WO1998046745A1

WO1998046745A1 - NOUVELLE MOLECULE DE LA FAMILLE dlg, POLYNUCLEOTIDE CODANT CETTE MOLECULE, ANTICORPS DIRIGE CONTRE ELLE ET PROCEDE DE DETECTION DE GENE dlg

Info

Publication number: WO1998046745A1
Application number: PCT/JP1998/001611
Authority: WO
Inventors: Motomi Nakata; Hideo Nakamura; Hideyuki Saya
Original assignee: Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 1998-10-22
Also published as: EP0979871A1; JPH10286094A; CA2287526A1; EP0979871A4

Description

明細書

新規 d 1 gフアミリー分子及び該分子をコードするポリヌクレオチド、該分子に対する抗体、及び d i g遺伝子検出方法技術分野

本発明は、新規な d 1 gフアミリ一分子及び該分子をコードするポリヌクレオチド、該分子に対する抗体、及び検体中の前記ポリヌクレオチドに関する。背景技術

ショウジヨウバエにおいて、これまでにいくつかの癌抑制遺伝子が単離され、その遺伝子の遺伝的な解析がされてきた。係る遺伝子は、生殖細胞系列（germ line) での変異は、劣性致死（recessive lethal) として挙動するものであることが知られている。係る遺伝子のうち、 d i g (discs large 1 ) として一般的に称される遺伝子（以下 d 1 g遺伝子という）が単離され、該遺伝子の欠失により成虫盤（imaginal discs) 新生において過増殖を引き起こすことが知られている（Woodら， Cell , 66卷， 451〜464ページ， 1991年）。また、該 d 1 g遺伝子は、 3コピーの D H R ドメイン（discs- large homologous region) 、 S H 3モチ一フ、及び酵母のグァニル酸キナーゼにホモロジ一のあるドメインを有することが知られている。

また最近、前記 d 1 g遺伝子がコードする蛋白質である d 1 g (又は d i g分子とする）にホモロジ一がある蛋白質がいくつか同定されている。これら蛋白質は、 M A G U K membrane - associated guanylate kinase homo log) と称され、新しい蛋白質ファミリーと考えられている（Wood ら， Mechanism of Developmen t, 44, p.85-89, 1993) 。本明細書中では、以下、この蛋白質ファミリ一を d 1 gファミリ一といい、また、このファミリーに属する蛋白質を d 1 gファミリ —分子という。さらに、該蛋白質が由来する動物種を明示するときは d 1 gファミリ一分子の前にその種名を付けることとする。例えばヒト由来の場合には、ヒト d 1 gフアミリー分子（または hd lgフアミリー分子）とする。

係る d i gファミリ一分子には、ラット由来では、ラット SAP— 97、ラヅト PSD— 95、ラット SAP— 90等が知られている。ヒト由来では、 hd l g l、 hd lg2、 ZO— 1、 Z◦— 2及びヒト p 55等が知られており、また、さらに係る d 1 gフアミリー分子をコードする遺伝子も知られている。さらに前記ヒト由来の d 1 1 (hd 1 g 1) 分子は、 protein 4.1 と結合すること、及び、 hd 1 g 1分子は細胞膜上に存在していることが知られている。また前記 h d lglをコードする hd l g 1遺伝子は約 100 kdの蛋白質をコ一ドする遺伝子であり、ヒ卜の組織中のうち、リンパ球、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、筋肉、腎臓で発現していることが知られている（Leu等、 Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, 91卷， 9818〜9822頁， 1994年) 。発明の開示

本発明者は、ハエの d 1 g分子が成虫盤の過増殖を抑える作用を有していることから、脊椎動物、特に哺乳類における d lgファミリー分子は、細胞の過増殖を抑える作用、即ち一種の癌抑制因子としての作用を有するものと推定し、ヒトにおいてもさらに多くの新規な d 1 gフアミリー分子を見出すことは、当該新規 d 1 gフアミリ一分子またはその遺伝子を用いた癌抑制作用の解明、抗癌剤の開発等において重要であると考えた。

本発明は係る重要性に鑑み、ヒト由来新規 d 1 gファミリ一分子、さらには該分子をコードするポリヌクレオチド（DNA又は RNA) を提供することを目的とするものである。

また、本発明は、 d 1 gファミリ一分子の機能解明に有用な、前記の新規なヒト由来の d 1 gフアミリー分子に対する抗体を提供することを目的とするものである。また、本発明は、検体中の前記の新規 d lgファミリ一分子の遺伝子を検出するためのポリヌクレオチドプローブを提供することを目的とするものである。

本発明者等は、上記目的を達成するべく鋭意研究を行った結果、ヒトの前立腺の cDNAライブラリ一より新規な d lgフアミリー分子をコードする遺伝子を見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。さらに、この新規な d l gフアミリ一分子をコードする遺伝子によりコ一ドされる d 1 gフアミリ一分子の単離、同定に成功した。以下、本発明で得られた新規な d 1 gファミリ一分子を P— d 1 gと命名し、該 P— digをコードする遺伝子を P— d 1 g遺伝子とする。図面の簡単な説明

図 1は、ヒトの各組織の mRN Aに対して、 P— d 1 gの cDNA断片をハイブリダィズさせたノーザンプロッ卜の結果を表す電気泳動写真である。

図 2は、ヒトの各組織の mRNAに対して、 P— d 1 gの cDNA断片をハイプリダイズさせたノ一ザンブロットの結果を表す電気泳動写真である。

図 3は、ヒトの各組織の mRN Aに対して、 P— d 1 gの c DNA断片をハイプリダイズさせたノーザンプロッ卜の結果を表す電気泳動写真である。

図 4は、ヒトの各種細胞株の mRNAについて、 P— d 1 gの cDNA断片をハィブリダイズさせたノ一ザンブロットの結果を表す電気泳動写真である。

図 5は、 P— d 1 gのべプチドに対する抗体の力価を EL I SAで測定した結果を表す図である。

図 6は、 P— d 1 gを導入した COS細胞からの抽出液について、抗 P— di g 抗体を用いたウエスタンプロットの結果を表す電気泳動写真である。ここで、レ —ン 1及び 2はマーカ一である（molecular weight markerバイオラッド社製）、レーン 3、 4及び 5は P— d 1 g遺伝子を導入した COS細胞を溶解液で溶解させ遠心分離した後の培養上清をローデイングした結果である。レーン 3は、クロ —ン dの培養上清、レーン 4は、クローン eの培養上清、レーン 5は、クローン：の培養上清を口一ディングしたものである。

図 7は、 PC— 3細胞を抗 P— d 1 g抗体で染色した結果を表す顕微鏡写真である。

図 8は、本発明の P—d 1 gを得る過程の各フラグメント A〜Cの関係を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明を発明の実施の形態に即してさらに詳しくに説明する。ここで、遺伝子については、天然に存在する mRN Aからの逆転写により得た DN A (該 D N Aを増幅して得られる DN Aを含む）を表す場合、その意味を明確にするときは cDNAと称する。

(P— d 1 g分子及び、それをコードするポリヌクレオチド）

本発明に係る P— d 1 g分子及び、それをコードするポリヌクレオチドは具体的には以下の操作により得ることが可能である。

すなわち、（1)ショウジヨウバエの d 1 gフアミリー分子をコ一ドする遺伝子情報を基に、 E S Tデータベースに基づき、それにホモロジ一のある塩基配列を検索して見出す。（2)次いで、得られた塩基配列情報に基づいて 5，伸長用プライマ —を合成し、これを用いて、ヒ卜の胎児脳の cDN Aライブラリ一を鍊型として、 PCR法により、 cDNAフラグメントを得る。（3)さらに、得られた断片の塩基配列情報に基づき、再び E S Tデータベースに基づいて、ホモロジ一のある塩基配列を検索して見出す。（4)次いで、これらの塩基配列情報をつなぎ合わせ、更にそのつなぎあわせた塩基配列の端部分の塩基配列情報に基づき、係る塩基配列からなる DN A断片を増幅するためのプライマーを合成する。（5)該プライマ —を用いて再度、ヒトの胎児脳の cDN Aライブラリーを錡型として、 PCR法により、前記プライマーを端にもつ断片の増幅産物を得る。（6)さらに、該増幅産物を強く発現している組織を同定し、同定された組織の c D N Aライブラリ一を銪型として、該増幅産物の塩基配列情報に基づいて合成された 5 ' 伸長用ブライマ一を用いて D N A断片の 5 ' 側に向けての P C R法による伸長反応を行う。 (7)以上の操作を全長の c D N Aの塩基配列情報を取得するまで必要に応じ繰り返す。（8)さらに、取得した c D N Aの塩基配列情報から、 P C R法により全長の c D N A (すなわち、 P-dlg c DNA) を得る。塩基配列の決定方法は、特に制限されず、例えば、 T a qサイクルシークェンシング法（『Biotechniques vol. 7』（1989年) 494〜499頁に記載の方法は好ましく使用可能である。

さらに、上記の方法により得られた全長の c DNAの塩基配列の情報に基づいて、該 c DNAがコードする本発明に係る P— d 1 gのアミノ酸配列を決定することが可能となる。

さらに、上記得られた P— d 1 c DNAの断片を用いてノーザンプロヅトにより、以下説明するように、 P— d 1 g遺伝子が発現している組織（例えば前立腺、胎盤、甲状腺、脊髄、気管及び副腎）を見いだすことが可能となる。

さらに、以下に説明するように、上記得られた P— d 1 gまたはその一部のァミノ酸配列からなるオリゴペプチドを調製し、それに対する抗体（以下、抗 P— d i g抗体とする）を得ることが可能となる。係る抗体を用いることにより、 P — d 1 gの発現等の機能解明、シグナル伝達系の解明等に使用可能とする。

さらに、以下に説明するように、上記得られた P— d 1 g遺伝子の塩基配列に基づき、 P— d 1 g遺伝子が関わる研究開発のための実験用、又は P— d l g遺伝子が関わる病気の診断用のアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用した診断薬等に使用可能とする。

上記決定された本発明に係るヒト由来の新規 d 1 gフアミリー分子は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するが、このアミノ酸配列に限定されることはない。その 1又は 2以上のアミノ酸を置換し、欠失又は付加したものであつて、かつ Lys - Glu - Gin - Arg - Asp - Pro - lie - Tyr - Leu - Arg - Asp - Lys - Vaト Thr- Gln-Ar g - His- Ser- Lys- Gluに対する抗体に反応する機能を有するものも含まれる。

アミノ酸配列間比較方法については、特に制限がなく、例えば、市販のプログラム（例えば、 G E N E T Y X (登録商標） —C Dプログラム V e r . 3 4 (ソフトウェアディべロブメント社製）を用いて可能である。

また本発明に係るヒト由来の新規 d 1 gフアミリー分子をコ一ドする遺伝子の 1つの具体例は、配列表の配列番号の 2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドであるが、本発明はこの塩基配列に限定されることはない。自然の変異により又は人工の変異（例えば、 ^Molecular Cloning 2nd Editionj (Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年） 15.1〜15. 113頁を参照）によりポリヌクレオチドの構造の一部を、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの主たる機能である活性に変化を与えることなく変化させることが可能である。すなわち、本発明に係る P— d 1 gは、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列の一又は複数のアミノ酸に、該ポリペプチドの主たる上記機能を変化させずに、置換、欠失又は付加を与えるアミノ酸配列からなるものが含まれる（これらを本発明では P— d i g変異体という）。ここで、該ポリペプチドの主たる機能として、上で説明した機能、すなわち、 Lys-Glu- Gin- Arg- Asp- Pro-l ie- Tyr- Leu- Arg- Asp- Lys- Va Thr- Gin- Arg- His- Ser-Lys-Gluに対する抗体に反応する機能が挙げられる。また、遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレオチドから生産されるポリペプチドのァミノ酸配列を変えることなく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一部の塩基を他の種類の塩基に置換することができる。したがって、本発明の P — d 1 g又は P— d 1 g変異体をコ一ドするポリヌクレオチドとは、該 P— d 1 g又は P— d 1 g変異体のポリべプチドをコードし得る全ての縮重のパターンを含むものである。

(P- d 1 g遺伝子スクリーニング用プローブ）

c D N Aライブラリ一等から、検体中の P- d 1 g遺伝子をスクリーニングするためのプロ一プは、配列表の配列番号 2の塩基配列のうちの連続する 1 2塩基以上を有する D N A又は該 D N Aにハイプリダイズするポリヌクレオチドとして選択することが可能である。上記の塩基数以上の配列は、特異性のある配列であると認識されている。このとき、 G C含有率が 3 0ないし 7 0 %のものが好適に使用可能である。また、連続する 1 5塩基以上である D N A又は該 D N Aにハイブリダィズするポリヌクレオチドが特に好ましい。ここで、プローブとして用いる該ポリヌクレオチドは種々の置換基等で修飾された誘導体であってもよい。該プローブを用いたスクリーニングにおいて使用する c D N Aライブラリーとしては、ヒト由来の mR N Aから作製されたものが好ましく使用できる。これらの c D N Aライブラリ一からランダムサンプリングにより選択された一群の c D N Aを検索の試料とすることができる。また、市販のライブラリーでも使用可能である。 ( P - d 1 g及び P— d 1 g変異体の取得）

P - d 1 g及び P— d 1 g変異体の取得は特に制限はなく、 P— d g 1遺伝子情報に基づき種々の公知の方法により可能である。例えば、遺伝子工学の手法、および化学合成法が挙げられる。遺伝子工学の手法によれば、 P— d i g及び P —d i g変異体をコードする遺伝子情報に基づき、係る遺伝子を導入したプラスミドを調製し、さらに大腸菌等の適当な宿主に導入して、形質転換体を得て、夕ンパク質を発現させる等の公知の方法により可能である。例えば、『細胞工学実験プロトコ一ル』（秀潤社、 1991年） 104〜106頁に記載の方法により可能である。得られた形質転換体を培養し、遺伝子の増幅、蛋白質の発現を行い P— d 1 gを製造することが可能である。次に培養物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶ィ匕、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行うことにより、本発明の P— d 1 g及び P— d 1 g変異体を精製することが可能である。

形質転換体の培養については、各種の教科書があり、例えば、『微生物実験法』 9 7— 1 3 4ページ（社団法人日本生化学会編、東京化学同人、 1 9 9 2年）に記載の方法で行うことが可能である。本発明に記載の塩基配列に基づいて P— d 1 gを発現させることも、公知の方法により可能である。このとき、宿主としては、大腸菌等の細菌、酵母、動物細胞のいずれも使用可能であるが、特には動物細胞が好ましい。細胞に遺伝子を導入するには、リボソーム法、エレクトロボ一レ一シヨン法等を用いることができる。特に、 D E A E—デキストラン法（フアルマシア社製）を用いることが好ましい。

得られた培養物から P— d 1 gを精製する精製方法には、免疫沈降法、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ一、疎水性ク口マトグラフィ一や抗体ク口マトグラフィ一等の各種ァフィニティ一クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィ一法及び逆相クロマトグラフィ一等があり、適宜選択して行えばよい。

また、製造段階において、製造する P— d l gは、他のポリペプチドとの融合ペプチドとして形質転換体に生産させてもよい。この場合は、精製工程において、ブロムシアン等の化学物質やプロテア一ゼ等の酵素で処理して、該 P— d l gを切り出す操作が必要になる。

また、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列情報に基づき種々のォリゴぺプチド合成方法を使用することで該タンパク質を得ることも可能である。

(アンチセンスポリヌクレオチド）

本発明は、前記の d 1 gフアミリー分子をコ一ドする遺伝子のアンチセンス鎖の塩基配列を含むものである。さらに、本発明は、前記のポリヌクレオチドのうちの、塩基配列の長さが 1 5塩基以上である部分のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体を含むものである。さらに、本発明は、前記のポリヌクレオチドのうちの、塩基配列の長さが 1 5塩基〜 3 0塩基である部分のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体を含むものである。本発明の P— d 1 gアンチセンスポリヌクレオチドには、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオチドが複数結合したものが含まれ、また天然には存在しないが人工的に合成されたものも含まれる。その代表的なものは、 D N Aと mR N Aである。

また、本発明のポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド誘導体には、その立体構造や機能がポリヌクレオチドと類似するものが含まれる。例えば、ポリヌクレオチドの 3，末端もしくは 5 ' 末端に他の物質が結合したものやポリヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか一部において、置換や欠失や付加の修飾が生じた物質、天然に存在しない塩基、糖、リン酸を有するものや、糖一リン酸骨格以外の骨格を有するものが該当する。

本発明に係るアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体は、 P— d 1 g又は P— d 1 g変異体をコードするポリヌクレオチドのいかなる部分にハイブリダィズするものであってもよい。なお、 P— d 1 g又は P— d 1 g変異体の全部又は一部をコ一ドする mR N Aの一部に対して相補的な塩基配列を有し、該 mR N Aにハイプリダイズするものが好ましい。

得られるアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体は、組織や細胞における P— d 1 g又は P— d 1 g変異体をコ一ドするポリヌクレオチドの存在、その発現状況を調べるためのポリヌクレオチドプローブとして有効に使用可能である。また、 P— d 1 g又は P— d 1 g変異体の関与する種々の病気の診断用ポリヌクレオチドプローブとしても使用可能である。

ここで係る使用目的においてプローブとしては、実用上 1 2塩基以上、且つ G C含有率が 3 0ないし 7 0 %であるものが好ましい。一般的には、 1 5塩基以上の塩基を含む塩基配列であれば、特異性のある配列であると考えられている（「蛋白質、酵素、核酸」 38卷 754- 765頁）。従って、 1 5塩基以上且つ G C含有率が 3 0ないし 7 0 %であるものが、特に好ましい。

また、該アンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体を使用して、 P— d l g又は P— d 1 g変異体の発現を調節することが可能である。これらは P— d 1 gもしくは P— d 1 g変異体をコ一ドする遺伝子もしくは mR N Aにハイプリダィズして P— d 1 g又は P— d 1 g変異体の発現を抑制することが期待されるので、 P _ d 1 g又は P— d 1 g変異体が関与する機能の異常に基づく疾患の治療薬として使用可能である。すなわち、該アンチセンスポリヌクレオチドやその誘導体よりアンチセンス医薬品を開発することが可能である。

ポリぺプチドをコ一ドする D N Aや mR N Aの相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを使用して、該ポリペプチドの発現を調節する方法は、アンチセンス法と呼ばれている技術である。相補的な配列を有するポリヌクレオチドは、（i ) 遺伝子から P r e — mR N Aへの転写段階、（ii ) p r e — mR N Aから成熟 mR N Aへのプロセッシング段階、（iii )核膜通過段階、（iv)蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝情報を担う D N A又は mR N Aに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えてポリぺプチドの発現を調節すると考えられている。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチド誘導体も、 P— d 1 g遺伝子若しくは P— d 1 gに対する mR N Aに相補的な塩基配列であって 1 2塩基以上からなる塩基配列を含むものが好ましく、 1 5塩基以上のものが特に好ましい。

一方、ポリヌクレオチドを細胞内に取り込ませるには、その長さはあまりに長すぎても不適当である。本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体は、いかなる長さのものであってもよいが、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチド誘導体を細胞内に取り込ませ、 P— d 1 gの発現を調節させることを考慮すると、前記アンチセンスポリヌクレオチド及びこれらアンチセンスポリヌクレオチドの誘導体は P— d 1 g遺伝子若しくは P - d 1 gに対する mR N Aに相補的な 1 2塩基以上 3 0塩基以下、好ましくは 1 5塩基以上 2 5塩基以下、より好ましくは 1 8塩基以上 2 2塩基以下の塩基数から成る塩基配列を有するものが好ましい。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチド誘導体においても、公知のアンチセンス技術を用いて、ポリヌクレオチドの医薬品としての効果を高めることを目的として様々な誘導体、即ち、目的の D N Aや m RN Aとの結合力、組織選択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性の高い様々なポリヌクレオチド誘導体が得られうる。

ハイブリダィズのし易さの点では、一般的には、ステムループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列を持つポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を設計するとよいとされている（『臨床免疫 25卷』 1200〜12 06頁、 1993年）。本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体は、必要に応じ、ステムループを形成することが可能である。

また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キヤッビング部位、スプラィス部位の配列に相補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる（『癌と化学療法 20卷 13号』 189 9〜1907頁）。したがって、本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体であって、 P— d ig又は P— d l g変異体をコードする遺伝子又は該遺伝子に対する mRNAの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キヤツビング部位、スプライス部位の相補的な配列を含むものは、高い発現抑制効果が期待される。

現在一般に知られている誘導体は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも 1つが高められた誘導体であることが好ましく、特に好ましくは、当該ポリヌクレオチド誘導体は、フォスフォロチォェ一ト結合（「癌と化学療法」 20卷、 13号、 1899- 1907頁、 1993年参照）を骨格構造として有する誘導体であることが示されている。本発明のポリヌクレオチド及びその誘導体についても、これらの機能又は構造を有する誘導体が含まれる。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチド誘導体の製造方法については、例えば、

"Ant l s ens e Re s ear ch and App l i cat i on s』 (Michael J. GAIT, p290-299, CRC出版，フロリダ， 1993年）に記載の方法を用いることが可能である。

例えば、天然型の DNAや RNAであれば、化学合成機を使用して合成したり、 P-d 1 g又は P— d 1 g変異体をコードする遺伝子を錶型とする PCR法により本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを得ることができる。また、メチルフォスフォネ一ト型ゃフォスフォロチォェ一ト型等、誘導体の中には、化学合成機

(例えば、パーキンエルマ一ジャパン社製 394型）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されている説明書にしたがって操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いた H PLC法により精製することによつても、目的のアンチセンスポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。

(抗 P— d 1 g抗体）

本発明の抗 P— d 1 g抗体とは、本発明の P— d 1 g又はその変異体に対する抗体を含むものである限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも含む。

また、その活性フラグメント及びその活性フラグメントを含むキメラ抗体も含まれる。一般に、抗体、すなわち免疫グロブリンは、 H鎖と L鎖を持ち、物理化学的性質や免疫学的性質から 5つのクラス（I gA、 I gD、 I gE、 I gG、 I gM、 ) に分けられ、このうち、 I gA、 I gGは H鎖のタイプによってさらにサブクラスに分けられる。本発明の新規抗体は、これらの全てのクラス、サブクラスに属するものを含む。

さらに、本発明の抗体は、必ずしも抗体分子全体を用いる必要はなく、活性を有する限り、分子の一部（活性フラグメント）を用いることができる。活性フラグメントとしては、具体的には F (ab，） 2、 Fab' 、 Fab、 Fv、組み換え Fv体及び一本鎖 Fvを挙げることができる。例えば、ペプシンで分解すると; F (ab，） 2、 F c ' が得られ、パパインで分解すると F a b、 Fcが得られ。

これらの活性フラグメントは、単独でも用いられるが、必要に応じて、アルブミン、ポリエチレングリコール等の物質と結合させ、新たな複合物として用いることができる。このような複合物は、一般に、生体内では、長時間分解されずにその効果を最大限まで発揮することが多い。活性フラグメントに、アルブミン、ポリエチレングリコール等の物質を付加する方法は、例えば、『Ant ibod 1 e s , A Laborat ory Manual』 (Co ld Spr in Harbor Laborat ory, 1988) . 77-8 U p l 29

— 137に記載されている。一般的には、 SPDP (フアルマシア社製）、 SM PB (ピアス社製）、 EMCS (ド一タイト社製）等の 2価反応性試薬を用いれば、活性フラグメントをアルブミン等と容易に結合させることができる。

本発明の抗 P— d 1 g抗体は、公知の方法によって得ることが可能である。例えば、『免疫実験操作法』（日本免疫学会編、日本免疫学会発行）を参考にして得ることができる。免疫抗原としては本発明の P— d 1 gの一部、すなわち配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうちの連続する 8個以上のアミノ酸からなるポリペプチドであればよい。例えば、 P- digに特異的なアミノ酸配列 KE Q RDP I YLRDKVTQRHSKEからなるポリペプチドがある。さらには、この C—末端に Cをつけてマレイミド化 KLH (スカシ貝のへモシァニン）を結合させることが好ましい。また、それが抗体の作製に使用しうる精製度のものであれば、該 P— d 1 gが得られた方法は問わない。

免疫抗原が、 8ないし約 20個のアミノ酸からなるポリべプチドである場合には、それをキーホールリンペットへモシァニン（KLH) 等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。

該免疫抗原を免疫する動物はヒト以外のいずれでもよく、通常当業者で使用される動物から目的の抗体を産生し得る動物種を選択して使用することが好ましい c ポリクロ一ナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得られる。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一等の方法を組み合わせて行えばよい。

モノクローナル抗体は、通常のハイプリドーマを作製する方法によって融合細胞を得た後、該細胞に抗体を産生させることにより得られる。細胞融合には、ポリエチレングリコール、センダイウィルス、電気パルス等を用いる手法が使用可能である。

また、上記以外に、遺伝子工学的な方法を用いても該モノクローナル抗体が得られうる。例えば、本発明の P— d 1 g又はその一部で免疫した動物の脾細胞、リンパ球又は該モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマから mRNAを採取し、これをもとに cDNAライブラリーを作製する。次に、該 cDNAライブラリ一により抗体を発現させる。抗原と反応する抗体を産生するクロ一ンをスクリーニングにより cDN Aライブラリ一から得、得られたクロ一ンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一等の方法を組み合わせて精製することができる。本発明の抗体は、前立腺、胎盤組織、甲状腺、脊髄、副腎及び気管組織の細胞に存在する本発明の P_d 1 g、 P-d 1 g変異体又はそれらの一部の検出に用いることができる。また、本発明の P— d l g、 P— d 1 g変異体又はそれらの一部を精製するために使用する抗体カラムの作製、各分画中の該 P— d l g、 P -d 1 g変異体又はその一部の検出のために用いることができる。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳述するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。 (実施例 1) P— d 1 gの同定

( 1) データベース検索（I)をインターネット（ http：〃 www.ncbi.nlm .

nih.gov/dbEST/index.htlm) を用いて以下のように行った。

ショウジヨウバエの d 1 1分子をコードする遺伝子の情報を基に、イン夕一ネット上の遺伝子デ一夕ベースにアクセスし、コンピュータを用いてホモロジ一 · サーチを行った。具体的には、染色体 10番目の位置に存在する E S Tを Unige ne デ——夕——ベ一ス (http： //ww .ncbi. nml.nih.gov/UniGene/mdex.html )から調ベたところ、 H29224という E S Tのフラグメントが見い出された。このフラグメン卜についてさらに、解析したところ同じクローン由来の E STフラグメントが Η29225であることが判明した。この 2つの E S Τについて、別のデ一夕一ベース、 T I GRデ一夕べ一ス（http：〃 www.tigr.org/tigr_home/tdb/)で検索したところ以下の配列表で示す、 THC79238がこれらの 2つの E STをカバ一するフラグメントであることが判明した。

TCCAGGAGGC TCAGCATGTC TGAAGTCAAA GATGACAATA GCGCCACAAA GACGCTGTCA GCGGCTGCAC GCCGGTSCTT TTTTCGGAGG AAACACAAGC ACAAACGCAG CGGGTCCAAG GACGGGAAAG ACCTGCTCGC CTTGGATGCC TTTTCCAGTG ACTCCATTCC ACTCTTTGAA GATTCGGTGA GCCTGGCCTA TCAGCGGGTC CAGAAGGTGG ACTGCACCGC TCTGAGGCCT GTCCTGATTC TGGGGCCTTT GCTGGACGTG GTGAAGGAGA TGCTGGTGAA TGAGGCTCCT GGCAAGTTCT GCAGATGTCC CCTTGAGGTG ATGAAGGCCT CCCAGCAGGC CATTGAGCGG GGTGTCAAAG ATTGCCTGTT TGTCGACTAT AAGCGGAGAA GCGGCCATTT CGATGTGACC ACTGTGGCGT CAATAWAGGA GATCACAGAA AAGAACCGAC ACTGCCTCCT GGACATTGCT CCGCACGCTA TTGAGCGGCT CCACCACATG CACATCTACC CCATTGTCAT CTTCATCCAC TACAAGAGCG CCAAGCACAT CAAGGAGCAG AGAGACCCCA TCTACCTGAG GGACAAGGTG ACTCAGAGGC ATTCCAAAGA GCARTTTGAG GCGGCGCAGA AGCTTGAGCA GGAGTACAGC AGGTACTTCA CAGGGGTCAT CCAGGGAGGA GCCCTGTCAA GCATTTGCAC TCAGATCTTG

この配列を基に、ヒト由来の新規 d 1 gフアミリ一分子の取得を試みた。

(2) 5' 伸長反応（I)

前記のデ一夕ベースより取得した HTC79238の配列を詳細に調べたところ終始コドンがあることが判明した。そこで、この配列をもとにして、全長の cDNAを取得するために、遺伝子の翻訳開始領域があると考えられる 5' 側への伸長反応を PCR操作を用いて行った。

( I ) ブライマーの合成

AS 3プライマー（5' — GCATCCAAGGCGAGCAGGTCTTT - 3 ' ) , AS 2プライマー（5' -TGCAGCCGCTGACAGCGT C TTTGT- 3 ' ) 及び T 7プライマ一（ 5' -ΑΑΤ ACGACT CACT A TAG— 3， ) を設計し、 DNA合成機（AB Iモデル 392) にて合成した。合成した DN Aプライマ一は蒸留水中に、 20 pmol/〃 1になるように溶解した。これを P CRブライマ一として用い、以下の P CR操作を行った。

(II) P CR操作

最初に、 AS 3プライマ一を用いて一方向のみへの P CR操作（以下、シングル P CR操作という場合あり）を行った。

PCR操作は、ヒト胎児脳の cDNA ( l ug/j l) 2〃1、 dNTP混合液（各 NT Pが 2 Opmol/〃1にて蒸留水中に溶解されている） 1 〃1、 AS 3プライマ一（20 pmol/ il) 1〃1、 1 0倍濃度の P CR緩衝液（400 mM Tri s-HCl(pH 8.3)、 1 M KC1 、 100 mM MgCl₂、 100 mM DTT) 1. 5〃 1、蒸留水 9 〃 1及び T a qポリメラ一ゼ（5 un i t s/ l) 0. 5 1 (合計 1 5 j l) の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル 1 5〃 1を重層し、 94°Cで 5分間放置した。その後、「60°Cで 30秒間、続いて 72°Cで 1. 5分間、続いて 94°Cで 30秒間のサイクル」を 50回繰り返して反応を行つた。次いで 55°Cで 2分間、最後に 72°Cで 1 0分間反応させて、断片の伸長反応を行い P CR操作を完了した。

その後、上記で得た P CR産物を鍊型として、 2度目の P CR操作を行った。 2度目の P CR操作は、上記で得た PCR産物（ l /g/〃l) 5〃1、 dNT P混合液（各 NTPが 2 Opmol/〃1にて蒸留水中に溶解されている） 1 〃1、 AS 2プライマ一（20 pmol// l) 1〃1、 T 7プライマー（20 pmol/ il) 1 μ.1、 1 0倍濃度の PCR緩衝液（400 mM Tris-HCl(pH 8.3)、 1 KCK 100 mM MgCl_2s 100 mM DTT) 2〃 1、蒸留水 9. 5〃 1及び T a qポリメラ一ゼ ( 5 un i t s/μ, Ι) 0. 5 1 (合計 20〃1) の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル 20 1を重層し、 94°Cで 5分間放置した。その後、「60°Cで 30秒間、続いて 72 で1分間、続いて 94°Cで 30秒間のサイクル」を 40回繰り返して反応を行った。次いで 55°Cで 2分間、最後に 72°Cで 10分間反応させて、断片の伸長反応を行い PC R操作を完了した。 (III) DN A塩基配列決定

上記で得た 5，側伸長反応による約 0.6kbpの DNA断片（以下フラグメント A という）について T 7プライマーを用いて Dy e夕一ミネ一夕一法によりダイレクト DNAシークェンスを行った。すなわち、上記得た P CR産物をミニゲル電気泳動（0.75%ァガロースゲル）させて、 P— d 1 gのフラグメントのバンドをゲルから切出した。 GeneClean (BiolOl社製）で P C R産物を回収してミニゲル電気泳動（0.75%ァガロースゲル）でバンドをチェックした。

プラスミド ND Aを 1 1とり、 99〃 1の TEにて希釈した。 A260を測定、 D NA値を計算した（A260、 1.0 = 50〃 1/ml) 。 A260より、 DNAが

となるように TEにて希釈した。ダイ夕一ミネ一夕一法により、 DNAシーケンスを行った（AB Iモデル 373 A) 。

(3) デ一夕ベース検索

(2) で得られた DN A配列をもとにして、 ESTデ一夕べ一ス（NCBIのサイト； [http：〃 www. ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index. html]) (ESTデータべースとは、 mRNAの断片を取得してその配列決定を行った結果得られた配列をデータベースとして登録してあるものである）でホモロジ一検索を行った。その結果、上記の配列と一部一致する、 THC 90513という配列が確認された。この TH C 90513、上記で得られたフラグメント A及び TH C 79238の 3つの配列を 5' から 3，へとコンピュータ上で結合させた。次いで、 3つの配列の結合により得られた DNA配列を、 E S Tデ一夕べ一スを用いて更に検索すると、一部において一致する配列として W 26281が確認された。

(4) 5，側伸長反応（II)

(I)コンピュータ上での伸長 W2 6 2 8 1及び上記の 3種の配列から得られた配列をコンピュータ上で、 5，から 3，へと結合し、約 2.4kbpの DNA断片の配列を得た。その後、上記操作により得た DN A断片をもとに、胎児脳の c DNAライブラリーを用いて P C R操作により更に 5，側への伸長反応を行った。

(II) c DNA断片の取得

上記操作（4) (I)により得られた約 2.4kbpの DNA断片の 5，末端領域は W 2 6 2 8 1のフラグメン卜に相当し、一方 3 ' 末端領域は THC 7 9 2 3 8のフラグメントに相当する。 W2 6 28 1のフラグメン卜に相当する部分にセンスプライマ一（5 ' - AAAGAC AAC C C CAGGAT T CGGAAG- 3' ) を設定し、一方 THC 7 9 2 3 8のフラグメントに相当する部分にアンチセンスプライマ一（5 ' - CGT GAAC T C CT CAGGGCGGTAC T G- 3 ' ) を設定し、これを用いて、ヒト胎児脳の c DNAライブラリーを錄型として、再度以下の条件にて P CR操作を行い、上記（4) (I)で得られた約 2.4kbpの配列に対応する部分の cDNA断片を得た（以下フラグメント Bという）。

(i)プライマ一の合成

センスプライマ一及びアンチセンスプライマ一は DN A合成機（AB Iモデル 3 92) にて合成した。合成した DN Aプライマ一は蒸留水中に、 20 pmol/〃 lになるように溶解した。これを P CRブライマ一として用い、以下の P C R操作を行った。

(ii)P CR操作

P CR操作は、ヒト胎児脳の c DNA ( l jug/ D 5〃1、 dNTP混合液 (各 NT Pが 2 Opmol/〃1にて蒸留水中に溶解されている） 1 〃1、センスプライマ一（20 pmol/〃l) 1 j 1_N アンチセンスプライマ一（20 ρπιο1/〃1) 1 〃1、 1 0倍濃度の P CR緩衝液（400 mM Tris-HCl(pH 8.3)、 1 M KC1 、 100 m M MgCl₂、 100 mM DTT) 2〃 1、蒸留水 9. 5〃 1及び T a qポリメラーゼ（ 5 un i t s/ l) 0. 5 jti l (合計 2 0〃 1 ) の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル 20〃1を重層し、 94°Cで 5分間放置した。その後、「60 °Cで 30秒間、続いて 72 °Cで 1分間、続いて 94 °Cで 30秒間のサィクル」を 40回繰り返して反応を行った。次いで 55°Cで 2分間、最後に 72°C で 10分間反応させて P CR操作を完了した。

(III)ミニゲル電気泳動

上記の反応後、 PCR生成物についてミニゲル電気泳動（0.75%ァガ口一スゲル）を行なった。その結果、約 2.4kbpのバンドが観察された。このバンドを新規な d 1 gフアミリ一分子をコ一ドする遺伝子の一部と考えた。

(5) ノーザン 'プロヅトによる解析

上記操作により得られた DN A断片がどのような組織において発現しているかを以下の様にして検討した。

ヒトの各組織のポリ A + RNA (mRNA) 及びヒトの各種細胞株のポリ A + RNA (mRNA) それぞれについて、各 2〃 gをメンブレンにブロットしたキッ卜 (Human Multiple Tissue Northern Blot I, II及び Human Cancer Cell Line Multiple Tissue Northern Blot) をクロ一ンテック社より購入した。

(4) で得られたフラグメント Bの DNAを以下の通りにして、このメンブレンにハイブリダィズさせた。まず、上記 DNAの断片を、ランダムプライムド ' ラベリングキット（TAKARA社製）を用いて、。 ² P— CTPで標識した。次いで、標識した cDNAを、ハイストリンジエンシーの条件下で、 Molecular C1 oning: A Laboratory Manual 2nd Edition, p.7.39〜7.52の記載に従って、メンプレンにハイプリダイズさせた。

各組織についての結果の写真を、図 1〜3に示す。写真より、 P— d igが、前立腺、胎盤、甲状腺、脊髄、気管及び副腎において発現していることが判った。各種細胞についての結果の写真を図 4に示す。写真より、 He la (ヒト子宮けいガン）に発現が認められた。

上記のように特に前立腺で、高い発現が認められた。そこで、ヒト前立腺の cD N Aライブラリ一を鍊型として用いて、後述の操作により完全長の cDN Aの取得を試みた。

(6) 5' 側伸長反応（III)

(I) プライマ一の合成

AS4プライマ一（5' -CGTGAACTCCTCAGGGCGGTACT

G- 3 ' ) , AS 5プライマ一（5，一 CTTCAGGCGGACGCCAGC C CT- 3 ' ) 及び T3プライマ一（5' -ATTAACCCTCACTAAA G— 3，）を設計し、 DNA合成機（AB Iモデル 392) にて合成した。合成した DNAプライマ一は蒸留水中に、 20 pmol/ 1になるように溶解した。これを P CRブライマ一として用い、以下の P CR操作を行った。

(II) PCR操作（ i)

AS 4プライマ一を用いてシングル P CR操作を行った。

PCR操作は、ヒト前立腺の cDNA (クローンテック社より購入（l〃g/〃 1) 2 1、 dNTP混合液（各 NTPが 2 Opmol/ 1にて蒸留水中に溶解されている） 1 〃1、 AS 4プライマー（20 pmol/〃l) 1〃1、 10倍濃度の PCR緩衝液（400 mM Tris-HCl(pH 8.3)、 1 M KC 100 mM MgC12、 100 mM D TT) 1. 5〃 1、蒸留水 9〃 1及び T a qポリメラーゼ（ 5 u n i t s /〃 1 ) 0. 5〃1 (合計 15〃1) の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル 15〃1を重層し、 94°Cで 5分間放置した。その後、「60°Cで 30 秒間、続いて 72°Cで 1. 5分間、続いて 94°Cで 30秒間のサイクル」を 50 回繰り返して反応を行った。次いで 55°Cで 2分間、最後に 72°Cで 10分間反応させて、断片の伸長反応を行い PCR操作を完了した。

(III) P CR操作（ii)

その後、上記で得た PCR産物を錶型として、 3，部分のプライマーとして A S 5プライマー（5' -CTTCAGGCGGACGCCAGCCCT-3' ) 及び 5，部分のプライマーとして T 3プライマ一（5， — ATTAACCCTC ACTAAAG— 3 ' ) を用いて 2度目の P C R操作を行った。

2度目の P CR操作は、上記で得た P CR産物 5〃1、 dNT P混合液（各 N T Pが 2 Opmol/〃1にて蒸留水中に溶解されている） 1 〃1、 AS 5プライマ — (20 pmol/〃l) 1〃1、 T 3プライマ一（20 pmol/〃l) 1 〃1、 1 0倍濃度の P CR緩衝液 2〃1、蒸留水 9. 5〃1及び T a qポリメラ一ゼ（5 u n i t s/〃l) 0. 5〃1 (合計 2 O j l) の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル 2 0〃 1を重層し、 9 4 °Cで 5分間放置した。その後、「 6 0 °Cで 3 0秒間、続いて 7 2 °Cで 1分間、続いて 9 4 °Cで 3◦秒間のサイクル」を 40回繰り返して反応を行った。次いで 5 5°Cで 2分間、最後に 7 2°Cで 1 0分間反応させて、断片の伸長反応を行い P CR操作を完了し、約 1.3kbpの D NA断片（以下フラグメント Cという）を得た。

(IV) DNA配列決定

上記で得たフラグメント Cについて T 3プライマ一を用いてダイ夕一ミネ一夕一法によりダイレクト DNAシークェンスを行った。

上よりフラグメント A, B， Cの 3つの断片の配列が決定された。フラグメント Aは Bに含まれ、フラグメント B， Cにより全長の遺伝子の配列が決定された。各フラグメン卜の関係を図 8に示す。

( 7 ) 全長 c DNAの取得

(I)プライマ一の合成

フラグメント Bおよび Cにより得られた DN A断片のシークェンスのデータをもとに、 5，末端部にセンスプライマ一（5， -TAGCAGACAC T CT T G C C CT TGCA— 3， ) を、一方 3，末端部にアンチセンスプライマ一（5， -T CAC CT T C C C C CATT GTGGGAGGA- 3 ' ) を設定し、これを用いて、ヒト前立腺の c DNAライブラリ一を錶型として、再度以下の条件にて P CR操作を行い、全長コード領域を得た。

センスプライマー及びアンチセンスプライマーは DN A合成機（AB Iモデル 392) にて合成した。合成した DNAプライマーは蒸留水中に、 20 pmol/ 1 になるように溶解した。これを PCRブライマーとして用い、以下の P CR操作を行った。

(II)P CR操作

PCR操作は、ヒト前立腺 cDNA ( l j g/jLLl) 5〃 1、 dNTP混合液 (各 NTPが 2 Opmol/〃1にて蒸留水中に溶解されている） 1 〃1、センスプライマ一（20 pmol/ l) 1〃 1、アンチセンスプライマ一（20 pmol/〃l) 1 〃 1、 1 0倍濃度の P CR緩衝液 2〃 1、蒸留水 9. 5〃 1及び T aqポリメラ一ゼ（ 5 un i t s/〃l) 0. 5〃1 (合計 20〃 1) の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラルオイル 20〃 1を重層し、 94°Cで 5分間放置した。その後、「 60 °Cで 30秒間、続いて Ί 2 °Cで 1分間、続いて 94 °Cで 3 0秒間のサイクル」を 40回繰り返して反応を行った。次いで 55°Cで 2分間、最後に 72 °Cで 1 0分間反応させて、 P CR操作を完了し、全長の cDNAを得た。

(III)配列決定

この全長 c DN Aをシークェンスした。その結果、配列表の配列番号 2に示す、目的の遺伝子の全長を含む配列が得られた。この遺伝子を、 P— d i g遺伝子と命名した。 P— d 1 g遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号 1に示す。

さらに、 P— d 1 g c DNAを P CGNベクター（インビトロジェン社製）に組み込み、 E. c 01 i (HB 10 1) に導入し、形質転換を行った。この形質転換体は、平成 9年 2月 14日に、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、平成 10年 1月 21日にブタペスト条約に基づく寄託に移管した（受託番号 FER M BP— 6234) (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）。

(実施例 2) 染色体マッピング (実施例 1 ) により得られた P— d 1 gの全長 c DNAの染色体マツビングを行った。 P— d 1 gの全長 c DNAを E S Tデ一夕ベースを用いて解析したところ、 ESTに登録されている複数の配列が、 P— d 1 gcDNAの配列の一部とォ—バーラップした。その結果、 P— d 1 g遺伝子は E T Sデ一夕ベースの登録されている WI 7219と WI 4544の間に位置し、染色体の 10番上に位置づけられた。具体的には 10 q 24に位置付けられた（これはもとの H 2922 4がここにマツピングされているため同じ位置と考えた）。

(実施例 3) P— d 1 gに対する抗体の作製

(I)抗原の調製

P-d 1 gの一部の配列であり下記のぺプチドをぺプチド合成機（AB I社製、モデル 431 A) で合成した。

配列 1 ： P— d 1 gに特異的な配列（ 604位〜 623位までの配列）： KEQRDPIYLRDKVTQRHSKEのN末端にC (Cys) を付けた 2 1 me rのぺプチド

(II)ポリクロ一ナル抗体の作製

(I)で合成したぺプチドについて以下の手順で抗体を作製した。

(i)合成したぺプチド 2mgをマレイミド化 KLH (スカシ貝のへモシァニン） (ピアス社製） 2mgに結合させた。反応はピアス社のキットに記載の方法に従つて行なった。

(ii)このペプチド一 KLHの 100〃gを 1回の免疫で使用した。すなわち、ぺプチド— KLH液（ 1 / g/ml) 100〃1、 PBS 0. 5 ml及びフロイント 'コンプリート 'アジュバント（ディフコ社製） 0. 5mlをシリンジに取り、混合してェマルジヨンとし、これを初回免疫に用いた。

(iii)このェマルジヨンをゥサギに皮下接種した。接種はゥサギの背に 4力所に分けて接種した。 (iv)l週間後、 2回目の免疫を行なった。 2回目からはアジュバントをフロイント · ィンコンプリート ·アジュバント（ディフコ社製）に変えて免疫を行なつた。その他の操作は 1回目同様である。 2回目以降は 1週間間隔をあけて、合計 6回免疫を行なった。

(V)最終免疫の 1週間後、採血して血清を取得した。血清は採血した血液を室温で 3時間放置し十分に血液凝固を行なった後、 3， 000 rpm、 5分間遠心分離を行い、上清（血清）を回収した。

(vi)この血清に 100%の飽和硫安を最終濃度が 50%飽和になるように加え塩析した。このサンプルを遠心分離して、抗体が含まれる画分を沈殿させた。その後、沈殿物を PBSに溶解し、さらに PB Sに対して透析した。その後、 Protei n Gセファロ一ス 'カラム（フアルマシア社製）を用いて、抗体をァフィ二ティ一精製した。その結果、全量で 37 Omgの I gG画分を得た。

(vii)上記の操作で得た I gG画分をさらに、免疫に使用した（ i )で合成したぺプチドを用いてァフィ二ティー精製した。ペプチドカラムは、（i) で合成したペプチドを NHS—活性化セファロ一ス（フアルマシア社製）に、添付のマニュアルに従い結合させて作製した。このカラムを用い、 vi)で得た精製された I g G画分をさらにァフィ二ティー精製した。その結果、全量で 5 mgのペプチド特異的抗体が得られた。

(III)抗体の力価測定（EL I S A)

(II)で得られたぺプチド特異的抗体の力価を E L I S Aにて測定した。

(i) 抗原液（配列 1のペプチド）を 25〃g/mlの濃度となるように PB S に溶解して、 96ゥエル E L I S Aプレート（ Xenobind、キセノポア社製）各ゥエルに 50〃 1ずつ分注し、 4°Cでー晚放置した。

(ii)抗原液を捨て、蒸留水で 4倍に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）を各ゥエルに 200 1ずつ分注し、室温で 2時間放置することによりブロッキングを行なった。 (iii)プロッキング液を捨て、 1次抗体として検討すべき精製した抗体を添加した。精製抗体は 96ゥエルの 1列目から順に 1 0〃g/ml、 5〃g/ml、 2 . 5j g/ml · · · 'の濃度となるように、 PB Sで倍々希釈した液を各ゥエルに、 50〃 1/ゥヱルの量にて分注した。最終ゥヱル中の抗体の濃度は約 0. 004〃g/mlとなった。なお、コントロールとして、免疫していないゥサギの血液から精製した I gGを用いた。各ゥエルに分注後、室温で 1時間放置した。

一次抗体を含む液として、ゥサギより採取した血清を用いる場合は、最初のゥエルに PB Sを用いて 40倍に希釈した液を入れ、順に PB Sを用いて倍々希釈した液を入れた。

(iv)抗体液を捨て、 0. 05 %Twe e n 20/PB Sでプレートを 4回洗浄し、次いで 2次抗体液として P B Sで 1000倍希釈したピオチン化抗ゥサギ I gG 抗体（ベクタ一社製）を各ゥヱルに 50〃 1ずつ分注し、室温で 1時間放置した。

(V) 2次抗体液を捨てた後、 0. 05%Twe e n 20/PB Sでプレートを 4 回洗浄し、 1 000倍に希釈した AB C溶液（ベクタ一社製）を各ゥエルに 50 1ずつ分注した。その後室温で、 30分間放置した。

(vi)次いで、 ABC液を捨てた後、 0. 05%Twe e n 20/PB Sでプレートを 4回洗浄し、 OPD (オルトフエ二レンジァミン）一 H ₂0₂/P CBを各ゥエルに 100〃 1ずつ分注した。十分に発色後、 2 Nの硫酸で反応を止めた後、 490 nmでの吸光度をマイクロ · ブレートリーダー（ Bio- rad社製）にて測定した。

この結果を図 5に示す。図中、横軸は加えた抗体の濃度又は血清の希釈倍数を表しており、縦軸は 490 nmにおける吸光度を表わしている。図から判るように、免疫したゥサギ由来の抗体価はコントロールに比べて高く、配列 1のぺプチドに対するポリクローナル抗体が取得できた。 (実施例 4) ウエスタンプロヅト

(実施例 3)で得られた P— d 1 g抗体を用いてウエスタンブロットを行った。以下にプロトコルを示す。

(I) P-d 1 g遺伝子を導入した CO S細胞及びその親株の細胞（P— d 1 g遺伝子がない細胞： Mo c kと表記する）について 1 X 10⁰個の細胞を、以下のようにして溶解しその上清を回収した。

細胞溶解液の組成は、 50 m Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X- 100, 50 m Mョ一ドアセトアミド， 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂,0.1% NaN₃, 10 g/ml大豆トリプシン 'インヒビ夕一， 1 g/ml ァプロチニン， 1 mM PMSF (フエニル ·メチル ·スルホニル . フロライド），1 〃_g/ml ロイぺプチンである。この細胞溶解液 100〃1を、細胞のペレツトに加えよく攪拌して溶解した。氷上に 60分間放置した後、 15,000 rpm、 10分間遠心分離し、上清液を回収した。

(II)回収した上清液に、免疫していないゥサギの I gG lmgを結合させた C NBr活性化セファロ一ス . ビーズ（フアルマシア社製）（抗体濃度 lmg/ 1 ml樹脂） 50 1を添加した。 4°Cで一晩反応後、遠心分離を行ない、ビーズに結合する非特異的結合蛋白質を除去し、上清を回収した。

(III) (II)で得られた上清 10〃1を、等量の SD S— PAGE用サンプルバッファー及び 1〃 1の 2 _メルカプトエタノールと混和し、 95 °Cで熱処理を 5分間行なった後、 5— 20%のグラディェント ·ゲルで電気泳動した。

(IV)電気泳動後、トランスプロットシステム（マリソル製）を用い、泳動された蛋白質を二トロセルロース膜に転写した。

(V)ニトロセルロース膜をブロックエース（大日本製薬製）に浸し、 1時間放置してブロッキングした。その後、 0. 05%Tween20/PBSで 5分間 X 2回洗浄した。

(VI )実施例 3で調製した配列 1に対する抗 P— d 1 g抗体を 1〃 g/m 1になるように PB Sで希釈したものを、メンブレンに加え室温で 2時間反応させた。その後、メンブレンを 0. 05 %Twe e n 20/PB Sで 5分間 x 3回洗浄した。 (VII)ペルォキシダ一ゼ標識抗ゥサギ I gG溶液（カルタグ社製）を PBSで 1 000倍に希釈した液を、上記メンブレンに加え、さらに 1時間室温にて反応させた。その後、 0. 05%Tween20/PBSで 5分間 X 3回洗浄した。 (VIII)E CLキット（アマシャム社製）の発色液 5mlをメンブレンに加えて 1分間反応させた。その後、このメンブレンを X線フィルムに 20秒間露光して現像した後、写真撮影した。その結果を図 6に示す。図 6では、 P— d lg導入 COS細胞において、約 110 kdの位置に P— d 1 g分子のバンドが確認された。この分子量は、 P— d 1 gのアミノ酸配列から予想される分子量とほぼ一致する。なお、 Mockでは該バンドはみられなかった。

(実施例 5) 組織染色

(実施例 3) で得られた抗体を用いて P— d 1 gが発現している細胞における P— dglの発現状態を免疫組織染色により検討した。材料は、ヒトの前立腺細胞株 PC— 3を用いて、以下の通りにして行った。

(I)細胞をラブチェック 'チャンバースライド中で培養した。

(II)次いで、スライド培養した細胞を 3. 7%ホルムアルデヒドで 3分間処理した後、 — 20°Cで冷却したメタノールで 3分間処理を行ない固定した。その後、スライドを 50 mM T r i s -HC 1 ( H 7. 5) で洗浄した（ 5分間 x 3 回）。

(III)ブロックエース（大日本製薬社製）をスライドグラス上の組織の上にのせ、室温で 1時間放置してプロッキングを行なつた。その後、スライドを 50 mM Tr i s-HCl (pH7. 5) で洗浄した（5分間 3回）。

( IV)実施例 3で調製した配列 1に対する抗 P— d 1 g抗体を 1 UL g/m 1になるように PB Sで希釈したものを、スライド上の細胞に加え、室温で 1時間反応させた。その後、スライドを 50 mM T r i s -HC 1 (pH 7. 5) で洗浄した（5分間 3回）。

(V) PB Sで 1000倍に希釈した F I TC標識抗ゥサギ I gG抗体液（カル夕グ社製）をスライド上の細胞に加え室温で 1時間反応させた。その後、スライドを 50mM T r i s -HC 1 ( H 7. 5) で洗浄した（ 5分間 x 3回）。

(VI)得られたスライドを蛍光顕微鏡で観察した。結果を図 7に示す。図 7より P — d 1 gは細胞質と細胞膜の境界部分に強く発現していることが確認された。産業上の禾リ用可能性

本発明は、ヒト由来新規 d 1 gファミリ一分子、それに対する抗体、さらには該分子をコードする遺伝子を提供する。また、本発明は、検体中の前記ポリヌクレオチドを検出するためのポリヌクレオチドプローブを提供する。

また、 P— d 1 g遺伝子が前立腺において強く発現されていることを見出した。前立腺癌では、染色体 10番の長腕の欠失が多発しているが、染色体 10番は本発明の P— d 1 g遺伝子が配座していると考えられ、本発明の P— d 1 g遺伝子が、前立腺癌に関し有用な知見を与え得るものである。さらに、本発明の P— d 1 gは、前立腺の発ガンのメカニズムの解明にも有用な知見を与え得るものである。また、本発明の P— d i gは、細胞内蛋白としての d 1 gファミリー分子の機能解明、細胞内の蛋白移送のメカニズムの解明に有用である。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 6 7 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Met Arg Ala Thr His Gly Ser Asn Ser Leu Pro Ser Ser Ala Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Ser Ser Asn Leu Gin Phe Lys Ala Glu Arg l ie Lys He Pro

20 25 30

Ser Thr Pro Arg Tyr Pro Arg Ser Val Val Gly Ser Glu Arg Gly Ser

35 40 45

Val Ser His Ser Glu Cys Ser Thr Pro Pro Gin Ser Pro Leu Asn l ie 50 55 60

Asp Thr Leu Ser Ser Cys Ser Gin Ser Gin Thr Ser Ala Ser Thr Leu 65 70 75 80

Pro Arg l ie Ala Val Asn Pro Ala Ser Leu Gly Glu Arg Arg Lys Asp

85 90 95 Arg Pro Tyr Val Glu Glu Pro Arg His Val Lys Val Gin Lys Gly Ser

100 105 110

Glu Pro Leu Gly l ie Ser He Val Ser Gly Glu Lys Gly Gly l ie Tyr

115 120 125

Val Ser Lys Val Thr Val Gly Ser l ie Ala His Gin Ala Gly Leu Glu 130 135 140

Tyr Gly Asp Gin Leu Leu Glu Phe Asn Gly l ie Asn Leu Arg Ser Ala 145 150 155 160

Thr Glu Gin Gin Ala Arg Leu l ie He Gly Gin Gin Cys Asp Thr l ie

165 170 175

Thr l ie Leu Ala Gin Tyr Asn Pro His Val His Gin Leu Ser Ser His

180 185 190

Ser Arg Ser Ser Ser His Leu Asp Pro Ala Gly Thr His Ser Thr Leu

195 200 205

Gin Gly Ser Gly Thr Thr Thr Pro Glu His Pro Ser Val l ie Asp Pro 210 215 220

Leu Met Glu Gin Asp Glu Gly Pro Ser Thr Pro Pro Ala Lys Gin Ser 225 230 235 240

Ser Ser Arg l ie Ala Gly Asp Ala Asn Lys Lys Thr Leu Glu Pro Arg

245 250 255

Val Val Phe l ie Lys Lys Ser Gin Leu Glu Leu Gly Val His Leu Cys

260 265 270

Gly Gly Asn Leu His Gly Val Phe Val Ala Glu Val Glu Asp Asp Ser

275 280 285

Pro Ala Lys Gly Pro Asp Gly Leu Val Pro Gly Asp Leu l ie Leu Glu 290 295 300

Tyr Gly Ser Leu Asp Val Arg Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Tyr Val 305 310 315 320

Glu Met Leu Lys Pro Arg Asp Gly Val Arg Leu Lys Val Gin Tyr Arg

325 330 335

Pro Glu Glu Phe Thr Lys Ala Lys Gly Leu Pro Gly Asp Ser Phe Tyr

340 345 350 l ie Arg Ala Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Asp Val Glu Gin Glu Leu Ser ¾IV 9Π dsy na na STH 3JV usy s \Q J d\\ n|g ¾¾x Q\\

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99C 09C 9SC

ll9TO/86dT/I3d Sf OAV 565 570 575

Pro His Ala lie Glu Arg Leu His His Met His He Tyr Pro lie Val

580 585 590 lie Phe lie His Tyr Lys Ser Ala Lys His lie Lys Glu Gin Arg Asp

595 600 605

Pro lie Tyr Leu Arg Asp Lys Val Thr Gin Arg His Ser Lys Glu Gin

610 615 620

Phe Glu Ala Ala Gin Lys Leu Glu Gin Glu Tyr Ser Arg Tyr Phe Thr 625 630 635 640 Gly Val He Gin Gly Gly Ala Leu Ser Ser lie Cys Thr Gin lie Leu

645 650 655

Ala Met Val Asn Gin Glu Gin Asn Lys Val Leu Trp lie Pro Ala Cys

660 665 670

Pro Leu 配列番号 2

配列の長さ： 3035

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA t o mRNA

配列

TAGCAGACAC TCTTGCCCTT GCATCTGCAG GAACAGAAGT GTGTCCCGGC CAGTGGAGAA 60 CTCTCCCCGG AGCTCCAGGA GTGGGCACCT TACTCGCCTG GGCATTCCAG CCGGCACAGC 120 AACCCCCCGC TATACCCTAG CAGGCCGTCT GTGGGCACTG TTCCCCGGAG TTTGACCCCC 180 AGCACCACTG TGAGCTCCAT CCTGCGGAAC CCCATCTACA CTGTGCGCAG TCACAGGGTC 240

GGCCCCTGCA GCTCTCCACC TGCGGCCCGA GATGCTGGCC CCCAGGGTTT GCATCCCAGT 300 GTCCAGCACC AGGGACGCCT GAGCCTGGAC CTGAGCCACA GGACCTGCAG CGACTACTCC 360

GAG ATG AGA GCC ACC CAT GGG TCC AAC TCA CTG CCC TCC AGC GCC CGC 408

CTG GGT TCT TCG AGT AAC TTG CAG TTC AAG GCG GAA CGC ATT AAA ATC 456

CCA TCA ACA CCA AGA TAT CCG CGG AGT GTC GTG GGC TCC GAG AGA GGT 504 TCA GTG TCA CAT TCT GAA TGC AGC ACT CCT CCA CAG TCA CCC CTG AAC 552

ATC GAC ACC CTG TCC TCT TGT AGC CAG TCC CAG ACC TCA GCC TCC ACA 600

TTG CCC AGA ATC GCT GTC AAC CCC GCG TCC CTC GGG GAG CGG AGA AAG 648

GAC AGG CCT TAT GTG GAG GAG CCA CGC CAC GTG AAG GTG CAG AAG GGC 696

TCA GAG CCG CTG GGC ATC TCC ATC GTG AGT GGA GAG AAG GGC GGC ATC 744 TAC GTC TCC AAG GTG ACC GTG GGG AGC ATC GCT CAC CAG GCT GGC CTC 792

GAG TAT GGG GAT CAG TTA CTG GAG TTC AAC GGC ATA AAC CTG CGG AGC 840

GCC ACG GAG CAG CAG GCG CGG CTC ATC ATC GGG CAG CAG TGT GAT ACC 888

ATC ACC ATC CTG GCC CAG TAC AAC CCC CAC GTG CAC CAG CTC AGC AGC 936

CAC TCC CGG TCC AGC TCA CAC CTG GAC CCT GCC GGT ACC CAC TCC ACT 984 CTC CAG GGC AGT GGC ACC ACC ACC CCG GAG CAT CCA TCT GTC ATC GAC 1032

CCA CTG ATG GAG CAG GAC GAG GGG CCT AGC ACC CCC CCA GCC AAG CAG 1080

AGC AGC TCC AGG ATT GCG GGA GAT GCC AAC AAG AAG ACC CTG GAG CCA 1128

CGC GTT GTC TTC ATC AAA AAG TCC CAG CTG GAG CTT GGG GTG CAC TTG 1176

TGT GGT GGG AAC CTG CAT GGG GTG TTT GTG GCC GAG GTG GAG GAT GAC 1224 AGT CCT GCC AAG GGT CCT GAC GGC CTC GTG CCA GGG GAC CTC ATC CTG 1272

GAG TAT GGC AGC CTG GAC GTG CGG AAC AAG ACA GTG GAG GAA GTC TAT 1320

GTG GAG ATG CTG AAG CCC AGG GAT GGC GTC CGC CTG AAG GTG CAG TAC 1368

CGC CCT GAG GAG TTC ACG AAG GCC AAG GGC CTG CCT GGT GAC AGC TTC 1416

TAC ATC AGG GCC CTG TAC GAC CGG CTG GCA GAT GTG GAG CAA GAG TTG 1464 AGC TTT AAG AAG GAC GAC ATC CTC TAC GTG GAT GAC ACC TTA CCC CAG 1512

GGC ACG TTC GGG TCC TGG ATG GCT TGG CAG CTG GAC GAG AAT GCC CAG 1560 AAG ATC CAG CGC GGG CAG ATT CCC AGC AAA TAT GTG ATG GAC CAA GAA 1608

TTC TCC AGG AGG CTC AGC ATG TCT GAA GTC AAA GAT GAC AAT AGC GCC 1656

ACA AAG ACG CTG TCA GCG GCT GCA CGC CGG TCC TTT TTT CGG AGG AAA 1704

CAC AAG CAC AAA CGC AGC GGG TCC AAG GAC GGG AM GAC CTG CTC GCC 1752 TTG GAT GCC TTT TCC AGT GAC TCC ATT CCA CTC TTT GAA GAT TCG GTG 1800

AGC CTG GCC TAT CAG CGG GTC CAG AAG GTG GAC TGC ACC GCT CTG AGG 1848

CCT GTC CTG ATT CTG GGG CCT TTG CTG GAC GTG GTG AAG GAG ATG CTG 1896

GTG AAT GAG GCT CCT GGC AAG TTC TGC AGA TGT CCC CTT GAG GTG ATG 1944

AAG GCC TCC CAG CAG GCC ATT GAG CGG GGT GTC AAA GAT TGC CTG TTT 1992 GTC GAC TAT AAG CGG AGA AGC GGC CAT TTC GAT GTG ACC ACT GTG GCG 2040

TCA ATA WAG GAG ATC ACA GAA AAG AAC CGA CAC TGC CTC CTG GAC ATT 2088

GCT CCG CAC GCT ATT GAG CGG CTC CAC CAC ATG CAC ATC TAC CCC ATT 2136

GTC ATC TTC ATC CAC TAC AAG AGC GCC AAG CAC ATC AAG GAG CAG AGA 2184

GAC CCC ATC TAC CTG AGG GAC AAG GTG ACT CAG AGG CAT TCC AAA GAG 2232 CAE TTT GAG GCG GCG CAG AAG CTT GAG CAG GAG TAC AGC AGG TAC TTC 2280

ACA GGG GTC ATC CAG GGA GGA GCC CTG TCA AGC ATT TGC ACT CAG ATC 2328

TTG GCA ATG GTC AAT CAA GAA CAA AAT AAA GTC CTG TGG ATT CCA GCC 2376

TGC CCG CTC TAG GAGAATGCTG TGCTGTGGAT GACTGCAGCT GGCCGCCTGA 2428

GGGGACACCA GACTCAGCTC TTTTCTAGCG ACTGAAAGTA GAAGTCTGTC CGTCTATGAA 2488 CATGCGGGGG AAGGATCCGG AACCAGGACC CAGAAGCACC TCCTTTGTAG ACAGAGGGCC 2548

ACGGCTGCGT GCGATCCAGG CCCAGGMCCA CACACTCTGC CCGTGTCACA CGTGTGCTTT 2608

AACACAAAAC AGATAACACT AAAGACGGGT TCAGCACCCA CCTTTCTTTA GCCAGCTGAT 2668

CAGAGATGCT GCAAAGAGAA CCTTTCGGAT CACTCGTTTA CAAGCCTTTT CTAAGTATTT 2728

GGTGGTTTAT GTTTACTTGA ACGGCTCCAT GTTGCCGGTG CCCAGCCCCT GTCCCCTCTG 2788 TCAACCCCCT GTCGCTTTGG TGTTGGTTTC GTTCCCGTCT TCAGCAAAAC GACCTTGGAA 2848

CCTCAATGGG GGCTGCTTTG CTTTGGGAGG TTCTTGTTGG TGGGACCAGA GCTTTGACAA 2908 ACCTCCTGCT CCTTGGTGGG CACCTCTCCT GGGAAGGACG TTCACAACTC CAGGGTGCTT 2968

CAGAATGCCT GTGGAACMAG GAACCAGTGG CCTTTGGATT TTTTCCTCCC ACAATGGGGG 3028

AAGGTGA 3035 配列番号 3

配列の長さ： 1 5 0 4

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A t o mR N A

配列

TCCAGGAGGC TCAGCATGTC TGAAGTCAAA GATGACAATA GCGCCACAAA GACGCTGTCA 60 GCGGCTGCAC GCCGGTSCTT TTTTCGGAGG AAACACAAGC ACAAACGCAG CGGGTCCAAG 120 GACGGGAAAG ACCTGCTCGC CTTGGATGCC TTTTCCAGTG ACTCCATTCC ACTCTTTGAA 180

GATTCGGTGA GCCTGGCCTA TCAGCGGGTC CAGAAGGTGG ACTGCACCGC TCTGAGGCCT 240 GTCCTGATTC TGGGGCCTTT GCTGGACGTG GTGAAGGAGA TGCTGGTGAA TGAGGCTCCT 300

GGCAAGTTCT GCAGATGTCC CCTTGAGGTG ATGAAGGCCT CCCAGCAGGC CATTGAGCGG 360

GGTGTCAAAG ATTGCCTGTT TGTCGACTAT AAGCGGAGAA GCGGCCATTT CGATGTGACC 420

ACTGTGGCGT CAATAWAGGA GATCACAGAA AAGAACCGAC ACTGCCTCCT GGACATTGCT 480

CCGCACGCTA TTGAGCGGCT CCACCACATG CACATCTACC CCATTGTCAT CTTCATCCAC 600 TACAAGAGCG CCAAGCACAT CAAGGAGCAG AGAGACCCCA TCTACCTGAG GGACAAGGTG 660

ACTCAGAGGC ATTCCAAAGA GCARTTTGAG GCGGCGCAGA AGCTTGAGCA GGAGTACAGC 720

AGGTACTTCA CAGGGGTCAT CCAGGGAGGA GCCCTGTCAA GCATTTGCAC TCAGATCTTG 780

GCAATGGTCA ATCAAGAACA AAATAAAGTC CTGTGGATTC CAGCCTGCCC GCTCTAGGAG 860

AATGCTGTGC TGTGGATGAC TGCAGCTGGC CGCCTGAGGG GACACCAGAC TCAGCTCTTT 920 TCTAGCGACT GAAAGTAGAA GTCTGTCCGT CTATGAACAT GCGGGGGAAG GATCCGGAAC 980

CAGGACCCAG AAGCACCTCC TTTGTAGACA GAGGGCCACG GCTGCGTGCG ATCCAGGCCC 1040 AGGMCCACAC ACTCTGCCCG TGTCACACGT GTGCTTTAAC ACAAAACAGA TAACACTAAA 1100 GACGGGTTCA GCACCCACCT TTCTTTAGCC AGCTGATCAG AGATGCTGCA AAGAGAACCT 1160 TTCGGATCAC TCGTTTACAA GCCTTTTCTA AGTATTTGGT GGTTTATGTT TACTTGAACG 1220 GCTCCATGTT GCCGGTGCCC AGCCCCTGTC CCCTCTGTCA ACCCCCTGTC GCTTTGGTGT 1280 TGGTTTCGTT CCCGTCTTCA GCAAAACGAC CTTGGAACCT CAATGGGGGC TGCTTTGCTT 1340 TGGGAGGTTC TTGTTGGTGG GACCAGAGCT TTGACAAACC TCCTGCTCCT TGGTGGGCAC 1400 CTCTCCTGGG AAGGACGTTC ACAACTCCAG GGTGCTTCAG AATGCCTGTG GAACMAGGAA 1460 CCAGTGGCCT TTGGATTTTT TCCTCCCACA ATGGGGGAAG GTGA 1504 配列番号 4

配列の長さ： 23

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸

配列

GCATCCAAGG CGAGCAGGTC TTT 23 配列番号 5

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸

配列

TGCAGCCGCT GACAGCGTCT TTGT 24 配列番号 6 配列の長さ： 17

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸

配列

AATACGACTC ACTATAG 17 配列番号 7

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸

配列

AAAGACAACC CCAGGATTCG GAAG 24 配列番号 8

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

トポロジ一：直鎖状

配列の種類：他の核酸

配列

CGTGAACTCC TCAGGGCGGT ACTG 24 配列番号 9

配列の長さ： 21

配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列

CTTCAGGCGG ACGCCAGCCC T 21 配列番号 1 0

配列の長さ： 17

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸配列

ATTAACCCTC ACTAAAG 17 配列番号 1 1

配列の長さ： 23

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸配列

TAGCAGACAC TCTTGCCCTT GCA 23 配列番号 1 2

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸

Claims

求の範囲

1. 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列を有する d 1 gファミリ一分子。

2. 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の、 1又は 2以上のアミノ酸を置換、欠失又は付加させた請求項 1に記載の d 1 gファミリ一分子であって、か oLys-Glu-Gln-Arg-Asp-Pro-Ile-Tyr-Leu-Arg-Asp-Lys-Val-Thr-Gln-Arg-His-Se r-Lys-Gluに対する抗体に反応する機能を有する d 1 gファミリー分子。

3. 請求項 1又は 2に記載の d 1 gフアミリー分子をコ一ドするポリヌクレオ賓

チド。

4. 請求項 1又は 2に記載の d 1 gファミリー分子に対する抗体。

5. 請求項 3に記載のポリヌクレオチドの一部分であり、配列表の配列番号 2 に記載の塩基配列のうちの連続する 12以上の塩基からなる塩基配列を有するポリヌクレオチド。

6. 請求項 5に記載のポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列を含むポリヌクレオチド。

7. 請求項 5又は 6に記載のポリヌクレオチドの誘導体。

8. 配列表の配列番号 2に記載の 364— 2388番の塩基配列からなるポリヌクレオチド。

9. KEQRDP I YLRDKVTQRHSKEなるアミノ酸配列をェピト一プとする請求項 4に記載の抗体。