KR102660061B1 - 항 열대열 말라리아 원충 hrp-ii 항체 - Google Patents
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Abstract
항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 항체 또는 그 항원 결합 단편을 제공하는 것으로, 상기 항체는 SEQ ID NO: 1-3으로 표시되는 중쇄CDR1-3와 SEQ ID NO:4-6으로 표시되는 경쇄CDR1-3를 포함한다. 상기 항체의 용도 및 상기 항체의 제조 방법을 더 제공한다.
Description
관련 출원의 교차인용
본 출원은 2018년 12월 29일에 중국특허청에 제출한 출원번호가 201811654293.X이고, 발명의 명칭이 "항 열대열 말라리아 원충 HRP-II항체"인 중국특허출원의 우선권을 주장할 것을 요구하여, 모든 내용은 본 출원에 인용 결합된다.
기술분야
본 공개는 말라리아 원충 항체, 그 용도 및 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 공개는 히스티딘-풍부 단백질-II (Histidine-rich protein II, HRP-II)의 항체, 말라리아를 검출 또는 진단하기 위한 그 용도, 및 상기 항체의 제조방법에 관한 것이다.
말라리아(Malaria)는 모기에게 물리거나 말라리아 원충을 갖는 자의 혈액을 수혈하여 말라리아 원충에 감염되어 일으키는 충매 전염병 중의 하나이다. 인체에서 기생하는 말라리아 원충은 주로 네가지가 있는데 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax, pv), 열대열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum, Pf), 사일열 말라리아 원충(Plasmodium malariae, pm), 난형 말라리아 원충(Plasmodium ovale, po)이다. 열대열 말라리아 원충은 흔히 보는 감염성 말라리아 원충(75%)으로서, 위험성이 가장 큰 병원체인 바, 이의 감염성이 강하고, 증식이 빠르며, 증상이 엄중하고, 최초 감염자 치사율이 높아, 이로 인한 사망은 감염자 사망 총수의 95%이상을 차지하고, 주로 아프리카, 남아메리카와 아시아의 열대지역에 존재한다. 열대열 말라리아 원충 감염은 아프리카 5세 이하의 아동들이 사망하는 가장 주된 원인이다. 삼일열 말라리아 원충은 두번째로 흔히 보는 말라리아 원충(20%)으로서, 이의 감염으로 인한 증상은 비교적 가볍지만, 더욱 광범위하게 분포되어, 이의 위협을 받고 있는 인구는 대략 2628.5억에 달하여, 매년 발병율이 8000만을 초과하고, 주로 동남아, 남아시아와 아메리카 아열대지역에 분포된다. WHO의 건의에 따르면, 모든 말라리아 의심환자는 응당 즉시로 말라리아 검출을 진행하여, 질환에 대한 빠르고 정확한 진단을 통해 항말라리아약을 정확하게 사용하여, 약물 내성 균주의 발생을 방지 및 병세악화를 제어하여, 사망율을 낮추는 것이 매우 중요하다.
말라리아 진단은 말라리아 예방 퇴치 작업의 중점이다. 검출 기술 원리로부터 분류해보면, 현재 말라리아 원충을 검출하는 방법은 네가지로 나눌 수 있다. 첫번째는 현미경으로 후혈막과 박혈막을 포함한 말라리아 원충을 직접 검출하는데, 이 역시 현재 임상적으로 말라리아를 진단하는 골든 표준이다. 그러나 시간, 인력이 소모되고, 숙련된 기술자와 일정한 실험조건을 수요로 한다. 두번째는 말라리아 원충 핵산검출로서, 검출타겟은 말라리아 원충 18S 리보솜 RNA등 특이성 뉴클레오티드 단편이고, 자주 사용하는 방법은 형광 PCR방법과 고리-매개 등온 증폭기술(loop-mediated isothermal amplification LAMP)이다. 상기 방법은 민감도와 특이성이 높지만, 더욱 복잡한 기기장치와 기술조건의 지원을 받아야 하기에, 말라리아 유행지역의 통상적인 검출수단으로는 적합하지 않아, 기층에서 광범위하게 보급 및 적용되기 어렵다. 세번째는 말라리아 원충 색소를 검출하는 것으로, 통삭적으로 유세포 검출기술 또는 질량 스펙트럼 방법을 사용한다. 상기 방법은 전문적인 검출기기를 수요로 하되, 일반적으로 실험실 연구에 사용되지, 현장 검출에 적용되지 않는다. 네번째는 항원 항체의 면역반응으로 말라리아 원충을 검출하는 것으로, 방법학에서는 면역 크로마토그래피 쾌속 진단 시약(RDT)과 효소결합 면역흡착(ELISA)이 있고, 검출되는 타겟항원은 대부분 LDH, HRP-II 등 진단항원이다. 항원을 검출목표로 하는 RDT은 열대열 말라리아 원충이 유행하는 낙후한 지역에 적용되는 것에 중요한 의미가 있는 바, 그 조작이 간단하고, 빠르며, 결과가 직관적이고, 복잡한 기기가 필요없고, 민감성과 특이성이 높은 등 우점이 있기 때문에, WHO에서 현장진단에 사용할 것을 추천하는 방법이다.
현재, 자주 사용되는 말라리아 검출 항원은 주로 열대열 말라리아 원충 특유의 히스티딘 풍부 단백질-II (Histidine-rich protein II, HRP-II)과 말라리아 원충 젖산탈수소효소(Plasmodium Lactate dehydiogenase, PLDH)이다. HRP-II은 열대열 말라리아 원충 특유의 35-105 kDa 수용성 단백질로서, 적혈구 내발육기 무성체기와 조기 배우체기에만 합성되는데, 합성은 미성숙된 고리형상으로부터 시작되어, 함량은 전체 적혈구 내발육기에서 메로조이트의 분열에 따라 점차적으로 높아지되, 28d까지 지속가능하여, 성숙한 배우체기에서 검출되기 어렵다. HRP-II 단백질은 가용형식으로 숙주혈액에 분비되는 동시에, 상기 단백질은 뇌척수액, 오줌 및 타액 중에서 모두 검출가능한 것으로서, 가장 인정되는 열대열 말라리아 원충 진단 마커이다. 특이적인 단일 클론 항체에 의해 HRP-II을 검출하여, 인체내 열대열 말라리아 원충의 존재를 판단할 수 있다.
현재, 시중에는 HRP-II을 타겟 단백질로 하여 말라리아 원충을 검출하기 위한 키트가 아주 많은 바, 예하면 국외의 ParaSight-F 키트, ICT Malaria P.f.& P.f/P.v 진단키트, BinaxNOW®키트, CareStart 말라리아HRP-II/PLDH 복합 키트가 있고; 중국 국내에는 아콘(ACON)P.f/P.v 콜로이드 금 면역 크로마토그래피 검출키트 등이 있다. ParaSight-F키트는 세계보건기구에서 추천하는 응용제품으로서, 랫트 항HRP-II IgGl류 단일 클론 항체 및 대조 HRP-II 항원을 사용하여 선형과 점선형으로 스트립형 니트로섬유소막에 피복되어 각각 포획항체와 검출라인으로 되어, 티오로다민B을 지시약으로 하여 현상시켜, 열대열 말라리아만 검출할 수 있다. ICT Malaria P.f/P.v 진단키트는 니트로섬유소막에 1개의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 단일 클론 항체와 1개의 삼일열 말라리아 종속 특이성 단일 클론 항체를 포획항체로서 피복하여, 콜로이드 금 표지로 현상시켜, 열대열 말라리아, 삼일열 말라리아와 혼합감염된다. BinaxNOW®키트는 2가지 다른 단일 클론 항체를 적용하고, 검출타겟 단백질은 HRP-II와 알돌라아제이며, HRP-II은 열대열 말라리아 특유의 성분이고, 알돌라아제는 4가지 인간 말라리아 감염 원충에서 공유되는 성분인 바, 단순 열대열 말라리아(악성 말라리아)와 열대열 말라리아를 제외한 기타 인간 말라리아 원충을 검출한다. CareStart 말라리아HRP-II/PLDH 복합 키트는 2가지 단일 클론 단량체를 사용하여 막에 별도의 두갈래의 검출라인을 형성하되, 각각 항말라리아 원충속(열대열 말라리아, 삼일열 말라리아, 난형 말라리아, 사일열 말라리아)의 젖산탈수소효소(PLDH)단일 클론 항체와 항HRP-II 단일 클론 항체인 바, 열대열 말라리아와 기타형식의 말라리아의 동정 및 진단에 전문적으로 사용된다. ACON P.f/P.v 콜로이드 금 면역 크로마토그래피 검출키트는 각각 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II과 항 삼일열 말라리아 원충PLDH 단일 클론 항체를 포획항체로서 사용하여, 단순 열대열 말라리아와 단순 삼일열 말라리아의 감염을 진단한다.
상기 각종 키트에서, 항HRP-II 단일 클론 항체를 사용하였다. 현재, 시중에서 진단을 위한 단일 클론 항체의 통상적인 제조방법은 하이브리도마 기술인 바, 즉 유전자공학 기술을 이용하여 HRP-II 단백질을 발현하여 마우스를 면역시키고, 면역시킨 마우스 비세포와 종양세포를 융합하여 하이브리도마 세포를 얻고, 최종적으로 목표 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 선별한 후, 항체를 생산한다. 그러나 기존의 하이브리도마 기술은, 하이브리도마 세포가 배양 또는 동결보존 및 소생하는 과정에서, 일부분 세포들이 항체를 분비하는 능력을 상실하게 되는데, 일부 귀중한 세포주들을 분실하게 된다. 이밖에, 항체를 대량생산할 때 체외에서 하이브리도마 세포를 대량으로 배양하되, 그 생산량은 적고, 생산비용이 높으며; 마우스 복강 유도과정에서, 마우스 개체 크기의 영향으로 인해, 항체의 생산이 불안정하고, 배치 사이의 차이값이 크며, 마우스 자체 항체를 함유함으로 인해 정제 난이도가 커졌다.
기존의 하이브리도마 기술의 미흡함을 방지하기 위하여, 본 공개는 항HRP-II 단일 클론 항체의 발현벡터를 설계하여, 고활성과 고친화력을 갖는 항HRP-II 단일 클론 항체서열, 재조합 기술에 의하여 항HRP-II 단일 클론 항체를 발현하는 숙주세포, 고특이성과 고민감도의 말라리아 진단 방법을 제공한다.
본 공개는 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 항체 또는 그 항원결합 단편을 제공한다. 본 공개는 상기 항체의 제조방법, 상기 항체를 포함하는 항체 약물 결합체, 융합단백질과 키트/진단제, 및 열대열 말라리아 원충 감염을 진단하기 위한 상기 항체의 용도를 더 제공한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 항체 또는 그 항원결합 단편을 제공하는 바, 상기 항체는 히스티딘-풍부 단백질-II, 즉 HRP-II과 결합되고, 여기서 상기 항체는 하기 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그이상의 서열 동일성)을 갖는 상보성 결정영역을 포함하되:
SEQ ID NO: 1으로 표시되는 아미노산 서열G-X1-T-X2-T-X3-Y-Y-M-N을 포함하거나, 또는 이에 의해 조성되되, 여기서 X1은 Y, T또는 S이고; X2는 L 또는 I이고; X3은 D 또는 E이고, 바람직하게는 D인 중쇄CDR1;
SEQ ID NO:2으로 표시되는 아미노산 서열 D-X1-N-P-I-X2-G-G-T-X3-Y-X4-Q-K-F을 포함하거나, 또는 이에 의해 조성되되, 여기서 X1은 L, V 또는 I이고; X2는 Q 또는 N이고; X3은 A 또는 P이고, 바람직하게는 A이고; X4는 Q 또는 N인 중쇄CDR2; 와
SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열T-X1-G-A-E-X2-Y을 포함하거나, 또는 이에 의해 조성되되, 여기서 X1은 K 또는 R이고; X2는 D 또는 E이고, 바람직하게는 D인 중쇄CDR3을 포함하고;
또한 상기 항체는
SEQ ID NO:4으로 표시되는 아미노산 서열 S-Q-S-X1-Y-S-X2-G-K-I-Y-X3-N을 포함하거나, 또는 이에 의해 조성되되, 여기서 X1은LL, IL, II 또는 LI이고; X2는 Q 또는 N이고; X3은 I 또는 L이고, 바람직하게는 L인 경쇄CDR1;
SEQ ID N0 5으로 표시되는 아미노산 서열Q-X1-S-K-X2-X3-P을 포함하거나, 또는 이에 의해 조성되되, 여기서 X1은 I, V 또는 L이고; X2는 I 또는 L이고, 바람직하게는 L이고; X3은 D 또는 E인 경쇄CDR2; 와
SEQ ID NO:6으로 표시되는 서열 L-Q-X1-T-Y-X2-P-X3-T을 포함하거나, 또는 이에 의해 조성되되, 여기서 X1은 A 또는 G이고; X2는 S, Y 또는 T이고; X3은 Q 또는 N이고, 바람직하게는 Q인 경쇄CDR3을 더 포함하고;
예를 들어, 상기 항체는 하기 표에 표시된 아미노산 잔기 치환 조합을 포함하는 중쇄CDR1, 중쇄CDR2, 중쇄CDR3, 경쇄CDR1, 경쇄CDR2, 및 경쇄CDR3을 포함할 수 있고:
i) 상기 항체는 하기 표에 표시된 아미노산 잔기 치환 조합을 포함하고:
ii) i) 중의 항체는 하기 표에 표시된 아미노산 잔기 치환 조합을 더 포함하고:
여기서 상기 항체는 10-9 M 또는 더욱 작은 KD으로 HRP-II단백질과 결합된다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 항체 또는 그 항원결합 단편을 제공하는 바, 상기 항체는 HRP-II와 결합되는데, 여기서 상기 항체는
SEQ ID NO: 21으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 조성되는 중쇄CDR1;
SEQ ID NO:22으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 조성되는 중쇄CDR2; 와
SEQ ID NO:23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 조성되는 중쇄CDR3을 포함하고;
상기 항체는
SEQ ID NO: 24으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 조성되는 경쇄CDR1;
SEQ ID NO: 25으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 조성되는 경쇄CDR2; 와
SEQ ID NO:26으로 표시되는 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 조성되는 경쇄CDR3을 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 항체는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역FR-H1, FR-H2, FR-H3과 FR-H4, 및 경쇄가변영역의 프레임워크 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 과 FR-L4을 더 포함할 수 있되, 여기서
FR-H1은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:27으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 SEQ ID NO:27으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 바람직하게는 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 조성되고;
FR-H2는 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:28으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 SEQ ID NO:28으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 바람직하게는 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 조성되고;
FR-H3은 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:29으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 SEQ ID NO:29으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 조성되고;
FR-H4는 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열 또는 SEQ ID N0:30으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 SEQ ID N0:30으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 조성; 및
FR-L1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열 또는 SEQ IDNO:31으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 SEQ ID NO:31으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 조성되고;
FR-L2는 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:32으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 SEQ ID NO:32으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 조성되고;
FR-L3은 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 SEQ ID NO:33으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 조성되고;
FR-L4는 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:34으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 SEQ ID NO:34으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이러한 서열로 조성된다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 항체 또는 그 항원결합 단편을 제공하는 바, 상기 항체는 HRP-II와 결합되는데, 여기서 상기 항체는
SEQ ID NO: 17으로 표시되는 아미노산 서열, 또는
SEQ ID NO: 17으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는
SEQ ID NO: 17으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 조성되는 (i) 중쇄 가변 영역; 과
SEQ ID NO: 19으로 표시되는 아미노산 서열, 또는
SEQ ID NO: 19으로 표시되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는
SEQ ID NO: 19으로 표시되는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 조성되는 (II)경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개에 따른 항체는 10-10 M 또는 더욱 작은 KD으로 HRP-II 단백질과 결합된다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개에 따른 항체는 대략 100 nM보다 작고, 예를 들어 대략 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM보다 작거나 또는 더욱 작은 EC50으로 HRP-II 단백질과 결합된다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개에 따른 항체의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 상보성 결정영역(CDR)단편, 단일사슬항체(예를 들어, scFv), 이가항체 또는 도메인 항체를 포함할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 분리된 폴리펩타이드(isolated polypeptide)를 제공하는 바,
(1) SEQ ID NO:21, 22와 23으로 표시되는 서열을 포함하되, 여기서 펩타이드는 항 HRP-II의 항체의 일부분으로서, HRP-II와 특이적으로 결합되고, 상기 항체는 SEQ ID NO:24, 25와 26으로 표시되는 서열을 더 포함하는, 분리된 폴리펩타이드;
(2) SEQ ID NO:24, 25와 26으로 표시되는 서열을 포함하되, 여기서, 펩타이드는 항 HRP-II의 항체의 일부분으로서, HRP-II와 특이적으로 결합되고, 상기 항체는 SEQ ID NO:21, 22와 23으로 표시되는 서열을 더 포함하는, 분리된 폴리펩타이드;
(3) SEQ ID NO: 17으로 표시되는 서열 또는 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 상기 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하되, 여기서 펩타이드는 항HRP-II의 항체의 일부분으로서, HRP-II와 특이적으로 결합되고, 상기 항체는 SEQ ID NO: 19으로 표시되는 서열 또는 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 상기 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 더 포함하는, 분리된 폴리펩타이드;
(4) SEQ ID NO: 19으로 표시되는 서열 또는 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 상기 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하되, 여기서 펩타이드는 항HRP-II의 항체의 일부분으로서, HRP-II와 특이적으로 결합되고, 상기 항체는 SEQ ID NO: 17으로 표시되는 서열 또는 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 또는상기 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 더 포함하는, 분리된 폴리펩타이드;
(5) SEQ ID NO: 18으로 표시되는 서열 또는 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 상기 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하되, 여기서 폴리펩타이드는 항HRP-II의 항체의 일부분으로서, HRP-II와 특이적으로 결합되고, 상기 항체는 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 서열 또는 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 상기 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 더 포함하는, 분리된 폴리펩타이드;
(6) SEQ ID NO: 20으로 표시되는 서열 또는 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 상기 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 포함하되, 여기서 상기 폴리펩타이드는 항HRP-II의 항체의 일부분으로서, HRP-II와 특이적으로 결합되고, 상기 항체는 SEQ ID NO: 18으로 표시되는 서열 또는 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 상기 서열에 비해 하나 또는 다수의(바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 돌연변이(바람직하게는 보존적 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하는 아미노산 서열을 더 포함하는, 분리된 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하는 바, 본 공개의 항체 또는 그 항원 결합 단편 또는 분리된 폴리펩타이드를 코딩한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 벡터를 제공하는 바, 본 명세서에 기술된 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 숙주세포를 제공하는 바, 본 명세서에 기술된 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 본 명세서에 기술된 항체 또는 그 항원결합 단편을 제조하는 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 항체약물 결합체를 제공하는 바, 본 명세서에 기술된 항체 또는 그 항원 결합 단편 및 이와 결합되는 결합 부분을 포함하되, 바람직하게는, 상기 결합 부분은 정제태그(예하면 His태그), 검출가능한 표지, 예를 들어 콜로이드 금, 방사성 표지, 발광물질, 유색물질, 효소, 예를 들어 형광표지, 발색단 표지, 전자밀도표지, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광단, 로다민 및 그 유도체, 루시퍼라아제, 루시페린, 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당류 옥시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토스 옥시다아제, 글루코스-6-인산탈수소효소, 바이오틴/아비딘, 스핀표지(purification tag (such as a His tag), a detectable label, such as a colloidal gold, a radioactive label, a luminescent substance, a colored substance, an enzyme, such as a fluorescent label, a chromophore label, an electronic dense label, such as a radioisotope, a fluorophore, rhodamine and a derivative thereof, a luciferase, a luciferin, a horseradish peroxidase, an alkaline phosphatase, a β-galactosidase, a glucoamylase, a lysozyme, a carbohydrate oxidase, a glucose oxidase, a galactose oxidase, and a glucose-6-phosphate dehydrogenase, biotin/avidin, and a spin label)로부터 선택되는 것을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 키트 또는 진단제를 제공하는 바, 본 명세서에 기술된 항체 또는 그 항원 결합 단편, 항체약물 결합체 또는 융합단백질을 포함하되, 여기서:
1) 바람직하게는, 상기 키트는 HRP-II 이외의 말라리아 항원과 결합되는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 항체약물 결합체, 또는 융합단백질을 더 포함하되, 예를 들어 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충 및/또는 난형 말라리아 원충의 특이성 항원 또는 공통 항원, 예를 들어 알돌라아제, 예를 들어 젖산탈수소효소PLDH, 예를 들어 말라리아 원충 젖산탈수소효소PLDH 또는 말라리아 원충종 특이성 젖산탈수소효소 PLDH를 포함하고,
2) 바람직하게는, 상기 키트는 또 다른 하나 또는 다수의 항체를 더 포함하고, 본 명세서에 기술된 항체 또는 그 항원 결합 단편, 항체약물 결합체, 또는 융합단백질을 특이적으로 식별; 및/또는 HRP-II이외의 말라리아 항원과 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 항체약물 결합체, 또는 융합단백질을 특이적으로 식별하되, 바람직하게는, 상기 또 다른 하나 또는 다수의 항체는 검출가능한 표지, 예를 들어 콜로이드 금, 방사성 표지, 발광물질, 유색물질, 효소, 예를 들어 형광표지, 발색단 표지, 전자밀도표지, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광단, 로다민 및 그 유도체, 루시퍼라아제, 루시페린, 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당류 옥시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토스 옥시다아제, 글루코스-6-인산탈수소효소, 바이오틴/아비딘, 스핀표지를 더 포함하고;
3) 임의로 선택가능한 것은, 상기 키트는 쾌속진단(RDT)키트로서, 예를 들어 박막면역크로마토그래피를 응용하는 키트, 예를 들어 콜로이드 금법의 박막면역크로마토그래피를 사용하는 키트인 바, 예를 들어 막지지물과 같은 고체상 지지물을 포함하고, 말라리아 항원과 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 항체약물 결합체, 또는 융합단백질 및 임의로 선택되는 대조항체를 상기 고체상 지지물에 고정시키고;
4) 임의로 선택가능한 것은, 상기 키트는 효소결합 면역흡착(ELISA)키트이다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 본 명세서에 기술된 항체 또는 그 항원결합 단편, 항체약물 결합체, 또는 융합단백질이 키트 또는 진단제를 제조함에 있어서의 용도를 제공하는 바, 상기 키트는 1) HRP-II이 샘플 중에서의 존재 또는 이의 수준을 검출하고, 2) 열대열 말라리아 원충 감염을 진단, 및/또는 3) 열대열 말라리아 원충 감염과 기타 말라리아 원충 감염을 감별 및 진단하기 위한 것이다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 샘플의 유래는 특별히 한정되지 않는 바, 예를 들어 조직, 세포 또는 유체 샘플, 예를 들어 체액의 샘플, 예를 들어 뇌척수액, 오줌, 타액, 혈액 샘플을 포함할 수 있다. 기존의 하이브리도마 기술의 미흡함을 방지하기 위하여, 본 공개는 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 단일 클론 항체의 발현벡터를 제공하고, 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 단일 클론 항체서열을 제공하여, 재조합 기술에 의하여 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II단일 클론 항체를 발현하여, 열대열 말라리아의 진단에 사용한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 하나 또는 다수의 방면을 포함하되:
1) 항HRP-II 단일 클론 항체 경쇄 유전자의 클로닝 단계;
2) 항HRP-II 단일 클론 항체 중쇄 유전자의 클로닝 단계;
3) 항HRP-II 단일 클론 항체 발현벡터의 구축단계;
4) 단계3)의 발현벡터에 대하여, 예하면 CHO 진핵 발현 시스템과 같은 발현 시스템을 사용하여 Anti-HRP-II 단일 클론 항체를 획득하는 단계;
5) 단계4)에 대하여, Anti-HRP-II 단일 클론 항체에 대한 활성동정 및 친화력 분석을 진행하는 단계를 포함한다.
도 1: 정제 항체 환원성 SDS-PAGE도, 여기서 트랙 1, 2는 ProteinA 친화 크로마토그래피 컬럼 정제에 의해 얻어진 5μg 항체 환원성 SDS-PAGE도이다.
이하, 본 공개의 구체적인 실시형태에 대하여 상세하게 설명하되, 기술되는 각 구체적인 실시형태는 제한된 것이 아닌, 서로 조합가능한 것이다.
용어 "아미노산”은 자연적으로 존재하거나 비자연적으로 존재하는 카르복시기α-아미노산이다. 용어 "아미노산”은 본 출원에서 자연적으로 존재하는 아미노산과 비자연적으로 존재하는 아미노산을 포함할 수 있다. 자연적으로 존재하는 아미노산은 알라닌(세자모 비번: Ala, 낱자모 비번: A), 아르기닌(Arg, R),아스파라긴(Asn, N),아스파르트산(Asp, D), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글루타민산(Glu, E), 글리신 (Gly, G), 히스티딘(His, H), 이소류신(lie, I), 류신(Leu, L), 라이신(Lys, K), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 트립토판(Trp, W), 타이로신(Tyr, Y)과 발린(Val, V)을 포함한다. 비천연적으로 존재하는 아미노산은 α-아미노아디프산, 아미노부티르산, 시트룰린, 호모시트룰린, 호모류신, 호모아르기닌, 히드록시프롤린, 노르로이신, 피리딜알라닌, 사르코신 등등을 포함하나 이에 의해 한정되지 않는다.
본 명세서에서, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질은 엄격히 구분되지 않아, 하나또는 여러 상황에서 서로 교대로 사용가능한 바, 일반적으로, 펩타이드 결합에 의해 연결되는 아미노산으로 조성되는 중합체를 의미하되, 자연적으로 생성된 것이든지, 합성된 것이든지를 막론한다. 폴리펩타이드는 예하면 탄수화합물 관능기(group), 금속이온 또는 카르복실에스테르와 같은 비아미노산 성분을 포함할 수도 있다. 비아미노산 성분은 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 의해 투입되는 것으로서, 세포유형에 따라 다르다. 폴리펩타이드는 본 명세서에서 이의 아미노산 골격구조 또는 이를 코딩하는 핵산에 의해 한정된다. 예하면 탄수화합물 관능기의 첨가는 통상적으로 규정되지 않지만, 존재 가능한 것이다. 모든 폴리펩타이드 서열은 통상적으로 허용되는 관례에 따라 기입되는 바, 여기서 α-N-말단 아미노산 잔기는 왼쪽에 있고, α-C-말단 아미노산 잔기는 오른쪽에 있다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "N-말단"은 폴리펩타이드 중 아미노산의 유리된 α-아미노기를 의미하고, 용어 "C-말단"은 폴리펩타이드 중 아미노산의 유리된 α-카르복실산 말단을 의미한다. N-말단에서 어떠한 관능기로 끝나는 폴리펩타이드는 N-말단아미노산 잔기의 α-아미노질소에 관능기가 구비된 폴리펩타이드를 의미한다. N-말단에서 어떠한 관능기로 끝나는 아미노산은 α-아미노질소에 관능기가 구비된 아미노산을 의미한다.
"보존적" 아미노산 치환은 그중의 아미노산 잔기가 비슷한 물리화학 성질을 구비하는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 그러한 치환이다. 비슷한 측쇄를 구비하는 아미노산 잔기는 본 기술분야에서 이미 알고 있는 것이고, 또한 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루타민산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β분지 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신)과 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 보존 아미노산 치환의 특수형식은 더이상 유전자 코드로 코딩되는 정상적인 20개 아미노산 중의 아미노산 치환들을 포함한다. 본 공개의 실시방안은 합성 펩타이드를 포함하여 사용하기에, 본 명세서에 공개된 펩타이드 중에서 이러한 "비자연적으로 존재하는" 아미노산 잔기를 사용할 수 있고, 아미노산 잔기 측쇄 중의 천연 포함 탄소사슬을 더욱 짧고 더욱 긴 포화 탄소사슬로 변환시킬 수 있다.
두개의 아미노산 서열일 경우, 최적화로 비교할 때, 예를 들어 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의하여 디폴트 갭 가중을 사용하여 비교할 때, 본 명세서의 서열은 서열목록으로 표시된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 75%, 70%의 서열 동일성을 갖는 해당 서열을 포괄한다. 예를 들어, 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 명세서의 항체는 SEQ ID NO: 1-3으로 표시된 중쇄CDR, SEQ ID NO:4-6으로 표시된 경쇄 CDR, 또는 SEQ ID NO: 21-23으로 표시된 중쇄 CDR, SEQ ID NO: 24-26으로 표시된경쇄 CDR와 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 75%, 70%의 서열 동일성을 갖는 해당 중쇄CDR와 경쇄CDR를 포함하는 항체이다. 예를 들어, 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 항체는 SEQ ID NO: 27-30으로 표시된 중쇄FR1-4, SEQ ID NO: 31-34으로 표시된 경쇄FR1-4와 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 75%, 70%의 서열 동일성을 갖는 해당 중쇄FR1-4와 경쇄FR1-4를 포함하는 항체이다. 예를 들어, 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 항체는 SEQ ID NO: 17으로 표시된 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 19으로 표시된 경쇄가변영역과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 75%, 70%의 서열 동일성을 갖는 해당 중쇄 가변 영역과 경쇄가변영역을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 항체는 SEQ ID NO: 18으로 표시된 중쇄, SEQ ID NO: 20으로 표시된 경쇄가변영역과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 75%, 70%의 서열 동일성을 갖는 해당 중쇄와 경쇄를 포함하는 항체이다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 명세서는 상기 항체의 항원 결합 단편, 항체약물 결합체, 또는 융합단백질을 포괄한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 상기 항체중쇄 및/또는 경쇄를 함유하는 해당 분리된 폴리펩타이드를 더 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 상기 항체를 코딩하고 폴리펩타이드를 분리하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주세포를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 항체의 같지 않은 잔기의 구별점은 보존 아미노산 치환에 있다. 본 기술분야의 당업자들이 알고 있듯이, 서열분석 소프트웨어로 서열 동일성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 공공으로 사용가능한 GCG 소프트웨어는 예하면 "Gap"와 "BestFit"같은 소프트웨어를 포함하여, 디폴트 파라미터로 상기 소프트웨어를 사용하여 밀접히 관련된 폴리펩타이드 사이 또는 야생형 단백질과 그 돌연변이 단백질 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정할 수 있다. FASTA 또는 ClustalW을 사용할 수도 있어, 디폴트 또는 추천 파라미터를 사용하여 폴리펩타이드 서열을 사용한다. GCG버전 6.1. 중의 프로그램, FASTA(예를 들어, FASTA2와 FASTA3)에서는 서열 사이의 최적 중첩영역의 비교와 백분율 서열 동일성을 조회하고 검색한다. 또 다른 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용한 컴퓨터 프로그램 BLAST인 바, 특히 blastp이다.
본 명세서 중의 용어 "항체"는 가장 광범위하게 사용되는데, 전장 단일 클론 항체, 이중 특이성 멀티특이성 항체, 키메라 항체, 및 항체단편을 포함하되, 이들이 수요되는 생물학적 활성을 나타낼 수 있으면 되는 바, 예하면 특이적으로 결합되는 HRP-II항원 또는 그 단편을 포함할 수 있다. "항체단편"은 전장항체 부분, 바람직하게는 그 항원 결합영역 또는 가변영역을 포함한다. 항체단편의 구현예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 상보성 결정영역(CDR)단편, 단일사슬항체(예를 들어, scFv), 이가항체 또는 도메인 항체를 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 항체 또는 항체단편의 융합단백질을 포함하되, 예를 들어 검출가능한 표지 또는 태그, 예하면 GFP, HA, Flag. His, GST, Myc등과 융합되고, 항원 검출을 촉진하기 적합한 기타 폴리펩타이드와 융합될 수도 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II을 코딩하는 항체 또는 그 단편을 함유하는 핵산서열을 포함한다. 본 명세서에서, 핵산서열은 이의 보존 치환된 변이체(예를 들어 축퇴 코돈의 치환)와 상보적 서열을 포함한다. 용어 "핵산"과 "폴리뉴클레오티드"는 같은 의미로서, 유전자, cDNA분자, mRNA 분자 및 예를 들어 올리고뉴클레오타이드와 같은 이들의 단편을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II을 코딩하는 항체 또는 그 단편을 함유하는 핵산서열의 발현 벡터를 포함하되, 그중의 핵산서열은 적어도 하나의 조절서열과 조작가능하게 연결된다. "조작가능하게 연결"은 코딩서열이 코딩서열의 발현을 허용하는 방식으로 코딩서열과 조절서열이 연결되는 것을 의미한다. 조절서열에 대한 선택은 적합한 숙주세포 중에서 목적단백질의 발현을 지시하기 위한 것으로서, 프로모터, 인핸서(enhancer)와 기타의 발현 조절 소자를 포함한다.
본 명세서에서, 벡터는 본 공개의 핵산 또는 그 단편을 함유하는, 유전정보을 갖고 유전정보를 세포에 전달가능한 분자 또는 시약을 포함한다. 전형적인 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 코스미드와 소형염색체를 포함한다. 벡터는 클론벡터(즉 유전정보를 세포에 전이시키는 벡터로서, 상기 세포를 번식시킬 수 있고 상기 유전정보가 존재하거나 존재하지 않은 상기 세포를 선택할 수 있음) 또는 발현벡터(즉 필요한 유전소자를 포함하여 상기 벡터의 유전정보가 세포중에서 발현되는 것을 허용하는 벡터)일 수 있다. 따라서, 클론벡터는 선택표지, 및 상기 클론벡터가 지정하는 세포유형과 매칭되는 복제기원을 포함할 수 있고, 발현벡터는 지정된 타겟세포 중에서의 발현에 영향을 주는 필요한 조절소자를 포함한다.
본 공개의 핵산 또는 그 단편을 적합한 벡터에 삽입가능하여, 본 공개의 핵산단편을 갖는 클론벡터 또는 발현벡터가 형성되도록 한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, 소형염색체 또는 바이러스를 포함할 수 있고, 특정세포에서만 순식간에 발현되는 네이키드 DNA를 포함할 수도 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 벡터는 목적 유전자와 선별표지(예하면 Dhfr, GS표지 또는 저항성 유전자 neo, hygro 등)를 갖는 서열을 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 벡터는 1) 예를 들어 항체의 중쇄와 경쇄가 다른 벡터를 사용하여, 숙주세포를 동시형질주입(cotransfection)하고; 중쇄와 경쇄 유전자를 동일한 벡터에 직렬연결하고, 각각의 프로모터, 종결자(terminator)를 각각 사용하여 전사 번역할 수도 있는 모노시스트로닉 벡터; 2) 예를 들어 벡터에서 리보솜 내부 진입 부위를 구축하여, 이의 양단에 경쇄, 중쇄 유전자를 직렬연결하여, 경쇄, 중쇄에 대한 동시 전사 번역을 구현하는 디시스트로닉 벡터; 3) 예를 들어 경쇄, 중쇄를 발현하는 벡터는 각각 선별 표지 유전자를 코딩하는 다른 서열을 함유하는 트랜스 상보적 벡터를 포함하되, 경쇄, 중쇄가 동시에 형질주입할 때에만, 선별 표지가 정확하게 발현될 수 있어, 선별효율을 향상시킨다. 어떠한 방법을 사용하든지 코딩서열에 돌연변이를 도입하여 본 공개의 변이체가 생생되도록 할 수 있되, 이러한 돌연변이는 결실 또는 삽입, 또는 치환 등을 포함할 수 있다.
본 공개의 발현벡터는 숙주세포를 형질전환하기 위한 것이다. 이러한 형질전환 세포 역시 본 공개의 일부분으로서, 본 공개의 핵산단편과 벡터를 증식하거나, 또는 본 공개의 폴리펩타이드를 제조하는 배양세포 또는 세포계를 재조합하기 위한 것일 수 있다. 본 공개의 숙주세포는 재조합 항체를 제조하기 적합한 임의의 엔지니어링 세포를 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 숙주세포는 예하면 세균(예하면 대장균, 아포간균 등)과 같은 미생물, 예하면 효모세포, 곤충세포, 식물세포 또는 포유동물세포와 같은 다세포생물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 숙주세포는 본 명세서에 기술된 항체예하면 단일사슬항체 또는 항체단편, 또는 분리된 폴리펩타이드, 융합단백질 등을 제조하기 위한 것일 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 숙주세포는 재조합 항체를 제조하기 적합한 포유동물세포, 예하면 CHO, 골수종세포, 하이브리도마 세포, PerC.6, HEK293, NSO, sp2/0등을 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 생장성이 좋고, 무혈청 현탁배양 밀도가 높으며, 이형발현 능력이 강하고, 정확하게 번역된 후 수식되는 능력을 갖는 세포를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체, 항원 결합 단편, 변이체와 기능성 유도체의 제조방법을 제공하였다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 재조합기술에 의해 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 단일 클론 항체를 발현한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 항체를 코딩하는 핵산벡터로 숙주세포를 형질주입시키고, 적합한 조건에서 상기 숙주세포를 배양하여 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체를 발현시킨다. 숙주세포는 하나 또는 다수의 발현벡터로 형질주입될 수도 있는데, 상기 발현벡터는 적어도 일부분 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 항체를 코딩하는 DNA을 단독으로 포함하거나 결합하여 포함할 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 항체를 재조합하여 제조할 때, 상기 발현산물은 배지에 출력되거나 또는 상기 형질전환 세포의 표면에 있을 수 있다. 통상적인 단백질과 펩타이드의 정제기술을 이용하여 배지 또는 세포분해물 중에서 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체를 분리할 수 있고, 상기 기술은 황산암모늄 침전, 크로마토그래피(예하면 이온교환, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피 등)및/또는 전기영동을 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 항체를 제조하기 위한 면역원은 완전한 열대열 말라리아 원충 HRP-II, 또는 그 단편 또는 유도체를 함유할 수 있다. 바람직한 면역원은 모든 또는 부분적 열대열 말라리아 원충 HRP-II을 함유한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 명세서에 기술된 항체 예하면 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체는 예하면 HRP-II와 같은 하나 또는 다양한 타겟분자가 생체샘플 중에서의 존재여부를 검출하기 위한 것일 수 있다. 용어 "검출"은 본 명세서에 사용될 때, 정량 또는 정성 검출을 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 생체샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 진단 또는 검출하기 위한 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 생체샘플과 본 명세서에 기술된 항체 예하면 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체를 상기 항체와 타겟이 결합되는 것을 허용한 조건하에서 접촉시켜, 상기 항체와 타겟 사이에 복합물이 형성되는 지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 방법은 인-비보 또는 인-비트로 방법일 수 있다. 본 공개는 또한 열대열 말라리아 원충에 감염될 수 있는 피험자에 대한 말라리아 진단을 진행하는 방법에 관한 것으로, 상기 피험자로부터 제공된 생물학적 샘플과 본 공개의 항체를 접촉시키되, 상기 접촉은 상기 항체와 상기 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 타겟에 의하여 항원/항체복합물을 형성하는 조건하에서 진행되어, 형성가능한 항원/항체 복합물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, ELISA 분석에 의하여 인비보 진단을 진행할 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 방법은 상기 생물학적 샘플과 기타 말라리아 항원을 진단하는 하나 또는 다양한 항체를 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있되, 상기 기타 항원은 예를 들어 LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PffiXPl, CS, MSP-3-1, MSP-3-2, MSP-3-5, MSP-3-6, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP 와 GLURP일 수 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 표지된 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체를 제공한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 표지는 형광표지, 발색단 표지, 전자밀도표지, 화학적 발광표지, 방사성 표지, 및 효소 또는 리간드 같은 간접표지를 포함하나 이에 의해 한정되지 않고, 예를 들어, 효소촉매반응 또는 분자 상호작용에 의하여 간접적으로 검출한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 예시적인 표지는 방사성 동위원소, 형광단, 로다민 및 그 유도체, 루시퍼라아제, 루시페린, 호스래디시 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당류 옥시다아제, 예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토스 옥시다아제, 글루코스-6-인산탈수소효소, 바이오틴/아비딘, 스핀표지, 박테리오파지 표지 등등을 포함하나 이에 의해 한정되지 않는다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체 또는 그 단편은 항원으로 될 수 있어 HRP-II 항체 검출을 위한 면역측정과 해당 키드에 사용될 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 면역측정은 ELISA, 간접면역 형광측정IFA을 포함하고, 방사성 면역측정RIA및 기타 비효소결합항체 결합시험 또는 방법을 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 예를 들어 ELISA 이중항체 샌드위치 실험방안에서는, HRP-II 항체를 미량반응판에 피복시켜, 샘플 중의 HRP-II 항원을 포획한 후, 표지된 항체와 반응판에 결합된 항원을 재차 결합시켜 현상(developing)시킨 후 결과를 판독할 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개의 HRP-II 항체는 미량반응판에 피복되거나 표지를 위한 제2 항체일 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체(anti-plasmodium falciparum HRP-II antibody) 또는 그 단편은 하나의 표면에 고정되는데, 예를 들어 플라스틱, 니트로섬유소막, 유리 또는 금속지지물과 같은 고체상 지지물에 고정된다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 고체 지지물은 스트립형 또는 카드형으로 제조가능하다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 피험자로부터 제공되는 샘플과 상기 고체 지지물이 접촉된 후, 로다민 표지와 같은 검출가능한 표지를 갖는 항체 지시약(Indicator)과 접촉되어 현상한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 우혈청알부민, 분유용액, 젤라틴, PVP, Superblock 블록킹 비특이성부위와 같은 블록킹제(blocking agent)를 사용할 수 있어, 비특이성결합으로 인한 배경을 줄일 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, BSA와 인산염완충용액(PBS)/트윈과 같은 희석제를 사용하여 항혈청을 희석할 수 있어, 비특이성 배경을 줄이는데 도움이 된다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 명세서는 HRP-II항원의 존재를 결정하거나 또는 정량하는 방법에 관한 것이다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 방법은 HRP-II 항원을 포함할 수 있는 생체샘플과 본 공개의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체를 접촉시켜, 상기 적어도 하나의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체와 상기 샘플 중의 항원 사이의 결합을 정량적 또는 정성적으로 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 어떠한 형식이든지 사용가능하고, 또한 예를 들어 비경쟁성 또는 경쟁성의 ELISA, RIA또는 자성면역측정, 응집측정과 Biacore측정과 같은 표면 플라즈몬 공명에 기반하는 측정방식을 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 생체샘플은 건강 및/또는 병리적 상태에 있는 생체조직, 세포 또는 체액샘플과 같은 유체를 지칭할 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 생체샘플은 말라리아 감염이 의심되는 피험자로부터 제공된다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 생체샘플은 뇌척수액, 오줌, 타액, 혈액 등과 체액같은 샘플이다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 명세서는 측정 또는 진단장치 또는 관련키트를 제공하는 바, 이는
(i) HRP-II항원과 결합가능한 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체; 와
(II) 상기 항원이 상기 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체와 결합될 때 지시되는 지시약을 포함할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 키트는 본 공개의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체 이외의 말라리아 원충의 기타 항원에 대한 항체를 더 포함할 수 있어, 예를 들어 상이한 말라리아 원충 감염을 감별하기 위한 것이다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 기타 항원은 예를 들어 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충 및/또는 난형 말라리아 원충 특이성 항원 또는 공통항원, 예를 들어 알돌라아제, 예를 들어 젖산탈수소효소PLDH, 예를 들어 말라리아 원충 젖산탈수소효소 PLDH 또는 말라리아 원충종 특이성 젖산탈수소효소PLDH, 예를 들어 말라리아 원충 글루탐산탈수소효소PGDH, LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP-3-1, MSP-3-2, MSP-3-5, MSP-3-6, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP 및 GLURP을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 키트는 측정 스트립 또는 측정 카드를 포함할 수 있고, 상기 피험자로부터 제공되는 상기 액체샘플을 상기 측정 스트립 또는 ELISA측정판에 놓되, 상기 ELISA측정판은 여기에 개인별 피험자가 제공하는 액체샘플을 놓을 수 있는 웰을 구비한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 키트는 유동 세포분석기, 바이오 분석기, 바이오 센서에 사용되는 측정장치를 포함하여 구성될 수 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 키트는 쾌속진단(RDT)키트로서, 예를 들어 박막 면역 크로마토그래피를 응용하는 키트, 콜로이드 금법의 박막 면역 크로마토그래피를 사용하는 키트인 바, 예를 들어 막지지물과 같은 고체상 지지물을 포함하고, 말라리아 항원과 결합하는 항체 또는 그 항원결합 단편, 항체약물 결합체, 또는 융합단백질 및 임의로 선택되는 대조항체를 상기 고체상 지지물에 고정시킨다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 쾌속진단(RDT)키트와 같은 상기 키트는 측정 스트립 또는 측정 카드를 포함할 수 있고, 상기 측정 스트립 또는 측정 카드는 샘플 패드, 상기 샘플 패드와 인접되는 말라리아 원충 항체(하나 또는 다수의 항체, 예하면 본 명세서에 기술된 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체와 말라리아 원충의 기타 항원에 대한 항체를 포함할 수 있되, 상기 항체는 콜로이드 금과 같은 검출가능한 표지를 구비할 수 있음)를 함유하는 표지 패드, 표지 패드와 인접하는, 섬유소막과 같은 막과 인접하는 흡수패드를 포함할 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 막에는 서로 분리되는 검출라인과 품질관리라인이 설치가능한 바, 상기 검출라인에는 표지항체와 다른 에피토프(epitope)에 결합되는 말라리아 원충 특이성 항체가 함유되고, 상기 품질관리라인은 상기 표지항체와 특이적으로 결합하는 항체를 함유할 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 측정 스트립 또는 측정 카드는 지지물, 샘플 패드, 표지 패드, 니트로섬유소막과 같은 막, 흡수패드, 한갈래 또는 여러갈래 검출라인, 및 품질관리라인을 포함할 수 있고, 상기 샘플 패드, 상기 표지 패드, 상기 니트로섬유소막 및 상기 흡수패드는 상기 지지물의 일단으로부터 타단에 순차적으로 설치되고, 상기 샘플 패드와 상기 표지 패드는 부분적으로 중첩되고, 상기 표지 패드와 상기 니트로섬유소막은 부분적으로 중첩되며, 상기 니트로섬유소막과 상기 흡수패드는 부분적으로 중첩되고, 상기 한갈래 또는 여러갈래의 검출라인과 상기 품질관리라인은 상기 니트로섬유소막에 각각 이격되게 설치되고, 상기 표지 패드에는 콜로이드 금과 같은 검출가능한 표지로 표지된 말라리아 원충 항체가 피복될 수 있고, 상기 한갈래 또는 여러갈래의 검출라인은 표지항체와 다른 에피토프에 결합되는 말라리아 원충 특이성 항체를 함유할 수 있고, 상기 품질관리라인은 상기 표지항체와 특이적으로 결합가능한 항체를 함유할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 공개는 키트를 제공하는 바, 이는 말라리아 원충 감염을 진단가능한 재료를 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 상기 키트는 용기와 용기에 붙어 있거나 용기와 같이 있는 태그 또는 포장 설명서를 포함한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 적합한 용기는 예를 들어, 병, 작은 병, 주사기 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 각종 재료로 제조될 수 있다. 용기에는 조성물이 충진되는데, 상기 조성물은 단독적이거나 말라리아 원충 감염을 효과적으로 진단가능한 또 다른 조성물과 결합된다. 조성물 중 적어도 하나의 활성시약은 본 명세서의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체이다. 이밖에, 상기 키트는 (a)본 명세서의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체를 함유하는 조성물을 내부에 포함하는 제1용기; (b)제2항체 및/또는 기타 관련 시약을 함유하는 조성물을 내부에 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 키트에는 본 공개의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체 이외의 말라리아 기타 항원에 대한 항체가 포함될 수 있되, 예를 들어 상이한 말라리아 원충 감염을 감별하기 위한 것이다. 본 공개의 키트는 포장 설명서를 더 포함할 수 있고, 상기 포장 설명서에서는 상기 조성물이 상기 질환 또는 감염을 진단할 수 있다고 명확히 밝혔다. 상기 키트는 제2 또는 제3용기를 더 포함할 수 있고, 상기 제2 또는 제3용기는 주사용 증류수, 인산염완충용액, 포도당 용액과 같은 버퍼를 포함하고, 기타 버퍼, 희석제, 필터, 주사침과 주사기와 같은 기타 재료를 더 포함할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 명세서는 상기 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체를 포함하는, 마이크로타이터(상기 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체가 피복될 수 있음)와 같은 키트를 제공한다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)는 폴리스티렌 마이크로타이터 웰과 같은 타이터 웰을 포함할 수 있는데, 이러한 웰(well)에는 항 열대열말라리아 원충 HRP-II의 항체, 또는 말라리아 원충에 감염된 완전세포 또는 그 세포 분해물이 피복된다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 본 명세서는 예를 들어말라리아 원충에 감염된 피험자를 결정하기 위한 키트를 제공하는 바, 상기 키트는 적어도 하나의 본 공개의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체, 관련된 버퍼, 액체샘플과 상기 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체가 반응할 때 수요되는 시약, 및 항체와 상기 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체 사이에 양성 또는 음성결합 반응이 일어나는 지를 결정하기 위한 시약을 포함한다. 이러한 키트는 액체샘플을 분리 및/또는 저장하기 위한 용기, 상기 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체와 샘플을 접촉시키는 용기와 시약, 및 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체와 샘플 중의 성분 사이의 결합이 이루어지는 지를 결정하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 항체의 존재를 결정하기 위하여, 상기 키트는 예를 들어 제2표지를 갖는 항체 또는 항원(이중항원 샌드위치법)을 이용할 수 있는데, 여기서 상기 표지는 임의의 적합한 표지일 수 있는 바, 예하면 형광 또는 방사성 표지, 효소표지 또는 스트렙트아비딘과 결합되기 위한 바이오틴 표지와 같은 결합표지일 수 있다. 키트에 있어서, 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체는 고체지지물과 결합가능하거나, 또는 상기 키트에 적어도 상기 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II의 항체와 결합하기 적합한 고체 지지물이 포함될 수 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 키트의 HRP-II 항체는 액체용액 형식, 고체 지지물에 부착되는 형식, 또는 건조 분말일 수 있다. HRP-II 항체 시약이 액체용액일 때, 상기 액체용액은 수용액일 수 있다. 시약이 고체 지지물에 부착되는 형식일 때, 바람직한 고체 지지물은 크로마토그래피 매질, 예하면 박막, 측정 스트립, 플라스틱 비드 또는 평판, 또는 현미경 유리 슬라이드일 수 있다. 시약이 건조분말일 경우, 적당한 용매를 넣어 분말을 다시 만들 수 있다. 하나 또는 다수의 실시방안에서, 키트는 적당한 용매를 포함하는 용기를 더 포함할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시방안에서, 키트는 정량의 제2항체, 예하면 커플링 알칼리성 포스파타제와 같은 제2항체를 포함하는 용기, 및 일정량의 버퍼를 포함하는 제2용기를 포함한다. 기타 실시방안에서, 키트는 제3용기를 더 포함할 수 있되, 이는 적당한 기질, 예하면 알칼리성 포스파타제를 위한 PNPP, 또는 퍼옥시다아제를 위한 기질을 더 포함할 수 있다. 제4 용기는 적당한 "최종"버퍼(final buffer)를 포함할 수 있다.
실시예
1. 발현 플라스미드 구축
본 실시예에서 제한성 엔도뉴클레아제, Prime Star DNA중합효소는 Takara회사에서 구매된다. MagExtractor -RNA 추출키트는 TOYOBO 회사에서 구매된다. BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 키트는 Takara회사에서 구매된다. pMD-18T벡터는 Takara 회사에서 구매된다. 플라스미드 추출키트는 Tiangen 회사에서 구매된다. 프라이머 합성과 유전자 시퀀싱은 Invitrogen회사에서 완성된다. Anti- HRP-II 3R5 단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주는 이미 있는 하이브리도마 세포주이다. MA-HRPII Ag 단백질(MyBioSource, MBS319418)로 마우스를 면역시킨 후의 비세포(splenocyte)와 SP 2/0세포는 융합 선별되고, 세포를 액체질소속에서 쾌속으로 소생시킨 후 완전배지(20%우태아혈청+80% RPMI 1640)에 넣어 배양하여 사용토록 한다.
1.1, 프라이머
증폭 Heavy Chain 와 Light Chain 5'RACE 프라이머:
SMARTER II A Oligonucleotide: 5'>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3'(SEQ ID NO .7);
5'-RACE CDS Primer (5'-CDS): 5'>(T)25VN<3'(N=A,C,G,orT;V=A,G,orC) (SEQ ID NO .8);
Universal Primer A Mix(UPM): 5'>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3'(SEQ ID NO .9)
Nested Universal Primer A(NUP): 5'>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3' (SEQ ID NO .10)
mIgG CKR: 5'> CGCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC <3' (SEQ ID NO . 11)。
mIgG CHR: 5'> CCGCTCATTTACCCGGAGACCG <3' (SEQ ID NO .12 )。
1.2, 항체가변영역 유전자 클론 및 시퀀싱
Anti- HRP-II 3R5단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주 중에서 RNA을 추출하여, 제조업체에서 건의하는 방안에 따라, SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit 키트 및 키트 중의 SMARTER II A Oligonucleotide와 5'-CDS 프라이머를 사용하여 제1 사슬 cDNA합성을 진행하여 얻어진 제1 사슬 cDNA 산물을 PCR 증폭 주형(Template)으로 사용한다. Light Chain 유전자는 Universal Primer A Mix(UPM), Nested Universal Primer A(NUP)와 mlgG CKR 프라이머로 증폭되고, Heavy Chain 유전자는 Universal Primer A Mix(UPM), Nested Universal Primer A(NUP)와 mIgG CHR 프라이머로 증폭된다. 여기서 Light Chain의 프라이머 쌍(Primer Pair)은 0.8KB좌우의 목적 스트립을 증폭하고, Heavy Chain의 프라이머 쌍은 1.4KB좌우의 목적 스트립을 증폭한다. 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하여 회수하되, 산물에 대하여 rTaqDNA 중합효소로 A첨가 반응을 진행한 후 pMD-18T벡터에 삽입하고, DH5a 수용성세포에 형질전환시켜, 균락이 자란 후 각각 Heavy Chain및 Light Chain유전자 클론을 각각 4개씩 취하여 Invitrogen회사에 전달하여 시퀀싱한다.
1.3, Anti-HRP-II 3R5 항체가변영역 유전자의 서열분석
상기 시퀀싱하여 얻어진 유전자 서열을 IMGT항체 데이터베이스에 넣어 분석하고, VNTI11 .5 소프트웨어를 이용하여 분석하여 중쇄와 경쇄 프라이머쌍이 증폭해낸 유전자가 모두 정확한 지를 결정하되, 여기서 Light Chain가 증폭해낸 유전자 단편 중에서, VL유전자 서열은 405bp로서, VkII유전자족(gene family)에 속하는 바, 이의 전측에는 66bp의 리더 펩타이드 서열이 있고; Heavy Chain프라이머쌍이 증폭해낸 유전자 단편 중에서, VH 유전자 서열은 399bp로서, VH1유전자족에 속하는 바, 이의 전측에는 57bp의 리더 펩타이드 서열이 있다. 항체 중쇄와 경쇄 서열은 SEQ ID NOs: 35-38으로 표시된 바와 같다.
1.4, 재조합 항체 발현 플라스미드의 구축
pcDNATM 3.4 TOPO® vector은 구축된 재조합 항체 진핵 발현벡터이고, Thermo Scientifico에서 상기 발현 벡터를 구매하여 HindIII, BamHI, EcoRI 등 다클론 제한효소 절단부위를 도입하여, pcDNA3.4A 발현벡터로 명명하고, 3.4A발현벡터로 후속약칭하며; 상기 pMD-18T 중 항체 가변영역 유전자 시퀀싱 결과에 의해, Anti- HRP-II 3R5의 VL와 VH 유전자 특이성 프라이머를 설계하되, 양단에 각각 HindIII, EcoRI 제한효소 절단부위와 보호염기, 프라이머가 구비되되 하기와 같고:
HRP-II3R5-HF: 5'>CCCAAGCTTGCCACCATGTACTTGGGACTGAACTGTGTATTC<3' (SEQ ID NO .13);
HRP-II3R5-HR: 5'>GGGGAATTCTCATTACTTTCCGGGAGATCTGGAGATGGTTTGCTTG<3' (SEQ ID NO .14);
HRP-II3R5-LF: 5'>CCCAAGCTTGCCACCATGGACATCAGGGCTCCTGCTCAGTTTCTTGGC<3' (SEQ ID NO .15);
HRP-II3R5-LR: 5'>GGGGAATTCTCATTAACATTCATTTCTGTTAAAAGATTTGACAATG<3' (SEQ ID NO .16);
PCR증폭방법에 의해 상기 클로닝된 유전자 중에서 Light Chain유전자 단편과 Heavy Chain 유전자 단편이 증폭된다. Heavy Chain와 Light Chain유전자 단편은 각각 Hindlll/EcoRI더블 제한효소 절단을 사용하고, 3.4A 벡터는 Hindlll/EcoRI더블 제한효소 절단을 사용하여, 단편과 벡터를 정제하여 회수한 후 Heavy Chain유전자와 Light Chain유전자를 각각 3.4A발현벡터에 연결시켜, Heavy Chain와 Light Chain의 재조합 발현 플라스미드를 각각 얻는다.
2. 항체의 제조
2.1 재조합 항체 발현 플라스미드 일시적 형질주입 CHO 세포 및 발현 상등액 항체활성 동정
2.1.1 재조합 플라스미드 일시적 형질주입 CHO 세포
상기 실시예1에서 구축된 항체 경중쇄DNA을 함유하는 3.4A재조합 발현 플라스미드를 초순수로 400 μg/ml까지 희석하여, CHO세포를 1.7x107 cells/ml으로 조절하여 원심분리관에 넣고, 100μl플라스미드와 700μl세포를 혼합하여, 전기회동컵(electrorotation cup)에 이전시켜 전기회동하여, CD CHO AGT (Thermo Scientific)을 함유하는 10ml 배지에 이전시키고, 37℃ 테이블에서 배양(8%CO2, 진폭115~200 rpm)하고; 매일 샘플링하여 세포생존율을 검출하되, 세포생존율이50%보다 낮을 경우, 세포를 원심분리하여 상등액을 배양한다.
2.1.2 발현 상등액의 항체 활성 동정
50mM탄산염 버퍼로 HRP-II단백질을 1ng/ml으로 희석하여, 웰당100uL씩, 4℃에서 밤새도록 피복하고; 다음날, PBST세척액으로 2회 세척하고, 두드리면서 건조하고; 블록킹액(20%BSA+80%PBS)을 첨가하되, 웰당120uL씩 첨가하여, 37℃에서 1h동안 인큐베이션하고, 두드리면서 건조하고; 배수비례로 희석된 세포 상등액을 100uL/웰로 첨가하여, 37℃에서 30min (일부분 상등액은 1h) 인큐베이션하고; PBST세척액으로 5회 세척하여, 두드리면서 건조하고; 산양 항-랫트IgG-HRP (Abcam회사에서 자력 생산, ab97019)을 첨가하되, 웰당100uL씩 첨가하여, 37℃에서, 30min 인큐베이션하고; PBST세척액으로 5회 세척하여, 두드리면서 건조하고; 요소-과산화수소(50uL/웰), 테트라메틸벤지딘(50uL/웰)을 첨가하여, 10min 현상하고; 50uL/웰의 희염산을 첨가하여 반응을 종료하고; 마이크로플레이트 리더의 450nm (630nm참조)쪽에서 OD값을 판독한다.
주석: 대조품은 100ng/ml으로부터 순차적으로 2배의 배수비례로 희석되고, 블랭크 웰은 대조품이 없음
상기 표의 결과에 따르면, 구축된 3.4A재조합 발현 플라스미드가 일시적으로 형질주입된 후 생성된 항체가 HRP-II단백질에 대하여 아주 좋은 활성을 갖는 것을 알 수 있다.
2.2 항체 정제 및 친화력 분석, 활성동정
2.2.1 ProteinA 친화성 크로마토그래피 컬럼 정제 발현 상등액
발효액의 상등액을 취하여, 0.22μm의 막으로 여과하고, 상등액을 일정한 유속의 조건하에서 Mab Slelect SuRe LX(GE Healthcare )친화성 필러의 컬럼을 통하여 나오지 못하도록 결합하고나서, 20mM NaAc(pH3.4) 용액으로 용리를 진행하고, 샘플 수집관에 일정량의 1M Tris용액을 넣어 사전중합시킨다. 용리된 샘플을 PBS (pH7.4)용액에서 투석하여 3회 용액을 바꾼 후 정제된 항체를 얻는다. 5μg정제된 항체를 취하여 환원성 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 진행한다. 결과는 도1에 도시된 바와 같이, 트랙1, 2는 모두 5ug샘플 볼륨(sample volume)이다.
2.2.2 정제된 항체의 친화력 분석
친화력 분석
활성동정과 같은 방식인 효소면역 간접법으로 데이터화하되, 네개 기울기 1ug/ml, 0.5ug/ml, 0.25ug/ml, 0.125ug/ml으로 피복하고; 항체를 1000ng/ml으로부터 시작하여 2배 기울기로 0.97656ng/ml까지 희석하여 샘플을 첨가한다. 상이한 피복농도하에서 상이한 항체 농도와 대응되는 OD값을 얻는다. 동일한 피복농도하에서, 항체농도를 횡좌표로 하고, OD값을 종좌표로 하여, 로그 그래프를 만들어, 피팅 방정식에 의하여 50%최대OD값일 때의 항체농도를 계산하고; 공식: K= (n-1) / (2* (n*Ab'-Ab))에 대입하여 친화력 상수의 역수를 계산하되, 여기서 Ab와 Ab'는 각각 대응되는 피복농도(Ag, Ag')하에서 50%최대 OD값일 때의 항체농도를 각각 나타내고, n=Ag/Ag'; 각 두개의 피복농도는 하나의 K값을 조합계산해 낼 수 있되, 최종적으로 6개의 K값을 얻을 수 있는 바, 이들의 평균수치를 취하여, 이들의 역수를 구하면 친화력 상수KD가 된다.
정제된 후의 Anti- HRP-II 3R5 단일 클론 항체 친화력 분석 데이터
2.2.3 정제된 항체의 활성동정
50mM탄산염 버퍼 피복액으로 MA-HRPII Ag재조합 MA단백질(MyBioSource, MBS319418)(자력생산150520-1)을 1ug/ml으로 희석하여 마이크로타이터 플레이트에 피복하되, 웰당100uL씩 피복하여, 4℃에서 밤을 지내고; 다음날, PBST세척액으로 2회 세척하여, 두드리면서 건조하고; 블록킹액(20%BSA+80%PBS)을 첨가하되, 웰당120uL씩 첨가하고, 37℃, 1h, 두드리면서 건조하고; 희석된 후의 Anti-HRP-II 3R5단일 클론 항체를 첨가하여, 1000ng/ml으로부터 5배의 배수비례로 희석하여, 100uL/웰씩 샘플을 넣고, 37℃, 30min (일부분 상등액은 1h)인큐베이션하고; PBST 세척액으로 5회 세척하여, 두드리면서 건조하고; 산양 항-랫트IgG-HRP을 첨가하되, 웰당100uL씩 첨가하여, 37℃에서, 30min 인큐베이션하고; PBST세척액으로 5회 세척하여, 두드리면서 건조하고; 요소-과산화수소(50uL/웰)을 첨가하고, 테트라메틸벤지딘(50uL/웰)을 첨가하여, 10min 현상하고; 50uL/웰의 희염산을 첨가하여 반응을 종료하고; 마이크로플레이트 리더의 450nm (630nm참조)쪽에서 OD값을 판독한다.
정제된 후의 Anti- HRP-II 3R5 단일 클론 항체 활성동정
항 열대열 말라리아 원충 HRP-II단일 클론 항체서열을 제공하여, 재조합 항체기술에 의하여 활성을 갖고 친화력이 높은 Anti-HRP-II단일 클론 항체를 얻는 바, 이는 하기 우세를 유리하게 갖는다:
1) 하이브리도마 기술에 비해, CHO세포주는 보다 더 안정적이고, 계대, 동결보존과 소생(resuscitation)과정에서 항체 분비 능력을 쉽게 잃어버리지 않고, 귀중한 세포주를 보다 더 쉽게 보존한다.
2) 항HRP-II재조합 항체의 발현벡터를 성공적으로 구축하여, CHO세포에서 발현시켜 생체활성을 가질 수 있다. 하이브리도마 기술에 비해, CHO세포주의 재조합 항체발현 생산량은 2 g/L좌우일 수 있고, 대량 생산시 비용이 낮으며; 이밖에, 세포주는 보다 더 안정적이고, 생산 안정성이 좋으며, 배치 사이의 차이값이 더욱 작고, 정제 난이도가 더욱 작으며, 비용이 더욱 적다.
3) 재조합 항체 기술을 사용하여, 열대열 말라리아 HRP-II 단백질 항원 에피토프를 특이적으로 식별가능한 발현 벡터를 구축하여, 특이적인 단일 클론 항체를 생산하여, 비특이성 반응의 발생을 줄이고, 열대열 말라리아를 검출하는 특이성을 향상시킨다.
3. 상기 실시예에서 얻어진 항체(서열 SEQ ID NO:20 및 18으로 표시된 경쇄와 중쇄를 구비함, WT)의 경쇄CDR및 중쇄CDR에 대하여 돌연변이를 진행한다.
분석에 따른, 중쇄의 상보성 결정영역(WT):
CDR-VH1은 G-X1 (S) -T-X2 (L) -T-X3 (E) -Y-Y-M-N이고;
CDR-VH2은 D-X1 (L) -N-P-I-X2 (N) -G-G-T-X3 (P) -Y-X4 (Q) -Q-K-F이고;
CDR-VH3은 T-X1 (R) -G-A-E-X2 (E) -Y이고;
경쇄의 상보성 결정영역:
CDR-VL1은 S-Q-S-X1 (II) -Y-S-X2 (N) -G-K-I-Y-X3 (I) -N이고;
CDR-VL2은 Q-X1 (L) -S-K-X2 (I) -X3 (D) -P이고;
CDR-VL3은 L-Q-X1 (G) -T-Y-X2 (S) -P-X3 (N) -T이고;
여기서, XI, X2, X3, X4는 모두 돌연변이 부위이다.
돌연변이 부위 설계
돌연변이후 항체활성을 검출하여, 피복액으로 MA-HRPII Ag단백질(fapon 바이오텍, 150520-1)을 1ug/ml으로 희석하여 마이크로타이터 플레이트에 피복시하되, 웰당100uL씩 피복하여, 4℃에서 밤을 지내고; 다음날, 세척액으로 2회 세척하여, 두드리면서 건조하고; 블록킹액(20%BSA+80%PBS)을 첨가하되, 웰당120uL씩 첨가하고, 37℃, 1h, 두드리면서 건조하고; 희석된 후의 Anti-HRP-II 3R5단일 클론 항체를 100uL/웰 첨가하여, 37℃, 30min (일부분 상등액은 1h)인큐베이션하고; 세척액으로 5회 세척하여, 두드리면서 건조하고; 산양 항-랫트IgG-HRP을 첨가하되, 웰당100uL씩 첨가하여, 37℃에서, 30min 인큐베이션하고; 세척액으로 5회 세척하여, 두드리면서 건조하고; 요소-과산화수소(50uL/웰), 테트라메틸벤지딘(50uL/웰)을 첨가하여 10min 현상하고; 50uL/웰의 희염산을 첨가하여 반응을 종료하고; 마이크로플레이트 리더의 450nm (630nm참조)쪽에서 OD값을 판독한다. 일부분 결과는 하기와 같은 바:
항체활성 분석 데이터
"-"은 무활성을 나타낸다.
상기 표에 따르면, 돌연변이1와 돌연변이2의 활성이 좋고, 특히 돌연변이1의 활성이 가장 좋다는 것을 알 수 있다. 나아가 돌연변이1을 골격서열로 하여 역가가 좋은 돌연변이부위(선별하여 얻어진 항체활성이 돌연변이1와 근접하도록 확보함, 항체활성±10%)를 선별하는 바, 일부분 결과는 하기와 같다.
역가가 좋은 돌연변이부위 리스트
친화력 분석
활성동정과 같은 방식인 효소면역 간접법으로 데이터화하되, 네개 기울기0.5ug/ml, 0.25ug/ml, 0.125ug/ml, 0.0625ug/ml으로 피복하고; 항체를 100ng/ml으로부터 시작하여 2배 기울기로 0.195ng/ml 까지 희석하여 샘플을 첨가한다. 상이한 피복농도하에서 상이한 항체 농도와 대응되는 OD값을 얻는다. 동일한 피복농도하에서, 항체농도를 횡좌표로 하고, OD값을 종좌표로 하여, 로그 그래프를 만들어, 피팅 방정식에 의하여 50%최대OD값일 때의 항체농도를 계산하고; 공식: K= (n-1) / (2* (n*Ab'-Ab))에 대입하여 친화력 상수의 역수를 계산하되, 여기서 Ab와 Ab'는 각각 대응되는 피복농도(Ag, Ag')하에서 50%최대 OD값일 때의 항체농도를 각각 나타내고, n=Ag/Ag'; 각 두개의 피복농도는 하나의 K값을 조합계산해 낼 수 있되, 최종적으로 6개의 K값을 얻을 수 있는 바, 이들의 평균수치를 취하여, 이들의 역수를 구하면 친화력 상수KD가 된다.
선별된 돌연변이 항체의 친화력 분석 데이터
따라서, 선별하여 얻어진 돌연변이부위가 항체에 대한 친화력 영향은 그닥 크지않다. 상기 결과를 검증하기 위하여, WT을 골격서열으로 하여 상기 실험을 중복하여, 돌연변이부위의 친화력을 검증하는 바, 일부분 결과는 하기와 같다.
WT을 골격으로 진행한 돌연변이
친화력 분석 데이터
상기 결과에 따르면, 항체활성을 갖도록 확보하는 전제하에서, 상기 돌연변이 부위와 기타 부위의 관련성 역시 크지 않다는 것을 알 수 있다.
출원인은 상기 항체와 내부의 또 다른 항체(HRP-II항체와 쌍을 이루는 항체)에 대하여 매칭쌍 항체에 관한 실험 검증하였는 바, 항체성질은 WT항체와 명확한 변화가 없고, 이중항체 샌드위치법을 거친 매칭쌍 실험 검증에 따르면, 특이성은 모두 기존의 높은 레벨을 유지하고, 명확한 변화가 없는데, 이는 상기 항체와 돌연변이전의 WT항체가 식별한 것이 같은 에피토프임을 설명한다. 돌연변이1의 활성과 친화력이 전반적으로 WT보다 높기에, 키트의 응용에 대응한 돌연변이1의 검출율 역시 WT보다 높다. 나아가, 면역진단 플랫폼에서 측정하여 상기 항체 특이적 성능이 98%-100%에 도달할 수 있도록 하고, 측정된 100회분의 샘플 일치성이 95%-98%에 도달하도록 한다.
더 나아가, WT, 돌연변이1, 및 랜덤으로 뽑은 8개 돌연변이 항체에 대하여 안정성 검출을 진행하고; 상기 항체를 37℃에서 72시간 보존하여, 꺼낸 후 같은 배치(batch)의 4℃에서 72시간 보존된 항체와 같은 검출조건에서 같은 음성, 양성 품질관리 시료를 검출하되, 검출방법은 상기 실시예에서 사용한 항체 활성 분석방법과 같이, 각 군의 항체의 선형성이 모두 99.90%이상 도달가능하고, CV값은 8% 미만이며, 상이한 온도로 보존된 항체 활성은 통계학적 차이가 없다. 이는 상기 항체가 모두 우수한 안정성을 갖고, 부위의 돌연변이가 안정성에 대한 영향을 주지 않는 다는 것을 설명한다.
마지막으로 설명해야 할 것은: 이상 각 실시예는 단지 본 공개의 기술적 해결수단을 설명하기 위한 것일 뿐, 이를 한정하기 위한 것이 아니고; 전술한 각 실시예를 참조하여 본 공개를 상세하게 설명할 지라도, 본 기술분야의 당업자들이 응당 이해해야 할 것은 여전히 전술한 각 실시예에 기재된 기술적 해결수단을 수정하거나, 그중의 일부분 또는 전부의 기술적 특징을 동가적으로 교체할 수 있고; 이러한 수정 또는 교체는 상응한 기술적 해결수단의 본질이 본 공개의 각 실시예의 기술적 해결수단의 범위를 벗어나지 않도록 한다.
본 공개의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 항체 또는 그 결합단백질은 가장 허용가능한 열대열 말라리아 원충 진단 마커로서, 인체내 열대열 말라리아 원충의 존재를 판단할 수 있다. 본 공개의 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 항체 또는 그 결합단백질의 검출방법을 사용하여, 조작이 간편하고, 빠르며, 민감성과 특이성이 높다.
관련 서열 설명:
CDR-VH1. G-X1-T-X2-T-X3 -Y-Y-M-N (SEQ ID NO . 1)
여기서:
X1은 Y, T 또는 S이고;
X2는 L 또는 I이고;
X3은 D 또는 E이고, 바람직하게는 D이고;
CDR-VH2. D-X1-N-P-I-X2-G-G-T-X3-Y-X4-Q-K-F(SEQ ID NO .2)
여기서:
X1은 L, V 또는 I이고;
X2는 Q 또는 N이고;
X3은 A 또는 P이고, 바람직하게는 A이고;
X4는 Q 또는 N이고;
CDR-VH3. T-X1-G-A-E-X2-Y (SEQ ID NO .3)
여기서:
X1은 K 또는 R이고;
X2는 D 또는 E이고, 바람직하게는 D이고;
CDR-VL1. S-Q-S-X1-Y-S-X2-G-K-I-Y-X3-N (SEQ ID NO .4)
여기서:
X1은 LL, IL, II 또는 LI이고;
X2는 Q 또는 N이고;
X3은 I 또는 L이고, 바람직하게는 L이고;
CDR-VL2. Q-X1-S-K-X2-X3-P (SEQ ID NO .5)
여기서:
X1은 I, V 또는 L이고;
X2는 I 또는 L이고, 바람직하게는 L이고;
X3은 D 또는 E이고;
CDR-VL3 L-Q-Xl-T-Y-X2-P-X3-T (SEQ ID NO .6)
여기서:
X1은 A 또는 G이고;
X2는 S, Y 또는 T이고;
X3은 Q 또는 N이고, 바람직하게는 Q이고;
서열설명:
SEQUENCE LISTING
<110> 비붕 생물 유한회사.
<120> 항 열대열 말라리아 원충 HRP-II 항체
<130> IP190435
<160> 38
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR-VH1
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be Tyr, Thr or Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be Leu or Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be Asp or Glu, preferably Asp
<400> 1
Gly Xaa Thr Xaa Thr Xaa Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR-VH2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be Leu, Val or Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be Gln or Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa can be Ala or Pro, preferably Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa can be Gln or Asn
<400> 2
Asp Xaa Asn Pro Ile Xaa Gly Gly Thr Xaa Tyr Xaa Gln Lys Phe
1 5 10 15
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR-VH3
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be Lys or Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be Asp or Glu, preferably Asp
<400> 3
Thr Xaa Gly Ala Glu Xaa Tyr
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR-VL1
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be Leu or Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be Leu or Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa can be Gln or Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa can be Ile or Leu, preferably Leu
<400> 4
Ser Gln Ser Xaa Xaa Tyr Ser Xaa Gly Lys Ile Tyr Xaa Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR-VL2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be Ile, Val or Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be Ile or Leu, preferably Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be Asp or Glu
<400> 5
Gln Xaa Ser Lys Xaa Xaa Pro
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR-VL3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be Ala or Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be Ser, Tyr or Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa can be Gln or Asn, preferably Gln
<400> 6
Leu Gln Xaa Thr Tyr Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SMARTER II A Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
aagcagtggt atcaacgcag agtacnnnnn 30
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 5'RACE CDS Primer(5'CDS)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> v is a or g or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
tttttttttt tttttttttt tttttvn 27
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Universal Primer A Mix(UPM)
<400> 9
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nested Universal Primer A(NUP)
<400> 10
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> mIgG CKR
<400> 11
cgcctaacac tcattcctgt tgaagc 26
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> mIgG CHR
<400> 12
ccgctcattt acccggagac cg 22
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti HRPII3R5HF
<400> 13
cccaagcttg ccaccatgta cttgggactg aactgtgtat tc 42
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti HRPII3R5HR
<400> 14
ggggaattct cattactttc cgggagatct ggagatggtt tgcttg 46
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti HRPII3R5LF
<400> 15
cccaagcttg ccaccatgga catcagggct cctgctcagt ttcttggc 48
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti HRPII3R5LR
<400> 16
ggggaattct cattaacatt catttctgtt aaaagatttg acaatg 46
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 Heavy Chain variable region
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Leu Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Ala Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 18
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 Heavy Chain
<400> 18
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Leu Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Ala Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly
115 120 125
Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln
180 185 190
Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp
195 200 205
Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
245 250 255
Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
260 265 270
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
275 280 285
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg
290 295 300
Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
305 310 315 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu
325 330 335
Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp
370 375 380
Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys
405 410 415
Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His
420 425 430
Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 Light Chain variable region
<400> 19
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Ile Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Met Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Asp Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Ser Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 Light Chain
<400> 20
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Ile Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Met Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Asp Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Ser Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 HEAVY CHAIN CDR1
<400> 21
Gly Ser Thr Leu Thr Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 HEAVY CHAIN CDR2
<400> 22
Asp Leu Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Gln Lys Phe
1 5 10 15
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 HEAVY CHAIN CDR3
<400> 23
Thr Arg Gly Ala Glu Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 LIGHT CHAIN CDR1
<400> 24
Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Ser Asn Gly Lys Ile Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 LIGHT CHAIN CDR2
<400> 25
Gln Leu Ser Lys Leu Asp Pro
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant 1 LIGHT CHAIN CDR3
<400> 26
Leu Gln Gly Thr Tyr Ser Pro Gln Thr
1 5
<210> 27
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR-H1
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR-H2
<400> 28
Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR-H3
<400> 29
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
1 5 10 15
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR-H4
<400> 30
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR-L1
<400> 31
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser
20 25
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR-L2
<400> 32
Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Met Tyr
1 5 10 15
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR-L3
<400> 33
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR-L4
<400> 34
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT Heavy Chain variable region
<400> 35
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Leu Thr Glu Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Leu Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr Pro Tyr Gln Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Ala Glu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 36
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT Heavy Chain
<400> 36
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Leu Thr Glu Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Leu Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr Pro Tyr Gln Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Ala Glu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly
115 120 125
Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln
180 185 190
Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp
195 200 205
Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
245 250 255
Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
260 265 270
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
275 280 285
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg
290 295 300
Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
305 310 315 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu
325 330 335
Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp
370 375 380
Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys
405 410 415
Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His
420 425 430
Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT Light Chain variable region
<400> 37
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Ile Tyr Ile Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Met Tyr Gln Leu Ser Lys Ile Asp Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Ser Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT Light Chain
<400> 38
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Ile Tyr Ile Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Met Tyr Gln Leu Ser Lys Ile Asp Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Ser Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
Claims (18)
- 항체 또는 그 항원 결합 단편에 있어서,
상기 항체는 열대열 말라리아 원충 히스티딘-풍부 단백질-II(plasmodium falciparum histidine-rich protein-II, namely HRP-II), 즉 HRP-II와 결합되고, 여기서 상기 항체는 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역:
SEQ ID NO: 1으로 표시되는 아미노산 서열 G-X1-T-X2-T-X3-Y-Y-M-N으로 조성되되, 여기서 X1은 Y, T또는 S이고; X2는 L 또는 I이고; X3은 D인 중쇄CDR1;
SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열 D-X1-N-P-I-X2-G-G-T-X3-Y-X4-Q-K-F로 조성되되, 여기서 X1은 L, V 또는 I이고; X2는 Q 또는 N이고; X3은 A이고; X4는 Q 또는 N인 중쇄CDR2;
SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열 T-X1-G-A-E-X2-Y로 조성되되, 여기서 X1은 K 또는 R이고; X2는 D인 중쇄CDR3;
SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열 S-Q-S-X1-Y-S-X2-G-K-I-Y-X3-N로 조성되되, 여기서 X1은 LL, IL, II 또는 LI이고; X2는 Q 또는 N이고; X3은 L인 경쇄CDR1;
SEQ ID N0: 5로 표시되는 아미노산 서열 Q-X1-S-K-X2-X3-P로 조성되되, 여기서 X1은 I, V 또는 L이고; X2는 L이고; X3은 D 또는 E인 경쇄CDR2; 및
SEQ ID NO: 6으로 표시되는 서열 L-Q-X1-T-Y-X2-P-X3-T로 조성되되, 여기서 X1은 A 또는 G이고; X2는 S, Y 또는 T이고; X3은 Q인 경쇄CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편. - 항체 또는 그 항원 결합 단편에 있어서,
상기 항체는 열대열 말라리아 원충 히스티딘-풍부 단백질-II, 즉 HRP-II와 결합되고, 여기서 상기 항체는
SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 G-X1-T-X2-T-X3-Y-Y-M-N으로 조성되되, 여기서 X1은 Y, T 또는 S이고; X2는 L 또는 I이고; X3은 D인 중쇄CDR1;
SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열 D-X1-N-P-I-X2-G-G-T-X3-Y-X4-Q-K-F로 조성되되, 여기서 X1은 L, V 또는 I이고; X2는 Q 또는 N이고; X3은 A이고; X4는 Q 또는 N인 중쇄CDR2;
SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열 T-X1-G-A-E-X2-Y로 조성되되, 여기서 X1은 K 또는 R이고; X2는 D인 중쇄CDR3;
SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열 S-Q-S-X1-Y-S-X2-G-K-I-Y-X3-N로 조성되되, 여기서 X1은 LL, IL, II 또는 LI이고; X2는 Q 또는 N이고; X3은 L인 경쇄CDR1;
SEQ ID N0: 5로 표시되는 아미노산 서열 Q-X1-S-K-X2-X3-P로 조성되되, 여기서 X1은 I, V 또는 L이고; X2는 L이고; X3은 D 또는 E인 경쇄CDR2; 및
SEQ ID NO: 6으로 표시되는 서열 L-Q-X1-T-Y-X2-P-X3-T로 조성되되, 여기서 X1은 A 또는 G이고; X2는 S, Y 또는 T이고; X3은 Q인 경쇄CDR3를 포함하되,
상기 항체는 하기 표에 표시된 아미노산 잔기 치환 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편:
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 10-9 M 또는 더욱 작은 KD로 HRP-II 단백질과 결합되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편. - 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3과 FR-H4, 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3과 FR-L4를 더 포함하되, 여기서
FR-H1은 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:27로 표시되는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 조성되고;
FR-H2는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:28로 표시되는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 조성되고;
FR-H3은 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:29로 표시되는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 조성되고;
FR-H4는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열 또는 SEQ ID N0: 30으로 표시되는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 조성되고; 및
FR-L1은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:31로 표시되는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 조성되고;
FR-L2는 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:32로 표시되는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 조성되고;
FR-L3은 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 조성되고;
FR-L4는 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:34으로 표시되는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 조성되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편. - 제 4 항에 있어서,
상기 항체는 10-10 M 또는 더욱 작은 KD으로 HRP-II 단백질과 결합되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편. - 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일사슬항체, 이가항체 또는 도메인 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편. - 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
항체 또는 그 항원 결합 단편은 하나의 고체상 지지물인 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편. - 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원 결합 단편 을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 제 8 항에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 8 항에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원 결합 단편 및 이와 결합되는 결합 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체약물 결합체.
- 제 12 항에 있어서,
상기 결합 부분은 정제태그 또는 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체약물 결합체. - 제 12 항에 있어서,
상기 결합 부분은 콜로이드 금, 방사성 표지, 발광물질, 유색물질, 효소, 바이오틴/아비딘, 스핀표지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체약물 결합체. - 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 15 항에 있어서, 상기 키트는 HRP-II이외의 말라리아 항원과 결합되는 항체 또는 그 항원 결합 단편, 또는 항체 약물 결합체를 더 포함하고, 상기 HRP-II이외의 말라리아 항원은 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충 및/또는 난형 말라리아 원충의 특이성 항원 또는 공통 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 15 항에 있어서,
상기 키트는 쾌속진단(RDT)키트, 효소결합면역흡착(ELISA)키트, 간접면역형광측정(IFA)키트, 또는 방사성면역측정(RIA)키트인 것을 특징으로 하는 키트. - 생체 샘플과 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원 결합 단편을 항체와 타겟이 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 접촉시켜, 항체와 타겟 사이에 복합물이 형성되는 지를 검출하는 단계를 포함하고, HRP-II의 샘플 중에서의 존재 또는 이의 수준을 검출하고, 열대열 말라리아 원충 감염을 진단하고, 및/또는 열대열 말라리아 원충 감염과 기타 말라리아 원충 감염을 감별 및 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 것을 특징으로 하는 말라리아 원충 감염의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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