단백질은 다양한 방법으로 생성될 수 있는데 융합 하이브리도마 또는 Fab' 단편 연결을 포함한다.
본문에 사용된 용어 "서열 동일성"은 적어도 2가지 상이한 서열 사이의 유사성을 의미한다. 이 퍼센트 동일성은 기준 알고리즘을 통해 결정될 수 있고, 예를 들면 블라스트(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST); Needleman 등 알고리즘; 또는 Meyers 등 알고리즘을 사용한다. 하나 또는 다수의 실시형태에서, 한 세트의 파라미터는 Blosum 62 점수 행렬 및 갭 페널티 12, 슬롯 연장 페널티 4, 및 구조 이동 갭 페널티 5일 수 있다. 하나 또는 다수의 실시형태에서, 두 가지 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Meyers 및 Miller((1989)CABIOS 4：11-17) 알고리즘을 통해 결정될 수도 있다. 상기 알고리즘은 이미 ALIGN 프로그램(2.0 버전)에 결합되었고, PAM120 가중 잔기표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용한다. 퍼센트 동일성은 통상적으로 상대적으로 유사한 길이의 서열을 통해 계산한다.
본문에 사용된 용어 "친화력"은 결합 단백질 또는 항체의 항원 결합 도메인과 항원 또는 항원 에피토프의 결합 강도를 의미한다. 친화력은 KD 값으로 평가할 수 있고 KD이 작을 수록 친화력이 크다.
본 발명이 제공하는 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열에서 선택되는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하거나, 또는 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 최소 80％의 서열 동일성을 구비하고 cTnI와 KD ≤ 7.51×10-8 ㏖/ℓ의 친화력을 구비하며;
상보성 결정 영역 CDR-VH1은 A-S-X1-Y-T-F-X2-X3-Y-W-M-Y이고,
X1은 G 또는 D, X2는 S 또는 T, X3은 T 또는 S이며;
상보성 결정 영역 CDR-VH2는 Y-X1-N-P-S-X2-G-H-T-X3-Y-N-Q-X4-F-K-D이고,
X1은 I 또는 L, X2는 S 또는 T, X3은 D 또는 E, X4는 R 또는 K이며;
상보성 결정 영역 CDR-VH3은 A-R-X1-Y-X2-G-P-F-X3-M-D이고,
X1은 K 또는 R, X2는 F, Y 또는 W, X3은 G 또는 A이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL1은 S-A-S-X1-X2-V-S-Y-X3-H이고,
X1은 S 또는 T, X2는 T 또는 S, X3은 A 또는 V이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL2는 W-X1-Y-D-X2-S-K-X3-A-S이고,
X1은 I 또는 L, X2는 T 또는 S, X3은 L 또는 I이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-W-S-X2-X3-P-Y-T이고,
X1은 Q 또는 N, X2는 T 또는 S, X3은 Q 또는 N이다.
본 기술분야에 공지된 바와 같이, 항체의 결합 특이성 및 친화력은 모두 주로 CDR 서열에 의해 결정되고, 성숙되고 공지된 기존의 다양한 기술에 따라 비 CDR 영역의 아미노산 서열을 변화시켜 유사한 생체 활성을 구비하는 변이체를 용이하게 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 결합 단백질의 "기능성 유도체"를 포함할 수도 있다. "기능성 유도체"는 아미노산 교체 변이체를 의미하고, 하나의 기능성 유도체는 검출 가능한 결합 단백질 활성을 보류하고, 바람직하게는 cTnI을 결합할 수 있는 항체의 활성이다. "기능성 유도체"는 "변이체" 및 "단편"을 포함할 수 있고, 이가 본 발명에 따른 결합 단백질과 완전히 같은 CDR 서열을 구비하기에 유사한 생체 활성을 구비한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 항원 결합 도메인과 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역은 최소 50％, 또는 최소 55％, 또는 최소 60％, 또는 최소 65％, 또는 최소 70％, 또는 최소 75％, 또는 최소 80％, 또는 최소 85％, 또는 최소 90％, 또는 최소 91％, 또는 최소 92％, 또는 최소 93％, 또는 최소 94％, 또는 최소 95％, 또는 최소 96％, 또는 최소 97％, 또는 최소 98％, 또는 최소 99％의 서열 동일성을 구비하고 심근 트로포닌 I와 KD ≤ 7.51×10-8 ㏖/ℓ를 구비하고, 예를 들면 4.86×10-8 ㏖/ℓ, 5.15×10-8 ㏖/ℓ, 3.18×10-8 ㏖/ℓ, 1.01×10-9 ㏖/ℓ, 3.70×10-9 ㏖/ℓ, 5.49×10-9 ㏖/ℓ, 7.96×10-9 ㏖/ℓ, 9.53×10-9 ㏖/ℓ, 2.21×10-10 ㏖/ℓ, 5.34×10-10 ㏖/ℓ, 8.13×10-10 ㏖/ℓ, 9.60×10-10 ㏖/ℓ이거나, 또는 2.21×10-10 ㏖/ℓ ≤ KD ≤ 7.51×10-8 ㏖/ℓ이거나, 또는 2.21×10-10 ㏖/ℓ ≤ KD ≤ 9.53×10-9 ㏖/ℓ이거나; 또는 KD가 4.86×10-8 ㏖/ℓ, 5.15×10-8 ㏖/ℓ, 3.18×10-8 ㏖/ℓ, 1.01×10-9 ㏖/ℓ, 3.70×10-9 ㏖/ℓ, 5.49×10-9 ㏖/ℓ, 7.96×10-9 ㏖/ℓ, 9.53×10-9 ㏖/ℓ, 2.21×10-10 ㏖/ℓ, 5.34×10-10 ㏖/ℓ, 8.13×10-10 ㏖/ℓ 또는 9.60×10-10 ㏖/ℓ이하이다.
여기서 친화력은 본 발명의 명세서에 기재된 방법으로 측정된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서,
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X1은 G이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X3은 D이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X3은 G이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X3은 V이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X2는 T이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X1은 Q이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 S, X3은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 S, X3은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 T, X3은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 T, X3은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 S, X4는 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 T, X4는 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 S, X4는 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 T, X4는 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 S, X4는 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 T, X4는 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 S, X4는 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 T, X4는 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 F이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 W이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 F이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 W이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 S, X2는 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 S, X2는 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 T, X2는 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 T, X2는 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 I, X3은 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 I, X3은 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 L, X3은 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 L, X3은 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 T, X3은 Q이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 T, X3은 N이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 S, X3은 Q이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 S, X3은 N이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 각 상보성 결정 영역의 돌연변이 부위는 하기 돌연변이 조합에서 선택되는 어느 하나이다.
Figure pct00003
Figure pct00004
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질에 나타난 6개의 CDR 영역에서 X1은 각각 독립적으로 본 발명에 한정된 아미노산을 의미하고; 본 발명에 따른 결합 단백질에 나타난 6개의 CDR 영역에서 X2는 각각 독립적으로 본 발명에 한정된 아미노산을 의미하며; 본 발명에 따른 결합 단백질에 나타난 6개의 CDR 영역에서 X3은 각각 독립적으로 본 발명에 한정된 아미노산을 의미하고; 본 발명에 따른 결합 단백질에 나타난 6개의 CDR 영역에서 X4는 각각 독립적으로 본 발명에 한정된 아미노산을 의미한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 또는, 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 완전한 항체이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위 중 하나이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 서열번호 1-4로 표시되는 경쇄 프레임워크 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 서열번호 5 내지 8로 표시되는 중쇄 프레임워크 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 항체 불변 영역 서열을 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역 서열에서 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역의 종속 기원은 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 산양, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 싸움닭 또는 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역 기원은 마우스이며;
경쇄 불변 영역 서열은 서열번호 9로 표시되고;
중쇄 불변 영역 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
본 발명은 분리된 핵산을 더 제공하고, 상기 핵산은 상술한 결합 단백질을 암호화한다.
본문에서, 핵산은 그 보존적 치환 변이체(예를 들면 보동의코돈의 치환) 및 상보 서열을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 같은 의미이고, 유전자, cDNA 분자, mRNA 분자 및 이들의 단편, 예를 들면 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 벡터를 더 제공하고, 상기 벡터는 상술한 핵산을 포함한다.
여기서 핵산 서열은 적어도 하나의 조절 서열과 조절 가능하게 연결된다.
조절 가능하게 연결"된다는 것은 서열을 암호화하여 암호화 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열과 연결되는 것을 의미한다. 조절 서열의 선택은 적절한 숙주 세포 중 타깃 단백질의 발현을 유도하기 위한 것이고, 프로모터, 다른 발현 조절 요소를 포함한다.
본문에서, 벡터는 본 발명의 핵산 또는 그 단편을 포함하고 유전 정보를 휴대할 수 있으며 유전 정보를 세포 중의 분자 또는 시약에 전달할 수 있다. 대표적인 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오 파지, 코스미드 및 꼬마염색체를 포함한다. 벡터는 클론 벡터(즉 유전 정보를 세포 중의 벡터에 전달하고 상기 세포를 번식시킬 수 있으며 상기 유전 정보의 존재 또는 비 존재를 선택할 수 있는 세포) 또는 발현 벡터(즉 필요한 유전 요소를 포함하여 상기 벡터의 유전 정보가 세포에서 발현할 수 있도록 하는 벡터)일 수 있다.따라서 클론 벡터는 선택 마커, 및 상기 클론 벡터가 지정하는 세포 타입과 매칭되는 복제 기점을 포함할 수 있고, 발현 벡터는 지정된 표적 세포 중의 발현에 영향을 주는 필수적인 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 핵산 또는 그 단편은 적절한 벡터에 삽입되어 본 발명의 핵산 단편을 휴대하는 클론 벡터 또는 발현 벡터를 형성할 수 있다. 이런 새로운 벡터도 본 발명의 일부분이다. 상기 벡터는 플라스미드, 박테리오 파지, 코스미드, 꼬마염색체 또는 바이러스를 포함할 수 있고, 특정 세포에서만 일과성 발현되는 naked DNA도 포함한다. 본 발명의 클론 벡터 및 발현 벡터는 자발적으로 복제될 수 있기에 추후 클론의 높은 수준의 발현 또는 높은 수준의 복제 목적을 위해 높은 복제 개수를 제공할 수 있다. 발현 벡터는 본 발명의 핵산 단편의 발현을 구동할 수 있는 프로모터, 상기 펩타이드 발현 생성물이 막 내로 분비되거나 통합될 수 있게 하는 신호 펩타이드를 선택적으로 암호화하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 단편, 및 터미네이터를 선택적으로 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터가 생산 균주 또는 세포계에서 조작될 경우, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있거나 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않을 수 있다. 벡터는 일반적으로 복제 부위 및 형질 전환된 세포에서 발현 선택을 제공할 수 있는 마커 서열을 휴대한다.
본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용된다. 이러한 형질 전환된 세포 역시 본 발명의 일부이고, 본 발명의 핵산 단편 및 벡터를 증식시키거나 본 발명의 폴리펩타이드를 재조합적으로 제조하는데 사용되는 배양 세포 또는 세포계일 수 있다. 본 발명의 형질 전환된 세포는 박테리아(예: 대장균, 내생포자 간균 등)와 같은 미생물을 포함한다. 숙주 세포는 또한 진균, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유 동물 세포와 같은 다세포생물 유래 세포, 바람직하게는 CHO 세포와 같은 포유 동물 유래 세포를 포함한다. 형질 전환된 세포는 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 조합을 재조합적으로 제조할 때, 상기 발현 생성물은 배지로 수출되거나 형질 전환된 세포의 표면에 휴대될 수 있다.
본 발명은 상기 결합 단백질의 제조 방법을 더 제공하고, 이는
배지에서 상술한 숙주 세포를 배양하고, 배지 또는 배양된 숙주 세포로부터 생성된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 예를 들면 적어도 일부 결합 단백질을 암호화하는 핵산 벡터를 사용하여 숙주 세포를 트랜스펙션시키고 적절한 조건에서 상기 숙주 세포를 배양하여 이가 상기 결합 단백질을 발현하도록 한다. 숙주 세포는 하나 또는 다수의 발현 벡터를 사용하여 트랜스펙션할 수도 있고, 상기 발현 벡터는 적어도 일부 결합 단백질을 암호화하는 DNA를 단독 또는 결합적으로 포함할 수 있다. 단백질 또는 펩타이드를 정제하는 통상적인 기술을 이용하여 배지 또는 세포 용해물에서 결합 단백질을 분리해낼 수 있고, 상기 기술은 황산암모늄 침전, 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피 등 및/또는 전기영동법을 포함한다.
목적 암호화 및 조절 서열을 포함하는 적합한 벡터의 구축은 본 기술분야에 공지된 표준 연결 및 제한 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 분리된 플라스미드, DNA 서열 또는 합성 올리고뉴클레오타이드는 원하는 형태로 절단, 테일링(tailing) 및 재결합된다. 본 발명의 변이체를 생성하기 위해 임의의 방법이 사용하여 암호화 서열에 돌연변이를 도입할 수 있고, 이러한 돌연변이는 결실 또는 삽입 또는 치환 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 단일 클론 및 다중 클론 항체를 포함하여 cTnI의 타이드프와 반응할 수 있는 항체를 제공한다. 상기 항체는 완전한 결합 단백질, 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 바람직한 항체는 결합 단백질의 전부 또는 일부를 포함한다.
본 발명은 급성 심근경색증, 급성 관상동맥증후군, 폐색전증, 불안정 가슴조임증, 심근 손상을 진단하기 위한 진단제 또는 키트 제조중의 상기 결합 단백질의 사용을 더 제공한다.
본 발명의 일 방면에 따르면, 본 발명은 측정 샘플 중의 트로포닌 I 항원의 검출 방법을 더 제공하고, 이는
항체/항원 결합 반응이 발생하기에 충분한 조건에서, 상기 측정 샘플 중의 트로포닌 I 항원과 청구항에서 상술한 결합 단백질을 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계 a); 및
상기 측정 샘플 중 상기 트로포닌 I 항원의 존재를 지시하는 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계 b)를 포함한다.
본 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 상기 복합체의 검출이 용이하도록 신호 강도를 나타내는 지시제(indicator)로 표지될 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 트로포닌 I 항원은 심근 트로포닌 I 항원이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 결합 단백질에 결합되며;
본 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 제1 항체의 형식으로 상기 제2 항체와 항체 쌍(antibody pair)을 형성하여 cTnI의 상이한 항원 에피토프를 결합하고;
상기 제2 항체는 상기 복합체의 검출이 용이하도록 신호 강도를 나타내는 지시제로 표지될 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 트로포닌 I 항원 결합에 결합된다.
본 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 상기 제2 항체의 항원으로서, 상기 제2 항체는 상기 복합체의 검출이 용이하도록 신호 강도를 나타내는 지시제로 표지될 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 신호 강도를 의미하는 지시제는 형광물질, 양자점, 디곡시제닌 표지 프로브, 비오틴, 방사성 동위원소, 방사성 조영제, 상자성 이온 형광 마이크로스피어, 전자 밀도 물질, 화학 발광 마커, 초음파 조영제, 광민감제, 콜로이드 금 또는 효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 형광물질은 Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 555, Alexa 647, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-카복시-4', 5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로 플루오레세인, 5-카복시 플루오레세인, 5-카복시 로다민, 6-카복시 로다민, 6-카복시 테트라메틸 로다민, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, 단실 클로라이드, 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD(7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green514, Pacific Blue, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레졸 퍼플, 크레실 블루 퍼플, 브릴리언트 크레실 블루, 파라아미노벤조산, 에리트로신, 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 석시닐 플루오레세인, 희토류 금속 크립테이트, 트라이-2-피리딜 다이아민 유로퓸, 유로퓸 크립테이트 또는 킬레이트, 디아민, 안토시아닌, La Jolla 블루 염료, 알로피코시아닌, allococyanin B, 피코시아닌 C, 피코시아닌 R, 티아민, Phycoyanin, phycoerythrin R, REG, 로다민 그린, 로다민 아이소티오시아네이트, 로다민 레드, ROX, TAMRA, TET, TRIT(테트라메틸 로다민 아이소머캅탄), 테트라메틸 로다민 및 텍사스 레드 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방사성 동위원소는 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb 및 83Sr 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 효소는 겨자무과산화효소, 알칼리인산분해효소 및 글루코스산화효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 형광 마이크로스피어는 폴리스티렌 형광 마이크로스피어이고, 내부에는 희토류 형광 이온 유로퓸이 피복된다.
본 발명의 다른 방면에 따르면, 본 발명은 키트를 더 제공하고, 상기 키트는 상술한 결합 단백질, 상술한 분리된 핵산 또는 상술한 벡터 중 하나 또는 다수를 포함한다.
바람직하게는 상기 키트는 상기 결합 단백질을 표지하기 위한 마커를 더 포함한다.
본 해결수단에서, 본 발명은 예를 들면 심근 세포 감염 피험자의 트로포닌 I을 결정하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 적어도 하나의 본 발명이 제공하는 결합 단백질, 관련 완충제, 액체 샘플와 상기 결합 단백질을 반응시키기 위해 필요한 시약, 및 트로포닌 I 및 결합 단백질 사이에 양성 또는 음성 결합 반응이 존재하는지를 결정하기 위한 시약을 포함한다. 트로포닌 I의 존재를 결정하기 위해, 상기 키트는 예를 들면 표지된 결합 단백질을 항체로 이용하고, 상기 표지는 임의의 적절한 표지일 수 있고 예를 들면 콜로이드 금 표지이다.
본 발명은 또한 심근 트로포닌 I 관련 질병의 진단에 있어서의 본문에 따른 결합 단백질의 사용을 더 제공한다.
본문에 사용된 용어 "심근 트로포닌 I 관련 질병"은 단백질 또는 암호화 핵산을 포함하는 심근 트로포닌 I을 마커로 사용하는 질병을 의미한다. 특히, 본 발명의 하나 또는 다수의 실시형태에서 심근 트로포닌 I 관련 질병은 혈액 중 심근 트로포닌 I 수준의 상승을 특징으로 하는 질병이다. 특히, 본 발명의 하나 또는 다수의 실시형태에서 심근 트로포닌 I 관련 질병은 심근 조직 또는 심근 세포에서 심근 트로포닌 I 수준의 하강을 특징으로 하는 질병이다.
본 발명은 또한 심근 트로포닌 I 관련 질병의 진단 방법을 더 제공하고, 이는
결합 반응이 발생하기에 충분한 조건에서, 피험자의 샘플과 본 발명에 따른 결합 단백질을 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계 A); 및
결합 반응을 통해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계 B)를 포함하고,
상기 면역 복합체의 존재는 심근 트로포닌 I 관련 질병의 존재를 지시한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 결합 면역 기술에 기반한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 샘플은 전혈, 외주혈, 혈청, 혈장 또는 심근 조직 중 적어도 하나에서 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 피험자는 포유 동물이고, 예를 들면 영장류 동물이며, 예를 들면 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 심근 트로포닌 I 관련 질병은 심혈관 질병이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 심근 트로포닌 I 관련 질병은 급성 심근경색증, 급성 관상동맥증후군, 폐색전증, 불안정 가슴조임증, 심근 손상 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
이하, 일부 실시예를 통해 본 발명을 예시적으로 설명하나 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서 제한 내부핵산 가수분해 효소와 Prime Star DNA 중합 효소는 Takara Company에서 구입하였다. MagExtractor-RNA 추출 키트는 TOY0B0 Company에서 구입하였다. SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit 키트는 Takara Company에서 구입하였다. pMD-18T 벡터는 Takara Company에서 구입하였다. 플라스미드 추출 키트는 Tiangen Company에서 구입하였다. 프라이머 합성 및 유전자 시퀀싱은 Invitrogen Company에서 완성하였다. Anti-cTnI 7B9 단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주는 본 출원인이 가지고 있던 하이브리도마 세포주이며 사용을 위해 해동하여 배양하였다.
1. 프라이머
증폭 중쇄 및 경쇄 5'RACE 프라이머:
SMARTER II A 올리고뉴클레오타이드:
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX-3';
5'-RACE CDS 프라이머 (5'-CDS): 5'-(T)　25 VN-3'(N＝A, C, G 또는 T; V＝A, G 또는 C);
범용 프라이머 A 혼합물(UPM):
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';
nested 범용 프라이머 A(NUP): 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';
mIg-KR: 5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT-3';
mIg-HR: 5'-TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC-3'.
2. 항체 가변 영역 유전자 클론 및 시퀀싱
Anti-cTnI 7B9 단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주에서 RNA를 추출하고, SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit 키트 및 키트 중 SMARTER II A 올리고뉴클레오타이드 및 5'-CDS 프라이머를 사용하여 제1 사슬 cDNA 합성을 진행하여 제1 사슬 cDNA 생성물을 얻어 PCR 증폭 탬플릿으로 한다. 경쇄 유전자는 범용 프라이머 A 혼합물(UPM), nested 범용 프라이머 A(NUP) 및 mIg-KR 프라이머로 증폭을 진행하고, 중쇄 유전자는 범용 프라이머 A 혼합물(UPM), nested 범용 프라이머 A(NUP) 및 mIg-HR 프라이머로 증폭을 진행한다. 여기서 경쇄 프라이머 쌍은 0.7 KB 정도의 목표 밴드를 증폭해내고, 중쇄 프라이머 쌍은 1.4 KB 정도의 목표 밴드를 증폭해낸다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 정제 및 회수하고, 생성물은 rTaq DNA 중합 효소로 A 추가 반응을 진행한 후 pMD-18T 벡터에 삽입하고, DH5α 컴피턴트 세포에 형질 전환시키며, 군락이 형성된 후 중쇄 및 경쇄 유전자 클론에서 클론을 각각 4개씩 취하여 Invitrogen Company에 보내 시퀀싱을 진행하였다.
3. Anti-cTnI 7B9 항체 가변 영역 유전자의 서열 분석
상기 시퀀싱을 통해 얻은 유전자 서열을 IMGT 항체 데이터 베이스에 넣고 분석을 진행하며, VNTI11.5 소프트웨어를 사용하여 분석을 진행하여 중쇄 및 경쇄 프라이머 쌍이 증폭해낸 유전자가 모두 정확한 것임을 결정하였다. 여기서 경쇄이 증폭해낸 유전자 단편에서 VL 유전자 서열은 321 bp로서 VkII 유전자 가족에 속하고, 그 앞에는 57 bp의 선도 펩타이드 서열이 있으며; 중쇄 프라이머 쌍이 증폭해낸 유전자 단편에서 VH 유전자 서열은 357 bp로서 VH1 유전자 가족에 속하고, 그 앞에는 57 bp의 선도 펩타이드 서열이 있다.
4. 재조합 항체 발현 플라스미드의 구축
pcDNATM 3.4　 TOPO® 벡터는 구축된 재조합 항체 진핵 발현 벡터이고, 상기 발현 벡터는 이미 HindIII, BamHI, EcoRI 등 다중 클론 효소 절단 부위에 인입되었으며, pcDNA 3.4A 발현 벡터로 명명하였고 이하에서 3.4A 발현 벡터로 약칭한다. 상기 pMD-18T 중 항체 유전자 시퀀싱 결과에 따라, Anti-cTnI 7B9 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자 특이성 프라이머를 설계하고, 양단은 각각 HindIII, EcoRI 효소 절단 부위 및 보호 염기를 포함하며, 프라이머는 다음와 같다.
cTnI-7B9-HF: 5'-CCCAAGCTTATGGAATGCAGCTGTGTCATGCTCTTCTTC-3';
cTnI-7B9-HR: 5'-CCCGAATTCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC-3';
cTnI-7B9-LF: 5'-CCCAAGCTTATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGG-3';
cTnI-7B9-LR: 5'-CCCGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA-3'.
PCR 증폭 방법을 통해 0.72 KB의 경쇄 유전자 단편 및 1.4 KB의 중쇄 유전자 단편을 증폭해낸다. 중쇄 및 경쇄 유전자 단편은 각각 HindIII/EcoRI 2중 효소 절단을 사용하고, 3.4A 벡터는 HindIII/EcoRI 이중 효소 절단을 사용하며, 단편 및 벡터를 정제 및 회수 후 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 각각 3.4A 발현 벡터에 연결하여, 각각 중쇄 및 경쇄 재조합 발현 플라스미드를 얻는다.
5. 안정적인 세포주 선별
5.1 초순수를 사용하여 플라스미드를 400 ng/㎖로 희석하고, 조절 CHO 세포1.43×107 세포/㎖를 원심분리관에 넣은 후 100㎕ 플라스미드와 700㎕ 세포를 혼합하고 전기 회전 용기에 넣고 전기 회전시킨다. 3, 5, 7일째에 샘플을 취하여 계수하고 7일째에 샘플을 수집하여 검출한다.
코팅 용액으로 상응한 항원을 지정된 농도로 희석하되 웰당 100㎕이고 4 ℃에서 하룻밤 동안 희석한다. 다음날 세척 용액으로 2회 세척하고 두드려 건조시킨 다음 차단 용액(20% BSA + 80% PBS)을 첨가하되 웰당 120㎕, 37℃, 1 시간이고, 두드려 건조시킨다. 희석된 세포 상청액을 첨가하되, 100㎕/웰, 37℃, 30분(부분 상청액 1시간)이며; 세척 용액으로 5회 세척하고 두드려 건조시킨다. 양 항 마우스 IgG-HRP를 첨가하되, 웰당 100㎕, 37℃, 30분이고; 세척 용액으로 5회 세척하고 두드려 건조시킨다. 발색 용액 A(50 ㎕/웰)를 첨가하고 발색 용액 B(50 ㎕/웰)를 첨가하되, 10분간 첨가한다. 정지 용액을 첨가하되, 50 ㎕/웰이고; 마이크로 플레이트 리더에서 450㎚(기준 630㎚)에서 0D 값을 읽는다. 표준품 농도와 OD 값을 표준 곡선으로 하여 세포 상층액의 항체 함량을 계산한다.
5.2 재조합 항체 발현 플라스미드 선형화
이하 시약을 준비한다: Buffer 50㎕, DNA 100 ㎍/튜브, Puv° 효소 10㎕. 멸균수를 500㎕까지 보충하고 37℃ 수욕에서 효소 절단하고 하룻밤 지새운다. 먼저 같은 부피의 페놀/클로로포름/아이소아밀 알코올(하층) 25:24:1을 사용하고, 다음 클로로포름(수상)을 사용하여 순차적으로 추출한다. 0.1배 부피(수상) 3M 탄산 나트륨 및 2배 부피 에탄올을 얼음에 침전시키고, 70％ 에탄올로 침전물을 헹구어 유기 용매를 제거하, 에탄올이 완전히 휘발되기를 기다려 적절한 멸균수로 재용해시키고 마지막으로 농도를 측정하였다.
재조합 항체 발현 플라스미드는 안정적으로 형질 감염되었고 가압 조건에서 안정적인 세포주를 선별하였다.
초순수를 사용하여 플라스미드를 400 ng/㎖로 희석하고, 조절 CHO 세포 1.43×107 세포/㎖를 원심분리관에 넣은 후 100㎕ 플라스미드와 700㎕ 세포를 혼합하고 전기 회전 용기에 넣고 전기 회전 시킨 후 다음날 계수한다. 25 μ㏖/ℓ MSX 96웰에서 가압 조건에서 약 25일간 배양한다.
현미경으로 표지된 세포가 있는 클론 웰을 관찰하고 컨플루언스를 기록한다. 배양 상층액을 취하여 샘플을 보내 검출한다. 항체 농도, 상대 농도가 높은 세포주를 선택하여 24 웰로 옮기고 약 3일 후 6 웰로 옮긴다. 3일 후 회분 배양을 유지하고 세포 밀도를 0.5×106 세포/㎖로 조절하고 2.2㎖를 회분 배양하며 세포 밀도 0.3×106 세포/㎖로 조절하고 2㎖를 보존(breeds conservation)하며, 6웰에서 7일간 회분 배양한 상청을 보내 검출하고, 항체 농도 및 세포 직경이 작은 세포주를 선택하여 TPP로 옮겨 보존 및 계대 배양한다.
6. 재조합 항체 생산
6.1 세포 확대 배양
세포를 해당시킨 후 먼저 125㎖ 쉐이크 플라스크에서 배양하고, 접종 부피는 30㎖, 배지는 100% Dynamis 배지이며 회전 속도 120 r/min, 온도 37℃, 이산화탄소 함량 8%의 쉐이킹 테이블에 넣는다. 72 시간 동안 배양하고, 접종 밀도 500,000 세포/㎖로 확장 접종하고, 확장 배양 부피는 생산 요구 사항에 따라 계산하며 배지는 100% Dynamis 배지이다. 그 후 72 시간마다 1번씩 확장 배양한다. 세포량이 생산 요구 사항을 충족하면 생산을 위해 접종 밀도를 약 500,000 세포/㎖로 엄격하게 제어한다.
6.2 쉐이크 플라스크 생산 및 정제
쉐이크 플라스크 파라미터: 회전 속도 120 r/min, 온도 37℃, 이산화탄소 함량 8%. 유가식　배양: 쉐이크 플라스크에서 72 시간까지 배양한 후 매일 공급한다. HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a는 매일 초기 배양 부피의 3%를 공급하고 Feed 7b는 초기 배양 부피의 0.1%을 공급하며 이렇게 12일째까지 공급한다(12번째 날 공급). 6 일째에 포도당을 3g/ℓ로 보충하였다. 샘플은 13일째에 수집하였다. proteinA 친화성 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 친화성 정제를 진행하였다. 정제 후 500 mg의 재조합 항체를 얻고 4㎍의 정제된 항체를 취하여 환원 SDS-PAGE에 적용하였다. 환원 SDS-PAGE 후에 2 개의 밴드가 나타났는데, 하나는 약 25 KD의 경쇄(서열번호 11로 표시된 서열)이고 다른 하나는 약 50 KD의 중쇄(서열번호 12로 표시된 서열)였다.
실시예 2
실시예 1에서 얻은 샘플 1의 항체(서열번호 11 및 12로 표시되는 서열을 구비하는 경쇄 및 중쇄)는 비록 cTnI 단백질에 결합하는 능력을 구비하지만, 친화력 및 항체 활성이 이상적이지 못하다. 따라서 출원인은 상기 항체의 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR에 돌연변이시켰다.
분석 결과, 중쇄 상보성 결정 영역(WT):
CDR-VH1은 A-S-D(X1)-Y-T-F-S(X2)-T(X3)-Y-W-M-Y;
CDR-VH2는 Y-L(X1)-N-P-S-S(X2)-G-H-T-E(X3)-Y-N-Q-R(X4)-F-K-D;
CDR-VH3은 A-R-K(X1)-Y-F(X2)-G-P-F-A(X3)-M-D;
경쇄 상보성 결정 영역:
CDR-VL1은 S-A-S-T(X1)-T(X2)-V-S-Y-A(X3)-H;
CDR-VL2는 W-L(X1)-Y-D-S(X2)-S-K-I(X3)-A-S;
CDR-VL3은 Q-N(X1)-W-S-T(X2)-Q(X3)-P-Y-T;
여기서 X1, X2, X3, X4는 모두 돌연변이 부위이다.
Figure pct00005
돌연변이 후 항체 활성을 측정하고, 코팅 용액으로 양 항 마우스 IgG를 1㎍/㎖로 희석하고 마이크로플레이트 코팅을 진행하며 웰당 100㎕이고 4℃에서 하룻밤 지새운다. 다음날 세척 용액으로 2회 세척하고 두드려 건조시킨 다음 차단 용액(20% BSA + 80% PBS)을 첨가하되 웰당 120㎕, 37℃, 1시간이고, 두드려 건조시킨다. 희석된 cTnI 단일 클론 항체를 첨가하되, 100㎕/웰, 37℃, 60분이다. 플레이트 내의 액체를 털어버리고 두드려 건조하며 20% 마우스 음성 혈액을 첨가하여 차단하고 웰당 120㎕, 37℃, 1시간이다. 플레이트 내의 액체를 털어버리고 두드려 건조하며 희석된 cTnI 항원(0.15㎍/㎖)을 첨가하되, 웰당 100㎕, 37℃, 40분이다. 세척 용액으로 5회 세척하고 두드려 건조시킨다. HRP 표지된 다른 하나의 cTnI 단일 클론 항체(1:5K)를 첨가하되, 웰당 100㎕, 37℃,30 분이다. 발색 용액 A(50 ㎕/웰)을 첨가하고 발색 용액 B(50 ㎕/웰)을 첨가하되, 10 분간 첨가한다. 정지 용액을 첨가하되, 50 ㎕/웰이고; 마이크로 플레이트 리더에서 450㎚(기준 630㎚)에서 0D 값을 읽는다.
일부 결과는 다음과 같다.
Figure pct00006
친화력 분석
AMC 센서를 사용하여 정제된 항체를 PBST로 10㎍/㎖로 희석하고, cTnI 품질 관리 재조합 단백질(회사 자체 생산 재조합 항원)을 PBST로 기울기 희석한다. 769.2 n㏖/㎖, 384.6 n㏖/㎖, 192.3 n㏖/㎖, 96.2 n㏖/㎖, 48.1 n㏖/㎖, 24 n㏖/㎖, 12 n㏖/㎖, 0 n㏖/㎖.
실행 과정: 완충 용액 1(PBST)에서 60초 동안 평형화하고, 항체 용액에서 300초 동안 항체 고형화를 진행하며, 완충 용액 2(PBST)에서 180초 동안 인큐베이션하고, 항원 용액에서 420초 동안 결합하고, 완충 용액 2에서 1200초 동안 해리하며, 10Mm pH 1.69 GLY 용액과 완충 용액 3을 사용하여 센서 재생을 수행하고 데이터를 출력한다.
KD는 평형 해리 상수 즉 친화력을 의미하고, Kon은 결합 속도, Kdis는 해리 속도를 나타낸다.
Figure pct00007
표 2 및 표 3을 참조하면, 돌연변이 1의 활성 효과 및 친화력이 가장 좋기에 돌연변이 1을 역가가 좋은 돌연변이 부위를 선별하기 위한 백본 서열로 사용한다(선별을 거쳐 얻은 항체 활성이 돌연변이 1과 근접하도록 보장하고 항체 활성 ±10％). 일부 결과는 다음과 같다.
Figure pct00008
Figure pct00009
친화력 분석 방법은 위와 같고 결과는 표 5와 같다.
Figure pct00010
Figure pct00011
표 5를 참조하면, 표 4에 열거된 돌연변이 부위가 항체의 친화력에 대한 영향이 크지 않다.
상기 결과를 검증하기 위해, WT를 백본 서열로 하여 상기 실험을 반복하여 돌연변이 부위의 친화력을 검증하였고 일부 결과는 다음과 같다.
Figure pct00012
Figure pct00013
표 6 및 표 7를 분석하면 WT 기반 돌연변이 항체도 일정한 친화력을 구비한다.
마지막으로 설명할 것은, 이상의 실시예는 본 발명의 과제의 해결 수단을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명에 대한 한정이 아니다. 비록 전술한 각 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하였으나, 당업자는 전술한 각 실시예에 기재된 과제의 해결 수단을 수정하거나 그중의 일부 또는 전부 기술특징에 대해 등가 대체가 가능하며, 이런 수정 또는 대체는 상응한 과제의 해결 수단의 본질이 본 발명의 각 실시예의 과제의 해결 수단의 범위를 벗어나지 않음을 이해할 것이다.
본 발명이 제공하는 심근 트로포닌 I와 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질은 특정 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함한다. 상기 결합 단백질은 심근 트로포닌 I 단백질에 특이적으로 인식하고 결합할 수 있어, 높은 민감도 및 특이성을 구비하며, 특히 상기 결합 단백질은 인간 cTnI 단백질과 아주 높은 친화력을 구비한다. 따라서 심근 트로포닌 I 관련 질병의 검출 및 진단에 사용될 수 있다.
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200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 11 <211> 213 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Glu Ile Phe Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Thr Thr Val Ser Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Leu Tyr 35 40 45 Asp Ser Ser Lys Ile Ala Ser Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Trp Ser Thr Gln Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 12 <211> 443 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Phe Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Leu Asn Pro Ser Ser Gly His Thr Glu Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Tyr Phe Gly Pro Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys 210 215 220 Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 260 265 270 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 290 295 300 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 305 310 315 320 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 325 330 335 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 340 345 350 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe 355 360 365 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 370 375 380 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 385 390 395 400 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 405 410 415 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 420 425 430 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440

Claims (18)

  1. 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질로서,
    상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열에서 선택되는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하거나, 또는 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 최소 80％의 서열 동일성을 구비하고 cTnI와 KD ≤ 7.51×10-8 ㏖/ℓ의 친화력을 구비하며;
    상보성 결정 영역 CDR-VH1은 A-S-X1-Y-T-F-X2-X3-Y-W-M-Y이고,
    X1은 G 또는 D, X2는 S 또는 T, X3은 T 또는 S이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VH2는 Y-X1-N-P-S-X2-G-H-T-X3-Y-N-Q-X4-F-K-D이고,
    X1은 I 또는 L, X2는 S 또는 T, X3은 D 또는 E, X4는 R 또는 K이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VH3은 A-R-X1-Y-X2-G-P-F-X3-M-D이고,
    X1은 K 또는 R, X2는 F, Y 또는 W, X3은 G 또는 A이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VL1은 S-A-S-X1-X2-V-S-Y-X3-H이고,
    X1은 S 또는 T, X2는 T 또는 S, X3은 A 또는 V이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VL2는 W-X1-Y-D-X2-S-K-X3-A-S이고,
    X1은 I 또는 L, X2는 T 또는 S, X3은 L 또는 I이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-W-S-X2-X3-P-Y-T이고,
    X1은 Q 또는 N, X2는 T 또는 S, X3은 Q 또는 N인 것을 특징으로 하는 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X1은 G이고;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X3은 D이며;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X3은 G이고;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X3은 V이며;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X2는 T이고;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X1은 Q이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 S, X3은 T이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 S, X3은 S이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 T, X3은 T이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서 X2는 T, X3은 S이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 S, X4는 R이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 T, X4는 R이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 S, X4는 K이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 I, X2는 T, X4는 K이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 S, X4는 R이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 T, X4는 R이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 S, X4는 K이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서 X1은 L, X2는 T, X4는 K이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 F이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 Y이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 K, X2는 W이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 F이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 Y이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서 X1은 R, X2는 W이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 S, X2는 T이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 S, X2는 S이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 T, X2는 T이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서 X1은 T, X2는 S이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 I, X3은 L이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 I, X3은 I이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 L, X3은 L이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서 X1은 L, X3은 I이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 T, X3은 Q이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 T, X3은 N이며;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 S, X3은 Q이고;
    또한, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서 X2는 S, X3은 N이며;
    바람직하게는, 각 상보성 결정 영역의 돌연변이 부위는 하기 돌연변이 조합에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 결합 단백질:
    Figure pct00014

    Figure pct00015
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 또는, 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함하고;
    또한, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위 중 하나이며;
    또한, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 서열번호 1-4로 표시되는 경쇄 프레임워크 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 서열번호 5 내지 8로 표시되는 중쇄 프레임워크 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    항체 불변 영역 서열을 더 포함하고;
    또한, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역 서열에서 선택되며;
    또한, 상기 불변 영역의 종속 기원은 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 산양, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 싸움닭 또는 인간이고;
    또한, 상기 불변 영역 기원은 마우스이며;
    경쇄 불변 영역 서열은 서열번호 9로 표시되고;
    중쇄 불변 영역 서열은 서열번호 10으로 표시되는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  5. 분리된 핵산에 있어서,
    상기 핵산은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  6. 제5항에 따른 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제5항에 따른 핵산 또는 제6항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 제조 방법에 있어서,
    배지에서 제7항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 배지 또는 배양된 숙주 세포로부터 생성된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질의 제조 방법.
  9. 급성 심근경색증, 급성 관상동맥증후군, 폐색전증, 불안정 가슴조임증, 심근 손상을 진단하기 위한 진단제 또는 키트 제조중의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 사용.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질, 제5항에 따른 분리된 핵산 또는 제6항에 따른 벡터 중 하나 또는 다수를 포함하고;
    바람직하게는 상기 결합 단백질을 표지하기 위한 마커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 측정 샘플 중의 트로포닌 I 항원의 검출 방법에 있어서,
    항체/항원 결합 반응이 발생하기에 충분한 조건에서, 상기 측정 샘플 중의 트로포닌 I 항원과 제3항에 따른 결합 단백질을 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계 a); 및
    상기 측정 샘플 중 상기 트로포닌 I 항원의 존재를 지시하는 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계 b)를 포함하고,
    바람직하게는, 상기 면역 복합체는 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 결합 단백질에 결합되며;
    바람직하게는, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 트로포닌 I 항원 결합에 결합되며;
    바람직하게는, 상기 트로포닌 I 항원은 심근 트로포닌 I 항원인 것을 특징으로 하는 측정 샘플 중의 트로포닌 I 항원의 검출 방법.
  12. 심근 트로포닌 I 관련 질병의 진단에 있어서의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 사용.
  13. 심근 트로포닌 I 관련 질병의 진단 방법에 있어서,
    결합 반응이 발생하기에 충분한 조건에서, 피험자의 샘플과 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계 A); 및
    결합 반응을 통해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계 B)를 포함하고,
    상기 면역 복합체의 존재는 심근 트로포닌 I 관련 질병의 존재를 지시하는 것을 특징으로 하는 심근 트로포닌 I 관련 질병의 진단 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 결합 면역 기술에 기반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 샘플은 전혈, 외주혈, 혈청, 혈장 또는 심근 조직 중 적어도 하나에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자는 포유 동물이고, 바람직하게는 영장류 동물이며, 보다 바람직하게는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제12항에 따른 사용 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서,
    상기 심근 트로포닌 I 관련 질병은 심혈관 질병인 것을 특징으로 하는 사용 또는 방법.
  18. 제12항에 따른 사용 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서,
    상기 심근 트로포닌 I 관련 질병은 급성 심근경색증, 급성 관상동맥증후군, 폐색전증, 불안정 가슴조임증, 심근 손상 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 사용 또는 방법.
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