CN117659178A - 抗甲型流感病毒抗体或其功能性片段、检测甲型流感病毒的试剂和试剂盒 - Google Patents

抗甲型流感病毒抗体或其功能性片段、检测甲型流感病毒的试剂和试剂盒 Download PDF

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CN117659178A CN202211013272.6A CN202211013272A CN117659178A CN 117659178 A CN117659178 A CN 117659178A CN 202211013272 A CN202211013272 A CN 202211013272A CN 117659178 A CN117659178 A CN 117659178A
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孟媛
钟冬梅
唐丽娜
游辉
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Abstract

本发明公开了抗甲型流感病毒抗体或其功能性片段、检测甲型流感病毒的试剂和试剂盒，涉及抗体领域。本发明公开的抗甲型流感病毒抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为甲型流感病毒的检测提供了重要的原料来源，具有提高的亲和力和活性。

Description

抗甲型流感病毒抗体或其功能性片段、检测甲型流感病毒的 试剂和试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及抗甲型流感病毒抗体或其功能性片段、检测甲型流感病毒的试剂和试剂盒。
背景技术
流行性感冒病毒(Influenza virus，Flu)，简称流感病毒，是正粘病毒科的代表种，包括人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒等，其中人流感病毒根据其核蛋白的抗原性可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒的病原体。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病。其中可感染人主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒，主要引起上呼吸道的感染，也可引起儿童与成年人的下呼吸道感染，主要为肺炎，婴幼儿的重症流感常伴有支气管、高热。
甲型流感病毒(Influenza A，Flu-A)于1933年分离成功，其抗原易发生变异，可以进一步分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型(H代表流感病毒的血凝素、N代表流感病毒的神经氨酸酶)，多次引起世界性大流行，每年均有一个高峰。甲型流感病毒感染发病程度与个人免疫相关，典型症状以畏寒、持续高热、头痛为主，同时伴有喉痛、咳嗽、鼻塞，一般会有浑身酸痛、乏力等全身症状。文献报道流行期阳性检出率为20～40％，而在非流行季节的阳性率为2-20％。甲型流感病毒的持续性流行会给人们的健康、生活及社会公共防疫系统带来极大的干扰和压力，它已经成为流行病学的主要研究对象之一。
目前市场上针对甲型流感病毒的检测方法主要有荧光PCR法、免疫法、病毒分离培养鉴定。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，定性或定量检测目的，该方法是病原检测的金标准；免疫法是通过抗原抗体发出特异性结合来检测目的蛋白；病毒分离培养常用的方法有鸡胚接种、动物接种、组织(细胞)培养等，再对产生的结果进行观察分析。荧光PCR法虽有较好的灵敏度和特异性，其检测窗口期较短，为疫病的早诊断、早治疗、降低死亡率及控制疫情争取时间，可作为诊断的金标准。但该法对检测人员要求较高，需要经过专业的技能培训，诊断检测需在具备资质的专业实验室使用专业的仪器设备才能进行，因此该法并不适用于临床或流行病监测一线的快速诊断。病毒分离培养鉴定检测耗时较长，环境要求高，操作者的感染风险大，培养效果差，在临床诊断和流行病监测等方面的应用非常有限。免疫法检测试剂针对的是样品中的抗原或者抗体，检测速度较快，准确性较好，同时对实验室与操作人员要求较低，普遍适用于医院检验科、疾控系统实验室等基层筛查，对甲型流感的初始检测、在医院及社区中成功控制爆发和指导治疗具有非常重要的作用。
目前市场上针对甲型流感的免疫诊断试剂产品主要有酶联免疫吸附法(ELISA法)、胶体金免疫层析法，如广州万孚的甲型流感病毒抗原检测试剂(胶体金法)、R&D的甲型流感ELISA试剂盒等。以上各种诊断试剂产品中，均需要针对甲型流感病毒的特异性抗体。
因此，本领域对于有效且特异性结合甲型流感病毒(Influenza A，Flu-A)并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供抗甲型流感病毒抗体或其功能性片段、检测甲型流感病毒的试剂和试剂盒。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括(a)～(c)中的任意一种：
(a)HCDR1～3和LCDR1～3，HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:1、2和3所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:4、5和6所示或如SEQ IDNo:4、5和7所示；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:8～12任一所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQID NO:19或20所示的轻链可变区；
(c)氨基酸序列与(b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1～HCDR3和LCDR1～LCDR3；
第二方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
第三方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段或如前述实施例所述的抗体偶联物。含有该抗体的试剂或试剂盒用于检测甲型流感病毒时具有改善的检测灵敏度和特异性。
第四方面，本发明实施例提供了一种检测甲型流感病毒的方法，其包括：将如前述实施例所述的抗体或其功能性片段与待检测样品混合，使所述抗体或其功能性片段与待测样本中的甲型流感病毒接触，形成免疫复合物。
第五方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
第六方面，本发明实施例提供了一种载体，其含有前述实施例所述的分离的核酸。
第七方面，本发明实施例提供了一种细胞，其含有前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体。
第八方面，本发明实施例提供了一种制备前述实施例所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养前述实施例所述的细胞。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开的抗甲型流感病毒抗体包括上述重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为甲型流感病毒的检测提供了重要的原料来源，具有提高的亲和力和活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Anti-FluA 30A9的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明实施例提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(a)HCDR1～3和LCDR1～3，HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:1、2和3所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:4、5和6所示或如SEQ IDNo:4、5和7所示。
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，重链可变区中含有的3个CDR包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，轻链可变区中含有的3个CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明实施例采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:8～12任一所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQID NO:19或20所示的轻链可变区。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(c)氨基酸序列与(b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3。上述抗体具有提高的活性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:8至12任一所示的重链可变区中的重链框架区，和SEQ ID NO:19或20所示的轻链可变区中的轻链框架区。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的框架区氨基酸序列可以与上述框架区具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:13所示或与其具有至少80％的同一性。
在可选的实施方式中，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:21所示或与其具有至少80％的同一性。
具体地，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ ID NO:13或21)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:14至18任一所示的重链，和氨基酸序列如SEQ IDNO:22或23所示的轻链。
在可选的实施方式中，前述实施例所述的抗体或其功能性片段以KD＜8.89×10- 10M的亲和力结合甲型流感病毒。
在可选的实施方式中，前述实施例所述的抗体或其功能性片段以KD≤10-10M、KD≤10-11M或KD≤10-12M的亲和力结合甲型流感病毒。
在可选的实施方式中，前述实施例所述的抗体或其功能性片段以KD≤2.10×10- 13M的亲和力结合甲型流感病毒。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体偶联物，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的生物素或生物素衍生物。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的标记物。
在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、胶体硒、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金或胶体银。
在可选的实施方式中，所述胶体金属为胶体金。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的固相载体。抗体偶联物中，所述抗体偶联至固相载体。
在可选的实施方式中，所述固相载体选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中，所述固相载体为硝酸纤维素膜。
另一方面，本发明实施例还提供了一种试剂或试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段或如前述任意实施例所述的抗体偶联物。
另一方面，本发明实施例还提供了一种检测甲型流感病毒的方法，其包括：
将如前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段或如前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒与待检测样品混合，使所述抗体或其功能性片段与待测样本中的甲型流感病毒接触，形成免疫复合物。
在优选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
在优选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与甲型流感病毒结合。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或功能性片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在检测甲型流感病毒或制备检测甲型流感病毒的产品中的应用。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或功能性片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用，所述用途包括：诊断或辅助诊断甲型流感病毒感染引发的相关疾病，预测或辅助预测甲型流感病毒感染引发相关疾病的预后疗效中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述甲型流感病毒感染引发的相关疾病包括病毒性肺炎、继发性细菌肺炎、心肌炎和心膜炎中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒。
另一方面，本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其编码前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段。
另一方面，本发明实施例还提供了一种载体，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸。
另一方面，本发明实施例还提供了一种细胞，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸或如前述任意实施例所述的载体。
另一方面，本发明实施例还提供了一种制备如前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如前述任意实施例所述的细胞。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1Anti-FluA 30A9单克隆抗体的制备
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由基因测序公司完成。
1.表达质粒构建
1.1、Anti-FluA 30A9抗体基因制备
从分泌Anti-FluA 30A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，并将其插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因的阳性克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。
1.2、Anti-FluA30A9抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为324bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为357bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
1.3、重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM 3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体经改造引入多克隆酶切位点，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-FluA 30A9抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有限制性内切酶酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.79kb的Light Chain基因片段和1.45kb的HeavyChain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用限制性内切酶进行双酶切，3.4A载体采用限制性内切酶进行双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和LightChain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2.重组抗体的样品制备
提前复苏HEK293细胞，传代培养到200ml体系，使细胞密度达到3～5×106cells/ml，细胞活力>95％；离心清洗细胞，用培养基复溶，同时将细胞密度调整到2.9×106cells/ml，作为细胞稀释液。用培养基分别配制质粒DNA和转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入到质粒DNA稀释液中，混匀后室温静置放置15min；将该混合物在1min内缓慢加入细胞稀释液中，混匀后取样计数，记录并观察细胞转染后的活力，并将其放置于35℃恒温培养箱中培养，转速120rmp，CO2含量8％，13天后离心收样。将离心上清用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。
实施例2亲和力及活性优化
实施例1得到的Anti-FluA 30A9单克隆抗体虽然具备结合甲型流感病毒的能力，但亲和力和抗体活性均不够理想，因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。得到单克隆抗体Anti-FluA-30A9RMb1～Anti-FluA-30A9RMb5，其重链和轻链氨基酸序如下：
表1抗体序列
样品名称 重链序号 轻链序号
Anti-FluA-30A9RMb1 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:22
Anti-FluA-30A9RMb2 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:22
Anti-FluA-30A9RMb3 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:22
Anti-FluA-30A9RMb4 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:23
Anti-FluA-30A9RMb5 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:22
实施例3亲和力分析
提前稀释纯化抗体，同时对流感A重组抗原(获自菲鹏生物)进行梯度稀释；利用已提前耦联羊抗小鼠IgG的CM5芯片，在biacore 8K+设备上测试抗原抗体的结合解离曲线，仪器自动拟合获得亲和力常数、结合速率、解离速率(KD表示平衡解离常数即亲和力常数；ka表示结合速率；kd表示解离速率)。结果显示：Anti-FluA-30A9RMb1至4的亲和力优于5和对照。
表2亲和力分析数据
样品名称 KD(M) ka kd
对照抗体 8.89E-10 4.32E+04 3.84E-05
Anti-FluA-30A9RMb1 2.10E-13 1.08E+06 2.27E-07
Anti-FluA-30A9RMb2 1.09E-13 2.17E+06 2.37E-07
Anti-FluA-30A9RMb3 1.96E-13 1.57E+06 3.07E-07
Anti-FluA-30A9RMb4 1.70E-13 1.93E+06 3.27E-07
Anti-FluA-30A9RMb5 7.11E-10 3.98E+04 2.83E-05
实施例4活性鉴定
包被液(主要成分NaHCO3)稀释流感A抗原(获自菲鹏生物)至3ug/ml，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na2HPO4+Nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体和对照抗体，100uL/孔，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。
表3活性数据
浓度(ng/ml) 250.00 125.00 62.50 31.25 15.63 0.00
对照抗体 1.499 1.123 0.697 0.387 0.212 0.015
Anti-FluA-30A9RMb1 1.741 1.435 0.941 0.607 0.362 0.017
Anti-FluA-30A9RMb2 1.758 1.425 0.953 0.607 0.357 0.012
Anti-FluA-30A9RMb3 1.764 1.447 0.946 0.608 0.368 0.015
Anti-FluA-30A9RMb4 1.788 1.467 0.966 0.611 0.356 0.014
Anti-FluA-30A9RMb5 1.501 1.125 0.702 0.392 0.216 0.015
实施例5抗体稳定性考核
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明表达的抗体稳定。下表为考核21天的酶免活性检测OD结果。
表4稳定性数据
样品浓度(ng/ml) 125.00 62.50 0
4℃，21天样品 1.435 0.957 0.022
-80℃，21天样品 1.457 0.966 0.023
37℃，21天样品 1.435 0.978 0.022
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示：
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Claims (11)

1.一种抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括(a)～(c)中的任意一种：
(a)HCDR1～3和LCDR1～3，HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:1、2和3所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No:4、5和6所示或如SEQ ID No:4、5和7所示；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:8～12任一所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNO:19或20所示的轻链可变区；
(c)氨基酸序列与(b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1～HCDR3和LCDR1～LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段以KD＜8.89×10-10M的亲和力结合甲型流感病毒。
3.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区；
可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；
可选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种；
可选地，所述恒定区的种属来源为小鼠；
可选地，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:13所示或与其具有至少80％的同一性；
可选地，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:21所示或与其具有至少80％的同一性；
可选地，所述抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:14至18任一所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:22或23所示的轻链。
4.根据权利要求1～3任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
5.一种抗体偶联物，其特征在于，其包括如权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的生物素或生物素衍生物；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的固相载体；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的标记物；
可选地，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种；
可选地，所述标记物为胶体金。
6.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段或如权利要求5所述的抗体偶联物。
7.一种检测甲型流感病毒的方法，其特征在于，其包括：
将如权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段与待检测样品混合，使所述抗体或其功能性片段与待测样本中的甲型流感病毒接触，形成免疫复合物；
优选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合；
优选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与甲型流感病毒结合。
8.一种分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段。
9.一种载体，其特征在于，其含有权利要求8所述的核酸。
10.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体。
11.一种制备权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求10所述的细胞。
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