CN101570742A - 人抗粘病毒蛋白A-hMxA的单克隆抗体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人MxA单克隆抗体，所述抗人MxA单克隆抗体由杂交瘤细胞系CCTCC NO：C200916产生，所述单克隆抗体为IgG1亚类，kappa型；该单克隆抗体具有良好特异性和很高亲和力，能够识别人MxA的原核表达产物，人MxA的真核表达产物，干扰素或其他因素诱导的人MxA基因表达产物，同时可以分别识别MxA表达蛋白的变性蛋白和非变性蛋白，良好地反映该蛋白的聚合体的存在形式，因此，利用该单克隆抗体可以简便快速准确地检测出人MxA蛋白的表达水平。

Description

人抗粘病毒蛋白A-hMxA的单克隆抗体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种人抗粘病毒蛋白A-hMxA的单克隆抗体的制备及其应用，具体涉及人抗粘病毒蛋白A-hMxA的单克隆抗体，以及在胞外分泌该抗体的杂交瘤细胞株；本发明还涉及应用该单克隆抗体检测人hMxA基因蛋白表达水平的多种免疫学方法。

背景技术

人抗粘病毒蛋白A-hMxA(human myxovirus resistance A)是由人I型干扰素(IFNα/β)特异性诱导表达并具有抗多种病毒活性的三磷酸鸟苷水解酶蛋白，该蛋白在体内多种细胞或组织中通过IFNα/β等I型干扰素的诱导可高效表达，同时人机体在一些病毒感染或注射了I型干扰素的情况下，可以直接通过人外周血单个核细胞PBMCs(peripheral blood mononuclear cells)样本检测出该蛋白的高效表达，上述的细胞IFNα/β的体外诱导也可检测其高效表达。现有报道表明人的III型干扰素亦可诱导该蛋白表达但其诱导表达水平远低于I型干扰素。更有意义的是：尽管一些病毒感染后可诱导该蛋白的表达，但该诱导表达方式是间接的必须通过激活I型干扰素介导的方式才能诱导该蛋白的表达。

尽管国内外已有IFNα/β抗体制备并建立了检测方法(主要是ELISA检测方法)，但IFNα/β基因是典型的诱导型表达基因，其蛋白含量极低且半衰期很短，因而在体内很难掌握测定该蛋白的最佳时机，而改用干扰素诱导的下游基因ISGs(Interferon Stimulation Genes)如人hMxA的表达情况(主要是考虑到这些基因表达蛋白非常稳定)作为替代(surrogate)指标来分析IFNα/β基因在体内被激活的状态具有极其重要的意义。

作为I类干扰素诱导的主要蛋白之一，hMxA的表达水平可作为I型干扰素活性的重要分子指标是有可靠理论依据的：(1)该蛋白非常稳定，(2)其表达水平严格与I型干扰素呈浓度依赖性(dose dependancy)。已有大量报道表明该基因仅受I型和III型干扰素的调控而不受II型干扰素的调节，而干扰素特别I和III型干扰素信号通路的激活与机体的病毒感染有很强的相关性，通过人hMxA基因转录水平特别是蛋白表达水平变化的分析在对小儿的细菌和病毒感染之间的鉴别诊断中有重要意义，为在临床中正确指导抗小儿病原体感染用药提供重要的指标。

同时，该蛋白作为人体先天性免疫系统中的重要功能蛋白之一，大量试验表明：该蛋白有抗多种RNA病毒的活性，主要包括正粘病毒，副粘病毒，本雅病毒。近十年来，有报道表明该蛋白具有抗乙型肝炎病毒的活性，同时研究发现：在一些慢性活动性乙肝患者中，I型干扰素治疗效果不佳与I型干扰素选择性失去的诱导人hMxA活性有密切的相关性，因此人hMxA基因的转录水平和蛋白表达水平可成为评判I型干扰素对慢性活动性乙肝患者治疗效果的重要指标，为此国内上海交通大学瑞金医院申报了用于检测乙肝患者样本中的人hMxA基因转录水平(mRNA)定量测定试剂盒专利(参见：申请号为CN200410093480.7的专利申请文件)。该试剂盒主要是利用荧光标记实时定量PCR法原理而设计，利用该试剂盒检测患者样本不仅需要纯化样本中的RNA，还需要定量PCR仪等高级仪器，其操作比较复杂且技术和设备要求高，因而在中小医院中的推广应用有一定的难度；同时该试剂盒测定的是人hMxA基因的mRNA转录水平，而该基因本身为诱导型基因，转录本的半衰期很短，利用该试剂盒同样存在如何掌握测定的最佳时机的问题。

不仅如此，本实验室还利用该单抗对数例乙型肝炎表面抗原疫苗受免健康者的PBMCs样本检测还发现：在免疫期内，正常人的PBMCs样本中的MxA基因均高表达，因此，如果可以得到特异性高、亲和力高、应用范围广的抗人hMxA单克隆抗体，则该单抗有望成为：检测乙型肝炎表面抗原疫苗免疫效果重要的辅助指标。

更有意义的是：国外相关学者以丙型肝炎病毒(HCV)和艾滋病毒(HIV)感染者为对象，研究二种病毒感染后的I型干扰素激活系统和I型干扰素信号通路时，发现这二种病毒感染与hMxA基因表达水平的改变存在很强的相关性，因此该基因非常有望成为主要的分子标记(Molecular Marker)来分析上述感染者的病程。

已有研究表明：人hMxA基因的表达蛋白半衰期很长，以单体的形式存在时，其半衰期为二周，以同源多聚体(＞30聚体)的形式存在时其半衰期更长，而通过免疫学方法测定样本中人hMxA基因蛋白表达水平更能准确地反映体内干扰素被激活和调节等情况，以及人hMxA基因的高表达与疾病病程相关性，而要建立免疫学检测方法检测样本中人hMxA基因蛋白表达水平就必须获取特异性强，亲和力高，应用范围广的抗人hMxA单克隆抗体。

综上所述：检测人hMxA基因蛋白具有重大意义，因此必须获取特异性强，亲和力高，应用范围广的抗人hMxA单克隆抗体，从而可以据此建立免疫学检测方法检测样本中人hMxA基因蛋白表达水平。

关于抗人hMxA单克隆抗体，经查新未见国内有同类产品报道，国外仅有德国弗莱堡大学KOCHS教授领导的课题组有制备该蛋白单抗的报道并命名为M143，该抗体已在国外多个实验室得到应用，但都是以该大学赠送名义而发表学术报告的，并未见有专利和商业化形式的报道。从已有的学术报告表明：该抗体主要应用于hMxA蛋白的免疫印迹(western-blot)和免疫细胞化学/免疫细胞荧光(immunocytochemistry/immunocytofluorescence)等方法的检测，其制备流程和主要技术参数未见公开；而且，他们的抗体未涉及免疫沉淀(immuno-precipitation)试验，从而一定程度上局限了该M143单抗的应用范围。

发明内容

本发明目的是提供一种人抗粘病毒蛋白A-hMxA的单克隆抗体，利用该单克隆抗体通过免疫学方法检测人hMxA基因的蛋白表达水平；本发明的另一目的是提供能产生具有良好识别hMxA蛋白并能与其进行免疫学反应的单克隆抗体分泌型稳定杂交瘤细胞株，通过该细胞株大量生产均质的、稳定的、多用途的、可用于商业化的单克隆抗体。

为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种杂交瘤细胞株，其制备方法包括以下步骤：

(1)利用hMxA基因(基因序列号是：NM182942)原核表达产物免疫Balb/C小鼠以获取能产生针对该蛋白特异性抗体的致敏B细胞；

采用该策略是基于以下几方面考虑：

首先，原核表达产物作免疫原其表达量高(这是真核表达产物无法达到的)，易纯化(通过蛋白制备电泳的方法可以获取其纯度大于85％纯化物，纯化周期仅需1天的时间，大大减少了该蛋白降解的可能性)。

其次，该基因表达蛋白无后加工过程，原核表达产物与天然表达蛋白能有相同的抗原识别位点完全满足制备抗体的要求；

再次，用PCR产物直接免疫动物属DNA疫苗的范畴，该技术到目前为止仅为探索阶段其技术不成熟，因此不宜采用该策略；

最后，选Balb/C小鼠免疫制备检测用单克隆抗体是通用策略，我们制备该抗体目的并不用于抗体的治疗故无需制备人源化的单抗，即便需要亦可在此基础上再进行研究。

(2)获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株(本细胞株由苏州大学免疫学研究所王雪峰副教授提供)融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

(3)分泌单克隆抗体融合细胞克隆的筛选：应用双抗体夹心ELISA或间接ELISA检测策略筛选分泌单克隆抗体融合细胞克隆是获取分泌单抗细胞克隆常规手段，发明人选用了间接ELISA检测手段进行检测；并引入间接免疫细胞荧光试验加以筛选：即以ELISA检测阳性的作为候选克隆，再采用细胞免疫荧光阳性作为关键指标以确立其阳性克隆；

采用该策略是出于以下考虑：

ELISA的优点是可进行大量样本检测，操作时间短：2～3h内可出报告，但缺点是有一定的非特异性，考虑到ELISA检测存在一定非特异性风险，本发明采用了双筛选方法，与常规单抗筛选方法相比，双筛选比单筛选提高了筛选的可靠性；此外，发明人制备的免疫原是一种融合蛋白，因此用ELISA法有可能筛选了融合蛋白的标签的位点而非MxA蛋白的位点的风险，所以必须用另一方法确立识别的是MxA蛋白抗原表位来佐证。

(4)单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得：采用双筛选方法，发明人仅获得三株合格细胞克隆，其中一株细胞9A5(我们进行融合细胞培养时共用了12块96孔板，这里指的是第9块板的A列5行孔中的细胞)克隆免疫荧光信号均强于其他二株(6A1，3B4，同样的方法编号)，将该克隆细胞按常规单细胞克隆方法进行了二轮亚克隆并对每轮亚克隆进行双筛选：直至所有的亚克隆均呈强双阳性后，从中挑出一株生长最旺的单细胞克隆(编号3C2)扩大培养并进行传代冻存。

将上述技术方案中生长最旺的单细胞克隆(编号3C2)送交至武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2009年3月5日；保藏编号CCTCC NO：C200916；分类命名：杂交瘤细胞株WL-3C2；

为达到上述目的，本发明的具体技术方案为：一种人抗粘病毒蛋白A-hMxA的单克隆抗体，所述人抗粘病毒蛋白A-hMxA的单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株产生，所述单克隆抗体为高特异性的鼠源抗hMxA单克隆抗体，所述单克隆抗体为IgG1类，lamda型，制备所述人抗粘病毒蛋白A-hMxA的单克隆抗体的方法有两种，

第一种方法包括以下步骤：以上述杂交瘤细胞-9A5克隆的一株细胞-3C2(即杂交瘤细胞株WL-3C2)作种子细胞用10％CBS+DMEM或10％CBS+RPMI-1640，在细胞培养设备(如转瓶细胞培养设备)中进行扩大培养，在培养上清中可分泌hMxA单克隆抗体；

第二种方法采用杂交瘤细胞株WL-3C2诱生腹水的方法来生产该单抗蛋白；

对上述两种方法进行比较：用ELISA法进行效价比较发现：腹水中抗体效价比培养上清(细胞浓度为10⁶/ml)抗体的效价高出3200倍以上，故采用该方法生产极大的提高了单抗蛋白产量大大的降低了生产成本和纯化成本。

用该细胞株反复进行诱生腹水试验发现：该株能良好诱导产生大量血性腹水且目标蛋白占在腹水总蛋白的比例能达到15～20％，其每毫升抗体蛋白产量均已达到毫克级以上，为下一步进行商业化生产提供了可靠保证。

本发明还涉及一种检测hMxA蛋白表达水平的方法，该方法使用上述单克隆抗体来检测。

优选的技术方案中，为检测人hMxA蛋白表达水平，可以使用以下免疫学方法，如：间接免疫酶联吸附试验(ELISA)法，免疫印迹试验(Western-blot)法，免疫细胞荧光试验(immunocytoflurescence)法，免疫沉淀试验(immunoprecipitation)法，免疫荧光流式细胞分析(flowcytometer analysis)等法对含多种形式hMxA蛋白的样本进行检测。

上述技术方案中，所述人hMxA蛋白选自：人MxA的原核表达产物、人MxA的真核表达产物、干扰素诱导的人MxA基因表达产物、人MxA表达蛋白的变性蛋白或非变性蛋白、人MxA蛋白的聚合体或单体中的一种。

进一步的技术方案中，上述检测hMxA蛋白表达水平的方法，可以分析IFNα/β基因在体内被激活的状态，进而分析鉴别小儿的细菌和病毒感染，分析I类干扰素治疗乙型肝炎病人的疗效。

上述技术方案中，所述免疫学方法属于免疫学常见基本技术，属于本领域技术人员公知的技术；另外还有免疫酶组织化学和免疫组织荧光化学试验未涉及到，我们将根据实际需要涉及该方面的工作，从现有试验结果推断，该抗体亦能这二种技术中良好的工作。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

(1)与CN200410093480.7专利相比，在检测人hMxA基因蛋白的时候，本发明由于得到了特异性高、亲和力高的抗人hMxA单克隆抗体，因此，本发明所述检测方法无需提取RNA那样非常苛刻的试验条件(主要防止RNA降解)，也无需real time RT-PCR技术那样需设严格的内参和外参和利用昂贵的定量PCR仪，不仅大大降低了检测的成本，更重要的是对检测时机的要求也大大降低了，没有上述专利严格；同时由于该单抗可大量生产也可制备直标抗体，而不用二级免疫试剂来降低成本和提高检测效率。

(2)本发明制备了一种抗人hMxA的单克隆抗体，该单克隆抗体具有良好特异性和很高亲和力，能够识别人hMxA的原核表达产物，人hMxA的真核表达产物，干扰素或其他因素诱导的人hMxA基因天然表达产物，以该蛋白生化存在形式来看，该抗体不仅能识别变性蛋白(还原蛋白)亦能识别非变性蛋白，客观的反映出该蛋白聚合体的存在形式，因此，利用该单克隆抗体可以简便快速准确地检测出人hMxA蛋白的表达水平。

(3)与现有技术中的M143单抗相比，本发明所述抗人hMxA的单克隆抗体能进行免疫沉淀试验，因而扩大了该单抗应用范围：在此基础上通过免疫亲和层析的原理建立亲和层析技术不仅能获取高浓度、高纯度、高活性的hMxA蛋白应用于临床等实际应用研究，同时亦可浓缩样本中的hMxA蛋白应用于有关hMxA基因基础理论研究。

因为本领域技术人员公知：单克隆抗体常以单价形式与抗原结合，因而一般单克隆抗体很难与抗原进行免疫沉淀试验；但是，如能进行免疫沉淀试验，该抗体便是能与多克隆抗体(一般多克隆抗体以多价形式与抗原形成巨大分子量的抗原抗体复合物，再用固相二级试剂(固相抗抗体(二抗)或固相proteinA/proteinG)结合形成更大复合物而免疫沉淀)媲美的优秀抗体。

(4)本发明制备了一种可以分泌抗人hMxA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株具有良好的传代能力并能大量扩增培养，能稳定体外分泌抗体，并且分泌抗体的能力随着培养代次增加而不下降，诱生腹水的能力也不随传代次数的增加而改变。

附图说明

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2009年3月5日；保藏编号CCTCC NO：C200916；分类命名：杂交瘤细胞株WL-3C2；

图1.实施例一中杂交瘤细胞克隆不同代次的生长曲线；

图2.实施例二中单克隆抗体纯化蛋白作一抗ELISA检测原核表达产物效价图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一，抗人hMxA蛋白单克隆抗体的制备和纯化

采用hMxA基因原核表达产物作为免疫原免疫Balb/C小鼠的策略以获取该免疫原致敏的B细胞，具体的操作方法：

1.制备单克隆抗体免疫原

1.1hMxA基因完整开放阅读框片段的扩增

直接从组织和细胞中获取纯化hMxA蛋白制备抗体十分困难，因而通过基因工程表达产物制备抗体是有效的方法，要获得基因工程表达产物调取目的基因是先决条件。

采用I型干扰素体外诱导人的细胞系6-12h能产生大量的hMxA基因转录本，然后经总RNA的提取、RT-PCR扩增和重组转移载体pUC119-hMxA的构建，重组质粒的经测序，获取hMxA基因完整开放阅读框片段，具体包括以下步骤：

(1)取2×10⁶由20ng/ml IFN-β(protope公司产品)诱导12h的人肺癌细胞系A549细胞(来源于ATCC，America)，用Trizol(promega公司产品)提取总mRNA，按RT试剂盒(promega公司产品)说明书的方法获取mRNA互补第一链(cDNA)；

(2)以步骤(1)所得mRNA互补第一链为模板，用第一对上下游引物进行100μl反应体系PFU酶的PCR扩增(100ul反应体系，3ul上样)，清洁后进行XbalI，KpnI(promega公司产品)双酶切；

以步骤(1)所得mRNA互补第一链为模板，用第二对上下游引物进行100μl反应体系PFU酶的PCR扩增(100ul反应体系，3ul上样)，清洁后进行KpnI，BamHI(promega公司产品)双酶切；

所述第一对上下游引物为：

5’-GGCTCTAGAATGGTTGTTTCCGAAGTGGACAT-3’(上游)；

5’-CAGGGTACCGTGGCCTTTCCTTCCCTCCAG-3(下游)；

所述第二对上下游引物为：

5’-CACGGTACCCTGCCTGGCAGAAAAACTTACCAG-3’(上游)；

5’-CCGGGATCCTTAACCGGGGAACTGGGCAAGCC-3’(下游)；

上述二对引物是根据公布的hMxA基因序列(基因序列号是：NM182942)设计的，设计二对引物是基于以下二个方面考虑：

I、该基因ORF(Open Reading Frame)由1986bp组成，以一对引物通过低扩增效率的高保真酶PFU(promega公司产品)(比普通Taq扩增效率要低2-3倍，但突变率和错配率很低，故调取大目的基因特别是大于500bp的基因时宜用)进行PCR扩增其产物量低不利于以后的基因操作；

II、一对通长引物PCR扩增长度过长基因(大于1000bp)易出现错配和突变)。

将上述PFU酶PCR产物经1％agarose电泳鉴定在950bp，1100bp位置上有明显的条带，与预期分子量(952bp，1058bp)一致，该结果表明我们已经获得该基因的两个特异性DNA片段。

(3)将步骤(2)双酶切所得的二片段通过XbalI和BamHI酶切点克隆到pUC119(由本室保存)载体上，酶切鉴定正确后备用，取3-4个重组菌落克隆的重组转移载体pUC119-hMxA进行hMxA基因的测序(测序工作由上海申能博彩公司完成)，测序结果与GENEBANK公布的hMxA(NM182942)cDNA序列一致。

1.2重组表达载体pET32a(+)-MxA的构建

将步骤1.1构建的经测序正确的质粒pUC119-hMxA和质粒pET32a(+)(invitrogen公司产品)分别用HindIII、BamH I酶于37℃双酶切2小时后，割胶回收目的片段，并用T₄DNA连接酶(上述三种酶均为promega公司产品)16℃连接过夜，得到含有重组表达载体pET32a(+)-MxA的连接液；

继而将连接液转化大肠杆菌DH5α(由本室保存)，挑单菌落，质粒提取双酶切鉴定，阳性克隆菌保种备用。

所述双酶切鉴定包括以下步骤：将所得重组质粒pET32a(+)-hMxA用HindIII/BamHI双酶切经1％agarose电泳鉴定，结果在2kb，5.8kb位置上各有一条明显的条带，该结果表明我们已将hMxA基因片段正确克隆于原核表达载体pET32a(+)上。

1.3hMxA基因原核表达产物的获得与纯化：

将上述已经酶切鉴定重组表达载体pET32a(+)-hMxA转化原核表达菌大肠杆菌-BL21株(invitrogen公司产品)，挑单菌落于5ml含50ug/ml Amp的LB细菌培养液中37℃250r/min振荡培养过夜后，取1ml该菌悬液接种于100ml含50ug/ml Amp的2YT(16g trypotone，10g yeast extract，5g NaCl溶于1000ml双蒸水中，调pH7.2，高压灭菌)细菌培养液中，37℃250r/min振荡培养至光密度OD₆₀₀为0.3时，补加10mM无菌IPTG(sigma公司产品)于28℃，100r/min振荡培养4h后，4℃下5000r/min离心10min，离心取菌体重悬于5ml0.01MPBS(pH7.2)中。

加等体积的2×SDS-PAGE电泳载样缓冲液，于沸水浴中孵育15min，12,000r/min 4℃离心15min取上清，上样于8块12％SDS-PAGE制备胶(10cm×8cm×1.5mm)(每块胶均上1ml蛋白样本液，同时设预染蛋白分子量marker孔)于冰水浴中电泳，电泳后按预染蛋白分子量marker指示分子量割取含目标蛋白的胶条，上述胶条剪碎后置于蛋白透析袋(14,000-20,000D，pharmacia公司产品)中，加适量电极缓冲液浸没后扎紧，置于western-blot转移片中央，加满电极缓冲液后，将电泳槽置于冰水浴中进行110mA电洗脱3h，再将透析袋置于冰冷的0.01MPBS(pH7.2)中透析24h，无菌取上清于12,000r/min 4℃离心15min再取上清，用少许样本进行紫外分光仪(BACKMAN公司产品)进行含量分析和12％SDS-PAGE电泳纯度，其余样本按每份100ul分装-80℃冻存备用。

上述纯化物经紫外分光仪测定其含量为1.2mg/ml和经电泳鉴定发现：在分子量93kd位置上有一条明显蛋白条带，其纯度约85％，该条带与我们预计目标表达产物分子量一致：hMxA(78Kd)+Trx(15Kd)＝93Kd；该结果表明：已经获得了目的基因表达产物电泳纯样本，已经能满足作免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体的需要。

2.抗原致敏B淋巴细胞的免疫小鼠获得

无菌取步骤1.3所得hMxA基因蛋白样本(蛋白浓度1.2mg/ml)用0.01MPBS(pH7.2)10×稀释后加等体积的弗氏完全佐剂(sigma公司产品)充分混匀后按20ug/只蛋白剂量注射于4只5周龄的SPF级Balb/c小鼠(由上海实验动物中心提供)腹腔中，二周后按上述等蛋白剂量加弗氏不完全佐剂(sigma公司产品)腹腔免疫一次，隔二周按30ug/只蛋白剂量(无佐剂)进行三免，再隔一周按30ug/只蛋白剂量(无佐剂)进行四免，四免后5～7天，割尾采血取血清作待测抗体；以步骤1.3所述hMxA基因纯化蛋白(1mg/ml)作固定标准抗原，做免疫双扩散试验(载玻片上铺由0.1M巴比妥/巴比妥钠(pH8.3)配制的1％agarose胶后，打梅花孔，中央孔加10ul抗原(上述的免疫原)，四周孔分别加10ul的0.01MPBS(pH7.2)倍比稀释的待测血清，37℃湿孵24h)效价达1∶16的为合格小鼠，此时无菌取其脾细胞作为抗原致敏B淋巴细胞。

免疫双扩散试验发现其双扩散效价已达到1∶16，该结果表明我们已经获得了能产生较高效价针对原核表达产物特异性抗体的免疫小鼠，同时说明该小鼠脾脏内已有抗原致敏B淋巴细胞克隆。至此已经完成了制备单抗第一重要阶段。

在此需说明的是：免疫小鼠获取抗原致敏B淋巴细胞有多种方法，本实施例采用了经典免疫方法，该方法的优点是免疫效果好，主要体现在B淋巴细胞受抗原免疫刺激时间长，受免疫刺激B淋巴细胞基因重排克隆稳定，为以后获取优良稳定杂交瘤细胞克隆奠定了良好的基础，其缺点是免疫期长：需40-50天免疫期；另外一种方法是将抗原直接注射小鼠脾脏免疫，该方法的优点是需要的抗原量少(10ng-2ug/只)，免疫期短：20-28天即可，但缺点是小鼠应激反应强、B淋巴细胞基因重排克隆稳定性差，在制备该抗体时，发明人考虑需要抗原易得故用经典免疫法以获取高稳定性基因重排的抗原致敏B淋巴细胞。

3.融合细胞克隆的获取和分泌抗体克隆的筛选

3.1融合细胞生长克隆培养

无菌取上述一只合格小鼠脾，将其置于无菌培养皿中，10％CBS+RPMI-1640洗涤2-3次后剪成3-4段，用无菌直角解剖针挤出脾细胞，30-40ml10％CBS+RPMI-1640吹散重悬细胞，过200目细胞筛后(单细胞易于细胞融合)再用RPMI-1640培养基洗涤2-3次并计数；

按脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0细胞10∶1的比例将处于对数生长期的SP2/0细胞加入脾细胞悬浮液离心管中，用RPMI-1640培养基离心洗涤2-3次，按常规45％PEG4000(SIGMA公司产品)细胞融合法进行脾细胞与SP2/0融合；融合后离心去除融合液，重悬于120ml 20％FBS plus RPMI-1640培养液中，并按100ul/孔植于12块预先长有Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞饲养层中的96孔板的孔中，(注：融合前一天按一只小鼠的饲养细胞种植4块96孔板，每孔加100ul含2×HAT(用100×HAT储存液(SIGMA公司产品)稀释)10％FBS PLUSRPMI-1640培养液的饲养细胞悬浮液；)于37℃5％CO₂培养，一周后用含1×HAT 20％FBS PLUS RPMI-1640培养液进行2/3换液并继续培养，于2周后培养出多个HAT抗性克隆(细胞克隆生长面积约占孔面积的1/10-1/4时)待筛选。

3.2分泌抗体克隆的筛选与亚克隆

各取克隆孔上清分成二份(50ul/份)作为待检抗体，检测前一天将上述原核表达纯化蛋白(1mg/ml)用0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃(pH9.6)作1∶15稀释并按100ul/孔包被于96孔酶标板(corning公司产品)中，于4℃包被过夜，用0.01MPBS(pH7.2)洗涤2次，加200ul/孔5％CBS(GIBCO公司产品)/0.01M PBS(pH7.2)于37℃湿浮2h，用0.01M PBS(pH7.2)洗涤1次，每孔加一份待检抗体，设SP2/0细胞培养上清对照孔，37℃湿浮1h，0.02％Tween20/0.01M PBS(pH7.2)洗涤4次(4×10min)，各加50ul的1∶300affinity purified HRP conjugated goatanti-mouseIgG(H+L)(亲和纯辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(重链和轻链)二抗)(Bioworld公司产品)(5％CBS/0.01M PBS(pH7.2)稀释)二抗，同上湿浮1h，洗涤4次后，加50ul/孔OPD(上海生工产品)/H₂O₂显色液避光显色，ELISA酶标仪(Thermo公司产品)测定OD₄₉₀值，以试验孔OD₄₉₀值大于对照孔OD₄₉₀值2倍判读为阳性孔。

准备检测前二天将0.2×10⁴/孔(含20ng/ml IFN-β的5％CBS plus DMEM悬浮A549细胞)种植于96孔细胞培养板(corning公司产品)中，于37℃5％CO₂培养36h，0.01MPBS(pH7.2)洗涤1次，4％多聚甲醛(上海化学试剂公司产品)/0.01M PBS(pH7.2)室温固定30min，0.01M PBS(pH7.2)洗涤1次，0.02％曲拉通-100(上海生工产品)/0.01M PBS(pH7.2)室温透化15min，3％CBS/0.02％曲拉通-100/0.01MPBS(pH7.2)室温封闭1h，每孔加一份待检抗体并设SP2/0细胞培养上清对照孔，于37℃湿浮1h，0.02％tween20/0.01MPBS(pH7.2)洗涤4次(4×10min)，每孔加50ul的1∶300affinity purified FITCeonjugated goat anti-mou se IgG(H+L)(亲和纯FITC标记山羊抗小鼠IgG(重链和轻链)二抗)(Bioworld公司产品)(3％CBS/0.01M PBS(pH7.2)稀释)二抗同上湿浮1h，洗涤4次后，于OLYMPAS(IX-71)荧光倒置显微镜观察分析，通过对照孔判读阳性孔，筛选出双阳性克隆。

将上述双阳性的克隆进行2轮单细胞亚克隆(方法同融合细胞生长克隆培养)，待细胞长至10％细胞单层时再进行上述双筛选(同上方法)直至获得100％双阳性克隆后，取其中生长最旺盛一株克隆并命名为-3C2，将该克隆进行扩大培养，并冻存和复苏。

4.单克隆抗体免疫球蛋白亚型分类分析：

上述的3C2克隆作为种子细胞，同时以SP2/0细胞作对照细胞，用10％FBSplus RPMI培养细胞浓度致1×10⁶/ml时，取细胞悬液1000r/min离心5min去除细胞，取上清12,000r/min 4℃离心15min去除细胞碎片，取上清分装一部分作为检测一抗和对照抗体-80℃冻存备用，再取少许(各0.5ml)送于南京金思特公司进行单克隆抗体免疫球蛋白亚型分类分析。

检测结果见表1，根据OD值显示该抗体为IgG1，lamda亚型。

表1抗体亚型鉴定数据

5.杂交瘤细胞克隆不同代次的生长曲线的分析

将1×10⁴/ml的第一代，第五代，第十代杂交瘤3C2细胞株按2ml/孔分别种植于6孔标准细胞培养板(corning公司产品)中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，分别在12h，24h时间点每个代细胞各取3孔充分分散后用血球计数器计数，36h计数组在24h时2/3换液一次致36h同上进行计数，并以时间点作为横坐标，细胞数作为纵坐标绘出生长曲线。

如图1所示：用10％小牛血清培养基对3C2杂交瘤细胞株进行第一代，第五代，第十代生长曲线分析，细胞的倍增时为3～4h，而各代次生长速率亦基本一致。上述结果说明实施例一获得杂交瘤细胞能良好的传代并能大量扩增培养；同时并不随培养代次增加而生长能力下降。

6.单克隆抗体的特异性分析

从步骤3中获得的克隆中遴选出免疫荧光信号最强的克隆3C2，作为种子细胞，将其扩大培养于50ml细胞瓶中，用其细胞浓度1×10⁶/ml培养上清原液作一抗，同时用SP 2/0细胞的上清作对照；

6.1单克隆抗体对多种样本western-blot试验

单克隆抗体对二种细胞株中hMxA蛋白western-blot定性试验：

(1)将hMxA基因重组真核载体稳定转染细胞株NIH-3T3/pEGFP-C1-hMxA悬浮于1000ug/ml G418(sigma)的10％CBS plus DMEM培养基中后，种植于50ml标准细胞瓶中待细胞长满后收集细胞；

(2)同时将A549细胞传代于上述的培养瓶中待细胞长50-60单层时换成含20ng/ml IFN的3％CBS plus DMEM培养基继续培养36h后收集细胞；

(3)同时设未加IFN处理A549细胞同样处理作对照

上述三组细胞用0.25％(trypsin/0.01M PBS(pH7.2)消化后，用0.01MPBS(pH7.2)离心洗涤2-3次后，加60-80ul该缓冲液重悬细胞，加等体积的2×SDS-PAGE loding buffer于沸水浴中孵育15min后，于12,000r/min 4℃离心15min取上清，测蛋白的含量，按50ug/line(同时上等量同样处理的原核表达菌体蛋白作阳性对照，并加中低标预染蛋白分子量marker孔)上样于12％SDS-PAGE于冰水浴中电泳，电泳后，按湿转移法于110mA冰水浴中将胶中的蛋白转移于NC膜(0.2um，pharmacia公司产品)上，0.01MPBS(pH7.2)浸没平衡15min后，于5％脱脂奶粉/0.01MPBS(pH7.2)4℃封闭过夜，加上述待测一抗室温孵育90min后，用0.02％Tween 20/0.01M PBS(pH7.2)洗涤4次(4×10min)后，1∶300affinity purified HRP conjugated goat anti-mouse IgG(H+L)(Bioworld公司产品)(3％脱脂奶粉/0.01MPBS(pH7.2)稀释)室温孵育60min并洗涤4次(同上)后，DAB(上海生工产品)/H₂O₂显色液中避光显色，充分洗涤后拍照。

实验证明：稳转细胞系和干扰素诱导的A549细胞在我们预计的分子量103Kd和76Kd处有明显的杂交信号，而未用干扰素处理的A549细胞样本未见有明显的杂交信号。该结果表明：该抗体通过wester-blot技术可以对上述二种高表达MxA基因的细胞变性蛋白样本进行定性鉴定。

上述的试验均是在MxA基因过表达(如该基因稳定转染细胞株)和大剂量(饱和甚至过饱和剂量)干扰素诱导下A549细胞的hMxA蛋白强表达样本作试验组进行了定性分析，用该抗体hMxA蛋白表达水平的变化(定量或半定量分析)为今后该抗体的实际应用研究具有重要的指导意义，为此，我们同样用A549细胞作靶细胞，以不同浓度的干扰素进行诱导来分析hMxA蛋白表达水平，步骤如下：

单克隆抗体对不同浓度干扰素诱导的一种细胞株中hMxA蛋白表达水平的western-blot试验：同将A549细胞传代于8只标准培养瓶中待细胞长50-60单层时分别换成含20、5、1.25、0.32、0.08ng/ml IFN的3％CBS plus DMEM培养基，同时设未加IFN培养细胞作对照继续培养36h后收集细胞，同时用上述稳定转染细胞株NIH-3T3/pEGFP-C1-hMxA作对照，样本收集处理、电泳、电转移、抗体的显色均同上。结果显示20、5ng/ml诱导条件下hMxA蛋白表达水平基本保持不变，而以下的浓度随干扰素的浓度下降而急剧下降，该结果表明我们的抗体不仅可以进行hMxA蛋白的定性分析，同时也可进行定量或半定量分析。

单克隆抗体对不同浓度干扰素诱导人PBMCs中hMxA的蛋白表达水平的western-blot试验：

取10ml健康人抗凝全血，加等体积无血清的DMEM稀释后，将稀释血样轻轻滴加于预先加有10ml淋巴细胞分离液的50ml无菌离心管中，于2000r/min室温离心20min后，无菌取血浆与淋巴细胞分离液界面的细胞，加5-10倍体积的无血清的DMEM充分混匀后1500r/min室温离心15min，取少许无血清的DMEM重悬细胞，并分成4份，每份分别加5ml含1×10⁵、5×10⁴\2×10⁴U和0/ml IFN的10％FBS plus DMEM培养液的标准培养瓶中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养36h后，分别收集细胞，并用50ug总蛋白原核表达菌体作阳性对照，样本收集处理、电泳、电转移、抗体的显色均同上。

结果显示三种不同浓度干扰素处理健康人外周血单个核细胞样本均在分子量76Kd处有明显的杂交信号，且信号强度基本相同，而未用干扰素处理的外周血单个核细胞样本未见有明显的杂交信号。该结果表明：该抗体通过wester-blot技术不仅可以检测到细胞系中该基因表达，同样也可检测常规人体细胞组织分离样本中该基因表达。同时我们推断我们用的三种浓度均为过饱和浓度，故其杂交信号强度基本相同。

6.2单克隆抗体对二种蛋白免疫沉淀试验

取上述IPTG诱导原核表达菌体和20ng/ml IFN诱导的A549细胞，同时用未诱导A549作阴性对照，按菌体加50×，细胞加20×体积的冰冷RIPA细胞裂解液悬浮菌体和细胞后，置冰上用超声波细胞粉碎仪充分超声裂解，裂解后12,000r/min 4℃离心15min取上清，测总蛋白的含量，按每组总蛋白50μg量将各组蛋白液分别置于1.5ml EP管中，三组管分别加100ul杂交瘤培养上清，另外三组管分别加100u l骨髓瘤SP2/0细胞培养上清，加完上清后用封口膜封好，将EP管平埋于预先装有碎冰小型保温盒的碎冰中，将保温盒置于脱色摇床上，50r/min振荡孵育2h后，将上述每个EP管均加100ul protein G悬浮液同上低温振荡孵育1.5h后，4000r/min 4℃离心5min，弃上清留免疫小珠，各管加1ml冰冷0.02％Tween20/0.01M PBS(pH7.2)洗涤液重悬免疫小珠，再同上离心弃上清留免疫小珠按该方法离心淘洗免疫小珠5-6次后，各管加40ul 2×SDS-PAGEloding buffer悬浮并于沸水浴中孵育15min后，于12,000r/min 4℃离心15min取上清，上样于12％SDS-PAGE胶，电泳、电转移、抗体的显色均同上。

结果显示原核表达产物样本和真核表达样本中与该抗体形成免疫复合物中有明显的杂交信号，同样样本与对照SP2/0细胞培养上清组无杂交信号，同时未诱导A549组也无明显杂交信号，结果表明该抗体能良好识别和结合非还原型的MxA蛋白。

6.3单克隆抗体对三种表达hMxA蛋白细胞免疫荧光试验

在检测前三天，将MDCK(购自于ATCC)细胞0.5×10⁴/孔种植于24孔细胞培养板9个孔中，培养过夜待细胞长至30-50％单层时，依照lipofectAMINE-2000(sigma公司产品)标准方法，按1ug/孔DNA将pCDNA3.1-hMxA(本室构建)和pCDNA3.1(购自于invitrogen公司产品)分别转6和3孔细胞，DNA覆盖液孵育过夜后，换成10％CBS plus DMEM培养液继续培养24h后用于检测。

在检测前二天(因为MxA在干扰素诱导36-48h时，其蛋白表达量达到峰值)，将A549细胞按1×10⁴/孔分别种植于24孔细胞培养板9个孔中，用10％CBSplus DMEM培养基培养待细胞完全贴壁后，其中6孔换成含20ng/ml IFN3％CBS plus DMEM培养液，其余3孔换成3％CBS plus DMEM培养液，培养36h后用于检测。

在检测前一天，将hMxA基因重组真核载体稳定转染细胞株NIH-3T3/pEGFP-C1-hMxA和空载体稳定转染细胞株NIH-3T3/pEGFP-C1悬浮于1000ug/ml G418(sigma)的10％CBS plus DMEM培养基中后，按1×10⁴/孔分别种植于24孔细胞培养板(corning公司产品)中，前者接种6孔，后者接种3孔。于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜，待细胞长至30-50％单层时用于检测。

上述各孔细胞用步骤3.2提及方法进行固定、洗涤、透化、封闭，注：上述二株稳定转染株的细胞孔在透化封闭步骤间需加3％/甲醇液30min一步处理以消除稳转细胞株中报告蛋白的绿色荧光干扰，上述表达hMxA蛋白的三种细胞孔中各加0.5ml杂交瘤细胞培养上清，每种处理3个复孔，其余3个复孔各加0.5ml骨髓瘤培养上清作抗体阴性对照，空载体转染细胞和未诱导A549细胞孔作抗原阴性对照同样加杂交瘤细胞培养上清，加完一抗后孵育洗涤同步骤3.2，每孔加0.5ml步骤3.2提及荧光二抗同上湿浮1h，洗涤4次后，于OLYMPAS(IX-71)荧光倒置显微镜观察分析，并拍照。

结果表明：试验组均有强免疫荧光信号；抗体阴性对照组无任何荧光信号；抗原阴性对照组除A549细胞组有弱荧光信号外，其余二组细胞无荧光信号，更有意义的是，我们分析A549本身是人癌细胞系有一定基础表达通过免疫荧光试验能测出，而western-blot不能测出可能是免疫荧光检测灵敏度高于western-blot检测水平的缘故，而其余二株细胞分别是犬肾细胞系和鼠胚胎细胞系无论有无同家族蛋白基础表达均不能被该抗体识别。

7.目标杂交瘤体内诱生腹水产生和单抗的纯化

7.1小鼠的预处理：选择5周龄SPF级balb/c小鼠(平均体重21g)10只，接种细胞前1-2周按0.5ml/只预先腹腔注射液体石蜡(上海化学试剂公司产品)(我们用弗氏不完全佐剂、降植烷、液体石蜡等三种试剂进行致敏效果的比较发现三者无差异，故选用廉价的液体石蜡)致敏。

7.2接种杂交瘤细胞：接种前一天，我们将上述杂交瘤细胞按1∶8-10传代待细胞处于对数生长期轻轻吹打悬浮细胞，1000r/min离心5min，弃培养液，用无血清培养基洗涤离心2次后，并用该培养基调细胞浓度至5×10⁶/ml，按0.5ml/只注射于上述的预处理的balb/e小鼠腹腔中，注射后精心饲养。

7.3腹水的采集：注射后7-12天取腹水于5ml离心管中，1000r/min离心5min以去除腹水中的细胞，取上清4℃12000r/min离心15min，取少量上清并用紫外分光光度计和SDS-PAGE检测其蛋白含量和纯度，同时用间接ELISA法测定其效价，并分装-80℃冻存备用。

7.4单克隆抗体蛋白的纯化：

盐析去除腹水中大量杂蛋白：将上述处理腹水加冰冷0.01MPBS(pH7.2)稀释4×后，加等体积的冰冷饱和(NH₄)₂SO₄溶液(取1000ml三蒸水加热至80℃，加700-800克的(NH₄)₂SO₄，边加边搅拌溶解，再冷却至室温有大量的(NH₄)₂SO₄结晶析出此液为饱和液，用氨水调pH至7.2冷却后备用)边加边振荡，于冰水浴中静置过夜，4℃7000r/min离心15min，弃上清，加原腹水4×体积冰冷0.01MPBS(pH7.2)溶解，再加一半体积的冰冷饱和(NH₄)₂SO₄溶液，于冰水浴中静置过夜，4℃7000r/min离心15min，取沉淀，加原腹水体积的1/2冰冷0.01MPBS(pH7.2)溶解。

凝胶层析脱盐处理：取4-5g Sphadex-G25(pharmacia公司产品)加50ml三蒸水4℃溶胀过液，装柱于1.5cm×40cm玻璃层析柱中，20×柱体积冰冷0.01MPBS(pH7.2)平衡后，取4-5ml上述溶解液进行层析，分部收集OD₂₈₀蛋白峰。取少许SDS-PAGE电泳检测其纯度。

固相proteinG亲和层析纯化单克隆抗体蛋白：用于结合哺乳动物免疫球蛋白Fc片段的制剂主要有金黄色葡萄球菌A蛋白(protein A)和G蛋白(proteinG)二种，根据该单抗为IgG1亚类与G蛋白的亲和力强于A蛋白，我们选用G蛋白(protein G)，取2ml protein G resin(pharmacia公司分装产品)装柱于小型亲和层析柱床中(由南京金思特公司提供)，用30-40X柱体积冰冷0.01MPBS(pH7.2)平衡后，按5mg总蛋白样本每毫升protein G resin剂量加上述脱盐处理蛋白样本溶液，待样本滴下后再将该样本重复上样2-3次(该处理利于样本中单克隆抗体蛋白与protein G充分结合)，用40-50ml冰冷0.01MPBS(pH7.2)充分洗涤亲和层析柱(以洗涤液不能测出蛋白为准)后，用冰冷0.1M柠檬酸(pH2.0)(上海化学试剂公司产品)洗脱，并按1ml/管分部收集，洗脱样本用1.5M Tris-HCl(pH8.5)调pH至7.2，并用紫外分光光度计和SDS-PAGE检测其蛋白含量和纯度后，合并样本蛋白峰，将蛋白样本置于上述蛋白透析袋中于1000ml冰冷0.01MPBS(pH7.2)透析24h，再用该缓冲液稀释蛋白浓度至1mg/ml，同样进行ELISA效价测定。层析柱用50ml 0.1M柠檬酸洗脱，再用40-50ml冰冷0.01MPBS(pH7.2)充分平衡后可重复使用10次。

获得稳定性分泌单克隆抗体杂交瘤细胞克隆-9A5株后，我们再二轮亚克隆获得了一株克隆并命名为-3C2，将其第五代细胞接种5周龄小鼠中，取腹水样本(0.5ul)，(NH₄)₂SO₄盐析脱盐后的初纯化单克隆抗体蛋白溶液样本(3ul)，1mg/ml亲和纯化后的单克隆抗体蛋白溶液样本(3ul)同时在12％SDS-PAGE电泳鉴定，腹水已有大量的抗体存在并含有大量的杂蛋白，特别是大量的白蛋白，初纯化单克隆抗体蛋白样本中大量的白蛋白已被去除，而亲和层析的蛋白样本仅有二条蛋白条带(分别是IgG的重链和轻链)；

从中我们得出二个结论：诱生腹水法的大量制备抗hMxA蛋白单克隆抗体是可行的，同时用(NH₄)₂SO₄盐析预处理结合亲和层析纯化抗体是十分可靠的方法。

8.亲和纯化单抗和腹水效价的测定：

按固定抗原稀释抗体间接ELISA法测定亲和纯化单抗和腹水效价，抗原的包被，洗涤、封闭按步骤3.2ELISA方法进行，封闭洗涤后，用1∶100-12800系列稀释的1mg/ml亲和纯单抗样本和诱生腹水作待测一抗(每个处理4个复孔)，杂交瘤细胞培养上清(原液)，用骨髓瘤细胞-SP2/0培养上清作抗体空白对照(8孔)，每孔100ul上述处理液，一抗湿浮洗涤同步骤3.2ELISA方法，每孔加50ul步骤3.2ELISA提及二抗，并设不加二抗的调零孔(4孔)。二抗湿浮、洗涤、显色、读板同步骤3.2ELISA方法，读板后以稀释度作横坐标，以OD490值纵坐标绘图(图2)。

实施例二：

杂交瘤细胞-3C2及其分泌抗体的主要技术指标

1.杂交瘤细胞株-3C2达到的主要技术指标

1.1杂交瘤细胞的生长指标：

对杂交瘤细胞的生长情况和生长条件和传代情况等进行了全面分析，发现该杂交瘤细胞株与骨髓瘤细胞株-SP2/0不仅能在10％的胎牛血清中(GIBCO和hyclone公司提供的产品)良好的生长，同时经过适应培养后亦能在上述二家公司提供的10％小牛血清的培养基中良好的生长；

用上述10％小牛血清培养基对上述的3C2细胞株进行第一代，第五代，第十代生长曲线分析细胞的倍增时为3～4h，而各代次生长速率亦基本一致。

细胞的生长曲线见图1，上述结果说明实施例一获得杂交瘤细胞能良好的传代并能大量扩增培养；同时并不随培养代次增加而生长能力下降。

1.2杂交瘤细胞株体外分泌抗体指标：

分别取第一代，第五代，第十代的杂交瘤(细胞密度：1×10⁶/ml)培养上清样本，通过紫外分光光度计测定各样本总蛋白的含量，同时用SDS-PAGE电泳考马氏亮蓝染色的条带密度照度计分析50Kd，25Kd二条带占总蛋白条带的比例；

分析结果显示：三个代次培养上清平均总蛋白的含量分别为5.35mg/ml，5.24mg/ml，5.31mg/ml，而上述二条带占总蛋白的百分比为7.53％，7.76％，7.21％；从统计学分析三个代次的分泌抗体无统计学上的差异；

从该结果可以说明实施例一获得杂交瘤能稳定体外分泌抗体，同时说明随着培养代次增加而分泌抗体的能力不下降。

1.3杂交瘤细胞株诱生腹水能力的指标：

同样用上述三个代次细胞，并按2×10⁶/只腹腔注射每代次注射10只5周龄雌性balb/c小鼠，三个代次细胞在二周内获得腹水平均数分别为5.13ml/只，5.24ml/只，5.17ml/只；用上述方法测腹水中平均总蛋白含量分别为103.12m g/ml，101.15mg/ml，104.23mg/ml，而抗体占总蛋白的百分比分别为18.18％，17.87％，20.12％；统计学分析上述三个指标均无统计学上的差异性，结果说明该杂交瘤细胞诱生腹水的能力也不随传代次数的增加而改变。

生产的腹水通过常规的盐析-脱盐和亲和层析的方法可获取高浓度高纯度和高活性的单克隆抗体蛋白：我们用小型亲和层系统可获取浓度2-3mg/ml，我们初步推测纯度》99％(仅用SDS-PAGE电泳鉴定发现仅有重链和轻链二条带，未见其他蛋白条带)单克隆抗体

2.单克隆抗体达到的主要技术指标

2.1单克隆抗体的特异性指标：

2.1.1通过常规western-blot检测技术：

该抗体不仅可以特异性的识别和鉴定多种细胞系样本中还原性的MxA蛋白，我们用二种MxA基因高表达细胞系：MxA基因稳定转染NIH-3T3细胞株和饱和剂量干扰素诱导的A549细胞作试验组均获得了很强的特异性杂交信号，且有很强的特异性：我们用二种MxA基因不表达或极低表达对应细胞：空载体稳定转染的NIH-3T3细胞株和A549细胞作对照均无明显的杂交信号；而且可以特异性的识别和鉴定原代细胞样本中还原性的MxA蛋白，我们以多例健康人的PBMCs作靶细胞通过饱和剂量干扰素体外诱导作样本获得了很强的特异性杂交信号且有良好的重复性，而未诱导的PBMCs作对照均未见有明显的杂交信号。

该抗体客观的反映了在细胞系中MxA基因诱导表达水平与干扰素呈浓度依赖性：我们用不同浓度干扰素诱导的A549细胞作试验发现：其特异性杂交信号随干扰素的浓度的加大而增强至饱和剂量后杂交信号强度均维持在峰值水平。

2.1.2通过免疫沉淀试验结合常规western-blot检测技术：

该抗体可以特异性的识别和结合细胞系样本中非还原性的MxA蛋白，在上述证实该抗体可以特异性的识别和鉴定多种细胞系样本中还原性的MxA蛋白的基础上，我们设计了先让非还原性抗原与该抗体结合，通过获得的免疫沉淀样本再用常规western-blot检测的方法证实了该抗体可以特异性的识别和结合细胞系样本中非还原性的MxA蛋白。

2.1.3通过免疫细胞荧光技术和细胞流式检测技术：

该抗体可以特异性的检测低百分比MxA基因强表达的细胞或MxA基因弱表达的细胞。尽管上述的常规western-blot检测有力证实了该抗体能特异性的检测到MxA基因表达，但上述样本试验组均是该基因高表达的样本，在实际应用上不可能有如此该基因高表达样本被该抗体检测，因此需要更灵敏的技术如免疫细胞荧光技术和细胞流式检测技术进行检测，为此我们用A549细胞为MxA基因弱表达细胞的代表(有一定的基础水平表达，用western-blot不能测出)和瞬时真核表达hMxA蛋白细胞(MDCK细胞转染pCDNA3.1-hMxA)作为低百分比MxA基因强表达的细胞代表(转染后未加任何筛选，用western-blot不能测出)作试验组均测出了其杂交荧光信号，正像我们的希望的：前种细胞为高比例弱阳性表达，后者为低比例高表达的阳性细胞。二者用细胞流式定量分析阳性率分别是95％和4.5％，而前者用阴性isotype抗体作对照，同时后者同类细胞MDCK细胞转染pCDNA3.1作阴性抗原(无任何表达人MxA蛋白的可能性)均未检测到任何免疫荧光信号而证实了其特异性。

2.2单克隆抗体的定量指标：

用盐析-脱盐-亲和层析等方法从该杂交瘤细胞的小鼠诱生腹水中纯化的抗体，经SDS-PAGE电泳鉴定仅有50，25KD二条蛋白带，其纯度达到99％；

从图2A的OD₄₉₀值可以看出：在1∶1600前纯化抗体每个稀释度的信号强度均高于腹水说明纯化抗体优于腹水；1∶3200二者无差异，该稀释度与杂交瘤细胞培养上清原液的OD₄₉₀值(见图2B，A line)相同可以初步说明纯化抗体和腹水原液的抗体效价均提高了3200×，空白对照的OD值为0.04(见图10B的B line)，已远远低于0.1(空白对照小于0.1OD₄₉₀是考察ELISA试验系统的特异性优劣常用的标准)说明该试验系统是可靠的。。

分别用同样浓度的该抗体(一抗)和FITC直接标记抗体分别对I型干扰素诱导A549细胞进行免疫荧光试验和细胞流式试验其阳性滴度分别达到1∶250-500，单抗上述western-blot试验滴度达到1∶200-400。工作浓度抗体ELISA可检测出10～20ng的人MxA蛋白，western-blot可检测出30～50ng的人MxA蛋白。

Claims (6)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：C200916的杂交瘤细胞株细胞系。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体蛋白。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体为鼠源抗hMxA单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体蛋白为IgG1类，lamda型。

5.权利要求2所述的单克隆抗体在检测人hMxA蛋白水平中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述单克隆抗体在检测人hMxA蛋白时采用的方法选自：间接免疫酶联吸附试验法、免疫印迹试验法、免疫细胞荧光试验法、免疫沉淀试验法或免疫荧光流式细胞分析法中的一种或两种及两种以上。

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