CN102154216A

CN102154216A - 抗ckm单克隆抗体与产生其的杂交瘤细胞株以及其的应用

Info

Publication number: CN102154216A
Application number: CN2010106230390A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Beijing Lideman Biochemistry Co Research And Development Center
Current assignee: Beijing Lideman Biochemistry Co Research And Development Center
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102154216B

Abstract

本发明提供一种抗CKM单克隆抗体与产生其的杂交瘤细胞株以及其的应用。所述抗CKM单克隆抗体能够特异性地结合并抑制CKM亚基酶活性，进一步，本发明的产生抗CKM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，能够特异性地结合并抑制CKM亚基酶活性，对CKMB酶活的抑制率接近50％。

Description

抗CKM单克隆抗体与产生其的杂交瘤细胞株以及其的应用

技术领域

本发明涉及一种抗人肌酸激酶M型亚基(Creatine Kinase M Type，CKM)的单克隆抗体和产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在CKMB试剂盒中的应用。特别是涉及一种能特异性结合并抑制CKM亚基活性的单克隆抗体和产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在CKMB试剂盒中的应用。

背景技术

肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。

肌酸激酶活性测定对骨骼肌损伤和心肌损伤，特别是急性心肌梗塞的诊断具有非常重要的意义。肌酸激酶已知有两个亚基M型(肌型)和B型(脑型)，两两组合而成CK-BB、CK-MM和CK-MB三种同工酶。CK-BB主要存在于脑或肾等内脏器官中，CK-MM主要存在于骨骼肌及心肌等肌肉中，而CK-MB主要分布于心肌中。

作为肌酸激酶同工酶之一的CKMB，由于在心肌中特异性地存在，因此，CKMB的测定在心肌梗塞的诊断中为特别有用的标记。已知在患急性心肌梗塞后3小时就可以发现血清内的CKMB升高，36小时后升高为100％。在临床领域中，CKMB活性增高是心肌损伤的特异指标，对心肌梗塞早期诊断很有价值。对于CKMB活性的测定以往就提出了很多方法，目前广泛采用的是免疫抑制法。这类方法是通过用抗体来抑制酶的部分酶活或部分同工酶的酶活，从而测得CKMB的活性。作为一般的测定方法，通常是将抑制CKM的抗体加入到双试剂试剂盒中的试剂1中，该抗体可以完全抑制CKM亚基的活性而不影响CKB亚基的活性(CKBB亚基的活性忽略不计)，将测得的CKB亚基的活性乘以2即为CKMB的活性。因此，基于免疫抑制法的原理，CK-MB检测试剂盒中的抗体需要具有较好的特异性。

非专利文献1中公开了一种抗CKM单克隆抗体的制备方法，该方法用CKMB全酶作为免疫小鼠与阳性细胞株检测的抗原，然后根据酶活抑制情况进一步筛选(参见非专利文献1)。

专利文献1中也提出了一种抗CKM的单克隆抗体及其制造方法。该抗CKM的单克隆抗体为与肌酸激酶反应，阻碍CKMB活性的抗体。(参见专利文献1)。

非专利文献1：一种骨骼肌肌酸激酶单克隆抗体(A monoclonal antibody against the skeletal muscle enzyme，creatine kinase)”，Glenn E.Morris与Linda P.Head，欧洲生物化学学会联合会简讯(FEBS LETTERS)，第145卷，第1期，第163-168页，1982年8月。

专利文献1：日本公开昭63-49095

发明内容

发明要解决的问题

但是，由非专利文献1中公开的抗CKM单克隆抗体的制备方法而得到的抗体中，很多都不具备酶活抑制特性，造成筛选的工作量大，效率低。

而专利文献1中的抗CKM的单克隆抗体特异性虽然得到了提高，但是对CKMB酶活的抑制率很难接近50％。

因此，目前的抗CKM的单克隆抗体特异性还不能满足要求，需要一种特异性好，且对CKMB酶活抑制率在50％左右的杂交瘤细胞株。

本发明是针对上述课题，进行大量研究而完成的，其目的在于提供一种特异性结合并抑制CKM亚基活性、且能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，以及由该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，进一步提供一种应用该单克隆抗体为主要原料的CKMB检测试剂盒。

解决问题的手段

本发明者们从CKM和CKB亚基序列中差异较大的片段中选取3段CKM特有的片段作为筛选抗原，采用间接ELISA法进行CKM亚基特异性单克隆抗体的筛选，最终获得了1株能够产生特异性结合CKM、且酶活抑制率接近50％的杂交瘤(2C3)作为目标细胞株，从而完成了本发明。

本发明的目的在于提供一种特异性结合CKM并抑制其酶活性的抗CKM单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一个目的在于提供一种由该杂交瘤细胞株所产生的抗CKM单克隆抗体。

本发明的目的还在于提供一种该杂交瘤细胞株的制备方法。

另外，本发明的目的在于提供一种单克隆抗体在CKMB试剂盒中的应用。

因此，本发明提供了下面所述的(1)至(6)的内容。

(1)产生能特异性结合CKM并抑制其酶活性的抗CKM单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(2)(1)中所述的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC4333。

(3)(1)至(2)任一项所述的杂交瘤细胞株所产生的抗CKM单克隆抗体。

(4)一种抗CKM单克隆抗体，其特征在于，能识别(2)中的杂交瘤细胞株产生的抗CKM单克隆抗体所识别的表位，并特异性抑制CKM酶活性。

(5)一种制备(1)或(2)中所述的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，包括从CKM和CKB亚基序列中差异较大的片段中选取3段CKM特有的片段作为筛选抗原，采用间接ELISA法进行CKM亚基特异性单克隆抗体的筛选的工序。

(6)(3)或(4)所述的抗CKM单克隆抗体在CKMB试剂盒制备中的应用。

发明效果

本发明的杂交瘤细胞株能够特异性地结合并抑制CKM亚基酶活性，对CKMB酶活的抑制率接近50％，而由该杂交瘤细胞株产生的抗CKM单克隆抗体可以特异性地识别CKM亚基的抗原决定簇，而不与CKB亚基结合。由于该抗CKM单克隆抗体很好得满足CKMB检测的要求，因此可以应用于CKMB检测试剂盒中。

附图说明

图1为由2C3杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体应用于试剂盒中的相关性分析图。

具体实施方式

在本发明下文的详细描述中，本领域的技术人员能够使用本领域中的已知技术在不同的实施方案中实现本发明，此外本发明并不局限于以下所列举的实施方案中。

本发明所说的“CKM”除非特别说明，是指具有肌酸激酶活性的人肌酸激酶M型亚基及其相关产物，如肌酸激酶M型亚基的前体、成熟形式或片段。

本发明所说的“特异性结合”是指抗CKM单克隆抗体仅与CKM亚基结合，而不与CKB亚基结合。

本发明所说的“抗体”是指能够与完整的全长度的CKM分子或CKM片段特异性结合的单克隆抗体，或者这些抗体的部分片段。

本发明所说的“抑制率接近50％”是指抗CKM单克隆抗体具有抑制CKMB酶活的能力，但抗体的加入只能使酶活性下降到不加抗体时的50％左右。

本发明中的杂交瘤细胞株与抗CKM单克隆抗体可以通过下文所述的方法产生。进一步，本领域的技术人员可以使用这些根据下文描述及本领域中已知技术改造过的更适合的方法。

(1)免疫原的制备

本发明采用原核表达纯化的CKM亚基作为免疫原。CKM的氨基酸序列为NCBI网站上公布的序列，其序列号为NP_001815，具体地参见SEQ ID No.1。将氨基酸序列用Vector NTI软件翻译成不带大肠杆菌稀有密码子的核苷酸序列，具体序列见SEQ ID No.2。

本发明是通过构建含有编码CKM的DNA片段(SEQ ID No.2)的表达载体并通过在宿主细胞导入及表达该载体的方式来获得重组人CKM。宿主细胞可以使用常用的宿主细胞，例如可以举出E.coli BL 21(DE3)或其他的E.coli感受态细胞，优选为E.coli BL21(DE3)。使用宿主细胞表达后，通过用菌落PCR的方法挑选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子在LB培养基中培养，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。诱导表达后的菌液进行细胞破碎，经过滤膜过滤后，用GST亲和纯化柱，优选GE公司的GSTrap FF预装柱进行纯化。对于细胞破碎，可以采用常规的细胞破碎方法，例如在8000-12000转/分的条件下、离心5-10分钟，离心后的上清用0.22um滤膜过滤，然后按纯化柱填料产品说明书提供的方法进行纯化。

(2)检测抗原的制备：

本发明是通过采用CKM与CKB亚基差异较大的多肽片段作为杂交瘤细胞的检测抗原来进行单克隆抗体的筛选。具体的为：用DNAStar软件所带的同源性比对软件MegAlign分析CKM与CKB亚基的序列，找出CKM与CKB的一些差异较大的片段，从中选取3段多肽片段进行合成作为检测抗原。本发明所选3段多肽序列示于表1中。

表1

序号	多肽的氨基酸序列
		多肽1	GNTHNKFKLNYKPEE

多肽2	VGLQKIEEIFKKAGHP
		多肽3	AHLSKHPKFEEILTR

(3)单克隆抗体的制备

由于CKM种属差异小，不容易诱导产生抗体，因此本发明将CKM插入到表达载体中进行表达，表达载体优选为pGEX-4T-1，表达的蛋白带有融合标签，优选为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，从而提高CKM的免疫原性。然后用基因工程表达并纯化的CKM免疫小鼠，进行3-5次免疫。在最后一次免疫接种2-5天(优选3天)后收集脾细胞，将这些组织中产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合后选择与CKM具有特异性结合的杂交瘤，从而制备产单克隆抗体的细胞。

融合可以按照公知的方法进行，例如可以举出如下方法：将脾细胞与瘤细胞按5-10∶1的比例混合，离心去上清后，向沉淀物中加入融合促进试剂，然后用DMEM培养基终止融合促进试剂的作用。离心弃上清后细胞用合适体积的HAT培养基重悬，制成融合细胞，融合细胞在培养杂交瘤的孔格中进行培养。对于骨髓瘤细胞可以使用公知的骨髓瘤细胞，例如可以举出SP2/0-Ag14(SP2/0)、P3/X63-Ag8(X63)、P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)、P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)等小鼠来源的细胞系，其中优选为SP2/0。融合促进试剂可以为聚乙二醇₁₄₅₀(PEG₁₄₅₀)、聚乙二醇₄₀₀₀(PEG₄₀₀₀)等，优选为PEG₁₄₅₀。

单克隆抗体的选择可以根据已知的方法进行。一般地是在添加有HAT的用于动物细胞的细胞培养基中进行的。用于选择与培养的培养基例如可以举出：体积比为5％-20％胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培养基。细胞一般在5-10％CO₂气体的环境中于36.5℃-37.5℃，培养10-14天。

从培养杂交瘤的孔格中收集培养物的上清液，与抗原多肽反应的抗体可通过间接ELISA方法来选择。首先，抗原多肽被固定在96孔酶标板中，并用吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤酶标板，然后将培养上清样品加入到不同多肽包被孔中，37℃温育30分钟后，加入1∶1000稀释的作为酶标二抗的羊抗鼠-HRP，37℃温育30分钟后加入过氧化氢脲-四甲基联苯胺底物(H₂O₂-TMB)作为底物进行显色，用酸终止反应后，测量450nm下的吸光值。

对ELISA检测呈阳性的培养孔，测定CK的酶活，从而计算杂交瘤细胞培养上清的酶活抑制率。该酶活抑制率，可以通过下式计算：

酶活抑制率＝[(对照CK活性-样品CK活性)/对照CK活性]*100％

CK酶活测定原理如下：

选择具有酶活抑制率为50％左右的细胞株，通过公知的有限稀释法进行克隆。通过培养该培养杂交瘤细胞株可以大量的获得抗CKM单克隆抗体。该抗CKM单克隆抗体的获取方法，大地可以划分为两种。一种是使用培养基，在烧瓶等培养容器中进行培养，从该上清液中获取抗体的方法。例如为体积比是10％-20％胎牛血清的DMEM培养液。另一种方法是将用培养容器培养的杂交瘤细胞株通过同系小鼠体内诱生法接种到同系的动物中，来获得抗CKM的单克隆抗体。

单克隆的杂交瘤细胞可以通过公知的保藏方法进行保藏。例如可以举出：从96孔培养板转到24孔板中进行扩大培养，每孔加1-1.5ml细胞冻存液重悬细胞，然后采用公知的梯度降温法冻存细胞，细胞可以冻存在-80℃冰箱或液氮中。

进一步，本发明人于2010年11月15日向位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提交了2C3杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC4333。

本发明的CKM的单克隆抗体包括了特异性结合并抑制由上文所述的杂交瘤，特别地，保藏号为CGMCC4333的杂交瘤所产生的单克隆抗体能够特异性结合并抑制CKM亚基活性的单克隆抗体，而且也能够特异性结合并抑制CKM亚基活性。这些单克隆抗体所识别的表位，含有上文所述的CKM序列所特有的氨基酸残基。

本发明的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括从CKM和CKB亚基序列中差异较大的片段中选取3段CKM特有的片段作为筛选抗原，采用间接ELISA法进行CKM亚基特异性单克隆抗体的筛选的工序。

本发明的杂交瘤细胞株的制备方法，还进一步包括将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合的细胞融合工序。

本发明的采用间接ELISA法进行CKM亚基特异性单克隆抗体的筛选的工序中，包括将抗原多肽固定在96孔酶标板中，并用吐温-20磷酸盐缓冲液洗涤酶标板的包被酶标板；将培养上清样品加入到不同多肽包被孔中，37℃温育30分钟后，用PBST洗涤酶标板的添加培养上清样品的工序；加入1∶1000稀释的作为酶标二抗的羊抗鼠-HRP，37℃温育30分钟后用PBST洗涤酶标板的添加酶标二抗的工序；以及进行显色的工序。

由于本发明的抗CKM单克隆抗体能够特异性结合并抑制CKM亚基活性，因此可以应用于CKMB试剂盒中。

本发明的CKMB试剂盒为双试剂，分为试剂1(R1)与试剂2(R2)。R1的成分一般包括单克隆抗体、缓冲液、酶底物、辅酶等。R2的成分一般为缓冲液、促反应的酶类等。具体的，R1的成分可以是50-200mmol/L pH6.7咪唑缓冲液、5-20mmoll/L醋酸镁、10-50mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)、1-5mmol/L EDTA、1-5mmol/L NADP、10-50mmol/L葡萄糖、10-50mmol/L肌酸磷酸、5-20umol/L二腺苷-5-磷酸、1-10mmol/L AMP、1-10mmol/L ADP、1-10ug/ml 2C3单克隆抗体，优选为100mmol/L pH6.7咪唑缓冲液、10mmoll/L醋酸镁、20mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)、2mmol/L EDTA、2mmol/L NADP、20mmol/L葡萄糖、30mmol/L肌酸磷酸、10umol/L二腺苷-5-磷酸、5mmol/LAMP、2mmol/LADP、1ug/ml2C3单克隆抗体。R2的成分可以是50-200mmol/LpH6.7咪唑缓冲液、1500-3000U/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、2500-5000U/L己糖激酶(HK)，优选为：100mmol/L pH6.7咪唑缓冲液、2000U/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、3000U/L己糖激酶(HK)。

实施例

本发明通过以下具体的实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不限于这些例子中。

实施例1

杂交瘤细胞株的制备

将序列2的CKM基因的两端加上酶切位点BamHI和XhoI，并将该基因插入到用相同方法处理过的pGEX-4T-1上，用TAKARA公司的连接试剂盒做连接，然后转化到E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中。通过菌落PCR方法挑选阳性克隆子，然后将得到的阳性克隆子在LB培养基中培养，用IPTG诱导表达。诱导表达后的菌液进行细胞破碎，12000转/分离心10分钟，离心后的上清用0.22um滤膜过滤，滤液用GE公司的GSTrap FF预装柱进行纯化，从而得到免疫原。

接下来，用基因工程表达并纯化的GST-CKM免疫BALB/c小鼠，进行4次免疫，前三次免疫用抗原与弗氏佐剂乳化后免疫，每两次免疫之间间隔21天，第3次免疫后15天用不加佐剂的抗原进行一次个冲击免疫。

冲击免疫后3天取免疫小鼠的脾细胞，并收集体外培养骨髓瘤细胞SP2/0，将脾细胞与瘤细胞按(5-10∶1)比例进行细胞融合。首先通过间接ELISA实验筛选与CKM特异性结合的培养孔。其过程为：用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将3个多肽片段分别稀释至5ug/ml，每孔100ul加到96孔酶标板中，4℃过夜包被酶标板，用0.15M pH7.4含0.05％吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗板1次。然后将每个培养孔取3次样，每次50ul，加到不同多肽包被孔中，37℃温育30分钟，用PBST洗板1次。进一步，在每孔中加入1∶1000稀释的羊抗鼠-HRP 100ul，37℃温育30分钟，用PBST洗板2次。最后在每孔中加入H₂O₂-TMB底物，避光显色10分钟，每孔加50ul 2M硫酸终止反应，于酶标仪中测定450nm的吸光值。

实施例2

抗CKM单克隆抗体的筛选

从培养实施例1中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，补液培养两天后，取样与等体积CK-MB质控品混匀，37℃温育5分钟，用OlympusAU400全自动生化分析仪测定CK酶活，选择具有50％左右抑制活性的细胞株，采用公知的有限稀释法进行2次克隆，第2次克隆后培养孔阳性率为100％，共获得4株杂交瘤细胞，分别命名为1F4、2C3、4G3和5D9。

不同单克隆抗体的CKMB酶活抑制性能示于表2中。

表2

从表2可知，这四株杂交瘤细胞所获得的单克隆抗体对CKMB的酶活抑制能力存在较大差异，多肽1、2筛选到的杂交瘤细胞1F4与4G3分泌的单克隆抗体酶活抑制能力较弱，不到20％，特别是4G3基本没有表现出明显的酶活抑制能力。但是从多肽3筛选到的两株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体表现出对CKM亚基特异的酶活抑制活性，对CKMB的酶活抑制到接近50％。在本发明中将2C3杂交瘤细胞进行了保藏。

实施例3

单克隆抗体的制备

用体积比为10-20％的胎牛血清的DMEM培养液，在CO₂浓度为5-10％下，进行培养。培养至培养基由红色变为黄色，取培养上清，采用离心的方法去除细胞与细胞碎片，用0.22um孔径的微孔滤膜对离心后的上清进行过滤，滤液即为抗人CKM的单克隆抗体。

实施例4

由2C3单克隆抗体配制的CKMB试剂盒

将成分为100mmol/L pH6.7咪唑缓冲液、10mmoll/L醋酸镁、20mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)、2mmol/L EDTA、2mmol/L NADP、20mmol/L葡萄糖、30mmol/L肌酸磷酸、10umol/L二腺苷-5-磷酸、5mmol/L AMP、2mmol/L ADP、1ug/ml2C3单克隆抗体的R1，与成分为100mmol/L pH6.7咪唑缓冲液、2000U/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、3000U/L己糖激酶的R2，作为CKMB-2C3试剂盒。

实施例5

2C3单克隆抗体所配CKMB试剂盒检测病人血清样本的试验

用CKMB-2C3试剂盒对20份不同CKMB含量的病人血清样本在全自动生化分析仪Olympus AU400上进行测定，所测得值是CKMB的含量，其单位是U/L。同时将英国朗道公司(RANDOX)的CKMB试剂盒也对同样的20份病人的血清样本进行测定。将两种测定结果进行对比，其结果示于表3中。其中，测定参数分别按Leadman公司CK-MB试剂盒和RANDOX公司CKMB试剂盒说明书进行。

同时，将CKMB-2C3试剂盒与CKMB-RANDOX试剂盒分别做了相关性分析曲线，其结果参见图1。

表3

样本

CKMB-2C3

CKMB-RANDOX

1	3.4	3.5
			2	8.7	9
3	10.2	10.5
			4	10.5	11.0
5	11.1	11.3
			6	12.5	12.9
7	11.5	11.0
			8	13.4	13.6
9	18.1	18.5
			10	18.2	18.4
11	20.5	21.5
			12	24.6	25.3
13	30.1	30.8
			14	54.9	56.1
15	70.9	69.5
			16	85.6	82.7
17	93.1	95.7
			18	154.5	162.6
19	360.2	368.0
			20	389.6	395.9

从表3和图1可知，CKMB-2C3试剂盒的检测结果与RANDOX公司CKMB试剂盒相关性为99.98％，斜率为1.0201。从该结果可知，由本发明的抗单克隆抗体配制的试剂盒与RANDOX公司CKMB试剂盒测值符合度高，准确度可靠，可以应用于CKMB试剂盒中。

工业上的应用性

根据本发明可提供一种能够特异性地结合并抑制CKM亚基酶活性的抗CKM单克隆抗体，该抗CKM单克隆抗体可以特异性地识别CKM亚基的抗原决定簇，而不与CKB亚基结合。进一步，根据本发明提供一种产生抗CKM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够特异性地结合并抑制CKM亚基酶活性，对CKMB酶活的抑制率接近50％。由于该抗CKM单克隆抗体很好得满足CKMB检测的要求，因此可以应用于CKMB检测试剂盒中。

Claims

1.一种产生能特异性结合CKM并抑制其酶活性的抗CKM单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC4333。

3.一种根据权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株所产生的抗CKM单克隆抗体。

4.一种抗CKM单克隆抗体，其特征在于，能识别权利要求2所述的杂交瘤细胞株产生的抗CKM单克隆抗体所识别的表位，并特异性抑制CKM酶活性。

5.一种制备权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，包括从CKM和CKB亚基序列中差异较大的片段中选取3段CKM特有的片段作为筛选抗原，采用间接ELISA法进行CKM亚基特异性单克隆抗体的筛选的工序。

6.权利要求4或5所述的抗CKM单克隆抗体在CKMB试剂盒制备中的应用。