JPS6349095A - 抗ｃｋ−ｍモノクロ−ナル抗体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生体液中のクレアチンキナーゼ（Ｃｒｅａｔ
ｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　ＥＣ２，７，３，２；以下ＣＫ
と略記する。）のＭＢアイソザイムの定量に用いること
ができ、ＣＫと反応し、かつＣＫ　　Ｍサブユニット活
性を阻害するモノクローナル抗体（以下抗ＣＫＭ活性阻
害モノクローナル抗体と略記する。）及びその製造法に
関するものである。

（従来の技術） ＣＫは、（１）式の左右両方向の反応を触媒する酵素で
ある。

（略号は、ＣＰ：クレアチンリン酸、Ｃ：クレアチン、
ＡＤＰ：アデノシンニリンＩＭ、ＡＴＰ：アデノシン三
リン酸である。） ＣＫには、２つのサブユニットの組合せにより。

３つのアイソザイムが存在する。二とが知られておリ、
それらは各々ＣＫ　　ＭＭ、ＣＫ　　ＭＢ、ＣＫ−ＢＢ
であり、ＣＫ−ＭＭは主に骨格筋や心筋などの筋肉に、
ＣＫ−ＭＢは心筋に、ＣＫ−ＢＢは王に脳及び腎などの
臓器に存在している。この中で、ＣＫ−ＭＢは心筋に特
異的に存在するので。

その特異的測定は心筋梗塞の診断において特に有用なマ
ーカーであることが明らかにされている。

臨床検査の領域においてＣＫ活性の測定は９筋疾居、、
神経性疾患、中枢神経系疾患、精神病、心疾６色などの
診断に日常的に測定されている重要な項目の１つで、従
来から種々のＣＫ測定法が提案されてきた。その１つは
、左方向の活性を測定するという方法で、これらの中に
は、■ＣＰの加水分解で生ずる無機リン酸を測定する方
法、■ＡＤＰをピルビン酸キナーゼ（以下ＰＫと略記す
る。）と乳酸脱水素酵素の作用で還元型β−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略記する
。）に導き、吸収減少として測定する方法。

■ＡＤＰをＰＫでピルビン酸に導き１次いで２．４−ジ
ニトロフェニルヒドラジンとの反応で生成したヒドラゾ
ンを測定する方法などがある。

また、右方向の活性を測定する方法には、■生成したＣ
を色素と反応させて比色する。あるいは螢光を測定する
方法、■ルシフェラーゼを用いる方法（特開昭５１−４
１５９７号公報、特開昭５５−１２０７９６号公報、特
開昭５６−２６２００号公報、特開昭５７−１０５１９
９号公報参照。）、■ホスホグリセリン酸キナーゼとグ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用い
る方法（特公昭５９−３４１１９号公報、特開昭５６−
１５５０００号公報参照。）、■ヘキソキナーゼとグル
コース−６−リン酸脱水素酵素（以下Ｇ　６　Ｐ　Ｄ　
Ｈと略記する。）を用いる方法。

■グルコキナーゼ（以下Ｇ　１　ｃ　Ｋと略記する。）
とＧ６　ＰＤＨを用いる方法などがある。

しかし、これらの方法は、３つのアイソザイムを区別し
て測定することができないので、心筋梗塞の有用なマー
カーであるＣＫ−ＭＢを特異的に測定する方法がいくつ
か提案されている。まず。

■ＣＫ−Ｍ活性を特異的に阻害する抗体を加えて。

ＣＫ−Ｂ活性のみを■〜■の方法で測定する方法（特公
昭５６−１９２３９号公報、特公昭５８−２０２７４号
公報参照。）がある。この場合、ＣＫ−ＢＢとの区別が
つかないが１通常血清中のＣＫ−ＢＩ３の量は無視でき
る。また、■イオン交換樹脂でＣＫ−ＭＢアイソザイム
を分離して、　　ＣＫ−ＭＢ活性を■〜■の方法で測定
する方法（特開昭５４−６５０９６号公報、特開昭５４
−１６３８８６号公報参照、）、さらに、■酵素活性で
はなく、免疫測定法でタンパク質量として測定する方法
〔クリニカルケミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ｃｈｅ
ｎ−ｉｓｔｒｙ）、　Ｖｏｌ、　２９　、　１２３２頁
（１９８３）参照〕などが報告されている。これらの方
法の中で５掻作が筒便なこと、総ＣＫ活性との比較が容
易である点で、■の免疫阻害法が最も有用である。この
方法では、抗体はＭＭアイソザイムを抗原として免疫し
て得られる抗血清から分離したポリクローナル抗体が用
いられている。

一方、１９７５年にケーラー（ＫＯｈｌｅｒ）とミルシ
ュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）は、免疫されたマウスの
肺細胞のリンパ球と骨髄腫細胞（ミエローマ）を融合さ
せることによって得られる融合細胞（ハイブリドーマ）
を用いて、単一、均質な抗体（モノクローナル抗体）を
製造しうろことを示した〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
、　　２５６巻、４９５頁（１９７５））。

この報告以来２種々のハイブリドーマ及びモノクローナ
ル抗体について報告がされてきた〔例えば。

コブロースキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）　、プロシーデ
ィングオブ　ナショナル　アカデミツク　サイエンスニ
ーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ）　７５巻、３９３８頁（１９７８）　
　；ガルフル（Ｇａｌｆｒｅ）ら。

ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　　２６６巻、５５０頁
（１９７７）；ケーラー（Ｋａｈｌｅｒ）ら、ヨーロピ
アン　ジャーナル　オプ　イムノロジー（［Ｅｕｒ、Ｊ
、１ｍｍｕｎｏ！、）。

６巻、５１１頁（１９７６）　）が、抗ＣＫ−Ｍ阻害モ
ノクローナル抗体については、全く何も記載されていな
いし、また、その創製に成功したとの報告もなされてい
ない。

（発明が解決しようとする問題点） 前記したポリクローナル抗体を得るためには。

抗原を高度に精製する必要があるが、ＭＭ抗原は高度な
精製が困難で、そのため、エタノール沈殿で得られた粗
酵素はＤＥＡＥセファセル、ＣＭ−セルロース、フェニ
ルセファロース、ブルーセファロースの各クロマトグラ
フィーを要する。特に免疫阻害法においては、アイソザ
イムの相互分離が重要であり１分離が不完全であると１
例えば。

ＭＭ抗原の中にＭＢ抗原が混入した抗原を用いて免疫し
た抗体は、Ｂサブユニットを阻害する抗体も生成してい
ると考えられ、このような抗体を阻害剤として使用すれ
ば、ＭＢアイソザイムのＢサブユニットも阻害し、異常
に低い測定値を与え。

正しい測定ができない。

さらに、ポリクローナル抗体を得るためには。

その高度に精製されたＭＭ抗原が常に多量に必要であり
、また、被免疫動物の個体差によるロフトのバラツキも
大きい。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決すべく鋭意研究
を重ねた結果、ＣＫ−ＭＭ又はＣＫ−ＭＢを抗原として
動物を免疫し、その動物のリンパ球と骨髄腫細胞（ミエ
ローマ）とを融合させることにより得られたハイブリド
ーマ細胞株が、大量の抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナ
ル抗体を生産し、しかも、この抗体を用いて免疫阻害法
でＣＫ−ＭＢアイソザイムを簡便で感度よく測定できる
ことを見い出し１本発明を完成した。

すなわち１本発明は、抗ＣＫ−Ｍ活性■害モノクローナ
ル抗体及び抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体産生
能を有するハイブリドーマ細胞株を培養し、培養物から
抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体を採取すること
を特徴とする抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体の
製造法を要旨とするものである。

本発明の抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体の理化
学的性質の一例を示す。

（１３作用 ＣＫに作用して抗原抗体反応が生じ、　　ＣＫ−Ｍサブ
ユニット酵素活性を阻害する。

（２）抗原抗体反応特異性 ＣＫサブユニットと反応する。

（３）　　至適ｐ　Ｈ ６〜９ （４）安定ｐＨ範囲 ３〜１１ （５）力価の測定方法 イムノアッセイによって検出されうる希釈倍率により測
定する。

（６）作用適温の範囲 ２０〜４０°Ｃ （７）失活の条件 １００℃、１０分の加熱で失活する。

（８）分子量 １４０．０００〜１８０，０００ 本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず。

抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体産生能を有する
ハイブリドーマ細胞株を得る。このハイブリドーマ細胞
株としては３例えば１次の細胞学的性質を示す細胞株が
あシブられる。

（１）由来 抗ＣＫ−Ｍ抗体産生リンパ球とミエローマ細胞との融合
により創製した融合細胞である。

（２）形態 ミエローマ細胞とほぼ同様の形態を示す。

例えば、大きさは１０〜２０μｍである。

（３）機能 単一の抗原決定基を認識する抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノク
ローナル抗体を定常的に生産する。

（４）増殖性 ミエローマ細胞とほぼ同様の増殖性を示す。

すなわち、７２時間で約１０倍に増殖する。

（５）保存性 一１２０℃以下で極めて容易に長期間保存可能である。

（６）最適増殖条件 温度３７°ｃ、ｐＨ７，２ （７）増殖範囲 温度３２〜４２℃、ｐＨ６，５〜７．８で増殖可能であ
る。

この細胞株を得るには９例えば３次のごとき方法を採用
すればよい。

すなわち、まず、抗原のＣＫ−Ｍ〜１又はＭＢを採取す
るには１例えば、クリニカ　キミ力　アクタ（Ｃ１ｉｎ
ｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ）　１２３巻、５９
〜７１頁（１９８２）記載の方法に従ってＤＥＡＥセフ
ァセルでＣＫ　−Ｍ　ＭとＭＢを分離した後、　　ＣＫ
　　ＭＭはＣＭ−セルロース、フェニルセファロース、
ブルーセファロースの各クロマトグラフィーを行うこと
により、抗原として使用可能な精製ＣＫ−ＭＭを得るこ
とができる。

また、ＣＫ−ＭＢは、ＤＥＡＥセファセルで分離した後
、フェニルセファロースによるクロマトグラフィーで抗
原として使用可能な精製ＣＫ−ＭＢを得ることができる
。

抗原としては、全てのＣＫ　　ＭＭ又はＭＢを使用する
ことができるが、臨床化学的には従来の抗血清がヒトの
ＣＫと交差する哺乳動物３例えば。

ヒト、サル、ブタ、ウシ等の由来で、かつ被免疫動物と
は異なる動物が好ましい。これらの抗原で。

哺乳動物、好ましくはマウス又はラットに免疫すればよ
い。抗原の使用量、投与部位、アジュバントの使用等、
免疫の方法は従来の抗血清を得る方法に準ずればよい。

例えば、マウスを用いる場合。

マウス１匹あたり１回につき０．００１〜１０＋＋ｖ、
好ましくは０．０１〜１■のＣＫ−ＭＭ又はＭＢを。

初回はアジュバント（例えば、フロイントの完全アジュ
バント）とよく混合して、皮下、　ｌ］１腔内等に投与
し、３週間以上経過後、再びアジュバント（例えば、フ
ロイントの不完全アジュバント）をよく混合して、皮下
、腹腔内等に投与する。さらに、２週間以上経過後、Ｃ
Ｋ−ＭＭ又はＭＢのみを静脈内、皮下、腹腔内等に投与
して、十分免疫する。このようにして免疫された動物を
、好ましくは最終免疫から２〜４日後に殺し、リンパ球
を採取する。リンパ球調製には、肺臓、リンパ節。

末梢血等が用いられる。このリンパ球を培養液に懸濁状
態にほぐしておく。

一方、骨髄腫細胞（ミエローマ）を用意する。

このミエローマは、被免疫動物と同じ種由来のものを使
用することが好ましい。さらに、そのミエローマは薬剤
抵抗性の変異株であることが好ましく、未融合のミエロ
ーマがハイブリドーマ選択培地で生育しないものが好ま
しい。最も一般には８−アザグアニン抵抗性の細胞ライ
ンが用いられる。

これは、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ　ｇｕａｎ
ｉｎｅｐｈｏ’５ｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆ
ｅｒａｓｅ）が欠損しており。

Ｍ　ｔＲ培地の一種ヒポキサンチンーアミノプテリン−
）ミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。また。

使用するミエローマ自身が抗体を分泌しないものが望ま
しい。以上の点から５例えば、市販のマウスミエローマ
Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８・６・５・３（Ｘ６３・６・５・
３）、Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８・Ｕｌ（Ｐ２Ｏ３）、　　
ラフトミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・２・３等
を用いるのが好ましい。

このミエローマを血清、好ましくは牛胎児血清を含有す
るイーグル最少培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭ１１６４０培地
（ＲＰＭ１１６４０）等の培地中で培養する。

次に、ＭＥＭ、ＲＰＭｒ１６４０等の培地に上記で得た
リンパ球及びミエローマをおのおの懸濁し、混合する。

このときの混合比は任意に選択できるが、好ましくはリ
ンパ球：ミエローマが細胞数でｌ：ｌ〜２０：１．好ま
しくは５：１〜１０：１の比率を用いればよい。混合し
た細胞は、融合促進剤を用いて融合を行う。融合方法と
しては。

例えば、イムノロジカルメソッズ　２巻、２８５頁（Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ＭｅＬｈｏｄｓ　Ｖｏｌ、
　Ｉｔ　、　１９８１．　Ａｃａ−ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ）に従って行えばよい。融合促進剤としては１種々
の高分子物質やウィルス等を用いることができるが、好
ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイ
ウィルスを用いればよい。ＰＥＧは、平均分子量４００
〜２０，０００のものが使用できるが、好ましくは１，
０００〜７，５°ＯＯのものを用いればよい。その使用
濃度は、４０〜６０シｏｆ、％が好ましい。

融合させた細胞は、洗浄で融合促進剤を除去し、。

５〜１５　ｖｏｌ、％の血清を含むＭ　ＩＥ　Ｍ又はＲ
Ｐ〜ｌ１１６４０培地に！懸濁し、９６穴培養皿等に０
．５〜５Ｘ１０ｂ／穴の割合で分注する。さらに、各穴
に選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）を加え、適宜選択培
地を交換すれば、１０〜１４日後には未融合のミエロー
マは死滅し、ハイブリドーマのみ生育する。因に、リン
パ球は長時間生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）では生育でき
ず、やはり１０〜１４日後には死滅する。

抗体を産生じているハイブリドーマの検索方法としては
、培養上澄液の阻害活性を知ることによって行うことが
できる。例えば、その上澄液をＣＫ活性測定用試薬系（
実施例１）の第１試薬に添加して、一定量のＣＫ−ＭＭ
活性を測定する。対照の上澄液無添加時の活性に比較し
て、低い値を示した上澄液の穴の株を選択すればよい。

以上の方法により、抗ＣＫ　−Ｍ活性阻害モノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞株を創製すること
ができる。

この方法に従って予めＣＫ−ＭＭで免疫したマウスの肺
臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞を融合して創製し
たハイブリドーマ細胞株の１種を。

ハイブリドーマＣＫＩ（−１と命名した。この株を。

昭和６１年１月２３日に財団法人発酵研究所に寄託の手
続を行い、ＩＦＯ−５００８８として受は入れられた。

このＣＫ　Ｈ−１は、−１２０°Ｃ以下でほぼ永久的に
凍結保存が可能であって、たえず頒布可能な状態に置か
れている。

次に、このハイブリドーマＣＫ　Ｈ−１を用いて培養す
るが、その際２通常用いられる培地で培養することがで
きる。例えば、牛胎児血清を５〜２０％含有するＲＰＭ
’ｌ　１６４０又はＭＥＭを培地として用い、３７℃、
炭酸ガス濃度５ｖｏ１．％含有空気下でよく増殖する。

また、ミエローマの造腫瘍性をも有しているので、生体
内（例えば、同系の動物、ヌードマウスなど）で増殖し
、抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体を産生ずるこ
とができる。

すなわち、このハイブリドーマ細胞株を培養することに
より、抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体を大量に
採取することができる。このモノクローナル抗体の採取
方法には、大きく分けて２通りの方法がある。１つは、
培地を用い、フラスコ等の培養容器で培養し、その上澄
液から抗体を採取する方法である。例えば、５〜１０ｖ
ｏ１．％の血清を含むＭ　Ｅ　Ｍ又はＲＰＭ１１６４０
培地に。

０．５〜５Ｘ１０’個のハイブリドーマ細胞株を植える
と、２〜４日で１０〜２０倍に生育し、その培養後の上
澄液から抗体を採取する方法である。

もう１つの方法は、このようにして培養容器で培養した
ハイブリドーマ細胞株を、同系の動物に接種する方法で
ある。すなわち、ハイプリドーマ細胞株ｌＯＳ〜１０７
個を同系の動物の皮下又は腹腔内等に投与し、７〜２０
日後ハイプリドーマ細胞株が増殖し、腫瘍が大きくなっ
たときに、血清及び腹水を採取する方法である。腹腔内
に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２．６，１
０゜１４−テトラメチルペンタデカン等の鉱物油を投与
すると、より多量の腹水が得られる。

このようにして得られた抗体は、必要に応じ精製して使
用することができる。すなわち、硫安分画、イオン交換
体、ＣＫ−Ｍを固定化したアフイニティクロマトグラフ
イーなどの２通常タンパク質に適用されうる手段を用い
て精製することができる。

（実施例） 次に１本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例１ クリニカ　キミカ　アクタ（Ｃ１ｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍ
ｉｃａＡｃｔａ）　　１２３巻、５９〜７１頁（１９８
２）記載の方法に従って、まず、ブタの心臓をミンチに
し、ホモゲナイズ３０．ＯＯＯＸｇの遠心分離、７０％
のエタノール沈殿により粗酵素を得た。

次に、粗酵素を溶解、透析後、ＤＥＡＲ−セファセルカ
ラム（ｐｌ（７，５）により素通りするＣＫ−ＭＭと吸
着するＣＫ−ＭＢとに分離し、ＣＫ−ＭＢ画分は食塩濃
度を上げて溶出した。各両分は２０％硫安を含むトリス
バッファーに透析し、フェニルセファロースカラムに吸
着させて硫安イ農度を下げて溶出した。以上の操作によ
り、精製された抗原のＣＫ−ＭＭ及びＭＢを得た。

参考例２ ８遇令のマウスＢａ１ｂ／ｃ（日本タレアより人手。）
に、参考例１で得た５０μｇのブタＣＫ−ＭＭを完全フ
ロインドアジュバント（牛丼化学より入手。）と１：１
に混合乳化し、　１１Ｉ腔内に投与し、３週間後に５０
μｇのブタＣＫＭＭを静注して追加免疫し、３日後に肺
臓を取り出し２Ｍ［ＥＭ培地（牛丼化学より入手。）に
ほぐして懸濁。

洗浄した。一方、マウスのミエローマＸ６３・６・５・
３　（京都大学より入手。）を２日前から培養し、対数
増５１１朋にある細胞を遠心分離で集めた。

肺細胞１０”個をミエローマＸ６３・６・５・３１０７
と混合し、遠心によりペレットした後、３７°Ｃの水浴
中で５０％のＰＥＧ４０００−ＲＰＭ１１６４０　（ギ
ブコ社より入手。）１ｍｇを徐々に１分間で加え５・さ
らに、１分間緩やかにＰＡ拌後。

９ｍｆｆ１のＲＰＭ１１６４０培地を徐々に加えて。

ＰＥＧ４０００を希釈した。遠心分離によりＰＥＧ溶液
を除去し、ペレットに１０％牛脂児血清を含むＨＡ　Ｔ
培地１０ｍ１を加えて、９６穴培養皿（ヌンク社より入
手。）の各穴に０．１　ｍ　ｌずつ分注した。４，８．
１１日口の計３回にわたり半分量の培養液を捨て、新し
いＨＡ　Ｔ培地を加えた。

１４０後には、９６穴中５６穴でハイブリドーマの生育
が見られたので、その上澄液をＣＫ活性測定用試薬系（
実施例１）の第１試薬に添加して。

一定量のＣＫ−ＭＭ活性を測定した。対照の上澄液無添
加時の活性に比較して、低い値を示した上澄液の穴の株
を選択し、限界希釈法にてクローニングを行い、モノク
ローンのハイブリドーマＣＫ■］−１を得た。このＣＫ
Ｈ−１は、前記した細胞学的性質によく一致した。

参考例３ ８週令のマウスＢａ１ｂ／ｃ（日本タレアより人手。）
に、参考例１で得た５０μｇのブタＣＫ−ＭＢを完全フ
ロインドアジュバント（牛丼化学より入手。）と１：１
に混合乳化し、ＢＮ腔内に投与し、３週間後に５０μｇ
のブタＣＫ−ＭＢを静注して追加免疫し、３日後に肺臓
を取り出し１ＭＥＭ培地（牛丼化学より入手。）にほぐ
して懸濁。

洗浄した。以下、参考例２と同様にしてハイブリドーマ
を作製してスクリーニングし、さらにクローニングして
、モノクローンのハイブリドーマＣＫＨ−２を得た。こ
のＣＫ　Ｈ−２は、前記した細胞学的性質によ（−敗し
た。

実施例１ 参考例２で得たハイブリドーマＣＫＨ−１を。

ｌＯ％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養し
、細胞濃度２Ｘ１０６個／　ｍ　１となった培養物３０
０ｍ！を遠心分離で上澄液を集め、５０％飽和硫安分画
により粗抗体画分を分離し、透析後。

プロティンＡセファロース（ｐ１４８．０）に吸着させ
、ｐＨ４，ｏのクエン酸緩衝液で溶出して抗ＣＫ−Ｍ活
性阻害モノクローナル抗体３．２■を得た。

この抗体をＣＫＡ−１と称し、以下に示すＣＫ活性測定
用試薬系に添加してＣＫ−ＭＭ活性に対する阻害度を測
定した。

まず、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のＧｌｃ
Ｋ（生化学工業より市販。）１．４ユニツト／　ｍ　！
！　、　　ロイコノストック　メセンテロイデス由来の
Ｇ６ＰＤＨ（オリエンタル酵母工業社より購入。）１．
２ユニツト／ｍｌ、ＡＤＰ１．２ｍＭ、ＮＡＤＰｏ、７
５ｍＭ、　グルコース２５ｍＭ、ＡＭＰ６．２５ｍＭ、
Ａｐ５Ａ１２．５μＭ、Ｎ−アセチルシスティン１２．
５ｍＭ、酢酸マグネウシム１２．５ｍＭ、　アジ化ナト
リウム１０　ｍ　Ｍ、　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ２．５ｍ　Ｍ
　、イミダゾール−酢酸緩衝液（ｐＨ６，７）１５０ｍ
Ｍよりなる第１試薬を調製し２次いで。

ＣＰｌｏｏｍＭ、アジ化ナトリウム１０ｍＭ、）リス−
酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，５）　２５　ｍＭよりなる第２
試薬を調製した。

上記の第１試薬に抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗
体ＣＫＡ−１０，５ｍｇを添加し、その０．５ｍｊ！に
ＣＫ−ＭＭ、Ｍｎ２又はＢＩ３を加えて光路長１印のセ
ルに入れ、１５分間インキュベートし９次いで、第２試
薬０．１２５ｍｊ！を加えて、セル室を同じく３０℃の
恒温に保った分光光度計にて、３４０ｎｍの吸光度変化
より残存ＣＫ活性を測定した。対照として、抗体を含ま
ない第１試薬に同量のＣＫ　−Ｍ　Ｍ　、　Ｍ　Ｂ又は
ＢＢを加えて、以下同様に測定した。

その結果を表１に示す。

表Ｉ　　ＣＫＡ−１の阻害活性 表１に示したように、ＣＫＡ−１はＣＫ−Ｍサブユニッ
トをよく阻害するが、Ｂサブユニットはほとんど阻害せ
ず、前記した理化学的性質によく一致した抗体であった
。

実施例２ 参考例３で得たハイブリドーマ細胞株ＣＫ　Ｈ−２を実
施例１と同様に培養し、その上澄液５００ｍ１から抗Ｃ
Ｋ　　Ｍ活性阻害モノクローナル抗体７．８ｍｇを得た
。この抗体をＣＫＡ−２と称し、参考例２と同様にＣＫ
活性測定用試薬系に添加して。

各ＣＫ活性に対する阻害率を測定した。

その結果を表２に示す。

表２　　ＣＫＡ−２の阻害活性 （注）値は各々３検体の平均値 表２に示したように、ＣＫ／ｌ−２はＣＫ−Ｍサブユニ
ットをよく阻害する・が、Ｂサブユニットはほとんど阻
害せず、前記した理化学的性質によく一致した抗体であ
った。

（発明の効果） 本発明の抗ＣＫ−Ｍ活性阻害モノクローナル抗体は、大
量に、しかも容易に、かつ安価に得ろことができるので
、免疫阻害法でＣＫ−ＭＢアイソザイムを簡便で感度よ
く測定することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）クレアチンキナーゼと反応し、クレアチンキナー
   ゼＭサブユニット活性を阻害するモノクローナル抗体。
2. （２）クレアチンキナーゼにより免疫された動物より調
   製したリンパ球と融合することにより得られ、クレアチ
   ンキナーゼと反応し、クレアチンキナーゼＭサブユニッ
   ト活性を阻害するモノクローナル抗体産生能を有するハ
   イブリドーマ細胞株を培養し、培養物からクレアチンキ
   ナーゼと反応し、クレアチンキナーゼＭサブユニット活
   性を阻害するモノクローナル抗体を採取することを特徴
   とするクレアチンキナーゼと反応し、クレアチンキナー
   ゼＭサブユニット活性を阻害するモノクローナル抗体の
   製造法。