BR112012005358B1 - Anticorpo ou fragmento do mesmo imunorreativo com um polipeptídeo hppd de pseudomonas, anticorpo, método e kit para detectar a presença do polipeptídeo hppd mutado de pseudomonas - Google Patents

Abstract

anticorpo imunorreativo com um polipeptídeo hppd de pseudomonas, linhagem de célula de hibridoma, método e kit para detectar a presença de um polipeptídeo hppd mutado de pseudomas em uma composição, método para gerar anticorpo. anticorpos imunorreativos a hppd de pseudomonas mutantes são fornecidos e, em um molalidade, o hppd mutante é um no qual o hppd de tipo selvagem é substituído no resíduo 336 de triptofano por glicina. também são fornecidos hibridomas produzindo os anticorpos, bem como métodos para fazer o utilizar os anticorpos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] As hidroxifenilpiruvato dioxigenases são enzimas as quais catalisam a reação na qual para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformada em homogentisato. Essa reação ocorre na presença de ferro e na presença de oxigênio (Crouch, N. P. ET AL., Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, 1997) . Pode ser hipotetizado que os HPPDs contenham um sitio ativo o qual é capaz de catalisar esta reação, na qual ferro, o substrato e a molécula de oxigênio ligam-se entre si.

[0002] Algumas moléculas as quais inibem esta enzima e as ligam-se às enzimas de modo a inibir a transformação de HPP em homogentisato são conhecidas. Algumas destas moléculas foram utilizadas como herbicidas, já que a inibição da reação nas plantas leva ao clareamento das folhas de plantas tratadas e à morte de ditas plantas (Pallet, K. E. ET AL. 1997 Pestic. Sei. 50 83-84) . Os herbicidas para os quais HPPD é o alvo, e os quais são descritos no estado da arte, são em particular isoxazolas (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Pedido de patente americano No. 5,424,276), em particular isoxaflutola, o qual é um herbicida seletivo para milho, dicetonitrilas (EP486630, EP 496631), em particular 2- ciano-3-ciclopropil-l-(2-SO2CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-SO2CH3-4-2,3C12 fenil)propano-1,3- diona, tricetonas (EP625505, EP625508, Pedido de patente americano No. 5,506,195), em particular sulcotriona ou outros pirazolinatos.

[0003] Adicionalmente, a sequência de aminoácidos do hidroxifenilpiruvato dioxigenase a partir de Pseudomonassp. P.J. 874 foi descrita (Ruetschi et al. : Eur. J. Biochem. 205, 459-466, 1992). No pedido de patente americano 6,268,549, uma sequência de um gene deste tipo é descrita e dito gene pode, uma vez incorporado às células vegetais, produzir uma super- expressão ou uma ativação de HPPD nas plantas, dando a elas uma tolerância válida a certos novos herbicidas, tais como aqueles da familia de isoxazolas ou de tricetonas. A sequência pode ser de origem bacteriana, de forma especial o gênero Pseudomonasou, alternativamente, de origem vegetal, de forma especial de plantas monocotiledônias ou dicotiledônias, especialmente de Arabídopsís ou de Umbellí ferae, com por exemplo a cenoura (Daucus carotta) . Elas pode ser isolada na forma nativa ou selvagem ou, possivelmente, mutada artificialmente, fundamentalmente mantendo ao mesmo tempo um propriedade de tolerância a herbicidas contra inibidores HPPD, como herbicidas da familia de isoxazolas ou tricetonas.

[0004] Também descrito no pedido de patente americano No. 6, 245, 968 é um mutante de tais sequências de HPPD. Ele é útil no processo de super-expressar a enzima sensível de modo a produzir quantidades da enzima alvo na planta suficientes para ter enzimas funcionais suficientes, apesar da presença do inibidor. A patente descreve que, pela mutação da enzima nas proximidades da parte C-terminal, foi possivel obter HPPDs funcionais (enzimaticamente ativos), os quais foram menos sensíveis a inibidores de HPPD, tanto que a expressão desses HPPDs funcionais, em plantas, aumenta a tolerância delas a inibidores de HPPD. Mutantes os quais são enzimaticamente ativos ou funcionais retêm uma porção significativa de atividade catalítica de HPPD e, no caso de plantas transformadas com as sequências, as sequências mutadas deveriam preferivelmente reter atividade de HPPD suficiente para sustentar o crescimento da planta.

[0005] Com esta mutação, um aminoácido da sequência primária é substituído por outro aminoácido. Pelo alinhamento destas sequências conhecidas, utilizando os meios comuns da arte, como, por exemplo, o método descrito por Thompson, J. D. et AL, (CLUSTALW: melhorando a sensibilidade do alinhamento de sequências múltiplas progressivas através da pesagem da sequência, penalidades de gapespecificas de posição e escolha da matriz de peso. Busca de Ácidos Nucleicos, 22; 4673-4680, 1994), e acessando estes programas de computador para o alinhamento de sequências os quais incluem uma ampla variedade de ferramentas e estão disponíveis na Internet, por exemplo, uma pessoa versada é capaz de definir as homologias de sequência em relação a uma sequência de referência e descobrir os aminoácidos chave ou então definir regiões comuns, tornando possível, por exemplo, alinhar a sequência e localizar uma posição referenciada e definir uma região C-terminal e uma N- terminal com base nesta sequência de referência.

[0006] No caso da presente invenção, a sequência de referência é a de Pseudomonas, com todas as definições e indicações das posições de aminoácidos particulares sendo feiras em relação à sequência de HPPD de Pseudomonasprimária, aqui referida como SEQ ID NO: 4 (esta é a sequência identificada como sequência 31 da patente '968). Esta sequência de referência é mostrada na Figura 1 da patente '968 e descreve um alinhamento de diversas sequências de HPPD as quais estão descritas no estado da arte; estas sequências estão alinhadas em relação à sequência de HPPD de Pseudomonas como a sequência de referência e compreende as sequências de HPPD como lá descritas de Streptomyces avermitílis(Genebank SAV 11864), de Daucus carota (Genebank DCU87257), de Aradopsis thaliana(Genebank AÍ047834), de Zea mays (Genebank NM001112312), de Hordeum vulgare (Genebank HVAJ693), de Mycosphaerella graminicola (Genebank AF038152), de Coccicoides immitis (Genebank COITRP) e de Mus musculus (Genebank MU54HD). Esta figura mostra a numeração dos aminoácidos da sequência de Pseudomonas e também os aminoácidos os quais são comuns a estas sequências, tais aminoácidos sendo marcados por um asterisco. Com base em tal alinhamento, é direta, pela definição do aminoácido de Pseudomonas por sua sequência e natureza, a identificação da posição do aminoácido correspondente em outra sequência de HPPD (com o alinhamento de sequências de diferentes origens, como vegetal, mamifera e bacteriana, demonstrando que este método de alinhamento, o qual é bem conhecido por uma pessoa versada, pode ser generalizado a qualquer outra sequência). Um alinhamento de diferentes sequências de HPPD é também conhecido em Maxwell et al. Publicação de Patente dos EUA 20030066102 e Pedido de Patente WO97/49816. A parte C-terminal dos HPPDs, onde o sitio ativo da enzima está localizado, difere de sua parte N- terminal por um peptideo ligante o qual garante a estabilidade da enzima e de sua oligomerização (o HPPD de Pseudomonas é um tetrâmero enquanto o HPPD vegetal é um dimero). 0 peptideo ligante torna possível definir o fim N-terminal da parte C- terminal da enzima, com dito peptideo sendo localizado entre os aminoácidos 145 e 157, no caso de Pseudomonas. A parte C- terminal pode, então, ser definida como consistindo da sequência definida, por um lado, pelo peptideo ligante, e por outro lado, pelo fim C-terminal da enzima, com a mutação que efetuada na parte C-terminal do HPPD sendo, portanto, efetuada na região a qual foi definida. Dois aminoácidos, os quais estão nas posições 161 e 162, no caso da sequência de Pseudomonas (D=Aspl62 e H=Hisl62), serão notados em todas as sequências. Como referência ao HPPD de Pseudomonas, é então possível definir o peptideo ligante, o qual representa o fim N-terminal da parte C-terminal do HPPD como sendo localizado entre, aproximadamente, 5 e 15 aminoácidos acima do aminoácido Aspl61. A mutação de interesse na presente invenção é feita em aminoácidos localizados com referência à sequência de Pseudomonas na posição 336.

[0007] Há necessidade de identificar anticorpos que são imunorreativos com a proteína de HPPD descrita acima a fim de que plantas contendo tal proteína de HPPD possam ser prontamente identificadas. Especialmente útil seria um anticorpo que imunorreage com HPPD de Pseudomonas e especialmente a proteína de HPPD mutante contendo a mutação no resíduo 336 (glicina (gly ou G) para triptofano (trp ou W) ) . Um método que evitaria consumo de tempo em etapas laboratoriais reduziria custos, permitindo a rápida identificação das plantas transgênicas contendo a proteína mutante, auxiliando na reprodução e seleção. Além disso, anticorpos os quais são imunorreativos com tais proteinas poderiam ser úteis no isolamento e purificação de proteinas.

[0008] Todas as referências citadas estão aqui incorporadas por referência. A aplicação imediata contém uma Listagem de Sequência, a qual está em anexo e é incorporada ao presente documento por referência em sua integridade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A invenção refere-se a hibridomas e a anticorpos e fragmentos produzidos a partir de hibridomas, os quais imunorreativos com a sequência de aminoácidos de um gene de HPPD mutado. A sequência de aminoácido é aquela a qual substitui uma glicina por triptofano no residue 336 quando comparada a um polipeptideo de HPPD de tipo selvagem e, em uma modalidade, faz tal substituição na posição 336 do gene de HPPD A32 de Pseudomonas fluorescens como é representado em SEQ ID NO: 4 e também com as mutações correspondentes mostradas na Figura 1 e é a SEQ ID NO: 3. O uso dos anticorpos para identificar células vegetais tendo ditos aminoácidos e para isolar e purificar as mesmas é também revelado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0010] A Figura 1 mostra a etiqueta His usada no isolamento da sequência, a qual é composta pelas 33 primeiras bases em negrito (SEQ ID NO: 1) e sequência de nucleotideo 1077 do quadro de leitura aberta do mutante HPPD começando pela base 34 com o sitio de inicio ATG (SEQ ID NO: 2) e a sequência de aminoácido codificada (SEQ ID NO: 3) disposta abaixo. A mutação de glicina para triptofano está em negrito e sublinhada e corresponde com a posição 336 do HPPD A32 de Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO: 4) . A Figura 2 é um gel SDS-PAGE do HPPD mutante expresso em E. coli. A fileira 1 é o sobrenadante do sonicado (parte solúvel), a fileira 2 é o precipitado do sonicado (corpo de inclusão) e a fileira 3 mostra as médias de massa molecular.

[0011] A Figura 3 é um gel SDS-PAGE com o perfil da proteina alvo de HPPD mutante por cromatografia de afinidade Ni-IDS. A fileira 1 é o sobrenadante do sonicado, a fileira 2 é a lavagem, a fileira 3 é o eluido e a fileira 4 mostra as médias das massas moleculares.

[0012] A Figura 4A é um Western blotusando o anticorpo monoclonal 2E6; 4B é usando o anticorpo monoclonal 1C5; 4G é usando o anticorpo 6H11; e 4D é usando o anti-soro policlonal. A fileira 1 mostra as médias de massa molecular, a fileira 2 é um extrato de cotilédone de uma planta transgênica expressando uma proteina de HPPD, a fileira 3 mostra uma planta de soja não transformada com proteina de HPPD purificada adicionada (a fileira 4 está vazia) e a fileira 5 é um extrato de cotilédone de uma planta de soja não transformada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO

[0013] São descritos aqui hibridomas e anticorpos e fragmentos dos mesmos, preparados a partir destes hibridomas contra uma enzima hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD) mutante. Os anticorpos monoclonais imunorreativos são úteis na identificação da presença da enzima e para isolar e purificar a enzima. Os termos usado aqui empregam suas definições comuns; por exemplo, imunorreativo refere-se a reagir com antigenos ou hapteno particulares, e tipo selvagem refere-se ao polipeptideo como ele ocorre na natureza.

[0014] Uma enzima HPPD mutante é uma na qual, comparada ao HPPD de tipo selvagem, o qual em uma modalidade pode ser o HPPD de Pseudomonas, existe uma mutação do aminoácido da enzima alinhado com a posição 336 da proteína de HPPD, como pode ser prontamente determinado, como descrito acima. Ver também, por exemplo, o Acesso No DQ459070 do GenBank, o qual alinha com o mutante, exceto nesta posição particular. Como o mutante é mostrado na Figura 1, a mutação ocorre na posição 336 (excluindo as etiquetas His) . Como mostrado nos exemplos abaixo, o anticorpo monoclonal é imunorreativo a uma proteína de HPD contendo triptofano no residue 336 do HPPD de P. fluorescens. Esta sequência é mostrada na Figura 1 com a posição da mutação em negrito e sublinhada e é SEQ ID NO: 3. A referência ao número de resíduos de aminoácido do HPPD é usada em exemplos aqui não para limitar a invenção, mas para facilitar a comparação entre as sequências de HPPD a partir de várias fontes. Como usado aqui quando em referência ao "anticorpo" ou "anticorpo policlonal" ou "anticorpo monoclonal"(MAb) da invenção, é entendido um anticorpo ou fragmento do mesmo que é imunorreativo com uma sequência de aminoácido de HPPD de Pseudomonas tendo a dita mutação.

[0015] Um anticorpo (ou uma imunoglobulina) é uma proteína sintetizada por um animal em resposta à presença de uma substância estranha, a qual é chamada de antigeno. Cada molécula de anticorpo possui uma estrutura única a qual possibilita que sua ligação seja feita especificamente com seu antigeno correspondente, mas nem todos os anticorpos possuem a mesma estrutura geral. Uma molécula de anticorpo é composta de duas regiões distintas. Uma delas é uma região constante e a outra é uma região variável que confere ao anticorpo a especificidade a uma vasta variedade de antigenos diferentes.

[0016] Cinco importantes classes de anticorpos são IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE. IgG é a classe mais abundante. IgG, como exemplo, possui massa molecular de 150 kDa e é composto de dois tipos diferentes de cadeias de polipeptideos: um é a cadeia pesada (50 kDa) e o outro é a cadeia leve (25 kDa) . Cada molécula de IgG possui duas cadeias pesadas e duas cadeias leves ligadas por ligações de sulfeto. Regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) funcionam conjuntamente como a região variável do anticorpo e conferem ao anticorpo a habilidade de ligar-se a um antigeno especifico.

[0017] Nas sequências de aminoácidos discutidas aqui, a nomenclatura padrão de letra única ou três letras é usada. Todas as estruturas de peptideos representadas na descrição seguinte são mostradas em formato convencional, no qual o grupo amino do N-terminal aparece à esquerda e o grupo carboxil no C-terminal aparece à direita. Semelhantemente, a nomenclatura de aminoácidos para os aminoácidos de ocorrência natural encontrados em proteína é como se segue: alanina (Ala; A) , asparagina (Asn; N) ácido aspártico (Asp; D) , arginina (Arg; R), cisteina (Cys; C), ácido glutâmico (Glu; E), glutamina (Gin; Q) , glicina (Gly; G) , histidina (His; H) , isoleucina (He; I), leucina (Leu; L) , lisina (Lys; K) , metionina (Met; M) , fenilalanina (Phe; F) , prolina (Pro; P) , serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) , e valina (Vai; V) . Um "X" pode ser usado quando o resíduo de aminoácido for desconhecido e parênteses designam que uma atribuição não ambígua não é possível e a designação do aminoácido entre parênteses é a estimativa mais provável, com base em informações conhecidas.

[0018] Ácido desoxirribonucléico (DNA) é um polímero compreendendo quatro unidades de mononucleotídeos, dAMP (2'- Desoxiadenosina-5-monofosfato), dGMP (2'-Desoxiguanosina-5- monofosfato), dCMP (2'-Desoxicitosina-5-monofosfato) e dTMP (2'-Desoxitimidina-5-monofosfato) ligados em várias sequências por pontes 3',5'-fosfodiéster. O DNA estrutural consiste de múltiplos tripletes de nucleotídeos chamados "códons", os quais codificam aminoácidos. Os códons correspondem aos vários aminoácidos, como segue: Arg (CGA, CGC, CGG, CGT, AGA, AGG) ; Leu (CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG) ; Ser (TCA, TCC, TCG, TCT, AGC, AGT); Thr (ACA, ACC, ACG, ACT); Pro (CCA, CCC, CCG, CCT); Ala (GCA, GCC, GCG, GCT) ; Gly (GGA, GGC, GGG, GGT) ; Ile (ATA, ATC, ATT); Vai (GTA, GTC, GTG, GTT); Lys (AAA, AAG); Asn (AAC, AAT) ; Gin (GAA, CAG) ; His (CAC, CAT) ; Glu (GAA, GAG) ; Asp (GAC, GAT) ; Tyr (TAG, TAT) ; Cys (TGC, TGT) ; Phe (TTC, TTT) ; Met (ATG); e Trp (UGG). Ademais, devido à redundância do código genético (isto é, mais de um códon para todos os aminoácidos, com exceção de dois), existem diversas possibilidades de sequências de DNA que podem codificar uma sequência particular de aminoácidos.

[0019] Métodos para produzir anticorpos policlonais são conhecidos por aqueles versados na arte. Tipicamente, um antígeno, preferivelmente uma proteína purificada, é misturado com um adjuvante e animais são imunizados com a mistura. A resposta imune do animal à preparação de antígeno é monitorada por testes de sangue e determinação da titulação de reatividade à proteina de interesse. Quando titulações apropriadamente altas de anticorpo ao antigeno são obtidas, usualmente após repetidas imunizações, sangue é coletado a partir do animal um antissoro é preparado. 0 fracionamento adicional do antissoro para aumentar a reatividade dos anticorpos para a proteina pode ser feito, se desejado. Ver, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 5, p. 76, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988); ou Coligan(1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, N.Y.

[0020] Anticorpos monoclonais podem ser obtidos por várias técnicas familiares àqueles versados na arte. Tipicamente, células do baço de um animal imunizado com um antigeno desejado são imortalizados, comumente por fusão com uma célula de mieloma (ver Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519, incorporado aqui por referência). Métodos alternatives de imortalização incluem transformação com Epstein Barr Virus, oncogenes ou retrovirus ou outros métodos conhecidos na arte. Colônias surgindo a partir de células únicas imortalizadas são monitoradas para a produção de anticorpos de especificidade desejada e afinidade pelo antigeno, e o rendimento dos anticorpos monoclonais produzidos por tais células pode ser otimizado por várias técnicas, incluindo injeção na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado. A descrição e as técnicas para o preparo de tais anticorpos monoclonais podem ser encontradas em, por exemplo, Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology(4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., e referências lá citadas; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, N.Y.; e particularmente em Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497, onde é discutido um método para a geração de anticorpos monoclonais. Em um breve resumo, o método involve injetar um antigeno em um animal. 0 animal é então sacrificado e células são retiradas de seu baço, as quais são, então, fundidas com células mieloma. 0 resultado é uma célula hibrida ou "hibridoma", a qual é capaz de reproduzir-se in vitro.A população de hibridomas é, então, monitorada para isolar clones individuais, cada qual secretando uma espécie única de anticorpo para o antigeno. Claramente, muitos métodos diferentes e variações estão disponíveis para aquele versado na arte.

[0021] O uso de linhagens de células hibridas somáticas como fonte de anticorpos para antigenos individuais geralmente data a partir do trabalho de Kohler e Milstein (1975), supracitados. Os anticorpos produzidos são um tanto diferentes daqueles recuperados a partir do antissoro de animais imunizados convencionalmente. Cada linhagem de célula hibrida sintetiza uma imunoglobulina homogenia que representa todos menos um dos inúmeros tipos de anticorpos que um animal pode sintetizar em resposta a um antigeno in vivo. Já que cada clone produtor de imunoglobulina é caracterizado por um único tipo de anticorpo que ele produz, o termo anticorpo monoclonal foi adotado. As vantagens dos anticorpos monoclonais são muitas; eles podem ser obtidos em grandes fornecimentos; a preparação é homogênea em respeito à reatividade do antigeno e mantém-se com o tempo.

[0022] O principio da tecnologia de hibridoma/monoclonal é predicado na observação que, quando duas células somáticas são fundidas, o resultado hibrido demonstra características de ambas os tipos de célula parentais. No caso da produção de anticorpos monoclonais, a habilidade de sintetizar o anticorpo particular é derivada de uma célula imunocompetente (geralmente uma célula do baço) retirada de um animal doador imunizado, enquanto que a habilidade de continuamente dividir- se em culturas de células é contribuída pelo outro componente da fusão, uma linhagem de célula tumorosa (usualmente um mieloma) . Fusões anteriores eram complicadas pelo fato de que a linhagem de célula de mieloma também produzia um anticorpo monoclonal; então o hibrido, em geral, produzia dois tipos de anticorpo monoclonal, um de origem do mieloma e o outro diretamente pela informação genética da célula imunocompetente. Subsequentemente, linhagens de células tumorosas, incapazes de produzir seus próprios monoclonais, tem sido usadas, por exemplo, SP2/0-Agl4 ou X63-Ag8.653, simplificando, portanto, a análise dos produtos da fusão resultante.

[0023] Outra consideração técnica envolve a lógica para selecionar os eventos de fusão bem sucedidos (células hibridas) a partir de dois tipos de células parentais. Rotineiramente, um milhão ou mais de células de cada tipo são usados no protocolo de fusão e, já que a fusão não ocorre com 100 % de freqüência, o trabalho de tentar recuperar produtos da fusão a partir a alta margem de células parentais não usadas ou auto-fundidas pode ser formidável. Como mencionado, hibridomas são formados a partir da fusão de células (do baço) jovens produtoras de anticorpos e células de mieloma maduras. 0 resultado desejado é uma linhagem de célula madura a qual produz anticorpos. Já que as células do baço possuem um intervalo de vida finito na cultura, pode-se simplesmente esperar por um periodo apropriado para que todas as células de baço não fundidas ou auto-fundidas morram; no entanto, deve-se ainda recuperar, a partir da população resultante, as células produtoras de anticorpos maduras das células não produtoras de anticorpo maduras. Um meio popular de selecionar células hibridas é o chamado sistema de seleção HAT. Este sistema envolve o uso da enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil transferase (HGPRT, sigla em inglês). Esta enzima funciona na via de recuperação de purinas em células de mamíferos. Estas células são capazes também de sintetizar novas purinas. Sob a maioria das condições, ambas as via provavelmente operam até um certo limite. Caso uma célula tenha deficiência em HGPRT, a via de recuperação é bloqueada e as purinas passam a precisar ser produzidas a partir de materiais não purinicos.

[0024] O composto 8-azaguanina é um antimetabólito o qual é capaz de se passar por uma purina guanina e de substitui-la em algumas de suas reações normais. Azaguanina é incorporada no DNA, interferindo com o padrão de crescimento normal e levando à morte celular. Já que a azaguanina deve ser recuperada, qualquer célula com deficiência na atividade de HGPRT não pode utilizar a azaguanina e crescerá em sua presença.

[0025] Um sistema seletivo o qual opera na mesma enzima, mas no sentido oposto em que as células positivas com HGPRT são selecionadas é descrito por J. W. Littlefield (Science, 145: 709 (1964)). Ele é chamado de HAT e contém hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). A aminopterina é um antimetabólito que previne a nova sintese de purinas e a metilação de desoxiuridilato para formar timidilato. A hipoxantina pode servir como uma purina recuperável no caso de a aminopterina bloquear a biosintese de novas purinas enquanto que a timidina contorna a necessidade para a metilação do timidilato. Então, na presença de aminopterina, qualquer célula com atividade HGPRT positiva irá proliferar enquanto que células com atividade HGPRT neqativa morrerão.

[0026] Em um sistema hibrido o qual pode ser usado para a seleção de acordo com a invenção, as células de mieloma são resistentes a azaguanina e suscetíveis a aminopterina, isto é, elas são HGPRT negativas. Então, elas morrerão na presença de aminopterina. As células produtoras de anticorpo são HGPRT positivas. Pela fusão das células e crescimento delas em meio HAT sem azaguanina (meio HT) , as células fundidas com sucesso são então selecionadas porque as células de mieloma, as quais constituem a linhagem de proliferação, podem crescer somente onde a atividade de HGPRT for presente e esta atividade de ser fornecida pela linhagem de célula HGPRT-positiva. As linhagens de célula produtoras de HGPRT positivas não são mortas neste meio. Elas viverão por um tempo, mas não vão proliferar.

[0027] Portanto, pela fusão das células em um meio HAT, sistemas são produzidos nos quais as células de mieloma e as células produtoras de anticorpo podem crescer por tempo suficiente para produzir células hibridas, mas nos quais somente as células hibridas podem sobreviver e proliferar. Após a seleção, cada clone de hibridoma é, então, monitorada para a habilidade de produzir o anticorpo particular de interesse.

[0028] Uma proteina de HPPD mutante foi purificada e usada como um antigeno na preparação do anticorpo monoclonal HPPD- especifico. Em uma modalidade, um processo de preparação é caracterizado por: a) um extrato feito a partir de E. coli expressando a proteina mutante de HPPD, preservado a baixa temperatura por moagem, centrifugação e filtração, b) o extrato obtido é enriquecido na proteina de HPPD por precipitação em um solvente apropriado, centrifugação e solubilização do precipitado obtido em uma solução tampão, c) a proteina ativa então obtida é purificada por cromatografia e, se desejado, d) os hibridomas e os anticorpos monoclonais são preparados a partir de uma solução de antigeno obtida de uma das preparações obtidas nos itens a), b) e c) acima, e) os hibridomas são monitorados e o(s) anticorpo(s) monoclonal(is) dirigidos especificamente contra o HPPD mutante são selecionados.

[0029] A descrição acima não tem intenção de limitar a produção dos anticorpos da invenção a tais sistemas precisos; a medida que métodos adicionais de tal produção de anticorpos forem desenvolvidos e otimizados, eles estão contidos no escopo da invenção.

[0030] Os anticorpos monoclonais então isolados podem ser usados em uma variedade de formas. Como demonstrado abaixo, os anticorpos pode distinguir entre tecidos vegetais contendo a proteina de HPPD de Pseudomonasmutada e aqueles que não contêm esta proteina. Portanto, os anticorpo podem ser usados para identificar células vegetais, tecidos vegetais e plantas as quais contêm a proteina de HPPD, permitindo, então, a seleção de tais plantas sem necessitar a destruição da planta ou requerimento de testes de campo extensivos.

[0031] Kits úteis com esta invenção podem tomar qualquer uma da variedade de formas e, em geral, são fornecidos para obter uma amostra contendo aminoácidos de um tecido vegetal, um suporte tendo afixado a ele um anticorpo da invenção capaz de formar um complexo binário com o HPPD, o qual pode estar presente na amostra, e meios de detecção de complexo binário. As especificidades do kit além da aplicação das propriedades imunorreativas de um anticorpo ou fragmento da invenção não são criticas. O método ou meio para obter uma amostra contendo aminoácido não é critico, e pode tomar qualquer forma, desde que uma amostra vegetal seja obtida; os meios de detecção pode, da mesmo forma, tomar qualquer uma das inúmeras formas, como pode ser entendido por aquele versado na arte. Meios de detecção foram usados por algum tempo e podem incluir, por exemplo, biotina, um marcador fluorescente, um isótopo de rádio ou uma enzima.

[0032] Em uma modalidade, por exemplo, o anticorpo monoclonal pode ser aplicado a uma estrutura suporte, como uma tira de teste. Por meio de um exemplo, sem a intenção de limitar a aplicação da invenção, o anticorpo pode ser usado como uma imunotira. Um anicorpo é conjugado a uma partícula de ouro e aplicado a um bloco de fibra. Um segundo anticorpo é estirado como uma linha sobre a membrana. Uma tira é feita de tal maneira que um bloco de amostra seja posicionado no extrato de amostra e o antigeno fique acima da tira, entrando em contato com o MAb conjugado e, posteriormente, com MAb estirado. 0 MAb estirado "captura" o complexo antigeno- conjugado, formando uma linha colorida. Se um antigeno não estiver presente, a linha não se forma. Um kit compreenderia materiais requeridos para realizar um teste para HPPD mutante.

[0033] No caso de serem requeridas determinações precisas para a presença do mutante, outros teste são bem conhecidos daquele versado na arte. Por meio de um exemplo, sem limitações, uma análise de Western Blot é um dos tipos de teste que pode ser aplicado. Uma análise Western é uma variação da técnica de análise Southern. Com uma análise Southern, o DNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em gel de agarose para separar o DNA por massa molecular e, então, transferido para membranas de nylon. Ele é, depois, hibridizado com o fragmento de sonda o qual foi ou 32P marcado (radioativo) ou não-radioativo marcado e lavado em uma solução de SDS. Na análise Western, ao invés de isolar o DNA, a proteína de interesse é extraida e separada em gel de acrilamida. A proteína é, então, posicionada sobre uma menbrana e tratada com uma substância marcadora. Ver Towbin et al, (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications"Proc Natl Acad Sci USA 76(9) : 4350-4354; Renart et al (1979). "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure"Proc Natl Acad Sci USA 76(7): 3116-3120.

[0034] Outra maneira de utilizar os MAbs é realizar o teste ELISA sanduíche duplo de anticorpos. As interações antigeno- anticorpo são similares àquelas da imunotira, mas ocorrem nas cavidades de uma placa de poliestireno.

[0035] Os anticorpos podem também ser usados na purificação e isolamento da proteina de HPPD. Por exemplo, amostras contendo proteínas podem ser passadas através de uma coluna de cromatografia contendo os anticorpos monoclonais da invenção de forma que as proteínas liguem-se e sejam isoladas das outras proteínas na amostra.

[0036] Claramente, os anticorpos da invenção podem ser aplicados em uma variedade de usos, alguns dos quais são exemplificados aqui, e os quais são conhecidos por aqueles versados na arte.

[0037] O que se segue é apresentado por meio de ilustração e não tem intenção de limitar o escopo da invenção.

PARTE EXPERIMENTAL Isolamento da proteína de HPPD his-marcada

[0038] O isolamento da proteina HPPD expressa em bactéria usou protocolos padrão como fornecidos por Qiagen, Inc. (The QIAexpressionist™ : A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged (SEQ ID NO: 5) proteins. 5th Edition, 2003).

[0039] O protocolo usado está resumido como segue. Expressão de Proteina 1. A cepa de E. coli foi posta em uma cultura com meio LB de 1L por 4 horas e então induzida por 0,05 mmol/L de IPTG por 5 horas a 28 °C. 2. As células foram colhidas por centrifugação e rompidas por sonicação. 3. A proteina alvo foi largamente expressada na forma solúvel (como mostrado na Figura 2; fileira 1 mostrando o sobrenadante do sonicado (parte solúvel), fileira 2 mostrando o precipitado do sonicado (corpo de inclusão) e fileira 3 mostra as massas moleculares médias.). Purificação da proteina 4. A pasta de células foi suspendida em tampão LEW e rompida com sonicação em gelo. O sonicado foi centrifugado em alta velocidade por 20 min. O sobrenadante foi coletado e aplicado à Resina Ni-IDA de Alta afinidade (Cat. No L00223) para purificar a proteina de fusão (como mostrado na Figura 2). 5. Diálise do eluido contra IxPBS.

[0040] Os resultados do perfil de purificação SDS-PAGE para a proteina alvo de HPPD mutante por Afinidade Ni-IDA são mostrados na Figura 3. A fileira 1 é o sobrenadante do sonicado, a fileira 2 o lavado, a fileira 3 o eluido, a fileira 4 mostra as massas moleculares médias.

Produção de anticorpos

[0041] Camundongos BALB/c foram preparados e impulsionados de três a quatro vezes com 6XHis-HPPD expresso bacterialmente a cada duas a quarto semanas. Adjuvante de Freund completo e incompleto da Sigma foi usado para o preparo e impulsionamento respectivamente. Após dois impulsionamentos, titulações do soro foram monitoradas por ELISA. Uma vez que os tituladas tornaram-se alto o suficiente, esplenócitos foram colhidos dos camundongos imunizados e fundidos com células de mieloma (P3/NSI/l-Ag4-l) usando PEG 1500 com um agente de fusão. Os produtos da fusão de células resultantes foram diluídos em meio de hibridoma e alimentados em 96 placas de cultura de tecidos. Após um dia, o meio HAT foi adicionado às culturas de hibridomas. Desde então, o meio foi modificado a cada três ou quatro dias como necessário com meio HT. Após dez a quatorze dias de cultura com seleção, o monitoramento foi iniciado por ELISA.

[0042] Anticorpos foram monitorados contra o HPPD purificado e ôXHis-HPPD. Noventa e seis bons Nunc Maxi-sorp Immunoplates™ (Nunc # 446612, Roskilde, Denmark) foram revestidos pela adição de 50 JLIL por cavidade de solução de HPPD e por adição de 50 p.L por cavidade de 0,5 p.g/mL de solução de 6xHis-KLH ('6xHis' descrito como SEQ ID NO: 5) em tampão de revestimento (BupH.™. Tampão Carbonato-Bicarbonato, Pierce # 28382, Rockford, IL) por uma hora a temperatura ambiente. O tampão de revestimento foi removido e a placa foi bloqueada pela adição de 250 p.L por cavidade de tampão de bloqueio (1% de bloqueador, TM. BSA, Pierce # 37525, em PBS) por duas horas a temperatura ambiente. 50 p,L de hibridoma sobrenadante foram adicionados nas cavidades e incubados por uma hora a temperatura ambiente. As cavidades foram então lavadas quatro vezes com PBS/Tween 20. 50 |1L de Ig anti-camundongo de cabra conjugado a HRP diluido (1:7.000) (Southern Biotech #1010-05) foram adicionados nas cavidades e incubados por uma hora a temperature ambiente. As cavidades foram lavadas cinco vezes com PBS/Tween 20. Anticorpos anti-HPPD foram detectados pela adição de 50 p,L por cavidade de solução de TMB (tetrametilbenzidina) (ImmunoPure®. TMB Substrate Kit, Pierce #34021) por cinco a dez minutes. As picas foram lidas espectrofotometricamente a 450 nm usando um leitor de microplaca (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[0043] Seguindo os monitoramentos dos produtos de fusão por ELISA, anticorpos mostrando ligações especificas ao HPPD foram selecionados.

Monitoramento ELISA

[0044] Anticorpos monoclonais derivados dos hibridomas produzidos contra HPPD foram monitorados usando um formato ELISA de sanduiche de anticorpos duplo indireto (DAS, em inglês). Brevemente, placas foram revestidas com um anticorpo policlonal especifico para HPPD. O tampão disparou com as concentrações variantes de HPPD, extratos de soja não-GMO (Jack), e soja de HPPD foram então incubados em uma placa por uma noite. As placas foram então incubadas com anticorpos monoclonais específicos e, então, detectadas com IgG anti- camundongo de coelho marcada com fosfatase alcalina. Anticorpos monoclonais mostrando especificidade por HPPD foram escolhidos para estudos posteriores. Nove anticorpos designados 1C5, 2E6, 3C6, 5E9, 6H11, 7A7, 7F10, 8E7 e 12H1 foram selecionados finalmente para seus ensaios de desenvolvimento. Os resultados de tal monitoramento estão mostrados abaixo.

[0045] A designação "PA056R@ 2ug/ml"refere-se ao anticorpo monoclonal de HPPD o qual foi revestido na placa a 2p,g/mL. A categoria "HPPD |j.g/ml"refere-se a uma curva padrão feita a partir do HPPD que foi expresso em E. coli e purificado.

[0046] A resposta calorimétrica foi registrada como densidade ótica (OD) por uma placa de leitura ELISA no comprimento de onda de 405 nM. Este ensaio, em particular, foi lido após 60 minutos de desenvolvimento de substrato. Após monitoramentos adicionais, MAbs 1C5, 2E6, e 6H11 provaram ter a maior utilidade para detectar HPPD.

Análise de Western Blot de anticorpos selecionados

[0047] Especificidade da reatividade dos anticorpos foi confirmada pelo ensaio de Western Blot. Ver a Figura 4A-D. extratos são obtidos a partir da planta de soja não transformada com HPPD (referida como "Jack"- ver fileira dos géis na Figura 4A-D); bem como linhas transformadas com HPPD (linha 2 dos géis da Figura 4A-D) . Tais linhas foram transformadas por bombardeamento por arma de particula. (Descrito geralmente em Klein, T.M., Arentzen, R., Lewis, P.A. and Fitzpatrick-McElligott, S. (1992) Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment. Biotechnology (N Y) 10, 286-291) com o gene de HPPD mutante e também com o gene duplo resistente glifosato de EPSPS mutante para criar uma linhagem de soja (Ver o identificador de sequência 3 nos pedidos de patente americanos US 6,566,587 e US 6, 040,497) . (A fileira 1 mostra as massas moleculares médias como indicado e tendo o marcador pré-manchado SeeBlue®Plus2 da Invitrogen, #LC5929 com miosina, fosforilase, BSA, glutâmico desidrogenase, álcool desidrogenase, carbônico anidrase, mioglobina, lisozima, aprotinina e insulina, Cadeia B. )

[0048] A proteína de HPPD purificada foi também adicionada a uma soja não-transgênica (ver fileira 3 dos géis nas Figuras 4A-4D). O extrato a partir das plantas identificadas foi separado por gel de eletroforese sódio dodecil sulfato- poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições de redução, vertida sobre um membrana de nitrocelulose e carregada com os anticorpos 2E6 (Figura 4A) 1C5 (Figura 4B) , 6H11 (Figura 4C) ou policlonal (Figura 4D). Em geral, 8-16% BioRad Ready Gel é usado em aparato de Bio-Rad Mini Protean 3 a 15mA/gel até que as amostras estejam completamente no gel, então a 30mA/gel. As proteínas na eletroforese nos géis são transferidas para membrana de PVDF. A detecção de proteínas imunorreativa é realizada usando o kit Zymed Western Blot (#96-9045).

[0049] Uma proteína com massa molecular aparente de 40 kDa foi identificada por SDS-PAGE e corresponde à massa molecular predita pela sequência de proteina de HPPD mutante. Os MAbs 1E6, 1C5 e 6H11 são específicos para o HPPD em soja de forma similar quando HPPD purificado é adicionado a extrato de planta não-transgênica. Bandas abaixo da banda principal são produtos da degradação a partir da proteina com extensão completa. Isto é deduzido porque eles são somente detectados em extratos combinando HPPD e não em extratos não- transgênicos. Os produtos da degradação são detectados de forma diferente por diferentes monoclonais, como é esperado já que cada um reconhece um diferente epitopo na molécula de proteina mutante de HPPD. Como é demonstrado nos resultados, especificamente na fileira 5 pelo ensaio Western na Figura 4A- D, HPPD de planta não-mutante endógeno não é detectado pelos monoclonais, portanto, fornece a habilidade de detectar a presença do HPPD de Pseudomonasmutante usando os anticorpos monoclonais.

Claims (4)

1. Anticorpo ou fragmento do mesmo imunorreativo com um polipeptideo HPPD de Pseudomonasdefinido pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 caracterizado por o dito anticorpo ser um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma selecionado a partir do grupo consistindo em IC5 depositado com o ATCC sob número de acesso PTA-10312, 2E6 depositado com o ATCC sob número de acesso PTA-10313, e 6H11 depositado com o ATCC sob número de acesso PTA-10314.

2. Anticorpo caracterizado por ser produzido por um hibridoma selecionado a partir do grupo consistindo em 1C5 depositado com o ATCC sob número de acesso PTA-10312, 2E6 depositado com o ATCC sob número de acesso PTA-10313, e 6H11 depositado com o ATCC sob número de acesso PTA-10314.

3. Método para detectar a presença do polipeptideo HPPD mutado de Pseudomonasdefinido pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 em uma composição, caracterizado por o dito método compreender o contato da dita composição com o anticorpo conforme definido na reivindicação 1 e a determinação se o dito anticorpo é imunorreativo com qualquer um dos polipeptideos HPPD mutados presentes em dita composição.

4. Kit para detectar a presença do polipeptideo HPPD mutado de Pseudomonasdefinido pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 em uma composição caracterizado por o dito kit compreender o anticorpo conforme definido na reivindicação 1 e um agente de detecção.

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