CN117417446B - 抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段、检测促肾上腺皮质激素的试剂和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段、检测促肾上腺皮质激素的试剂和试剂盒，涉及抗体领域。本发明公开的抗促肾上腺皮质激素抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为促肾上腺皮质激素的检测提供了重要的原料来源，且具有改善的活性。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体而言，涉及抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段、检测促肾上腺皮质激素的试剂和试剂盒。
背景技术
促肾上腺皮质激素(adrenocor ticotropic hormore，ACTH)是一种由脊椎动物脑垂体分泌的多肽类激素，由39个氨基酸组成，分子量大小4.5KD。ATCH的合成和分泌受下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的直接调控，它主要作用于肾上腺皮质束状带，刺激糖皮质激素和类固醇的分泌，分泌过多的皮质激素会通过负反馈调节影响着垂体和下丘脑的活动。
促肾上皮质激素水平显现昼夜变化，一般来说，正常值为上午8时2.2-17.6pmol/L，下午4时为1.1～8.8pmol/L。促肾上腺皮质激素对于鉴别诊断肾上腺功能减退和分泌亢进很有价值。ACTH增高可见于先天性肾上腺皮质功能减退症、异位ACTH综合征、Nelson综合征、库欣病、遗传性肾上腺皮质对ACTH不反应综合征、先天性肾上腺皮质增生症、周期性ACTH、ADH分泌增多综合征、其他(如手术、创伤、休克、低血糖等)。ACTH降低可见于：下丘脑垂体功能减退、垂体卒中，手术切除垂体、垂体柄切除术、垂体促肾上腺皮质激素肿瘤，原发性Cushing病，肾上腺皮质肿瘤、应用大剂量皮质激素，继发于垂体功能减低的肾上腺皮质功能减退症(Simmonds-Sheehan综合征)等。
临床上用于检测促肾上腺皮质激素的免疫分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法。放射免疫测定法是基于抗原和抗体结合的分析方法，其竞争结合原理和ELISA相似，常用的原料来源于单克隆抗体，该方法灵敏度和特异性高，但试剂价格昂贵，需使用特殊的检测设备，还存在稳定性差、放射性污染和操作受限等问题；酶联免疫吸附法(ELISA)有特异性强，成本低，操纵简便，不需要大型仪器等优点，已经广泛用于生物样本的测定；ELISA试剂盒中关键因素在于获得高特异性、高亲和力的抗体；化学发光法采用磁微粒偶联促肾上腺皮质激素捕获抗体，吖啶酯标记促肾上腺皮质激素单克隆抗体，具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高，检测速度快，检测结果具有更高的准确性与重复性等优点，成为了目前测定ATCH的主要方法。
上述方法都需要针对ACTH的特异性抗体才能实现，因此，本领域对于有效且特异性结合ACTH并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段、检测促肾上腺皮质激素的试剂和试剂盒。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括(a)～(d)中的任意一种；(a)氨基酸序列依次如SEQ ID No:1～3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和氨基酸序列依次如SEQ ID No:4～6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:7～10任一项所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO.16～17所示的轻链可变区；(c)氨基酸序列与(b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1～HCDR3和LCDR1～LCDR3；(e)氨基酸序列如SEQ ID NO:12～15任一项所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:19～20任一项所示的轻链。
第二方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
第三方面，本发明实施例提供了一种检测促肾上腺皮质激素的试剂或试剂盒，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段或如前述实施例所述的抗体偶联物。
第四方面，本发明实施例提供了一种检测促肾上腺皮质激素的方法，其包括：将如前述实施例所述的抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段或如前述实施例所述的抗体偶联物或前述实施例所述的试剂或试剂盒与待检测样品混合，使抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段与待测样本中的促肾上腺皮质激素接触，形成免疫复合物。
第五方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
第六方面，本发明实施例提供了一种载体，其含有前述实施例所述的分离的核酸。
第七方面，本发明实施例提供了一种细胞，其含有前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体。
第八方面，本发明实施例提供了一种制备前述实施例所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养前述实施例所述的细胞。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开的抗促肾上腺皮质激素抗体包括上述重链互补决定区和轻链互补决定区，为促肾上腺皮质激素的检测提供了重要的原料来源，具有提高的活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Anti-ACTH-13C9RMb1至Anti-ACTH-13C9RMb5的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(a)氨基酸序列依次如SEQ ID No:1～3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和氨基酸序列依次如SEQ ID No:4～6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。上述抗体具有提高的活性。
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:7～10任一项所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO.16～17所示的轻链可变区。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(c)氨基酸序列与(b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3。上述抗体具有提高的活性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:7～10任一项所示的重链可变区中的重链框架区，和SEQ ID NO:16～17所示的轻链可变区中的轻链框架区。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的框架区氨基酸序列可以与上述框架区具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:11所示或与其具有至少80％的同一性。
在可选的实施方式中，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:18所示或与其具有至少80％的同一性。
具体地，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ ID NO:11或18)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
(d)氨基酸序列如SEQ ID NO:12～15任一项所示的重链，和氨基酸序列如SEQ IDNO:19～20所示的轻链。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体偶联物，其包括如前述实施例所述的抗体或其功能性片段。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的生物素或生物素衍生物。抗体偶联物中，所述抗体偶联至生物素或生物素衍生物。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的标记物。抗体偶联物中，所述抗体偶联至标记物。
在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、胶体硒、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金或胶体银。
在可选的实施方式中，所述胶体金属为胶体金。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的固相载体。抗体偶联物中，所述抗体偶联至固相载体。
在可选的实施方式中，所述固相载体选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中，所述固相载体为硝酸纤维素膜。
另一方面，本发明实施例还提供了一种检测促肾上腺皮质激素的试剂或试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段或如前述任意实施例所述的抗体偶联物。
另一方面，本发明实施例还提供了一种检测促肾上腺皮质激素的方法，其包括：
将如前述任意实施例所述的抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段或如前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒与待检测样品混合，使抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段与待测样本中的促肾上腺皮质激素接触，形成免疫复合物。
在优选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
在优选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与促肾上腺皮质激素结合。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或功能性片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在检测促肾上腺皮质激素或制备检测促肾上腺皮质激素的产品中的应用。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或功能性片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断促肾上腺皮质激素代谢相关疾病的产品中的应用。
在可选的实施方式中，制备诊断促肾上腺皮质激素代谢相关疾病的产品时，所述疾病包括肾上腺功能减退和肾上腺功能分泌亢进中的至少一种。
促肾上腺皮质激素代谢相关疾病包括促肾上腺皮质激素代谢上调的相关疾病和促肾上腺皮质激素代谢下调的相关疾病。在可选的实施方式中，代谢上调的相关疾病包括先天性肾上腺皮质功能减退症、异位ACTH综合征、Nelson综合征、库欣病、遗传性肾上腺皮质对ACTH不反应综合征、先天性肾上腺皮质增生症、周期性ACTH、ADH分泌增多综合征中的任意一种。在可选的实施方式中，所述代谢下调的相关疾病包括下丘脑垂体功能减退、垂体卒中，手术切除垂体、垂体柄切除术、垂体促肾上腺皮质激素肿瘤，原发性Cushing病，肾上腺皮质肿瘤、应用大剂量皮质激素，继发于垂体功能减低的肾上腺皮质功能减退症(Simmonds-Sheehan综合征)中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒。
另一方面，本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其编码前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段。
另一方面，本发明实施例还提供了一种载体，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸。
另一方面，本发明实施例还提供了一种细胞，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸或如前述任意实施例所述的载体。
另一方面，本发明实施例还提供了一种制备如前述任意实施例所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如前述任意实施例所述的细胞。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1Anti-ACTH 13C9单克隆抗体的制备
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTMRACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由基因测序公司完成。分泌Anti-ACTH 13C9单克隆抗体的杂交瘤细胞株为已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。
1.表达载体的构建
1.1、Anti-ACTH 13C9抗体基因制备
从分泌Anti-ACTH 13C9单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，并将其插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因的阳性克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。
1.2、Anti-ACTH 13C9抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为336bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为348bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
1.3、重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体经改造引入多克隆酶切位点，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-ACTH 13C9抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有限制性内切酶酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.74KB的Light Chain基因片段和1.44kb的HeavyChain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用限制性内切酶进行双酶切，3.4A载体采用限制性内切酶进行双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和LightChain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2.重组抗体的样品制备
提前复苏HEK293细胞，传代培养到200ml体系，使细胞密度达到3～5×106cells/ml，细胞活力>95％；离心清洗细胞，用培养基复溶，同时将细胞密度调整到2.9×106cells/ml，作为细胞稀释液。用培养基分别配制质粒DNA和转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入到质粒DNA稀释液中，混匀后室温静置放置15min；将该混合物在1min内缓慢加入细胞稀释液中，混匀后取样计数，记录并观察细胞转染后的活力，并将其放置于35℃恒温培养箱中培养，转速120rmp，CO2含量8％，13天后离心收样。将离心上清用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。
实施例2性能优化
申请人对实施例1得到的Anti-ACTH 13C9单克隆抗体的重链和轻链进行了定向突变，即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。经筛选，得到抗体活性显著提升的单克隆抗体，并命名为：Anti-ACTH-13C9RMb1至Anti-ACTH-13C9RMb5，各抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如下。
表1抗体序列
| 样品名称 | 重链序列 | 轻链序列 |
| Anti-ACTH-13C9RMb1 | SEQ ID NO：12 | SEQ ID NO：19 |
| Anti-ACTH-13C9RMb2 | SEQ ID NO：13 | SEQ ID NO：19 |
| Anti-ACTH-13C9RMb3 | SEQ ID NO：14 | SEQ ID NO：19 |
| Anti-ACTH-13C9RMb4 | SEQ ID NO：13 | SEQ ID NO：20 |
| Anti-ACTH-13C9RMb5 | SEQ ID NO：14 | SEQ ID NO：20 |
实施例3
1.活性鉴定
包被液(主要成分NaHCO3)稀释ACTH(购自生工生物，货号T510014-0001)至0.5μg/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成分Na2HPO4+NaCl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体和对照抗体，100μL/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50μL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。
表2活性鉴定数据
| 浓度(ng/ml) | 15.625 | 7.813 | 3.906 | 1.953 | 0.977 | 0 |
| 对照抗体 | 1.201 | 0.724 | 0.410 | 0.301 | 0.181 | 0.022 |
| Anti-ACTH-13C9RMb1 | 1.534 | 1.241 | 0.655 | 0.518 | 0.207 | 0.027 |
| Anti-ACTH-13C9RMb2 | 1.597 | 1.269 | 0.851 | 0.639 | 0.301 | 0.021 |
| Anti-ACTH-13C9RMb3 | 1.494 | 1.297 | 0.782 | 0.606 | 0.298 | 0.028 |
| Anti-ACTH-13C9RMb4 | 1.763 | 1.244 | 0.772 | 0.640 | 0.361 | 0.021 |
| Anti-ACTH-13C9RMb5 | 1.598 | 1.218 | 0.876 | 0.553 | 0.244 | 0.034 |
2.性能评估
将上述抗体作为标记端抗体，通过化学偶联标记吖啶酯，另一株特异性识别ACTH的单克隆抗体标记磁微粒，组合配对采用化学发光检测模式进行性能评估，具体的实验数据如下。
表3性能评估结果
3.稳定性考核
将上述单克隆抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明该抗体稳定。下表为考核21天的酶免活性检测OD结果。
表4稳定性结果
| 样品浓度(ng/ml) | 15.625 | 1.953 | 0 |
| 4℃，21天样品 | 1.754 | 0.626 | 0.034 |
| -80℃，21天样品 | 1.772 | 0.639 | 0.029 |
| 37℃，21天样品 | 1.743 | 0.610 | 0.027 |
本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示。
| 序列(5'-3’) | SEQ ID NO： | |
| HCDR1 | DNTMH | 1 |
| HCDR2 | GINPKNGATTYNPEFKD | 2 |
| HCDR3 | GGSWF | 3 |
| LCDR1 | RSSQSLLHSNGTTYLH | 4 |
| LCDR2 | KVSNRFS | 5 |
| LCDR3 | SQTTHVP | 6 |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (22)
1.一种抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括（a）~（d）中的任意一种：
（a）氨基酸序列依次如SEQ ID No:1~3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和氨基酸序列依次如SEQ ID No:4~6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
（b）氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的轻链可变区，或氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示的轻链可变区，或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的轻链可变区，或氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的轻链可变区，或氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的轻链可变区；
（c）氨基酸序列与（b）所示序列具有80%以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括（a）所示序列的HCDR1~HCDR3和LCDR1~LCDR3；
（d）氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的轻链，或氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的轻链，或氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的轻链，或氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的轻链，或氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的轻链。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区。
3.根据权利要求2所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区。
4.根据权利要求3所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
5.根据权利要求2所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为小鼠。
7.根据权利要求3所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:11所示或与其具有至少80%的同一性；所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:18所示或与其具有至少80%的同一性。
8.根据权利要求1~7任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F（ab’）2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
9.一种抗体偶联物，其特征在于，其包括如权利要求1~8任一项所述的抗体或其功能性片段。
10.根据权利要求9所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的生物素。
11.根据权利要求9所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的固相载体。
12.根据权利要求9所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其功能性片段偶联的标记物。
13.根据权利要求12所述的抗体偶联物，其特征在于，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的抗体偶联物，其特征在于，所述标记物为胶体金。
15.一种检测促肾上腺皮质激素的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1~8任一项所述的抗体或其功能性片段或如权利要求9～14任一项所述的抗体偶联物。
16.如权利要求1～8任一项所述的抗体或其功能性片段或如权利要求9～14任一项所述的抗体偶联物在制备检测促肾上腺皮质激素的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，检测促肾上腺皮质激素，包括：
将如权利要求1~8任一项所述的抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段或如权利要求9～14任一项所述的抗体偶联物与待检测样品混合，使抗促肾上腺皮质激素抗体或其功能性片段与待测样本中的促肾上腺皮质激素接触，形成免疫复合物。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与促肾上腺皮质激素结合。
19.一种分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1~8任一项所述的抗体或其功能性片段。
20.一种载体，其特征在于，其含有权利要求19所述的分离的核酸。
21.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求19所述的分离的核酸或权利要求20所述的载体。
22.一种制备权利要求1~8任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求21所述的细胞。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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