JP2003116562A

JP2003116562A - Ｔｓｌｌ２遺伝子

Info

Publication number: JP2003116562A
Application number: JP2001313967A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Murakami; 善則村上; Yukio Nomura; 幸男野村
Original assignee: BML Inc; National Cancer Center Japan
Current assignee: BML Inc; National Cancer Center Japan
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2001-10-11
Publication date: 2003-04-22
Also published as: US20030109027A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１の他に、これと、構造
上または機能上の関連性を有する癌抑制遺伝子を見出し
て、さらに、癌予防や癌治療に関する新たな手段を提供
すること。【解決手段】癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１と相同性は認めら
れるが、これとは異なる第１９染色体上に存在する癌抑
制遺伝子（ＴＳＬＬ２遺伝子）の塩基配列およびそのア
ミノ酸配列を明らかにした。また、これに関連するタン
パク質、ベクター、形質転換体および抗体を提供するこ
とにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定の遺伝子、さ
らに具体的には、癌抑制遺伝子と、これに関連するタン
パク質、ベクター、形質転換体および抗体に関する発明
である。

【０００２】

【従来の技術】癌に対する研究が進展するにつれて、癌
の発症を抑制する役割を担っている遺伝子である、癌抑
制遺伝子の存在がクローズアップされており、現在まで
に、数多くの癌抑制遺伝子が見出されている。

【０００３】例えば、網膜芽細胞腫におけるＲＢ遺伝
子、神経線維腫症のＮＦ１，ＮＦ２遺伝子、家族性大腸
ポリポーシスのＡＰＣ遺伝子、Wilms 腫瘍のＷＴ１遺伝
子、多発性内分泌腫瘍症のＭＥＮ１遺伝子、Li-Fraumen
i 症候群のｐ５３遺伝子、vonHippel-Lindau 症候群の
ＶＨＬ遺伝子、遺伝性乳癌のＢＲＣＡ１，ＢＲＣＡ２遺
伝子、遺伝性メラノーマのｐ１６遺伝子、結節性硬化症
（肉腫，脳腫瘍）のＴＳＣ１，ＴＳＣ２遺伝子、母斑性
基底細症候群のＰＴＣＨ遺伝子等が、現在までに見出さ
れている癌抑制遺伝子として挙げられる。

【０００４】癌抑制遺伝子は、主に、細胞の増殖を抑制
することにより、細胞の癌化を阻んでいることが知られ
ており、また、ミスマッチ修復遺伝子群や、細胞接着に
係わる遺伝子群も、癌の抑制に係わっているらしいこと
が知られている。

【０００５】癌抑制遺伝子は、癌の発症前診断、癌の質
的診断、癌治療の予後の予測、癌の転移性の予測、化学
療法や放射線療法に対する癌の感受性の予測、遺伝子治
療等に極めて有用な遺伝子であり、可能な限り多くの癌
抑制遺伝子を見出すべく、日夜、検討が行われている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、非小細
胞肺癌で、高頻度に染色体におけるヘテロ接合性の消失
を示す、第１１染色体長腕に位置する、癌抑制遺伝子Ｔ
ＳＬＣ１を新たに見出した。肺腺癌細胞Ａ５４９の腫瘍
原性の抑制を指標として見出された、この癌抑制遺伝子
ＴＳＬＣ１は、多数の進行癌細胞に対しても腫瘍抑制活
性を示すことから、新たな癌治療の標的になり得ると期
待されている。

【０００７】本発明が解決すべき課題は、この癌抑制遺
伝子ＴＳＬＣ１の他に、これと、構造上または機能上の
関連性を有する癌抑制遺伝子を見出して、さらに、癌予
防や癌治療に関する新たな手段を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決に向けて、癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１について、さら
に深い検討を重ねた結果、この癌抑制遺伝子と相同性が
認められるが、これとは異なる、第１９染色体上に存在
する、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を含む、新たな癌抑制機能を有する遺伝子を見
出して本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、配列番号１で表され
るアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子（以
下、本遺伝子またはＴＳＬＬ２遺伝子ともいう）を提供
する発明である。

【００１０】本発明者が、本遺伝子を見出した過程につ
いては、本明細書の実施例の欄において開示する。ま
た、本明細書におけるアミノ酸の標記方法は、三文字法
と一文字法を併用する。すなわち、本明細書において
は、アラニンはＡｌａ（三文字法）〔Ａ（一文字法）〕
で、バリンはＶａｌ（Ｖ）で、ロイシンはＬｅｕ（Ｌ）
で、イソロイシンはＩｌｅ（Ｉ）で、プロリンはＰｒｏ
（Ｐ）で、フェニルアラニンはＰｈｅ（Ｆ）で、トリプ
トファンはＴｒｐ（Ｗ）で、メチオニンはＭｅｔ（Ｍ）
で、グリシンはＧｌｙ（Ｇ）で、セリンはＳｅｒ（Ｓ）
で、トレオニンはＴｈｒ（Ｔ）で、システインはＣｙｓ
（Ｃ）で、グルタミンはＧｌｎ（Ｑ）で、アスパラギン
はＡｓｎ（Ｎ）で、チロシンはＴｙｒ（Ｙ）で、リシン
はＬｙｓ（Ｌ）で、アルギニンはＡｒｇ（Ｒ）で、ヒス
チジンはＨｉｓ（Ｈ）で、アスパラギン酸はＡｓｐ
（Ｄ）で、グルタミン酸はＧｌｕ（Ｅ）として標記され
得る。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
する。Ａ．本遺伝子の内容本遺伝子は、前述したように、配列番号１で表されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子である。

【００１２】本遺伝子は、９個のエクソンからなる、約
１７kbにわたる遺伝子である。９個のエクソンのうち、
エクソン１は、コザックのコンセンサス配列の下流に位
置するメチオニンの開始コドンを含んでいる。また、本
遺伝子の上流領域はグアニンとシトシンの含有量が多く
なり、１０３９bpのＣｐＧのアイランド領域が認められ
る。

【００１３】本遺伝子の配列から予測されるアミノ酸配
列（配列番号１）から、本遺伝子は、３か所の潜在的な
Ｎ−糖鎖付加部位を有する免疫グロブリン様Ｃ２−タイ
プループと、１か所の細胞膜貫通領域と短い細胞質領域
をコードしていることを推測することができる。細胞質
領域における、本遺伝子と癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１との
アミノ酸配列の相同性は３７％であり、全配列における
本遺伝子と癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１とのアミノ酸配列の
相同性は３７％である。このことにより、本遺伝子がコ
ードするタンパク質は、免疫グロブリンのスーパーファ
ミリーに属するタンパク質であるということがわかる。

【００１４】また、本遺伝子の染色体上の座位は、第１
９染色体上（１９ｑ１３．２）であり、ヒトの脳、腎
臓、前立腺、心臓、骨格筋、膵臓、卵巣、小腸および結
腸において発現している遺伝子である。

【００１５】本遺伝子は、少なくとも、脳・神経系細胞
由来の癌と前立腺細胞由来の癌の発症に関して深く係わ
っており、特に、かかる脳・神経系細胞と前立腺におけ
る発癌を抑制する機能を有する遺伝子である。

【００１６】Ｂ．本遺伝子の製造本遺伝子は、例えば、ヒト脳組織由来のｐｏｌｙ（Ａ）
⁺ＲＮＡからｃＤＮＡを調製して、これを鋳型としたＰ
ＣＲ法等の遺伝子増幅法を用いて得ることができる。

【００１７】具体的には、常法（例えば、ｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いる方
法）で、ＴＳＬＬ２をコードし得るｃＤＮＡを調製し
て、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を用いて、このｃＤＮＡ
を増幅する。

【００１８】また、ＰＣＲ法による増幅に必要なＰＣＲ
プライマーとして、例えば、ＴＳＬＬ２遺伝子に対する
特異的なプライマーを用いることができる。具体的に
は、後述のようにして決定された本遺伝子のコード領域
の５’末端側と同３’末端側の配列を含むＤＮＡ断片を
プライマーとして、本遺伝子を大量に増幅して、これを
用いることができる。

【００１９】遺伝子増幅用プライマーの塩基配列は、選
択する遺伝子増幅方法に応じた配列を用いることが可能
であり、特に限定されないが、通常、遺伝子増幅を行う
遺伝子領域の５’末端側と３’末端側のそれぞれに相補
的な塩基配列のプライマーを用いることにより、かかる
遺伝子増幅用プライマーに挟まれた、本遺伝子に相当す
る遺伝子を増幅することができる。遺伝子増幅用プライ
マーにおける塩基数は、特に限定されるものではない
が、通常は、１７〜３５塩基程度であり、２０〜３０塩
基程度が好適である。塩基数が少な過ぎると、本来、ハ
イブリダイズするべき領域へのハイブリダイズの精度が
下がり、多過ぎると、コスト高になったり、取扱いが煩
雑になる傾向が認められる。また、鋳型となるハイブリ
ダイズ領域との相補性は、ハイブリダイズの確実性を向
上させる上で、可能な限り高いことが好適である、特
に、プライマーの３’末端側は、鋳型配列との相補性は
高いことが好適である。

【００２０】遺伝子増幅用プライマーとしては、例え
ば、下記のような塩基配列のヌクレオチド鎖が例示され
るが、これに限定されるものではない。５’ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧ３’
（配列番号３）５’ＡＡＧＣＧＴＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＡＧＴＧＧＴＧ
３’（配列番号４）これらの特異的な遺伝子増幅用プライマーは、通常は、
化学合成により調製される。また、必要に応じて、この
遺伝子増幅用プライマーに適当な制限酵素認識部位を含
む塩基配列を付加することもできる。

【００２１】このようにして得られた遺伝子増幅産物か
ら、ＴＳＬＬ２遺伝子を含むものを濃縮することができ
る。例えば、ＴＳＬＬ２遺伝子に特異的な塩基配列を有
するポリヌクレオチドに標識を施したものを、プローブ
として、遺伝子増幅産物にハイブリダイズさせ、この標
識に基づいて、ＴＳＬＬ２遺伝子を含むｃＤＮＡ断片と
して選択することが可能である。

【００２２】ここで用いる標識は、上記選別方法を行う
ことが可能である限り特に限定されないが、可能な限り
標識と選別が簡便な手段を用いることが好ましいことは
勿論である。かかる点より、例えばビオチンでｃＤＮＡ
断片を標識して、標識されたｃＤＮＡ断片をストレプト
アビジンに吸着させる手法等を用いることが有利であ
る。

【００２３】このようにして、所望する本遺伝子ｃＤＮ
Ａを得ることができる。なお、このようにして調製した
本遺伝子を、適切な遺伝子導入用ベクターに組み込み、
これを選択した遺伝子導入用ベクターに適した宿主細胞
に導入することにより、本遺伝子が導入された形質転換
体を得ることができる。遺伝子導入用ベクターにｃＤＮ
Ａ断片が組み込まれたか否かは、このベクターが保有す
る，例えばlac Ｚ遺伝子活性によるカラーセレクション
等によって確認することができる。

【００２４】また、この遺伝子の導入工程を、市販の遺
伝子ライブラリー調製用キットを用いて行うことも可能
である。本遺伝子を有するクローンは、例えば、ＴＳＬ
Ｌ２遺伝子に特異的な塩基配列のヌクレオチド鎖を調製
し、これに標識を施して標識プローブとして、各クロー
ンのレプリカとハイブリダイズさせて、この標識プロー
ブとハイブリダイズするクローンを選別して、このクロ
ーンを本遺伝子であるＴＳＬＬ２遺伝子を保有するクロ
ーンとすることができる。

【００２５】上述のようにして得られた本遺伝子の塩基
配列の確認は、常法に従って行うことができる。例え
ば、マキサム−ギルバート法（Maxam,A.M.,and Gilber
t,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,560(1977)），ジ
デオキシ法（Sanger,F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.,74,5463(1977)），ゲノミック・シークエンス法
（Church,G.M.and Gilbert,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.,81,1991(1984)），マルチプレックス法（Church,
G.M. and Kieffer-Higgins,S.,Science,240,185(198
8)），サイクルシークエンス法（Murray,V.,Nucleic Ac
ids Res.,17,8889(1989)）等の方法を用いて、対象の塩
基配列を確認することができる。

【００２６】なお、これらの原理を応用した塩基配列自
動解析装置を用いて、この塩基配列を確認することも勿
論可能である。さらに、ホスファイト−トリエステル法
（Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5
956(1984) ）等の通常公知の方法を用いて本遺伝子断片
を化学合成することも可能であり、これらの化学合成法
を応用したＤＮＡシンセサイザーを用いて本遺伝子断片
を合成することも可能である。

【００２７】なお、このようにして製造する本遺伝子の
塩基配列の一部を改変して、この塩基配列の一部の塩基
が欠失，置換若しくは挿入された塩基配列からなる改変
遺伝子（ただし、大規模な欠失，置換若しくは挿入を施
した塩基配列の場合は、非改変の本遺伝子と対応する部
分の相同性が概ね９０％以上である）の存在を本発明者
は認識し、このような改変遺伝子にも本発明の技術的範
囲は及ぶものである。

【００２８】この遺伝子改変法として、通常公知の方
法、例えばいわゆるサイト−スペシフィックミュータジ
ェネシス（Site-Specific Mutagenesis)（Mark,D.F.,et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81,5662(1984) ）等
の方法を用いて、所望する遺伝子改変を行うことができ
る。

【００２９】この本発明の技術的範囲が及び得る本遺伝
子は、ストリンジェントな条件下｛系におけるＤＮＡ同
士のハイブリッドが形成しにくい条件〔具体的には、系
の温度（高い程ハイブリッドしにくい）や塩濃度（低い
程ハイブリッドしにくい）や、ホルムアミド等の変性剤
の濃度（高い程ハイブリッドしにくい）等に依存する〕
のことをいう。｝で配列番号２（後述する）で表される
塩基配列のＤＮＡとハイブリダイズし、さらに配列番号
１（後述する）で表されるアミノ酸配列を有するＴＳＬ
Ｌ２と実質的に同一の生物学的活性を有する、ＴＳＬＬ
２をコードする遺伝子である。

【００３０】ここにいう「実質的に同一」とは、その生
物学的活性が比較の対象となるＴＳＬＬ２の生物学的活
性と質的及び／又は量的に同一性を有することを意味す
る。

【００３１】Ｃ．本遺伝子の有用性（１）遺伝子診断における有用性本遺伝子を、癌に関する遺伝子診断に利用することが可
能である。つまり、本遺伝子は、脳・神経系細胞および前立腺癌細胞の癌
抑制遺伝子であるために、腫瘍の生検試料における、ヘ
マトキシリンエオジン染色等の染色像の病理診断と共
に、本遺伝子を、少なくともターゲットの一つとした遺
伝子の解析を行うことで、その生検試料の悪性度を検討
することが可能である。

【００３２】具体的には、生検試料のＤＮＡにおける、
本遺伝子の変異、欠失等の有無を検出することにより、
その試料提供者における腫瘍の悪性度を把握する一要素
とすることができる。すなわち、生検試料のＤＮＡにお
ける本遺伝子に、変異や欠失が認められない場合には、
本遺伝子が腫瘍抑制的に働いていることが推定され、悪
性度を低く判定する要素となり得るが、逆に、変異や欠
失が認められると、本遺伝子が正しく機能していないも
のと推測され、悪性度が高く判定される要素となり得
る。

【００３３】また、上記の変異や欠失を、被検者の予後
の判定要素とすることも可能である。特に、本遺伝子
は、細胞の接着等に関連していることも予想されるため
に、本遺伝子が、癌の浸潤や転移に抑制的に働いている
可能性が高い。よって、本遺伝子の変異や欠失を、対象
となる腫瘍の浸潤や転移の危険度を判定する要素とする
ことも可能である。

【００３４】腫瘍を発症する前に、本遺伝子の異常を
検出することで、被検者の脳・神経系腫瘍および前立腺
癌細胞の発生の危険度を判定する要素とすることが可能
である。

【００３５】すなわち、被検者の検体において、本遺伝
子における、変異、欠失等の異常が認められる場合に
は、本遺伝子が癌抑制遺伝子として正常に機能しておら
ず、被検者の脳・神経系の腫瘍や前立腺癌の発生頻度を
高く判定する一要素となり得る。

【００３６】（２）遺伝子治療における有用性特に、上記の遺伝子診断において、本遺伝子における変
異や欠失が認められ、本遺伝子の機能が正常に働いてい
ないと判断される者（対象となる癌の未発症者と既発症
者の両者を含む）に対して、正常の本遺伝子を補うこと
により、癌の発症を抑制したり、発症した癌の治療を行
うことができる。

【００３７】すなわち、本遺伝子（好ましくは、本遺伝
子を発現させるための、プロモーター等を結合させた形
式であることが好適である）を、遺伝子治療において用
いられ得る遺伝子導入ベクター（例えば、レトロウイル
スベクターやアデノウイルスベクター等）に組み込ん
で、これを、対象者に投与することにより、対象者にお
ける本遺伝子の機能を回復させ、癌の発症の抑制や癌の
治療に用いることが可能である。

【００３８】Ｄ．ＴＳＬＬ２タンパク質の製造：さら
に、このようにして入手した、本遺伝子である、ＴＳＬ
Ｌ２遺伝子を用いて、組換えＴＳＬＬ２タンパク質（以
下、ＴＳＬＬ２タンパク質ともいう。このＴＳＬＬ２タ
ンパク質には、特に断らない限り上記の改変遺伝子から
翻訳され得るＴＳＬＬ２タンパク質が含まれ、勿論これ
らの改変遺伝子から翻訳され得る改変タンパク質は、改
変されていないＴＳＬＬ２タンパク質と実質的に同一の
生物学的活性を有する。）を製造することができる。

【００３９】このＴＳＬＬ２タンパク質は、上記本遺伝
子を利用して、通常公知の一般的な遺伝子組換え技術に
従って製造することができる。より具体的には、本遺伝
子が発現可能な形態の遺伝子発現用ベクターに本遺伝子
を組み込み、この遺伝子発現用ベクターの性質に応じた
宿主にこの組換えベクターを導入して形質転換し、この
形質転換体を培養等することにより所望のＴＳＬＬ２タ
ンパク質を製造することができる。

【００４０】ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通
常発現しようとする遺伝子の上流域に、エンハンサー、
プロモーター、翻訳開始配列、及び、下流域に転写終了
配列等を保有するものを用いるのが好適である。

【００４１】また、本遺伝子の発現は、直接発現系に限
らず、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子，グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子やチオレドキシン
遺伝子を利用した融合タンパク質発現系とすることもで
きる。

【００４２】かかる遺伝子発現用ベクターとしては、例
えば宿主を大腸菌とするものとしては、ｐＱＥ，ｐＧＥ
Ｘ，ｐＴ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，
ｐＮＴ２６ＣII等を例示することができる。また、宿主
を枯草菌とするものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮＣ
３，ｐＳＭ２３，ｐＫＨ８０等を例示することができ
る。

【００４３】また、宿主を酵母とするものとしては、ｐ
ＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ１，Ｙ
Ｅｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０等を例示することがで
きる。

【００４４】また、宿主を哺乳動物細胞又は昆虫細胞と
するものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤ
Ｌ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２ｄｈ
ｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡｃＹＭ１，
ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡＩ等を例示す
ることができる。

【００４５】これらの遺伝子発現ベクターは、ＴＳＬＬ
２タンパク質を発現させる目的に応じて選択することが
できる。例えば大量にＴＳＬＬ２タンパク質を発現させ
ることを企図する場合には、宿主として大腸菌，枯草菌
又は酵母等を選択し得る遺伝子発現ベクターを選択する
のが好ましく、少量でも確実に活性を有するようにＴＳ
ＬＬ２タンパク質を発現させることを企図する場合に
は、哺乳動物細胞や昆虫細胞を宿主として選択し得る遺
伝子発現ベクターを選択するのが好ましい。

【００４６】なお、上記のように既存の遺伝子発現ベク
ターを選択することも可能であるが、目的に応じて適宜
遺伝子発現ベクターを作出して、これを用いることも勿
論可能である。なお、これらの遺伝子発現用ベクターも
本発明の技術的範囲に入るものである。

【００４７】本遺伝子を組み込んだ上記遺伝子発現用ベ
クターの宿主細胞への導入及びこれによる形質転換法
は、一般的な方法、例えば宿主細胞が大腸菌や枯草菌で
ある場合には、塩化カルシウム法やエレクトロポレーシ
ョン法等を；宿主が哺乳動物細胞や昆虫細胞の場合はリ
ン酸カルシウム法，エレクトロポレーション法又はリポ
ソーム法等の手段により行うことができる。

【００４８】このようにして得られる形質転換体を常法
に従い培養することにより、所望するＴＳＬＬ２タンパ
ク質が蓄積される（このような形質転換体も本発明の技
術的範囲に含まれる。）。

【００４９】かかる培養に用いられる培地は、宿主の性
質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が
大腸菌である場合には、ＬＢ培地やＴＢ培地等が、宿主
が哺乳動物細胞の場合には、ＲＰＭＩ１６４０培地等を
適宜用いることができる。

【００５０】この培養により得られる培養物からのＴＳ
ＬＬ２タンパク質の単離及び精製は、常法に従い行うこ
とが可能であり、例えば培養物を、ＴＳＬＬ２タンパク
質の物理的及び／又は化学的性質を利用した各種の処理
操作を用いて行うことが可能である。

【００５１】具体的には、タンパク沈澱剤による処理，
限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラフィー，遠
心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィニティクロ
マトグラフィー，透析法等を単独で又はこれらの方法を
組み合わせて用いることができる。このようにして、Ｔ
ＳＬＬ２タンパク質を単離、精製することが可能であ
る。

【００５２】ＴＳＬＬ２タンパク質を抗原として用いる
ことにより、ＴＳＬＬ２を特異的に認識する抗体を製造
することが容易となり、これを、例えば、診断目的で利
用することができる。また、ＴＳＬＬ２タンパク質をも
とにして、その類似構造体を製造したり、また、その機
能を活性化させる分子を単離、あるいは、合成し、神経
膠腫の治療に役立てることができる。また、ＴＳＬＬ２
タンパク質を、細胞内で発現させることにより、その細
胞内における局在部位を決定したり、細胞内でＴＳＬＬ
２タンパク質と結合し、相互作用する、他のタンパク質
を同定することもできる。これらの結合タンパク質は、
ＴＳＬＬ２タンパク質と共に、神経膠腫等の脳腫瘍や前
立腺癌を抑制し得る経路の解明や、抑制する物質の同定
や合成等に利用することができる。

【００５３】Ｅ．ＴＳＬＬ２タンパク質に対する抗体の
製造：本発明は、ＴＳＬＬ２タンパク質に対する抗体
（以下、本抗体ともいい、本抗体が、ポリクローナル抗
体である場合には、本ポリクローナル抗体ともいい、本
抗体が、モノクローナル抗体である場合には、本モノク
ローナル抗体ともいう）にも関する。すなわち、本ポリ
クローナル抗体は、ＴＳＬＬ２タンパク質を免疫抗原と
して免疫した動物に由来する免疫血清から製造すること
ができる。

【００５４】ここで使用される免疫抗原としてのＴＳＬ
Ｌ２タンパク質は、特に限定されるものではなく、上記
のごとく調製される本遺伝子（その塩基配列の一部を改
変したものも含む）がコードするＴＳＬＬ２タンパク質
を用い得ることは勿論のこと、本遺伝子の一部断片がコ
ードするＴＳＬＬ２タンパク質断片やＴＳＬＬ２タンパ
ク質に直接酵素処理等を施して、又は化学合成して得ら
れるＴＳＬＬ２タンパク質の部分ペプチドをも本ポリク
ローナル抗体を製造する上での免疫抗原とすることがで
きる。なお、用いるＴＳＬＬ２タンパク質由来の部分ペ
プチドが小さい場合等、必要に応じて、ハプテンをかか
るペプチドに結合させて、これを免疫抗原として用いる
ことも可能である。

【００５５】また、免疫動物と同種・同系統の動物由来
の細胞株に、ＴＳＬＬ２タンパク質（ＴＳＬＬ２タンパ
ク質を含む）又はその一部をコードする遺伝子を組み込
んだ発現ベクターを導入して形質転換して、この形質転
換細胞をその免疫動物に移植することにより本ポリクロ
ーナル抗体を調製することができる。すなわち、形質転
換細胞を移植した動物の体内で、持続的に上記ＴＳＬＬ
２タンパク質がその形質転換細胞で作られ、それに対す
る抗体が産生されて、これをポリクローナル抗体とする
こともできる（Nemoto,T.,et al.,Eur.J.Immunol.,25,3
001(1995) ）。

【００５６】さらに、ＴＳＬＬ２タンパク質を発現する
発現ベクターを直接動物に筋注や皮下注等の手段で投与
することにより、その動物内でＴＳＬＬ２タンパク質を
継続的に産生させて、上記の形質転換細胞を移植した場
合と同様に本ポリクローナル抗体を製造することができ
る（Raz,E.,el al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,951
9(1994) ）。

【００５７】一方、本モノクローナル抗体は、本ポリク
ローナル抗体の場合と同様の方法で、免疫した動物の免
疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出
し、これにより、ＴＳＬＬ２タンパク質を認識する抗体
を産生するクローンを選択し、このクローンを培養する
ことにより製造することができる。

【００５８】また、免疫される動物も特に限定されるも
のではなく、マウス，ラット等を広く用いることができ
るが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融
合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択するこ
とが望ましい。

【００５９】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，腹
腔内注射等で投与することにより行うことができる。よ
り具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュ
バントと併用して、免疫の対象とする動物に２〜１４日
毎に上記手段により数回投与し、ポリクローナル抗体製
造のための免疫血清又はモノクローナル抗体製造のため
の免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を得ることができ
る。

【００６０】モノクローナル抗体を製造する場合、この
免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細
胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ
１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４
５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．Ｒ
ＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００
７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等
を用いることができる。

【００６１】上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融
合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495
(1975)）等に準じて行うことができる。

【００６２】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。

【００６３】所望のハイブリドーマの分離は、通常の選
別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテ
リン及びチミジン）培地で培養することにより行うこと
ができる。すなわち、この選別用培地において目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間
をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行
うことができる。このようにして得られるハイブリドー
マは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナ
ル抗体の検索及び単一クローン化に供することができ
る。

【００６４】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，
凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検
索法に従い行うことができる。

【００６５】このようにして得られるＴＳＬＬ２タンパ
ク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であ
り、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる
（本発明の技術的範囲には、このハイブリドーマも含ま
れる。）。

【００６６】このハイブリドーマからの所望のモノクロ
ーナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従っ
て培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリ
ドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物
に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用い
ることができる。

【００６７】なお、インビトロで免疫細胞を、ＴＳＬＬ
２タンパク質又はその一部の存在下で培養し、一定期間
後に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫
細胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリド
ーマをスクリーニングすることで所望するモノクローナ
ル抗体を得ることもできる（Reading,C.L.,J.Immunol.M
eth.,53,261(1982) ；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Bio
l.,96,1149(1983））。

【００６８】さらに、免疫原としてＴＳＬＬ２タンパク
質を用いることなしに、免疫原として直接本遺伝子又は
その一部を用いて所望するモノクローナル抗体を製造す
ることも可能である。

【００６９】すなわち、本遺伝子で直接動物を免疫して
（この免疫の際には、この遺伝子を含む遺伝子発現用組
換えベクターを免疫原として用いることができる）、そ
の遺伝子免疫動物の免疫細胞又は免疫血清を用いること
によって、ＴＳＬＬ２タンパク質を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を製造することができる。

【００７０】また、上記で得られるポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，ア
フィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精
製することができる。

【００７１】このようにして得られるポリクローナル抗
体及びモノクローナル抗体は、ＴＳＬＬ２タンパク質に
特異反応性を有する抗体である。ＴＳＬＬ２に対する抗
体を用いることにより、細胞や組織におけるＴＳＬＬ２
タンパク質の発現を特異的に検出することができる。こ
れにより、神経膠腫や前立腺癌をはじめとする、脳や神
経、さらには前立腺に関連する種々の疾患の診断、鑑別
診断、質的診断に利用することができる。

【００７２】

【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。ｃＤＮＡクローンの単離と塩基配列の決定４６アミノ酸残基のＴＳＬＣ１の全細胞質領域蛋白に対
して相同するアミノ酸配列は、advanced BLAST program
(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) を用いて検出し
た。成人ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーであるLamb
da TriplExは、クローンテック社から購入した。ｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングに用いたプローブは、
下記のプライマーを用いて得られる１１０３bpのＴＳＬ
Ｌ２遺伝子に対するＰＣＲ由来のｃＤＮＡフラグメント
である。プライマー１：５’−ＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧ
ＴＡＣＡ−３’（配列番号５）プライマー２：５’−ＴＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＴＣ
ＣＴＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号６）

【００７３】また、ＴＳＬＬ２遺伝子の５’末端の高速
増幅は、Marathon-Ready cDNA Kit(Clontech社製）を用
いて行った。プライマーとしては、以下に示すものを用
いた。アダプタープライマー：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号
７）遺伝子特異的プライマー：５’−ＣＴＴＣＧＴＴＧＴＡ
ＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧ−３’（配列番号
８）

【００７４】ＤＮＡの塩基配列は、ＡＢＩ３７７ＤＮＡ
オートシークエンサー（アプライドバイオシステム社
製）において、the BigDye terminator cycle sequenci
ngready kit（Perkin-Elmer社製）を用いることにより
決定した。

【００７５】ＴＳＬＣ１の細胞質領域のアミノ酸配列
（glycophirin Ｃとの著しい相同性を示す）は、BLAST
プログラムによるデータベースにおける配列の相同性の
検索のために用いた。対応するヌクレオチド配列とのア
ミノ酸配列の比較解析により、ヒト遺伝子の配列であ
る、1143bpのF22162 1(AAC32470) が、相同する配列と
して確認された。F22162 1 は、35465 bpのコスミドク
ローンF22162の配列であると予想されている。

【００７６】しかしながら、F22162 1 は、コーディン
グ配列全部を含んでいなかった。この配列F22162 1
は、成人ヒト脳中でも発現されていたので、我々は、ｃ
ＤＮＡ（全長）を得るために、成人ヒト脳由来のｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングした。この遺伝子のコ
ーディング配列全部および５’未翻訳領域(UTR) を、Ｒ
ＡＣＥ法によって決定し、これを、本遺伝子（ＴＳＬＬ
２遺伝子）とした。

【００７７】決定した本遺伝子であるＴＳＬＬ２の塩基
配列を配列番号２に示し、これから推定されるアミノ酸
配列を配列番号１に示す（第１図に、これらの遺伝子配
列とアミノ酸配列を示す）。

【００７８】本遺伝子は、３８８個のアミノ酸からなる
タンパク質をコードしている、１１６４bpのオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を１個含んでいた。第２
図には、ヒトＴＳＬＣ１、ヒトＴＳＬＬ１（bk134P22.1
をプローブとして用いて得た、成人ヒト脳由来のｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングの結果得られた遺伝子
で、ＴＳＬＬ１のｃＤＮＡは、３９８個のアミノ酸から
なるタンパク質をコードしている、１１９４bpのＯＲ
Ｆ：GenBank Accession No.CAB56227）、ヒトＴＳＬＬ
２、human glycophirin Ｃ（ｈＧＬＰＣ）（GenBank Ac
cession No.P04921)、ヒトコンタクチン結合蛋白２（ｈ
Ｃａｓｐｒ２）（NP 054860)およびDrosophia melanoga
ster Neurexin IV（ｄＮＲＸ）(X86685)蛋白の間でのア
ミノ酸配列の整合性を示している。空白部分は、最良の
整合を行うために導入されている。これらのアミノ酸配
列間で保存されているアミノ酸残基は、黒く囲んであ
る。ｈＧＬＰＣの蛋白４．１に結合するために必要な１
３アミノ酸(Marfatia et al.,1995)は、下線で示され、
ＰＤＺが結合するためのＣＯＯＨ末端の３つのコンセン
サスアミノ酸(Marfatia et al.,1997;Songyang et al.,
1997) は、二本下線で示されている。

【００７９】予測したアミノ酸配列は、ＴＳＬＬ２にお
いて、いくつかの潜在的なＮ−グリコシル化部位、１つ
の膜貫通ドメイン、および短い細胞質ドメインをもつ３
つの免疫グロブリン様Ｃ２タイプのループを含んでいる
細胞外ドメインを有する膜タンパク質をコードしている
ことを示している。第２図に示されているように、ＴＳ
ＬＣ１は、細胞質ドメイン中で、ＴＳＬＬ２との間にお
ける相同性を示した（アミノ酸配列中37％同一であっ
た）。さらに、ＴＳＬＬ２は、アミノ酸配列全体におい
ても、ＴＳＬＣ１との類似性を示した（アミノ酸配列中
37％同一であった）。このことは、ＴＳＬＬ２タンパク
質が、免疫グロブリンのスーパーファミリータンパク質
に属していることを示している。

【００８０】本遺伝子のゲノム構造は、コスミドクロー
ン(AC005525)の既知のゲノム配列を、本遺伝子配列と比
較することにより特定した。本遺伝子の遺伝子配列の一
部は、鋳型として343M13クローンからのＢＡＣＤＮＡ
クローンを用いて決定した。

【００８１】遺伝子構造の決定ＲＰＣＩ−IIヒトＢＡＣライブラリーの高濃度フィルタ
ーは、ResearchGenetics社から購入し、添付の指示書に
従った。ＴＳＬＬ２遺伝子の全コード配列に相当するｃ
ＤＮＡプローブでハイブリダイズを行うことにより、Ｔ
ＳＬＬ２遺伝子を含む３４３Ｍ１３クローン由来のＢＡ
ＣＤＮＡを同定した。ＴＳＬＬ２遺伝子の遺伝子構造
は、ＢＡＣクローン134P22(GenBank Accession No. AL0
35403)の既知のゲノム塩基配列に、各ｃＤＮＡ配列を並
べることによって決定した。ＴＳＬＬ２遺伝子のゲノム
配列の一部は、３４３Ｍ１３クローン由来のＢＡＣＤＮ
Ａクローンを、鋳型として用いて決定した。

【００８２】第３図は、ヒトＴＳＬＬ２遺伝子とヒトＴ
ＳＬＣ１遺伝子を図式化した図面である。翻訳領域のエ
クソンは、そのヌクレオチド長と共に黒く囲んで示し、
非翻訳領域のエクソンは、白抜きで示してある。エクソ
ンの数は、囲みの上に記載されている。

【００８３】第３図に示すように、ＴＳＬＬ２遺伝子
は、９個のエクソンからなる、約１７kbにわたる遺伝子
である。９個のエクソンのうち、エクソン１は、コザッ
クのコンセンサス配列(Kozak, 1989) の下流に位置する
メチオニンの開始コドンを含んでいる。また、本遺伝子
の上流領域はグアニンとシトシンの含有量が多くなり、
１０３９bpのＣｐＧのアイランド領域が認められる(Ant
equeraら, 1993) 。

【００８４】本遺伝子の配列から予測されるアミノ酸配
列（配列番号２）から、本遺伝子は、３か所の潜在的な
Ｎ−糖鎖付加部位を有する免疫グロブリン様Ｃ２−タイ
プループと、１か所の細胞膜貫通領域と短い細胞質領域
をコードしていることを推測することができる。細胞質
領域における、本遺伝子と癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１との
アミノ酸配列の相同性は３７％であり、全配列における
本遺伝子と癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１とのアミノ酸配列の
相同性は３７％である。このことにより、本遺伝子がコ
ードするタンパク質は、免疫グロブリンのスーパーファ
ミリーに属するタンパク質であるということがわかる。

【００８５】Fluorescene in situ hybridization （Ｆ
ＩＳＨ）ＴＳＬＬ２遺伝子の染色体位置を直接決定するために、
蛍光in situ ハイブリッド形成法(FISH)を行った。

【００８６】ＦＩＳＨは、既に確立している方法（Pink
el et al.,1986）により行った。ＢＡＣクローン３４３
Ｍ１３から精製されたＤＮＡは、nick translation kit
（ベーリンガー社製）を用いて、Spectrum Green-dUTP
（VISIS 社製）で、既に報告されている方法（Shimura
et al.,1999 ）により標識し、これを、ＴＳＬＬ２遺伝
子の染色体上の位置を決定するためのプローブとして用
いた。ヒト染色体１９ｑのテロメア領域に対するプロー
ブは、ＶＹＳＩＳ社から購入し、上記と同様にSpectrum
Orenge-dUTPで標識した。ハイブリダイゼーション後、
細胞と染色体を、０．１％ｐ−フェニレンジアミンと９
０％グリセロールを含有するアンチフェードソリューシ
ョン（和光純薬社製）中において、4',6-diamidino-2-p
henylindole （ＤＡＰＩ）で、対比染色した。デジタル
イメージを、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で検出し、
ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ（Applied Imaging 社製）で解
析した。少なくとも２０個の中期染色体で検討し、ヒト
染色体１９ｑ上で、特定のシグナルを検出した。

【００８７】第４図は、ＴＳＬＬ２の染色体上の位置を
示す図面である。緑色のシグナル（図中で、△印で示し
た部分）は、ＴＳＬＬ２を含むＤＮＡを示し、赤色のシ
グナル（図中で、矢印で示した部分）は、第１９染色体
長腕上のテロメア領域を示している（図における色は、
本件出願における参考図面を参照のこと）。

【００８８】第４図に示されているように、ＢＡＣクロ
ーン３４３Ｍ１３を、通常のヒト中期染色体に対してハ
イブリッド形成させた時に、１９ｑ上で特定のシグナル
を検出した。この結果は、ＴＳＬＬ２のｃＤＮＡ配列
が、染色体１９ｑ１３．２上のコスミドクローンF22162
のゲノム配列の一部と同一であるという知見と一致して
いる。

【００８９】細胞株ヒト前立腺癌の細胞株である、ＰＰＣ−１は、ユタ大学
のA.R.Brothman博士のご厚意で分けていただいた。ヒト
神経膠腫細胞の細胞株である、Ｈｓ６８３，ＳＷ１０８
８，ＳＷ１７８３，ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ，ＣＣＦ−Ｓ
ＴＴＧ１，Ｕ８７ＭＧ，Ｕ１１８ＭＧ，Ｕ３７３ＭＧ
と、ヒト前立腺癌の細胞株である、ＰＣ３，ＬＮＣａ
Ｐ，ＤＵ１４５は、アメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡＴＣＣ）から入手した。ヒト神経膠腫細胞の
細胞株である、Ｔ９８Ｇ，Ａ１７２，ＹＫＧ−１，ＫＧ
１Ｃは、ヘルスサイエンスリサーチリソースバンク（大
阪）から入手した。これらの細胞株は、供給者の指示に
従って培養した。

【００９０】ノーザンブロット解析ヒトの多組織ノーザンブロット膜、ヒト成人脳、前立腺
ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡとヒトβアクチン用のｃＤＮＡ
プローブは、クローンテック社から購入した。神経膠腫
細胞又は前立腺癌の細胞株からのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮ
Ａは、FastTrack2.0Kit （インビトロゲン社製）を用い
て抽出した。ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡの１μg に対して
は、２．１Ｍのホルムアミドを含有する１％アガロース
ゲルでの電気泳動を行い、これを、Hybond-N+nylon mem
brene （アマシャム社製）に移した。ＴＳＬＬ２遺伝子
のコードィング配列をプローブとして用いた。ハイブリ
ダイゼーションは、５×ＳＳＣ，４２℃の２０mMナトリ
ウム緩衝液，１×Denhardt's溶液，０．２％ＳＤＳ，１
００μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ，１０％デキストラン硫
酸，および，５０％ホルムアミド，中で１８時間行っ
た。ハイブリダイゼーション終了後、ＲＮＡを移したメ
ンブレンは、４２℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１
５分間、および、５０℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％Ｓ
ＤＳで１５分間の洗浄を行った後、増強用スクリーンと
共に、１〜４日間，−７０℃で露光した。

【００９１】第５図は、成人（１６種類）と胎児（４種
類）の組織における、ＴＳＬＬ２遺伝子のノーザンブロ
ット解析の結果を示した図面である。各々のレーンは、
２μg のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを含んでいる。レーン
１は、心臓；レーン２は、脳；レーン３は、胎盤；レー
ン４は、肺；レーン５は、肝臓；レーン６は、骨格筋；
レーン７は、腎臓；レーン８は、膵臓；レーン９は、脾
臓；レーン10は、胸腺；レーン11は、前立腺；レーン12
は、精巣；レーン13は、卵巣；レーン14は、小腸；レー
ン15は、結腸；レーン16は、末梢血細胞；レーン17は、
胎児の脳；レーン18は、胎児の肺；レーン19は、胎児の
肝臓；レーン20は、胎児の腎臓のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮ
Ａである。

【００９２】第５図に示されているように、ＴＳＬＬ２
遺伝子は、２．２Kbの遺伝子転写物が、前立腺、脳、心
臓、骨格筋、膵臓、卵巣、小腸および結腸において発現
していた。

【００９３】第６図は、１２種類のヒト神経膠腫細胞の
細胞株における、ＴＳＬＬ２遺伝子のノーザンブロット
解析の結果を示した図面である。βアクチンは、各レー
ンの低い位置に示されている。各々のレーンは、５μg
のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを含んでいる。レーン１は、
Ｈｓ６８３；レーン２は、ＳＷ１０８８；レーン３は、
ＳＷ１７８３；レーン４は、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ；レ
ーン５は、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１；レーン６は、Ｕ８７Ｍ
Ｇ；レーン７は、Ｕ１１８ＭＧ；レーン８は、Ｕ３７３
ＭＧ；レーン９は、Ｔ９８Ｇ；レーン10は、Ａ１７２；
レーン11は、ＹＫＧ−１；レーン12は、ＫＧ１−Ｃ；レ
ーン13は、成人の脳のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡである。

【００９４】第６図は、ノーザンブロット解析におい
て、神経膠腫細胞全般〔７種類の神経膠腫細胞（SW108
8, SW1783, CCF-STTG1, U87MG, U118, T98G, およびKG1
-C)、並びに、他の４つの細胞中〕で著しく減少してい
ることを示したが、これは、ＴＳＬＬ２遺伝子が、ヒト
神経膠腫の発生または進展において、抑制的に機能して
いることを示している。

【００９５】第７図は、４種類のヒト前立腺癌細胞にお
ける、ＴＳＬＬ２遺伝子のノーザンブロット解析の結果
を示した図面である。βアクチンは、各レーンの低い位
置に示されている。各々のレーンは、５μg のｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ＲＮＡを含んでいる。レーン１は、ＰＰＣ−
１；レーン２は、ＰＣ−３；レーン３は、ＤＵ１４５；
レーン４は、ＬＮＣａＰ；レーン５は、健常前立腺のｐ
ｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡである。

【００９６】第７図は、ノーザンブロット解析におい
て、ヒト前立腺腫瘍細胞ＰＰＣ−１においてＴＳＬＬ２
の発現が失われ、他のヒト前立腺腫瘍細胞においても著
しく現象していることを示したが、これは、ＴＳＬＬ２
遺伝子が、ヒト前立腺癌の発生または進展において、抑
制的に機能していることを示している。これらのことに
より、本遺伝子が、癌抑制遺伝子としての機能を有して
いることが明らかとなった。

【００９７】ＴＳＬＬ２に対する抗体の製造ＴＳＬＬ２タンパク質の一部分のアミノ酸配列〔ＧＳＤ
ＧＨＫＲＫＥＥＦＦＩ：配列番号９〕を、ペプチド合成
機を用いて合成し、かかるペプチドに、常法により、キ
ャリアタンパク質〔キーホール・リンペットヘモシア
ニン（ＫＬＨ）〕を結合し、免疫抗原を調製した。かか
る免疫抗原を、ウサギに、１４日おきに、５回免疫し
て、免疫血清を得た。これを、スルフォリンク・カップ
リング・ゲル樹脂に、合成ペプチド（Ｃ）ＧＳＤＧＨＫ
ＲＫＥＥＦＦＩ：配列番号９）を結合させた、ペプチド
アフィニティーカラムを用いて、常法により精製して、
ポリクローナル抗体（ＢＣ２と命名した）を得た。

【００９８】従って、ＢＣ２の抗原認識部位は、ＧＳＤ
ＧＨＫＲＫＥＥＦＦＩ（配列番号９）であることが判明
した、この配列は、上記の合成ペプチドの配列と同一で
あり、確かに、ＢＣ２が、ＴＳＬＬ２タンパク質に対し
て特異的なポリクローナル抗体であることが判明した。

【００９９】ＴＳＬＬ２に対する抗体によるＴＳＬＬ２
タンパク質の検出サル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ−７に、ＴＳＬＬ２の発現
ベクター〔ヒト脳細胞由来のpoly(A) ⁺ＲＮＡから調製
したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号３，４で示される塩
基配列を有するヌクレオチドを増幅用プライマーとし
て、ＰＣＲ法を行うことによって得られたＤＮＡ断片
を、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロ
ゲン社）に組み込んで得たベクター〕を導入し、発現し
た細胞を分離した。細胞抽出物のウエスタン・ブロット
は、常法に従って行った(Towbin et al.,1979,Burnctte
et al., 1981) 。すなわち、培養した細胞を集め、１
％ＳＤＳ，１mM ＥＤＴＡ，Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ
７．５）、１００μM Pefabloc and Complete （ベーリ
ンガー・マンハイム社製）を含む細胞融解液で可溶化
し、１００００×ｇで、１０分間遠心して、上清を回収
した。これにより得られた４０μg のタンパク質を、１
０〜２０％ＳＤＳ加ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分離し、ポリビニル・リジン・ジフルオロライドフィル
ターに移した。このフィルターに、ＴＳＬＬ２タンパク
質に対する特異的ポリクローナル抗体ＢＣ２を加えて反
応させた。タンパク質は、アルカリフォスファターゼを
結合させたロバ抗ウサギIgG 抗体を用いて検出した。

【０１００】ＴＳＬＬ２の発現ベクターを導入して発現
させた、ＣＯＳ−７細胞の全細胞抽出物（レーン１）、
ＴＳＬＬ２の発現ベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の
抽出物をＴＳＬＬ２に対するポリクローナル抗体ＢＣ２
で免疫沈降したもの（レーン２）、ＴＳＬＬ２の発現ベ
クターを導入していないＣＯＳ−７細胞の全細胞抽出物
をＢＣ２で免疫沈降したもの（レーン３）を、それぞ
れ、ＳＤＳ加ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、メンブレンに移した後、ＢＣ２で、ウエスタン・ブ
ロット法により、ハイブリダイズした（第８図）。その
結果、レーン１，２で、それぞれ、分子量約４０キロダ
ルトンのＴＳＬＬタンパク質が特異的に検出された。

【０１０１】

【発明の効果】本発明により、新たな癌抑制遺伝子等が
提供され、これにより、癌予防や癌診断や癌治療に関す
る新たな手段が提供され得る。

【０１０２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BML, INC <120> TSLL2 Gene <130> PBM64 <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 388 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Arg Ala Arg Arg Phe Gln Trp Pro Leu Leu Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ala Gly Gln Glu Val Gln Thr Glu Asn Val 20 25 30 Thr Val Ala Glu Gly Gly Val Ala Glu Ile Thr Cys Arg Leu His Gln 35 40 45 Tyr Asp Gly Ser Ile Val Val Ile Gln Asn Pro Ala Arg Gln Thr Leu 50 55 60 Phe Phe Asn Gly Thr Arg Ala Leu Lys Asp Glu Arg Phe Gln Leu Glu 65 70 75 80 Glu Phe Ser Pro Arg Arg Val Arg Ile Arg Leu Ser Asp Ala Arg Leu 85 90 95 Glu Asp Glu Gly Gly Tyr Phe Cys Gln Leu Tyr Thr Glu Asp Thr His 100 105 110 His Gln Ile Ala Thr Leu Thr Val Leu Val Ala Pro Glu Asn Pro Val 115 120 125 Val Glu Val Arg Glu Gln Ala Val Glu Gly Gly Glu Val Glu Leu Ser 130 135 140 Cys Leu Val Pro Arg Ser Arg Pro Ala Ala Thr Leu Arg Trp Tyr Arg 145 150 155 160 Asp Arg Lys Glu Leu Lys Gly Val Ser Ser Ser Gln Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Val Trp Ser Val Ala Ser Thr Val Arg Phe Arg Val Asp Arg Lys Asp 180 185 190 Asp Gly Gly Ile Ile Ile Cys Glu Ala Gln Asn Gln Ala Leu Pro Ser 195 200 205 Gly His Ser Lys Gln Thr Gln Tyr Val Leu Asp Val Gln Tyr Ser Pro 210 215 220 Thr Ala Arg Ile His Ala Ser Gln Ala Val Val Arg Glu Gly Asp Thr 225 230 235 240 Leu Val Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Asn Pro Arg Pro Asn Gln Ile 245 250 255 Arg Trp Asn Arg Gly Asn Glu Ser Leu Pro Glu Arg Ala Glu Ala Val 260 265 270 Gly Glu Thr Leu Thr Leu Pro Gly Leu Val Ser Ala Asp Asn Gly Thr 275 280 285 Tyr Thr Cys Glu Ala Ser Asn Lys His Gly His Ala Arg Ala Leu Tyr 290 295 300 Val Leu Val Val Tyr Asp Pro Gly Ala Val Val Glu Ala Gln Thr Ser 305 310 315 320 Val Pro Tyr Ala Ile Val Gly Gly Ile Leu Ala Leu Leu Val Phe Leu 325 330 335 Ile Ile Cys Val Leu Val Gly Met Val Trp Cys Ser Val Arg Gln Lys 340 345 350 Gly Ser Tyr Leu Thr His Glu Ala Ser Gly Leu Asp Glu Gln Gly Glu 355 360 365 Ala Arg Glu Ala Phe Leu Asn Gly Ser Asp Gly His Lys Arg Lys Glu 370 375 380 Glu Phe Phe Ile 385 <210> 2 <211> 2176 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (50)..(1213) <400> 2 tgcaggtgcc gggccgggag cgagcggcgg cggcggcggc ggcggcacc atg ggc cgg 58 Met Gly Arg 1 gcc cgg cgc ttc cag tgg ccg ctg ctg ctg ctg tgg gcg gcc gcg gcg 106 Ala Arg Arg Phe Gln Trp Pro Leu Leu Leu Leu Trp Ala Ala Ala Ala 5 10 15 ggg cca ggg gca gga cag gaa gta cag aca gag aac gtg aca gtg gct 154 Gly Pro Gly Ala Gly Gln Glu Val Gln Thr Glu Asn Val Thr Val Ala 20 25 30 35 gag ggt ggg gtg gct gag atc acc tgc cgt ctg cac cag tat gat ggg 202 Glu Gly Gly Val Ala Glu Ile Thr Cys Arg Leu His Gln Tyr Asp Gly 40 45 50 tcc ata gtt gtc atc cag aac cca gcc cgg cag acc ctc ttc ttc aat 250 Ser Ile Val Val Ile Gln Asn Pro Ala Arg Gln Thr Leu Phe Phe Asn 55 60 65 ggc acc cgt gcc ttg aag gat gag cgt ttc cag ctt gag gag ttc tcc 298 Gly Thr Arg Ala Leu Lys Asp Glu Arg Phe Gln Leu Glu Glu Phe Ser 70 75 80 cca cgc cgg gtg cgg atc cgg ctc tca gat gcc cgc ctg gag gac gag 346 Pro Arg Arg Val Arg Ile Arg Leu Ser Asp Ala Arg Leu Glu Asp Glu 85 90 95 ggg ggc tat ttc tgc cag ctc tac aca gaa gac acc cac cac cag att 394 Gly Gly Tyr Phe Cys Gln Leu Tyr Thr Glu Asp Thr His His Gln Ile 100 105 110 115 gcc acg ctc acg gta cta gtg gcc cca gag aat cct gtg gtg gag gtc 442 Ala Thr Leu Thr Val Leu Val Ala Pro Glu Asn Pro Val Val Glu Val 120 125 130 cgg gag cag gcg gta gag ggc ggc gag gtg gag ctc agc tgc ctc gtt 490 Arg Glu Gln Ala Val Glu Gly Gly Glu Val Glu Leu Ser Cys Leu Val 135 140 145 ccg cgg tcc cgt ccg gct gcc acc ctg cgc tgg tac cgg gac cgc aag 538 Pro Arg Ser Arg Pro Ala Ala Thr Leu Arg Trp Tyr Arg Asp Arg Lys 150 155 160 gag ctg aaa gga gtg agc agc agc cag gaa aat ggc aag gtc tgg agc 586 Glu Leu Lys Gly Val Ser Ser Ser Gln Glu Asn Gly Lys Val Trp Ser 165 170 175 gtg gca agc aca gta cgg ttt cgt gtg gac cgt aag gac gac ggt ggt 634 Val Ala Ser Thr Val Arg Phe Arg Val Asp Arg Lys Asp Asp Gly Gly 180 185 190 195 atc atc atc tgt gag gcg cag aac cag gcg ctg ccc tcc gga cac agc 682 Ile Ile Ile Cys Glu Ala Gln Asn Gln Ala Leu Pro Ser Gly His Ser 200 205 210 aag cag acg cag tac gtg ctg gat gtg cag tac tcc ccc acg gcc cgg 730 Lys Gln Thr Gln Tyr Val Leu Asp Val Gln Tyr Ser Pro Thr Ala Arg 215 220 225 att cat gcc tcc caa gct gtg gtg agg gag gga gac acg ctg gtg ttg 778 Ile His Ala Ser Gln Ala Val Val Arg Glu Gly Asp Thr Leu Val Leu 230 235 240 acg tgt gct gtc acg ggg aac ccc agg cca aac cag atc cgc tgg aac 826 Thr Cys Ala Val Thr Gly Asn Pro Arg Pro Asn Gln Ile Arg Trp Asn 245 250 255 cgc ggg aat gag tct ttg ccg gag agg gcg gag gcc gtg gga gag acg 874 Arg Gly Asn Glu Ser Leu Pro Glu Arg Ala Glu Ala Val Gly Glu Thr 260 265 270 275 ctc acg ctg ccg ggt ctg gta tcc gcg gat aac ggc acc tac act tgc 922 Leu Thr Leu Pro Gly Leu Val Ser Ala Asp Asn Gly Thr Tyr Thr Cys 280 285 290 gag gcg tcc aat aag cac ggc cat gcg agg gcg ctc tac gta ctt gtg 970 Glu Ala Ser Asn Lys His Gly His Ala Arg Ala Leu Tyr Val Leu Val 295 300 305 gtc tac gac cct ggt gcg gtg gta gag gct cag acg tcg gtt ccc tat 1018 Val Tyr Asp Pro Gly Ala Val Val Glu Ala Gln Thr Ser Val Pro Tyr 310 315 320 gcc att gtg ggc ggc atc ctg gcg ctg ctg gtg ttt ctg atc ata tgt 1066 Ala Ile Val Gly Gly Ile Leu Ala Leu Leu Val Phe Leu Ile Ile Cys 325 330 335 gtg cta gtg ggc atg gtc tgg tgc tcg gta cgg cag aag ggt tcc tat 1114 Val Leu Val Gly Met Val Trp Cys Ser Val Arg Gln Lys Gly Ser Tyr 340 345 350 355 ctg acc cac gaa gcc agt ggc ttg gat gaa cag gga gaa gca aga gaa 1162 Leu Thr His Glu Ala Ser Gly Leu Asp Glu Gln Gly Glu Ala Arg Glu 360 365 370 gcc ttc ctc aat ggc agc gac gga cac aag agg aaa gag gaa ttc ttc 1210 Ala Phe Leu Asn Gly Ser Asp Gly His Lys Arg Lys Glu Glu Phe Phe 375 380 385 atc tgaccctatc cccaccccag gcctaggcct gggcctgggc tggggtcccc 1263 Ile cccactgcca gctgcaagga accagcaaag acatttacca gagtctggga tggtgggctt 1323 ctccccccac cactaacacc tcagacgctt gggcagggat gggggtgttg gatgcctgga 1383 tctctgtaag ggccagaagt gagggcccag aggtctgggt cccccagggg gcaggggcca 1443 aaggtccaga ccccccaagt ccagtgaggg cagtagggat tgggttgggg gaagataact 1503 gggggaaggc cagggcccct aggctacaaa accaggtctt gtggggaggg ggtcagtttc 1563 tgggaagggt ggggggggca gggaagggga acacagattt ctttgggggt cctagacccc 1623 atgccagcca ttgtaagagt tccacagagc tctgggcact tctttgcaaa gccatgtttg 1683 cacggtgggg ggatgggtgg ggggagggcg tggaaatagg gattctgtgt ctttgtgtca 1743 taactttgat gggggcagtg agggagacag ccccaaccct tttctccaat cccccttccc 1803 caggttcctg ggctcccctt ctctctacct tctcccccaa cgtctgtccc atccatattt 1863 gtctctctgt ccacccactc ctgggggggc cttccccatc tctcctccag gccccccggg 1923 gagggggaaa ggagtttggg gaggattcgt ggtcttcatg gttttatata taatatatta 1983 aaaaatcaaa agtctgtatg aaaatatcag attgcacccc cctctcccca ttcctggctt 2043 ttgccccctt tttcttgtta aaaaacaaaa aacaaaaaac aaaaaaccac acacacattt 2103 tgtacggggt ggggagggga atggggaggg ggtttggcaa tctcactaac caccattaaa 2163 ctgaggagag aac 2176 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 3 ggcggcggca ccatgggccg 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 4 aagcgtctga ggtgttagtg gtg 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 5 gggcaggaca ggaagtaca 19 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 6 tcagatgaag aattcctctt tcc 23 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 7 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene Amplification Primer <400> 8 cttcgttgta gagctggcag aaatag 26 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Cys Gly Ser Asp Gly His Lys Arg Lys Glu Glu Phe Phe Ile 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＳＬＬ２ｃＤＮＡの塩基配列と、これから推
定されるアミノ酸配列を示した図面である。

【図２】本遺伝子と関連する他の遺伝子とがコードする
アミノ酸配列における構造類似性を示した図面である。

【図３】本遺伝子とヒトＴＳＬＣ１遺伝子を図式化した
図面である。

【図４】本遺伝子の染色体上の座位を示す図面である。

【図５】成人と胎児の組織における、本遺伝子のノーザ
ンブロット解析の結果を示した図面である。

【図６】ヒト神経膠腫細胞の細胞株における、本遺伝子
のノーザンブロット解析の結果を示した図面である。

【図７】ヒト前立腺癌の細胞株における、本遺伝子のノ
ーザンブロット解析の結果を示した図面である。

【図８】抗ＴＳＬＬ２ポリクローナル抗体ＢＣ２によ
る、ＴＳＬＬ２タンパク質の特異的な検出を示した図面
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ (72)発明者野村幸男埼玉県川越市的場1361−１株式会社ビー・エム・エル総合研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 CA04 CA05 HA11 HA17 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA30 BA09 CA40 DA75 EA28 EA51

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列のタン
パク質。
【請求項２】配列番号１で表されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項３】配列番号１で表されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなる遺伝子。
【請求項４】配列番号２で表される塩基配列を含む遺伝
子。
【請求項５】配列番号２で表される塩基配列からなる遺
伝子。
【請求項６】遺伝子が、癌抑制遺伝子である、請求項２
〜５のいずれかの請求項記載の遺伝子。
【請求項７】請求項２〜６のいずれかの請求項記載の遺
伝子が組み込まれている遺伝子発現用ベクター。
【請求項８】請求項７記載の遺伝子発現用ベクターで形
質転換された形質転換体。
【請求項９】請求項１記載のタンパク質の全部又は一部
を免疫原とする、このタンパク質に対して免疫反応性が
認められる抗体。