CN112707964B

CN112707964B - 一种抗n末端脑钠肽前体的重组抗体

Info

Publication number: CN112707964B
Application number: CN201911020416.9A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏; 何志强; 孟媛; 钟冬梅; 叶庆妮; 覃婷; 游辉; 王晨
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN112707964A

Abstract

本发明涉及一种包含N末端脑钠肽前体抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。所述结合蛋白活性强，与人N末端脑钠肽前体蛋白具有很高的亲和力，可广泛应用于N末端脑钠肽前体蛋白的检测领域。

Description

一种抗N末端脑钠肽前体的重组抗体

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及一种抗N末端脑钠肽前体的重组抗体。

背景技术

1988年日本学者Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强有力的利尿、扩血管和降压作用的多肽，将其命名为脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)。BNP分布在心脏含量最高，但心肌细胞首先合成的是含有108个氨基酸的proBNP(BNP前体)，当心肌细胞受到刺激后，proBNP在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、具有活性的B型利钠肽(BNP)，两者来源相同并且等摩尔分泌释放进入血循环。

当心脏容量负荷增加或心脏功能受损时，N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)与BNP的指标浓度会异常升高，其中NT-proBNP相对BNP生物稳定性较好，半衰期较长(120min)，浓度相对较稳定，有效检测时间长，血液中含量相对比BNP高约16～20倍，因此检测相对容易，并且血浆标本在体外的稳定性长(>48h)，是诊断心力衰竭和评价心脏功能的最佳心肌标志物。

正常的人血液中NT-proBNP含量一般低于0.3ng/mL。当心脏功能受损，心肌扩张时，NT-proBNP会快速合成并大量分泌释放进入到人体血液中。在发现一些相关早期病症的时候，准确、灵敏、高效稳定地测定血液中NT-proBNP的量，能给早期心功能不全、心衰、呼吸困难的心源性及非心源性心衰治疗及预后监测、急性冠状动脉综合征的分级等方面提供快速、准确的早期诊断依据。目前用于检NT-proBNP含量的方法主要有金标定性试验、荧光免疫法、酶联免疫吸附试验(ELISA)和磁微粒化学发光法(CMIA)，但是这些测量方法都需要针对于NT-proBNP的特异性单克隆抗体，而传统的临床诊断使用的都是鼠源的单克隆抗体。

长期以来，杂交瘤技术生产的鼠单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗。但由于杂交瘤方式生产采用小鼠腹腔诱生，受小鼠个体影响特别大，生产不稳定、批间差大、含小鼠自身抗体纯化难度大，而本发明涉及的重组抗体采用重组抗体技术，可完全解决上述问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种新颖的包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。

其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性，且与NT-proBNP具有K_D≤9.63E-9mol/L的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-X2-S-X3-Y-T-M-S，其中，

X1是F或A，X2是L、V或I，X3是R或K；

互补决定区CDR-VH2为X1-I-X2-S-G-X3-G-N-T-X4-Y-P-D-S-V-K-G，其中，

X1是L、V或I，X2是T或S，X3是N或GG，X4是F或A；

互补决定区CDR-VH3为S-X1-Y-X2-Y-D-G-X3-W-F-A，其中，X1是K或R，X2是F、A或G，X3是F或A；

互补决定区CDR-VL1为R-S-X1-K-S-L-X2-H-S-X3-G-N-T-Y-X4-L-Y，其中，

X1是Q、N、R或K，X2是I或L，X3是Q或N，X4是I、V或L；

互补决定区CDR-VL2为R-M-X1-N-X2-A-S，其中，

X1是T或S，X2是L、V或I；

互补决定区CDR-VL3为M-Q-X1-L-E-X2-P-L-X3，其中，

X1是Q、H或N，X2是W、Y或F，X3是S或T。

一个重要优点在于，所述结合蛋白活性强，与NT-proBNP具有很高的亲和力，适用于NT-proBNP的含量检测，特别是人NT-proBNP的含量检测。同时本发明通过重组方式得到的结合蛋白个体差异小、批间差异小、质量稳定，更利于其质量控制和检测稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例1中抗NT-proBNP的单克隆抗体电泳图。

具体实施方式

本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。

在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。

术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的梭基α-氨基酸。术语“氨基酸”用在本申请中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密码：A1a，单字母密码：A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，c)，谷氨酰胺(G1n，Q)，谷氨酸(G1u，E)，甘氨酸(G1y，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(I1e，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，和缬氨酸(Va1，V)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羟基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。

术语“分离的结合蛋白”是这样的蛋白，其由于衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的蛋白将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含大然结合的组分。

术语“包括抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)₂、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

尽管Fv片段的2个结构域(VL和VH)由单独的基因编码，使用重组方法，通过合成的连接物可以连接它们，所述连接物使它们能够制成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)，“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，在有些实施方案中，所述Fv多肽另外包含在VH和VL结构域之间的多肽连接物，其使sFv能够形成抗原结合所希望的结构。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

当在本文中使用时，“骨架”、“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

本发明中使用的术语“亲和力”表示2种试剂的可逆结合的平衡常数，并表示为KD。结合蛋白对配体的亲和力(诸如抗体对表位的亲和力)可以是，例如，约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)或约100nM至约1飞摩尔(fM)。本文使用的术语“亲合力”表示，2种或更多种试剂的复合物在稀释以后对解离的抵抗力。通过诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的任意其它技术等方法，可以测定表观亲和力。

本发明中使用的术语“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性和同一性中的每一个可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列为了比较目的而进行比对。当所比较的序列中的等同位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在此位置是相同的；当等同位置被相同或相似氨基酸残基(例如在空间和/或电子性质方面相似的)占据时，则所述分子可称作在此位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性的百分比表示是指，在所比较的序列共有的位置处的相同或相似的氨基酸的数目的函数。在比较两个序列中，残基(氨基酸或核酸)的缺失或额外残基的存在，也会降低同一性和同源性/相似性。

本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与NT-proBNP具有KD≤9.63E-9mol/L的亲和力；

或者1.02E-10mol/L≤K_D≤9.63E-9mol/L；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-X2-S-X3-Y-T-M-S，其中，

X1是F或A，X2是L、V或I，X3是R或K；

互补决定区CDR-VH2为X1-I-X2-S-G-X3-G-N-T-X4-Y-P-D-S-V-K-G，其中，

X1是L、V或I，X2是T或S，X3是N或GG，X4是F或A；

互补决定区CDR-VL1为R-S-X1-K-S-L-X2-H-S-X3-G-N-T-Y-X4-L-Y，其中，

X1是Q、N、R或K，X2是I或L，X3是Q或N，X4是I、V或L；

互补决定区CDR-VL2为R-M-X1-N-X2-A-S，其中，

X1是T或S，X2是L、V或I；

互补决定区CDR-VL3为M-Q-X1-L-E-X2-P-L-X3，其中，

X1是Q、H或N，X2是W、Y或F，X3是S或T。

在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％，85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与proBNP具有K_D≤9.63E-09mol/L，KD值也可以选择9E-09mol/L，或8E-09mol/L，或7E-09mol/L，或6E-09mol/L，或5E-09mol/L，或4E-09mol/L，或3E-09mol/L，或2E-09mol/L，或1E-09mol/L，或9E-10mol/L，或8E-10mol/L，或7E-10mol/L，或6E-10mol/L，或5E-10mol/L，或4E-10mol/L，或3E-10mol/L，或2E-10mol/L，或1E-10mol/L。

或者1.02E-10mol/L≤KD≤9.63E-9mol/L；

其中，亲和力按照本发明说明书中的方法测定。

在一些实施方式中：

所述互补决定区CDR-VH1中，X1是F；

所述互补决定区CDR-VH2中，X4是F；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；

所述互补决定区CDR-VL1中，X2是L；

所述互补决定区CDR-VL2中，X1是S；

所述互补决定区CDR-VL3中，X3是T。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是R。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是K。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是T。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是S。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是GG。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是F。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是A。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是G。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是F。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是A。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是R。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是K。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X4是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是H。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是W。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是Y。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是F。

在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

在一些实施方式中，所述结合蛋白中包含至少3个CDRs(例如3个轻链CDR或3个重链CDR)。

在一些实施方式中，所述结合蛋白包含至少6个CDRs。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO：1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO：5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在一些实施方式中，所述恒定区来源于小鼠；

轻链恒定区序列如SEQ ID NO：9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO：10所示。

另一方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的结合蛋白。

在本文中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。

根据本发明的一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体包含上述的核酸分子。

其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。

在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。

本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。

另一方面，本发明还提供了及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。

本发明的表达载体用于转化宿主细胞。这种转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的多肽的培养细胞或细胞系。本发明的转化细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽抱杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，优选来自哺乳动物的细胞，例如CHO细胞。所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。当重组制备本发明的肽组合时，所述表达产物可以输出到培养基中或携带在所述转化细胞的表面。

根据本发明的一方面，本发明还提供了一种生产上述结合蛋白的方法，包括如下步骤：

在合适的培养条件中培养上述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的结合蛋白。

所述方法可以是例如，用编码至少一部分结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。

构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。

根据本发明的一方面，本发明还提供了如上所述的结合蛋白在制备用于诊断心力衰竭和评价心脏功能的诊断剂或试剂盒中的应用。

根据本发明的一方面，本发明还提供了一种检测测试样品中NT-proBNP的方法，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的NT-proBNP抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在。

在上述检测方法中，步骤b)中所述复合物的存在指示所述测试样品中所述NT-proBNP的存在。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述NT-proBNP结合；

在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合NT-proBNP的不同抗原表位；

在一些实施方式中，所述的结合蛋白可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述NT-proBNP抗原结合；

在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninB、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测试剂或试剂盒，其包括如上所述的结合蛋白。

在一些实施方式中，所述试剂或试剂盒还包含药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、稳定剂、稀释剂或载体中的一种或多种。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1

本实施例提供了一种抗NT-ProBNP的重组抗体的示例性制备方法。

1.构建表达质粒

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。分泌Anti-NT-proBNP 5G3单克隆抗体的杂交瘤细胞株为我司已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。

1.1引物的设计与合成

扩增Heavy Chain和Light Chain 5'RACE引物：

SMARTER II A Oligonucleotide：

5'>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3'；

5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：

5'>(T)₂₅VN<3'(N＝A,C,G,orT；V＝A,G,orC)；

Universal Primer A Mix(UPM)：

5'>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3'Nested UniversalPrimer A(NUP)：

5'>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3'；

mIgG CKR：

5'>CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT<3'；

mIgG CHR：

5'>TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC<3'。

1.2抗体可变区基因克隆及测序

从分泌Anti-NT-proBNP 5G3单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II AOligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CKR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CHR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.75KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.45KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

1.3Anti-NT-proBNP 5G3抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为339bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为357bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

1.4重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-NT-proBNP 5G3抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

proGRP-5G3-HF：

5'>CCCAAGCTTGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC<3'；

proGRP-5G3-HR：

5'>CCCGAATTCTCATTATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCTCTTCTC<3'；

proGRP-5G3-LF：

5'>CCCAAGCTTGCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTA<3'；

proGRP-5G3-LR：

5'>CCCGAATTCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA<3'；

通过PCR扩增方法扩出0.75KB的Light Chain基因片段和1.45kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2.稳定细胞株筛选

2.1重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液稀释重组NT抗原(自产，130410)到1ug/ml，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100uL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对重组NT蛋白都有活性。

2.2重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50ul、DNA 100ug/管、PuvⅠ酶10ul、无菌水补至500ul，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

2.3重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3.重组抗体生产

3.1细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

3.2摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。

实施例2

抗体亲和力分析及活性鉴定

实施例1中得到的抗体经分析具有序列如SEQ ID NO:11所示的轻链以及12所示的重链。

经分析，重链的互补决定区(WT)：

CDR-VH1为：

G-A(X1)-T-L(X2)-S-K(X3)-Y-T-M-S；

CDR-VH2为：

L(X1)-I-S(X2)-S-G-N(X3)-G-N-T-A(X4)-Y-P-D-S-V-K-G；

CDR-VH3为：

S-K(X1)-Y-F(X2)-Y-D-G-A(X3)-W-F-A；

轻链的互补决定区：

CDR-VL1为：

R-S-Q(X1)-K-S-L-I(X2)-H-S-N(X3)-G-N-T-Y-V(X4)-L-Y；

CDR-VL2为：

R-M-T(X1)-N-L(X2)-A-S；

CDR-VL3为：

M-Q-Q(X1)-L-E-Y(X2)-P-L-S(X3)；

其中，X1、X2、X3均为待突变位点。

表1与抗体活性有关的突变位点

发明人将WT中的CDR位点进行上述突变，以获得活性和亲和力更好的抗体。

包被液稀释重组NT抗原(自产，130410)到1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的NT单克隆抗体，100uL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

表2抗体活性分析数据

从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点，部分结果如下。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

亲和力分析

利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10ug/ml，重组NT抗原(自产，130410)用PBST进行梯度稀释：104nmol/ml、52nmol/ml、26nmol/ml、13nmol/ml、6.5nmol/ml、3.25nmol/ml、0nmol/ml；

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。(KD表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。)

表4亲和力分析数据

从表4可以看出，表3中列出的突变位点对应的突变序列都具有较好的亲和力。

为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。

表5以WT为骨架进行的突变

表6亲和力分析数据

样品名称	K<sub>D</sub>(M)	样品名称	K<sub>D</sub>(M)
				WT	6.19E-9	WT 1-7	6.76E-9
WT 1-1	6.25E-9	WT 1-8	8.36E-9
				WT 1-2	6.74E-9	WT 1-9	7.55E-9
WT 1-3	8.35E-9	WT 1-10	7.74E-9
				WT 1-4	9.63E-9	WT 1-11	8.63E-9
WT 1-5	5.31E-9	WT 1-12	8.37E-9
				WT 1-6	5.25E-9

从表5和表6分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点对应的突变序列都具有较好的亲和力。

申请人将表4中上述抗体与内部另一株抗体(与原WT序列的抗体配对的抗体)做配对抗体实验验证，抗体性质与WT抗体未发生明显改变，经双抗夹心法配对实验验证，特异性均维持原有高水平，未见明显改变，这说明上述抗体与突变前的WT抗体识别的为相同表位。但由于突变抗体活性和亲和力的升高而表现出了更高的灵敏度。

稳定性分析

将基于突变1的同批次抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化。对突变后的抗体活性进行检测，检测方法如上述实施例中所采用的抗体活性分析方法，各组抗体的线性均可达99.90％以上，且CV值低于10％，不同温度保存的抗体活性未见统计学差异。这说明上述抗体均具有优秀的稳定性，且位点的突变对稳定性无影响。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 一种抗N末端脑钠肽前体的重组抗体

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr

1 5 10 15

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly

<210> 11

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gln Lys Ser Leu Ile His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Val Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Gln Leu Glu Tyr Pro Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu

145 150 155 160

Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr

180 185 190

Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr

195 200 205

Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215 220

<210> 12

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Leu Ser Lys Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Leu Ile Ser Ser Gly Asn Gly Asn Thr Ala Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Lys Tyr Phe Tyr Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

210 215 220

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser

260 265 270

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

290 295 300

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

305 310 315 320

Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

325 330 335

Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

340 345 350

Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

355 360 365

Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala

370 375 380

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

385 390 395 400

Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly

405 410 415

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

420 425 430

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly

435 440

Claims

1.一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-X2-S-X3-Y-T-M-S，其中，X1是F；

互补决定区CDR-VH2为X1-I-X2-S-G-X3-G-N-T-X4-Y-P-D-S-V-K-G，其中，X4是F；

互补决定区CDR-VH3为S-X1-Y-X2-Y-D-G-X3-W-F-A，其中，X1是R；

互补决定区CDR-VL1为R-S-X1-K-S-L-X2-H-S-X3-G-N-T-Y-X4-L-Y，其中，X2是L；

互补决定区CDR-VL2为R-M-X1-N-X2-A-S，其中，X1是S；

互补决定区CDR-VL3为M-Q-X1-L-E-X2-P-L-X3，其中，X3是T；

各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

突变 CDR-VH1 X2/X3 CDR-VH2 X1/X2/X3 CDR-VH3 X2/X3 CDR-VL1 X1/X3/X4 CDR-VL2 X2 CDR-VL3 X1/X2 突变 1 L/K L/S/N F/A Q/N/V L Q/Y 突变 1-1 L/R L/T/N F/F Q/Q/L V Q/W 突变 1-2 V/K L/T/GG A/A Q/Q/I I Q/F 突变 1-3 V/R L/S/N A/F Q/Q/V I H/Y 突变 1-4 I/K L/S/GG G/A Q/N/L V H/W 突变 1-5 I/R V/T/N G/F Q/N/I V H/F 突变 1-6 L/K V/T/GG F/A Q/N/V L N/Y 突变 1-7 I/K V/S/N F/F N/Q/L I N/W 突变 1-8 V/K V/S/GG A/A N/Q/I V N/F 突变 1-9 L/R I/T/N A/F N/Q/V I Q/Y 突变 1-10 I/R I/T/GG G/A N/N/L L H/Y 突变 1-11 V/R I/S/N G/F N/N/I L N/Y 突变 1-12 L/K I/S/GG F/A N/N/V V Q/W 突变 1-13 I/K L/T/N F/F R/Q/L V H/W 突变 1-14 V/K L/T/GG A/A R/Q/I I N/W 突变 1-15 L/R L/S/N A/F R/Q/V I Q/F 突变 1-16 I/R L/S/GG G/A R/N/L L H/F 突变 1-17 V/R V/T/N G/F R/N/I I N/F 突变 1-18 L/K V/T/GG F/A R/N/V V Q/Y 突变 1-19 L/R V/S/N F/F K/Q/L I Q/W 突变 1-20 V/K V/S/GG A/A K/Q/I L Q/F 突变 1-21 V/R I/T/N A/F K/Q/V L H/Y 突变 1-22 I/K I/T/GG G/A K/N/L I H/W 突变 1-23 I/R I/S/N G/F K/N/I V H/F 突变 1-24 L/K I/S/GG F/A K/N/V I N/Y 突变 1-25 L/R L/T/N F/F K/N/L L N/W 突变 1-26 V/K L/T/GG A/A K/N/V V N/F 突变 1-27 V/R L/S/N A/F K/N/I V Q/Y 突变 1-28 I/K L/S/GG G/A K/Q/L L H/Y 突变 1-29 I/R V/T/N G/F K/Q/V V N/Y 突变 1-30 L/K V/T/GG F/A K/Q/I L Q/W 突变 1-31 I/K V/S/N F/F R/N/L L H/W 突变 1-32 V/K V/S/GG A/A R/N/V I N/W 突变 1-33 L/R I/T/N A/F R/N/I L Q/F 突变 1-34 I/R I/T/GG G/A R/Q/L V H/F 突变 1-35 V/R I/S/N G/F R/Q/V V N/F 突变 1-36 L/K I/S/GG F/A R/Q/I I Q/Y 突变 1-37 I/K L/T/N F/F N/N/V L Q/W 突变 1-38 V/K L/T/GG A/A N/N/I V Q/F 突变 1-39 L/R L/S/N A/F N/N/L L H/Y 突变 1-40 I/R L/S/GG G/A N/Q/V I H/W 突变 1-41 V/R V/T/N G/F N/Q/I I H/F 突变 1-42 L/K V/T/GG F/A N/Q/L V N/Y 突变 1-43 L/R V/S/N F/F Q/N/V L N/W 突变 1-44 V/K V/S/GG A/A Q/N/I I N/F 突变 1-45 V/R I/T/N A/F Q/N/L L Q/Y 突变 1-46 I/K I/T/GG G/A Q/Q/V L H/Y 突变 1-47 I/R I/S/N G/F Q/Q/I L N/Y 突变 1-48 L/K I/S/GG F/A Q/Q/L I Q/W 突变 1-49 L/R L/S/GG F/F N/N/V V H/W 突变 1-50 V/K V/T/N A/A R/Q/I V N/W 突变 1-51 V/R V/T/GG A/F R/N/L V Q/F 突变 1-52 I/K V/S/N G/A K/Q/V L H/F 突变 1-53 I/R V/S/GG G/F Q/N/I I N/F 突变 1-54 L/K I/T/N G/F N/Q/L I Q/Y

。

2.一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-X2-S-X3-Y-T-M-S，其中，X1是A；

互补决定区CDR-VH2为X1-I-X2-S-G-X3-G-N-T-X4-Y-P-D-S-V-K-G，其中，X4是A；

互补决定区CDR-VH3为S-X1-Y-X2-Y-D-G-X3-W-F-A，其中，X1是K；

互补决定区CDR-VL1为R-S-X1-K-S-L-X2-H-S-X3-G-N-T-Y-X4-L-Y，其中，X2是I；

互补决定区CDR-VL2为R-M-X1-N-X2-A-S，其中，X1是T；

互补决定区CDR-VL3为M-Q-X1-L-E-X2-P-L-X3，其中，X3是S；

各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

位点 CDR-VH1 X2/X3 CDR-VH2 X1/X2/X3 CDR-VH3 X2/X3 CDR-VL1 X1/X3/X4 CDR-VL2 X2 CDR-VL3 X1/X2 WT L/K L/S/N F/A Q/N/V L Q/Y WT 1-1 I/T/GG A/A K/N/I I H/W I/T/GG WT 1-2 I/S/N G/F K/N/V V H/Y I/S/N WT 1-3 I/S/GG G/A K/N/L I H/F I/S/GG WT 1-4 L/T/N F/F K/N/L L N/W L/T/N WT 1-5 L/T/GG F/A K/N/V V N/Y L/T/GG WT 1-6 L/S/N A/F K/N/I V N/F L/S/N WT 1-7 L/S/GG A/A K/Q/L L Q/W L/S/GG WT 1-8 V/T/N G/F K/Q/V V Q/Y V/T/N WT 1-9 V/T/GG G/A K/Q/I L Q/F V/T/GG WT 1-10 V/S/N F/F R/N/L L H/W V/S/N WT 1-11 V/S/GG F/A R/N/V I H/Y V/S/GG WT 1-12 I/T/N A/F R/N/I L H/F I/T/N

。

3.如权利要求1~2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的一种。

4.如权利要求1~2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO：1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ IDNO：5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

5.如权利要求1~2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD任何其中之一恒定区的序列。

7.根据权利要求5所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

8.根据权利要求7所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为乳牛。

9.根据权利要求7所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为火鸡或斗鸡。

10.根据权利要求7所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区来源于小鼠。

11.根据权利要求10所述的结合蛋白，其特征在于，轻链恒定区序列如SEQ ID NO：9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO：10所示。

12.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1~11任一项所述的结合蛋白。

13.一种载体，其包含权利要求12所述的核酸分子。

14.一种宿主细胞，其被权利要求13所述的载体转化。

15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾细胞和NS0小鼠骨髓瘤细胞。

17.一种生产权利要求1~11任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：在合适的培养条件下培养权利要求14~16任一项所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的结合蛋白。

18.权利要求1~11任一项所述的结合蛋白在制备用于NT-proBNP抗原检测试剂中的应用。

19.如权利要求1~11任一项所述的结合蛋白在制备检测测试样品中的NT-proBNP的试剂盒中的应用，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的NT-proBNP抗原与权利要求1~11任一项所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述NT-proBNP的存在。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，在步骤a）中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。

21.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，在步骤a）中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述proBNP结合。

22.一种试剂或试剂盒，其包括权利要求1~11任一项所述的结合蛋白。

23.根据权利要求22所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包含药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、稳定剂、稀释剂和载体中的一种或多种。