CN103087193A - 基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法，步骤为：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物,通过RT-PCR,得到NSE基因SEQ ID NO.3；将NSE基因接入pGEM-T，形成质粒pGEM-T-NSE；转染入BEL7402细胞中，培养，从细胞裂解液中纯化出NSE重组蛋白；用质粒注射小鼠；取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合得杂交瘤细胞；培养；筛选能产生针对NSE蛋白表位单抗的阳性杂交瘤细胞；将阳性杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔内使产生腹水；纯化得到人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。本发明缩短了杂交瘤细胞前期筛选时间，使生产简单，操作容易，周期更短。

Description

基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法

技术领域

本发明属于基因工程和分子免疫学领域，特别是涉及一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法。

技术背景

人神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，存在于神经组织和神经内分泌组织中。NSE在脑组织细胞的活性最高，外周神经和神经分泌组织的活性水平居中，最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。它被发现在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中，特别是SCLC（小细胞肺癌）中有过量的NSE表达，导致小细胞肺癌患者的血清中NSE明显升高。

神经元特异性烯醇化酶临床意义：

神经元特异性烯醇化酶(NSE)是一种在临床上很有应用价值的分子学标记物。这是从2个方面的应用来评述的，一是NSE可以作为肺癌和儿童神经母细胞瘤的肿瘤标记物，用于小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的鉴别诊断；监测小细胞肺癌和神经母细胞瘤的病情、治疗反应和预报复发。二是NSE的活性改变同神经损伤所致的许多神经性疾病关系密切。

NSE在SCLC和神经母细胞瘤等内分泌肿瘤中显示出很高的免疫活性，并可在血清中直接检出。虽然NSE并不构成是SCLC的早期诊断指标，但特别是用于临床相关疾病的诊断和治疗，以及生物制品的生产和纯化等。最重要和最有意义的是，NSE活性水平变化，可以用来监测SCLC和神经母细胞瘤患者的病情发展，评价治疗效果，预报复发，其方法要比X线胸透检查来得早和方便，因此，NSE在临床中已被做为一个十分有用的血清学的肿瘤标记物予以应用。

为了进一步研究及临床诊断和治疗的需要，有学者设法从相关癌组织或癌细胞对NSE进行提取分离制备。但采用生物化学的方式进行提取制备不仅十分繁琐且得不偿失。为此国内外学者采用基因工程的方法制备NSE和NSE单克隆抗体。

目前制备NSE单克隆抗体方法的技术背景：用杂交瘤成功制备单克隆抗体技术发明至今已有30多年的历史，到目前为止单克隆抗体的种类非常繁多，已广泛地用于生命科学等领域，以往常规制备单克隆抗体的方法主要是从相关的细胞或组织中提取抗原或购买商品抗原用于免疫实验动物。抗原的来源不同其生物学性质有很多差别，特别是一些真核细胞表达的蛋白质在制备和纯化过程中使用的试剂影响蛋白质的空间结构，由此导致蛋白质的免疫原性的改变。用于制备抗体的抗原来源影响抗体生产的关键问题，有些抗原来源非常困难，甚至没有商品试剂，也没有标准品，在这种情况下制备单克隆抗体比较复杂，首先需要鉴定提取的抗原是否正确，否则免疫原错误必导致抗体的错误；因此，抗原是制备抗体的关键问题。随着分子生物学技术的发展，得到任何一个已知蛋白质的基因序列，且克隆基因和进行基因工程表达已是一个十分成熟的技术，所以大量的基因工程制备的蛋白质非常多，用于免疫动物也非常方便，许多生物公司均可以提供一定数量的纯化蛋白质，只是价格较高，另外不同公司的产品和实验人员制备的蛋白质在某些性质上还有差别，有时同一种蛋白质在免疫原性上差别很大，甚至与生理条件下天然蛋白的免疫原性相差甚远；由于蛋白质的空间结构（一级结构以上）在抗原制备过程中发生改变导致有些抗原性丢失，或暴露出非生理条件下的抗原决定簇。因为抗体用于诊断和治疗等过程时，抗体识别的抗原是天然结构，是具有一定空间结构的单体或多聚体，所以制备抗体的理想蛋白质抗原应该是具有天然结构的蛋白质，另外对于真核细胞产生的蛋白质在某些情况下还要考虑糖基化对蛋白质的影响。有些蛋白质是否糖基化将影响蛋白质的免疫原性；由于原核细胞没有糖基化系统。因此通过大肠杆菌基因工程制备的抗原没有糖基化，所以有些必须糖基化的蛋白质抗原不能用大肠杆菌制备，糖基化对有些蛋白是必须的，其影响抗原的决定簇，因此有些免疫原必须来源真核细胞（从细胞中提取或真核细胞表达）。

目前，制备NSE单抗多数以原核表达制备抗体，抗体针对天然蛋白的亲和力一直不好，以至于此抗体实用价值很低，同时人神经元特异性烯醇化酶（NSE）在体液中及细胞体外分泌的量极低，也增加了天然NSE蛋白纯化的难度。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法，其特征是包括如下步骤：

（1）以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上、下游引物,通过RT-PCR,从人肝癌细胞株BEL7402中扩增人NSE分子的cDNA全长，经TA克隆后进行DNA序列分析，确定正确的NSE基因序列SEQ ID NO.3，所述NSE为人神经元特异性烯醇化酶的简称；

(2)将SEQ ID NO.3所示基因序列定向连接入真核分泌型载体pGEM-T的NcoI和XhoI位点之间，形成质粒pGEM-T-NSE；

（3）将质粒pGEM-T-NSE转染入BEL7402细胞中，通过细胞培养，从细胞裂解液中纯化出NSE重组蛋白；

（4）用所述质粒pGEM-T-NSE多点注射于Balb/c小鼠的股四头肌；

（5）取经步骤（4）免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；

（6）将所述杂交瘤细胞用参有荧光标记的步骤（3）获得的NSE重组蛋白的甲基纤维素制备的半固体培养基培养；

（7）将步骤（6）培养获得的杂交瘤细胞利用步骤（3）获得的NSE重组蛋白通过ELISA，WB和免疫组化至少一种方法筛选能产生针对NSE蛋白表位单抗的阳性杂交瘤细胞株；

（8）将步骤（7）获得的阳性杂交瘤细胞株注射于Balb/c小鼠腹腔内使所述小鼠产生腹水；用蛋白G柱亲和纯化得到人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。

本发明所能达到的有益效果：

本发明制备的NSE单克隆抗体，具有高亲和力及高特异性。

本发明制备的NSE单克隆抗体具有与人体NSE抗原更为接近的免疫学反应，因此，适用于研制临床相关肿瘤标志物诊断的试剂盒。

本发明制备的NSE单克隆抗体可针对天然的NSE抗原。

本发明制备的NSE单克隆抗体是由真核表达的质粒直接免疫动物获得。因此，使NSE分子真正作为诊断肿瘤性疾病的指示分子。

本发明在NSE单克隆抗体的制备方法利用参有荧光标记的NSE转染蛋白的甲基纤维素制备半固体培养基培养杂交瘤细胞，缩短了杂交瘤细胞前期筛选时间，使NSE单克隆生产实施更加简单，操作更加容易，周期更短，制备更容易产业化和标准化。

具体实施方式

实验材料：Taq DNA聚合酶，dNTP，限制性内切酶NcoI和XhoI，引物Oligo-dT，引物T7和SP6，T4DNA连接酶，BEL7402细胞株，SCLC细胞株，pGEM-T载体，PMD-18T载体，大肠杆菌JM109菌株，脂质体复合物（大连TAKARA公司）；逆转录酶，TMB，DAB，MBS（Roche公司）；Trizol试剂，DMEM培养基（GIBCO）;胎牛血清（GIBCO）；Balb/c小鼠（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心）；质粒DNA提取试剂盒和凝胶DNA回收试剂盒（Axygen公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）,蛋白胨和酵母粉，氨苄青霉素，琼脂糖，氨基蝶呤，PEG-1500，HT，HAT,Tris，蛋白酶K，弗氏不完全佐剂，OPD，EDTA，RNA酶，Ni柱，BSA，PAGE（聚丙烯酰胺）（sigma公司）；丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，十二烷基磺酸钠(SDS)，甲基纤维素，过硫酸铵，TEMED（FLUKA），BCA蛋白定量试剂，蛋白质透析袋（Pierce公司）；HRP标记羊抗鼠IgG、FITC标记的鼠抗人IgG，荧光标记物FITC（R and D system），双氧水，蛋白G纯化胶，IgY，丙酮,流式细胞仪（BD公司）；硫酸，磷酸盐，甲醛等（天津化工厂）；LipofectAMINE DNA转染试剂（Invitrogen公司）；细胞培养板，移液管（corning公司）；鼠抗人NSE单克隆抗体5E2（hystest）。上述实验材料均为商品。

引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2合成（北京三博远志生物技术有限责任公司）；

所需的全部仪器设备：PCR仪（Hybaid）；低温离心机，二氧化碳培养箱（美国Themo3100）；加样器，恒温水浴锅，基因枪（德国eppendorf）；倒置显微镜（上海，H0508）；生物安全柜（TECH，B2）；酶标仪，核酸蛋白检测仪，PH仪，（美国biorad）；分析天平（Satorius BS110S）；超低温冰箱（FORMA）；液氮罐（成都液氮容器厂，YS-30-125）；普通离心机（北京医用离心机厂，LD5-2A）；紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司，751GD）；蛋白转膜仪，蛋白电泳仪（bio-rad）

实施例1

（1）NSE基因进行克隆和分析：

逆转录PCR扩增NSE cDNA：用Trizol试剂（一种动物组织核细胞、细菌、真菌等提取总RNA的试剂盒）从500万个BEL7402（人肝癌细胞）提取经氨基蝶呤处理48小时的细胞总核糖核酸（RNA），纯化后用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理沉淀所得液体30μl。由于DEPC可破坏核糖核酸酶（RNase）活性，因此可去除RNase的污染。

在进行逆转录时，加入4μl的5倍缓冲液（pH为7.2的PBS）、1μl引物Oligo-dT（0.5μg/μl）、2μl的10mMol/L浓度的脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10μlRNA、2μl去离子水，充分混匀，并置于70℃恒温水浴10分钟；然后，再置于冰上2分钟；加入1μl逆转录酶（50U，Roche），混匀，再置于42℃水浴90分钟，其逆转录体积共20μl。根据人NSE基因序列设计一对引物：

SEQ ID NO.1  5’-GAATTCATGTCCATAGATAGAAGCTG-3’

SEQ ID NO.2  5’-TCTAGAAGAGGACAGATCACACACTG-3’

上游引物选取SEQ ID NO.1引入NcoI酶切位点；下游引物选取SEQ ID NO.2引入XhoI酶切位点；

再进行PCR扩增，即加入5μl的10倍缓冲液（pH为7.2的PBS），4μl dNTP（2.5mMol/L），

1μl（200ng）上游引物1，1μl（200ng）下游引物2，5μl cDNA，1μl（2.5U）Taq酶，33μl去离子水；PCR扩增体积共50μl。混匀，置PCR仪上扩增：94℃60秒，55℃60秒，72℃120秒，共进行30个循环，最后补加72℃五分钟。最后，用10μlPCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，切下292bp位置的DNA条带，用凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段用于TA克隆。

TA克隆和DNA序列分析：纯化的PCR产物与PMD-18T载体重化大肠杆菌组，转大肠杆菌JM109菌株，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，次日挑取10个白色的单菌落扩大培养，用质粒DNA提取试剂盒纯化质粒，双酶切NcoI和XhoI鉴定插入片段，在所选的10个克隆中均有插入片段，片段大小为2423bp。NSE重组TA克隆用T7和SP6引物双向测序，结果与GenBank的NSE序列比较证明本次克隆的cDNA是人NSE基因，全长2423个碱基，用SEQ ID NO.3表示。

（2）NSE基因亚克隆入真核分泌型表达载体

采用真核分泌型表达载体pGEM-T，其可将重组基因表达的蛋白分泌到细胞外。用NcoI和XhoI分别酶切NSE TA克隆质粒和pGEM-T质粒，用凝胶电泳和凝胶DNA回收试剂盒，分别纯化NSE和pGEM-T的DNA片段，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应。连接反应体积共15μl，即1.5μl的10倍的缓冲液（pH为7.2的PBS），8.0μl NSE DNA片段（SEQ ID NO.3），4.5μl的pGEM-T DNA，1.0μl的T4DNA连接酶，混匀，置4℃冰箱过夜：加入300μl感受态的大肠杆菌JM109，置冰浴中1小时，42℃水浴90秒，再于冰水浴中5分钟；加LB培养基1ml，混匀，置37℃培养1小时，离心收集沉淀，将沉淀的菌体涂于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基上，于37℃过夜培养。挑取10个菌落扩大培养，用试剂盒小提质粒DNA，再用内切酶和电泳鉴定重组质粒，所挑选的10个质粒均含有NSE基因，电泳显示可以切下大约2423bp的DNA片段，NSE重组质粒,命名为pGEM-T-NSE。

（3）pGEM-T-NSE DNA的大量制备

将pGEM-T-NSE转入大肠杆菌JM109菌株,形成重组菌，重组菌于37℃活化培养过夜，然后接种于50ml的LB培养基中(含氨苄青霉素50pg/ml)，37℃振荡培养5小时，再转入500mL LB培养基中继续培养5小时，离心回收菌体；按质粒DNA提取试剂盒程序提取质粒DNA；在最后洗脱时选用无菌蒸馏水。纯化的质粒DNA用紫外分光光度计检测纯度和定量。500ml培养的菌体可以提取400μg质粒DNA，冰箱中冻存备用。

利用pGEM-T-NSE载体，转染真核细胞，纯化蛋白

在6孔板中接种1-3×10⁵BEL7402细胞/孔，加入2ml体积百分浓度为20%胎牛血清DMEM培养基，置CO₂孵箱中37℃培养过夜。待细胞长到80%单层时，在无菌离心管中配制如下溶液：

①溶液A：将2μg待转染的超纯DNA（pGEM-T-NSE）稀释到100μl DMEM培养基中。

②溶液B：将25μl LipofectAMINE稀释到100μl DMEM培养基中。

③混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置45分钟。

④用2ml DMEM培养基轻轻洗涤细胞，加入0.8ml DMEM培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO₂孵箱中37℃孵育24小时。

⑤用20%胎牛血清DMEM培养基替换转染液，继续培养。

⑥72小时后通过WB实验检测蛋白质的表达。

⑦真核蛋白纯化：准备2×10¹⁰转染后的BEL7402细胞，用0.2mM EDTA1ml消化细胞，超声破碎后，以15000转/分钟离心，收集上清，以PBS稀释一定体积过Ni柱，用咪唑与pH为7.2的PBS缓冲液按体积比为1:1混合，从0-100mM梯度洗脱，分管接流出液，用SDS-page确定蛋白为NSE蛋白。之后蛋白加入甘油，使甘油的体积浓度为10%，放置小于零下70℃的超低温冰箱中，以备后期使用。

⑧蛋白质的荧光标记：取步骤⑦获得的NSE蛋白1mg，于PBS缓冲溶液中37℃透析2小时后，加入MBS2mg37℃反应2小时。加入荧光标记物FITC2mg37℃反应4小时后PBS缓冲溶液中透析12小时。透析袋中即为连接好荧光标记物FITC的NSE蛋白。之后蛋白加入甘油，使甘油的体积浓度为10%，放置小于零下70℃的超低温冰箱中，以备后期使用。

（4）基因免疫制备NSE单克隆抗体

NSE基因免疫Balb/c小鼠：免疫过程：取4周龄Balb/c纯系雌性小鼠3只（其中一只不免疫作为对照），每只鼠两侧股四头肌分别注入50μg,pGEM-T-NSE（每侧50pL）；对照鼠注入等量的生理盐水；每15天免疫一次，总共免疫5次，第二次免疫后10天开始检测血清中抗体；于末次免疫后一周进行细胞融合。

（5）取经步骤（4）免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合：

A:饲养细胞制备：Balb/c小鼠拉颈处死，取其胸腺，置于l0mlDMEM培养液中，在钢网上研磨分散细胞，弃大块组织，将细胞调成5×10⁶个/ml，96孔培养板每孔l00μl。

B：骨髓瘤细胞准备：小鼠骨髓瘤细胞为SP2/0细胞株，融合前细胞生长良好，细胞浓度为5×10⁶个/ml。

C：细胞融合：2.0×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞与2.0×10⁸个经步骤（4）免疫的Balb/c小鼠的脾细胞混匀，离心，弃上清，轻微振荡混匀，于37℃水浴中，在90秒内滴加1ml体积浓度为50%的PEG-1500水溶液，然后滴加20mlDMEM培养基，离心，弃上清，再洗一次，离心，弃上清，得到杂交瘤细胞。

（6）在含15%胎牛血清、1%甲基纤维素的DMEM半固体培养基50ml(含HAT)，再加入无菌处理过的，用荧光素FITC标记过的NSE蛋白10μg，混匀，向每直径3.5cm培养皿倒3ml，（同时设有单独Balb/c小鼠的脾细胞和单独SP2/0骨髓瘤细胞对照）。细胞培养箱避光培养。每日观察细胞生长状态，10天左右出现克隆。于荧光显微镜下挑取有明显荧光反应的细胞团，此细胞团即为针对NSE蛋白的阳性克隆。用移液器吸出细胞团于加入15%胎牛血清的DMEM培养基的96孔板中培养3-5天。

（7）杂交瘤培养上清NSE抗体的检测：用直接ELISA检测杂交瘤培养上清中的抗体，用NSE抗原包被ELISA板，加入培养上清，冲洗后加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，孵浴和冲洗后，加显色底物TMB，然后测492nm的光密度，以高于阴性对照光密度2倍以上为阳性克隆。结果在融合后两周的培养上清中有38孔显示NSE抗体阳性。选择效价高的几个孔进行克隆化。

阳性杂交瘤细胞株克隆化和扩大培养：培养孔内的多克隆细胞采用有限稀释法进行克隆化，用含有HAT的培养基制备小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，培养孔内的多克隆细胞进行稀释至每孔含有100，10和1个细胞(100μl)，培养观察，对只有一个克隆杂交瘤的培养上清进行检测。选择阳性克隆转入24孔培养板中进行扩大培养，每孔1ml，培养5天后，加入4ml的15%胎牛血清的DMEM培养基，混匀，分入4个培养孔中，继续培养5天，然后转入培养瓶中进行扩大培养，选择抗体阳性，且效价稳定的克隆进行进一步扩大和冻存。

（8）NSE单克隆抗体大量制备和纯化：Balb/c小鼠腹腔注入0.5ml弗氏不完全佐剂，一周后每只小鼠腹腔注入5×10⁵个步骤（7）所得到的杂交瘤细胞，然后当有明显腹水形成时，针头穿刺放腹水。收集的腹水12000转/分钟离心5分钟，弃除沉淀，其上清液采用正辛酸-硫酸胺法进行提取，并用蛋白G柱亲和层析纯化，得到经过纯化的NSE单克隆抗体：将纯化后的NSE单克隆抗体用蛋白定量试剂(BCA)定量抗体，分装保存。

（9)NSE单克隆抗体的鉴定：

A:双抗体夹心ELISA:用体积比为1：200稀释后的腹水包被固相；加入不同浓度的NSE蛋白，然后加碱性磷酸酶标记抗NSE的IgY，用碱性磷酸酶底物显色，测450nm的光密度。

B：免疫组化：制备SCLC细胞涂片，分成两组：一组为SCLC细胞；另一组为氨基喋呤诱导48小时的SCLC细胞，用EDTA消化培养两组细胞，使其分散，用PBS洗一次，稀释成5×10⁵个/ml，每组细胞涂点为30μl；室温干燥，丙酮固定5分钟，然后用1%的双氧水处理30分钟；再用3%的BSA封闭30分钟。然后加抗体（1:400稀释），孵浴和冲洗，加HRP标记羊抗鼠IgG，冲洗后加DAB底物显色，光镜下观察结果，同时用商品试剂盒对照进行。最后，经过十二烷基磺酸钠(SDS)-PAGE（聚丙烯酰胺）凝胶电泳法检测其抗体纯度；同时，进行抗体的IgG类型、亚类鉴定、以及抗体的结合位点和亲和力测定等。结果得到两株结合位点不同、且稳定分泌NSE抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞克隆号为：1E4、7C6。所产的NSE单克隆抗体分别命名为1E4、7C6之后，置于低温冰箱中保存，即可备为后续应用。

效果：

利用实施例1中得到最优的两株抗NSE单克隆抗体1E4、7C6与hystest公司鼠抗人NSE单克隆抗体5E2进行比较试验，流式细胞技术进行对比试验，方法如下：

取3支10ml离心管分别加入1×10⁸个SCLC细胞，在其中各加入10ml甲醛固定2小时，PBS洗涤三次，800转/分钟，离心五分钟，弃上清。取抗体1E4、7C6与5E2各1μg分别加入10ml离心管中，37℃反应1小时，再加入FITC标记的鼠抗人IgG，37℃反应1.5小时，在流式细胞仪中测得10000个细胞中所能结合的抗体的平均荧光数值。其读值为，1E4 10³、7C6 10²、5E2 10^2.5。通过流式细胞实验，可以明确这三种抗体与人的天然NSE蛋白有结合，因此对于疾病检测试剂盒与科研实验有着很好的用途及市场前景。通过实验得到的各单克隆抗体的平均荧光数值可以看出，抗体1E4平均荧光值大于抗体5E2，进而抗体1E4的亲和力要好于抗体5E2。

引物Oligo-dT：本品为多聚胸腺嘧啶，因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。

本发明操作的注意事项：

本发明制备的产生NSE抗体的杂交瘤细胞常规保存于液氮中，定期复苏和鉴定。杂交瘤细胞在小鼠体内诱导产生的腹水，以及后续纯化的抗体等均应保存于低温，并且在应用时稀释液中应含有0.1%的牛血清白蛋白：长期保存腹水，或纯化的抗体应存于深低温（摄氏零下70℃）；每一个批次制备的抗体或腹水小样分装保存，避免反复冻融。

Claims (1)

1.一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法，其特征是包括如下步骤：

（1）以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上、下游引物,通过RT-PCR,从人肝癌细胞株BEL7402中扩增人NSE分子的cDNA全长，经TA克隆后进行DNA序列分析，确定正确的NSE基因序列SEQ ID NO.3，所述NSE为人神经元特异性烯醇化酶的简称；

（2）将SEQ ID NO.3所示基因序列定向连接入真核分泌型载体pGEM-T的NcoI和XhoI位点之间，形成质粒pGEM-T-NSE；

（3）将质粒pGEM-T-NSE转染入BEL7402细胞中，通过细胞培养，从细胞裂解液中纯化出NSE重组蛋白；

（4）用所述质粒pGEM-T-NSE多点注射于Balb/c小鼠的股四头肌；

（5）取经步骤（4）免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；

（6）将所述杂交瘤细胞用参有荧光标记的步骤（3）获得的NSE重组蛋白的甲基纤维素制备的半固体培养基培养；

（7）将步骤（6）培养获得的杂交瘤细胞利用步骤（3）获得的NSE重组蛋白通过ELISA方法筛选能产生针对NSE蛋白表位单抗的阳性杂交瘤细胞株；

（8）将步骤（7）获得的阳性杂交瘤细胞株注射于Balb/c小鼠腹腔内使所述小鼠产生腹水；用蛋白G柱亲和纯化得到人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。