CN116063536B - 抗人MxA单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开抗人MxA单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明人制备并筛选了数种抗人MxA蛋白单克隆抗体，分别通过ELISA和流式细胞术检测这些单克隆抗体与MxA蛋白的结合能力，选择得到两种在细胞内和细胞外均与MxA蛋白具有较高结合能力的MxA单克隆抗体(MxA‑9和MxA‑19)。进一步发现两种单克隆抗体无交叉反应，组合使用可用于竞争免疫实验。

Description

抗人MxA单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物免疫检测技术领域，具体地涉及抗人MxA单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
人MxA蛋白属于GTPase超家族，由MxA(抗黏液病毒1)基因编码。全长MxA蛋白由662个氨基酸组成，分子量为76kD。除了单体形式，MxA还能形成二聚体、三聚体和四聚体等不同的寡聚形式。在寡聚体基础之上，MxA还能形成环状、球状、棒状和长丝状等的高级结构，且已知体外MxA蛋白与细胞内MxA的结构存在差异。
I型干扰素(IFN-I)是一类抗病毒细胞因子的总称。人IFN-I包含IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε和IFN-κ等5个亚型。多种病毒感染可以诱导IFN-I的表达，IFN-I进一步诱导MxA等效应分子的表达，从而抑制病毒增殖或者诱导抗病毒免疫反应。MxA具有广谱抗病毒作用，可以抑制流感病毒(IAV)、副流感病毒(hPIV3)、麻疹病毒、柯萨奇病毒、水泡性口膜炎病毒(VSV)、乙肝病毒(HBV)等多种病毒的复制(Trends Microbiol.2015；23(3):154-63.)。
与病毒感染不同，细菌感染基本不诱导IFN-I，因此可以通过检测IFN-I来区分病毒或者细菌感染。然而，由于IFN-I的血清浓度非常低，难以建立临床可用的检测方法。鉴于IFN-I特异性的诱导MxA蛋白表达且呈剂量依赖性，可以通过MxA间接检测IFN-I的活性。因此，MxA可以作为多种病毒感染的生物标志物(Clin Chem.2019；65(6):739-750.)。比较MxA和细菌感染标志物CRP的相对表达，可用于鉴别病毒和细菌感染。除了病毒感染之外，MxA还可能成为诊断其它IFN-I过表达相关疾病诊断和预后，或者用于监测IFN-α或IFN-β临床疗效。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的技术问题，发明人制备并筛选了两种能够在细胞内和细胞外与MxA蛋白结合，且具有较高结合能力的MxA单克隆抗体。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种抗体或其抗原结合片段，其至少能够结合具有第一结构形式的MxA蛋白和具有第二结构形式的MxA蛋白，其中，所述第一结构形式为体外MxA蛋白形式，所述第二结构形式为细胞内MxA蛋白形式。
在某些实施方案中，根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一结构形式通过ELISA实验检测，所述第二结构形式通过流式细胞检测。
在某些实施方案中，根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体含有轻链可变区和/或重链可变区，其中，所述轻链可变区含有氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、4、12、13、23、24至少之一的轻链抗原互补决定区CDR1-3；所述重链可变区含有氨基酸序列选自SEQ ID NO：7-9、16-18至少之一的重链抗原互补决定区CDR1-3。
在某些实施方案中，根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列：
(I)SEQ ID NO：2或11所示的轻链可变区氨基酸序列，和SEQ ID NO：6或15所示的重链可变区氨基酸序列；
(II)与SEQ ID NO：2、6、11和15所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
(III)与SEQ ID NO：2、6、11和15所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，(II)和(III)所述氨基酸序列的抗体依然保留对MxA蛋白的结合活性。
在某些实施方案中，根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和双特异性抗体中的至少一种；所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’、F(ab’)2片段、单链可变片段scFv、scFv-Fc片段和单链抗体ScAb中的至少一种。
本发明的第二方面，提供一种抗体或其抗原结合片段，其中，其由保藏号CGMCCNo.45326和/或CGMCC No.45327的杂交瘤细胞株或其后代产生。
本发明的第三方面，提供一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.45326或CGMCCNo.45327。
本发明的第四方面，提供一种制备本发明所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其中，在允许所述抗体表达的条件下培养第三方面所述的杂交瘤细胞株并从培养物中分离所述抗体，或通过人工合成。
本发明的第五方面，提供一种分离的核酸分子，其编码根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第六方面，提供一种组合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第七方面，提供一种检测试剂盒，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第八方面，提供根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于病毒感染相关的诊断剂中的用途。
本发明的第九方面，提供一种检测MxA蛋白水平的实验方法，其包括使本发明所述的抗体或其抗原结合片段与生物样品接触的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的检测、诊断或应用，其中，检测方法选自下述中的至少一种：间接免疫酶联吸附试验、免疫印迹、免疫细胞荧光试验、免疫沉淀试验、免疫荧光流式细胞分析、免疫层析、电泳法、胶体金法、直接竞争法、间接竞争法和放射免疫分析。
本申请的发明人制备并筛选了数种抗人MxA蛋白单克隆抗体，分别通过ELISA和流式细胞术检测这些单克隆抗体在细胞外和细胞内与MxA蛋白的结合能力，得到两种在细胞内和细胞外均与MxA蛋白具有较高结合能力的MxA单克隆抗体，即单克隆抗体MxA-9和MxA-19。将单克隆抗体MxA-9包被，HRP标记的MxA-19与之配对检测最明显，同样将单克隆抗体MxA-19包被，HRP标记的MxA-9与之配对检测最明显，两种配对方式的检测限可达1ng/ml。这一对抗体可用于进行MxA蛋白的检测。
附图说明
图1显示MxA蛋白经Ni柱纯化后跑SDS-PAGE电泳结果。
图2显示MxA蛋白经Superose 6increase 10/300分子筛纯化后，分子筛分析图的SDS-PAGE电泳结果。
图3显示MxA单克隆抗体在ELISA水平上结合纯化的MxA蛋白。
图4显示MxA单克隆抗体在流式水平上结合HEK293T细胞内表达的MxA蛋白。
图5显示MxA单克隆抗体MxA-9轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。图中黑色阴影区域标出了CDR1区(序列3)、CDR2区(序列23)和CDR3区(序列4)。
图6显示MxA单克隆抗体MxA-9重链可变区的核苷酸和氨基酸序列。图中黑色阴影区域标出了CDR1区(序列7)、CDR2区(序列8)和CDR3区(序列9)。
图7显示MxA单克隆抗体MxA-19轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。图中黑色阴影区域标出了CDR1区(序列12)、CDR2区(序列24)和CDR3区(序列13)。
图8显示MxA单克隆抗体MxA-19重链可变区的核苷酸和氨基酸序列。图中黑色阴影区域标出了CDR1区(序列16)、CDR2区(序列17)和CDR3区(序列18)。
图9显示MxA单克隆抗体MxA-9轻链可变区的氨基酸序列(序列2)和小鼠氨基酸序列(序列19)的对比结果。
图10显示MxA单克隆抗体MxA-9重链可变区的氨基酸序列(序列6)和小鼠氨基酸序列(序列20)的对比结果。
图11显示MxA单克隆抗体MxA-19轻链可变区的氨基酸序列(序列11)和小鼠氨基酸序列(序列21)的对比结果。
图12显示MxA单克隆抗体MxA-19重链可变区的氨基酸序列(序列15)和小鼠氨基酸序列(序列22)的对比结果。
图13显示MxA单克隆抗体MxA-9包被，MxA-9和MxA-19竞争配对结果。
图14显示MxA单克隆抗体MxA-19包被，MxA-9和MxA-19竞争配对结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其它陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本说明书中提供了相应氨基酸或核酸分子的具体序列，同时根据相关规定，本申请还提供了计算机可读形式的序列表。需要说明的是，计算机可读形式的序列表中的序列仅供参考，在本说明书中的序列与计算机可读形式的序列表中的序列不一致的情况下，以本说明书中的序列内容为准。
抗体
如本文所用，术语“抗体”指的是免疫球蛋白分子(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与之免疫反应)的抗原结合位点的分子。“结合”或“与之免疫反应”或“靶向”是指发生在免疫球蛋白分子与对所述免疫球蛋白特异的抗原之间的非共价相互作用。
抗体的重链可变区和轻链可变区通常包括3个互补决定区CDR和4个骨架区FR。互补决定区之间通过骨架区连接，在识别抗体时，FR分子卷曲使CDR分子相互靠近。互补决定区为抗体或抗原结合片段与抗原的结合部位，因此，互补决定区的序列决定了抗体的特异性。如本领域所理解，抗体是包含通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链的可变区包含框架区(FR)和互补决定区(CDR)。四个FR是相对保守的，而CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3)包含高变区。
本文中的“抗原结合片段”是指多肽片段，其包含完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合区或可变区，并且具有能够特异性靶向MxA的特性。优选地，其含有抗体重链可变区和/或轻链可变区的至少一个CDR。还优选地，其可以含有重链可变区的CDR1-3和/或轻链可变区的CDR1-3。抗原结合片段可以通过多种技术制备，包括但不限于将完整的抗体蛋白水解消化，或由包含抗原结合片段的宿主细胞表达产生。
在没有限定或理论约束的情况下，抗体或其抗原结合片段的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3和重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的序列可在下述范围内随机选择：SEQ ID NO：3、4、12、13、23、24所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1-3；和/或SEQ ID NO：7-9、16-18所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1-3。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3为SEQID NO：3、23、4，并且重链可变区CDR1、CDR2、CDR3为SEQ ID NO：7-9。在另外的实施方案中，抗体或其抗原结合片段的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3为SEQ ID NO：12、24、13，并且重链可变区CDR1、CDR2、CDR3为SEQ ID NO：16-18。
本发明中，抗体或其抗原结合片段具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列：(I)SEQ ID NO：2或11所示的轻链可变区氨基酸序列，和SEQ ID NO：6或15所示的重链可变区氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO：2、6、11和15所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；(III)与SEQ ID NO：2、6、11和15所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列。需要说明的是上述同源性(也称为“同一性”)序列不会改变抗原与抗体结合特性，即选自上述的氨基酸序列的抗体依然保留针对MxA蛋白的结合活性。
优选地，本发明中的抗体包括单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体中的至少一种；所述抗原结合片段为Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fd、单链抗体scFv、二硫键连接的Fv(sdFv)和单域抗体。还优选地，所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
本文所用术语“Fv”表示含有完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段含有紧密地非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体。这两个结构域的折叠导致六个高变环(三个环各自来自H和L链)的形成，它们促进用于抗原结合的氨基酸残基并给所述抗体赋予抗原结合特异性。但是，即使单个可变区(或仅包含三个对抗原特异性的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力(尽管以较低结合能力)。“单链Fv”(“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。sFv多肽还可以包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成期望的结构用于抗原结合。
本文所用术语“Fab”片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的差别在于几个残基在重链CH1结构域的羧基端处的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
优选地，所述抗体还包括抗体恒定区。还优选地，所述抗体恒定区选自：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
优选地，所述抗体恒定区的重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中任意一者的重链恒定区，优选为IgG4的重链恒定区。所述抗体恒定区的轻链恒定区为κ或λ。
本文所用术语“单克隆抗体”，有时也称为“单抗”或mAb，其是指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，但这不应被解释成需要用任何特殊或特定的方法来生产所述抗体。
除非另有说明，否则本文所述抗体或其抗原结合片段为分离的抗体或其抗原结合片段。其中所用术语“分离的”是指已经从它的天然环境提取出的核酸或抗体。已经“分离的”核酸、肽和蛋白因而包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语也包括通过在宿主细胞中的重组表达而制备的核酸、肽和蛋白以及化学合成的核酸和/或多肽。
变体抗体也都被包括在本发明的范围内。在本发明对变体的序列不特别限定，只要其具有靶向MxA抗原的结合特性，或具有提高的结合能力的抗体即可，具有这样序列的其它变体可以使用本领域已知的方法得到，并都包括在本发明的范围内。本领域技术人员利用用于生产变体多肽的重组方法和/或合成化学技术可以修改多肽的氨基酸序列。例如，可以使用氨基酸置换得到具有进一步提高的结合能力的抗体。可选地，可以使用核苷酸序列的密码子优化来提高在用于生产抗体的表达系统中的翻译效率。这样的变体抗体序列与在本发明中列举的序列具有80％或更高的(即，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性。相对于在本发明中列举的序列，计算所述序列同一性。或进行最佳比对时，如通过程序GAP或使用默认值间隙权重的BESTFIT。
本文所用术语“修饰”表示氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。本发明的抗体可包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰等。
保守氨基酸取代指的是具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸及苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸-天门冬酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。
另一类可能存在的可变区修饰是突变VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区中的氨基酸残基以改进目的抗体的一种或多种结合特性(例如结合能力)。可以通过定点诱变或PCR介导的诱变来导入突变。优选导入(如上所述的)保守修饰。突变可以是氨基酸的取代、添加或缺失，但优选为取代。此外，CDR区中残基变化通常不超过一个、两个、三个、四个或五个。
核酸分子
本发明进一步提供涉及编码本发明的抗体的核酸分子。核酸可以存在于完整的细胞中、存在于细胞溶胞物中或者以部分纯化或基本纯的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其它技术纯化除去其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“使得基本纯的”。参见F.Ausubel等人(1987)Current Protocols in MolecularBiology，GreenePublishing and Wiley Interscience,New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，而且可以含有或不含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO：2-4、6-9、11-13、15-18、23-24中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO：2-4、6-9、11-13、15-18、23-24中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。在某些实施方案中，本发明的编码序列包括SEQ ID NO：1、5、10、14所示的核苷酸序列。
可以使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸。一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，进一步通过标准重组DNA技术操作这些DNA片段，以例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作的连接至编码另一蛋白质，诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。术语“可操作的连接”在用于本文时旨在表示连接两DNA片段从而使得这两个DNA片段所编码的氨基酸序列保持在同一读码框中。
通过将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可以将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的。
通过将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可以将编码VL区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。
本发明还提供了编码本发明抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的肽序列的多核苷酸变体。这些多核苷酸变体与本发明的多核苷酸序列相比可以具有至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或更大的序列同一性。这样的连续序列可以编码CDR序列，或可以编码完整可变区。如本领域已知的，可变区序列可以与任何适当的恒定区序列融合。如本领域技术人员所理解，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等，可以适当地调节这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的对应同一性。
本领域可以理解的是，在本发明所公开的抗体编码序列的基础上经宿主密码子偏好性改造的序列可适用于本发明。为了适应于不同宿主的需要，可根据简并密码子来对本发明的碱基序列进行偏好性改造。密码子偏好性改造一般不改变产物蛋白或多肽的序列。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中互换地用于表示单链或双链RNA、DNA或混合的聚合物。
对于抗体的重组生产，将编码它的核酸插入载体中用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。根据在实施例中阐述的方法，分离编码本发明的抗体的DNA。如本领域技术人员所理解，许多载体可供用在抗体的重组生产中。载体组分通常包括但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
在本发明中，载体是指表达载体，包括但不限于质粒、逆转录病毒、YAC、EBV衍生的游离基因等。合适的载体是编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有经工程改造的合适的限制位点使得任何VH或VL序列可容易地插入并表达。所得的嵌合抗体可结合到任何强启动子，包括逆转录病毒LTR，例如，SV-40早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒LTR和莫洛尼氏鼠白血病病毒LTR。同样地，可使用天然Ig启动子等。
优选的载体包括病毒载体、融合蛋白质和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼氏鼠白血病病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘载体诸如：正天花或禽痘载体、疱疹病毒载体诸如：单纯疱疹I病毒(HSV)载体。具体载体的选择将取决于靶细胞和所处理的条件。导入可通过标准技术例如，感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包括例如，裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE聚葡糖、电穿孔、原生质体融合、脂质体转染、细胞显微注射和病毒载体。
用于克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。将用于本发明抗体生产的、用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞在适当修饰的常规营养物培养基中培养，用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。使用本领域普通技术人员已知的纯化技术，可以纯化从所述细胞制备的抗体。
本发明进一步提供表达完整人单克隆抗体的转基因非人类动物，例如转基因小鼠。在一个具体的实施方案中，转基因非人类动物是转基因小鼠，其基因组包含编码所有或部分本发明抗MxA抗体的人重链转基因和人轻链转基因。因此，在另一个实施方案中，本发明提供来自或分离自如上所述的转基因非人类动物(例如转基因小鼠)的分离的细胞，所述细胞表达人抗体。分离的B细胞可以通过与无限增殖化细胞融合而无限增殖，以提供人抗体的来源(例如杂交瘤)。这些杂交瘤也包括在本发明的范围之内。在某些实施方案中，所述杂交瘤细胞株为分泌抗人MxA单克隆抗体杂交瘤细胞株MxA-9，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2022年10月24日，保藏号为CGMCC No.45326。在某些实施方案中，所述杂交瘤细胞株为分泌抗人MxA单克隆抗体杂交瘤细胞株MxA-19，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2022年10月24日，保藏号为CGMCC No.45327。
本发明还提供至少一种抗体、组合物、试剂盒以及检测或诊断病毒感染相关的方法，其中，所述抗体、组合物、试剂盒用于在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或在相关疾病之前、之后或期间来实现下述中的至少一种：诊断至少一种IFN相关病症、区分病毒或者细菌感染、监测IFN-α或IFN-β临床疗效、检测或诊断病毒感染相关的疾病或病症、检测MxA蛋白水平。本发明中，术语“水平”和“量”可互换使用，并且含义包含含量、绝对量、相对量等。
本发明的试剂除了上述抗体外还可包括其它成分。其它成分的实例包括但不限于稀释液、显色液、终止液、洗涤液等。在某些实施方案中，任何上述物质之一可以与其他物质分离的状态单独存在分别存放于不同的容器(例如，小瓶)中，只要在使用时它们能够相互接触即可。另外，优选地，任何两种以上的上述物质可混合作为混合物存在。
在某些实施方案中，其它成分可以溶液形式提供，例如水溶液的状态存在。在以水溶液状态存在的情况下，这些物质的浓度或量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，物质的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明中的试剂可被进一步制备为检测或诊断病毒感染相关的诊断剂。该诊断剂的形式或为诊断组合物、诊断试剂盒，或者多种单独存在的试剂组合使用的其他任何形式。
在某些实施方案中，检测性或治疗性地标记抗体是有用的。将抗体与这些试剂缀合的方法是本领域已知的。仅为说明的目的，抗体可以用放射性原子、生色团、荧光团等可检测部分来标记。这样的标记抗体可用于诊断技术，可用于体内，或用于分离的样本。
检测方法
本发明还提供一种检测病毒感染或MxA蛋白水平的方法。检测方法选自下述中的至少一种：间接免疫酶联吸附试验、免疫印迹、免疫细胞荧光试验、免疫沉淀试验、免疫荧光流式细胞分析、免疫层析、电泳法、胶体金法、直接竞争法、间接竞争法和放射免疫分析。优选地，可用于本发明的检测方法为免疫酶联吸附试验(特别是双抗体夹心ELISA法)和流式细胞分析。在某些实施方案中，通过ELISA和流式细胞术检测，本发明的单克隆抗体在细胞外(体外重组)和细胞内均与具有不同结构形式的MxA蛋白结合，且结合能力较高。同时本发明人研究发现，使用双抗体夹心法检测时，同时使用两种抗人MxA单克隆抗体竞争配对，其检测限可以达到1ng/ml，因此，本发明的两种抗体组合能够有效应用于不同检测场景同时对MxA蛋白进行检测。
在某些实施方案中，本发明的抗体能够结合至少两种结构形式的MxA蛋白，其中的一种结构来源于体外重组MxA蛋白，另一种结构来源于细胞内MxA蛋白。优选地，体外重组MxA蛋白和细胞内MxA蛋白的结构不同。在某些实施方案中，体外重组MxA蛋白为寡聚体，其实例包括但不限于例如二聚体、三聚体、四聚体或由多于四个的单体所形成的寡聚体。在某些实施方案中，细胞内MxA蛋白结构选自MxA的单体、寡聚体、环状、球状、棒状和长丝状结构中的至少一种，例如细胞内MxA蛋白结构可以为单体。
本发明中，“受试者”和“患者”可互换地用于指可能需要本文描述的抗体或组合物或包含其的诊断剂进行诊断或检测的任何动物。受试者和患者因此包括但不限于灵长类动物(包括人类)、犬科动物、猫科动物、鼠和其它哺乳动物受试者。优选地，所述受试者是人类。从在其中使用所述术语的上下文显而易见，受试者和患者表示易于被病毒感染的受试者或患者。
本发明中，待测样品的类型不限定，其实例包括但不限于组织样品或流体样品。组织样品包括体细胞样品，流体样品包括血液或其成分例如血浆、血清等。生物样品可以是任何哺乳动物来源的样品，优选为来源于人的样品。可用于本发明的生物样品类型的实例包括但不限于以下的一种或多种：尿、粪便、泪液、全血、血清、血浆、血液成分、骨髓、细胞、组织、器官、体液、唾液、脸颊拭子、淋巴液、脑脊髓液、病变渗出物和由身体产生的其他流体。生物样品也可以是冷冻、固定、石蜡包埋或新鲜的活检样品。
实施例1
本实施例为抗人MxA蛋白单克隆抗体的制备。
1.人MxA蛋白抗原的制备
(1)根据人MxA基因序列，设计如下引物：
引物F:ATGGTTGTTTCCGAAGTGGACATCGCA
引物R:ACCGGGGAACTGGGCAAGCCGGCG
(2)以cDNA为模板，采用步骤(1)设计的引物进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物即为人MxA基因的全长片段。
上述PCR反应条件为：预变性，98℃，3min；变性，98℃，15s；退火，60℃，15s；延伸，72℃，1min 30s，共进行30个循环；最后增加延伸10min。
(3)将步骤(2)获得的PCR产物克隆至pET-Duet1载体上，得到pET-Duet1-humanMxA质粒。MxA序列N端有6×His标签，用于MxA蛋白纯化。
(4)将pET-Duet1-human MxA质粒转化大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，加入IPTG诱导表达。诱导12h后收集菌体，进行超声破碎。
(5)菌体裂解后收集上清进行Ni柱亲和层析，分别用含有30、80和300mM咪唑的缓冲液洗脱，并收集300mM咪唑洗脱液。洗脱液经TEV酶切和反挂Ni柱后即可去掉His标签。
结果如图1所示。取TEV酶切前、TEV酶切后和反挂穿柱液进行SDS-PAGE胶检测，并进行质谱检测。检测结果显示所纯化蛋白是人MxA蛋白。
(6)用Superose 6increase 10/300分子筛进行进一步纯化。测定蛋白浓度，用于下述小鼠免疫实验。
结果如图2所示。取峰1和峰2蛋白进行SDS-PAGE胶检测，结果显示峰1为人MxA蛋白且纯度较高，出峰位置约14ml，蛋白大小约300kD，为四聚体形式。
2.BalB/C小鼠的免疫
以人MxA作为免疫原免疫小鼠。具体步骤如下：将等体积的含有5μg人MxA蛋白的PBS和完全弗氏佐剂配制成200μl乳化液，通过皮下注射方式免疫6周龄BalB/C小鼠。4周后用等体积的含5μg人MxA蛋白的PBS和不完全弗氏佐剂配制成200μl乳化液再次皮下注射。每个月免疫一次，共免疫4次。最后，用200μl含有10μg人MxA蛋白的PBS腹腔注射加强免疫，并在3天后进行杂交瘤融合。
3.杂交瘤的融合
将免疫后待融合的小鼠处死，取出脾脏细胞。通过细胞计数，将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC，CRL1581)按照1:3生物比例进行混合，并使用50％ PEG融合细胞。将融合后的细胞加入到60ml含1×HAT的RPMI 1640培养基(含有10％胎牛血清)中，按照每孔1-2滴的量加入到96孔细胞培养板中。随后，将杂交瘤细胞在37℃，5％ CO2条件下进行培养，3-4天进行半量换液。约10天后进行抗体筛选。
4.人MxA单克隆抗体的筛选
将人MxA蛋白用PBS稀释至1μg/ml，取100μl稀释后的MxA蛋白加入ELISA板中，4℃孵育过夜后用PBST清洗3次。包被完毕后，加入200μl 0.2％ BSA室温封闭1h，之后用PBST清洗3次。将96孔板细胞培养板中的上清吸出约100μl至ELISA板中，并在原孔补入100μl新鲜的含有1×HAT的RPMI 1640培养基，继续培养细胞，同时设Balb/c阴性血清和阳性血清(1:2000稀释)对照。室温孵育1h后，用PBST洗掉未结合的抗体。然后每孔加入100μl HRP-山羊抗小鼠IgG(1：10000稀释)，室温孵育1h后，并用PBST清洗5次。加入100μl TMB显色2-10min后加入50μl H2SO4终止反应，并读取450nm处吸光值。OD450值大于2倍阴性孔OD450值的孔为MxA结合抗体的阳性孔。
根据上述步骤，筛选出19个MxA单克隆杂交瘤细胞株，分别命名为MxA-2、MxA-3、MxA-4、MxA-5、MxA-6、MxA-7、MxA-8、MxA-9、MxA-10、MxA-11、MxA-12、MxA-14、MxA-15、MxA-16、MxA-17、MxA-18、MxA-19、MxA-20、MxA-21。
实施例2
小鼠抗人MxA单克隆抗体可以在ELISA水平上结合人MxA蛋白。
1.将人MxA蛋白用PBS稀释至1μg/ml，取100μl稀释后的MxA蛋白加入ELISA板中，4℃孵育过夜后用PBST清洗3次。
2.加入200μl 0.2％ BSA室温封闭1h，之后用PBST清洗3次。
3.将小鼠抗人MxA单克隆抗体(MxA-2、MxA-3、MxA-4、MxA-5、MxA-6、MxA-7、MxA-8、MxA-9、MxA-10、MxA-11、MxA-12、MxA-14、MxA-15、MxA-16、MxA-17、MxA-18、MxA-19、MxA-20、MxA-21)稀释至10μg/ml，同时设阴性和阳性对照。室温孵育1h后，用PBST清洗3次洗掉未结合的抗体。
4.每孔加入100μl HRP-山羊抗小鼠IgG(1：10000稀释)，室温孵育1h后，并用PBST清洗5次。
5.加入100μl TMB显色2-10min后加入50μl H2SO4终止反应。
6.在酶标仪上读取450nm处吸光值。
结果如图3所示。从图中可以看出，小鼠抗人MxA单克隆抗体在ELISA水平可以结合人MxA蛋白，其中MxA-4、MxA-9、MxA-14、MxA-17、MxA-19结合能力较高。
实施例3
本发明的小鼠抗人MxA单克隆抗体可以在流式水平上结合细胞中表达的MxA。
1.将人MxA基因按照实施例1步骤1中所示方法构建至真核表达载体pTT3上，得到pTT3-human MxA质粒，MxA序列下游融合有GFP基因，当MxA表达时，可观察到GFP信号。
2.将pTT3-huaman MxA质粒使用lipofectamine 2000转染至HEK293T细胞，24h后用含有2mM EDTA的PBS溶液(1L PBS溶液含KH2PO4 0.27g、Na2HPO4 1.42g、NaCl 8g、KCl0.2g，调节pH至7.2-7.4，用水定容至1L)处理细胞。
3.将表达MxA的细胞3000rpm/5min离心后弃上清，用1ml 2％ PFA溶液重悬细胞，4℃孵育30min。
4.孵育完毕3000rpm/3min离心，弃上清，加入800μl破膜缓冲液洗涤细胞两遍。弃掉上清，用破膜缓冲液重悬细胞，制成单细胞悬液。将单细胞悬液加入96孔U型底培养板中，10000个细胞/200μl/孔。
5.每孔分别加入含有10μg/ml的实施例1制备的小鼠单克隆抗体(MxA-2、MxA-3、MxA-4、MxA-5、MxA-6、MxA-8、MxA-9、MxA-10、MxA-11、MxA-12、MxA-14、MxA-15、MxA-17、MxA-18、MxA-19、MxA-20、MxA-21)的破膜缓冲液，重悬细胞后4℃孵育30min。
6.孵育完成后，通过2200rpm/3min离心，弃上清，收集沉淀并进行清洗。
7.每孔分别加入1:500稀释的PE标记的羊抗鼠IgG抗体，将细胞重悬后在4℃避光条件下孵育30min。孵育后将培养板进行离心并去除上清。按照前述方法清洗细胞后加入200μl PBS重悬细胞。
8.使用流式仪分析细胞GFP与PE信号。
结果如图4所示。由于MxA与GFP融合表达，GFP表达量高的细胞其MxA表达量也较高。因此，GFP表达高的细胞结合抗人MxA抗体也较多，会结合更多的PE标记的羊抗鼠IgG抗体，也就具有更高的PE信号。从图中可以看出，小鼠抗人MxA单克隆抗体均可结合人MxA蛋白，其中MxA-3、MxA-8、MxA-9、MxA-10、MxA-11、MxA-12、MxA-15、MxA-18、MxA-19、MxA-20、MxA-21结合能力较高。
实施例4
小鼠抗人MxA单克隆抗体MxA-9和MxA-19的序列。
1.RNA的提取
利用Trizol裂解杂交瘤细胞，提取杂交瘤细胞RNA。RNA提取的具体操作步骤如下：每1ml Trizol加入200μl氯仿，充分震荡后静置5min；13000rpm/4℃/15min离心；吸取400μl上清至等体积预冷的异丙醇中，混匀后13000rpm/4℃/15min离心；去除上清，加入70％乙醇清洗沉淀2次，rpm/4℃/10min离心；去除上清，加入40μl无RNA酶的水溶解得到RNA溶液。
2.cDNA的获得
将步骤1获得的RNA进行反转录，得到cDNA。反转录的具体步骤如下：取16μl步骤1制备的RNA溶液，加入1μl浓度为100mM的oligo dT，70℃反应5min；立即放置冰上；分别加入1μl RNA酶抑制剂，1μl dNTPs(浓度为10mM)，1μl MLV反转录酶和5μl缓冲液，42℃反应60min；72℃处理5min。
3.PCR扩增及测序
以步骤2获得的cDNA为模板，分别采用重链引物F和重链引物R、轻链引物F和轻链引物R进行PCR扩增，分别获得编码重链的轻链的片段并对其进行测序。引物序列如下：
重链引物F：SARGTNMAGCTGSAGSAGTC；
重链引物R：ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC；
轻链引物F：GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA；
轻链引物R：GGATACAGTTGGTGCAGCATC；
其中，R＝a、g；Y＝c、t；M＝a、c；K＝g、t；S＝c、g；W＝a、t；V＝a、c、g；N＝a、c、g、t。
上述PCR反应条件：预变性，95℃，3min；变性，95℃，30s；退火，57℃，30s；延伸，72℃，40s，共进行30个循环；最后增加延伸10min。
测序结果如下：
MxA单克隆抗体MxA-9的轻链可变区核酸和氨基酸序列显示于图5中，MxA-9的轻链可变区核苷酸序列为序列1，轻链可变区氨基酸序列为序列2。将MxA-9的轻链可变区氨基酸序列第27-31位所示的氨基酸序列(序列3)命名为MxA-9轻链CDR1，将MxA-9的轻链可变区氨基酸序列第55-57位所示的氨基酸序列(KVS)(序列23)命名为MxA-9轻链CDR2，将MxA-9的轻链可变区氨基酸序列第94-100位所示的氨基酸序列(序列4)命名为MxA-9轻链CDR3。
MxA单克隆抗体MxA-9的重链可变区核酸和氨基酸序列显示于图6中，MxA-9的重链可变区核苷酸序列为序列5，重链可变区氨基酸序列为序列6。将MxA-9的重链可变区氨基酸序列第26-33位所示的氨基酸序列(序列7)命名为MxA-9重链CDR1，将MxA-9的重链可变区氨基酸序列第51-58位所示的氨基酸序列(序列8)命名为MxA-9重链CDR2，将MxA-9的重链可变区氨基酸序列第97-106位所示的氨基酸序列(序列9)命名为MxA-9重链CDR3。
MxA单克隆抗体MxA-19的轻链可变区核酸和氨基酸序列显示于图7中，MxA-19的轻链可变区核苷酸序列为序列10，轻链可变区氨基酸序列为序列11。将MxA-19的轻链可变区氨基酸序列第27-31位所示的氨基酸序列(序列12)命名为MxA-19轻链CDR1，将MxA-19的轻链可变区氨基酸序列第55-57位所示的氨基酸序列(KVS)(序列24)命名为MxA-19轻链CDR2，将MxA-19的轻链可变区氨基酸序列第94-100位所示的氨基酸序列(序列13)命名为MxA-19轻链CDR3。
MxA单克隆抗体MxA-19的重链可变区核酸和氨基酸序列显示于图8中，MxA-19的重链可变区核苷酸序列为序列14，重链可变区氨基酸序列为序列15。将MxA-19的重链可变区氨基酸序列第26-33位所示的氨基酸序列(序列16)命名为MxA-19重链CDR1，将MxA-19的重链可变区氨基酸序列第51-58位所示的氨基酸序列(序列17)命名为MxA-19重链CDR2，将MxA-19的重链可变区氨基酸序列第97-106位所示的氨基酸序列(序列18)命名为MxA-19重链CDR3。
4.抗体序列分析
将步骤3测序所得核酸片段在抗体序列分析工具igBlast tool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)中进行分析发现：
MxA单克隆抗体MxA-9的轻链编码基因的V基因和J基因分别对应于小鼠IGKV1-117基因和IGKJ1基因，MxA单克隆抗体MxA-9轻链可变区的氨基酸序列(序列2)与小鼠VJ区氨基酸序列(序列19)的对比结果如图9所示。
MxA单克隆抗体MxA-9的重链编码基因的V基因、D基因和J基因分别对应于小鼠IGHV1-87基因、IGHD2-3基因和IGKJ2基因，MxA单克隆抗体MxA-9重链可变区的氨基酸序列(序列6)与小鼠VDJ区氨基酸序列(序列20)的对比结果如图10所示。
MxA单克隆抗体MxA-19的轻链编码基因的V基因和J基因分别对应于小鼠IGKV1-117基因和IGKJ2基因，MxA单克隆抗体MxA-19轻链可变区的氨基酸序列(序列11)与小鼠VJ区氨基酸序列(序列21)的对比结果如图11所示。
MxA单克隆抗体MxA-19的重链编码基因的V基因、D基因和J基因分别对应于小鼠IGHV1S137基因、IGHD1-1基因和IGKJ4基因，MxA单克隆抗体MxA-19重链可变区的氨基酸序列(序列15)与小鼠VDJ区氨基酸序列(序列22)的对比结果如图12所示。
具体序列如下所示：
序列1：
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCGGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC；
序列2：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK；
序列3：
QSIVHSNGNTY；
序列4：
FQGSHVPPT；
序列5：
CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGACAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTTCCTACTGGATGCACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGCTCTGGAATGGATTGGGACTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACACTCAGATTTTCAAGGGCAAGGTCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCTATGATAACTACTTTGACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAG；
序列6：
QVQLQQSGAELTRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQALEWIGTIYPGDGDTRYTQIFKGKVTLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARSYDNYFDYWGQGTTLTVSS；
序列7：
GYTFTSYW；
序列8：
IYPGDGDT；
序列9：
ARSYDNYFDY；
序列10：
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAAATCTAGTCAGAACATTGTACATACTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAC；
序列11：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCKSSQNIVHTNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK；
序列12：
QNIVHTNGNTY；
序列13：
FQGSHVPYT；
序列14：
CAGGTCAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGGTTCTGGTTACACATTCACTGATTATGCTATGCACTGGGTGAAGCAGAGTCATGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGACTGATTATTACTTACTATGGTGATGCTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTATATGGAACTTGCCAGACTGACATCTGAGGATTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGGGAGATTTAGTACTACGGTAGTAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACC；
序列15：
QVKLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQSHAKSLEWIGLIITYYGDASYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARGRFSTTVVGAMDYWGQGTSVT；
序列16：
GYTFTDYA；
序列17：
IITYYGDA；
序列18：
ARGRFSTTVVGAMDY；
序列19：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK；
序列20：
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGRATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATYDGYFDYWGQGTTLTVSS；
序列21：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK；
序列22：
QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQSHAKSLEWIGVISTYYGDASYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAVYYCARFITTVVYAMDYWGQGTSVTS；
序列23：
KVS；
序列24：
KVS。
实施例5
小鼠抗人MxA单克隆抗体MxA-9和MxA-19竞争配对。
1.分别将人MxA单克隆抗体MxA-9和MxA-19用PBS稀释至2μg/ml，取100μl稀释后的MxA-9和MxA-19分别加入ELISA板中，4℃孵育过夜后用PBST清洗3次。
2.加入200μl 0.2％BSA室温封闭1h，之后用PBST清洗3次。
3.将人MxA蛋白用PBS稀释至0.01、0.1、1和10μg/ml，取100μl稀释后的MxA蛋白加入ELISA板中。同时加入100μl PBS作为阴性对照。室温孵育1h后，用PBST清洗3次。
4.将带有HRP标签的小鼠抗人MxA单克隆抗体MxA-9和MxA-19稀释至1μg/ml MxA-20、MxA-21)稀释至10μg/ml。每孔加入100μl HRP-MxA-9抗体和HRP-MxA-19抗体，室温孵育1h后，并用PBST清洗5次。
5.加入100μl TMB显色2-10min后加入50μl H2SO4终止反应。
6.在酶标仪上读取450nm处吸光值。
结果如图3所示。从图中可以看出，小鼠抗人MxA单克隆抗体在ELISA水平可以结合人MxA蛋白，其中MxA-4、MxA-9、MxA-14、MxA-17、MxA-19结合能力较高。
MxA单克隆抗体MxA-9包被，HRP-MxA-19抗体配对检测非常敏感，0.01μg MxA蛋白即ELISA检测阳性，ELISA结果如图13所示。
MxA单克隆抗体MxA-19包被，HRP-MxA-9抗体配对检测非常敏感，0.01μg MxA蛋白即ELISA检测阳性，ELISA结果如图14所示。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (13)

1. 抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其结合具有第一结构形式的MxA蛋白和具有第二结构形式的MxA蛋白，其中，所述第一结构形式为体外MxA蛋白形式，所述第二结构形式为细胞内MxA蛋白形式，所述抗体含有轻链可变区和重链可变区，其中：
(1) 所述轻链可变区的抗原互补决定区CDR1-3分别如SEQ ID NO：3、23、4所示，所述重链可变区的抗原互补决定区CDR1-3分别如SEQ ID NO：7-9所示；或
(2) 所述轻链可变区的抗原互补决定区CDR1-3分别如SEQ ID NO：12、24、13所示，所述重链可变区的抗原互补决定区CDR1-3分别如SEQ ID NO：16-18所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第一结构形式通过ELISA实验检测，所述第二结构形式通过流式细胞检测。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列：
(I) SEQ ID NO：2或11所示的轻链可变区氨基酸序列，或SEQ ID NO：6或15所示的重链可变区氨基酸序列；
(II) 与SEQ ID NO：2、6、11和15所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
(III) 与SEQ ID NO：2、6、11和15所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，(II)和(III)所述氨基酸序列的抗体依然保留对MxA蛋白的结合活性。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中所述抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体中的至少一种；所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’、F(ab’)2片段、单链可变片段scFv、scFv-Fc片段和单链抗体ScAb中的至少一种。
5. 抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其由保藏号CGMCC No.45326和/或CGMCCNo.45327的杂交瘤细胞株或其后代产生。
6.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
7. 杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.45326或CGMCC No.45327。
8.一种制备根据权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，在允许所述抗体表达的条件下培养根据权利要求7所述的杂交瘤细胞株并从培养物中分离所述抗体，或通过人工合成制备得到。
9.组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.检测试剂盒，其特征在于，包含根据权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测病毒感染相关的诊断剂中的用途。
12.试剂在用于制备MxA蛋白水平检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂包括权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述检测包括使所述抗体或其抗原结合片段与生物样品接触的步骤。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述检测选自下述中的至少一种：免疫酶联吸附试验、免疫印迹、免疫细胞荧光试验、免疫沉淀试验、流式细胞分析、免疫层析、电泳法、胶体金法、直接竞争法、间接竞争法和放射免疫分析。
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Denomination of invention: Anti human MxA monoclonal antibody and its preparation method and application

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Pledgor: Baoding Guolan Biotechnology Co.,Ltd.

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