CN117720644A

CN117720644A - 抗猴痘病毒抗体或其抗原结合片段、检测猴痘病毒的试剂和试剂盒

Info

Publication number: CN117720644A
Application number: CN202311174645.2A
Authority: CN
Inventors: 孟媛; 钟冬梅; 唐丽娜; 游辉; 曹慧方
Original assignee: Fapon Biotech Inc
Current assignee: Fapon Biotech Inc
Priority date: 2022-09-16
Filing date: 2023-09-11
Publication date: 2024-03-19

Abstract

本发明公开了抗猴痘病毒抗体或其抗原结合片段、检测猴痘病毒的试剂和试剂盒，涉及抗体领域。本发明公开的抗猴痘病毒抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为猴痘病毒的检测提供了重要的原料来源，具有改善的亲和力或活性。

Description

抗猴痘病毒抗体或其抗原结合片段、检测猴痘病毒的试剂和试剂盒

相关申请的交叉引用

本公开要求于2022年09月16日提交的中国专利局的申请号为202211126051.X，名称为“抗猴痘病毒抗体或其功能性片段、检测猴痘病毒的试剂和试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及抗猴痘病毒抗体或其抗原结合片段、检测猴痘病毒的试剂和试剂盒。

背景技术

猴痘是由猴痘病毒(Monkeypox virus，MPXV)引起的。猴痘病毒是一种双链DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属的一员。猴痘是一种病毒性人畜共患病，主要发生在中非和西非的热带雨林地区，偶尔输出到其它地区。目前研究发现，病毒经黏膜和破损的皮肤侵入人体。人主要通过接触感染动物病变渗出物、血液、其它体液，或被感染动物咬伤、抓伤而感染。人与人之间主要通过密切接触传播，也可通过飞沫传播，接触被病毒污染的物品也有可能感染，还可通过胎盘垂直传播。尚不能排除性传播。

在临床症状上，猴痘的感染症状与天花相似，但猴痘的临床症状较轻，潜伏期5-12天，多为6-13天。患者发病初期表现为发热、头痛、淋巴结肿大、肌肉酸痛、重度疲乏等症状，之后会引起面部和身体的皮疹。猴痘为自限性疾病，患者通常会在两到三个星期内自行康复；但对于儿童、孕妇或由于其他健康状况而免疫抑制的人来说，猴痘可能会导致其他继发性感染，如肺炎、败血症和脑炎等严重疾病。

目前，猴痘病毒的检测方法主要是PCR扩增法和免疫检测法，PCR扩增法是国内外检测猴痘病毒的主要检测方法，但对仪器设备、检测场地及环境条件要求高，存在检测时间长、通量低等缺点，不便于人群大规模检测。而基于胶体金的免疫检测法具有快速、方便、易携带等的优势，因此成为研发的热点，而胶体金的检测性能依赖于针对猴痘病毒的抗体的性能。因此，本领域对于有效结合猴痘病毒并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。

发明内容

本发明的目的在于提供抗猴痘病毒抗体或其抗原结合片段、检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原的试剂和试剂盒。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3组合与SEQ ID NO:7～10任一所示重链可变区包含的HCDR1/HCDR2/HCDR3组合相同，所述LCDR1/LCDR2/LCDR3组合与SEQ ID NO:11所示轻链可变区包含的LCDR1/LCDR2/LCDR3组合相同。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括(a)～(c)中的任意一种：

(a)HCDR1～3和LCDR1～3；HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次包括SEQ IDNo:1～3或依次如SEQ ID No:1～3所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次包括SEQID No:4～6或依次如SEQ ID No:4～6所示；

(b)重链可变区和轻链可变区；重链可变区包括SEQ ID NO:7～10任一所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:7～10任一所示的氨基酸序列组成；轻链可变区包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成；

(c)氨基酸序列与(b)所示重链可变区或/和轻链可变区序列具有至少80％同一性的重链可变区或/和轻链可变区，且包括(a)所示序列的HCDR1～HCDR3和LCDR1～LCDR3。

第二方面，本发明实施例提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的结合表位与上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段的结合表位相同；或，所述抗体或其抗原结合片段与上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争性结合相同的表位。

第三方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

第四方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段或如前述实施例所述的抗体偶联物。

第五方面，本发明实施例提供了一种检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原的方法，其包括：将如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒与待测样本中的猴痘病毒或猴痘病毒抗原接触，形成免疫复合物。

第六方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

第七方面，本发明实施例提供了一种载体，其含有前述实施例所述的分离的核酸。

第八方面，本发明实施例提供了一种细胞，其含有前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体。

第九方面，本发明实施例提供了一种制备前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养前述实施例所述的细胞。

第十方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒在检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原或制备检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原的产品中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开的抗猴痘病毒抗体包括上述重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为猴痘病毒或猴痘病毒抗原的检测提供了重要的原料来源，具有改善的亲和力或活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Anti-MPXV 11D3RMb1～4的还原性SDS-PAGE的结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。

在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。

在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，重链可变区中含有的3个CDR包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，轻链可变区中含有的3个CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在可选的实施方式中，所述CDRs由Kabat、Chothia、IMGT或Lesk编号系统定义。

在可选的实施方式中，所述CDRs可以根据Kabat、Chothia、AbM、Contact或IMGT系统定义。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。还有其他CDRs定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍会与Kabat定义的CDRs的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组的预测或实验结果可能会缩短或延长它们。如本文所述，CDR可以指由本领域已知的任何方法定义的CDR，包括方法的组合。

在可选的实施方式中，所述CDRs可以指由本领域已知的任何方法定义的CDRs。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：

(a)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次包括SEQ ID No:1～3或依次如SEQ IDNo:1～3所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次包括SEQ ID No:4～6或依次如SEQID No:4～6所示。

在可选的实施方式中，所述CDRs由在Kabat系统定义的CDRs基础上，在HCDR3的C端缩短3个氨基酸，LCDR3的C端缩短2个氨基酸。

第二方面，本发明实施例提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：(a)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次包括SEQ ID No:1～3或依次如SEQ ID No:1～3所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次包括SEQ ID No:4～6或依次如SEQ ID No:4～6所示。

在可选的实施方式中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3分别对应Kabat编号下的H31～H35、H50～H65、H95～H100B、L24～34、L50～56、L89～95位置区段的氨基酸。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包括框架区。

在可选的实施方式中，上述第一方面、第二方面所述的抗体或其抗原结合片段包括：

(b)重链可变区和轻链可变区；重链可变区包括SEQ ID NO:7～10任一所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:7～10任一所示的氨基酸序列组成；轻链可变区包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成。

第三方面，本发明实施例提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：(b)重链可变区和轻链可变区；重链可变区包括SEQ ID NO:7～10任一所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:7～10任一所示的氨基酸序列组成；轻链可变区包括SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成。

在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。

在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括：

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:7～10任一所示的重链可变区中的重链框架区，和SEQ ID NO:11所示的轻链可变区中的轻链框架区。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的框架区氨基酸序列可以与上述框架区具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包含恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区包括SEQ ID NO:12或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区由SEQ ID NO:12或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列组成。

在可选的实施方式中，所述轻链恒定区包括SEQ ID NO:13或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述轻链恒定区由SEQ ID NO:13或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列组成。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括重链和轻链；所述重链包括SEQ ID NO:14～17任一所示或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列；或，由SEQ IDNO:14～17任一所示或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列组成；所述轻链包括SEQID NO:18或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列；或，由SEQ ID NO:18或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列组成。

具体地，上述“至少80％同一性”，可以是具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且同一性的变体位点不在CDRs区。

另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的结合表位与上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段的结合表位相同；或，所述抗体或其抗原结合片段与上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争性结合相同的表位。

在可选的实施方式中，所述相同的表位位于猴痘病毒A29L蛋白氨基酸序列1至110之中；或，所述抗体或其抗原结合片段与上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争性结合猴痘病毒A29L蛋白。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD≤7.36×10^-8M的亲和力结合猴痘病毒抗原。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD≤10^-8M、KD≤10^-9M、KD≤10^-10M、KD≤10^-11M、KD≤10^-12M的亲和力结合猴痘病毒抗原。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD≤1.78×10^-9M的亲和力结合猴痘病毒抗原。

在可选的实施方式中，所述抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括上述任一实施例所述的HCDR1～HCDR3和所述轻链可变区包括上述任一实施例所述的LCDR1～LCDR3。

在可选的实施方式中，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

上述抗体的抗原结合片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。

在本发明中，术语“抗原结合片段”和具有与其来源抗体相同的结合特异性的“功能性性片段”可互换使用。

本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的抗原结合片段。

上述抗体的抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体偶联物，其包括如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的生物素或生物素衍生物。

在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的标记物。

在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。

在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、胶体硒、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金或胶体银。

在可选的实施方式中，所述胶体金属为胶体金。

在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体。抗体偶联物中，所述抗体偶联至固相载体。

在可选的实施方式中，所述固相载体选自微球、板和膜。

在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。

在可选的实施方式中，所述固相载体为硝酸纤维素膜。

另一方面，本发明实施例还提供了一种试剂或试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段或如前述任意实施例所述的抗体偶联物。

在可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒具有提高的检测灵敏度或特异性。

另一方面，本发明实施例还提供了一种检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原的方法，其包括：

将如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段或如前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒与待检测样本中的猴痘病毒或猴痘病毒抗原接触，形成免疫复合物。

在优选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段结合。

在优选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与猴痘病毒或猴痘病毒抗原结合。

另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或抗原结合片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原或制备检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原产品中的应用。

另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的抗体或抗原结合片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物或前述任意实施例所述的试剂或试剂盒在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用，所述用途包括：诊断或辅助诊断猴痘病毒感染引发的相关疾病，预测或辅助预测猴痘病毒感染引发相关疾病的预后疗效中的至少一种。

在可选的实施方式中，所述猴痘病毒感染引发的相关疾病包括发热、头痛、淋巴结肿大、肌肉酸痛、重度疲乏、肺炎、败血症和脑炎中的至少一种。

在可选的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒。

另一方面，本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其编码前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本发明实施例还提供了一种载体，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸。

另一方面，本发明实施例还提供了一种细胞，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸或如前述任意实施例所述的载体。

另一方面，本发明实施例还提供了一种制备如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养如前述任意实施例所述的细胞。

在本发明公开了抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其抗原结合片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其抗原结合片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其抗原结合片段，其均属于本发明的保护范围。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

实施例1Anti-MPXV 11D3单克隆抗体的制备

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由基因测序公司完成。分泌Anti-MPXV 11D3单克隆抗体的杂交瘤细胞株为本实验室制备的杂交瘤细胞株，复苏备用。

1.表达质粒构建

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由基因测序公司完成。

1.1Anti-MPXV 11D3抗体基因制备

从分泌Anti-MPXV 11D3单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，并将其插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因的阳性克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。

1.2Anti-MPXV 11D3抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为333bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为366bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

1.3重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体经改造引入多克隆酶切位点，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-MPXV 11D3抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有限制性内切酶酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.71KB的Light Chain基因片段和1.41kb的HeavyChain基因片段。

Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用限制性内切酶进行双酶切，3.4A载体采用限制性内切酶进行双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和LightChain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2.重组抗体的样品制备

提前复苏HEK293细胞，传代培养到200ml体系，使细胞密度达到3～5×10⁶cells/ml，细胞活力>95％；离心清洗细胞，用培养基复溶，同时将细胞密度调整到2.9×10⁶cells/ml，作为细胞稀释液。用培养基分别配制质粒DNA和转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入到质粒DNA稀释液中，混匀后室温静置放置15min；将该混合物在1min内缓慢加入细胞稀释液中，混匀后取样计数，记录并观察细胞转染后的活力，并将其放置于35℃恒温培养箱中培养，转速120rmp，CO2含量8％，13天后离心收样。将离心上清用protein A亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。

3.亲和力及活性优化

上述制备得到的Anti-MPXV 11D3单克隆抗体虽然具备结合猴痘病毒抗原的能力，但亲和力和抗体活性均不够理想，因而申请人通过对该抗体的可变区进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照上述2的方法进行突变抗体的制备。经筛选，得到亲和力和抗体活性显著提升的单克隆抗体，并命名为Anti-MPXV 11D3RMb1至Anti-MPXV 11D3RMb4，其重链和轻链氨基酸序列分别如下。

表1抗体序列

样品名称	重链序号	轻链序号
			Anti-MPXV 11D3RMb1	SEQ ID NO:14	SEQ ID NO:18
Anti-MPXV 11D3RMb2	SEQ ID NO:15	SEQ ID NO:18
			Anti-MPXV 11D3RMb3	SEQ ID NO:16	SEQ ID NO:18
Anti-MPXV 11D3RMb4	SEQ ID NO:17	SEQ ID NO:18

实施例2亲和力分析

提前稀释纯化抗体，同时对猴痘重组抗原(购自菲鹏生物)进行梯度稀释；利用已提前偶联羊抗小鼠IgG的CM5芯片，在Biacore 8K+设备上测试抗原抗体的结合解离曲线，仪器自动拟合获得亲和力常数、结合速率、解离速率。(KD表示平衡解离常数即亲和力常数；ka表示结合速率；kd表示解离速率)。

表2亲和力分析数据

实施例3活性鉴定

包被液(主要成分NaHCO3)稀释重组猴痘重组抗原(购自菲鹏生物)至1ug/ml，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na₂HPO4+Nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体和对照抗体，100uL/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

表3活性数据

浓度(ng/ml)	31.25	15.63	7.81	3.91	1.95	0.00
							对照抗体	1.324	0.754	0.402	0.233	0.114	0.017
Anti-MPXV 11D3RMb1	2.148	1.757	0.995	0.502	0.165	0.012
							Anti-MPXV 11D3RMb2	2.144	1.778	0.972	0.524	0.174	0.013
Anti-MPXV 11D3RMb3	2.158	1.756	0.998	0.558	0.185	0.012
							Anti-MPXV 11D3RMb4	2.176	1.732	0.923	0.576	0.177	0.015

实施例4抗体稳定性考核

将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明表达的抗体稳定。下表为考核21天的酶免活性检测OD结果。

表4稳定性数据

样品浓度(ng/ml)	15.63	7.81	0.00
				4℃，21天样品	1.756	0.927	0.012
-80℃，21天样品	1.738	0.938	0.013
				37℃，21天样品	1.772	0.991	0.011

实施例5性能评估

通过ELISA，鉴定上述制备的抗体与猴痘病毒A29L蛋白的反应性。ELISA操作如下：分别用0.5μg/ml和0.05μg/ml的MKPVA29L以100ul/孔包被微量滴定板，37℃孵育2h。BSA封闭。将上述制备的抗体均用PBS稀释至0.5ug/ml、0.05ug/ml，50ul/孔，37℃孵育30min。

阴性对照：加入PBS孵育。

二抗：100ul/孔，加入羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育30min。

显色：各加50ulA、B液，10min后加50ul终止液，读数。

结果显示上述制备的抗体与猴痘病毒A29L蛋白的反应性均优于对照。

表5性能评估数据

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本申请涉及的部分氨基酸序列如下表6所示：

表6氨基酸序列

Claims

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其特征在于，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3组合与SEQ ID NO:7～10任一所示重链可变区包含的HCDR1/HCDR2/HCDR3组合相同，所述LCDR1/LCDR2/LCDR3组合与SEQID NO:11所示轻链可变区包含的LCDR1/LCDR2/LCDR3组合相同。

2.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括(a)～(c)中的任意一种：

(a)HCDR1～3和LCDR1～3；HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次包括SEQ ID No:1～3或依次如SEQ ID No:1～3所示；LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次包括SEQ ID No:4～6或依次如SEQ ID No:4～6所示；

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包含恒定区；

可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；

可选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；

可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种；

可选地，所述重链恒定区包括SEQ ID NO:12所示或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列；或由SEQ ID NO:12或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列组成；

可选地，所述轻链恒定区包括SEQ ID NO:13所示或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；或，由SEQ ID NO:13所示或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列组成；

可选地，所述抗体或其抗原结合片段包括重链和轻链；所述重链包括SEQ ID NO:14～17任一所示或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列；或，由SEQ ID NO:14～17任一所示或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列组成；所述轻链包括SEQ ID NO:18或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列；或，由SEQ ID NO:18或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列组成。

4.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的结合表位与权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段的结合表位相同；或，所述抗体或其抗原结合片段与权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争性结合相同的表位；

可选地，所述相同的表位位于猴痘病毒A29L蛋白氨基酸序列1至110之中；或，所述抗体或其抗原结合片段与权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争性结合猴痘病毒A29L蛋白。

5.根据权利要求1～4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，

所述抗体或其抗原结合片段以KD≤7.36×10^-8M的亲和力结合猴痘病毒抗原；

可选地，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述CDRs由Kabat、Chothia、AbM、Contact或IMGT系统定义。

7.一种抗体偶联物，其特征在于，其包括如权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的生物素或生物素衍生物；

可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体；

可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的标记物；

可选地，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种；

可选地，所述标记物为胶体金。

8.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求7所述的抗体偶联物。

9.一种检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原的方法，其特征在于，其包括：

将如权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求7所述的抗体偶联物或如权利要求8所述的试剂或试剂盒与待检测样本中的猴痘病毒或猴痘病毒抗原接触，形成免疫复合物；

可选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段结合；

可选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与猴痘病毒或猴痘病毒抗原结合。

10.一种分离的核酸、载体、细胞或制备权利要求1～6任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～6任一项所述的抗体或其功能性片段；所述载体含有上述的核酸；所述细胞含有上述的核酸或载体；所述方法包括：培养权利要求上述的细胞。

11.如权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求7所述的抗体偶联物或如权利要求8所述的试剂或试剂盒在检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原或制备检测猴痘病毒或猴痘病毒抗原的产品中的应用。