JP3378600B2 - 低分子量Ｇ蛋白質ｒａｂ３Ａ ｐ２５の標的蛋白質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】低分子量Ｇ蛋白質 rab3A p25の標
的蛋白質およびそれをコードするDNA に関するもので、
医薬の分野で有効に利用される。

【０００２】

【従来の技術】生体の細胞はホルモンや神経伝達物質な
どに反応し、お互いに情報を交換することにより生理機
能を発現する。細胞の情報伝達はまず標的細胞の表面受
容体に因子が結合し、次いで細胞膜を横切る受容体が作
動して内部のエフェクター分子を介し、多くの過程を経
て情報の伝達が完了する。近年、この情報伝達機構に関
し飛躍的進展がもたらされ、 GTP結合蛋白質（以下Ｇ蛋
白質と略記する）が受容体刺激をエフェクター分子へ伝
達するトランスデューサーとして機能し、ホルモン分
泌、筋肉の収縮、認識などに至る細胞活動において中心
的役割を果たしていることがわかっている。さらに最
近、細胞膜受容体の刺激伝達以後の反応過程に別種のＧ
蛋白質が関与していることが明らかになった。このＧ蛋
白質は細胞膜受容体のトランスデューサーとして働いて
いる一群のＧ蛋白質とは異なり、分子量２万前後の低分
子量Ｇ蛋白質の一群である。すなわち細胞の分泌機構に
関して記すと、最初に細胞質で合成された分泌蛋白質が
細胞外へ分泌される場合、小胞形成、小胞と細胞膜との
融合、分泌蛋白の細胞外放出という分泌反応にこの低分
子量Ｇ蛋白質が深く関与していることが判明した（Taka
i, Y. et al., Int. Rev. Cytol., 133, 187−230, 199
2)。

【０００３】これまでに、 ras（Ha−, Ki−, N−）、
rho (A, B , C)、ral 、rab (1-4)など40種以上の低分
子量Ｇ蛋白質をコードする遺伝子が哺乳類組織から酵母
に至るまでクローニングされ、これら遺伝子の蛋白質も
順次精製されている。本発明者らはウシ大脳から低分子
量Ｇ蛋白質を15種類分離し、均一化に成功した。この中
で新しい低分子量Ｇ蛋白質としてrab3A p25 がある（Ki
kuchi, A. et al., J.Biol. Chem., 263, 2897−2904,
1988）。rab3A p25 は ras p21類似低分子Ｇ蛋白質の
サブファリーである rabサブファミリーに属している。
この rabファミリーは分泌反応やエンドサイトシスなど
の細胞内小胞輸送の制御に関与していることが明らかに
なっている（Balch,W.B.etal.,Trends Biochem.Sci.,1
5,473-477,1990) 。rab3A p25 は、プレシナプスに存在
し特にアクティブゾーン付近のプレシナプティックメン
ブランとシナプティックベジクルに多く分布しており、
プレシナプスからの神経伝達物質の放出を制御している
ことが明らかになりつつある (Mizoguchi,A.et al.,J.B
iol.Chem.,265,11872-11879,1990) 。 rab3A p25には、
GDP結合型の不活性型と GTP結合型の活性型が存在し、
GDP結合型からGTP 結合型への交換反応は、 GDP結合型
から GTP結合型への変換を制御するGDP/GTP exchange p
rotein（GEP)により制御されている。本発明者らは rab
3A p25に作用する GEPとして、smg p25 GDI (GDP解離抑
制蛋白質）をウシ大脳可溶性画分より精製しその一次構
造を決定している。さらに、本発明者らは smg p25 GDI
が、rab3A p25 の GDP/GTP変換反応を制御するだけでな
く rab3A p25の膜画分から可溶性画分へのトランスロ−
ケションを制御していること、および rabファミリーに
属する rab11 p24やSEC4 p24にも作用することを明らか
にしている。現在までの知見をもとに、本発明者らは、
rab3A p25の作用機構について以下のように考えた。 GT
P結合型の rab3A p25は smg p25 GDIと複合体を形成し
シナプス細胞質に存在しており、 rab GDIと解離すると
rab3A p25は GTP結合型に変換されシナプティックベジ
クル上の標的蛋白質に結合する。この GTP結合型の rab
3A p25が結合したシナプティックベジクルはシナプティ
ックメンブランにtargetしfusionする。

【０００４】小胞輸送の経路はきわめて厳密に制御され
ており、多くの低分子量Ｇ蛋白質が小胞輸送に関与して
いるのは種々の小胞がそれぞれ異なったアクセプター膜
にtargeting するために必要であると推定されている。
しかし、これまで標的蛋白質の単離、構造確認はされて
おらず、分泌機構の解明さらに疾患との関係解明のため
にも、標的蛋白質の構造確認が重要な課題となってい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は低分子量Ｇ蛋
白質 rab3A p25の標的蛋白質の単離、構造解析を行いア
ミノ酸配列およびそれをコードするcDNAを提供すること
にある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記現状に鑑み、本発明
者らはウシ大脳膜画分より rab3A p25と結合する蛋白質
を見いだし部分精製した（Sirataki, H., et al., J. B
iol. Chem., 267, 10946−10949, 1992)。この蛋白質は
分子量 85000で GTP結合型の rab3A p25と結合するが、
GDP結合型 rab3A p25との親和性は低い。またｃ−ki−
ras p21 やrhoA p21 、smg p21 、rab11 p24 などの低
分子量Ｇ蛋白質とは結合しない。さらに本蛋白質は GAP
（GTPase活性促進蛋白質）、GDI (GDP/GTP交換反応を抑
制する GDP解離抑制蛋白質）、GDS (GDP/GTP交換反応を
促進する GDP解離促進蛋白質）活性を有していないこと
から、 rab3A p25の標的蛋白質である可能性が高い。

【０００７】そこで本発明者らは本標的蛋白質をコード
する塩基配列の解析を鋭意試み、全構造を解明したこと
により本発明を完成するに至った。一次構造解析の結
果、本発明の rab3A p25の標的蛋白質は 704個のアミノ
酸からなる分子量 77、976 の新規蛋白質であり、本発明
者らは rabphilin−3Aと命名した。以下、本標的蛋白質
は rabphilin−3Aと記載する。すなわち、本発明は rab
philin−3Aの全アミノ酸配列、それをコードする DNAお
よび抗 rabphilin−3A抗体に関するものである。rabphi
lin−3Aの機能から神経伝達物質分泌機構および各種脳
疾患病理解明の試薬として、さらに同疾患の治療、診断
への応用が期待される。以下に本発明を詳細に説明す
る。

【０００８】（１） rabphilin−3Aの精製 本発明者らの方法（Sirataki, H., et al., J. Biol. C
him., 267, 10946−10949, 1992)に従い、ウシ大脳を原
料としてコール酸抽出により粗膜画分を得る。この粗膜
画分をコール酸含有 Buffer A （20mM HEPES−NaOH, pH
7.4, ５mM MgCl₂, １mMジチオスレイトール）を用いる
食塩濃度勾配抽出法にて Q−Sepharoseカラムで精製す
る。得られた目的画分を CHAPS含有 Buffer A を用いる
Mono Ｑカラム、CHAPS およびKH₂PO₄含有 Buffer A を
用いるヒドロキシアパタイトカラムにて精製し、次い
で、5 - 20％ショ糖密度勾配超遠心法により高純度精製
品を得ることができる。最後にこの高純度 rabphilin−
3Aを SDS−PAGEにて分画し、PVDF膜（ポリデニリデンジ
フルオリド膜）に転写する。転写後 Ponceau Sで染色
し、 rabphilin−3Aに相当するバンドを切り出し単離し
た。

【０００９】（２） rabphilin−3Aの同定法 上記精製過程における rabphilin−3Aの同定はクロスリ
ンキング法により rab3A p25との結合性を測定すること
により行う。すなわち放射性ヨードラベルしたGTPγS
結合型のrab3A p25 と各カラムによる分画した画分を反
応させ、反応液を SDS−PAGE（10％ポリアクリルアミド
ゲル）にかけて、分子量約 110、000のバンドの有無を測
定することにより rabphilin−3Aの同定・確認すること
ができる。大腸菌由来 rab3A p25は Arakiらの方法によ
り rab3A p25をoverexpressionした大腸菌より調製する
ことができる（Araki, S. et al., Mol. Cell. Biol.,
11, 1438−1447, 1991）。

【００１０】（３） rabphilin−3Aの構造解析 イ）部分ペプチドアミノ配列 前記の方法により得られた rabphilin−3AをAchromobac
ter preteaseＩにて分解処理し、その処理液をＣ₈ 逆相
カラムクロマトグラフィにかけ、出現するペプチドのピ
ークをそれぞれ分取しアミノ酸シークエンサーによりア
ミノ酸配列の解析を行い部分ペプチドアミノ酸配列を決
定することができる。 ロ） rabphilin−3A cDNA のクローニングと構造解析 rabphilin−3Aの部分アミノ酸配列をもとにして、適宜
選択しそれに相当するオリゴヌクレオチドを合成しプロ
ーブとする。ウシ大脳cDNAライブラリーからこれらプロ
ーブとハイブリダイズするクローンを選び出し塩基の構
造解析を行うことにより rabphilin−3A cDNA を決定す
ることができる。クローニングする方法はプラークハイ
ブリダイゼーション法（Sambrook, J. et al., Molecul
ar cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989）によ
ればよく、選び出されたクローンは必要に応じてプラス
ミドまたはファージベクターなどにサブクローニングす
る。塩基配列の構造はマキサム、ギルバート法（Maxam,
A. M. and Gilbert, W.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 560, 1977)あるいはジデオキシ法（Messing,J. et
al., Nucl. Acids Res., 9, 309, 1981）によって決定
することができる。最終的に rabphilin−3A cDNA は配
列番号１の如く決められ、そのアミノ酸配列は配列番号
１に記載される如く演繹された。

【００１１】（４）抗 rabphilin−3A抗体の作製 抗原は rabphilin−3Aまたはそのアミノ酸配列をもとに
その部分構造を有するペプチドを用いる。抗原とキャリ
ア蛋白質の複合体の調製は常法の縮合剤を用い、牛血清
アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニンなどの常
用の蛋白質を用いることができる。免疫される動物とし
てはマウス、ラット、ウサギ、モルモットなどがあげら
れ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与され
る。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完
全フロイントアジュバンドを混和してよく、投与は通常
２〜５週毎に１回ずつ行われる。ポリクローナル抗体は
充分に免疫した動物から採血、血清分離し得ることがで
きる。抗体の精製は既知の方法を用いればよく、硫安分
画法、 PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体
の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィなどの手
段により容易に達成することができる。モノクローナル
抗体は公知の方法により作製し得る。例えば、免疫され
た動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細
胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイブリドーマとし
て単離される。骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、
ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来
のものであることが好ましいが、異種間においても可能
な場合もある。

【００１２】細胞融合の操作は既知の方法、例えばケー
ラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 1975）
に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレン
グリコールやセンダイウイルスなどがあげられるが、通
常20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均
分子量1000〜4000）を用いて20〜40℃、好ましくは30〜
37℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通
常１：１〜10：１程度、約１〜10分間程度反応させるこ
とにより、細胞融合を実施することができる。抗 rab3A
p25抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々
の免疫化学的方法が使用できる。例えば、 rab3A p25を
コートしたマイクロプレートを用いるELISA （Enzyme−
Linked immunosorbent assay）法、抗免疫グロブリン抗
体をコートしたマイクロプレートを用いる EIA（Enzyme
immunoassay）法などがあげられる。これら免疫化学的
手法により、目的とする抗体を産生しているウエルを得
る。このようなウエルから、更に例えば限界希釈法によ
ってクローニングを行いクローンを得る。ハイブリドー
マの選別、育種は通常 HAT（ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を
含む動物細胞用培地（例、RPMI 1640)で行われる。

【００１３】このようにして得られたクローンはあらか
じめプリスタンを投与したBALB/Cマウスの腹腔内へ移植
し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹
水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。ま
た、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料
とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は免疫
グロブリンの精製法として前記の方法を用いればよい。
これら抗体を用いる免疫学的測定法によりヒト生体試料
中のヒトプロヒビチンの同定や定量を可能とし、癌診断
試薬への応用が期待される。ヒトプロヒビチンの免疫学
的測定法は、公知の方法に準ずればよく、例えば蛍光抗
体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法に
おいても実施できる。本発明のモノクローナル抗体はIg
G 、IgA 、IgM いかなるクラスのものでもよく、また該
抗体のFc' あるいはFc領域を除去したFab'あるいは Fab
画分、あるいはその重合体を用いてもよい。また、その
キメラ抗体であってもよい。

【００１４】（５）本発明の rabphilin−3A構造解析の
結果、アミノ酸番号 105および 590付近の２個所に疎水
性部分を有していた。また rabphilin−3Aアミノ酸番号
396−530 位および 548−669 位の配列が、 protein k
inase C やsynaptotagmin に存在するＣ₂ 領域とホモロ
ジーのある配列を有することが判明した（Perin, M. S.
et al., Nature, 345, 260−263, 1990)。synaptotagm
in はシナプティックベジクルに存在し神経伝達物質の
放出に関与していると考えられている物質であり、Ｃ端
側にＣ₂ 領域を２つ保有している。 rabphilin−3AはＣ
端側に２つのＣ₂領域を保有しており、分泌反応に関与
すると考えられている低分子量Ｇ蛋白質 rab3A p25の標
的蛋白質であり、脳組織に特異的に分布していることか
ら神経伝達物質の放出に関与し各種脳疾患と密接に関係
していると予想される。

【００１５】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００１６】実施例１ rabphilin−3Aの同定法（ Cross−linking Assay) 放射性ヨード標識した GTPγS 結合型のrab3A p25 （１
pmol, 2.2 −2.6 ×10⁵ cpm ）を検体試料溶液45μl
（22.2mM HEPES/NaOH pH 7.4, 5.56mM MgCl₂,1.11 μM
GTPγS , 222mM NaCl, 0.056％ Na cholate)と30℃５
分反応後、20mM disuccinimidyl suberate /20％ DMSO
５μl の添加。さらに30℃ 30 分反応を続行し、25μl
の溶液（200mM Tris/HCl pH 6.7,９％ SDS、６％ ２−
メルカプトエタノール、15％グリセロール）を添加し反
応を停止した。反応液の一部６０μｌ を SDS−PAGE
（10％ポリアクリルアミドゲル）にかけた後、Fujix BA
S 2000Bio−imaging analyzerにより放射活性を測定し
た（標準は放射性ヨード標識 rab3A p25）。 rab3A p25
は分子量25,000の位置に検出され、 rabphilin−3Aと結
合すると分子量 110,000の位置に検出されることで同定
することができる。 rab3A p25は大腸菌より調製し、放
射性ヨードの標識はBolton−Hunter試薬を用いて行うこ
とができる（Shirataki, H. et al., J. Biol. Chem.,
267, 10946−10949, 1992)。下記の rabphilin−3Aの精
製過程において、各精製画分をこの方法に処し rabphil
in−3Aの同定を行った。

【００１７】実施例２ rabphilin−3Aの精製 ウシ脳を原料として kikuchiらの方法（Kikuchi, A. et
al., J. Biol. Chem., 263. 2897−2904, 1988）に準
じて粗膜画分を調製した。この粗膜画分（800ml, 9.6g
protein)を20,000×g 、１時間遠心分離を行いペレット
を得た。このペレットを 320mlの２％コール酸ナトリウ
ム含有 Buffer A (20mM HEPES/NaON pH7.4,５mM MgCl₂,
１mMジチオスレイトール）に溶解し 100,000×g 、１
時間遠心分離を行い不溶物を除去し上澄液（320ml, 2.9
g protein)を以下の精製に処した。上澄液80mlを、１％
コール酸ナトリウム含有 Buffer A にて平衡化した Hil
oad 26/10 Q−Sepharose カラム（ 2.6×10cm）に負荷
し同Buffer 148mlで洗浄後、同Buffer（600ml)を用いる
０−1.0M食塩の濃度勾配グラジエント溶出を行い12mlず
つ分取し活性画分37−39を得た。残りの上澄液 240mlも
同操作を行いプールした。この活性画分を濃縮後、 0.6
％ CHAPS含有 Buffer A を添加しコール酸ナトリウムを
除いた溶液（144ml, 72mg protein)を、 0.6％ CHAPS含
有 Buffer Aにて平衡化した Mono Q HR 10/10カラム
（１×10cm）に負荷した。同 Buffer 56mlにて洗浄後、
同 Buffer （240ml)を用い０−0.5M食塩濃度勾配溶出を
行い２mlずつ分取し活性画分 128−141 を得た。次いで
この画分（28ml, 1.4mg protein)を、 0.6％ CHAPSおよ
び 50mM KH₂PO₄含有 Buffer A にて平衡化したハイドロ
オキシアパタイトカラム（ 0.8×20cm）に負荷、 0.6％
CHAPSおよび 80mM KH₂PO₄含有 Buffer A 42ml で洗浄
後、 0.6％ CHAPSおよび 120mM KH₂PO₄ 含有 Buffer A
にて溶出、 1.5mlずつ分取し、活性画分49−52を得た。
この活性画分（６ml，10μg protein)を 1.2mlに濃縮
し、５−20％ショ糖濃度勾配超遠心分離（チューブ液量
4.8ml） 238,000×g 、19時間行い、チューブの底から
0.25mlずつ分取し検定の結果、７−10の画分（６ml，５
μg protein)を高純度 rabphilin−3Aとして得た。上記
の精製操作を20回繰り返し約 100μg の rabphilin−3A
を得た。最後に、これら高純度品を SDS−PAGEにて分離
しPVDF膜へ転写した後、Ponceau S で染色し rabphilin
−3Aに相当するバンドを切り出し rabphilin−3Aを単離
した。このようにして得られた rabphilin−3Aと rab3A
p25との複合体形成について実施例１の方法により確認
した。 GDP結合型 rab3A p25存在下では rabphilin−3A
は分子量約85,000の位置に出現した。 GTPγS 結合型 r
ab3A p25存在下では rabphilin−3Aは分子量約 110,000
の位置に移動し、 rab3A p25の一部が分子量 110,000の
位置に移動した。このことから単離した rabphilin−3A
は GTPγS 結合型 rab3A p25とのみ複合体を形成するこ
とが確認された。

【００１８】実施例３ rabphilin−3Aの部分アミノ酸配列の解析 実施例２により得た rabphilin−3AをAchromopacter pr
oteaseＩ（API)にて 0.2M Tris/HCl pH 9.0,８％アセト
ニトリル溶液中で37℃24時間、酵素分解処理（モル比
１：50＝API ： rabphilin−3A）した後、Ｃ₈ 逆相カラ
ムクロマトグラフィにかけ約30のペプチドピークを分取
した。この内11個のピークにつき自動気相シークエンサ
ー（Applied Biosystems, Model 470A）を用いアミノ酸
配列を解析した。その結果は表１に示した。

【００１９】

【表１】

【００２０】実施例４ rabphilin−3A cDNA のクローニングと塩基配列の解析 実施例３の rabphilin−3A部分ペプチドアミノ酸配列の
結果をもとに、ピーク10に含まれるペプチド LysMetGlu
GluMetGluGlnGlu およびピーク11に含まれるペプチド G
luPheAsnGluGluPhePheTyr をコードするオリゴヌクレオ
チドを DNA合成基（Applied Biosystems, Model 380A）
にて合成しプローブとして用いた。λgt10 を用いるcDN
Aクローニングキット（Amersham社）を用いウシ脳cDNA
ライブラリーの約60万個のファージプラークより、両プ
ローブとハイブリダイズする24個のクローンを得た。プ
ラークハイブリダイゼイションはManiatisらの方法に準
ずる公知の方法により行った。得られたクローンはPlas
mid pUC 19を用いリクローニングを行いそれぞれの塩基
配列を解析した。その中の１つ、約 2.7kbのcDNAを含む
クローンを得、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。そ
の塩基配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列を配
列番号１に記載した。このcDNAは 704個のアミノ酸から
なるオープンリーディングフレームを有しており、表１
に示される rabphilin−3Aの部分ペプチドアミノ酸配列
を全て含んでいた。また開始コドンATG の前に Kozak配
列を有していた。演繹されたアミノ酸配列から rabphil
in−3Aの分子量は77,976で、精製した rabphilin−3Aの
SDS−PAGEおよびショ糖密度勾配遠心法から得られた分
子量約85,000に近い。このことから rabphilin−3Aはサ
ブユニット構造を持たない単鎖ペプチドからなると考え
られる。単離された24個のクローンの内、４個のクロー
ンが２種類のプローブとハイブリダイズし、１個のクロ
ーンがＮ末端部翻訳領域を有しており、残りはＣ末端部
翻訳領域を有していた。このようにして単離されたcDNA
が rabphilin−3Aをコードしているかどうかを検討する
ため、そのcDNAを含む発現ベクターでCOS7細胞を形質転
換し rabphilin−3Aを表現させた細胞のホモジネイトを
後記実施例５記載と同様の方法で SDS−PAGE後抗 rabph
ilin−3A抗体にてイムノブロットした。形質転換の方法
はまず、 rabphilin−3A cDNA の開始コドンとストップ
コドンの端に BamHIとKpnI制限酵素のsiteをつないだ
2.1kbのフラグメントをPCR により作製した。その PCR
産物を BamHIで切断し、外来遺伝子の発現がSRα promo
ter でコントロールされているpCEV4 のBamHI siteに挿
入し、DEAEデキストラン法でCOS7細胞にトランスフェク
トした。トランスフェクト後を72時間培養して細胞を回
収し、 rabphilin−3Aの発現を抗 rabphilin−3Aポリク
ローナル抗体によるイムノブロットで検討した。その結
果、ウシ大脳 rabphilin−3Aと同じく分子量約85,000の
位置にバンドが認められ、単離したcDNAは rabphilin−
3Aをコードしていることが確認された。

【００２１】実施例５ 抗 rabphilin−3A抗体の作製および rabphilin−3Aの組
織分布 表１に示される rabphilin−3A部分アミノ酸配列の中か
らピーク２のペプチドのＮ端 Hisを除いた18個のアミノ
酸からなるペプチドを合成し抗原として使用した。この
合成ペプチドをキャリア蛋白質 KLHと縮合剤マレイミド
活性エステルを用い複合体を調製した後、完全フロイン
トアジュバンドと混和しウサギの皮下に２週間ごと合計
５回免疫し抗体を作製した。抗体産生の確認はそれぞれ
の抗原ペプチドをマイクロプレートに固相化し、採血し
た血清を添加、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ標識
した抗ウサギ免疫グロブリン抗体を用いる ELISA法によ
り行った。得られた抗血清は同抗原に対するアフィニテ
ィカラムにかけ精製を行い、抗 rabphilin−3Aポリクロ
ーナル抗体を作製した。この抗体を用いて rabphilin−
3Aの組織分布を検討した。ラットの種々の臓器（約0.1
g）を10mlの20mM Tris/HCl pH 7.5，0.25M ショ糖、 0.
017％デオキシコール酸ナトリウム、10μM p−amidino
phenyl −methanesulfonyl fluoride溶液でホモジナイ
ズした後トリクロロ酢酸を最終濃度６％になるように添
加。遠心分離後沈殿をLaemmli's ハッファーに溶解し加
熱処理した後、 SDS−PAGE（12％ポリアクリルアミドゲ
ル）にかけた。電気泳動後ニトロセルロース膜に蛋白を
転写し抗 rabphilin−3Aポリクローナル抗体、次いでパ
ーオキシデイス標識羊抗ウサギ免疫グロブリン抗体を反
応させ陽性バンドの有無を検定した。その結果、免疫反
応陽性バンドは脳だけに認められ、膵臓、肝臓、脾臓、
腎臓、肺臓には認められなかった。

【００２２】

【発明の効果】本発明は低分子量Ｇ蛋白質 rab3A p25の
新規な標的蛋白質 rabphilin−3Aのアミノ酸配列、それ
をコードするcDNAおよび抗 rabphilin−3A抗体を提供す
る。 rabphilin−3Aは脳組織に特異的に分布し、神経伝
達物質の放出に関与するものであり、そのcDNAも含めて
分泌機構解明の研究試薬として有用である。さらにその
抗体を用いる免疫学的手法により生体試料の rabphilin
−3Aの同定、定量を行うことができ、各種脳神経疾患と
の関係を研究することにより、診断薬の分野においても
その応用が期待される。

【００２３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２１３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：ウシ 配列の特徴 特徴を表す記号：Peptide 存在位置：21..2132 特徴を決定した記号：Ｓ 配列 TGGAGTGCTG GGCTTCAGCC ATG ACT GAC ACC GTG TTC AGC AGC AGC TCA AGC 53 Met Thr Asp Thr Val Phe Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 CGT TGG ATG TGT CCC AGT GAC CGA CCC CTG CAG TCA AAT GAT AAA GAG 101 Arg Trp Met Cys Pro Ser Asp Arg Pro Leu Gln Ser Asn Asp Lys Glu 15 20 25 CAG CTC CAG ACA GGA TGG TCT GTC CAC CCC AGC GGT CAG CCG GAC AGA 149 Gln Leu Gln Thr Gly Trp Ser Val His Pro Ser Gly Gln Pro Asp Arg 30 35 40 CAG AGG AAA CAG GAA GAG CTG ACA GAT GAG GAG AAG GAA ATC ATC AAC 197 Gln Arg Lys Gln Glu Glu Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ile Ile Asn 45 50 55 AGG GTG ATC GCT CGC GCT GAG AAG ATG GAA GAG ATG GAA CAG GAG CGA 245 Arg Val Ile Ala Arg Ala Glu Lys Met Glu Glu Met Glu Gln Glu Arg 60 65 70 75 ATC GGG CGC CTG GTG GAC CGC CTA GAG AAC ATG AGG AAG AAC GTG GCC 293 Ile Gly Arg Leu Val Asp Arg Leu Glu Asn Met Arg Lys Asn Val Ala 80 85 90 GGG GAC GGG GTG AAC CGC TGC ATC CTG TGT GGA GAA CAG CTG GGG ATG 341 Gly Asp Gly Val Asn Arg Cys Ile Leu Cys Gly Glu Gln Leu Gly Met 95 100 105 CTG GGC TCT GCC TGT GTG GTG TGT GAG GAC TGT AAG AAG AAT GTC TGC 389 Leu Gly Ser Ala Cys Val Val Cys Glu Asp Cys Lys Lys Asn Val Cys 110 115 120 ACC AAG TGT GGG GTG GAG ACC TCC AAC AAC CGC CCA CAC CCT GTG TGG 437 Thr Lys Cys Gly Val Glu Thr Ser Asn Asn Arg Pro His Pro Val Trp 125 130 135 CTC TGC AAA ATC TGC ATC GAG CAG AGA GAG GTG TGG AAG CGC TCT GGA 485 Leu Cys Lys Ile Cys Ile Glu Gln Arg Glu Val Trp Lys Arg Ser Gly 140 145 150 155 GCA TGG TTC TTC AAG GGC TTC CCC AAA CAG GTC CTC CCA CAG CCT ATG 533 Ala Trp Phe Phe Lys Gly Phe Pro Lys Gln Val Leu Pro Gln Pro Met 160 165 170 CCC ATA AAG AAG AAC AAG CCC CAG CAG CCA GTC AGT GAG CCT GTG CCC 581 Pro Ile Lys Lys Asn Lys Pro Gln Gln Pro Val Ser Glu Pro Val Pro 175 180 185 GCT GCC CCT GAG CCA GCC ACT CCT GAG CCC AAG CAC CCT GCC CGG GCT 629 Ala Ala Pro Glu Pro Ala Thr Pro Glu Pro Lys His Pro Ala Arg Ala 190 195 200 CCA ACT CGA GGT GAC ACT GAA GAC AGG AGG GGC CCA GGT CAG AAG ACA 677 Pro Thr Arg Gly Asp Thr Glu Asp Arg Arg Gly Pro Gly Gln Lys Thr 205 210 215 GGC CCT GAC ATG ACT TCT GCT CCT GGG CGA GGA AGC TAC GGG CCT CCT 725 Gly Pro Asp Met Thr Ser Ala Pro Gly Arg Gly Ser Tyr Gly Pro Pro 220 225 230 235 GTG CGC AGG GCC TCT GAG GCA CGA ATG AGC TCC TCT GGC CGG GAC TCA 773 Val Arg Arg Ala Ser Glu Ala Arg Met Ser Ser Ser Gly Arg Asp Ser 240 245 250 GAC AGC TGG GAC CAG GGC CAC GGC ATG GCT GCT GGG GAC CCC AGC CAG 821 Asp Ser Trp Asp Gln Gly His Gly Met Ala Ala Gly Asp Pro Ser Gln 255 260 265 AGC CCA GCA GGT TTG AGA CGG GCC AAC TCA GTC CAG GCT TCT AGA CCT 869 Ser Pro Ala Gly Leu Arg Arg Ala Asn Ser Val Gln Ala Ser Arg Pro 270 275 280 GCC CCA GCC TCA ATG CAG AGC CCG GCA CCT CCC CAG CCG GGG CAA CCA 917 Ala Pro Ala Ser Met Gln Ser Pro Ala Pro Pro Gln Pro Gly Gln Pro 285 290 295 GGA CCC CCA GGA GGC AGC AGA CCC AGT CCG GGG CCG ACG GGA CGC TTT 965 Gly Pro Pro Gly Gly Ser Arg Pro Ser Pro Gly Pro Thr Gly Arg Phe 300 305 310 315 CCA GAT CAG AGA CCA GAG GTG GCT CCC AGT GAC CCC GAC TAT ACA GGG 1013 Pro Asp Gln Arg Pro Glu Val Ala Pro Ser Glu Pro Glu Tyr Thr Gly 320 325 330 GCC GCC GCC CAA CCC CGG GAG GAG AGA ACC GGG GGA ATC GGA GGC TAC 1061 Ala Ala Ala Gln Pro Arg Glu Glu Arg Thr Gly Gly Ile Gly Gly Tyr 335 340 345 TCG GCA GCT GGA ACC AGG GAG GAC CGA GCG GGC CAC CCC CCG GGC TCC 1109 Ser Ala Ala Gly Thr Arg Glu Asp Arg Ala Gly His Pro Pro Gly Ser 350 355 360 TAT ACC CAA GCC TCT GCG GCT GCT CCC CAG CCG GTG GTG GCC TCG GCC 1157 Tyr Thr Gln Ala Ser Ala Ala Ala Pro Gln Pro Val Val Ala Ser Ala 365 370 375 CGT CAG CCC CCA CCC CCT GAG GAG GAC GAG GAG GAA GCT AAC AGC TAC 1205 Arg Gln Pro Pro Pro Pro Glu Glu Asp Glu Glu Glu Ala Asn Ser Tyr 380 385 390 395 GAT TCG GAT GAA GCA ACC ACC CTG GGT GCC CTG GAG TTC AGC CTT CTC 1253 Asp Ser Asp Glu Ala Thr Thr Leu Gly Ala Leu Glu Phe Ser Leu Leu 400 405 410 TAT GAC CAG GAC AAC AGC TCC CTG CAC TGC ACC ATC ATA AAG GCC AAG 1301 Tyr Asp Gln Asp Asn Ser Ser Leu His Cys Thr Ile Ile Lys Ala Lys 415 420 425 GGA CTG AAG CCC ATG GAT TCG AAT GGC TTG GCC GAT CCC TAC GTT AAG 1349 Gly Leu Lys Pro Met Asp Ser Asn Gly Leu Ala Asp Pro Tyr Val Lys 430 435 440 CTG CAC CTC CTG CCG GGA GCC AGC AAG TCC AAC AAG CTT CGT ACA AAA 1397 leu His Leu Leu Pro Gly Ala Ser Lys Ser Asn Lys Leu Arg Thr Lys 445 450 455 ACC CTG CGG AAC ACC AGA AAC CCC ATC TGG AAC GAA ACT CTG GTC TAC 1445 Thr Leu Arg Asn Thr Arg Asn Pro Ile Trp Asn Glu Thr Leu Val Tyr 460 465 470 475 CAT GGC ATC ACA GAC GAG GAC ATG CAA AGG AAG ACC CTC AGA ATC TCT 1493 His Gly Ile Thr Asp Glu Asp Met Gln Arg Lys Thr Leu Arg Ile Ser 480 485 490 GTC TGT GAT GAG GAC AAA TTC GGC CAT AAT GAG TTT ATT GGT GAG ACC 1541 Val Cys Asp Glu Asp Lys Phe Gly His Asn Glu Phe Ile Gly Glu Thr 495 500 505 AGA TTC TCC CTC AAG AAA CTG AAG CCC AAT CAG AGG AAG AAC TTC AAC 1589 Arg Phe Ser Leu Lys Lys Leu Lys Pro Asn Gln Arg Lys Asn Phe Asn 510 515 520 ATC TGT CTG GAG CGG GTG ATC CCG ATG AAG CGT GCC GGA ACC ACT GGG 1637 Ile Cys Leu Glu Arg Val Ile Pro Met Lys Arg Ala Gly Thr Thr Gly 525 530 535 TCA GCC CGA GGC ATG GCC CTC TAT GAG GAG GAG CAG GTG GAA CGT ATT 1685 Ser Ala Arg Gly Met Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Gln Val Glu Arg Ile 540 545 550 555 GGT GAC ATA GAG GAA CGC GGC AAG ATC CTG GTG TCC CTC ATG TAC AGC 1733 Gly Asp Ile Glu Glu Arg Gly Lys Ile Leu Val Ser Leu Met Tyr Ser 560 565 570 ACA CAG CAG GGA GGC CTC ATC GTG GGC ATC ATA CGC TGC GTG CAC CTG 1781 Thr Gln Gln Gly Gly Leu Ile Val Gly Ile Ile Arg Cys Val His Leu 575 580 585 GCG GCC ATG GAT GCC AAT GGC TAC TCA GAT CCA TTT GTC AAG CTC TGG 1829 Ala Ala Met Asp Ala Asn Gly Tyr Ser Asp Pro Phe Val Lys Leu Trp 590 595 600 CTG AAA CCA GAC ATG GGA AAG AAA GCC AAA CAC AAG ACT CAA ATT AAG 1877 Leu Lys Pro Asp Met Gly Lys Lys Ala Lys His Lys Thr Gln Ile Lys 605 610 615 AAG AAA ACC TTG AAT CCT GAA TTT AAT GAG GAA TTT TTC TAT GAC ATC 1925 Lys Lys Thr Leu Asn Pro Glu Phe Asn Glu Glu Phe Phe Tyr Asp Ile 620 625 630 635 AAA CAC AGT GAC CTG GCG AAG AAG TCA CTG GAC ATC TCA GTC TGG GAC 1973 Lys His Ser Asp Leu Ala Lys Lys Ser Leu Asp Ile Ser Val Trp Asp 640 645 650 TAT GAC ATC GGC AAG TCC AAT GAT TAC ATT GGA GGC TGC CAG CTG GGG 2021 Tyr Asp Ile Gly Lys Ser Asn Asp Tyr Ile Gly Gly Cys Gln Leu Gly 655 660 665 ATC TCG GCC AAG GGA GAG CGC TTA AAA CAC TGG TAC GAG TGT CTG AAA 2069 Ile Ser Ala Lys Gly Glu Arg Leu Lys His Trp Tyr Glu Cys Leu Lys 670 675 680 AAC AAG GAC AAG AAG ATC GAA CGC TGG CAC CAG CTA CAG AAC GAG AAC 2117 Asn Lys Asp Lys Lys Ile Glu Arg Trp His Gln Leu Gln Asn Glu Asn 685 690 695 CAC GTG TCG AGC GAT TAG 2135 His Val Ser Ser Asp 700

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＰｕｂＭｅｄ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
   低分子量Ｇ蛋白質 rab3A p25の標的蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１記載の低分子量Ｇ蛋白質 rab3A
   p25の標的蛋白質をコードする、配列番号１記載のDNA
   。
3. 【請求項３】 請求項１記載の標的蛋白質またはその部
   分ペプチドを抗原とする抗体であって、請求項１に記載
   の標的蛋白質と反応性を有する抗体。