CN117886929A - 抗新型冠状病毒的抗体、检测新型冠状病毒的试剂和试剂盒 - Google Patents
抗新型冠状病毒的抗体、检测新型冠状病毒的试剂和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗新型冠状病毒的抗体、检测新型冠状病毒的试剂和试剂盒,涉及抗体技术领域。本发明公开的抗新型冠状病毒的抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体对新型冠状病毒的N蛋白具有改善的亲和力、检测灵敏度或特异性。本发明为新型冠状病毒的检测提供了更为优秀的抗体选择。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域,具体而言,涉及一种抗新型冠状病毒的抗体、检测新型冠状病毒的试剂和试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒2019-nCoV的结构蛋白分为:刺突糖蛋白(S蛋白)、包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白),和核衣壳蛋白(N蛋白),这些蛋白包括多个抗原表位。N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳,在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。同时,N蛋白相对保守,在病毒的结构蛋白中所占比例最大,感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。最后,N蛋白是新型冠状病毒重要的标志蛋白,利用抗原与抗体特异性结合的原理,可通过N蛋白单克隆抗体检测抗原的存在,从而直接证明样本中含有新型冠状病毒,实现新型冠状病毒的检测。
检测的抗体主要分为IgM和IgG两类。目前对新型冠状病毒的这两类抗体的产生和持续时间尚缺乏系统性研究。通常情况下,IgM抗体产生早,一经感染,快速产生,维持时间短,消失快,血液中检测阳性可反应机体处于急性感染状态,可作为早期感染的指标。与核酸检测方法相比,抗体检测样本为血清或血浆,受样本采样的影响较小,有利于早期诊断和排除可疑病例,同时检测快速、方便、适合大规模筛查。
新型冠状病毒2019-nCoV肺炎疫情发生以来,在全球蔓延,严重威胁着人类的生命安全和身体健康。呼吸道飞沫和密切接触传播是新型冠状病毒肺炎主要的传播途径,在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况中存在经气溶胶传播的可能。2019-nCoV具有很强的传染性,多数患者感染后出现临床症状,但也有部分患者为无症状感染者。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中,感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭,甚至死亡。虽然目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法,但是轻症、或者无症状患者通过治疗可以大大的提高治愈率,缩短治疗时间。因此,对患者的检测或者鉴定变的尤为重要。
目前主要以核酸检测和病毒基因测序为病原学确诊证据,由于采样、操作以及试剂等多方面因素影响,核酸检测会出现假阴性结果。高度疑似2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染患者的病毒核酸阳性检出率仅为30%~50%。另外,核酸检测对仪器设备、检测场地及环境条件要求高,存在检测时间长、通量低等缺点,不便于目前疫情下的人群大规模检测。因此,迫切需要研发出一种快速便捷检测试剂盒用于临床检测,从而尽快隔离感染人群以阻断病毒传播。因此,抗原检测试剂盒变得更为重要,提供有益的新冠抗体原料是关键。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗新型冠状病毒的抗体、检测新型冠状病毒试剂和试剂盒。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明提供一种抗体或其功能性片段,含有如SEQ ID NO:1或其变体所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:2或其变体所示的轻链可变区,所述SEQ ID NO:1变体含有T28,S30,T31,或F32位点的氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体含有K24,A54,S95,或T101位点的氨基酸替换;且,所述抗体或其功能性片段不同时含有如SEQ ID NO:1所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。
在可选的实施方式中,所述SEQ ID NO:1变体含有选自T28,S30,T31,或F32的1,2,3,或4个位点的氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体含有选自K24,A54,S95,或T101的1,2,3,或4个位点的氨基酸替换。
第二方面,本发明提供一种抗体或其功能性片段,包括HCDRs和LCDRs,所述HCDRs与上述任一重链可变区包含的HCDRs相同,所述LCDRs与上述任一轻链可变区包含的LCDRs相同。
在可选的实施方式中,所述HCDRs和LCDRs由Kabat,Chothia,AbM,Contact或IMGT编号系统定义。
在可选的实施方式中,所述HCDRs和LCDRs包括下述氨基酸序列或如下述氨基酸序列所示:
HCDR1:GFX1FX2X3X4GMH;其中:X1是T,D,Q,K,E,G,R,N,或P;X2是S或G,X3是T或E,X4是F或W;
HCDR2:YINSASNIIYYADTVKG;
HCDR3:HAMDY;
LCDR1:X5ASQSVDYDGDSYMN;其中:X5是K或V;
LCDR2:X6ASNLES;其中:X6是A,E,或F;
LCDR3:QQX7NEDPYX8;其中:X7是S或D;X8是T,Y,I,或V;
且X1/X2/X3/X4/X5/X6/X7/X8不同时为T\S\T\F\K\A\S\T组合。
第三方面,本发明提供一种抗体偶联物,其包括如上所述的抗体或其功能性片段。
第四方面,本发明提供一种检测新型冠状病毒或其N蛋白的试剂或试剂盒,其包括如上所述的抗体或其功能性片段或如上所述的偶联物。
第五方面,本发明提供一种检测新型冠状病毒或其N蛋白的方法,其包括:将如上所述的任一抗体或其功能性片段或如上所述的抗体偶联物或如上所述的试剂或试剂盒与待检测样本中的新型冠状病毒或其N蛋白接触,形成免疫复合物。
第六方面,本发明提供一种核酸、载体或细胞。
第七方面,本发明提供一种制备如上所述的抗体或其功能性片段的方法,包括:培养上述的细胞,从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。
第八方面,本发明提供如上所述的任一抗体或其功能性片段、抗体偶联物或试剂或试剂盒在检测新型冠状病毒或其N蛋白或制备检测新型冠状病毒或其N蛋白的产品中的应用。
第九方面,本发明提供一种筛选抗新型冠状病毒或其N蛋白的抗体或其功能性片段的方法,所述方法包括:a)设计引物,用于对上述HCDRs或LCDRs的至少一个氨基酸位点进行氨基酸替换;b)以上述的核酸、载体或细胞为模板,用a)所述引物构建突变文库;c)从所述突变文库中筛选抗新型冠状病毒或其N蛋白的抗体或其功能性片段。
第十方面,本发明提供一种上述的突变文库。
本发明具有以下有益效果:
本发明公开的抗新型冠状病毒或其N蛋白的抗体为新型冠状病毒或其N蛋白的检测提供了重要的原料来源,具有提高的亲和力。用该抗体检测新型冠状病毒或其N蛋白具有改善的灵敏度或特异性。本发明为新型冠状病毒的检测提供了更为优秀的抗体选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的抗新型冠状病毒的抗体的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试,但现在描述一些方法和材料。除非另有说明,否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明,否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术,所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术,如《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989);《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.);《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994);以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,1991),所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
在本发明中,术语“抗体”在最广义上使用,其可以包括全长单克隆抗体,双特异性或多特异性抗体,以及嵌合抗体,只要它们展示所需的生物学活性。全长单克隆抗体由重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)构成。在本发明中重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区依次用VH、VL、CH和CL表示。
在本发明中,术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”,是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区,指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。
在本发明中,术语“重链互补决定区”、“HCDR”或“HCDRs”,指一种或多种或者甚至全部的重链可变区中的互补决定区。重链可变区中含有的3个HCDR包括HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明中,术语“轻链互补决定区”、“LCDR”或“LCDRs”,指一种或多种或者甚至全部的轻链可变区中的互补决定区。轻链可变区中含有的3个LCDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。
CDRs的定义是本领域已知的,例如可以根据Kabat、Chothia、AbM、Contact或IMGT编号系统定义。还有其他CDRs定义可能不严格遵循上述方法之一,但仍会与Kabat定义的CDRs的至少一部分重叠,尽管根据特定残基或残基组的预测或实验结果可能会缩短或延长它们。在本发明中,CDRs可以指由本领域已知的任何方法定义,包括已知方法的组合。
在本发明中,术语“框架区”或“FRs”区,是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDRs之外的区域,包括重链框架区和轻链框架区。其中,重链框架区可以被进一步细分成被HCDRs分隔开的毗邻区域,包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区;轻链框架区可以被进一步细分成被LCDRs分隔开的毗邻区域,包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。在本发明中,重链框架区用HFR或HFRs表示;轻链框架区用LFR或LFRs表示。
在本发明中,重链可变区由以下编号的HCDR与HFR按如下组合排列连接获得:HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4;轻链可变区由以下编号的LCDR与LFR按如下组合排列连接获得:LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。上述组合片段从序列上游(N端)至下游(C端)依次排布,所述“-”代表共价连接键(肽键)。
本发明实施例提供一种抗体或其功能性片段,含有如SEQ ID NO:1或其变体所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:2或其变体所示的轻链可变区,所述SEQ ID NO:1变体含有T28,S30,T31,或F32位点的氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体含有K24,A54,S95,或T101位点的氨基酸替换;且,所述抗体或其功能性片段不同时含有如SEQ ID NO:1所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。
在可选的实施方式中,所述SEQ ID NO:1变体含有选自T28,S30,T31,或F32的1,2,3,或4个位点的氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体含有选自K24,A54,S95,或T101的1,2,3,或4个位点的氨基酸替换。
在可选的实施方式中,所述SEQ ID NO:1变体是在T28,S30,T31,或F32位点进行氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体是在K24,A54,S95,或T101位点进行氨基酸替换。
在可选的实施方式中,所述抗体或其功能性片段的氨基酸替换的总个数是1,2,3,4,5,6,7,或8个。
在可选的实施方式中,所述SEQ ID NO:1变体是在T28位点进行氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体是在K24,A54,S95,或T101位点进行氨基酸替换。
所述SEQ ID NO:1变体是在S30位点进行氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体是在K24,A54,S95,或T101位点进行氨基酸替换。
所述SEQ ID NO:1变体是在T31位点进行氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体是在K24,A54,S95,或T101位点进行氨基酸替换。
所述SEQ ID NO:1变体是在F32位点进行氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体是在K24,A54,S95,或T101位点进行氨基酸替换。
在可选的实施方式中,所述T28位点的氨基酸替换为T28D,T28Q,T28K,T28E,T28G,T28R,T28N,或T28P;所述S30位点的氨基酸替换为S30G;所述T31位点的氨基酸替换为T31E;所述F32位点的氨基酸替换为F32W;所述K24位点的氨基酸替换为K24V;所述A54位点的氨基酸替换为A54E或A54F;所述S95位点的氨基酸替换为S95D;或,所述T101位点的氨基酸替换为T101V,T101I,或T101Y。
在可选的实施方式中,所述T28位点的氨基酸替换为T28D、T28Q、T28K、T28E,或T28G。
在可选的实施方式中,所述抗体或其功能性片段,含有如SEQ ID NO:1变体所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:2或其变体所示的轻链可变区,所述SEQ ID NO:1变体在T28位点进行了T28D、T28Q、T28K、T28E,或T28G的氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体在K24,A54,S95,或T101位点进行了K24V,A54E,A54F,S95D,T101V,T101I,或T101Y的氨基酸替换。
在可选的实施方式中,所述抗体或其功能性片段的氨基酸替换为选自如下突变1-77中的任意一种:WT表示未进行氨基酸替换。
另一方面,本发明实施例提供一种抗体或其功能性片段,包括HCDRs和LCDRs,所述HCDRs与上述任一重链可变区包含的HCDRs相同,所述LCDRs与上述任一轻链可变区包含的LCDRs相同。
在可选的实施方式中,所述HCDRs和LCDRs由Kabat,Chothia,AbM,Contact或IMGT编号系统定义。
在可选的实施方式中,所述HCDRs和LCDRs包括下述氨基酸序列或如下述氨基酸序列所示:
HCDR1:GFX1FX2X3X4GMH;其中:X1是T,D,Q,K,E,G,R,N,或P,X2是S或G,X3是T或E,X4是F或W;
HCDR2:YINSASNIIYYADTVKG;
HCDR3:HAMDY;
LCDR1:X5ASQSVDYDGDSYMN;其中:X5是K或V;
LCDR2:X6ASNLES;其中:X6是A,E,或F;
LCDR3:QQX7NEDPYX8;其中:X7是S或D;X8是T,Y,I,或V;
且X1/X2/X3/X4/X5/X6/X7/X8不同时为T\S\T\F\K\A\S\T组合。
在可选的实施方式中,HCDR1中,X1不是T。
在可选的实施方式中,HCDR1中,X1是D,Q,K,E,G,R,N,或P;可选为D,Q,K,E,或G。
在可选的实施方式中,所述X1/X2/X3/X4/X5/X6/X7/X8选自如下突变1-77中的任意一种:
/>
含有上述突变位点的HCDRs和LCDRs的抗体或其功能性片段对新型冠状病毒的N蛋白表现出改善的亲和力。
在可选的实施方式中,所述抗体或其功能性片段还包括HFRs和LFRs,所述HFRs和LFRs与上述可变区包含的HFRs和LFRs相同或与其具有至少80%同一性。
在可选的实施方式中,所述HFRs的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4依次包括SEQ ID NO:3-6或依次如SEQ ID NO:3-6所示,或与其具有至少80%同一性,和/或,所述LFRs的LFR1、LFR2、LFR3、LFR4依次包括SEQ ID NO:7-10或依次如SEQ ID NO:7-10所示,或与其具有至少80%同一性。
通常情况下,重链可变区(VH)和轻链的可变区(VL)可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。上述组合片段从序列上游(N端)至下游(C端)依次排布,所述“-”代表共价连接键(肽键)。
需要说明的是,在其他的实施例中,本发明提供的抗体或其功能性片段的各框架区氨基酸序列可以与上述对应框架区具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
在可选的实施方式中,所述抗体或其功能性片段还包含恒定区。
在可选的实施方式中,所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
在可选的实施方式中,所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中,所述恒定区来源于小鼠。
在可选的实施方式中,所述恒定区的重链恒定区(CH)序列包括SEQ ID NO:11或如SEQ ID NO:11所示,或与其具有至少80%同一性,所述恒定区的轻链恒定区(CL)序列包括SEQ ID NO:12或如SEQ ID NO:12所示,或与其具有至少80%同一性。
需要说明的是,在其他的实施例中,本发明提供的抗体的恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ ID NO:11或12)可以具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
在可选的实施方式中,所述抗体或其功能性片段包括重链和轻链;所述重链含有VH-CH的序列结构,所述轻链含有VL-CL的序列结构,所述VH、VL、CH、CL的氨基酸序列为上述任一实施例所述的VH、VL、CH、CL的氨基酸序列。上述组合片段从序列上游(N端)至下游(C端)依次排布,所述“-”代表共价连接键(肽键)。
抗体亲和力(KD)测定方法有很多种,根据检测原理可分为热力学检测方法、动力学检测方法和动态平衡检测方法。其中,热力学检测方法常见如等温滴定量热法(ITC);动力学检测方法常见如表面等离子共振(SPR)及生物膜光干涉法(BLI);动态平衡检测方法常见如酶联免疫吸附(ELISA)等。
在可选的实施方式中,KD的测定采用动力学检测方法;优选为,表面等离子共振方法,例如通过使用诸如系统的生物传感器系统。
在可选的实施方式中,KD的测定参考本发明实施例中的方法进行。
在可选的实施方式中,所述抗体或其功能性片段以KD≤3.47×10-09M的亲和力结合新型冠状病毒N蛋白。
在可选的实施方式中,所述抗体或其功能性片段以KD≤10-09M、KD≤10-10M、KD≤10-11M或KD≤10-12M的亲和力结合新型冠状病毒N蛋白。在可选的实施方式中,所述功能性片段选自所述抗体的VHH、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到,上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上,本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪,比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
另一方面,本发明提供一种抗体偶联物,其包括如上所述的抗体或其功能性片段。
在可选的实施方式中,所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的生物素或生物素衍生物。
在可选的实施方式中,所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的固相载体。
在可选的实施方式中,所述固相载体选自微球、板或膜,例如所述固相载体可以是磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中,所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的标记物。
在可选的实施方式中,所述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质,通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中,所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
在实际的使用过程中,本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物,无论使用何种标记物,其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中,所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中,所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中,所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中,所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中,所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中,所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中,所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
另一方面,本发明提供一种检测新型冠状病毒或其N蛋白的试剂或试剂盒,其包括如上任一项所述的抗体或其功能性片段或偶联物。
在可选的实施方式中,所述试剂或试剂盒具有提高的检测灵敏度或特异性。
另一方面,本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
另一方面,本发明提供含有上述核酸分子的载体。
另一方面,本发明提供含有上述核酸或载体的重组细胞。
另一方面,本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法,其包括:培养如上所述的重组细胞,从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上,本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段,例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段,这对本领域技术人员来说是容易实现的,基于此,无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段,其均属于本发明的保护范围。
另一方面,本发明提供上述的抗体或其功能性片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒在检测新型冠状病毒或其N蛋白或制备检测新型冠状病毒或其N蛋白的产品中的应用。
另一方面,本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或功能性片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用,所述用途包括:诊断或辅助诊断新型冠状病毒感染引发的相关疾病,预测或辅助预测新型冠状病毒病毒感染引发相关疾病的预后疗效中的至少一种。
在可选的实施方式中,所述新型冠状病毒感染引发的相关疾病包括呼吸道症状、发热、咳嗽、气促、呼吸困难、肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭中的至少一种。
在可选的实施方式中,所述产品包括试剂或试剂盒。
另一方面,本发明提供一种筛选抗新型冠状病毒或其N蛋白的抗体或其功能性片段的方法,所述方法包括:a)设计引物,用于对上述HCDRs或LCDRs的至少一个氨基酸位点进行氨基酸的替换;b)以上述的核酸、载体或重组细胞为模板,用a)所述引物构建突变文库;c)从所述突变文库中筛选抗新型冠状病毒或其N蛋白的抗体或其功能性片段。
在可选的实施方式中,所述引物用于对上述X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8的1,2,3,4,5,6,7,或8个位点进行氨基酸替换。
在可选的实施方式中,所述突变文库为单点饱和突变文库。
在可选的实施方式中,所述引物用于将X1替换为X1替换为D,Q,K,E,G,R,N,或P。
在可选的实施方式中,所述引物用于将X2替换为G。
在可选的实施方式中,所述引物用于将X3替换为E。
在可选的实施方式中,所述引物用于将X4替换为W。
在可选的实施方式中,所述引物用于将X5替换为V。
在可选的实施方式中,所述引物用于将X6替换为E或F。
在可选的实施方式中,所述引物用于将X7替换为D。
在可选的实施方式中,所述引物用于将X8替换为V,I,或Y。
另一方面,本发明提供上述的突变文库。从所述突变文库中可筛选到亲和力提升的突变抗体或其功能性片段。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本实施例中限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶购自New England Biolabs公司,Taq DNA聚合酶来购自TaKaRa,凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒市售,基因、引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。。2019-nCoV N蛋白单克隆抗体(以下简称WT抗体)序列来源于小鼠杂交瘤细胞测序。WT的重链、轻链序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。
实施例1亲和力成熟突变文库的构建和筛选
1WT模板质粒的构建
(1)抗体基因合成
将WT抗体序列的VH和VL进行大肠杆菌密码子优化,然后合成抗体基因序列。
(2)WT抗体基因片段扩增
将合成好的抗体序列,运用DNA聚合酶进行PCR扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳分离抗体条带,接着用凝胶回收试剂盒纯化得到抗体基因片段。
(3)WT抗体基因片段酶切和连接
将抗体基因片段和表达载体质粒同时用限制性内切酶进行双酶切,然后用凝胶回收试剂盒纯化得到带有粘性末端的抗体基因片段和表达载体,接着用T4DNA连接酶将抗体基因片段和表达载体在22℃连接4小时后,取连接反应产物进行回收纯化,并测定DNA浓度,最后取100ng的质粒转化到100ul TG1大肠杆菌感受态中,将菌液全部涂于含氨苄青霉素抗性的平板上,37℃培养过夜。
(4)WT模板质粒的提取和测序验证
次日,挑选10个单克隆菌落,采用Taq DNA聚合酶进行菌落PCR和凝胶电泳检测,选择正确插入抗体基因序列的菌进行培养扩增,用质粒提取试剂盒得到WT模板质粒,并进行基因测序验证。
2单点突变文库的构建
(1)引物设计和合成
利用兼并碱基密码子,设计VH和VL全CDR区(63个氨基酸位点)的单点饱和突变上下游引物63对,并进行引物合成。
(2)单点饱和突变质粒PCR扩增
采用PCR方法,并按照表1配置反应体系,然后采用表2的PCR反应条件进行单点饱和突变文库质粒的扩增制备,最后用限制性内切酶在37℃条件下消化WT模板质粒1小时,得到63个突变文库的质粒。
WT模板质粒 | 50ng |
DNA聚合酶 | 1ul |
DNA聚合酶buffer | 10ul |
dNTP(2.5mM) | 4ul |
上游引物(10uM) | 1ul |
下游引物(10uM) | 1ul |
ddH2O | 定容至50ul |
表1:PCR体系
Step1 | Step2 | Step3 | Step4 | Step5 | Step6 | |
Temperature | 95℃ | 95℃ | 55-60℃ | 72℃ | 72℃ | 4℃ |
Time | 5min | 30s | 30s | 2min | 5min | ∞ |
Step2 to Step4:22cycles
表2:PCR反应条件
(3)单点饱和突变质粒转化
取10ul反应产物转化到100ul TG1大肠杆菌感受态中,将菌液全部涂于含氨苄青霉素抗性的平板上,37℃培养过夜。
3单点突变文库的筛选
(1)突变文库抗体表达
次日,在96孔培养板中事先加入500ul的培养基,每个单点突变文库,挑选92个单克隆菌落(63×92个菌落),并设置WT、阴性、空白对照菌落,在37℃进行培养5-6小时后,将菌液转接到一块新的96孔培养板中,然后,在37℃进行培养1-2小时后,最后,加入诱导培养基,37℃过夜培养表达抗体,得到63个突变文库的抗体表达上清。
(2)突变文库筛选和测序
将2019-nCoV N蛋白按照0.02μg/ml、100ul/孔的量,加入到63块ELISA板中,4℃过夜反应包被,次日,用1-2%脱脂奶粉进行封闭,将63个突变文库的抗体表达上清,按照100ul/孔的量加入ELISA板孔中,并设置WT、阴性和空白对照,室温孵育2小时,采用常规ELISA的检测方法,进行后续的洗板、显色、读数;最后,对数据结果进行整理分析,将有提升的克隆送测序,最后对测序结果进行分析,选出15个唯一突变候选克隆的突变位点(见表3)。(Ratio值说明:Ratio值代表了亲和力提升的程度,当Ratio值等于1时,表示突变克隆的亲和力和WT一样;当Ratio值大于1时,表示亲和力有提升,即Ratio值越大,亲和力提升的程度也大)。
表3:候选克隆的筛选结果和突变位点
4组合突变文库的构建
(1)文库引物设计和合成
为进一步验证组合突变的效果,将表3中15个唯一突变候选克隆的突变位点进行组合突变文库构建。根据VH和VL上的突变位点,设计组合突变文库的扩增引物,并进行引物合成。说明:由于T28位点是对抗体亲和力提升重要的位点,VH的T28突变氨基酸较多(D/Q/E/G/K),设计引物时,采用了兼并碱基,因此该位点突变氨基酸不只有D/Q/E/G/K,包括了其余的19种氨基酸。
(2)片段扩增和连接
根据表1的PCR体系和表2的PCR反应条件,进行抗体突变片段的扩增,然后将抗体突变片段进行胶回收。采用Overlap PCR的方法,将抗体突变片段拼接成完整的抗体片段。
最后,采用酶切连接的方法将抗体片段插入表达载体中,形成完整的抗体表达质粒:方法与“WT抗体基因片段酶切和连接”相同。取100ng的质粒转化到100ul TG1大肠杆菌感受态中,将菌液全部涂于含氨苄青霉素抗性的平板上,37℃培养过夜。
5组合突变文库的筛选
次日,随机挑选出62个单克隆菌落进行抗体上清的表达、ELISA筛选检测、阳性克隆测序分析。其余操作与单点突变文库筛选相同。
具体筛选结果和突变位点信息见表4(Ratio值说明:Ratio值代表了亲和力提升的程度,当Ratio值等于1时,表示突变克隆的亲和力和WT一样;当Ratio值大于1时,表示亲和力有提升,即Ratio值越大,亲和力提升的程度也大)。
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表4:组合突变候选克隆信息
实施例2抗体真核重组表达验证
1真核重组表达质粒构建
pcDNATM3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体,该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点,并命名为pcDNA3.4A表达载体,后续简称3.4A表达载体;根据上述62个组合突变候选克隆中可变区基因序列,设计相应抗体序列的VL和VH基因特异性扩增引物及恒定区overlap引物,两端引物分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基,通过PCR扩增方法扩出0.73KB的Light Chain基因片段和1.40kb的Heavy Chain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切,3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切,将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中并转化至DH5α感受态细胞中,长出菌落后分别挑取单菌落进行PCR鉴定阳性克隆子,挑取阳性克隆子进行测序,确定序列的正确性。挑选测序正确克隆进行质粒提取备用。
2重组抗体的样品制备
提前复苏HEK293细胞,传代培养到200ml体系,使细胞密度达到3~5×106cells/ml,细胞活力>95%;离心清洗细胞,用培养基复溶,同时将细胞密度调整到2.9×106cells/ml,作为细胞稀释液。用培养基分别配制质粒DNA和转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入到质粒DNA稀释液中,混匀后室温静置放置15min;将该混合物在1min内缓慢加入细胞稀释液中,混匀后取样计数,记录并观察细胞转染后的活力,并将其放置于35℃恒温培养箱中培养,转速120rmp,CO2含量8%,13天后离心收样。用ProteinA亲和层析柱进行亲和纯化得到抗体。
3亲和力分析
将上述获得的重组抗体进行亲和力检测分析:在Biacore8K+设备上测试抗原抗体的结合解离曲线,仪器自动拟合获得亲和力常数、结合速率、解离速率。(KD表示平衡解离常数即亲和力常数,KD值越小,亲和力越高;ka表示结合速率;kd表示解离速率)。重组抗体的亲和力检测结果见表5。
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/>
表5:候选抗体亲和力检测结果
结果显示,上述获得的单克隆抗体的亲和力比野生型及对照抗体更佳。
4抗体检测性能验证
将上述获得的重组抗体或对照抗体作为包被抗体与可配对的抗新冠单克隆抗体组合,应用于胶体金平台进行组合样本测试,验证抗体的性能。(说明:胶体金平台反应度以色卡表示;B代表阴性;后面的数值越小表示抗体的活性越高,数值越大表示活性越低;“+”代表活性高半个色卡;如C2表示2个色卡;C2+表示1.5个色卡)。重组抗体的胶体金验证结果见表6。
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表6:重组抗体胶体金验证结果
结果显示,上述获得的重组抗体的胶体金性能比野生型及对照抗体更佳。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
本申请涉及的部分氨基酸序列如下:
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Claims (14)
1.一种抗体或其功能性片段,含有如SEQ ID NO:1或其变体所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:2或其变体所示的轻链可变区,所述SEQ ID NO:1变体含有T28,S30,T31,或F32位点的氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体含有K24,A54,S95,或T101位点的氨基酸替换;且,所述抗体或其功能性片段不同时含有如SEQ ID NO:1所示的重链可变区,和如SEQ IDNO:2所示的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段,其特征在于,所述SEQ ID NO:1变体含有选自T28,S30,T31,或F32的1,2,3,或4个位点的氨基酸替换;所述SEQ ID NO:2变体含有选自K24,A54,S95,或T101的1,2,3,或4个位点的氨基酸替换;
可选地,所述SEQ ID NO:1变体含有T28位点的氨基酸替换;
可选地,所述T28位点的氨基酸替换为T28D,T28Q,T28K,T28E,T28G,T28R,T28N,或T28P;所述S30位点的氨基酸替换为S30G;所述T31位点的氨基酸替换为T31E;所述F32位点的氨基酸替换为F32W;所述K24位点的氨基酸替换为K24V;所述A54位点的氨基酸替换为A54E或A54F;所述S95位点的氨基酸替换为S95D;或,所述T101位点的氨基酸替换为T101V,T101I,或T101Y;
可选地,所述抗体或其功能性片段的氨基酸替换选自如下突变1-77中的任意一种:WT表示未进行氨基酸的替换。
3.一种抗体或其功能性片段,包括HCDRs和LCDRs,所述HCDRs与权利要求1或2所述任一重链可变区包含的HCDRs相同,所述LCDRs与权利要求1或2所述任一轻链可变区包含的LCDRs相同;
可选地,所述HCDRs和LCDRs由Kabat,Chothia,AbM,Contact或IMGT编号系统定义;
可选地,所述HCDRs和LCDRs包括下述氨基酸序列或如下述氨基酸序列所示:
HCDR1:GFX1FX2X3X4GMH;其中:X1是T,D,Q,K,E,G,R,N,或P;X2是S或G,X3是T或E,X4是F或W;
HCDR2:YINSASNIIYYADTVKG;
HCDR3:HAMDY;
LCDR1:X5ASQSVDYDGDSYMN;其中:X5是K或V;
LCDR2:X6ASNLES;其中:X6是A,E,或F;
LCDR3:QQX7NEDPYX8;其中:X7是S或D;X8是T,Y,I,或V;
且X1/X2/X3/X4/X5/X6/X7/X8不同时为T\S\T\F\K\A\S\T组合;
可选地,HCDR1中,X1不是T;
可选的,所述X1/X2/X3/X4/X5/X6/X7/X8选自如下突变1-77中的任意一种:
可选地,所述抗体或其功能性片段还包括HFRs和LFRs,所述HFRs和LFRs与权利要求1或2所述可变区包含的HFRs和LFRs相同或与其具有至少80%同一性;
可选地,所述HFRs的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4依次包括SEQ ID NO:3-6或依次如SEQ IDNO:3-6所示,或与其具有至少80%同一性,和/或,所述LFRs的LFR1、LFR2、LFR3、LFR4依次包括SEQ ID NO:7-10或依次如SEQ ID NO:7-10所示,或与其具有至少80%同一性。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其功能性片段,其特征在于,所述抗体或其功能性片段还包含恒定区;
可选的,所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区;
可选的,所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人;
可选的,所述恒定区来源于小鼠;
可选的,所述恒定区的重链恒定区包括SEQ ID NO:11或如SEQ ID NO:11所示,或与其具有至少80%同一性,所述恒定区的轻链恒定区包括SEQ ID NO:12或如SEQ ID NO:12所示,或与其具有至少80%同一性;
可选的,所述抗体或其功能性片段以KD≤3.47×10-9M的亲和力结合新型冠状病毒N蛋白;
可选的,所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
5.一种抗体偶联物,其特征在于,其包括如权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段;
可选地,所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的生物素或生物素衍生物;
可选地,所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的固相载体;
可选地,所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的标记物;
可选地,所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种;
可选地,所述标记物为胶体金。
6.一种试剂或试剂盒,其特征在于,其包括如权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求5所述的偶联物。
7.一种检测新型冠状病毒或其N蛋白的方法,其特征在于,其包括:将如权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段或如权利要求5所述的抗体偶联物或如权利要求6所述的试剂或试剂盒与待检测样本中的新型冠状病毒或其N蛋白接触,形成免疫复合物;
可选地,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合;
可选地,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与新型冠状病毒或其N蛋白结合。
8.一种核酸,其特征在于,其编码如权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段。
9.一种载体,其特征在于,其含有权利要求8所述的核酸。
10.一种细胞,其特征在于,其含有权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体。
11.一种制备权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段的方法,其特征在于,其包括:培养权利要求10所述的重组细胞,从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。
12.如权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段、如权利要求5所述的抗体偶联物或如权利要求6所述的试剂或试剂盒在检测新型冠状病毒或其N蛋白或制备检测新型冠状病毒或其N蛋白的产品中的应用。
13.一种筛选抗新型冠状病毒或其N蛋白的抗体或其功能性片段的方法,其特征在于,所述方法包括:a)设计引物,用于对权利要求3所述HCDRs和LCDRs的至少一个氨基酸位点进行氨基酸替换;b)以权利要求8所述的核酸、权利要求9所述的载体或权利要求10所述的细胞为模板,用a)所述引物构建突变文库;c)从所述突变文库中筛选抗新型冠状病毒或其N蛋白的抗体或其功能性片段;
可选地,所述引物用于对权利要求3所述X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8的1,2,3,4,5,6,7,或8个位点进行氨基酸替换;
可选地,所述突变文库为单点饱和突变文库;
可选地,所述引物用于将X1替换为D,Q,K,E,G,R,N,或P。
14.权利要求13所述的突变文库。
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