JP3378600B2 - 低分子量G蛋白質rab3A p25の標的蛋白質 - Google Patents
低分子量G蛋白質rab3A p25の標的蛋白質Info
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Description
的蛋白質およびそれをコードするDNA に関するもので、
医薬の分野で有効に利用される。
どに反応し、お互いに情報を交換することにより生理機
能を発現する。細胞の情報伝達はまず標的細胞の表面受
容体に因子が結合し、次いで細胞膜を横切る受容体が作
動して内部のエフェクター分子を介し、多くの過程を経
て情報の伝達が完了する。近年、この情報伝達機構に関
し飛躍的進展がもたらされ、 GTP結合蛋白質(以下G蛋
白質と略記する)が受容体刺激をエフェクター分子へ伝
達するトランスデューサーとして機能し、ホルモン分
泌、筋肉の収縮、認識などに至る細胞活動において中心
的役割を果たしていることがわかっている。さらに最
近、細胞膜受容体の刺激伝達以後の反応過程に別種のG
蛋白質が関与していることが明らかになった。このG蛋
白質は細胞膜受容体のトランスデューサーとして働いて
いる一群のG蛋白質とは異なり、分子量2万前後の低分
子量G蛋白質の一群である。すなわち細胞の分泌機構に
関して記すと、最初に細胞質で合成された分泌蛋白質が
細胞外へ分泌される場合、小胞形成、小胞と細胞膜との
融合、分泌蛋白の細胞外放出という分泌反応にこの低分
子量G蛋白質が深く関与していることが判明した(Taka
i, Y. et al., Int. Rev. Cytol., 133, 187−230, 199
2)。
rho (A, B , C)、ral 、rab (1-4)など40種以上の低分
子量G蛋白質をコードする遺伝子が哺乳類組織から酵母
に至るまでクローニングされ、これら遺伝子の蛋白質も
順次精製されている。本発明者らはウシ大脳から低分子
量G蛋白質を15種類分離し、均一化に成功した。この中
で新しい低分子量G蛋白質としてrab3A p25 がある(Ki
kuchi, A. et al., J.Biol. Chem., 263, 2897−2904,
1988)。rab3A p25 は ras p21類似低分子G蛋白質の
サブファリーである rabサブファミリーに属している。
この rabファミリーは分泌反応やエンドサイトシスなど
の細胞内小胞輸送の制御に関与していることが明らかに
なっている(Balch,W.B.etal.,Trends Biochem.Sci.,1
5,473-477,1990) 。rab3A p25 は、プレシナプスに存在
し特にアクティブゾーン付近のプレシナプティックメン
ブランとシナプティックベジクルに多く分布しており、
プレシナプスからの神経伝達物質の放出を制御している
ことが明らかになりつつある (Mizoguchi,A.et al.,J.B
iol.Chem.,265,11872-11879,1990) 。 rab3A p25には、
GDP結合型の不活性型と GTP結合型の活性型が存在し、
GDP結合型からGTP 結合型への交換反応は、 GDP結合型
から GTP結合型への変換を制御するGDP/GTP exchange p
rotein(GEP)により制御されている。本発明者らは rab
3A p25に作用する GEPとして、smg p25 GDI (GDP解離抑
制蛋白質)をウシ大脳可溶性画分より精製しその一次構
造を決定している。さらに、本発明者らは smg p25 GDI
が、rab3A p25 の GDP/GTP変換反応を制御するだけでな
く rab3A p25の膜画分から可溶性画分へのトランスロ−
ケションを制御していること、および rabファミリーに
属する rab11 p24やSEC4 p24にも作用することを明らか
にしている。現在までの知見をもとに、本発明者らは、
rab3A p25の作用機構について以下のように考えた。 GT
P結合型の rab3A p25は smg p25 GDIと複合体を形成し
シナプス細胞質に存在しており、 rab GDIと解離すると
rab3A p25は GTP結合型に変換されシナプティックベジ
クル上の標的蛋白質に結合する。この GTP結合型の rab
3A p25が結合したシナプティックベジクルはシナプティ
ックメンブランにtargetしfusionする。
ており、多くの低分子量G蛋白質が小胞輸送に関与して
いるのは種々の小胞がそれぞれ異なったアクセプター膜
にtargeting するために必要であると推定されている。
しかし、これまで標的蛋白質の単離、構造確認はされて
おらず、分泌機構の解明さらに疾患との関係解明のため
にも、標的蛋白質の構造確認が重要な課題となってい
る。
白質 rab3A p25の標的蛋白質の単離、構造解析を行いア
ミノ酸配列およびそれをコードするcDNAを提供すること
にある。
者らはウシ大脳膜画分より rab3A p25と結合する蛋白質
を見いだし部分精製した(Sirataki, H., et al., J. B
iol. Chem., 267, 10946−10949, 1992)。この蛋白質は
分子量 85000で GTP結合型の rab3A p25と結合するが、
GDP結合型 rab3A p25との親和性は低い。またc−ki−
ras p21 やrhoA p21 、smg p21 、rab11 p24 などの低
分子量G蛋白質とは結合しない。さらに本蛋白質は GAP
(GTPase活性促進蛋白質)、GDI (GDP/GTP交換反応を抑
制する GDP解離抑制蛋白質)、GDS (GDP/GTP交換反応を
促進する GDP解離促進蛋白質)活性を有していないこと
から、 rab3A p25の標的蛋白質である可能性が高い。
する塩基配列の解析を鋭意試み、全構造を解明したこと
により本発明を完成するに至った。一次構造解析の結
果、本発明の rab3A p25の標的蛋白質は 704個のアミノ
酸からなる分子量 77、976 の新規蛋白質であり、本発明
者らは rabphilin−3Aと命名した。以下、本標的蛋白質
は rabphilin−3Aと記載する。すなわち、本発明は rab
philin−3Aの全アミノ酸配列、それをコードする DNAお
よび抗 rabphilin−3A抗体に関するものである。rabphi
lin−3Aの機能から神経伝達物質分泌機構および各種脳
疾患病理解明の試薬として、さらに同疾患の治療、診断
への応用が期待される。以下に本発明を詳細に説明す
る。
him., 267, 10946−10949, 1992)に従い、ウシ大脳を原
料としてコール酸抽出により粗膜画分を得る。この粗膜
画分をコール酸含有 Buffer A (20mM HEPES−NaOH, pH
7.4, 5mM MgCl2, 1mMジチオスレイトール)を用いる
食塩濃度勾配抽出法にて Q−Sepharoseカラムで精製す
る。得られた目的画分を CHAPS含有 Buffer A を用いる
Mono Qカラム、CHAPS およびKH2PO4含有 Buffer A を
用いるヒドロキシアパタイトカラムにて精製し、次い
で、5 - 20%ショ糖密度勾配超遠心法により高純度精製
品を得ることができる。最後にこの高純度 rabphilin−
3Aを SDS−PAGEにて分画し、PVDF膜(ポリデニリデンジ
フルオリド膜)に転写する。転写後 Ponceau Sで染色
し、 rabphilin−3Aに相当するバンドを切り出し単離し
た。
ンキング法により rab3A p25との結合性を測定すること
により行う。すなわち放射性ヨードラベルしたGTPγS
結合型のrab3A p25 と各カラムによる分画した画分を反
応させ、反応液を SDS−PAGE(10%ポリアクリルアミド
ゲル)にかけて、分子量約 110、000のバンドの有無を測
定することにより rabphilin−3Aの同定・確認すること
ができる。大腸菌由来 rab3A p25は Arakiらの方法によ
り rab3A p25をoverexpressionした大腸菌より調製する
ことができる(Araki, S. et al., Mol. Cell. Biol.,
11, 1438−1447, 1991)。
ter preteaseIにて分解処理し、その処理液をC8 逆相
カラムクロマトグラフィにかけ、出現するペプチドのピ
ークをそれぞれ分取しアミノ酸シークエンサーによりア
ミノ酸配列の解析を行い部分ペプチドアミノ酸配列を決
定することができる。 ロ) rabphilin−3A cDNA のクローニングと構造解析 rabphilin−3Aの部分アミノ酸配列をもとにして、適宜
選択しそれに相当するオリゴヌクレオチドを合成しプロ
ーブとする。ウシ大脳cDNAライブラリーからこれらプロ
ーブとハイブリダイズするクローンを選び出し塩基の構
造解析を行うことにより rabphilin−3A cDNA を決定す
ることができる。クローニングする方法はプラークハイ
ブリダイゼーション法(Sambrook, J. et al., Molecul
ar cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989)によ
ればよく、選び出されたクローンは必要に応じてプラス
ミドまたはファージベクターなどにサブクローニングす
る。塩基配列の構造はマキサム、ギルバート法(Maxam,
A. M. and Gilbert, W.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 560, 1977)あるいはジデオキシ法(Messing,J. et
al., Nucl. Acids Res., 9, 309, 1981)によって決定
することができる。最終的に rabphilin−3A cDNA は配
列番号1の如く決められ、そのアミノ酸配列は配列番号
1に記載される如く演繹された。
その部分構造を有するペプチドを用いる。抗原とキャリ
ア蛋白質の複合体の調製は常法の縮合剤を用い、牛血清
アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニンなどの常
用の蛋白質を用いることができる。免疫される動物とし
てはマウス、ラット、ウサギ、モルモットなどがあげら
れ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与され
る。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完
全フロイントアジュバンドを混和してよく、投与は通常
2〜5週毎に1回ずつ行われる。ポリクローナル抗体は
充分に免疫した動物から採血、血清分離し得ることがで
きる。抗体の精製は既知の方法を用いればよく、硫安分
画法、 PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体
の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィなどの手
段により容易に達成することができる。モノクローナル
抗体は公知の方法により作製し得る。例えば、免疫され
た動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細
胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイブリドーマとし
て単離される。骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、
ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来
のものであることが好ましいが、異種間においても可能
な場合もある。
ラーとミルスタインの方法(Nature, 256, 495, 1975)
に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレン
グリコールやセンダイウイルスなどがあげられるが、通
常20〜50%程度の濃度のポリエチレングリコール(平均
分子量1000〜4000)を用いて20〜40℃、好ましくは30〜
37℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通
常1:1〜10:1程度、約1〜10分間程度反応させるこ
とにより、細胞融合を実施することができる。抗 rab3A
p25抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々
の免疫化学的方法が使用できる。例えば、 rab3A p25を
コートしたマイクロプレートを用いるELISA (Enzyme−
Linked immunosorbent assay)法、抗免疫グロブリン抗
体をコートしたマイクロプレートを用いる EIA(Enzyme
immunoassay)法などがあげられる。これら免疫化学的
手法により、目的とする抗体を産生しているウエルを得
る。このようなウエルから、更に例えば限界希釈法によ
ってクローニングを行いクローンを得る。ハイブリドー
マの選別、育種は通常 HAT(ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジン)を添加して、10〜20%牛胎児血清を
含む動物細胞用培地(例、RPMI 1640)で行われる。
じめプリスタンを投与したBALB/Cマウスの腹腔内へ移植
し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹
水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。ま
た、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料
とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は免疫
グロブリンの精製法として前記の方法を用いればよい。
これら抗体を用いる免疫学的測定法によりヒト生体試料
中のヒトプロヒビチンの同定や定量を可能とし、癌診断
試薬への応用が期待される。ヒトプロヒビチンの免疫学
的測定法は、公知の方法に準ずればよく、例えば蛍光抗
体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法に
おいても実施できる。本発明のモノクローナル抗体はIg
G 、IgA 、IgM いかなるクラスのものでもよく、また該
抗体のFc' あるいはFc領域を除去したFab'あるいは Fab
画分、あるいはその重合体を用いてもよい。また、その
キメラ抗体であってもよい。
結果、アミノ酸番号 105および 590付近の2個所に疎水
性部分を有していた。また rabphilin−3Aアミノ酸番号
396−530 位および 548−669 位の配列が、 protein k
inase C やsynaptotagmin に存在するC2 領域とホモロ
ジーのある配列を有することが判明した(Perin, M. S.
et al., Nature, 345, 260−263, 1990)。synaptotagm
in はシナプティックベジクルに存在し神経伝達物質の
放出に関与していると考えられている物質であり、C端
側にC2 領域を2つ保有している。 rabphilin−3AはC
端側に2つのC2領域を保有しており、分泌反応に関与
すると考えられている低分子量G蛋白質 rab3A p25の標
的蛋白質であり、脳組織に特異的に分布していることか
ら神経伝達物質の放出に関与し各種脳疾患と密接に関係
していると予想される。
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
pmol, 2.2 −2.6 ×105 cpm )を検体試料溶液45μl
(22.2mM HEPES/NaOH pH 7.4, 5.56mM MgCl2,1.11 μM
GTPγS , 222mM NaCl, 0.056% Na cholate)と30℃5
分反応後、20mM disuccinimidyl suberate /20% DMSO
5μl の添加。さらに30℃ 30 分反応を続行し、25μl
の溶液(200mM Tris/HCl pH 6.7,9% SDS、6% 2−
メルカプトエタノール、15%グリセロール)を添加し反
応を停止した。反応液の一部60μl を SDS−PAGE
(10%ポリアクリルアミドゲル)にかけた後、Fujix BA
S 2000Bio−imaging analyzerにより放射活性を測定し
た(標準は放射性ヨード標識 rab3A p25)。 rab3A p25
は分子量25,000の位置に検出され、 rabphilin−3Aと結
合すると分子量 110,000の位置に検出されることで同定
することができる。 rab3A p25は大腸菌より調製し、放
射性ヨードの標識はBolton−Hunter試薬を用いて行うこ
とができる(Shirataki, H. et al., J. Biol. Chem.,
267, 10946−10949, 1992)。下記の rabphilin−3Aの精
製過程において、各精製画分をこの方法に処し rabphil
in−3Aの同定を行った。
al., J. Biol. Chem., 263. 2897−2904, 1988)に準
じて粗膜画分を調製した。この粗膜画分(800ml, 9.6g
protein)を20,000×g 、1時間遠心分離を行いペレット
を得た。このペレットを 320mlの2%コール酸ナトリウ
ム含有 Buffer A (20mM HEPES/NaON pH7.4,5mM MgCl2,
1mMジチオスレイトール)に溶解し 100,000×g 、1
時間遠心分離を行い不溶物を除去し上澄液(320ml, 2.9
g protein)を以下の精製に処した。上澄液80mlを、1%
コール酸ナトリウム含有 Buffer A にて平衡化した Hil
oad 26/10 Q−Sepharose カラム( 2.6×10cm)に負荷
し同Buffer 148mlで洗浄後、同Buffer(600ml)を用いる
0−1.0M食塩の濃度勾配グラジエント溶出を行い12mlず
つ分取し活性画分37−39を得た。残りの上澄液 240mlも
同操作を行いプールした。この活性画分を濃縮後、 0.6
% CHAPS含有 Buffer A を添加しコール酸ナトリウムを
除いた溶液(144ml, 72mg protein)を、 0.6% CHAPS含
有 Buffer Aにて平衡化した Mono Q HR 10/10カラム
(1×10cm)に負荷した。同 Buffer 56mlにて洗浄後、
同 Buffer (240ml)を用い0−0.5M食塩濃度勾配溶出を
行い2mlずつ分取し活性画分 128−141 を得た。次いで
この画分(28ml, 1.4mg protein)を、 0.6% CHAPSおよ
び 50mM KH2PO4含有 Buffer A にて平衡化したハイドロ
オキシアパタイトカラム( 0.8×20cm)に負荷、 0.6%
CHAPSおよび 80mM KH2PO4含有 Buffer A 42ml で洗浄
後、 0.6% CHAPSおよび 120mM KH2PO4 含有 Buffer A
にて溶出、 1.5mlずつ分取し、活性画分49−52を得た。
この活性画分(6ml,10μg protein)を 1.2mlに濃縮
し、5−20%ショ糖濃度勾配超遠心分離(チューブ液量
4.8ml) 238,000×g 、19時間行い、チューブの底から
0.25mlずつ分取し検定の結果、7−10の画分(6ml,5
μg protein)を高純度 rabphilin−3Aとして得た。上記
の精製操作を20回繰り返し約 100μg の rabphilin−3A
を得た。最後に、これら高純度品を SDS−PAGEにて分離
しPVDF膜へ転写した後、Ponceau S で染色し rabphilin
−3Aに相当するバンドを切り出し rabphilin−3Aを単離
した。このようにして得られた rabphilin−3Aと rab3A
p25との複合体形成について実施例1の方法により確認
した。 GDP結合型 rab3A p25存在下では rabphilin−3A
は分子量約85,000の位置に出現した。 GTPγS 結合型 r
ab3A p25存在下では rabphilin−3Aは分子量約 110,000
の位置に移動し、 rab3A p25の一部が分子量 110,000の
位置に移動した。このことから単離した rabphilin−3A
は GTPγS 結合型 rab3A p25とのみ複合体を形成するこ
とが確認された。
oteaseI(API)にて 0.2M Tris/HCl pH 9.0,8%アセト
ニトリル溶液中で37℃24時間、酵素分解処理(モル比
1:50=API : rabphilin−3A)した後、C8 逆相カラ
ムクロマトグラフィにかけ約30のペプチドピークを分取
した。この内11個のピークにつき自動気相シークエンサ
ー(Applied Biosystems, Model 470A)を用いアミノ酸
配列を解析した。その結果は表1に示した。
結果をもとに、ピーク10に含まれるペプチド LysMetGlu
GluMetGluGlnGlu およびピーク11に含まれるペプチド G
luPheAsnGluGluPhePheTyr をコードするオリゴヌクレオ
チドを DNA合成基(Applied Biosystems, Model 380A)
にて合成しプローブとして用いた。λgt10 を用いるcDN
Aクローニングキット(Amersham社)を用いウシ脳cDNA
ライブラリーの約60万個のファージプラークより、両プ
ローブとハイブリダイズする24個のクローンを得た。プ
ラークハイブリダイゼイションはManiatisらの方法に準
ずる公知の方法により行った。得られたクローンはPlas
mid pUC 19を用いリクローニングを行いそれぞれの塩基
配列を解析した。その中の1つ、約 2.7kbのcDNAを含む
クローンを得、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。そ
の塩基配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配
列番号1に記載した。このcDNAは 704個のアミノ酸から
なるオープンリーディングフレームを有しており、表1
に示される rabphilin−3Aの部分ペプチドアミノ酸配列
を全て含んでいた。また開始コドンATG の前に Kozak配
列を有していた。演繹されたアミノ酸配列から rabphil
in−3Aの分子量は77,976で、精製した rabphilin−3Aの
SDS−PAGEおよびショ糖密度勾配遠心法から得られた分
子量約85,000に近い。このことから rabphilin−3Aはサ
ブユニット構造を持たない単鎖ペプチドからなると考え
られる。単離された24個のクローンの内、4個のクロー
ンが2種類のプローブとハイブリダイズし、1個のクロ
ーンがN末端部翻訳領域を有しており、残りはC末端部
翻訳領域を有していた。このようにして単離されたcDNA
が rabphilin−3Aをコードしているかどうかを検討する
ため、そのcDNAを含む発現ベクターでCOS7細胞を形質転
換し rabphilin−3Aを表現させた細胞のホモジネイトを
後記実施例5記載と同様の方法で SDS−PAGE後抗 rabph
ilin−3A抗体にてイムノブロットした。形質転換の方法
はまず、 rabphilin−3A cDNA の開始コドンとストップ
コドンの端に BamHIとKpnI制限酵素のsiteをつないだ
2.1kbのフラグメントをPCR により作製した。その PCR
産物を BamHIで切断し、外来遺伝子の発現がSRα promo
ter でコントロールされているpCEV4 のBamHI siteに挿
入し、DEAEデキストラン法でCOS7細胞にトランスフェク
トした。トランスフェクト後を72時間培養して細胞を回
収し、 rabphilin−3Aの発現を抗 rabphilin−3Aポリク
ローナル抗体によるイムノブロットで検討した。その結
果、ウシ大脳 rabphilin−3Aと同じく分子量約85,000の
位置にバンドが認められ、単離したcDNAは rabphilin−
3Aをコードしていることが確認された。
織分布 表1に示される rabphilin−3A部分アミノ酸配列の中か
らピーク2のペプチドのN端 Hisを除いた18個のアミノ
酸からなるペプチドを合成し抗原として使用した。この
合成ペプチドをキャリア蛋白質 KLHと縮合剤マレイミド
活性エステルを用い複合体を調製した後、完全フロイン
トアジュバンドと混和しウサギの皮下に2週間ごと合計
5回免疫し抗体を作製した。抗体産生の確認はそれぞれ
の抗原ペプチドをマイクロプレートに固相化し、採血し
た血清を添加、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ標識
した抗ウサギ免疫グロブリン抗体を用いる ELISA法によ
り行った。得られた抗血清は同抗原に対するアフィニテ
ィカラムにかけ精製を行い、抗 rabphilin−3Aポリクロ
ーナル抗体を作製した。この抗体を用いて rabphilin−
3Aの組織分布を検討した。ラットの種々の臓器(約0.1
g)を10mlの20mM Tris/HCl pH 7.5,0.25M ショ糖、 0.
017%デオキシコール酸ナトリウム、10μM p−amidino
phenyl −methanesulfonyl fluoride溶液でホモジナイ
ズした後トリクロロ酢酸を最終濃度6%になるように添
加。遠心分離後沈殿をLaemmli's ハッファーに溶解し加
熱処理した後、 SDS−PAGE(12%ポリアクリルアミドゲ
ル)にかけた。電気泳動後ニトロセルロース膜に蛋白を
転写し抗 rabphilin−3Aポリクローナル抗体、次いでパ
ーオキシデイス標識羊抗ウサギ免疫グロブリン抗体を反
応させ陽性バンドの有無を検定した。その結果、免疫反
応陽性バンドは脳だけに認められ、膵臓、肝臓、脾臓、
腎臓、肺臓には認められなかった。
新規な標的蛋白質 rabphilin−3Aのアミノ酸配列、それ
をコードするcDNAおよび抗 rabphilin−3A抗体を提供す
る。 rabphilin−3Aは脳組織に特異的に分布し、神経伝
達物質の放出に関与するものであり、そのcDNAも含めて
分泌機構解明の研究試薬として有用である。さらにその
抗体を用いる免疫学的手法により生体試料の rabphilin
−3Aの同定、定量を行うことができ、各種脳神経疾患と
の関係を研究することにより、診断薬の分野においても
その応用が期待される。
Claims (3)
- 【請求項1】 配列番号1記載のアミノ酸配列を有する
低分子量G蛋白質 rab3A p25の標的蛋白質。 - 【請求項2】 請求項1記載の低分子量G蛋白質 rab3A
p25の標的蛋白質をコードする、配列番号1記載のDNA
。 - 【請求項3】 請求項1記載の標的蛋白質またはその部
分ペプチドを抗原とする抗体であって、請求項1に記載
の標的蛋白質と反応性を有する抗体。
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Country | Link |
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JP (1) | JP3378600B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6618107B2 (ja) * | 2015-05-26 | 2019-12-11 | 国立大学法人名古屋大学 | リンパ球性漏斗下垂体後葉炎検査試薬及びその用途 |
-
1992
- 1992-12-24 JP JP34405592A patent/JP3378600B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J.Biol.Chem.(1991),267,p.10946−10949 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH06184199A (ja) | 1994-07-05 |
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