KR20210035249A - Ns1 단백질의 결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 의해 제공되는 NS1 단백질에 결합된 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질은 특정된 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함한다. 상기 결합 단백질은 NS1 단백질을 특이적으로 식별하고 이에 특이적으로 결합될 수 있으며, 비교적 높은 민감도 및 특이성을 구비함으로써, 뎅기 바이러스에 대한 검출을 구현한다. 또한, 하이브리도마 세포를 마우스 복강에 주입하여 상기 결합 단백질을 생산할 필요 없으므로, 생산 난이도가 낮은 동시에 항체 기능이 더욱 안정하다.

Description

NS1 단백질의 결합 단백질
관련 출원의 상호 참조
본원 발명은 2018년 8월 28일에 중국 특허국에 제출한 출원 번호가 201811001557.1이고 발명의 명칭이 "NS1 단백질의 결합 단백질"인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하는 바, 이의 모든 내용은 참조로서 본원 발명에 인용된다.
본 발명은 생물 공학 기술 및 의학 기술 분야에 관한 것으로, 특히 NS1 단백질의 결합 단백질에 관한 것이다.
뎅기열(dengue fever, DF)은 4가지 혈청형 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4)에 의해 유발되는 급성 모기 매개성 전염병으로, 주로 이집트 숲모기 및 흰줄 숲모기를 통해 전파된다. DF는 분포가 가장 광범위하고, 발병율이 가장 높으며, 위험이 비교적 큰 충매 독성 질환으로, 전세계 열대 및 아열대의 아프리카, 아메리카, 동남아세아 및 서태평양 지역의 100여개 나라 및 지역에서 광범위하게 유행되고 있다.
임상에서, DF는 심각한 인플루엔자와 유사한 질환이다. 주로 돌연 발병, 고열, 심한 두통, 눈언저리 뒤의 통증, 근육 및 관절통으로 표현되고, 피진, 림프절종 및 백혈구 감소가 수반될 수 있으며, 모든 사람에 파급될 수 있지만, 증상은 환자의 연령에 따라 다를 수 있다. 일반적으로, 이러한 질환 종류를 고전적 뎅기열이라고 하는데, 이러한 종류의 질환은 전파가 빠르므로, 비교적 큰 규모의 유행을 초래할 수 있다. 뎅기열의 유행 기간에, 사람을 쉽게 감염시키는 이환율은 일반적으로 40 % ~ 50 %인데, 80 % ~ 90 %까지 달할 수 있지만, 치사율은 아주 낮다. 뎅기열 출혈열은 고열, 출혈, 간비대, 심각한 경우 순환부전을 특징으로 하는 치사율이 높은 비교적 심각한 임상 종류의 질환이다. 쇼크 증후군이 수반된 질환은 뎅기 쇼크 증후군으로 불리운다.
뎅기열에 특수한 효과를 일으키는 치료 방법은 없다. 적합한 치료 방법이 없으면, 뎅기열 출혈열의 치사율은 20 %를 초과할 수 있지만, 유효한 지지 요법을 사용하면 치사율은 1 %보다 낮을 수 있다. 뎅기열 진단 요점은, 1) 역학 자료, 발병 전 15일간의 활동 상황, 유행 지역에 간 적 있는지 여부, 모기에 물린 경력; 2) 임상 특징, 돌연 발병, 발열, "삼홍삼통(삼홍은 얼굴, 목, 가슴이 붉음을 의미하고, 삼통은 두통, 허리 통증, 눈의 통증을 의미함)", 피진; 3) 실험실 검사, 백혈구, 혈소판 감소; 혈성 특성 검출에서 IgM 양성을 나타내고; 회복기의 IgG가 급성기보다 4배 증가되며; 바이러스 또는 특이성 항원이 분리되는 것이다. 임상에서 뎅기 바이러스를 검출하기 방법에는 바이러스 배양, 혈청학 검출, 바이러스 핵산 검출 등이 있다. 바이러스 분리에 필요한 시간은 비교적 길기 때문에, 신속한 진단의 목적에 도달하지 못하고, 통상적인 혈청학 진단에는 광범위한 교차 반응이 존재하여 간섭을 받게 된다. 금콜로이드로 라벨링하는 면역 크로마토그래피 방법은 신속하고 간단하며 특수한 기기에 의존할 필요없고 현장 검출을 구현할 수 있는 등 특징을 가지므로, 현재 전염병의 진속한 진단에서 연구 이슈로 되고 있다. NS1 단백질은 뎅기 바이러스 비구조 단백질 중 유일한 당단백질로서, 항원성이 아주 강하고 항체 의존 면역 증강(ADE)을 유발하지 않으므로, 금콜로이드 검출의 표적으로 사용할 수 있다. 금콜로이드 검출은 NS1 단백질에 특이적인 단클론 항체가 필요한데, 기존에 임상에서 사용한 것은 모두 뮤린 단클론 항체이다. 뮤린 단클론 항체는 과학 연구, 임상 진단 및 치료에 오랫동안 광범위하게 응용되고 있었다. 하지만, 하이브리도마 방식을 통한 생산은 마우스 복강을 사용하여 하이브리도마를 생산해야 하므로, 마우스 개체의 영향을 크게 받고, 생산이 불안정하며, 배치 간 차이(batch-to-batch difference)가 크고, 또한 마우스 자가 항체를 함유하므로, 정제 난이도가 높다.
본 발명은 항 뎅기 바이러스 NS1 7F8 단클론 항체에 기반하여, 클론, 검정 및 유전자 구조 분석을 통해, 이의 CDR 영역 서열을 확정하고, 대응되는 NS1 단백질에 결합된 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질을 구축하며, 대응되는 진핵세포 발현 시스템을 구축하여, 상기 결합 단백질을 생산 및 정제한다.
본 발명에 의해 제공되는 NS1 단백질에 결합된 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질에서, 상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 적어도 하나의 상보성 결정 영역으로부터 선택된 것을 포함하거나; 또는, 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 적어도 80 %의 서열 동일성을 가지며 NS1 단백질과 KD≤5.78×10-8 mol/L의 친화력을 가지되;
상보성 결정 영역 CDR-VH1은 G-Y-T-X1-T-S-X2-V-I-H이고, 여기서,
X1은 V 또는 F이며, X2는 T, S 또는 Y이고;
상보성 결정 영역 CDR-VH2는 Y-M-N-X1-Y-N-D-G-X2-K-Y-N-X3-K-F-I-G이며, 여기서,
X1은 A이며, P 또는 G이고, X2는 L 또는 I이며, X3은 E, D 또는 N이고;
상보성 결정 영역 CDR-VH3은 T-X1-E-G-L-F-Y-V-X2-D-Y이며, 여기서,
X1은 K 또는 R이고, X2는 M 또는 F이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL1은 S-X1-T-S-S-X2-S-Y-M-H이고, 여기서,
X1은 G 또는 A이며, X2는 I, L 또는 V이고;
상보성 결정 영역 CDR-VL2는 D-X1-S-K-L-A-S-X2-V이며, 여기서,
X1은 T 또는 S이고, X2는 P, A 또는 G이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-W-R-S-X2-L-P-T이고, 여기서,
X1은 Q, Y 또는 W이고, X2는 D인 또는 V이다.
예를 들어,
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 F이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 P이며, X3은 E이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 A이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 G이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 D이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 T이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 S이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 Y이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 L이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 I이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 K이고, X2는 M이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 K이고, X2는 F이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이고, X2는 M이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이고, X2는 F이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 I이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 L이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 V이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 T이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 S이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Q이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Y이다.
예를 들어, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 W이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 대응 부위의 아미노산은 하기와 같다.
Figure pct00001
Figure pct00002
예를 들어, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 또는, 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함하고;
예를 들어, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 식별 유닛 중 하나이며;
예를 들어, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:1-4로 표시된 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:5-8로 표시된 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 항체 불변 영역 서열을 더 포함하고;
예를 들어, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역의 서열로부터 선택되며;
예를 들어, 상기 불변 영역의 종속 유래는 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 게임콕(game cock) 또는 인간이고;
예를 들어, 상기 불변 영역은 마우스로부터 유래되며;
경쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:9로 표시되고;
중쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시되는.
본 발명은 상기 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 더 제공한다.
본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 더 제공한다.
본 발명은 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 더 제공한다.
본 발명은 상기 결합 단백질, 핵산 또는 벡터 중 하나 또는 다수를 포함하는 키트를 더 제공한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 키트는 상기 결합 단백질을 라벨링하기 위한 라벨을 더 포함한다.
본 발명은, 상기 핵산 또는 벡터를 제조하는 단계를 포함하고;
예를 들어,
배지에서 상기 숙주세포를 배양하여, 배지 또는 배양된 숙주세포로부터, 생산된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 상기 결합 단백질의 생산 방법을 더 제공한다.
이 밖에, 본 발명은 뎅기열 감염을 검출하기 위한 제품의 제조에서의 상기 결합 단백질의 응용을 더 제공한다.
본 발명은 뎅기열 감염의 검출에서의 본문에 따른 결합 단백질의 응용을 더 제공한다.
본 발명은,
A) 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 피험자로부터 유래된 샘플을 본문에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계; 및
B) 결합 반응에 의해 생산된 면역 복합물을 검출하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 면역 복합물의 존재는 뎅기열 감염의 존재를 지시하는 뎅기열 감염의 검출 방법을 더 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 NS1 단백질에 결합된 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질은 특정된 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함한다. 상기 결합 단백질은 NS1 단백질을 특이적으로 식별하고 이에 특이적으로 결합될 수 있으며, 비교적 높은 민감도 및 특이성을 구비함으로써, 뎅기 바이러스에 대한 검출을 구현한다. 또한, 하이브리도마 세포를 마우스 복강에 주입하여 상기 결합 단백질을 생산할 필요 없으므로, 생산 난이도가 낮은 동시에 항체 기능이 더욱 안정하다.
본문에서 달리 정의되지 않은 한, 본 발명에서 사용된 과학 및 기술 용어는 본 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 용어의 의미 및 범위는 명확해야 하지만, 불명확성이 잠재하는 임의의 경우, 본문에 의해 제공되는 정의는 임의의 사전 또는 외래 정의보다 우선적이다. 본 발명에서, 달리 설명되지 않은 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 이 밖에, 용어 "포함" 및 다른 형태의 사용은 비제한적이다.
일반적으로, 본문에서 설명된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 교잡에 사용된 명명법 및 그 기술은, 본 기술분야에서 공지되고 다양한 일반적 및 더 구체적인 참조문헌에 기재된 통상적인 방법에 따라 진행되며, 상기 참조문헌은 명세서의 시작부터 끝까지 인용 및 토론된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명서, 본 기술분야에서 통상적으로 구현되거나 본문에 따른 내용에 따라 진행된다. 본문에서 설명된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학과 약물 화학에 사용된 명명법, 및 그 실험실 프로그램 및 기술은 본 기술분야에서 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다.
본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있도록, 선택된 용어는 하기와 같이 정의된다.
용어 "아미노산"은 천연 또는 비천연 카르복시 α-아미노산을 의미한다. 용어 "아미노산"은 본 발명에서 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 천연 아미노산은 알라닌(3 레터 코드(three-letter code): A1a, 1 레터 코드(one-letter code): A), 아르기닌(Arg, R), 아스파라긴(Asn, N), 아스파르트산(Asp, D), 시스테인(Cys, c), 글루타민(G1n, Q), 글루타민산(G1u, E), 글리신(G1y, G), 히스티딘(His, H), 이소류신(I1e, I), 류신(Leu, L), 라이신(Lys, K), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 트립토판(Trp, W), 타이로신(Tyr, Y), 및 발린(Va1, V)을 포함한다. 비천연 아미노산은 α-아미노아디프산, 아미노부티르산, 시트룰린, 호모시트룰린, 호모류신, 호모아르기닌, 히드록시 프롤린, 노르류신, 피리딜 알라닌, 사르코신 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "분리된 결합 단백질"은 하기와 같은 단백질인 바, 유도 기원 또는 유래는 천연적으로 결합된 조성성분과 결합되지 않고, 상기 천연적으로 결합된 조성성분은 이의 천연 상태에서 이와 수반되고; 동일한 종류로부터 유래된 다른 단백질을 거의 포함하지 않으며; 상이한 종류로부터 유래된 세포에 의해 발현되거나; 또는 자연계에 존재하지 않는다. 따라서, 화학 합성, 또는 이의 천연적으로 기원된 세포와 상이한 세포계에서 합성된 단백질은 이의 천연적으로 결합된 조성성분과 "분리된"것이다. 또한, 예를 들어 본 기술분야에서 공지된 단백질 정제 기술과 같은 분리를 통해 단백질이 천연적으로 결합된 조성성분을 거의 포함하지 않도록 한다.
용어 "항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질"은 일반적으로 CDR 영역을 포함하는 모든 단백질/단백질 단편을 의미한다. 용어 "항체"는 다클론 항체, 단클론 항체 및 이들 항체의 항원 화합물 결합 단편을 포함하는데, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 식별 유닛, 및 이들 항체 및 단편의 단일 가닥 유도체를 포함한다. 항체의 유형은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD로부터 선택될 수 있다. 이 밖에, 용어 "항체"는 천연 항체 및 비천연 항체를 포함하는데, 예를 들어, 키메라(chimeric) 항체, 이중 기능성(bifunctional) 항체 및 인간화(humanized) 항체, 및 관련된 합성 이성구조 형태(isoforms)를 포함한다. 용어 "항체"는 "면역 글로불린"과 호환하여 사용될 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단기 도메인을 의미한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 불리울 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 불리울 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원 결합 부위를 포함한다. 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역 " 또는 "CDR"의 초가변 영역 및 이를 분리하는 골격 영역 (framework region, FR)으로 불리우는 3개로 구성된다. 항체의 골격 영역은 중요한 경쇄 및 중쇄의 조합을 구성하는 골격 영역으로서, 위치를 결정하고 CDR을 정렬하는 작용을 한다. 상기 CDR은 주로 항원과의 결합을 담당한다.
본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중 특이성 항체" 또는 "이중 기능성 항체"는 두 쌍의 상이한 중쇄/경괘 및 2개의 상이한 결합 부위를 가지는 인조 이형접합성 결합 단백질을 의미한다. 이중 특이성 결합 단백질은 하이브리도마의 융합 또는 Fab'단편의 연결을 포함한 다양한 방법을 통해 생성될 수 있다.
본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 적어도 2가지 상이한 서열 사이의 유사성을 의미한다. 이 백분율 동일성은 예를 들어 블라스트(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST); Needleman 등 알고리즘; 또는 Meyers 등 알고리즘과 같은 표준 알고리즘을 통해 확정될 수 있다. 하나 또는 다수의 실시형태에서, 한 그룹의 파라미터는 Blosum 62 평점 매트릭스 및 갭 패널티 12, 갭 확장 패널티 4 및 프레임시프트 갭 패널티 5일 수 있다. 하나 또는 다수의 실시형태에서, 2가지 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 백분율 동일성은 Meyers 및 Miller((1989)CABIOS 4: 11-17)의 알고리즘을 사용하여 확정될 수도 있는데, 상기 알고리즘에 ALIGN 프로그램(2.0버전)을 도입하였고, PAM120 가중 잔기 리스트, 갭 길이 패널티 12, 및 갭 패널티 4를 사용하였다. 백분율 동일성은 일반적으로 길이가 비슷한 서열을 비교하여 계산한다.
본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화력"은 결합 단백질 또는 항체의 항원 결합 도메인과 항원 또는 항원 에피토프의 결합 강도를 의미한다. 친화력은 KD 값을 사용하여 측정할 수 있고, KD 값이 작을 수록, 친화력이 크다.
본 발명에 의해 제공되는 NS1 단백질에 결합된 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질에서, 상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 적어도 하나의 상보성 결정 영역으로부터 선택된 것을 포함하거나; 또는, 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 적어도 80 %의 서열 동일성을 가지며 NS1 단백질과 KD≤5.78×10-8 mol/L의 친화력을 가지되;
상보성 결정 영역 CDR-VH1은 G-Y-T-X1-T-S-X2-V-I-H이고, 여기서,
X1은 V 또는 F이며, X2는 T, S 또는 Y이고;
상보성 결정 영역 CDR-VH2는 Y-M-N-X1-Y-N-D-G-X2-K-Y-N-X3-K-F-I-G이며, 여기서,
X1은 A이며, P 또는 G이고, X2는 L 또는 I이며, X3은 E, D 또는 N이고;
상보성 결정 영역 CDR-VH3은 T-X1-E-G-L-F-Y-V-X2-D-Y이며, 여기서,
X1은 K 또는 R이고, X2는 M 또는 F이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL1은 S-X1-T-S-S-X2-S-Y-M-H이고, 여기서,
X1은 G 또는 A이며, X2는 I, L 또는 V이고;
상보성 결정 영역 CDR-VL2는 D-X1-S-K-L-A-S-X2-V이며, 여기서,
X1은 T 또는 S이고, X2는 P, A 또는 G이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-W-R-S-X2-L-P-T이고, 여기서,
X1은 Q, Y 또는 W이고, X2는 D인 또는 V이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에서 나타난 X1은 각각 서로 독립적으로 본 발명에서 한정된 아미노산을 의미하고; 본 발명에 따른 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에서 나타난 X2는 각각 서로 독립적으로 본 발명에서 한정된 아미노산을 의미하며; 본 발명에 따른 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에서 나타난 X3은 각각 서로 독립적으로 본 발명에서 한정된 아미노산을 의미한다.
본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 항체의 결합 특이성 및 친화력은 모두 주로 CDR 서열에 의해 결정되고, 성숙, 공지된 기존의 각 기술에 따라 비 CDR 영역의 아미노산 서열을 용이하게 개변시켜 서로 유사한 생물학적 활성을 가지는 변이체를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 결합 단백질의 "기능성 유도체"도 포함한다. "기능성 유도체"는 아미노산이 대체된 변이체를 의미하고, 하나의 기능성 유도체에는 검출 가능한 결합 단백질의 활성이 보존되는데, 예를 들어, NS1 단백질에 결합될 수 있는 항체의 활성이 보존된다. "기능성 유도체"는 "변이체" 및 "단편"을 포함할 수 있고, 본 발명에 따른 결합 단백질과 완전히 동일한 CDR 서열을 구비하므로, 서로 유사한 생물학적 활성을 가진다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 적어도 50 %, 또는 적어도 55 %, 또는 적어도 60 %, 또는 적어도 65 %, 또는 적어도 70 %, 또는 적어도 75 %, 또는 적어도 80 %, 또는 적어도 85 %, 또는 적어도 90 %, 또는 적어도 91 %, 또는 적어도 92 %, 또는 적어도 93 %, 또는 적어도 94 %, 또는 적어도 95 %, 또는 적어도 96 %, 또는 적어도 97 %, 또는 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %의 서열 동일성을 가지고, NS1 단백질과 KD≤5.78×10- 8 mol/L, 예를 들어 4.45×10- 10 mol/L, 5.70×10- 10 mol/L, 6.71×10- 10 mol/L, 7.65×10- 10 mol/L, 2.85×10- 9 mol/L, 3.47×10- 9 mol/L, 4.08×10-9 mol/L, 4.55×10- 9 mol/L 또는 5.78×10- 8 mol/L의 친화력을 가지거나; 또는 4.45×10- 10 mol/L≤KD≤5.78×10- 8 mol/L이거나, 또는 KD는 4.45×10- 10 mol/L, 5.70×10- 10 mol/L, 6.71×10- 10 mol/L, 7.65×10- 10 mol/L, 2.85×10- 9 mol/L, 3.47×10-9 mol/L, 4.08×10-9 mol/L, 4.55×10-9 mol/L보다 작거나 같다.
하나 또는 다수의 실시형태에서,
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 F이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 P이며, X3은 E이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 A이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 G이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 D이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 이고, X2는 M이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 K이고, X2는 F이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이고, X2는 M이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이고, X2는 F이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 V이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Q이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 W이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 또는, 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 완전 항체이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 식별 유닛 중 하나이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:1-4로 표시된 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:5-8로 표시된 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 항체 불변 영역 서열을 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역의 서열로부터 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역의 종속 유래는 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 게임콕(game cock) 또는 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역은 마우스로부터 유래되며;
경쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:9로 표시되고;
중쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명은 상기 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본문에서, 핵산 서열은 이의 보존적 치환된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈의 치환) 및 상보성 서열을 포함한다. 용어 "핵산"과 "폴리뉴클레오티드"의 의미는 같고, 유전자, cDNA 분자, mRNA 분자 및 이들의 단편, 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명은 상기 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하고, 여기서의 핵산 서열은 적어도 하나의 조절 서열과 조작 가능하게 연결된다. "조작 가능하게 연결"은 코딩 서열이 코딩 서열의 발현을 허용하도록 조절 서열과 연결되는 것을 의미한다. 조절 서열의 선택은 적합한 숙주세포에서 표적 단백질의 발현을 가이드하기 위한 것이고, 프로모터, 증폭자 및 다른 발현 조절 요소를 포함한다.
본문에서, 벡터는 본 발명의 핵산 또는 이의 단편을 포함한, 유전 정보를 휴대하고 유전 정보를 세포에 전달할 수 있는 분자 또는 시약을 의미할 수 있다. 전형적인 벡터는 플라스미드, 바이러스, 미니 염색체를 포함한다. 벡터는 클론 벡터(즉, 유전 정보를 세포에 전달하기 위한 벡터로서, 상기 세포를 증식시킬 수 있고 상기 유전 정보가 존재하거나 존재하지 않은 상기 세포를 선택할 수 있음) 또는 발현 벡터(즉, 필요한 유전 요소를 포함하여 상기 벡터의 유전 정보가 세포에서 발현되도록 허용하는 벡터)일 수 있다. 따라서, 클론 벡터는 선택 라벨, 및 상기 클론 벡터에 의해 지정된 세포 유형과 매칭된 복제 개시점을 포함할 수 있고, 발현 벡터는 지정된 표적 세포에서의 발현 필요성에 대해 영향을 미치는 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 핵산 또는 이의 단편은 적합한 벡터에 삽입되어 본 발명의 핵산 단편을 휴대한 클론 벡터 또는 발현 벡터를 형성할 수 있다. 이러한 신규 벡터도 본 발명의 일부분이다. 상기 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, 미니 염색체 또는 바이러스를 포함할 수 있고, 특정 세포에서만 순간적으로 발현하는 네이키드 DNA도 포함한다. 본 발명의 클론 벡터 및 발현 벡터는 자발적으로 복제할 수 있으므로, 추후 클론을 위한 고수준 발현 또는 고수준 복제 목적을 위해 높은 복제 수를 제공할 수 있다. 발현 벡터는 본 발명의 핵산 단편 발현을 구동시키기 위한 프로모터, 상기 펩티드 발현 산물이 분비되거나 막에 통합되도록 하는 신호 펩티드를 선택적으로 코딩하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 단편, 및 터미네이터를 선택적으로 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 균주 또는 세포주에서 발현 벡터를 조작할 경우, 벡터는 숙주세포에 인입될 시 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 숙주세포 게놈에 통합되지 않을 수도 있다. 벡터는 일반적으로 복제 부위, 및 형질전환 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 라벨링 서열을 휴대한다.
본 발명의 발현 벡터는 숙주세포를 형질전환하기 위한 것이다. 이러한 형질전환 세포도 본 발명의 일부분이고, 본 발명의 핵산 단편 및 벡터를 증식시키거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 배양 세포 또는 세포주를 재조합하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 형질전환 세포는 세균(예를 들어, 대장균, 바실러스 등)과 같은 미생물을 포함한다. 숙주세포는 또한 진균과 같은 다세포 생물로부터 유래된 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유 동물 세포를 포함하는데, 예를 들어, CHO 세포와 같은 포유 동물로부터 유래된 세포를 포함한다. 상기 형질전환 세포는 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있다. 본 발명의 펩티드 조합을 제조하여 재조합할 경우, 상기 발현 산물은 배지에 수송되거나 상기 형질전환 세포의 표면에 휴대될 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 결합 단백질은 생물학적 샘플에서의 하나 또는 다수의 표적 분자의 존재를 검출할 수 있다. 용어 "검출"이 본문에서 사용될 경우, 정량 또는 정성 검출을 포함한다. 하나 또는 다수의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "금콜로이드 면역 측정"은 금콜로이드를 추적 마커로 사용하여 항원 및/또는 항체에 응용하는 면역 라벨링 기술이다. 금콜로이드는 염화 금산이 예컨대 백린, 아스코르빈산, 구연산 나트륨, 타닌산 등 환원제의 작용 하에 특정 크기의 금 과립으로 중합되어 정전기 작용 하에 안정한 콜로이드 상대로 된 것이다.
본 발명의 면역 측정은 금콜로이드 면역 측정을 포함하고, ELISA, 및 다른 항원 항체 반응을 이용한 실험 또는 방법을 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명은 제품(예를 들어, 키트)를 제공하되, 상기 제품은 뎅기 바이러스 감염을 진단할 수 있는 재료를 포함한다. 상기 제품은 용기, 및 용기에 부착되거나 용기와 함께 존재하는 라벨 또는 포장 설명서를 포함한다. 적합한 용기는 예컨대 병 또는 주사기 등을 포함한다. 상기 용기는 예컨대 유리 또는 플라스틱 등 다양한 재료로 제조될 수 있다. 용기에는 조성물이 내장되고, 상기 조성물은 단독으로 사용되거나 뎅기열을 효과적으로 진단할 수 있는 다른 조성물과 결합하여 사용된다. 조성물 중 적어도 하나의 활성 시약은 본 발명에 의해 제공되는 결합 단백질이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본문은 본문에서 설명된 결합 단백질, 핵산 또는 벡터를 포함하는 검출 키트를 제공한다.
시험 샘플 중의 NS1 단백질 항원을 검출하는 방법은,
A) 항체/항원 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 상기 시험 샘플 중의 NS1 단백질 항원을 상술한 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합물을 형성하는 단계; 및
B) 상기 시험 샘플 중의 상기 NS1 단백질 항원의 존재를 지시하는 상기 면역 복합물의 존재를 검출하는 단계를 포함하고,
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 신호 세기를 나타내는 지시약을 라벨링하여 상기 복합물이 용이하게 검출되도록 할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 A)에서, 상기 면역 복합물은 상기 결합 단백질에 결합되는 2차 항체를 더 포함하고;
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 1차 항체의 형태로 상기 2차 항체와 함께 항체 쌍을 형성하여 NS1 단백질의 상이한 항원 에피토프에 결합되며;
상기 2차 항체는 신호 세기를 나타내는 지시약을 라벨링하여 상기 복합물이 용이하게 검출되도록 할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 A)에서, 상기 면역 복합물은 상기 NS1 단백질 항원에 결합되는 2차 항체를 더 포함하고;
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 상기 2차 항체의 항원으로 사용되고, 상기 2차 항체는 신호 세기를 나타내는 지시약을 라벨링하여 상기 복합물이 용이하게 검출되도록 할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 신호 세기를 나타내는 지시약은 형광 물질, 양자점, 디곡시게닌 라벨링 프로브, 바이오틴, 방사성 동위 원소, 방사성 조영제, 상자성 이온 형광 비드, 전자밀도 물질, 광학 발광 마커, 초음파 조영제, 감광제, 금콜로이드 또는 효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 형광 물질은 Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 555, Alexa 647, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-카르복시-4′, 5′-디클로로-2′, 7′-디메톡시플루오레세인, 5-카르복시-2′, 4′, 5′, 7′-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, 단실클로라이드, 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD(7-니트로벤조-2-옥사-1, 3-디아졸), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green514, Pacific Blue, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리안트 크레실 블루, P-아미노벤조산, 에리트로신, 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 숙시닐플루오레세인, 희토류 금속 크립테이트, 유로퓸 트리비스 피리딜디아민, 유로퓸 크립테이트 또는 킬레이트, 디아민, 디시아닌, La Jolla 블루 염료, 알로피코시아닌, allococyanin B, 피코시아닌 C, 피코시아닌 R, 티아민, 피코에리트린 B, 피코에리트린 R, REG, 로다민 그린, 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 레드, ROX, TAMRA, TET, TRIT(테트라메틸로다민 이소티올), 테트라메틸로다민 및 텍사스 레드 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방사성 동위 원소는 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154- 158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb 및 83Sr 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 효소는 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타아제 및 글루코스산화효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 형광 비드는 내부에 희토류 형광 이온 유로퓸이 감싸져 있는 폴리스티렌 형광 비드이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명은 예컨대 뎅기열에 감염된 피험자에 NS1 단백질이 존재하는지 여부를 확정하기 위한 키트를 제공하되, 상기 키트는 적어도 한 가지의 본 발명에 의해 제공되는 결합 단백질, 관련 완충제, 액체 샘플과 상기 결합 단백의 반응에 필요한 시약, 및 NS1 단백질과 결합 단백질 사이에 양성 또는 음성 결합 반응이 존재하는지 여부를 확정하기 위한 시약을 포함한다. NS1 단백질의 존재를 확정하기 위해, 상기 키트는 예컨대 라벨이 휴대된 결합 단백질을 항체로 사용하는데, 여기서 상기 라벨은 금콜로이드 라벨과 같은 임의의 적합한 라벨일 수 있다.
본 발명은 뎅기열 감염의 검출에서의 본문에 따른 결합 단백질의 응용을 더 제공한다.
본 발명은,
A)결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 피험자로부터 유래된 샘플을 본문에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계; 및
B)결합 반응에 의해 생산된 면역 복합물을 검출하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 면역 복합물의 존재는 뎅기열 감염의 존재를 지시하는 뎅기열 감염의 검출 방법을 더 제공한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 면역 측면 크로마토그래피, 방사선 면역 분석 및/또는 효소 결합 면역 기술에 기초한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방법은 효소 결합 면역 측정에 기초한 것이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방법은 금콜로이드 면역 측정법에 기초한 것이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 샘플은 전혈, 말초 혈액, 혈청 또는 혈장 중 적어도 하나로부터 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 피험자는 인간과 같은 영장류 동물 등 포유 동물이다.
아래, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니라 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 일부 구현예를 제공한다.
실시예 1
본 실시예에서 제한 엔도뉴클레아제, Prime Star DNA 폴리메라아제는 Takara 회사에서 구매하였다. MagExtractor-RNA 추출 키트는 TOYOBO 회사에서 구매하였다. SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit 키트는 Takara 회사에서 구매하였다. pMD-18T 벡터는 Takara 회사에서 구매하였다. 플라스미드 추출 키트는 TIANGEN 회사에서 구매하였다. 프라이머 합성 및 유전자 시퀀싱(gene sequencing)은 Invitrogen 회사에서 완성하였다. 항 뎅기 바이러스 NS1 7F8 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주는 출원인이 새로 선별한 하이브리도마 세포주이다.
1.1. 프라이머
증폭 중쇄 및 경쇄 5'RACE 프라이머:
SMARTER II A 올리고뉴클레오티드:
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX-3';
5'-RACE CDS 프라이머(5'-CDS): 5'-(T)25VN-3'(N=A,C,G,orT;V=A,G,orC);
범용 프라이머 A 혼합물(UPM):
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';
둥지 범용 프라이머 A(nested universal primer, NUP): 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';
mkR: 5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3';
mHR: 5'-TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGA-3'.
1.2. 항체 가변 영역 유전자 클론 및 시퀀싱
항 뎅기 바이러스 NS1 7F8 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주로부터 RNA을 추출하고, SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit 키트 및 키트 중의 SMARTER II A 올리고뉴클레오티드 및 5'-CDS 프라이머를 사용하여 제1 가닥 cDNA 합성을 진행하여 얻은 제1 가닥 cDNA 산물을 PCR 증폭 템플릿으로 사용한다. 범용 프라이머 A 혼합물(UPM), 둥지 범용 프라이머 A(NUP) 및 mkR 프라이머로 경쇄 유전자를 증폭하고, 범용 프라이머 A 혼합물(UPM), 둥지 범용 프라이머 A(NUP) 및 mHR프라이머로 중쇄 유전자를 증폭한다. 여기서, 경쇄의 프라이머 쌍은 0.8 KB 정도의 목적 스트라이프를 증폭해내고, 중쇄의 프라이머 쌍은 1.4 KB 정도의 목적 스트라이프를 증폭해낸다. 아가로스 겔 전기영동으로 정제하여 회수하고, rTaq DNA 폴리메라아제를 사용하여 산물을 A추가 반응시켜 pMD-18T벡터에 삽입하여, DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환시키며, 콜로니가 자란 후 4개의 중쇄 및 경쇄 유전자 클론을 4개씩 취하여 Invitrogen 회사에 보내 시퀀싱을 진행한다.
1.3. 항 뎅기 바이러스 NS1 7F8 항체 가변 영역 유전자의 서열 분석
상기 시퀀싱하여 얻은 유전자 서열을 IMGT 항체 데이터베이스에 넣어 분석하되, VNTI11.5 소프트웨어를 이용하여 분석하여, 중쇄 및 경쇄 프라이머 쌍이 증폭해낸 유전자가 모두 정확한 것을 확정하며, 여기서, 경쇄 프라이머 쌍이 증폭해낸 유전자 단편에서, VL유전자 서열은 342 bp이고, VkII 유전자 패밀리에 속하며, 이의 앞에는 57 bp의 선도펩티드 서열이 있고; 중쇄 프라이머 쌍이 증폭해낸 유전자 단편에서, VH 유전자 서열은 357 bp이며, VH1 유전자 패밀리에 속하고, 이의 앞에는 57 bp의 선도펩티드 서열이 있다.
1.4. 재조합 항체 발현 플라스미드의 구축
pcDNA™ 3.4 TOPO® vector는 구축된 재조합 항체 진핵 발현 벡터이고, 상기 발현 벡터는 HindIII, BamHI, EcoRI 등 다클론 효소 절단 부위를 이미 인입하여 pcDNA 3.4A 발현 벡터로 명명하되, 후속적으로는 3.4A 발현 벡터로 약칭하며; 상기 pMD-18T 중 항체 유전자 시퀀싱 결과에 따라, 양단에 각각 HindIII, EcoRI 효소 절단 부위 및 보호 염기가 구비된, 항 뎅기 바이러스 NS1 7F8 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자 특이성 프라이머를 설계하되, 프라이머는 하기와 같다.
DN7F8-HF: 5'-CAGAAGCTTATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGG-3';
DN7F8-HR: 5'-CAGGAATTCTTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCT-3';
DN7F8-LF: 5'-CATAAGCTTATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGT-3';
DN7F8-LR: 5'-ATCGAATTCTTACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3'.
PCR 증폭 방법을 통해 0.75 KB의 경쇄 유전자 단편 및 1.42 KB의 중쇄 유전자 단편을 증폭해낸다. 중쇄 및 경쇄 유전자 단편은 각각 HindIII/EcoRI 이중 효소 절단을 적용하고, 3.4A 벡터는 HindIII/EcoRI 이중 효소 절단을 적용하여, 단편 및 벡터를 정제하여 회수한 후 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 각각 3.4A 발현 벡터에 연결하여, 중쇄 및 경쇄의 재조합 발현 플라스미드를 각각 얻는다.
실시예 2
1. 발현 상청액 결합 단백질 활성 검정
초순수를 사용하여 플라스미드를 400 ng/ml까지 희석하고, 중국 햄스터 난소 CHO 세포를 1.43×107 cells/mL로 조절하여 원심분리관에 넣으며, 100 μL의 플라스미드와 700 μL의 세포를 혼합하고, 전기 회전 컵에 이동하여 전기 회전시키고, CD CHO AGT를 함유한 10 mL의 배지에 이동하여, 37 ℃의 진탕기에서 배양하며(8 %의 CO2, 150의 진폭); 매일 샘플링하여 세포 생존율을 검출하되, 세포 생존율이 50 %보다 낮을 때, 세포 배양 상청액을 원심분리하여 단백질 샘플을 얻는다.
CB를 사용하여 항원 DN-IV-Ag#(Fapon 생물 제품)를 1000배 희석하고, 폴리스티렌 효소 라벨링 블록의 각 웰에 100 μL의 샘플을 넣고, 4 ℃에서 하룻밤 지난 다음날, 세척액 PBST로 2번 세척하여 두드려 건조시키며; 37 ℃에서 1 h 동안 각 웰에 120 μL의 차단액(20 %의 BSA + 80 %의 PBS)을 넣고, 두드려 건조시키며, 37 ℃에서 30 min 동안(일부 상청액은 1 h 동안 진행됨) 100 μL/웰의 희석된 후의 세포 상청액을 넣고, 세척액으로 5번 세척하며, 두드려 건조시키고; 10 min 동안 현색액 A액(50 μL/웰)을 넣은 다음 현색액 B액(50 μL/웰)을 넣으며, 50 μL/웰의 정지액을 넣고; 마이크로 플레이트 리더의 450 nm(참조 630 nm) 위치에서 OD 값을 읽는다.
2. 결합 단백질 정제
단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 상기 샘플에 대해 친화성 정제를 진행하고, 정제한 후 500 mg의 재조합 항체를 얻으며, 4 μg의 정제된 항체를 취하여 환원성 SDS-PAGE를 진행한다. 환원성 SDS-PAGE 후 2개의 스트라이프가 나타났는데, 하나는 28 KD의 경쇄(서열은 SEQ ID NO:11로 표시됨)이고, 다른 하나는 50 KD의 중쇄(서열은 SEQ ID NO:12로 표시됨)이다.
3. 항체 친화력 분석
AMC 센서를 이용하여, PBST로 정제된 항체를 10 μg/ml까지 희석하고, DN-IV 품질 제어 제품으로 단백질(회사에서 스스로 생산함)을 재조합하여, PBST로 500 nmol/ml, 250 nmol/ml, 125 nmol/ml, 62.5 nmol/ml, 31.3 nmol/ml, 15.6 nmol/ml, 7.81 nmol/ml, 0 nmol/ml인 구배 희석을 진행한다.
진행 과정: 완충액 1(PBST)에서 60 s동안 평형을 이루도록 하고, 항체 용액에서 300 s 동안 항체를 경화시키며, 완충액 2(PBST)에서 180 s 동안 배양하고, 항원 용액에서 420 s 동안 결합시키며, 완충액 2에서 1200 s 동안 해리하고, 10 mM의 pH 1.69 GLY 용액 및 완충액 3으로 센서 재생을 진행하여, 데이터를 출력한다(KD는 친화력을 평가하기 위한 평형 해리 상수를 나타내고; kon은 결합 속도를 나타내며; koff는 해리 속도를 나타냄).
실시예 3
실시예 2에서 얻은 항체(서열이 SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:12로 표시되는 경쇄 및 중쇄를 구비함)는 비록 NS1 단백질에 결합되는 능력을 가지지만, 친화력 및 항체 활성은 이상적이지 못하므로, 출원인은 상기 항체의 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 돌연변이시켰다.
분석 결과, 중쇄의 상보성 결정 영역은 하기와 같은 바,
CDR-VH1은 G-Y-T-V(X1)-T-S-T(X2)-V-I-H이고;
CDR-VH2는 Y-M-N-A(X1)-Y-N-D-G-L(X2)-K-Y-N-D(X3)-K-F-I-G이며;
CDR-VH3은 T-K(X1)-E-G-L-F-Y-V-M(X2)-D-Y이고;
경쇄의 상보성 결정 영역은 하기와 같은 바,
CDR-VL1은 S-G(X1)-T-S-S-I(X2)-S-Y-M-H이고;
CDR-VL2는 D-T(X1)-S-K-L-A-S-P(X2)-V이며;
CDR-VL3은 Q-Q(X1)-W-R-S-V(X2)-L-P-T이다.
여기서, X1, X2, X3은 모두 돌연변이 부위이다.
돌연변이 후 실시예 2에서 제공한 방법을 응용하여 항체 활성을 검출한 일부 결과는 하기와 같다.
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 표로부터 알 수 있는 바, 돌연변이 1의 활성 효과가 가장 우수하므로, 돌연변이 1을 골격 서열로 사용하여 역가 가 비교적 우수한 돌연변이 부위를 선별한 일부 결과는 하기와 같다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
WT를 골격 서열로 사용하여 상기 실험을 반복하여 돌연변이 부위의 친화력 검정을 진행한 일부 결과는 하기와 같다.
Figure pct00009
Figure pct00010
상기 표의 데이터 분석으로부터 알 수 있는 바, 항체 활성을 가지도록 보장하는 전제 하에, 돌연변이 1을 골격으로 사용한 항체 친화력은 WT를 골격으로 사용한 항체의 친화력보다 높다.
실시예 4
상술한 자가 항체를 4 ℃(냉장고), -80 ℃(냉장고), 37 ℃(항온기)에 21일 동안 방치하고, 7일, 14일, 21일 샘플을 취하여 상태를 관찰하며, 21일 샘플의 활성을 검출한 결과, 3가지 평가 조건에서 항체를 21일 동안 방치하여도 단백질 상태는 모두 현저하게 변하지 않았고, 활성도 평가 온도의 상승에 따라 감소되지 않았는데, 이는 자가 항체의 안정성이 우수함을 설명하며, 하기 표는 21일 동안 평가한 효소면역 활성 검출 OD 결과이다.
Figure pct00011
마지막으로 설명해야 할 것은, 이상의 각 실시예는 단지 본 발명의 기술적 해결수단을 설명하기 위한 것일 뿐, 이를 한정하려는 것이 아니며, 전술한 각 실시예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하였지만, 본 기술분야의 통상의 기술자는, 여전히 전술한 각 실시에 기재된 기술적 해결수단을 수정할 수 있거나 그 중 부분 또는 전부 기술특징에 대해 등가적 대체를 진행할 수 있으며, 이러한 수정 또는 대체는 대응되는 기술적 해결수단의 본질이 본 발명의 각 실시예의 기술적 해결수단의 범위를 벗어나지 않도록 함을 이해해야 한다.
본 발명에 의해 제공되는 NS1 단백질에 결합된 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질은 특정된 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함한다. 상기 결합 단백질은 NS1 단백질을 특이적으로 식별하고 이에 특이적으로 결합될 수 있으며, 비교적 높은 민감도 및 특이성을 구비함으로써, 뎅기 바이러스에 대한 검출을 구현한다. 또한, 하이브리도마 세포를 마우스 복강에 주입하여 상기 결합 단백질을 생산할 필요 없으므로, 생산 난이도가 낮은 동시에 항체 기능이 더욱 안정하다.
SEQUENCE LISTING <110> 둥관시 펑즈 생물과학기술 유한회사 <120> NS1 단백질의 결합 단백질 <130> PI19032247 <150> CN2018110015571 <151> 2018-08-28 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 경쇄 골격 영역 FR-L1 <400> 1 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 20 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 경쇄 골격 영역 FR-L2 <400> 2 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 경쇄 골격 영역 FR-L3 <400> 3 Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 1 5 10 15 Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 경쇄 골격 영역 FR-L4 <400> 4 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 중쇄 골격 영역 FR-H1 <400> 5 Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 중쇄 골격 영역 FR-H2 <400> 6 Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 중쇄 골격 영역 FR-H3 <400> 7 Lys Ala Ile Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 중쇄 골격 영역 FR-H4 <400> 8 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 경쇄 불변 영역 <400> 9 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 10 <211> 324 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 중쇄 불변 영역 <400> 10 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 11 <211> 213 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 경쇄 <400> 11 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Pro Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Tyr Trp Arg Ser Asp Leu Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 12 <211> 442 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 중쇄 <400> 12 Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Met Asn Ala Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Ile Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Lys Glu Gly Leu Phe Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr 180 185 190 Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 210 215 220 Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 260 265 270 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 340 345 350 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe 355 360 365 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 370 375 380 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 385 390 395 400 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 405 410 415 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 420 425 430 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440

Claims (15)

  1. NS1 단백질에 결합된 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질로서,
    상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 적어도 하나의 상보성 결정 영역으로부터 선택된 것을 포함하거나;
    또는, 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 적어도 80 %의 서열 동일성을 가지며 NS1 단백질과 KD≤5.78×10-8 mol/L의 친화력을 가지되;
    상보성 결정 영역 CDR-VH1은 G-Y-T-X1-T-S-X2-V-I-H이고, 여기서,
    X1은 V 또는 F이며, X2는 T, S 또는 Y이고;
    상보성 결정 영역 CDR-VH2는 Y-M-N-X1-Y-N-D-G-X2-K-Y-N-X3-K-F-I-G이며, 여기서,
    X1은 A이며, P 또는 G이고, X2는 L 또는 I이며, X3은 E, D 또는 N이고;
    상보성 결정 영역 CDR-VH3은 T-X1-E-G-L-F-Y-V-X2-D-Y이며, 여기서,
    X1은 K 또는 R이고, X2는 M 또는 F이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VL1은 S-X1-T-S-S-X2-S-Y-M-H이고, 여기서,
    X1은 G 또는 A이며, X2는 I, L 또는 V이고;
    상보성 결정 영역 CDR-VL2는 D-X1-S-K-L-A-S-X2-V이며, 여기서,
    X1은 T 또는 S이고, X2는 P, A 또는 G이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-W-R-S-X2-L-P-T이고, 여기서,
    X1은 Q, Y 또는 W이고, X2는 D인 또는 V인 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 F이고;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 P이며, X3은 E이고;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 A이며;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 G이고;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 D인 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 상보성 결정 영역 대응 부위의 아미노산은 하기와 같은 결합 단백질.
    Figure pct00012

    Figure pct00013
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 또는 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함하고;
    바람직하게, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 식별 유닛 중 하나이며;
    바람직하게, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:1-4로 표시된 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:5-8로 표시된 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함하는 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 단백질은 항체 불변 영역 서열을 더 포함하고;
    바람직하게, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역의 서열로부터 선택되며;
    바람직하게, 상기 불변 영역의 종속 유래는 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 게임콕(game cock) 또는 인간이고;
    바람직하게, 상기 불변 영역은 마우스로부터 유래되며;
    경쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:9로 표시되고;
    중쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시되는 결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 코딩하는 핵산.
  7. 제6항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  8. 제6항에 따른 핵산 또는 제7항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포.
  9. 키트로서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질, 제6항에 따른 핵산 또는 제7항에 따른 벡터 중 하나 또는 다수를 포함하고,
    바람직하게, 상기 키트는 상기 결합 단백질을 라벨링하기 위한 라벨을 더 포함하는 키트.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 생산 방법으로서,
    제6항에 따른 핵산 또는 제7항에 따른 벡터를 제조하는 단계를 포함하고;
    바람직하게, 배지에서 제8항에 따른 숙주세포를 배양하여, 배지 또는 배양된 숙주세포로부터, 생산된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 뎅기열 감염을 검출하기 위한 제품의 제조에서의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 응용.
  12. 뎅기열 감염의 검출에서의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 응용.
  13. 뎅기열 감염의 검출 방법으로서,
    A) 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 피험자로부터 유래된 샘플을 제1항 내지 제5중 어느 한 항에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계; 및
    B) 결합 반응에 의해 생산된 면역 복합물을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 면역 복합물의 존재는 뎅기열 감염의 존재를 지시하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 금콜로이드 면역 측정 기술, 방사선 면역 분석 및/또는 효소 결합 면역 기술에 기초하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 피험자는 포유 동물이고, 바람직하게는 영장류 동물이며, 더 바람직하게는 인간인 방법.
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