JPH10286094A - 新規ｄｌｇファミリー分子及び該分子をコードするポリヌクレオチド、該分子に対する抗体、及びｄｌｇ遺伝子検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は新規なｄｌｇファミリー分子及び該
分子をコードする遺伝子を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は、新規なｄｌｇファミリー分子
（Ｐ−ｄｌｇ）及び該分子をコードする遺伝子に関す
る。また、本発明は、Ｐ−ｄｌｇ分子を特異的に認識す
る抗体に関する。本発明の分子、遺伝子及び抗体は、ｄ
ｌｇ分子の機能解明に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なｄｌｇファ
ミリー分子及び該分子をコードするポリヌクレオチド、
該分子に対する抗体、及び検体中のｄｌｇ遺伝子検出方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ショウジョウバエにおいて、これまでに
いくつかの癌抑制遺伝子が単離され、その遺伝子の遺伝
的な解析がされてきた。係る遺伝子は、生殖細胞系列
（germ line）での変異は、劣性致死（recessive litha
l）として挙動するものであることが知られている。係
る遺伝子のうち、ｄｌｇ（discs large 1）として一般
的に称される遺伝子が、その欠失により成虫盤（imagin
al discs）新生の 過増殖を引き起こす遺伝子として単
離されている（Woodら, Cell, 66巻, 451〜464ページ,
1991年）。また、該ｄｌｇ遺伝子は、３コピーのＤＨＲ
ドメイン（discs-large homologous region）、ＳＨ３
モチーフ、及び酵母のグアニル酸キナ ーゼにホモロジ
ーのあるドメインをもつことが知られている。

【０００３】最近、前記ｄｌｇ遺伝子がコードする蛋白
質であるｄｌｇ（又はｄｌｇ分子）にホモロジーがある
分子がいくつか同定されている。これら分子は、ＭＡＧ
ＵＫ（membrane-associated guanylate kinase homolo
g）と称され、新しい蛋白質ファミリーと考えられてい
るものである（Wood ら, Mechanism of Development, 4
4,p.85-89, 1993）。本明細書中では、以下、この蛋白
質ファミリーをｄｌｇファミリーといい、また、このフ
ァミリーに属する蛋白質をｄｌｇファミリー分子とい
う。さらに、該蛋白質が由来する動物種を明示するとき
はヒトｄｌｇファミリー分子というように種をｄｌｇフ
ァミリー分子の前に付けることとする。

【０００４】係るｄｌｇファミリー分子には、ヒト由来
のｈｄｌｇ１、ｈｄｌｇ２、ＺＯ−１、ＺＯ−２及びヒ
トｐ５５等が知られており、また、ラット由来のラット
ＳＡＰ−９７、ラットＰＳＤ−９５、ラットＳＡＰ−９
０等も係るｄｌｇファミリー分子をコードする遺伝子と
ともに知られている。

【０００５】前記ヒト由来のｄｌｇ１（ｈｄｌｇ１）
は、protein 4.1 と結合すること、また、ｈｄｌｇ１分
子は細胞膜上に存在していることが知られており、さら
に、前記ｈｄｌｇ１をコードするｈｄｌｇ１遺伝子は約
１００ｋｄの蛋白質をコードする遺伝子であり、ヒトの
組織中のうち、リンパ球、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、
筋肉、腎臓で発現していることが知られている（Ｌｅｕ
等、Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 91巻, 9818〜9822頁,
1994年）。また、ショウジョウバエ由来のｄｌｇ遺伝
子は、その欠失により、成虫盤新生の過増殖から最終的
には神経芽細胞腫を形成することが知られている（Wood
ら,Cell, 66巻, 451〜464ページ, 1991年）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記説明し
た従来知られているｄｌｇ分子の特性に鑑みて、細胞の
過増殖を抑える働きをする分子、即ち一種の癌抑制因子
としての働きをする分子である可能性があり、ヒトにお
いても、さらに多くのｄｌｇファミリー分子が存在する
との考えの下に、ヒト由来の新規なｄｌｇファミリー分
子を提供することを目的とするものである。

【０００７】さらに、本発明らは、前記新規なヒト由来
のｄｌｇファミリー分子をコードするポリヌクレオチド
（ＤＮＡ又はＤＮＡ）を提供することを目的とする。

【０００８】また本発明は、ｄｌｇファミリー分子の機
能解明に有用な、新規なヒト由来のｄｌｇファミリー分
子に対する抗体を提供することを目的とする。

【０００９】また、本発明は、検体中のｄｌｇ遺伝子を
検出するためのポリヌクレオチドプローブを提供するこ
とを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するべく鋭意研究を行った結果、ヒトの前立腺の
ｃＤＮＡライブラリーより新規なｄｌｇファミリー分子
をコードする遺伝子を見出すことに成功し、本発明を完
成するに至った。

【００１１】本発明者らはまた、この新規なｄｌｇファ
ミリー分子をコードする遺伝子によりコードされるｄｌ
ｇファミリー分子の単離、同定に成功した。以下、本発
明で得られた新規なｄｌｇファミリー分子をＰ−ｄｌｇ
と命名し、該Ｐ−ｄｌｇ分子をコードする遺伝子をＰ−
ｄｌｇ遺伝子と命名する。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下に本発明を発明の実施の形態
に即してさらに詳しくに説明する。ここで、遺伝子につ
いては、天然に存在するｍＲＮＡからの逆転写により得
たＤＮＡ（該ＤＮＡを増幅して得られるＤＮＡを含む）
を表す場合、その意味を明確するときはｃＤＮＡと称す
る。

【００１３】より詳しくは、以下の操作により、ヒト由
来の新規ｄｌｇファミリー分子及び、それをコードする
ポリヌクレオチドを見出すことが可能である。

【００１４】すなわち、ショウジョウバエのｄｌｇファ
ミリー分子をコードする遺伝子情報を基に、ＥＳＴ デ
ータベースに基づき、それにホモロジーのある塩基配列
を検索して見出すことが可能である。

【００１５】次いで、係る塩基配列情報に基づいて５’
伸張用プライマーを合成し、これを用いて、ヒトの胎児
脳のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法によ
り、ｃＤＮＡフラグメントを得る。

【００１６】さらに、得られた断片の塩基配列情報に基
づき、再びＥＳＴデータベースに基づいて、ホモロジー
のある塩基配列を検索して見出すことが可能である。

【００１７】次いで、これらの塩基配列情報をつなぎ合
わせ、更にそのつなぎあわせた塩基配列の端部分の塩基
配列情報に基づき、係る塩基配列からなるＤＮＡ断片を
増幅するためのプライマーを合成する。

【００１８】該プライマーを用いて再度、ヒトの胎児脳
のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法によ
り、前記プライマーを端にもつ断片の増幅産物を得る。

【００１９】さらに、該増幅産物を強く発現している組
織を同定し、同定された組織のｃＤＮＡライブラリーを
鋳型として、該増幅産物の塩基配列情報に基づいて合成
された５’伸張用プライマーを用いてＤＮＡ断片の５’
側に向けてのＰＣＲ法による伸張反応を行う。

【００２０】上記の操作を全長のｃＤＮＡの塩基配列情
報を取得するまで必要に応じ繰り返し、全長ｃＤＮＡを
取得する。さらに、取得したｃＤＮＡの塩基配列情報か
ら、ＰＣＲ法により全長のｃＤＮＡフラグメントを取得
することが可能である。

【００２１】上記の方法により、本発明に係るヒト由来
の新規なｄｌｇ遺伝子（Ｐ−ｄｌｇ遺伝子）を取得し、
係る遺伝子の塩基配列情報からその遺伝子がコードする
ｄｌｇファミリー分子（すなわち、Ｐ−ｄｌｇ分子）の
アミノ酸配列を同定することが可能となる。

【００２２】また本発明は、前記のｄｌｇファミリー分
子をコードする遺伝子のアンチセンス鎖の塩基配列を含
むものである。さらに、本発明は、前記のポリヌクレオ
チドのうちの、塩基配列の長さが１５塩基以上である部
分のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド
及びその誘導体を含むものである。さらに、本発明は、
前記のポリヌクレオチドのうちの、塩基配列の長さが１
５塩基〜３０塩基である部分のポリヌクレオチドのアン
チセンスポリヌクレオチド及びその誘導体を含むもので
ある。

【００２３】上記得られたＰ−ｄｌｇ遺伝子の断片を用
いたノーザンブロットにより、Ｐ−ｄｌｇ遺伝子が発現
している組織（例えば前立腺、胎盤、甲状腺、脊髄、気
管及び副腎）を見いだすことが可能である。

【００２４】さらに、上記得られたＰ−ｄｌｇに特異的
なアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを調製し、それ
に対する抗体（以下、抗Ｐ−ｄｌｇ抗体とする）。係る
抗体を用いることにより、Ｐ−ｄｌｇの発現等の機能解
明、シグナル伝達系の解明等に使用可能とする。

【００２５】さらに、Ｐ−ｄｌｇ遺伝子の実験用、又は
診断用のプローブを提供し、診断薬に使用可能とする。

【００２６】本発明に係るヒト由来の新規ｄｌｇファミ
リー分子は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
を有するものであるが、このアミノ酸配列に限定される
ことはなく、その１又は２以上のアミノ酸を置換し、欠
失又は付加したものであって、かつLys-Glu-Gln-Arg-As
p-Pro-Ile-Tyr-Leu-Arg-Asp-Lys-Val-Thr-Gln-Arg-His-
Ser-Lys-Gluに対する抗体に反応する機能を有するもの
である。

【００２７】また本発明に係るヒト由来の新規ｄｌｇフ
ァミリー分子をコードするポリヌクレオチドの具体例
は、配列表の配列番号の２に記載の塩基配列からなるポ
リヌクレオチドであるが、これに限定されることはな
い。。

【００２８】自然の変異により又は人工の変異（例え
ば、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）
１５．１〜１５．１１３頁を参照）によりポリヌクレオ
チドの構造の一部を、該ポリヌクレオチドがコードする
ポリペプチドの主たる機能である活性に変化を与えるこ
となく変化させることが可能であり、本発明に係るＰ−
ｄｌｇも、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の
一又は複数のアミノ酸に、該ポリペプチドの主たる上記
機能を変化させずに、置換、欠失又は付加を与えること
が可能である。これらを本発明ではＰ−ｄｌｇ変異体と
いい、本発明で言うところのＰ−ｄｌｇに含まれる。

【００２９】また、遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレ
オチドから生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を変
えることなく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なく
とも一部の塩基を他の種類の塩基に置換することができ
る。したがって、本発明のＰ−ｄｌｇ及びＰ−ｄｌｇ変
異体をコードするポリヌクレオチドとは、該Ｐ−ｄｌｇ
又はＰ−ｄｌｇ変異体のポリペプチドをコードしうる全
ての縮重のパターンを含むものである。

【００３０】配列表の配列番号２に示される塩基配列
は、本発明に係る天然に存在するＰ−ｄｌｇ遺伝子の塩
基配列である。

【００３１】配列表の配列番号２の塩基配列のうちの連
続する１２塩基以上を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡライブラ
リー等から検体中のｄｌｇ遺伝子をスクリーニングする
ためのプローブとして使用可能である。このとき、ＧＣ
含有率が３０ないし７０％のものが好適に使用可能であ
る。また、連続する１５塩基以上であるＤＮＡ又は該Ｄ
ＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドが特に好ま
しい。プローブとして用いる該ポリヌクレオチドは誘導
体であってもよい。通常、上記の塩基数以上の配列は、
特異性のある配列であると認識されている。該プローブ
を用いたスクリーニングにおいて使用するｃＤＮＡライ
ブラリーとしては、ヒト由来のｍＲＮＡから作製された
ものが好ましく使用できる。これらのｃＤＮＡライブラ
リーからランダムサンプリングにより選択された一群の
ｃＤＮＡを検索の試料とすることができる。また、市販
のものでも使用可能である。

【００３２】本発明のＰ−ｄｌｇ遺伝子及びその変異体
の塩基配列の決定方法は、特に制限されない。例えば、
Ｔａｑサイクルシークエンシング法（『Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ｖｏｌ．７』（１９８９年）４９４〜４
９９頁に記載の方法は好ましく使用可能である。

【００３３】本発明のＰ−ｄｌｇ遺伝子の変異体の塩基
配列から翻訳されるアミノ酸配列及び本発明のＰ−ｄｌ
ｇ変異体のアミノ酸配列と、Ｐ−ｄｌｇのアミノ酸配列
との比較方法については、特に制限がない。例えば、市
販のプログラム（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）
−ＣＤプログラムＶｅｒ．３４（ソフトウェアディベロ
プメント社製）を用いて可能である。

【００３４】プラスミドを大腸菌等の適当な宿主に導入
して、形質転換体を得ることは公知の方法により可能で
ある。例えば、『細胞工学プロトコール』（秀潤社、１
９９１年）１０５〜１０７頁に記載の方法により可能で
ある。得られた形質転換体を培養し、遺伝子の増幅、蛋
白質の発現を行いＰ−ｄｌｇを製造することが可能であ
る。次に培養物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、
透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行うことによ
り、本発明のＰ−ｄｌｇ及びＰ−ｄｌｇ変異体を精製す
ることが可能である。

【００３５】形質転換体の培養については、各種の教科
書があり、例えば、『微生物実験法』（社団法人日本生
化学会編、東京化学同人、１９９２年）に記載の方法で
行うことが可能である。本発明に記載の塩基配列に基づ
いてＰ−ｄｌｇを発現させることも、公知の方法により
可能である。このとき、宿主としては、大腸菌等の細
菌、酵母、動物細胞のいずれも使用可能であるが、特に
は動物細胞が好ましい。細胞に遺伝子を導入するには、
リポソーム法、エレクトロポーレーション法等を用いる
ことができる。特に、ＤＥＡＥ−デキストラン法（ファ
ルマシア社製）を用いることが好ましい。

【００３６】得られた培養物からＰ−ｄｌｇを精製する
精製方法には、免疫沈降法、塩析法、限外濾過法、等電
点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマ
トグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィ
ー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィ
ー法及び逆相クロマトグラフィー等があり、適宜選択し
て行えばよい。

【００３７】また、製造段階において、製造するＰ−ｄ
ｌｇは、他のポリペプチドとの融合ペプチドとして形質
転換体に生産させてもよい。この場合は、精製工程にお
いて、ブロムシアン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵
素で処理して、該Ｐ−ｄｌｇを切り出す操作が必要にな
る。

【００３８】本発明のＰ−ｄｌｇアンチセンスポリヌク
レオチドには、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオチド
が複数結合したものが、天然には存在しないものを含め
て全て含まれる。その代表的なものは、ＤＮＡとｍＲＮ
Ａである。

【００３９】また、本発明のアンチセンスポリヌクレオ
チド誘導体には、その立体構造や機能がポリヌクレオチ
ドと類似するものが全て含まれる。例えば、ポリヌクレ
オチドの３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合し
たものやポリヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なく
ともいずれか一部において、置換や欠失や付加の修飾が
生じた物質、天然に存在しないような塩基、糖、リン酸
を有するものや、糖−リン酸骨格以外の骨格を有するも
のである。

【００４０】該アンチセンスポリヌクレオチド及びその
誘導体は、Ｐ−ｄｌｇ又はＰ−ｄｌｇ変異体をコードす
るポリヌクレオチドのいかなる部分にハイブリダイズす
るものであってもよい。なお、Ｐ−ｄｌｇ又はＰ−ｄｌ
ｇ変異体の全部又は一部をコードするｍＲＮＡの一部に
対して相補的な塩基配列を有し、該ｍＲＮＡにハイブリ
ダイズするものが好ましい。

【００４１】また、該アンチセンスポリヌクレオチド及
びその誘導体は、組織や細胞におけるＰ−ｄｌｇ又はＰ
−ｄｌｇ変異体をコードするポリヌクレオチドの存在や
その発現状況を調べるための研究用ポリヌクレオチドプ
ローブとして、使用可能である。また、診断用ポリヌク
レオチドプローブとしても使用可能である。なお、プロ
ーブとしては、実用上１２塩基以上且つＧＣ含有率が３
０ないし７０％であるものが好ましい。一般的には、１
５塩基以上の塩基を含む塩基配列であれば、特異性のあ
る配列であると考えられている（「蛋白質、酵素、核
酸」３８巻７５４−７６５頁）。従って、１５塩基以上
且つＧＣ含有率が３０ないし７０％であるものが、特に
好ましい。

【００４２】また、該アンチセンスポリヌクレオチド及
びその誘導体を使用して、Ｐ−ｄｌｇ又はＰ−ｄｌｇ変
異体の発現を調節することが可能である。これらはＰ−
ｄｌｇもしくはＰ−ｄｌｇ変異体をコードする遺伝子も
しくはｍＲＮＡにハイブリダイズしてＰ−ｄｌｇ又はＰ
−ｄｌｇ変異体の発現を抑制することが期待されるの
で、Ｐ−ｄｌｇ又はＰ−ｄｌｇ変異体が関与する機能の
異常に基づく疾患の治療薬として使用可能である。すな
わち、該アンチセンスポリヌクレオチドやその誘導体よ
りアンチセンス医薬品を開発することが可能である。

【００４３】ポリペプチドをコードするＤＮＡやｍＲＮ
Ａの相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを使用し
て、該ポリペプチドの発現を調節する方法は、アンチセ
ンス法と呼ばれており、現在多くの研究者によって研究
が進められている技術である。相補的な配列を有するポ
リヌクレオチドは、遺伝子からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの
転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプ
ロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段
階のいずれかで、遺伝情報を担うＤＮＡ又はｍＲＮＡに
結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えてポ
リペプチドの発現を調節すると考えられている。

【００４４】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及
びアンチセンスポリヌクレオチド誘導体も、Ｐ−ｄｌｇ
遺伝子若しくはＰ−ｄｌｇに対するｍＲＮＡに相補的な
塩基配列であって１２塩基以上からなる塩基配列を含む
ものが好ましく、１５塩基以上のものが特に好ましい。

【００４５】一方、ポリヌクレオチドを細胞内に取り込
ませるには、その長さはあまりに長すぎても不適当であ
る。本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘
導体は、いかなる長さのものであってもよいが、本発明
のアンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポ
リヌクレオチド誘導体を細胞内に取り込ませ、Ｐ−ｄｌ
ｇの発現を調節させることを考慮すると、前記アンチセ
ンスポリヌクレオチド及びこれらアンチセンスポリヌク
レオチドの誘導体はＰ−ｄｌｇ遺伝子若しくはＰ−ｄｌ
ｇに対するｍＲＮＡに相補的な１２塩基以上３０塩基以
下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好まし
くは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数から成る塩基配
列を有するものが好ましい。

【００４６】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及
びアンチセンスポリヌクレオチド誘導体においても、公
知のアンチセンス技術を用いて、ポリヌクレオチドの医
薬品としての効果を高めることを目的として様々な誘導
体、即ち、目的のＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選
択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性の
高い様々なポリヌクレオチド誘導体が得られうる。

【００４７】ハイブリダイズのし易さの点では、一般的
には、ステムループを形成している領域の塩基配列に相
補的な塩基配列を持つポリヌクレオチド又はポリヌクレ
オチド誘導体を設計するとよいとされている（『臨床免
疫 ２５巻』１２００〜１２０６頁、１９９３年）。本
発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体
は、必要に応じ、ステムループを形成することが可能で
ある。

【００４８】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる（『癌と化
学療法 ２０巻１３号』１８９９〜１９０７頁）。した
がって、本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチ
ド誘導体であって、Ｐ−ｄｌｇ又はＰ−ｄｌｇ変異体を
コードする遺伝子又は該遺伝子に対するｍＲＮＡの翻訳
開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部
位、スプライス部位の相補的な配列を含むものは、高い
発現抑制効果が期待される。

【００４９】現在一般に知られている誘導体は、ヌクレ
アーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なく
とも１つが高められた誘導体であることが好ましく、特
に好ましくは、当該ポリヌクレオチド誘導体は、フォス
フォロチオエート結合（「癌と化学療法」２０巻、１３
号、1899-1907頁、1993年参照）を骨格構造として有す
る誘導体であることが示されている。本発明のポリヌク
レオチド及びその誘導体についても、これらの機能又は
構造を有する誘導体が含まれる。

【００５０】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド誘
導体の製造方法については、例えば、『ｉｎ Ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ』（Michael J. GAIT, p290-299, CRC出
版, フロリダ,1993年）に記載の方法を用いることが可
能である。

【００５１】例えば、天然型のＤＮＡやＲＮＡであれ
ば、化学合成機を使用して合成したり、Ｐ−ｄｌｇ又は
Ｐ−ｄｌｇ変異体をコードする遺伝子を鋳型とするＰＣ
Ｒ法により本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを得
ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフ
ォスフォロチオエート型等、誘導体の中には、化学合成
機（例えば、パーキンエルマージャパン社製３９４型）
を使用して合成できるものもある。この場合には、化学
合成機に添付されている説明書にしたがって操作を行
い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用
いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、目的の
アンチセンスポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌ
クレオチド誘導体を得ることができる。

【００５２】本発明の抗Ｐ−ｄｌｇ抗体とは、本発明の
Ｐ−ｄｌｇ又はその変異体と反応する限り、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも含む。また、
その活性フラグメント及びその活性フラグメントを含む
キメラ抗体も含まれる。

【００５３】抗体、すなわち免疫グロブリンは、Ｈ鎖と
Ｌ鎖を持ち、物理化学的性質や免疫学的性質から５つの
クラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、）
に分けられる。このうち、ＩｇＡ、ＩｇＧはＨ鎖のタイ
プによってさらにサブクラスに分けられる。本発明の新
規抗体は、これらの全てのクラス、サブクラスに属する
ものを含む。

【００５４】さらに、本発明の抗体は、必ずしも抗体分
子全体を用いる必要はなく、活性を有する限り、分子の
一部（活性フラグメント）を用いることができる。活性
フラグメントとしては、具体的にはＦ（ａｂ’）2 、Ｆ
ａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、組み換えＦｖ体及び一本鎖Ｆｖ
を挙げることができる。例えば、ペプシンで分解すると
Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ’が得られ、パパインで分解する
とＦａｂ、Ｆｃが得られる。

【００５５】これらの活性フラグメントは、単独でも用
いられるが、必要に応じて、アルブミン、ポリエチレン
グリコール等の物質と結合させ、新たな複合物として用
いることができる。このような複合物は、一般に、生体
内では、長時間分解されずにその効果を最大限まで発揮
することが多い。活性フラグメントに、アルブミン、ポ
リエチレングリコール等の物質を付加する方法は、例え
ば、『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ』（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）ｐ．７７−８
１、ｐ１２９−１３７に記載されている。一般的には、
ＳＰＤＰ（ファルマシア社製）、ＳＭＰＢ（ピアス社
製）、ＥＭＣＳ（ドータイト社製）等の２価反応性試薬
を用いれば、活性フラグメントをアルブミン等と容易に
結合させることができる。

【００５６】本発明の抗Ｐ−ｄｌｇ抗体は、公知の方法
によって得ることが可能である。例えば、『免疫実験操
作法』（日本免疫学会編、日本免疫学会発行）を参考に
して得ることができる。免疫抗原としては本発明のＰ−
ｄｌｇの一部、すなわち配列表の配列番号１に記載のア
ミノ酸配列のうちの連続する８個以上のアミノ酸からな
るポリペプチドであればよい。また、それが抗体の作製
に使用しうる精製度のものであれば、該Ｐ−ｄｌｇが得
られた方法は問わない。

【００５７】免疫抗原が、８ないし約２０個のアミノ酸
からなるポリペプチドである場合には、それをキーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結
合させて抗原として使用すればよい。

【００５８】該免疫抗原を免疫する動物はヒト以外のい
ずれでもよく、通常当業者で使用される動物から目的の
抗体を産生し得る動物種を選択して使用することが好ま
しい。

【００５９】ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を
精製することによって得られる。精製は、塩析、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等の方法を組み合わせて行えばよい。

【００６０】モノクローナル抗体は、通常のハイブリド
ーマを作製する方法によって融合細胞を得た後、該細胞
に抗体を産生させることにより得られる。細胞融合に
は、ポリエチレングリコール、センダイウィルス、電気
パルス等を用いる手法が使用可能である。

【００６１】また、上記以外に、遺伝子工学的な方法を
用いても該モノクローナル抗体が得られうる。例えば、
本発明のＰ−ｄｌｇ又はその一部で免疫した動物の脾細
胞、リンパ球又は該モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する。次に、該ｃＤＮＡライブラ
リーにより抗体を発現させる。抗原と反応する抗体を産
生するクローンをスクリーニングによりｃＤＮＡライブ
ラリーから得、得られたクローンを培養し、培養混合物
から目的とする抗体を、塩析、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を
組み合わせて精製することができる。

【００６２】本発明の抗体は、前立腺、胎盤組織、甲状
腺、脊髄、副腎及び気管組織の細胞に存在する本発明の
Ｐ−ｄｌｇ、Ｐ−ｄｌｇ変異体又はそれらの一部の検出
に用いることができる。また、本発明のＰ−ｄｌｇ、Ｐ
−ｄｌｇ変異体又はそれらの一部を精製するために使用
する抗体カラムの作製、各分画中の該Ｐ−ｄｌｇ、Ｐ−
ｄｌｇ変異体又はその一部の検出のために用いることが
できる。

【００６３】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳述す
るが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

【００６４】（実施例１）Ｐ−ｄｌｇの同定 （１）データベース検索(I)（インターネット、例え
ば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） ショウジョウバエのｄｌｇ１分子をコードする遺伝子の
情報を基に、インターネット上の遺伝子データベースに
アクセスし、コンピュータを用いてホモロジー・サーチ
を行った。具体的には、染色体１０番目の位置に存在す
るＥＳＴをUnigen データーベースから調べたところ、H
29224というＥＳＴのフラグメントが見出された。この
フラグメントについてさらに、解析したところ同じクロ
ーン由来のＥＳＴフラグメントがH29225であることが判
明した。この２つのＥＳＴについて、別のデーターベー
ス、ＴＩＧＲデータベースで検索したところ以下の配列
表で示す、THC79238がこれらの２つのＥＳＴをカバーす
るフラグメントであることが判明した。

【００６５】 TCCAGGAGGC TCAGCATGTC TGAAGTCAAA GATGACAATA GCGCCACAAA GACGCTGTCA GCGGCTGCAC GCCGGTSCTT TTTTCGGAGG AAACACAAGC ACAAACGCAG CGGGTCCAAG GACGGGAAAG ACCTGCTCGC CTTGGATGCC TTTTCCAGTG ACTCCATTCC ACTCTTTGAA GATTCGGTGA GCCTGGCCTA TCAGCGGGTC CAGAAGGTGG ACTGCACCGC TCTGAGGCCT GTCCTGATTC TGGGGCCTTT GCTGGACGTG GTGAAGGAGA TGCTGGTGAA TGAGGCTCCT GGCAAGTTCT GCAGATGTCC CCTTGAGGTG ATGAAGGCCT CCCAGCAGGC CATTGAGCGG GGTGTCAAAG ATTGCCTGTT TGTCGACTAT AAGCGGAGAA GCGGCCATTT CGATGTGACC ACTGTGGCGT CAATAWAGGA GATCACAGAA AAGAACCGAC ACTGCCTCCT GGACATTGCT CCGCACGCTA TTGAGCGGCT CCACCACATG CACATCTACC CCATTGTCAT CTTCATCCAC TACAAGAGCG CCAAGCACAT CAAGGAGCAG AGAGACCCCA TCTACCTGAG GGACAAGGTG ACTCAGAGGC ATTCCAAAGA GCARTTTGAG GCGGCGCAGA AGCTTGAGCA GGAGTACAGC AGGTACTTCA CAGGGGTCAT CCAGGGAGGA GCCCTGTCAA GCATTTGCAC TCAGATCTTG GCAATGGTCA ATCAAGAACA AAATAAAGTC CTGTGGATTC CAGCCTGCCC GCTCTAGGAG AATGCTGTGC TGTGGATGAC TGCAGCTGGC CGCCTGAGGG GACACCAGAC TCAGCTCTTT TCTAGCGACT GAAAGTAGAA GTCTGTCCGT CTATGAACAT GCGGGGGAAG GATCCGGAAC CAGGACCCAG AAGCACCTCC TTTGTAGACA GAGGGCCACG GCTGCGTGCG ATCCAGGCCC AGGMCCACAC ACTCTGCCCG TGTCACACGT GTGCTTTAAC ACAAAACAGA TAACACTAAA GACGGGTTCA GCACCCACCT TTCTTTAGCC AGCTGATCAG AGATGCTGCA AAGAGAACCT TTCGGATCAC TCGTTTACAA GCCTTTTCTA AGTATTTGGT GGTTTATGTT TACTTGAACG GCTCCATGTT GCCGGTGCCC AGCCCCTGTC CCCTCTGTCA ACCCCCTGTC GCTTTGGTGT TGGTTTCGTT CCCGTCTTCA GCAAAACGAC CTTGGAACCT CAATGGGGGC TGCTTTGCTT TGGGAGGTTC TTGTTGGTGG GACCAGAGCT TTGACAAACC TCCTGCTCCT TGGTGGGCAC CTCTCCTGGG AAGGACGTTC ACAACTCCAG GGTGCTTCAG AATGCCTGTG GAACMAGGAA CCAGTGGCCT TTGGATTTTT TCCTCCCACA ATGGGGGAAG GTGA この配列を基に、ヒト由来の新規ｄｌｇファミリー分子
の取得を試みた。

【００６６】（２）５’伸長反応(I) 前記のデータベースより取得したHTC79238の配列を詳細
に調べたところ終始コドンがあることが判明した。そこ
で、この配列をもとにして、全長のｃＤＮＡを取得する
ために、遺伝子の翻訳開始領域があると考えられる５’
側への伸長反応をＰＣＲ操作を用いて行った。

【００６７】（Ｉ）ブライマーの合成 ＡＳ３プライマー（５’−ＧＣＡＴＣＣＡＡＧＧＣＧＡ
ＧＣＡＧＧＴＣＴＴＴ−３’）、ＡＳ２プライマー
（５’−ＴＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＴＴ
ＴＧＴ−３’）及びＴ７プライマー（５’−ＡＡＴＡＣ
ＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）を設計し、ＤＮＡ合
成機（ＡＢＩモデル 392）にて合成した。合成したＤＮ
Ａプライマーは蒸留水中に、20 pmol／μｌになるよう
に溶解した。これをＰＣＲブライマーとして用い、以下
のＰＣＲ操作を行った。

【００６８】（II）ＰＣＲ操作 最初に、ＡＳ３プライマーを用いて一方向のみへのＰＣ
Ｒ操作（以下、シングルＰＣＲ操作という場合あり）を
行った。

【００６９】ＰＣＲ操作は、ヒト胎児脳のｃＤＮＡ（１
μｇ／μl）２μｌ、 ｄＮＴＰ混合液（各ＮＴＰが２０
pmol／μlにて蒸留水中に溶解されている）１ μｌ、Ａ
Ｓ３プライマー（20 pmol／μl）１μｌ、１０倍濃度の
ＰＣＲ緩衝液（400 mM Tris-HCl(pH 8.3)、1 M KCl 、1
00 mM MgCl₂、100 mM DTT）１．５μｌ、蒸留水 ９μ
ｌ及びＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．
５μｌ（合計１５μｌ）の組成から成る液を試験管に入
れ、その上にミネラルオイル１５μｌを重層し、９４℃
で５分間放置した。その後、「６０℃で３０秒間、続い
て７２℃で１．５分間、続いて９４℃で３０秒間のサイ
クル」を５０回繰り返して反応を行った。次いで５５℃
で２分間、最後に７２℃で１０分間反応させて、断片の
伸長反応を行いＰＣＲ操作を完了した。

【００７０】その後、上記で得たＰＣＲ産物を鋳型とし
て、２度目のＰＣＲ操作を行った。２度目のＰＣＲ操作
は、上記で得たＰＣＲ産物（１μｇ／μl）５μｌ、 ｄ
ＮＴＰ混合液（各ＮＴＰが２０pmol／μlにて蒸留水中
に溶解されている）１ μｌ、ＡＳ２プライマー（20 pm
ol／μl）１μｌ、Ｔ７プライマー（20 pmol／μl）１
μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液（400 mM Tris-HCl(pH
8.3)、1 M KCl 、100mM MgCl₂、100 mM DTT）２μｌ、
蒸留水 ９．５μｌ及びＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉ
ｔｓ／μｌ）０．５μｌ（合計２０μｌ）の組成から成
る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル２０μｌ
を重層し、９４℃で５分間放置した。その後、「６０℃
で３０秒間、続いて７２℃で１分間、続いて９４℃で３
０秒間のサイクル」を４０回繰り返して反応を行った。
次いで５５℃で２分間、最後に７２℃で１０分間反応さ
せて、断片の伸長反応を行いＰＣＲ操作を完了した。

【００７１】（III）ＤＮＡ塩基配列決定 上記で得た５’側伸長反応による約0.6kbpのＤＮＡ断片
（以下フラグメントＡという）についてＴ７プライマー
を用いてＤｙｅターミネーター法によりダイレクトＤＮ
Ａシークエンスを行った。すなわち、上記得たＰＣＲ産
物をミニゲル電気泳動（0.75％アガロースゲル）させ
て、Ｐ−ｄｌｇのフラグメントのバンドをゲルから切出
した。GeneClean（Bio101社製）でＰＣＲ産物を回収し
てミニゲル電気泳動（0.75％アガロースゲル）でバンド
をチエックした。

【００７２】プラスミドＮＤＡを１μｌとり、99μｌの
ＴＥにて希釈した。A260を測定、ＤＮＡ値を計算した(A
260、1.0＝50μｌ／ml）。A260より、ＤＮＡが１μｌ／
μｌとなるようにＴＥにて希釈した。ダイターミネータ
ー法により、DNAシーケンスを行った（ＡＢＩモデル３
７３Ａ）。

【００７３】』 （３）データベース検索 （２）で得られたＤＮＡ配列をもとにして、ＥＳＴデー
タベース（ＮＣＢＩのサイト；[http://www.ncbi.nlm.n
ih.gov./index html]）（ＥＳＴデータベースとは、ｍ
ＲＮＡの断片を取得してその配列決定を行った結果得ら
れた配列をデータベースとして登録してあるものであ
る）でホモロジー検索を行った。その結果、上記の配列
と一部一致する、ＴＨＣ９０５１３という配列が確認さ
れた。このＴＨＣ９０５１３、上記で得られたフラグメ
ントＡ及びＴＨＣ７９２３８の３つの配列を５’から
３’へとコンピュータ上で結合させた。次いで、３つの
配列の結合により得られたＤＮＡ配列を、ＥＳＴデータ
ベースを用いて更に検索すると、一部において一致する
配列としてＷ２６２８１が確認された。

【００７４】（４）５’側伸張反応(II) (I)コンピュータ上での伸張 Ｗ２６２８１及び上記の３種の配列から得られた配列を
コンピュータ上で、５’から３’へと結合し、約2.4kbp
のＤＮＡ断片の配列を得た。

【００７５】その後、上記操作により得たＤＮＡ断片を
もとに、胎児脳のｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲ
操作により更に５’側への伸長反応を行った。

【００７６】（II）ｃＤＮＡ断片の取得 上記操作（４）(I)により得られた約2.4kbpのＤＮＡ断
片の５’末端領域はＷ２６２８１のフラグメントに相当
し、一方３’末端領域はＴＨＣ７９２３８のフラグメン
トに相当する。Ｗ２６２８１のフラグメントに相当する
部分にセンスプライマー（５’−ＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣ
ＣＣＡＧＧＡＴＴＣＧＧＡＡＧ−３’）を設定し、一方
ＴＨＣ７９２３８のフラグメントに相当する部分にアン
チセンスプライマー（５’−ＣＧＴＧＡＡＣＴＣＣＴＣ
ＡＧＧＧＣＧＧＴＡＣＴＧ−３’）を設定し、これを用
いて、ヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし
て、再度以下の条件にてＰＣＲ操作を行い、上記（４）
(I)で得られた約2.4kbpの配列に対応する部分のｃＤＮ
Ａ断片を得た（以下フラグメントＢという）。

【００７７】 プライマーの合成 センスプライマー及びアンチセンスプライマーはＤＮＡ
合成機（ＡＢＩモデル 392）にて合成した。合成したＤ
ＮＡプライマーは蒸留水中に、20 pmol／μｌになるよ
うに溶解した。これをＰＣＲブライマーとして用い、以
下のＰＣＲ操作を行った。

【００７８】 ＰＣＲ操作 ＰＣＲ操作は、ヒト胎児脳のｃＤＮＡ（１μｇ／μl）
５μｌ、 ｄＮＴＰ混合液（各ＮＴＰが２０pmol／μlに
て蒸留水中に溶解されている）１ μｌ、センスプライ
マー（20 pmol／μl）１μｌ、アンチセンスプライマー
（20 pmol／μl）１μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液
（400 mM Tris-HCl(pH 8.3)、1 M KCl 、100 mM MgC
l₂、100 mM DTT)２μｌ、蒸留水 ９．５μｌ及びＴａ
ｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌ（合
計２０μｌ）の組成から成る液を試験管に入れ、その上
にミネラルオイル２０μｌを重層し、９４℃で５分間放
置した。その後、「６０℃で３０秒間、続いて７２℃で
１分間、続いて９４℃で３０秒間のサイクル」を４０回
繰り返して反応を行った。次いで５５℃で２分間、最後
に７２℃で１０分間反応させてＰＣＲ操作を完了した。

【００７９】(III)ミニゲル電気泳動 上記の反応後、ＰＣＲ生成物についてミニゲル電気泳動
（0.75％アガロースゲル）を行なった。その結果、約2.
4kbpのバンドが観察された。このバンドを新規なｄｌｇ
ファミリー分子をコードする遺伝子の一部と考えた。

【００８０】（５）ノーザン・ブロットによる解析 上記操作により得られたＤＮＡ断片がどのような組織に
おいて発現しているかを以下の様にして検討した。

【００８１】ヒトの各組織のポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）及びヒトの各種細胞株のポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）それぞれについて、各２μｇをメンブレンにブロッ
トしたキット（Human Multiple Tissue Northern Blot
I,II及びHuman Cancer Cell LineMultiple Tissue Nort
hern Blot）をクローンテック社より購入した。

【００８２】（４）で得られたフラグメントＢのＤＮＡ
を以下の通りにして、このメンブレンにハイブリダイズ
させた。まず、上記ＤＮＡの断片を、ランダムプライム
ド・ラベリングキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて、
³²Ｐ−ＣＴＰで標識した。次いで、標識したｃＤＮＡ
を、ハイストリンジェンシーの条件下で、Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual 2nd Edition, p.7.39〜7.
52の記載に従って、メンブレンにハイブリダイズさせ
た。

【００８３】各組織についての結果の写真を、図１〜３
に示す。写真より、Ｐ−ｄｌｇが、前立腺、胎盤、甲状
腺、脊髄、気管及び副腎において発現していることが判
った。

【００８４】各種細胞についての結果の写真を図４に示
す。写真より、Ｈｅｌａ（ヒト子宮けいガン）に発現が
認められた。

【００８５】上記のように特に前立腺で、高い発現が認
められた。そこで、ヒト前立腺のｃＤＮＡライブラリー
を鋳型として用いて、後述の操作により完全長のｃＤＮ
Ａの取得を試みた。

【００８６】（６）５’側伸長反応(III) (I) プライマーの合成 ＡＳ４プライマー（５’−ＣＧＴＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡ
ＧＧＧＣＧＧＴＡＣＴＧ−３’）、ＡＳ５プライマー
（５’−ＣＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＣＧＣＣＡＧＣＣＣＴ
−３’）及びＴ３プライマー（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣ
ＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’）を設計し、ＤＮＡ合成機
（ＡＢＩモデル 392）にて合成した。合成したＤＮＡプ
ライマーは蒸留水中に、20 pmol／μｌになるように溶
解した。これをＰＣＲブライマーとして用い、以下のＰ
ＣＲ操作を行った。

【００８７】(II)ＰＣＲ操作 ＡＳ４プライマーを用いてシングルＰＣＲ操作を行っ
た。

【００８８】ＰＣＲ操作は、ヒト前立腺のｃＤＮＡ（ク
ローンテック社より購入（１μｇ／μl）２μｌ、 ｄＮ
ＴＰ混合液（各ＮＴＰが２０pmol／μlにて蒸留水中に
溶解されている）１ μｌ、ＡＳ４プライマー（20 pmol
／μl）１μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液（400 mM Tr
is-HCl(pH 8.3)、1 M KCl 、100 mM MgCl₂、100 mMDTT)
１．５μｌ、蒸留水 ９μｌ及びＴａｑポリメラーゼ
（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌ（合計１５μｌ）の
組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイ
ル１５μｌを重層し、９４℃で５分間放置した。その
後、「６０℃で３０秒間、続いて７２℃で１．５分間、
続いて９４℃で３０秒間のサイクル」を５０回繰り返し
て反応を行った。次いで５５℃で２分間、最後に７２℃
で１０分間反応させて、断片の伸長反応を行いＰＣＲ操
作を完了した。

【００８９】(III)ＰＣＲ操作 その後、上記で得たＰＣＲ産物を鋳型として、３’部分
のプライマーとしてＡＳ５プライマー（５’−ＣＴＴＣ
ＡＧＧＣＧＧＡＣＧＣＣＡＧＣＣＣＴ−３’）及び５’
部分のプライマーとしてＴ３プライマー（５’−ＡＴＴ
ＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’）を用いて２度目
のＰＣＲ操作を行った。

【００９０】２度目のＰＣＲ操作は、上記で得たＰＣＲ
産物５μｌ、 ｄＮＴＰ混合液（各ＮＴＰが２０pmol／
μlにて蒸留水中に溶解されている）１ μｌ、ＡＳ５プ
ライマー（20 pmol／μl）１μｌ、Ｔ３プライマー（20
pmol／μl）１ μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液２μ
ｌ、蒸留水 ９．５μｌ及びＴａｑポリメラーゼ（５ｕ
ｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌ（合計２０μｌ）の組成か
ら成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル２０
μｌを重層し、９４℃で５分間放置した。その後、「６
０℃で３０秒間、続いて７２℃で１分間、続いて９４℃
で３０秒間のサイクル」を４０回繰り返して反応を行っ
た。次いで５５℃で２分間、最後に７２℃で１０分間反
応させて、断片の伸長反応を行いＰＣＲ操作を完了し、
約1.3kbpのＤＮＡ断片（以下フラグメントＣという）を
得た。

【００９１】（IV）ＤＮＡ配列決定 上記で得たフラグメントＣについてＴ３プライマーを用
いてダイターミネーター法によりダイレクトＤＮＡシー
クエンスを行った。

【００９２】上よりフラグメントＡ，Ｂ，Ｃの３つの断
片の配列が決定された。フラグメントＡはＢに含まれ、
フラグメントＢ，Ｃにより全長の遺伝子の配列が決定さ
れた。各フラグメントの関係を図８に示す。

【００９３】（７）全長ｃＤＮＡの取得 (I)プライマーの合成 フラグメントＢおよびＣにより得られたＤＮＡ断片のシ
ークエンスのデータをもとに、５’末端部にセンスプラ
イマー（５’−ＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＣ
ＴＴＧＣＡ−３’）を、一方３’末端部にアンチセンス
プライマー（５’−ＴＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧ
ＴＧＧＧＡＧＧＡ−３’）を設定し、これを用いて、ヒ
ト前立腺のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、再度以
下の条件にてＰＣＲ操作を行い、全長コード領域を得
た。

【００９４】センスプライマー及びアンチセンスプライ
マーはＤＮＡ合成機（ＡＢＩモデル392）にて合成し
た。合成したＤＮＡプライマーは蒸留水中に、20 pmol
／μｌになるように溶解した。これをＰＣＲブライマー
として用い、以下のＰＣＲ操作を行った。

【００９５】(II)ＰＣＲ操作 ＰＣＲ操作は、ヒト前立腺ｃＤＮＡ（１μｇ／μl）５
μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各ＮＴＰが２０pmol／μlにて
蒸留水中に溶解されている）１ μｌ、センスプライマ
ー（20 pmol／μl）１μｌ、アンチセンスプライマー
（20 pmol／μl）１μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液２
μｌ、蒸留水 ９．５μｌ及びＴａｑポリメラーゼ（５
ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌ（合計２０μｌ）の組成
から成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル２
０μｌを重層し、９４℃で５分間放置した。その後、
「６０℃で３０秒間、続いて７２℃で１分間、続いて９
４℃で３０秒間のサイクル」を４０回繰り返して反応を
行った。次いで５５℃で２分間、最後に７２℃で１０分
間反応させて、ＰＣＲ操作を完了し、全長の遺伝子を得
た。

【００９６】(III)ＤＮＡ配列決定 この全長ｃＤＮＡをシークエンスした。その結果、配列
表の配列番号２に示す、目的の遺伝子の全長を含む配列
が得られた。この遺伝子を、Ｐ−ｄｌｇ遺伝子と命名し
た。Ｐ−ｄｌｇ遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列
表の配列番号１に示す。

【００９７】さらに、Ｐ−ｄｌｇ遺伝子をＰＣＧＮベク
ター（インビトロジェン社製）に組み込み、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ（ＨＢ１０１）に導入し、形質転換を行った。この形
質転換体は、平成９年２月１４日に、工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託した（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ
−１６０８１）。

【００９８】（実施例２）染色体マッピング 実施例１により得られたＰ−ｄｌｇの全長ｃＤＮＡの染
色体マッピングを行った。Ｐ−ｄｌｇの全長ｃＤＮＡを
ＥＴＳデータベースを用いて解析したところ、ＥＴＳに
登録されている複数の配列が、Ｐ−ｄｌｇの配列の一部
とオーバーラップした。その結果、Ｐ−ｄｌｇはＥＴＳ
データベースの登録されているＷＩ７２１９とＷＩ４５
４４の間に位置し、染色体の１０番上に位置づけられ
た。具体的には１０ｑ２４に位置付けられた（これはも
とのＨ２９２２４がここにマッピングされているため同
じ位置と考えた）。

【００９９】（実施例３）Ｐ−ｄｌｇに対する抗体の作
製 抗原の調製 Ｐ−ｄｌｇ分子のー部の配列であり下記のペプチドをペ
プチド合成機（ＡＢＩ社製、モデル４３１Ａ）で合成し
た。

【０１００】配列１：Ｐ−ｄｌｇ分子に特異的な配列
（６０４位〜６２３位までの配列）：ＫＥＱＲＤＰＩＹ
ＬＲＤＫＶＴＱＲＨＳＫＥのＮ末端にＣ（Ｃｙｓ）を付
けた２１ｍｅｒのペプチド ポリクローナル抗体の作製 で合成したペプチドについて以下の手順で抗体を作製
した。

【０１０１】i)合成したペプチド２ｍｇをマレイミド化
ＫＬＨ（スカシ貝のへモシアニン）（ピアス社製）２ｍ
ｇに結合させた。反応はピアス社のキットに記載の方法
に従って行なった。

【０１０２】ii)このペプチド−ＫＬＨの１００μｇを
１回の免疫で使用した。すなわち、ペプチド−ＫＬＨ液
（１μｇ／ｍｌ）１００μｌ、ＰＢＳ ０．５ｍｌ及び
フロイント・コンプリート・アジュバント（ディフコ社
製）０．５ｍｌをシリンジに取り、混合して工マルジヨ
ンとし、これを初回免疫に用いた。

【０１０３】iii)このエマルジョンをウサギに皮下接種
した。接種はウサギの背に４カ所に分けて接種した。

【０１０４】iV)１週間後、２回目の免疫を行なった。
２回目からはアジュバントをフロイント・インコンプリ
ート・アジュバント（ディフコ社製）に変えて免疫を行
なった。その他の操作は１回目同様である。２回目以降
は１週間間隔をあけて、合計６回免疫を行なった。

【０１０５】v)最終免疫の１週間後、採血して血清を取
得した。血清は採血した血液を室温で３時間放置し十分
に血液凝固を行なった後、３，０００ｒｐｍ、５分間遠
心分離を行い、上清（血清）を回収した。

【０１０６】vi)この血清に１００％の飽和硫安を最終
濃度が５０％飽和になるように加え塩析した。このサン
プルを遠心分離して、抗体が含まれる画分を沈殿させ
た。その後、沈殿物をＰＢＳに溶解し、さらにＰＢＳに
対して透析した。その後、Protein Gセファロース・カ
ラム（ファルマシア社製）を用いて、抗体をアフィニテ
ィー精製した。その結果、全量で３７０ｍｇのＩｇＧ画
分を得た。

【０１０７】vii)上記の操作で得たＩｇＧ画分をさら
に、免疫に使用したで合成したペブチドを用いてアフ
ィニティー精製した。ペプチドカラムは、で合成した
ペプチドをＮＨＳ−活性化セファロース（ファルマシア
社製）に、添付のマニュアルに従い結合させて作製し
た。この力ラムを用い、vi)で得た精製されたＩｇＧ画
分をさらにアフィニティー精製した。その結果、全量で
５ｍｇのペプチド特異的抗体が得られた。

【０１０８】抗体の力価測定（ＥＬＩＳＡ） で得られたペプチド特異的抗体の力価をＥＬＩＳＡに
て測定した。

【０１０９】i)抗原液（配列１のべブチド）を２５μｇ
／ｍｌの濃度となるようにＰＢＳに溶解して、９６ウェ
ルＥＬＩＳＡプレート（ Xenobind、キセノポア社製）
各ウェルに５０μｌずつ分注し、４℃で一晩放置した。

【０１１０】ii)抗原液を捨て、蒸留水で４倍に希釈し
たブロックエース（大日本製薬社製）を各ウェルに２０
０μｌずつ分注し、室温で２時間放置することによりブ
ロッキングを行なった。

【０１１１】iii)ブロッキング液を捨て、１次抗体とし
て検討すべき精製した抗体を添加した。精製抗体は９６
ウェルの１列目から順に １０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍ
ｌ、２．５μｇ／ｍｌ・・・・の濃度となるように、Ｐ
ＢＳで倍々希釈した液を各ウェルに、５０μｌ／ウェル
の量にて分注した。最終ウェル中の抗体の濃度は約０．
００４μｇ／ｍｌとなった。なお、コントロールとし
て、免疫していないウサギの血液から精製したＩｇＧを
用いた。各ウェルに分注後、室温で１時間放置した。

【０１１２】一次抗体を含む液として、ウサギより採取
した血清を用いる場合は、最初のウェルにＰＢＳを用い
て４０倍に希釈した液を入れ、順にＰＢＳを用いて倍々
希釈した液を入れた。

【０１１３】iV)抗体液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、次いで２次抗体
液としてＰＢＳで1000倍希釈したビオチン化抗ウサギＩ
ｇＧ抗体（ベクター社製）を各ウェルに５０μｌずつ分
注し、室温で１時間放置した。

【０１１４】v)２次抗体液を捨てた後、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０／ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、１０００
倍に希釈したＡＢＣ溶液（ベクター社製）を各ウェルに
５０μｌずつ分注した。その後室温で、３０分間放置し
た。

【０１１５】vi)次いで、ＡＢＣ液を捨てた後、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、
ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）−Ｈ₂０₂／ＰＣＢ
を各ウェルに１００μｌずつ分注した。十分に発色後、
２Ｎの硫酸で反応を止めた後、４９０ｎｍでの吸光度を
マイクロ・ブレートリーダー（ Bio-rad社製）にて測定
した。

【０１１６】この結果を図５に示す。図中、横軸は加え
た抗体の濃度又は血清の希釈倍数を表しており、縦軸は
４９０ｎｍにおける吸光度を表わしている。図から判る
ように、免疫したウサギ由来の抗体価はコントロールに
比べて高く、配列１のペプチドに対するポリクローナル
抗体が取得できた。

【０１１７】（実施例４）ウェスタンブロット 実施例３で得られたＰ−ｄｌｇ抗体を用いてウェスタン
ブロットを行った。以下にプロトコルを示す。

【０１１８】Ｐ−ｄｌｇ遺伝子を導入したＣＯＳ細胞
及びその親株の細胞（Ｐ−ｄｌｇ遺伝子がない細胞：Ｍ
ｏｃｋと表記する）について１×１０⁶個の細胞を、以
下のようにして溶解しその上清を回収した。

【０１１９】細胞溶解液の組成は、50 mM Tris-HCl, 15
0 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM ヨードアセトアミ
ド, 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂,0.1% NaN₃, 10μg/ml 大
豆トリプシン・インヒビター, 1 μg/ml アプロチニン,
1 mM PMSF（フェニル・メチル・スルホニル・フロライ
ド）,1 μg/ml ロイペプチンである。この細胞溶解液１
００μｌを、細胞のペレットに加えよく撹拌して溶解し
た。氷上に６０分間放置した後、15,000 rpm、１０分間
遠心分離し、上清液を回収した。

【０１２０】回収した上清液に、免疫していないウサ
ギのＩｇＧ １ｍｇを結合させたＣＮＢｒ活性化セファ
ロース・ビーズ（ファルマシア社製）（抗体濃度１ｍｇ
／１ｍｌ樹脂）５０μｌを添加した。４℃で一晩反応
後、遠心分離を行ない、ビーズに結合する非特異的結合
蛋白質を除去し、上清を回収した。

【０１２１】で得られた上清１０μｌを、等量のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー及び１μｌの２−
メルカプトエタノールと混和し、９５℃で熱処理を５分
間行なった後、５−２０％のグラディエント・ゲルで電
気泳動した。

【０１２２】電気泳動後、トランスブロットシステム
(マリソル製)を用い、泳動された蛋白質をニトロセルロ
ース膜に転写した。

【０１２３】ニトロセルロース膜をブロックエース
（大日本製薬製）に浸し、１時間放置してブロッキング
した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５
分間×２回洗浄した。

【０１２４】実施例３で調製した配列１に対する抗Ｐ
−ｄｌｇ抗体を１μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈
したものを、メンブレンに加え室温で２時間反応させ
た。その後、メンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／
ＰＢＳで５分間×３回洗浄した。

【０１２５】ベルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ溶
液（カルタグ社製）をＰＢＳで１０００倍に希釈した液
を、上記メンブレンに加え、さらに１時間室温にて反応
させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで
５分間×３回洗浄した。

【０１２６】ＥＣＬキット（アマシャム社製）の発色
液 ５ｍｌをメンブレンに加えて１分間反応させた。そ
の後、このメンブレンをＸ線フィルムに２０秒間露光し
て現像した後、写真撮影した。その結果を図６に示す。
図６では、Ｐ−ｄｌｇ導入ＣＯＳ細胞において、約１１
０ｋｄの位置にＰ−ｄｌｇ分子のバンドが確認された。
この分子量は、Ｐ−ｄｌｇのアミノ酸配列から予想され
る分子量とほぼ一致する。なお、Mockでは該バンドはみ
られなかった。

【０１２７】（実施例５）組織染色 実施例３で得られた抗体を用いてＰ−ｄｌｇが発現して
いる細胞におけるＰ−ｄｇｌの発現状態を免疫組織染色
により検討した。材料は、ヒトの前立腺細胞株ＰＣ−３
を用いて、以下の通りにして行った。

【０１２８】細胞をラブチェック・チャンバースライ
ド中で培養した。

【０１２９】次いで、スライド培養した細胞を３．７
％ホルムアルデヒドで３分間処理した後、−２０℃で冷
却したメタノールで３分間処理を行ない固定した。その
後、スライドを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）で洗浄した（５分間×３回）。

【０１３０】ブロックエース（大日本製薬社製）をス
ライドグラス上の組織の上にのせ、室温で１時間放置し
てブロッキングを行なった。その後、スライドを５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した（５分
間×３回）。

【０１３１】実施例３で調製した配列１に対する抗Ｐ
−ｄｌｇ抗体を１μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈
したものを、スライド上の細胞に加え、室温で１時間反
応させた。その後、スライドを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した（５分間×３回）。

【０１３２】ＰＢＳで１０００倍に希釈したＦＩＴＣ
標識抗ウサギＩｇＧ抗体液（カルタグ社製）をスライド
上の細胞に加え室温で１時間反応させた。その後、スラ
イドを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗
浄した（５分間×３回）。

【０１３３】得られたスライドを蛍光顕微鏡で観察し
た。結果を図７に示す。図７よりＰ−ｄｌｇは細胞質と
細胞膜の境界部分に強く発現していることが確認され
た。

【０１３４】上記の如く、本発明者らは、新規なＰ−ｄ
ｌｇ及び該蛋白質をコードするＤＮＡを見いだし、さら
には、Ｐ−ｄｌｇが、前立腺において強く発現されてい
ることを見いだした。

【０１３５】また、前立腺癌では、染色体１０番の長腕
の欠失が多発していることが報告されている。染色体１
０番は本発明のＰ−ｄｌｇ遺伝子が配座していると考え
られる染色体であり、本発明のＰ−ｄｌｇ遺伝子と前立
腺癌の関係が示唆される。本発明のＰ−ｄｌｇは、細胞
内蛋白としてのｄｌｇファミリー分子の機能解明、細胞
内の蛋白移送のメカニズムの解明に有用であると考えら
れる。

【０１３６】さらには、ショウジョウバエのｄｌｇが細
胞の過増殖を抑える分子であること、及び本発明のＰ−
ｄｌｇ遺伝子が染色体１０番に配座していることより、
本発明のＰ−ｄｌｇは、前立腺での発ガンのメカニズム
の解明にも有用であろうと考えられる。

【０１３７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６７４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Arg Ala Thr His Gly Ser Asn Ser Leu Pro Ser Ser Ala Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Ser Ser Asn Leu Gln Phe Lys Ala Glu Arg Ile Lys Ile Pro 20 25 30 Ser Thr Pro Arg Tyr Pro Arg Ser Val Val Gly Ser Glu Arg Gly Ser 35 40 45 Val Ser His Ser Glu Cys Ser Thr Pro Pro Gln Ser Pro Leu Asn Ile 50 55 60 Asp Thr Leu Ser Ser Cys Ser Gln Ser Gln Thr Ser Ala Ser Thr Leu 65 70 75 80 Pro Arg Ile Ala Val Asn Pro Ala Ser Leu Gly Glu Arg Arg Lys Asp 85 90 95 Arg Pro Tyr Val Glu Glu Pro Arg His Val Lys Val Gln Lys Gly Ser 100 105 110 Glu Pro Leu Gly Ile Ser Ile Val Ser Gly Glu Lys Gly Gly Ile Tyr 115 120 125 Val Ser Lys Val Thr Val Gly Ser Ile Ala His Gln Ala Gly Leu Glu 130 135 140 Tyr Gly Asp Gln Leu Leu Glu Phe Asn Gly Ile Asn Leu Arg Ser Ala 145 150 155 160 Thr Glu Gln Gln Ala Arg Leu Ile Ile Gly Gln Gln Cys Asp Thr Ile 165 170 175 Thr Ile Leu Ala Gln Tyr Asn Pro His Val His Gln Leu Ser Ser His 180 185 190 Ser Arg Ser Ser Ser His Leu Asp Pro Ala Gly Thr His Ser Thr Leu 195 200 205 Gln Gly Ser Gly Thr Thr Thr Pro Glu His Pro Ser Val Ile Asp Pro 210 215 220 Leu Met Glu Gln Asp Glu Gly Pro Ser Thr Pro Pro Ala Lys Gln Ser 225 230 235 240 Ser Ser Arg Ile Ala Gly Asp Ala Asn Lys Lys Thr Leu Glu Pro Arg 245 250 255 Val Val Phe Ile Lys Lys Ser Gln Leu Glu Leu Gly Val His Leu Cys 260 265 270 Gly Gly Asn Leu His Gly Val Phe Val Ala Glu Val Glu Asp Asp Ser 275 280 285 Pro Ala Lys Gly Pro Asp Gly Leu Val Pro Gly Asp Leu Ile Leu Glu 290 295 300 Tyr Gly Ser Leu Asp Val Arg Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Tyr Val 305 310 315 320 Glu Met Leu Lys Pro Arg Asp Gly Val Arg Leu Lys Val Gln Tyr Arg 325 330 335 Pro Glu Glu Phe Thr Lys Ala Lys Gly Leu Pro Gly Asp Ser Phe Tyr 340 345 350 Ile Arg Ala Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Asp Val Glu Gln Glu Leu Ser 355 360 365 Phe Lys Lys Asp Asp Ile Leu Tyr Val Asp Asp Thr Leu Pro Gln Gly 370 375 380 Thr Phe Gly Ser Trp Met Ala Trp Gln Leu Asp Glu Asn Ala Gln Lys 385 390 395 400 Ile Gln Arg Gly Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Val Met Asp Gln Glu Phe 405 410 415 Ser Arg Arg Leu Ser Met Ser Glu Val Lys Asp Asp Asn Ser Ala Thr 420 425 430 Lys Thr Leu Ser Ala Ala Ala Arg Arg Ser Phe Phe Arg Arg Lys His 435 440 445 Lys His Lys Arg Ser Gly Ser Lys Asp Gly Lys Asp Leu Leu Ala Leu 450 455 460 Asp Ala Phe Ser Ser Asp Ser Ile Pro Leu Phe Glu Asp Ser Val Ser 465 470 475 480 Leu Ala Tyr Gln Arg Val Gln Lys Val Asp Cys Thr Ala Leu Arg Pro 485 490 495 Val Leu Ile Leu Gly Pro Leu Leu Asp Val Val Lys Glu Met Leu Val 500 505 510 Asn Glu Ala Pro Gly Lys Phe Cys Arg Cys Pro Leu Glu Val Met Lys 515 520 525 Ala Ser Gln Gln Ala Ile Glu Arg Gly Val Lys Asp Cys Leu Phe Val 530 535 540 Asp Tyr Lys Arg Arg Ser Gly His Phe Asp Val Thr Thr Val Ala Ser 545 550 555 560 Ile Xaa Glu Ile Thr Glu Lys Asn Arg His Cys Leu Leu Asp Ile Ala 565 570 575 Pro His Ala Ile Glu Arg Leu His His Met His Ile Tyr Pro Ile Val 580 585 590 Ile Phe Ile His Tyr Lys Ser Ala Lys His Ile Lys Glu Gln Arg Asp 595 600 605 Pro Ile Tyr Leu Arg Asp Lys Val Thr Gln Arg His Ser Lys Glu Gln 610 615 620 Phe Glu Ala Ala Gln Lys Leu Glu Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Phe Thr 625 630 635 640 Gly Val Ile Gln Gly Gly Ala Leu Ser Ser Ile Cys Thr Gln Ile Leu 645 650 655 Ala Met Val Asn Gln Glu Gln Asn Lys Val Leu Trp Ile Pro Ala Cys 660 665 670 Pro Leu 配列番号２ 配列の長さ：３０３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 TAGCAGACAC TCTTGCCCTT GCATCTGCAG GAACAGAAGT GTGTCCCGGC CAGTGGAGAA 60 CTCTCCCCGG AGCTCCAGGA GTGGGCACCT TACTCGCCTG GGCATTCCAG CCGGCACAGC 120 AACCCCCCGC TATACCCTAG CAGGCCGTCT GTGGGCACTG TTCCCCGGAG TTTGACCCCC 180 AGCACCACTG TGAGCTCCAT CCTGCGGAAC CCCATCTACA CTGTGCGCAG TCACAGGGTC 240 GGCCCCTGCA GCTCTCCACC TGCGGCCCGA GATGCTGGCC CCCAGGGTTT GCATCCCAGT 300 GTCCAGCACC AGGGACGCCT GAGCCTGGAC CTGAGCCACA GGACCTGCAG CGACTACTCC 360 GAG ATG AGA GCC ACC CAT GGG TCC AAC TCA CTG CCC TCC AGC GCC CGC 408 CTG GGT TCT TCG AGT AAC TTG CAG TTC AAG GCG GAA CGC ATT AAA ATC 456 CCA TCA ACA CCA AGA TAT CCG CGG AGT GTC GTG GGC TCC GAG AGA GGT 504 TCA GTG TCA CAT TCT GAA TGC AGC ACT CCT CCA CAG TCA CCC CTG AAC 552 ATC GAC ACC CTG TCC TCT TGT AGC CAG TCC CAG ACC TCA GCC TCC ACA 600 TTG CCC AGA ATC GCT GTC AAC CCC GCG TCC CTC GGG GAG CGG AGA AAG 648 GAC AGG CCT TAT GTG GAG GAG CCA CGC CAC GTG AAG GTG CAG AAG GGC 696 TCA GAG CCG CTG GGC ATC TCC ATC GTG AGT GGA GAG AAG GGC GGC ATC 744 TAC GTC TCC AAG GTG ACC GTG GGG AGC ATC GCT CAC CAG GCT GGC CTC 792 GAG TAT GGG GAT CAG TTA CTG GAG TTC AAC GGC ATA AAC CTG CGG AGC 840 GCC ACG GAG CAG CAG GCG CGG CTC ATC ATC GGG CAG CAG TGT GAT ACC 888 ATC ACC ATC CTG GCC CAG TAC AAC CCC CAC GTG CAC CAG CTC AGC AGC 936 CAC TCC CGG TCC AGC TCA CAC CTG GAC CCT GCC GGT ACC CAC TCC ACT 984 CTC CAG GGC AGT GGC ACC ACC ACC CCG GAG CAT CCA TCT GTC ATC GAC 1032 CCA CTG ATG GAG CAG GAC GAG GGG CCT AGC ACC CCC CCA GCC AAG CAG 1080 AGC AGC TCC AGG ATT GCG GGA GAT GCC AAC AAG AAG ACC CTG GAG CCA 1128 CGC GTT GTC TTC ATC AAA AAG TCC CAG CTG GAG CTT GGG GTG CAC TTG 1176 TGT GGT GGG AAC CTG CAT GGG GTG TTT GTG GCC GAG GTG GAG GAT GAC 1224 AGT CCT GCC AAG GGT CCT GAC GGC CTC GTG CCA GGG GAC CTC ATC CTG 1272 GAG TAT GGC AGC CTG GAC GTG CGG AAC AAG ACA GTG GAG GAA GTC TAT 1320 GTG GAG ATG CTG AAG CCC AGG GAT GGC GTC CGC CTG AAG GTG CAG TAC 1368 CGC CCT GAG GAG TTC ACG AAG GCC AAG GGC CTG CCT GGT GAC AGC TTC 1416 TAC ATC AGG GCC CTG TAC GAC CGG CTG GCA GAT GTG GAG CAA GAG TTG 1464 AGC TTT AAG AAG GAC GAC ATC CTC TAC GTG GAT GAC ACC TTA CCC CAG 1512 GGC ACG TTC GGG TCC TGG ATG GCT TGG CAG CTG GAC GAG AAT GCC CAG 1560 AAG ATC CAG CGC GGG CAG ATT CCC AGC AAA TAT GTG ATG GAC CAA GAA 1608 TTC TCC AGG AGG CTC AGC ATG TCT GAA GTC AAA GAT GAC AAT AGC GCC 1656 ACA AAG ACG CTG TCA GCG GCT GCA CGC CGG TCC TTT TTT CGG AGG AAA 1704 CAC AAG CAC AAA CGC AGC GGG TCC AAG GAC GGG AAA GAC CTG CTC GCC 1752 TTG GAT GCC TTT TCC AGT GAC TCC ATT CCA CTC TTT GAA GAT TCG GTG 1800 AGC CTG GCC TAT CAG CGG GTC CAG AAG GTG GAC TGC ACC GCT CTG AGG 1848 CCT GTC CTG ATT CTG GGG CCT TTG CTG GAC GTG GTG AAG GAG ATG CTG 1896 GTG AAT GAG GCT CCT GGC AAG TTC TGC AGA TGT CCC CTT GAG GTG ATG 1944 AAG GCC TCC CAG CAG GCC ATT GAG CGG GGT GTC AAA GAT TGC CTG TTT 1992 GTC GAC TAT AAG CGG AGA AGC GGC CAT TTC GAT GTG ACC ACT GTG GCG 2040 TCA ATA WAG GAG ATC ACA GAA AAG AAC CGA CAC TGC CTC CTG GAC ATT 2088 GCT CCG CAC GCT ATT GAG CGG CTC CAC CAC ATG CAC ATC TAC CCC ATT 2136 GTC ATC TTC ATC CAC TAC AAG AGC GCC AAG CAC ATC AAG GAG CAG AGA 2184 GAC CCC ATC TAC CTG AGG GAC AAG GTG ACT CAG AGG CAT TCC AAA GAG 2232 CAR TTT GAG GCG GCG CAG AAG CTT GAG CAG GAG TAC AGC AGG TAC TTC 2280 ACA GGG GTC ATC CAG GGA GGA GCC CTG TCA AGC ATT TGC ACT CAG ATC 2328 TTG GCA ATG GTC AAT CAA GAA CAA AAT AAA GTC CTG TGG ATT CCA GCC 2376 TGC CCG CTC TAG GAGAATGCTG TGCTGTGGAT GACTGCAGCT GGCCGCCTGA 2428 GGGGACACCA GACTCAGCTC TTTTCTAGCG ACTGAAAGTA GAAGTCTGTC CGTCTATGAA 2488 CATGCGGGGG AAGGATCCGG AACCAGGACC CAGAAGCACC TCCTTTGTAG ACAGAGGGCC 2548 ACGGCTGCGT GCGATCCAGG CCCAGGMCCA CACACTCTGC CCGTGTCACA CGTGTGCTTT 2608 AACACAAAAC AGATAACACT AAAGACGGGT TCAGCACCCA CCTTTCTTTA GCCAGCTGAT 2668 CAGAGATGCT GCAAAGAGAA CCTTTCGGAT CACTCGTTTA CAAGCCTTTT CTAAGTATTT 2728 GGTGGTTTAT GTTTACTTGA ACGGCTCCAT GTTGCCGGTG CCCAGCCCCT GTCCCCTCTG 2788 TCAACCCCCT GTCGCTTTGG TGTTGGTTTC GTTCCCGTCT TCAGCAAAAC GACCTTGGAA 2848 CCTCAATGGG GGCTGCTTTG CTTTGGGAGG TTCTTGTTGG TGGGACCAGA GCTTTGACAA 2908 ACCTCCTGCT CCTTGGTGGG CACCTCTCCT GGGAAGGACG TTCACAACTC CAGGGTGCTT 2968 CAGAATGCCT GTGGAACMAG GAACCAGTGG CCTTTGGATT TTTTCCTCCC ACAATGGGGG 3028 AAGGTGA 3035 配列番号３ 配列の長さ：１５０４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 TCCAGGAGGC TCAGCATGTC TGAAGTCAAA GATGACAATA GCGCCACAAA GACGCTGTCA 60 GCGGCTGCAC GCCGGTSCTT TTTTCGGAGG AAACACAAGC ACAAACGCAG CGGGTCCAAG 120 GACGGGAAAG ACCTGCTCGC CTTGGATGCC TTTTCCAGTG ACTCCATTCC ACTCTTTGAA 180 GATTCGGTGA GCCTGGCCTA TCAGCGGGTC CAGAAGGTGG ACTGCACCGC TCTGAGGCCT 240 GTCCTGATTC TGGGGCCTTT GCTGGACGTG GTGAAGGAGA TGCTGGTGAA TGAGGCTCCT 300 GGCAAGTTCT GCAGATGTCC CCTTGAGGTG ATGAAGGCCT CCCAGCAGGC CATTGAGCGG 360 GGTGTCAAAG ATTGCCTGTT TGTCGACTAT AAGCGGAGAA GCGGCCATTT CGATGTGACC 420 ACTGTGGCGT CAATAWAGGA GATCACAGAA AAGAACCGAC ACTGCCTCCT GGACATTGCT 480 CCGCACGCTA TTGAGCGGCT CCACCACATG CACATCTACC CCATTGTCAT CTTCATCCAC 600 TACAAGAGCG CCAAGCACAT CAAGGAGCAG AGAGACCCCA TCTACCTGAG GGACAAGGTG 660 ACTCAGAGGC ATTCCAAAGA GCARTTTGAG GCGGCGCAGA AGCTTGAGCA GGAGTACAGC 720 AGGTACTTCA CAGGGGTCAT CCAGGGAGGA GCCCTGTCAA GCATTTGCAC TCAGATCTTG 780 GCAATGGTCA ATCAAGAACA AAATAAAGTC CTGTGGATTC CAGCCTGCCC GCTCTAGGAG 860 AATGCTGTGC TGTGGATGAC TGCAGCTGGC CGCCTGAGGG GACACCAGAC TCAGCTCTTT 920 TCTAGCGACT GAAAGTAGAA GTCTGTCCGT CTATGAACAT GCGGGGGAAG GATCCGGAAC 980 CAGGACCCAG AAGCACCTCC TTTGTAGACA GAGGGCCACG GCTGCGTGCG ATCCAGGCCC 1040 AGGMCCACAC ACTCTGCCCG TGTCACACGT GTGCTTTAAC ACAAAACAGA TAACACTAAA 1100 GACGGGTTCA GCACCCACCT TTCTTTAGCC AGCTGATCAG AGATGCTGCA AAGAGAACCT 1160 TTCGGATCAC TCGTTTACAA GCCTTTTCTA AGTATTTGGT GGTTTATGTT TACTTGAACG 1220 GCTCCATGTT GCCGGTGCCC AGCCCCTGTC CCCTCTGTCA ACCCCCTGTC GCTTTGGTGT 1280 TGGTTTCGTT CCCGTCTTCA GCAAAACGAC CTTGGAACCT CAATGGGGGC TGCTTTGCTT 1340 TGGGAGGTTC TTGTTGGTGG GACCAGAGCT TTGACAAACC TCCTGCTCCT TGGTGGGCAC 1400 CTCTCCTGGG AAGGACGTTC ACAACTCCAG GGTGCTTCAG AATGCCTGTG GAACMAGGAA 1460 CCAGTGGCCT TTGGATTTTT TCCTCCCACA ATGGGGGAAG GTGA 1504 配列番号４ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GCATCCAAGG CGAGCAGGTC TTT 23 配列番号５ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TGCAGCCGCT GACAGCGTCT TTGT 24 配列番号６ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 AATACGACTC ACTATAG 17 配列番号７ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 AAAGACAACC CCAGGATTCG GAAG 24 配列番号８ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CGTGAACTCC TCAGGGCGGT ACTG 24 配列番号９ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CTTCAGGCGG ACGCCAGCCC T 21 配列番号１０ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ATTAACCCTC ACTAAAG 17 配列番号１１ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TAGCAGACAC TCTTGCCCTT GCA 23 配列番号１２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TCACCTTCCC CCATTGTGGG AGGA 24

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトの各組織のｍＲＮＡに対して、Ｐ−ｄｌｇ
のｃＤＮＡ断片をハイブリダイズさせたノーザンブロッ
トの結果を表す電気泳動写真である。

【図２】ヒトの各組織のｍＲＮＡに対して、Ｐ−ｄｌｇ
のｃＤＮＡ断片をハイブリダイズさせたノーザンブロッ
トの結果を表す電気泳動写真である。

【図３】ヒトの各組織のｍＲＮＡに対して、Ｐ−ｄｌｇ
のｃＤＮＡ断片をハイブリダイズさせたノーザンブロッ
トの結果を表す電気泳動写真である。

【図４】ヒトの各種細胞株のｍＲＮＡについて、Ｐ−ｄ
ｌｇのｃＤＮＡ断片をハイブリダイズさせたノーザンブ
ロットの結果を表す電気泳動写真である。

【図５】Ｐ−ｄｌｇのペプチドに対する抗体の力価をＥ
ＬＩＳＡで測定した結果を表す図である。

【図６】Ｐ−ｄｌｇを導入したＣＯＳ細胞からの抽出液
について、抗Ｐ−ｄｌｇ抗体を用いたウェスタンブロッ
トの結果を表す電気泳動写真である。レーン１及び２は
マーカーである(molecular weight markerバイオラッド
社製）、レーン３、４及び５はＰ−ｄｌｇ遺伝子を導入
したＣＯＳ細胞を溶解液で溶解させ遠心分離した後の培
養上清をローディングした結果である。レーン３は、ク
ローンｄの培養上清、レーン４は、クローンｅの培養上
清、レーン５は、クローンｆの培養上清をローディング
したものである。

【図７】ＰＣ−３細胞を抗Ｐ−ｄｌｇ抗体で染色した結
果を表す顕微鏡写真である。

【図８】本発明のＰ−ｄｌｇを得る過程の各フラグメン
トＡ〜Ｃの関係を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列を有するｄｌｇファミリー分子。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列の、１又は２以上のアミノ酸を置換、欠失又は付加さ
   せた請求項１に記載のｄｌｇファミリー分子であって、
   かつLys-Glu-Gln-Arg-Asp-Pro-Ile-Tyr-Leu-Arg-Asp-Ly
   s-Val-Thr-Gln-Arg-His-Ser-Lys-Gluに対する抗体に反
   応する機能を有するｄｌｇファミリー分子。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のｄｌｇファミリ
   ー分子をコードするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項１又は２に記載のｄｌｇファミリ
   ー分子に対する抗体。
5. 【請求項５】 請求項３に記載のポリヌクレオチド、又
   はその塩基配列のうち少なくとも連続する１２塩基以上
   のポリヌクレオチドを用いて、検体中のｄｌｇ遺伝子又
   はｄｌｇ遺伝子に対するｍＲＮＡを検出する方法。
6. 【請求項６】 請求項３に記載のポリヌクレオチドのア
   ンチセンス鎖の塩基配列を含むポリヌクレオチド。