JPH11500004A - 腫瘍遺伝子Ｉｎｔ６のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトおよびマウスの野生型Ｉｎｔ６遺伝子およびこの遺伝子に対応するｃＤＮＡの単離を開示する。本発明はさらに、診断方法、免疫治療、遺伝子治療における、およびワクチンとしての、Ｉｎｔ６遺伝子の核酸およびアミノ酸配列から誘導された試薬の使用を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、１９９５年２月９日出願の米国特許出願第０８／３８５，９９８号 の一部継続出願である。発明の名称 腫瘍遺伝子Ｉｎｔ６のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列発明の分野 本発明は、癌の診断及び治療の分野に関する。より特定的には、本発明は、Ｉ ｎｔ６遺伝子に関し、また、遺伝子療法、ワクチン、診断方法及び免疫療法にお けるＩｎｔ６遺伝子の核酸配列及び推定アミノ酸配列に由来の試薬の使用に関す る。発明の背景 マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）は、乳腫瘍のＭＭＴＶ取込み部位に隣接し た細胞性遺伝子の発現の調節異常を招く挿入性突然変異誘発物質として作用する ことが証明されたレトロウイルスである（Ｖａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ． ，１：３０９−３２０）。ＭＭＴＶ感染マウスでは腫 瘍発現前の過形成性胞状結節（ＨＡＮ）が高頻度で発達し（Ｄａｎｉｅｌ，Ｃ． ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，６１：５３−６０；Ｄ ｅＯｍｅ，Ｋ．Ｂ．（１９５９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，７ ８：７５１−７５７；Ｍｅｄｉｎａ，Ｄ．（１９７３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｎ ｃｅｒ Ｒｅｓ． ，７：３−５３；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．ら（１９８４）Ｃａｎｃｅ ｒ Ｒｅｓ． ，４４：３４２６−３４３７）、同系マウスの清浄化された乳脂肪 パッド中でこれらの結節を連続外殖（outgrowth）によって継代させると、これ らのマウスにおいて確率的に乳腫瘍が発達するという結果がしばしば得られる。 更に、乳腫瘍をもつ外殖（outgrowth）を有するマウスの肺に転移病巣が発見さ れることも珍しくはない。これらの理由から、腫瘍発達の種々の時期に関与する と考えられるＭＭＴＶに誘発された突然変異イベントを同定することは極めて重 要である。 ＭＭＴＶゲノムを分子標識として使用して、マウス乳腫瘍の共通のＭＭＴＶ取 込み部位（Ｉｎｔ遺伝子座と命名）を表す５つの遺伝子座（Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ −１、Ｆｇｆ−３／Ｉｎｔ−２、Ｉｎｔ−３、Ｗｎｔ−３及びＦｇｆ−４／Ｈｓ ｔ／ｋ−ＦＧＦ）が同定された（Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｃ．ら（１９８４）Ｃｅｌｌ ，３７：５２９−５３６；Ｇａｌｌａｈａｎ，Ｄ．ら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏ ｌ． ，６１：２１８−２２０；Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．ら（１９８２）Ｃｅｌｌ．，３ １：９９−１０９；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ，８６：５６７８−５６８２）。ＭＭＴＶ ＬＴＲが ＷＮＴ−１、Ｆｇｆ−３、Ｉｎｔ−３のいずれかの遺伝子に結合しているトラン スジーンを用いたトランスジェニックマウスの研究は、これらの遺伝子の発現の 活性化が乳房の腫瘍発生の一因であることを証明した（Ｊｈａｐｐａｎ，Ｃ．ら （１９９２） Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，６：３４５−３５５；Ｍｕ ｌｌｅｒ，Ｗ．Ｊ．ら（１９９０） Ｅｍｂｏ Ｊ．，９：９０７−９１３；Ｔ ｓｕｋａｍｏｔｏ，Ａ．Ｓ．ら（１９８８）Ｃｅｌｌ．，５５：６１９−６２５ ）。 本発明は、Ｉｎｔ６と命名された新規なＩｎｔ遺伝子の単離を記載しており、 また、診断方法、ワクチン、免疫療法及び遺伝子療法における該遺伝子及びその 遺伝子産物並びに該遺伝子及びその遺伝子産物に由来の試薬の使用を記載するも のである。発明の概要 本発明はＩｎｔ６遺伝子の単離に関する。本発明はまた、Ｉｎｔ６遺伝子のコ ーディング配列を含むネズミ及びヒトのｃＤＮＡに関する。本発明は更に、Ｉｎ ｔ６遺伝子及びＩｎｔ６ ｃＤＮＡに由来の核酸配列に関し、また、他の哺乳類 のＩｎｔ６遺伝子の相同体単離用プローブまたはＩｎｔ６遺伝子の突然変異検出 用プローブとしてこれらの核酸配列を使用することに関する。 組換えＩｎｔ６タンパク質及び該タンパク質に由来のペプチドフラグメントの 産生を指令し得る合成核酸配列並びに等価の天然核酸配列を提供することも本発 明の目的の１つである。このような天然核酸配列は、Ｉｎｔ６タンパク質の合成 を指令し得る遺伝子が同定または単離できるｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリ ーから単離され得る。本出願の目的となる核酸配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮ Ａまたは任意のその合成変異体である。 本発明は更に、Ｉｎｔ６タンパク質及び該タンパク質に由来のペプチドに関す る。 本発明はまた、Ｉｎｔ６タンパク質または該タンパク質に由来のペプチドに対 する抗体に関する。 本発明はまた、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の検出方法を提供する。このような 突然変異の検出は、被験者の異常増殖組織の存在または被験者の遺伝的癌素因の 存在を判断するために有用である。 Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出する第一の方法では、Ｉｎｔ６遺伝子の突然 変異を検出するために被験者のＤＮＡを分析することを含む。 Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出する第二の方法では、Ｉｎｔ６ｍＲＮＡ発現 の改変を検出するために被験者のＲＮＡを分析することを含む。 Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するまた別の方法では、Ｉｎｔ６タンパク質 発現の改変を検出するために被験者のタンパク質を分析することを含む。 本発明はまた、被験者を癌に対して免疫感作するワクチンとして使用するため 及び免疫治療方法で使用するための医薬組成物を提供する。このような医薬組成 物の１つは、Ｉｎｔ６タンパク質またはそのペプチドフラグメントの宿主生物合 成を指令し得る核酸配列を含む一方、第二の医薬組成物はＩｎｔ６タンパク質ま たは該タンパク質に由来のペプチドを含む。 上記の医薬組成物はまた、癌患者を治療するために免疫治療方法で使用され得 る。本発明は更に、免疫療法で使用するためのＩｎｔ６タンパク質または該タン パク質に由来のペプチドに対する抗体を含み、これらの抗体が毒素分子、放射性 同位体または薬剤に結合している第三の医薬組成物を提供する。 従って本発明は、１種以上の上記医薬組成物を治療有効量で癌患者に投与する ことを含む癌患者に対する免疫療法の適用に関する。 本発明は更に、 （ａ）特異的Ｔ細胞応答を誘発すべく有効な量のＩｎｔ６タンパク質をコードし ている発現ベクターまたはＩｎｔ６タンパク質自体によって患者を免疫し、 （ｂ）免疫した患者からＴ細胞を単離し、 （ｃ）免疫した患者または非免疫患者に治療有効量のＴ細胞を投与する； ことを含む癌患者の治療方法に関する。。 本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＩｎｔ６の対立遺伝 子のヌクレオチド配列を決定するための診断用キットを提供する。本発明のキッ トは、ＰＣＲプライマーとして有用な精製及び単離された核酸配列を含む。これ らのＰＣＲプライマーはまた、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するための被験 者のＤＮＡまたはＲＮＡ分析にも有用である。 本発明は更に、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異によってＩｎｔ６タンパク質の発現 が改変された細胞に野生型Ｉｎｔ６遺伝子を供給する方法を提供する。この方法 は、Ｉｎｔ６タンパク質の発現が改変された細胞に野生型Ｉｎｔ６遺伝子を導入 し野生型遺伝子を細胞中で発現させることを含む。図面の説明 図１Ａ及び１Ｂは、サザンブロット分析の結果を示す。この分析では、１０マ イクログラムの細胞性ＤＮＡをＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気 泳動によって分離し、ＭＭＴＶ ＬＴＲプローブとハイブリダイズさせた。図１ Ａにおいて、分析されたＤＮＡは、図１Ａの上部に示すように、ＣＺＺ−１ Ｈ ＯＧと命名された腫瘍発現前の過形成性外殖細胞系ＣＺＺ−１（レーン１）、及 び、乳腫瘍２２（レーン２）、１２６２（レーン３）、１２６３（レーン４）、 ２０（レーン５）、１９（レーン６）、２３（レーン７）、２１（レーン８）、 ２４（レーン９）、８（レーン１０）、９（レーン１１）、１２（レーン１２） 、１３（レーン１３）及び１４（レーン１４）に由来のＣＺＺ−１から単離した 。図１Ｂにおいて、分析されたＤＮＡは、図１Ｂの上部に示すように、腫瘍４９ ７３（レーン１）に由来のＣＺＺ−１、及び、腫瘍４９７３を保有するマウスの １１個の独立の肺転移（レーン２−１２）から単離した。 図２Ａ−２Ｃは、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、以 下の手順でハイブリダイズさせた１０マイクログラムの細胞性ＤＮＡのサザンブ ロット分析の結果を示す。図２Ａ及び２Ｂのブロットのレーン１及び２は、宿主 のフランキング配列に対応するプローブＤとハイブリダイズした。図２Ａ及び２ Ｂのレーン２のブロットを引き続いてＭＭＴＶ ｇａｇ配列（ＭＭＴＶ ＧＲ− ４０に由来の２．０ｋｂのＰＳｔ−ＸｈｏＩフラグメント；Ｇａｌｌａｈａｎ ａｎｄ Ｃａｌｌａｈａｎ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１，６６−７４：（１９８７ ））とハイブリダイズさせ、その結果を図２Ａ及び２Ｂのレーン３に示す。図２ Ｃのレーン１及び２はプローブＣとハイブリダイズさせた。レーン２を引き続い てＭＭＴＶ ｅｎｖ配列（ＭＭＴＶ（Ｃ３Ｈ）に由来の１．７ｋｂのＰＳｔＩフ ラグメント；Ｇａｌｌａｈａｎ ａｎｄ Ｃａｌｌａｈａｎ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ，６１：６６−７４；（１９８７））とハイブリダイズさせ、その結果を図２Ｃ のレーン３に示す。分析したＤＮＡは、腫瘍２２に由来のＣＺＺ−１ ＨＯＧ（ 図２Ａ、レーン２及び３）、独立の乳腫瘍１１３９（図２Ｂ、レーン２及び３） 、独立の乳腫瘍３１３４（図２Ｃ、レーン２及び３）、及び、正常肝臓（図２Ａ −２Ｃのレーン１）から単離した。図２Ａ−２Ｃの矢印の存在は、ＭＭＴＶに誘 発されて転位した制限フラグメントの部位を示す。Ｉｎｔ６遺伝子中のプローブ Ｃ及びＤの位置は図３に示されている。 図３は、ネズミのＩｎｔ６遺伝子座の概略図である。図中、Ｉｎｔ６遺伝子座 （１−４で指定）にわたる４つのオーバーラップするラムダクローンの位置が、 Ｉｎｔ６遺伝子座中のＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＸｂａＩ（Ｘ）、ＰｓｔＩ（Ｐ）、Ｂ ｇｌII（ＢＧＬ）、ＨｉｎｄIII（Ｈ）及びＢａｍＨＩ（Ｂ）部位の部分的制限 地図に対する相対位置で示されている。Ｉｎｔ６エキソンの位置及びプローブＡ −Ｄとして使用される制限フラグメントの位置は夫々、制限地図の下方に夫々実 線枠及び斜線枠で示されている。制限地図の目盛りは、図の下部では１目盛り１ ．０ｋｂの増加を示し、腫瘍１１３９及び３１４４のＩｎｔ６遺伝子の内部また はＣＺＺ−１ ＨＯＧのＩｎｔ６遺伝子の内部に取込まれたＭＭＴＶプロウイル スゲノムの位置及び転写方向は制限地図の上方の矢印の向きによって示されてい る。 図４は、Ｉｎｔ６陰性腫瘍（腫瘍１７８）及びＩｎｔ６陽性腫瘍（２２及び１ １３９）から単離された全ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。ＲＮＡ をホルムアルデヒドの存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含有する１％アガ ロースゲルで分離し、プローブＡとハイブリダイズさせた。 図５は、ネズミの１．４ｋｂのＩｎｔ６ ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を 示す。イントロンの切れ目は次のエキソンの起点の上方の小矢印（▲）で示し、 遺伝子産物の推定アミノ酸配列はヌクレオチド配列の下方に示す。サイクリック ＡＭＰ／サイクリックＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼ（○）、タンパク質キ ナーゼＣ（△）、チロシンキナーゼ（−）、カゼインキナーゼII（▽）のリン酸 化可能部位及びグリコシレーション部位（□）を推定アミノ酸配列中に示す。 アミノ酸残基の略号：Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；Ｙ，Ｔｙｒ． 図６は、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓ，ショウジョウバエ、ツメガエル、ニワトリ、マ ウス及びヒトから単離した細胞性ＤＮＡ（各々１０μｇ）をストリンジェンシー の高い条件下でＩｎｔ６ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた“Ｚｏｏ”ブロット の結果を示す。 図７は、正常成人組織（上部パネル）及び発達中の胚（下部パネル）から単離 した全ＲＮＡ（各々１０μｇ）のノーザンブロット分析の結果を示す。ＲＮＡを ホルムアルデヒドの存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロ ースゲルに流し、次いでナイロン膜に移し、β−アクチンプローブ（２．３ｋｂ のｍＲＮＡ）及びネズミのＩｎｔ６ ｃＤＮＡプローブ（１．４ｋｂのｍＲＮＡ ）に順次ハイブリダイズさせた。 図８は、ＭＭＴＶ ＬＴＲの反転配列中の潜在的転写終了シグナルの位置及び ヌクレオチド配列（下線部分）を示す概略図である。図示の配列はＬＴＲの３′ 端から数えて４６４から４９７までの塩基に対応する。斜線枠はＩｎｔ６エキソ ンに対応し、白抜き枠はＩｎｔ６に取込まれたＭＭＴＶプロウイルスゲノムのＬ ＴＲに対応する。ＭＭＴＶ ＬＴＲのＵ５、Ｒ及びＵ３領域、並びに、ＭＭＴＶ ゲノム及びＩｎｔ６遺伝子の転写方向が示されている。 図９Ａ及び９Ｂは、腫瘍１１３９（図９Ａ）及び２２（図９Ｂ）で検出された キメラＩｎｔ６−ＭＭＴＶ ＬＴＲ ＲＮＡ種のＭＭＴＶ配列とＩｎｔ６配列と の結合部のヌクレオチド配列を示す。図９Ａで、図示のヌクレオチド配列はエキ ソンの５′端を起点とし、小文字で示すヌクレオチド配列はイントロン５の配列 に対応する。ＲＮＡ種１のアミノ酸配列に等しいＲＮＡ種２のアミノ酸配列を付 点で示し、スプライシングによって除去されたＲＮＡ種２のヌクレオチド配列を ダッシュで示す。下線を引いたヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は取込まれた ＭＭＴＶゲノムに由来の配列である。 図９Ｂ中、腫瘍２２で検出されたキメラＲＮＡ種に関して図示したヌクレオチ ド配列は、エキソン９の５′端を起点とし、イントロン９の一部分を通ってＭＭ ＴＶゲノムの潜在的ポリＡ付加シグナルまで伸びている。イントロンのヌクレオ チド配列を小文字で示し、ＭＭＴＶ配列を下線で示し、スプライシングによって 除去されたイントロンのヌクレオチド配列をダッシュで示す。付点はＲＮＡ種２ 及び３によってコードされたアミノ酸残基に対応し、これらの残基はＲＮＡ種１ によってコードされたアミノ酸残基に等しい。図９Ａ及び９Ｂに示すアミノ酸の 略号は図５の凡例で示した略号と同じである。 図１０は、ヒトＩｎｔ６遺伝子のゲノム地図を示す。マウスゲノムの場合と同 様に、ヒトＩｎｔ６遺伝子は１３のエキソン（黒塗り枠）から成り、各エキソン のヌクレオチドの両端も図示されている。７番目のイントロンのＣＡ反復配列の 位置も図示されている。 図１１は、ヒトＩｎｔ６遺伝子のイントロン７のＣＡ反復配列にフランキング する核酸配列（下線なし）に相補的なプライマーのヌクレオチド配列（下線付き ）を示す。ＣＡ反復配列からプライマーまでの間隔は夫々４０及び１３８塩基対 であり、図示のＣＡ反復配列の数（１８）は野生型Ｉｎｔ６遺伝子中に見出され る数である。上部の核酸配列は５′から３′の方向で示されており、下部の核酸 配列は読取りが左から右に向かって行われる３′から５′の方向で示されている 。 図１２は、ヒトＤＮＡ（レーン４）、ヒト染色体６（レーン１）またはヒト染 色体８（レーン２）だけを含むチャイニーズハムスター−ヒト体細胞ハイブリッ トＤＮＡ、ヒト染色体３，７，８，１５及び1７を含むマウスーヒト体細胞ハイ ブリットＤＮＡ（レーン３）を、ＨｉｎｄIIIで消化し、ヒトＩｎｔ６ ｃＤＮ Ａとハイブリダイズさせたサザンブロットの結果を示す。 図１３は、Ｉｎｔ６遺伝子のイントロン７のＣＡ反復配列にフランキングする 標識プライマーを用いたヒト原発性乳腫瘍（Ｔ）及び適合性正常組織（Ｌ）Ｌは リンパ球を意味する）に由来のＤＮＡのＰＣＲ増幅の結果を示す。各ブロットの 上方の数字は、腫瘍サンプル及び適合性正常組織サンプルを提供した被験者を示 す。各ブロットに近接の矢印は、適合性正常ＤＮＡに比べて対立遺伝子のシグナ ルが完全に消失しているかまたは有意に低下していることを示す。 図１４は、１３のヒトＩｎｔ６エキソンのうちの１２のエキソンの両端に隣接 するヌクレオチド配列を示す。各エキソンの両端に隣接する核酸配列（下線なし ）に相補的なプライマーの核酸配列（下線付き）を各エキソンの左右に示す。各 エキソンの左右の上方に示す核酸配列は５′から３′の方向であり、各エキソン の左右の下方に示す配列は３′から５′の方向である。各エキソンの両端に隣接 する配列がイントロン−エキソン結合点から始まるとき、この配列の長さは結合 点を起点とする各エキソンの左右の塩基対の数で与えられる。 図１５は、原発性乳腫瘍（Ｔ）及び適合性正常組織（Ｎ）から単離された全Ｒ ＮＡ（各々２０μｇ）のノーザンブロットの結果を示す。ＲＮＡサンプルをホル ムアルデヒドの存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロース ゲルに流し、次いでナイロン膜に移し、β−アクチンプローブ及びヒトＩｎｔ６ ｃＤＮＡプローブと順次ハイブリダイズさせた。 図１６は、ヒト非小細胞肺癌（５４Ｔ及び５５Ｔ）及び適合性正常組織（５５ Ｎ）から単離した全ＲＮＡ（各々２０μｇ）のノーザンブロットの結果を示す。 ５４Ｔに対する適合性正常組織についてもＩｎｔ６ ｍＲＮＡ発現を観察したが 、５４Ｎのノーザンブロットは図示していない。図１５の場合と同様にしてノー ザンブロット分析を行った。発明の説明 本発明は、腫瘍発生中の宿主細胞ゲノムへのＭＭＴＶ取込みに関連する突然変 異性イベントが、Ｉｎｔ６と命名されたこれまでは知られなかった遺伝子中で生 じることを開示している。この遺伝子はマウスの染色体１５に局在する。より特 定的には本発明は、Ｉｎｔ６遺伝子及びその対応するｃＤＮＡに関する。Ｉｎｔ ６を保有するマウス染色体１５の領域は、オーバーラップする４つのラムダクロ ーン（図３に符号１−４で示す）中に提示され、完全Ｉｎｔ６遺伝子を含んでい る。Ｉｎｔ６遺伝子は野生型Ｉｎｔ６遺伝子を表す。 本発明はまた、ネズミのＩｎｔ６遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを目的とする 。このｃＤＮＡ配列を配列１として以下に示す。 ヌクレオチドに使用した略号は当業界で標準的に使用されている略号に準拠し た。 ネズミのＩｎｔ６ ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を配列番号２として以下に示 す。この配列は、配列番号１のヌクレオチド１７３を起点とし、１１８８ヌクレ オチドの長さを有している。 本発明はまた、ヒトのＩｎｔ６ ｃＤＮＡと相同のヌクレオチド配列を開示し ている。ヒトのＩｎｔ６ ｃＤＮＡ配列はマウスの配列に８９％の相同性を有し ている。オーバーラップする２つの組換えクローン（ＨＩＮＴ６ＡとＨＩＮＴ６ Ｂ）は夫々、ヒトのＩｎｔ６ ｃＤＮＡ配列の５′側の半鎖及び３′側の半鎖を 表している。これらの２つのクローンはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２に１９９５年１月２４日付 けで寄託され、ＡＴＣＣ受託番号９７０２９及び９７０３０で受託された。ヒト のＩｎｔ６ ｃＤＮＡ配列を配列番号３として以下に示す。 ヒトのＩｎｔ６ ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を配列番号４として以下に示す 。この配列は、配列番号３のヌクレオチド１６８を起点とし、１１８８ヌクレオ チドの長さを有している。 ヒト及びマウスのＩｎｔ６タンパク質のアミノ酸配列は等しい。 配列番号１及び３で示すｃＤＮＡ配列中には、配列番号２及び４で夫々示すタ ンパク質の類似体の産生を指令し得るＤＮＡ配列を与える変異が存在してもよい 。上記に示したＤＮＡ配列は本発明の好適例の１つを表すものであることに留意 されたい。遺伝コードが縮重性なので、本発明のＩｎｔ６タンパク質またはそれ らの類似体の産生を指令し得るＤＮＡ配列を与える多数の代替可能なヌクレオチ ドが存在することは理解されよう。このことは、上記に示した配列に機能的に等 価のＤＮＡ配列、または、上記に示したアミノ酸配列通りに産生されるＩｎｔ６ タンパク質の類似体の産生を指令する配列に機能的に等価のＤＮＡ配列が本発明 の範囲内に包含されることを意味する。 類似体という用語は、本文中に特定的に示した配列に実質的に等しいアミノ酸 残基配列を有しており１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が機能的に等しい残基 によって保存的に置換されている任意のタンパク質またはポリペプチドを意味す る。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオ ニンのような１つの非極性（即ち、疎水性）残基による他の残基の置換、アルギ ニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、もしくは、グリシンと セリンとの間の置換のような１つの極性（即ち、親水性）残基による他の残基の 置換、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのような１つの塩基性残基による 他の残基の置換、または、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のような１つの 酸性残基による他の残基の置換がある。 保存的置換という表現はまた、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化さ れた残基を使用することを意味する。 化学的誘導体という用語は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化され た１つまたはそれ以上の残基を有するＩｎｔ６タンパク質またはポリペプチドを 意味する。このような誘導体化された分子の例としては、遊離アミノ基が誘導体 化されて、例えばアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンズオキ シ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形 成している分子があるが、これらに限定されない。遊離カルボキシル基は誘導体 化されて、塩、メチルエステル及びエチルエステルまたは他の種類のエステルま たはヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、Ｏ−アシ ルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘 導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成し得る。また、２０個の標 準アミノ酸の天然産生アミノ酸誘導体を１つまたはそれ以上の数で含むタンパク 質またはペプチドも化学的誘導体に包含される。例えば、４−ヒドロキシプロリ ンはプロリンに置換し得る。５−ヒドロキシリシンはヒスチジンに置換し得る。 ホモセリンはセリンに置換し得る。オルニチンはリシンに置換し得る。 本発明によって提供される核酸配列は、プローブとして多くの目的に使用し得 る。例えば、これらの核酸配列は、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼ ーションのプローブとして使用でき、また、点突然変異を検出するためにＲＮア ーゼ保護方法でプローブとして使用できる。ＰＣＲ増幅産物を検出するためにも プローブを使用できる。また、他の技術を用いてＩｎｔ６遺伝子またはｍＲＮＡ とのミスマッチを検出するためにプローブを使用してもよい。ミスマッチは、酵 素（例えばＳ１ヌクレアーゼ）、化学薬品（例えば、ヒドロキシルアミンまたは 四酸化オスミウムとピペリジン）を用いて検出してもよく、または、完全に適合 したハイブリッドと比較したときの不適正ハイブリッドの電気泳動移動度の変化 を利用して検出してもよい。これらの技術は当業界で公知である。プローブはＩ ｎｔ６遺伝子のコーディング配列に相補的であるが、イントロンに対するプロー ブも設計できる。野生型Ｉｎｔ６遺伝子の改変を検出するキットを構成するため に完全セットの核酸プローブを使用し得る。キットは完全Ｉｎｔ６遺伝子にハイ ブリダイゼーションできるようになっている。プローブは互いにオーバーラップ してもよくまたは隣合って連続していてもよい。 ｍＲＮＡとのミスマッチを検出するためにリボプローブを使用する場合、リボ プローブはヒト野生型Ｉｎｔ６遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。従ってリボプ ローブは、センス鎖の反対の極性を有するのでＩｎｔ６タンパク質をコードしな いアンチセンスプローブである。一般にはリボプローブを、当業界で公知の任意 の手段を用いて放射性物質、比色物質または蛍光物質によって標識し得る。ＤＮ Ａとのミスマッチを検出するためにリボプローブを使用する場合、リボプローブ がセンスまたはアンチセンスのいずれの極性を有していてもよい。ＤＮＡプロー ブも同様にしてミスマッチを検出するために使用し得る。 核酸プローブはまた、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異対立遺伝子に相補的であって もよい。これらの対立遺伝子特異的プローブは、ミスマッチではなくハイブリダ イゼーションに基づいて他の被験者中の同様の突然変異を検出するために有用で ある。Ｉｎｔ６プローブはまた上述のように、欠失及び挿入のような染色体の顕 著な変化を検出するためにゲノムＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションで使 用できる。プローブはまた、腫瘍組織及び正常組織からＩｎｔ６遺伝子のｃＤＮ Ａクローンを選択するために使用できる。更に、発現の改変が野生型Ｉｎｔ６遺 伝子の突然変異の結果であるか否かを判断すべく、プローブを組織中のＩｎｔ６ ｍＲＮＡを検出するために使用できる。Ｉｎｔ６遺伝子及びＩｎｔ６ ｃＤＮ Ａの配列が配列番号１及び３に示す配列である限り、特定のプローブの設計は平 均的な当業者の技術の範囲内である。 本発明はまた被験者のＩｎｔ６遺伝子の突然変異を検出する方法に関する。 本発明において、被験者は哺乳動物を意味し、突然変異は、野生型Ｉｎｔ６遺 伝子の反転、転位、挿入、欠失または点突然変異を意味する。 腫瘍組織中に見出される多くの突然変異はＩｎｔ６タンパク質の発現の改変に 導く突然変異であると考えられている。しかしながら、非機能性遺伝子産物に導 く突然変異もまた癌の原因となり得る。更に、点突然変異は、調節領域（例えば プロモーター）で発生するか、または、適正なＲＮＡプロセッシングを混乱させ 、その結果としてＩｎｔ６ ｍＲＮＡの発現の低下の原因またはＩｎｔ６タンパ ク質の発現の消失の原因となると理解されている。 マウスの腫瘍発現前の乳房病巣で観察されるＩｎｔ６遺伝子へのＭＭＴＶの取 込みは、Ｉｎｔ６の突然変異が癌の初期イベントに関与することを示唆する。従 ってＩｎｔ６遺伝子の突然変異の検出方法は診断及び予後に関する情報を提供し 得る。例えば臨床医は、腫瘍中のＩｎｔ６遺伝子の突然変異の検出に基づいて治 療計画を選択し得る。本発明の方法はＩｎｔ６の突然変異が発生するいかなる腫 瘍にも適用できる。肺及び乳房の腫瘍ではＩｎｔ６遺伝子の発現の消失が観察さ れた。従ってこれらの腫瘍では、Ｉｎｔ６が腫瘍発生に何らかの役割を果たして いる。更に、Ｉｎｔ６は、脳、心臓、腎臓、肝臓、卵巣、脾臓及び精巣などの試 験 したすべての組織中で発現されるので、Ｉｎｔ６遺伝子の発現に不利な影響を及 ぼす突然変異はこれらの組織中の異常増殖の一因ともなり得る。最後に、肺腫瘍 及び乳腫瘍は上皮組織に由来するので、本発明方法は、非小細胞肺癌のような上 皮細胞由来の癌の検出にも有用であろう。 更に、本発明で開示された検出方法が胎児の出生前スクリーニングまたは家族 の病歴に基づいて癌の危険が予測される被験者の前兆スクリーニングにも使用で きることが当業者に理解されよう。 本発明の１つの実施態様においては、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の検出方法は 、野生型Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するために被験者のＤＮＡを分析する ことを含む。ＤＮＡ分析のためには、生物標本を被験者から採取する。本方法で 使用するために採取される生物標本の例としては、組織生検及び血液があるが、 これらに限定されない。組織調製物中の腫瘍細胞を富化する手段は当業界で公知 である。例えば、パラフィン切片もしくはクリオスタット切片から組織を単離し てもよい。また、フローサイトメトリーによって正常細胞から癌細胞を分離して もよい。正常細胞から腫瘍を分離するこれらの技術及びその他の技術は当業界で 周知である。または、平均的な当業者に公知の方法を用いて腫瘍生検から一次細 胞培養物を樹立してもよい。 Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するために、生物標本から単離したＤＮＡを 種々の方法で分析し得る。例えば、適当な制限酵素による消化後のサザンブロッ ティング（制限酵素断片長多型、ＲＥＬＰ）（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ａｍｅｒ ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８０）６９：２０１−２０５）、変性勾配電 気泳動法（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：４９５− ４９８）、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（Ｃｏｎｎｅｒ，Ｒ．ら ，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８４）３：１３３２１−１３２６）、プローブＲＮＡと 標的ＤＮＡとの間の二重鎖のＲＮアーゼ消化（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅ．ら， Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８５）８２：７５７５− ７５７９）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｓｃ ｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７−４９１；米国特許第４，６８３，１９ ５号及び第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（欧州特許出 願第 ０，３２０，３０８号及び第０，４３９，１８２号）、並びに、ＰＣＲ−一本鎖 コンフォーメーション分析（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら，Ｇｅｎ ｏｍｉｃｓ（１９８９）５：８７４−８７９；Ｄｅａｎ，Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ（１ ９９０）６１：８６３−８７１）などの方法がある。 １つの好ましい実施態様では、腫瘍または血液のＤＮＡ中のＩｎｔ６遺伝子の 顕著な転位を観察するためにサザンブロット分析を使用できる。サザン分析によ って分析すべきＤＮＡを、１つまたはそれ以上の制限酵素によって消化する。制 限消化後、得られたＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動によって分離し、標識し た核酸プローブとのハイブリダイゼーションによってフラグメントを検出する（ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７５）９８：５０ ３−５１７）。 サザン分析においてプローブとして使用される核酸配列は、一本鎖または二重 鎖の形態で標識できる。核酸配列の標識は当業者に公知の技術によって行うこと ができる。このような標識技術では、ラジオラベル及び酵素を使用できる（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。更に、化学的 部分をピリミジン環及びプリン環に結合させる方法（Ｄａｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｋ．ら （１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７０：２２３８−２２ ４２；Ｈｅｃｋ，Ｒ．Ｆ．（１９６８）Ｓ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９０： ５５１８−５５２３）、化学発光によって検出する方法（Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋ ．ら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：８７３６−８７４０ ）、ビオチニル化した核酸プローブを使用する方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｋ． ら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１２６−１３１；Ｅｒｉｃ ｋｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．ら（１９８２）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈ ｏｄｓ ，５１：２４１−２４９；Ｍａｔｔｈａｅｉ，Ｆ．Ｓ．ら（１９８６）Ａ ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，１５７：１２３−１２８）及び市販製品を用いる蛍 光検出方法のような非放射性のシグナル増幅技術も知られている。プローブの大 きさは約２００ヌクレオチドから約数キロ塩基の範囲に及ぶ。好ましいプローブ の 大きさは約５００〜約２０００ヌクレオチドである。プローブはＩｎｔ６遺伝子 のイントロンに由来してもよくまたはエキソンに由来してもよい。サザン分析で プローブとして使用される核酸配列の各々はネズミまたはヒトのＩｎｔ６遺伝子 の対応する部分、即ちこれらの遺伝子が夫々配列番号１または３で示すｃＤＮＡ 配列を有している部分に実質的に相同である。好ましい実施態様において、プロ ーブは、配列番号３に示すＩｎｔ６ ｃＤＮＡ配列を有するヒトＩｎｔ６遺伝子 に由来する。「実質的に相同な」という表現は、プローブとして使用される核酸 配列とヒトまたはネズミのＩｎｔ６遺伝子の対応する配列との間の相同性のレベ ルを意味する。相同性のレベルは、好ましくは７０％以上、極めて好ましくは８ ０％以上であり、特に好ましい核酸配列はマウスまたはヒトのＩｎｔ６遺伝子の 配列と９０％以上の相同性を有している。 分離したＤＮＡフラグメントと標識した核酸プローブとをハイブリダイズさせ た後、オートラジオグラフィーによって制限消化パターンを可視化し、Ｉｎｔ６ 遺伝子の突然変異に関連した制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の有無を検査する。 別の好ましい実施態様においては、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するため に、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ−ＳＳＣＰによって分析してもよい。この方法では、 ＰＣＲで使用するために選択されたプライマー対の各々を、Ｉｎｔ６遺伝子中の 配列とハイブリダイズして増幅され、変性した増幅産物中の突然変異が非変性型 ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出され得るように設計する。好まし い実施態様では、プライマー対がヒトＩｎｔ６遺伝子に由来する。より好ましい 実施態様では、プライマー対がヒトＩｎｔ６遺伝子の所与のエキソンの５′端及 び３′端に隣接するイントロン性配列に由来する。ヒトＩｎｔ６遺伝子のエキソ ンの特異的増幅を可能にするプライマー対の例を以下に示すが、これらに限定さ れない： 配列番号５及び６はエキソン１の両端に隣接し、配列番号７及び８はエキソン ２の両端に隣接し、配列番号９及び１０はエキソン３の両端に隣接し、配列番号 １１及び１２はエキソン４の両端に隣接し、配列番号１３及び１４はエキソン５ の両端に隣接し、配列番号１５及び１６はエキソン６の両端に隣接し、配列番号 １７及び１８はエキソン８の両端に隣接し、配列番号１９及び２０はエキソン９ の両端に隣接し、配列番号２１及び２２はエキソン１０の両端に隣接し、配列番 号２３及び２４はエキソン１１の両端に隣接し、配列番号２５及び２６はエキソ ン１２の両端に隣接し、配列番号２７及び２８はエキソン１３の両端に隣接する 。Ｉｎｔ６遺伝子配列に対して十分に特異的なハイブリダイゼーションを得るた めの増幅反応の最適化は当業者の知識の範囲内であり、好ましくはアニーリング 温度の調整によって行う。 本発明のプライマーは公知のオリゴヌクレオチド合成方法のいずれかを用いて 合成できる（例えば、Ａｇａｒｗａｌら（１９７２）Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉ ｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１１：４５１のホスホジエステル法、Ｈｓｉｕｎｇら（ １９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：１３７１のホスホトリエ ステル法、または、Ｂｅｕａｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６２の全自動ジエチルホスホルアミダイ ド法）。または、これらのプライマーは天然産生ＤＮＡまたはクローン化したＤ ＮＡの単離フラグメントであってもよい。更に、オリゴヌクレオチドを、種々 の製造業者から販売されている全自動装置によって合成できること、または、業 者に注文生産することができることが当業者には明らかであろう。１つの実施態 様においては、プライマー延長産物を検出及び／または同定するために適当な検 出可能ラベル（例えば、ビオチン、アビジンまたは放射性標識ｄＮＴＰ）を含む ようにプライマーを誘導体化してもよく、または増幅産物の単離を容易にする物 質（例えばビオチンまたはアビジン）によってプライマーを誘導体化してもよい 。 別の実施態様においては、Ｉｎｔ６疾病遺伝子の突然変異形態にハイブリダイ ズするようにプライマー対を選択し得る。選択されたプライマー対は、突然変異 した遺伝子配列に十分に特異的にハイブリダイズし、従って、野生型Ｉｎｔ６遺 伝子配列に対する非特異的ハイブリダイゼーションが、突然変異遺伝子配列の増 幅産物の同定を妨害することはない。Ｉｎｔ６遺伝子配列中の突然変異にハイブ リダイズするプライマー対は、生物サンプルのＤＮＡ中に存在する特異的突然変 異遺伝子配列を増幅するために使用できる。 ＰＣＲの増幅産物は直接または間接に検出できる。増幅産物の直接検出はプラ イマー対の標識を介して行う。本発明のプライマーを標識するための好適なラベ ルは当業者に公知であり、例えば、放射性ラベル、ビオチン、アビジン、酵素及 び蛍光分子がある。増幅反応を実施する前に所望のラベルをプライマーに組込む とよい。好ましい標識手順では、放射性標識したＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼを使用する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），“Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏ ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ） 。または、増幅反応中のプライマー延長産物に１つまたはそれ以上の標識ｄＮＴ Ｐの形態で所望のラベルを組込んでもよい。本発明においては、Ｉｎｔ６遺伝子 の突然変異を検出するための標識された増幅ＰＣＲ産物の分析を、非変性ポリア クリルアミドゲル電気泳動、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＣＲ−Ｓ ＳＣＰ）によってＰＣＲ産物を分離するかまたはＰＣＲ産物を直接配列決定する ことによって行う。 更に、別の実施態様においては、Ｉｎｔ６疾病遺伝子中の突然変異を検出する ための非標識増幅産物の分析を、サザンブロットまたはドットブロット中の放射 性標識またはビオチン標識した核酸プローブとのハイブリダイゼーションによっ て行う。この実施態様に有用な核酸プローブは、サザン分析に関して前述した核 酸プローブである。更に別の実施態様においては、配列番号１及び３に示したｃ ＤＮＡ配列を用いて腫瘍組織中に存在する対立遺伝子を分子クローニングし、当 業界で周知の技術を用いてこの対立遺伝子を配列決定することによって点突然変 異を検出し得る。 第２の実施態様においては、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の検出方法は、Ｉｎｔ ６特異的ｍＲＮＡ発現の改変を検出するために被験者のＲＮＡを分析することを 含む。 この方法でＲＮＡを分析するためには、被験者から得られた血液サンプルまた は腫瘍生検サンプルからＲＮＡを単離できる。このような腫瘍の例は乳房及び肺 の腫瘍であるが、これらに限定されない。 分析すべきＲＮＡを血液サンプルまたは生検サンプルから全細胞ＲＮＡまたは ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡとして単離できる。全細胞ＲＮＡは当業者に公知の方法によ って単離できる。このような方法には、差別的沈降によるＲＮＡの抽出（Ｂｉｒ ｎｂｉｏｍ，Ｈ．Ｃ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１ ６：１４８７−１４９７）、有機溶媒によるＲＮＡの抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓ ｋｉ，Ｐ．ら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５ ９）、及び、強い変性剤によるＲＮＡの抽出（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら（ １９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９）がある。ポ リ（Ａ）⁺ＲＮＡはオリゴ−ｄ（Ｔ）カラムにおけるアフィニティクロマトグラ フィーによって全細胞ＲＮＡから選択できる（Ａｖｉｖ，Ｈ．ら（１９７２）Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６９：１４０８−１４１２）。ＲＮＡ の好ましい単離方法は、酸−フェノールによる全細胞ＲＮＡの抽出である（Ｃｈ ｏｍｃｚｙｎsｋｉら，１９８７）。 Ｉｎｔ６特異的ｍＲＮＡ発現のパターンまたはレベルの改変を検出するために ＲＮＡを分析する方法としては、ノーザンブロッティング（Ａｌｗｉｎｅ， Ｊ ．Ｃ．ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５３５ ０ −５３５４）、ドット及びスロットハイブリダイゼーション（Ｋａｆａｔｏｓ， Ｆ．Ｃ．ら（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７：１５４１ −１５２２）、フィルターハイブリダイゼーション（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｍ． Ｃ．ら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；９：１７４−１７９）、ＲＮ アーゼ保護（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）、逆転写ポ リメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２） ，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ． Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及び、Ｒ Ｔ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰがある。好適な方法はノーザンブロッティングである。 Ｉｎｔ６特異的ｍＲＮＡ発現を検出するプローブとして使用される核酸配列は 配列番号１または３に実質的に相同である。「実質的に相同」という表現は、核 酸配列と配列番号１または３のｃＤＮＡ配列との間の相同性のレベルを意味する 。相同性のレベルは、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であり 、特に好ましい核酸配列は配列番号１または３に示すｃＤＮＡ配列と９０％以上 の相同性を有している。 第二の好ましい実施態様においては、Ｉｎｔ６遺伝子中の突然変異を検出する ためにＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰによって分析する。逆転写酵素を用いて 腫瘍の全ＲＮＡまたはポリＡ⁺富化ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを調製する。この 方法においては、得られる一本鎖ｃＤＮＡのＰＣＲに使用すべく選択されたプラ イマー対の各々は、増幅され、次いで変性した増幅産物中の突然変異が非変性型 ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出されるべく適正な間隔（少なくと も約１００〜３００ヌクレオチド）を隔てて遺伝子中に存在するＩｎｔ６ ｃＤ ＮＡ中の配列とハイブリダイズするように設計される。オーバーラップするＩｎ ｔ６遺伝子配列に特異的にハイブリダイズし得るプライマー対は、Ｉｎｔ６遺伝 子配列に由来し得る。プライマー対は、上記に示した配列番号１及び３中のｃＤ ＮＡ配列に由来し得る。好ましい実施態様において、プライマーは配列番号３に 示すヒトＩｎｔ６ ｃＤＮＡ配列に由来する。対を成すプライマーの各々は、二 重鎖標的配列の一方の鎖の３′端の配列に相補的な約１５〜２０塩基の長さの一 本鎖オリゴヌクレオチドである。各対が２つのこのようなプライマーを含み、一 方のプライマーが相補的３′端であり、他方のプライマーが標的配列の他の３′ 端に相補的である。標的配列は一般的には約１００〜約３００塩基対の長さであ る。Ｉｎｔ６ ｃＤＮＡに対して十分に特異的なハイブリダイゼーションを得る ための増幅反応の最適化は当業界でよく知られており、好ましくはアニーリング 温度の調整によって行う。または、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出すべく変性 ＲＴ−ＰＣＴ産物を分析するために、ＲＴ−ＰＣＴ産物を直接配列決定してもよ い。 更に別の好ましい分析方法はＲＮアーゼ保護方法であり、この方法は、Ｗｉｎ ｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：ｐ．７５７ ５（１９８５）及びＭｅｙｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：ｐ．１２４２（ １９８５）に詳細に記載されている。本発明の実施にあたっては、方法がヒト野 生型遺伝子のコーディング配列に相補的な標識リボプローブの使用を含む。リボ プローブと腫瘍組織から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡとを一緒にアニーリン グ（ハイブリダイズ）し、次いで二重鎖ＲＮＡ構造中のミスマッチを検出できる 酵素ＲＮアーゼＡによって消化する。ＲＮアーゼＡによりミスマッチが検出され た場合、それはミスマッチの部位を開裂させる。リボプローブはＲＮＡまたは遺 伝子の全長を含む必要はなく、ＲＮＡまたは遺伝子のいずれか一方の一部分を含 んでいればよい。リボプローブがＩｎｔ６ ＲＮＡまたはＩｎｔ６遺伝子の一部 分だけを含む場合に、全ｍＲＮＡ配列をミスマッチのためにスクリーニングする ためには、これらのプローブを複数で使用するのが望ましい。 本発明はまた、配列番号１及び３に示すｃＤＮＡに由来の組換えタンパク質を 包含する。組換えＩｎｔ６タンパク質は当業者に公知の組換えＤＮＡ方法によっ て産生できる。Ｉｎｔ６タンパク質のアミノ酸配列がマウス（配列番号２）及び ヒト（配列番号４）で等しいので、配列番号４に示すアミノ酸配列の全部または 一部を含むタンパク質をコードし得る適当な核酸配列は、配列番号３または配列 番号１に示された配列である。好ましい実施態様では、このような適当な核酸配 列を、宿主生物に導入され宿主生物中で複製され得るベクターにクローニングで きる。 本発明で使用するように設計されたベクターは、上記の核酸配列が任意の好適 なまたは必要な作動要素と共に挿入され次いで宿主生物に導入され宿主生物中で 複製され得るような任意のベクターである。好ましいベクターは、十分に解明さ れた制限部位を有しており且つ核酸配列の転写に好適なまたは必要な作動要素を 含んでいるベクターである。 本文中で使用された「作動要素」という用語は、少なくとも１つのプロモータ ーと、少なくとも１つのオペレーターと、少なくとも１つのリーダー配列と、少 なくとも１つの終止コドンと、ベクター核酸の適正な転写及びその後の翻訳に必 要なまたは好適な他の任意のＤＮＡ配列とを意味する。このようなベクターは特 に、宿主生物によって認識される少なくとも１つの複製起点を、少なくとも１つ の選択可能マーカーと核酸配列の転写を開始させ得る少なくとも１つのプロモー ター配列と共に含むように設計されている。 本発明のクローニングベクターの構築においては、さらに、核酸配列及びそれ に付帯する作動要素との多数コピーを各ベクターに挿入し得ることに注目するべ きである。このような実施態様においては、宿主生物が産生するベクターあたり の所望Ｉｎｔ６タンパク質の量が増加している。ベクターに挿入し得るＤＮＡ配 列の多数コピーの数は、適当な宿主微生物に導入され複製及び転写されるベクタ ーの能力のみによって限定され、この能力は得られるベクターの大きさに依存す る。 別の実施態様では、Ｉｎｔ６タンパク質のコーディング配列を含む制限消化フ ラグメントを、原核細胞または真核細胞中で機能する適当な発現ベクターに挿入 し得る。「適当な」という用語は、ベクターがＩｎｔ６タンパク質をコードする 完全核酸配列を保有し発現し得ることを意味する。細菌のような原核細胞中で機 能する発現ベクターの例は、Ｔ７プロモーターに基づくベクター及びｔｒｐＥ及 びｌａｃＺ融合物を産生するベクターであるが、これらに限定されない。好適な 発現ベクターは、真核細胞中で機能するベクターである。このようなベクターの 例は、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキ ュロウイルスまたは哺乳類のＣ型レトロウイルスのベクターであるが、これらに 限 定されない。 次に、選択された組換え発現ベクターを、組換えタンパク質を発現させる目的 の適当な真核細胞系にトランスフェクトし得る。このような真核細胞系の例とし ては、ヒトＭＣＦ１０ＡまたはマウスＨＣ１１乳房上皮細胞のような細胞系があ るが、これらに限定されない。バキュロウイルスベクターと共に使用するための 好ましい真核細胞系の一例は、ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｙｅｒｄａ由来 のＳＦ２１卵巣細胞である。 発現された組換えタンパク質を、クーマシーブルー染色、及び、抗Ｉｎｔ６抗 体含有血清を用いるウエスタンブロッティングのような当業界で公知の方法によ って検出し得る。 別の実施態様においては、発現された組換えタンパク質を粗溶解物として得る ことができ、または当業界で公知の標準タンパク質精製手順によって精製するこ ともできる。このような精製手順としては、分画（differential）沈殿、分子ふ るいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシン グ、ゲル電気泳動、アフィニティー及びイムノアフィニティークロマトグラフィ ー、などがある。イムノアフィニティークロマトグラフィーの場合、Ｉｎｔ６タ ンパク質に特異的な抗体を結合させた樹脂を含むカラムに通すことによって組換 えタンパク質を精製し得る。 更に別の実施態様においては、本発明は、配列番号２及び４に示すＩｎｔ６ア ミノ酸配列に由来のペプチドに関する。本発明のペプチドまたはその類似体が、 種々の製造業者によって販売されている全自動装置によって合成できること、業 者に注文生産させることができること、または、適当な発現ベクターから上述の ように発現させることができることは当業者に容易に理解されよう。「類似体」 という用語は本発明のペプチドを説明するために本文中で既に説明したが、更に 、分枝状または非直鎖状のペプチドも類似体に包含される。好ましいペプチドは 約２０〜約２４アミノ酸の長さの免疫原性ペプチドである。本発明の実施例８で 後述するように、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異の結果として、発現されたＩｎｔ６ タンパク質は先端が切断されている。点突然変異したｒａｓタンパク質が適正に プロセッシングされることによって特異的Ｔ細胞媒介細胞障害性の標的となり得 る ことは従来の研究（Ｔｓａｎｇ，Ｋ．Ｙ．ら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ ，３：１８３−１９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．Ｓ．ら（１９８ ９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１１８−１２１；Ｊｕｎｇ，Ｓ．ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． ，１７３：２７３−２７６（１９９１）；Ｐｅａｃｅ，Ｄ ．Ｊ．ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：２０５９−２０６５；Ｆ ｅｎｔｏｎ，Ｒ．Ｇ．ら（１９９３）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ，８５：１２９４−１３０２；Ｇｅｄｄｅ−Ｄａｈｌ，Ｔ．，IIIら（１９９２ ）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：２６６−２７４及びＧｅｄｄｅ−Ｄａｈｌ ，Ｔ．，IIIら（１９９２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：１３３１−１３３ ７）で指摘されており、これらの研究に基づいて、突然変異したＩｎｔ６タンパ ク質は、ＭＨＣ装置を介して腫瘍細胞表面に提示されることによって特異的Ｔ細 胞応答を誘発すると考えられる。 従って本発明は、ワクチン及び免疫治療方法で使用するためのＩｎｔ６タンパ クまたは該タンパク質に由来のペプチドを含む医薬組成物を提供する。哺乳類の 癌を防御するワクチンとして使用される場合、医薬組成物は、組換え発現ベクタ ーまたは発現タンパク質を含有する培養上清をトランスフェクトした細胞から得 られた細胞溶解物を免疫原として含有し得る。または、免疫原が、部分的もしく は実質的に精製された組換えタンパク質または合成ペプチドであってもよい。 獣医薬及びヒト医薬の双方に使用される上記の組成物又は製剤は、上記のよう な免疫原を、１種またはそれ以上の適格な医薬用担体及び任意の他の治療用成分 と共に含有する。（１種または複数の）担体は、製剤の他の成分と相溶性であり 、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容できる」ものでなければな らない。製剤は単位量の剤形で提供されるのが好都合であり、製剤業界で周知の 任意の方法によって調製できる。 すべての方法が、有効成分と１種またはそれ以上の補助成分を構成する担体と を会合させる段階を含む。一般には、有効成分を液体担体または微細分割した固 体担体またはその双方と均一かつ均質に会合させ、次いで、必要に応じて製品を 所望の製剤形態に形成することによって製剤を調製する。 静脈内筋肉内、皮下、または腹腔内投与に好適な調剤は便宜的には、受容者の 血液と好ましくは等張である溶液を含む活性成分の滅菌水性溶液を含む。そのよ うな調剤は、固体活性成分を塩化ナトリウム（例えば０．１〜２．０Ｍ）、グリ シンなどのような生理学的に適合可能な物質を含み、水性溶液を製造するための 生理学的条件と適合可能な緩衝化したｐＨを有する水に溶解し、そして上記溶液 を滅菌することによって便宜的に調製することができる。これらは、単位または 多数回投薬容器、例えば、シールしたアンプルまたはバイアル中に存在すること ができる。 本発明の調剤は安定剤を取り込むことができる。例示的な安定剤はポリエチレ ングリコール、タンパク質、多糖類、アミノ酸、無機酸、および有機酸であり、 これらはそれらのみでも混合物としてでも使用することができる。これらの安定 剤は、好ましくは、免疫原の１重量部当たり０．１１〜１０，０００重量部の量 で取り込まれる。２以上の安定剤を使用することを意図する場合、それらの総量 は好ましくは上記で特定した範囲内である。これらの安定剤は好適な濃度および ｐＨにおいて水性溶液中で使用される。そのような水性溶液の特定の浸透圧は一 般的には０．１〜３．０浸透圧モルの範囲内であり、好ましくは０．８〜１．２ の範囲内である。水性溶液のｐＨは５．０〜９．０の範囲内、好ましくは６〜８ の範囲内に調整される。本発明の免疫原を配合する際に、抗吸着剤を使用しても よい。 さらなる薬学的方法を使用して、作用の持続を調節することができる。調節さ れた放出調製物をポリマーの使用を通じて達成し、本タンパク質またはその誘導 体を複合化または吸収することができる。調節された運搬は、放出を調節するこ とを目的として、好適な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリ ビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキ シメチルセルロース、またはプロタミン硫酸塩）と、巨大分子の濃度と、配合の 方法とを選択することによって達成することができる。調節された放出調製物に よる作用の持続を調節するためのもう一つ別の可能な方法は、タンパク質、タン パク質アナログまたはそれらの機能的誘導体を、ポリエステル、ポリアミノ酸、 ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポ リマー材料の粒子中に配合することである。あるいは、これらの試薬をポリマー 粒子に配合する代わりに、これらの材料を、例えばコアセルベーション技術また は界面重合によって調製したマイクロカプセル中に、例えば各々ヒドロキシ−メ チルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリ レート）マイクロカプセル中に、あるいはコロイド薬剤運搬システム中に、例え ばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子 、およびナノカプセル中に、あるいはマクロエマルジョン中に、入れることも可 能である。 経口調製物を所望する場合、組成物を、ラクトース、スクロース、澱粉、タル クステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシ メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたは中でもアラビアゴ ムなどの典型的な担体と組み合わせることができる。 本発明のタンパク質は、キットの形態、単独、または上記のような医薬組成物 の形態で供給できる。 ワクチン化は慣用的方法により実施できる。例えば、免疫原は、食塩水または 水などの好適な希釈剤、あるいは完全または不完全アジュバンド中において使用 できる。さらに、免疫原は、タンパク質を免疫原性にするために担体に結合して もよいし、しなくてもよい。そのような担体分子の例には、ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド などが挙げられるが、これらに限定されない。免疫原は、静脈内、腹腔内、筋肉 内、皮下などの抗体産生に適した任意の経路によって投与することができる。免 疫原は、有意な力価の抗−Ｉｎｔ６抗体が生産されるまで、一回または周期的間 隔で投与することができる。抗体は以下に記載する免疫分析を使用して血清中に 検出することができる。 さらに別の態様において、本発明は、Ｉｎｔ６タンパク質またはＩｎｔ６タン パク質配列から誘導されたペプチドの宿主生物合成を指令できる核酸配列を含む 医薬組成物を提供する。そのような核酸配列は、当業者に既知の方法によって好 適な発現ベクター中に挿入することができる。ｉｎ ｖｉｖｏで高効率遺伝子移 入を生み出すために好適な発現ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイ ルスおよびワクシニアウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されな い。そのような発現ベクターの作動要素は、本明細書中に以前に開示されており 当業者に既知である。そのような発現ベクターは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔 内または経口的に投与することができる。 免疫原が、Ｉｎｔ６タンパク質、それから誘導されたペプチド、あるいはＩｎ ｔ６タンパク質またはそれから誘導されたペプチドの宿主生物合成を指令できる 核酸配列であるにせよ、免疫原は予防または治療目的の何れかのために投与する ことができる。予防的に付与される場合、免疫原は癌または癌に起因する任意の 症状に先立って付与される。免疫原の予防的投与は、癌のいかなる次の発症を防 止または衰退させるのに役立つ。治療的に付与される場合、免疫原は癌または癌 に付随する任意の症状の発症時または発症直後に付与される。 免疫原が部分的または実質的に精製された組み換えＩｎｔ６タンパク質または Ｉｎｔ６ペプチドである場合、Ｉｎｔ６に対する抗体応答を引き出すのに有効な 投与量は約１０μｇから約１５００μｇの範囲である。 Ｉｎｔ６に対する抗体応答を引き出すのに有効な核酸配列をコードするＩｎｔ ６タンパク質の投与量は、約１０から約１０００μｇの範囲である。 Ｉｎｔ６タンパク質（単数または複数）の宿主生物合成を指令できる核酸配列 を含む発現ベクターは、キットの形態、単独、または上記したような医薬組成物 の形態で供給することができる。 本発明はさらに、薬学的に許容できる担体中に、Ｉｎｔ６タンパク質あるいは Ｉｎｔ６タンパク質の宿主生物合成を指令できる発現ベクターを含む癌に対して 哺乳動物を免疫するためのワクチンに関する。 ワクチンとしての並びに免疫治療における使用に加えて、上記組成物はＩｎｔ ６タンパク質に対する抗体を調製するために使用することができる。抗体を調製 するためには、宿主動物は、Ｉｎｔ６タンパク質あるいはそれから誘導されたペ プチドあるいはＩｎｔ６タンパク質またはそれから誘導されたペプチドを発現す ることができる上記発現ベクターを使用して、免疫される。宿主の血清または血 漿を適当な時間間隔後に回収し、ウイルス粒子と反応性を有する抗体を含む組成 物が得られる。ガンマグロブリン画分またはＩｇＧ抗体を、例えば、飽和硫酸ア ンモニウムまたはＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ、または当業者に公知の他の技術 を使用することによって得ることができる。抗体は、薬剤のような他の抗ウイル ス剤に付随することがある多くの有害副作用を実質的には含まない。 抗体組成物は、潜在的な有害免疫系応答を最小化することによって、宿主系と より適合可能にすることができる。これは、外来種抗体のＦｃ部分の全部または 一部を除去することによって、または宿主動物と同一種の抗体を使用することに よって、例えば、ヒト／ヒトハイブリドーマからの抗体の使用によって、達成す ることができる。ヒト化抗体（即ち、ヒトにおいては非免疫原性）は、例えば、 抗体の免疫原性部分を、対応するが非免疫原性である部分で置き換えることによ って作製することができる（即ち、キメラ抗体）。そのようなキメラ抗体は、１ つの種からの抗体の反応性または抗原結合部位および異なる種からの抗体（非免 疫原性）のＦｃ部位を含むことができる。キメラ抗体の例としては、非ヒト哺乳 動物−ヒトキメラ、げっ歯動物−ヒトキメラ、マウス−ヒトおよびラット−ヒト キメラが挙げられるが、これらに限定されない（Robinson et al.，国際特許出 願１８４，１８７；Taniguchi M.，欧州特許出願１７１，４９６；Morrison et al.，欧州特許出願１７３，４９４；Neuberger et al.，ＰＣＴ出願ＷＯ８６／ ０１５３３；Cabilly et al.，1987Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3439；Nish imura et al.，1987 Canc．Res．47: 999；Wood et al.，1985 Nature 314: 446 ；Shaw et al.，1988 J．Natl．Cancer Inst．80: 15553，これらは全て引用に より本明細書中に取り込まれる）。 「ヒト化」キメラ抗体の一般的考察は、Morrison S.，1985 Science 229: 120 2およびOi et al.，1986 BioTechniques 4; 214 により提供される。 好適な「ヒト化」抗体はあるいはまたＣＤＲまたはＣＥＡ置換によって作製す ることができる（Jones et al.，1986 Nature 321:552; Verhoeyan et al.，198 8 Science 239: 1534; Biedleret al．1988J．Immunol．141: 4053，これらは全 て引用により本明細書中に取り込まれる）。 抗体または抗原結合断片はまた遺伝子工学によって作製することができる。E. coli 中における重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方の発現のための技術は、Ｐ ＣＴ特許出願;公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１ ４４２４および Huse et al.，1989 Science 246: 1275-1281の対象である。 あるいはまた、抗Ｉｎｔ６抗体を免疫原として抗イディオタイプ抗体を投与す ることによって誘導することができる。便宜的には、上記で説明したように調製 された精製した抗Ｉｎｔ６抗体調製物を使用して、宿主動物中に抗イディオタイ プ抗体を誘導する。本組成物は好適な希釈剤中で宿主動物に投与される。投与後 に、通常は反復投与後に、宿主は抗イディオタイプ抗体を産生する。Ｆｃ領域に 対する免疫原性応答を排除するために、宿主動物と同一種により産生された抗体 を使用することができ、または投与された抗体のＦＣ領域を除去することができ る。宿主動物中に抗イディオタイプ抗体を誘導した後、血清または血漿を取り出 し、抗体組成物が得られる。本組成物は抗−Ｉｎｔ６抗体に関して上記説明した ように、あるいは親和性マトリックスに結合した抗−Ｉｎｔ６抗体を使用するア フィニティークロマトグラフィーによって、精製することができる。産生した抗 イディオタイプ抗体は真正なＩｎｔ６抗原と立体配置が同様であり、Ｉｎｔタン パク質を使用するよりはむしろ、ワクチンを調製するために使用することができ る。 動物中に抗−Ｉｎｔ６抗体を誘導するための手段として使用する場合、抗体の 注入方法はワクチン接種目的の場合と同一であり、即ち、アジュバンドと一緒に またはそれなしに、生理学的に好適な希釈剤中において有効濃度において、筋肉 内、腹腔内、皮下などに注入される。１以上の追加免疫注入が望ましい場合もあ る。 Ｉｎｔ６タンパク質に対する抗体および抗イディオタイプ抗体の両方のｉｎ ｖｉｖｏ 使用のために、並びに診断用途のためには、モノクローナル抗体を使用 することが好ましい場合がある。モノクローナル抗−Ｉｎｔ６抗体または抗イデ ィオタイプ抗体は当業者に既知の方法によって作製することができる（Goding， J.W．1983．Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，Pladermic Pre ss，Inc.，NY，NY，pp．56-97）。ヒト−ヒトハイブリドーマを作製するために 、ヒトリンパ球提供者が選択される。Ｉｎｔ６抗原を有することが知られる提供 者は好適なリンパ球提供者として役立つ場合がある。リンパ球は抹消血液試料か ら単離することができ、提供者が牌除去に付される場合は脾臓細胞を使用できる 。エ プスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を使用してヒトリンパ球を不死化すること ができ、またはヒト融合パートナーを使用してヒト−ヒトハイブリドーマを作製 することができる。ペプチドによる１次ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作またヒトモノ クローナル抗体の生成においても使用することができる。 不死化された細胞により分泌される抗体をスクリーニングして、所望の特異性 を有する抗体を分泌するクローンを決定する。モノクローナル抗体については、 抗体はＩｎｔ６タンパク質またはペプチドに結合しなければならない。モノクロ ーナル抗イディオタイプ抗体のためには、抗体は抗−Ｉｎｔ６抗体に結合しなけ ればならない。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞が選択される。 上記の抗体およびその抗原結合断片は、キット形態、単独またはｉｎ ｖｉｖ ｏ 用途用の医薬組成物において提供することができる。免疫治療において医薬組 成物として使用する場合、本書中に記載した抗体またはキメラ抗体はまた、慣用 的方法により毒素分子、ラジオアイソトープ、および薬剤に結合することができ る（Vitetta et al.（1991）in「Biologic Therapy of Cancer」De Vita VT，He llman S.，Rosenberg，S.A．（編集）J.B．Lippincott Co．フィラデルフィア； Larson，S.M．et al．（1991）in「Bio1ogical Therapy of Cancer」De Vita V. T.，Hellman S.，Rosenberg，S.A．（編集）J.B．Lippincott Co.，フィラデル フィア）。抗体を結合させることができる毒素の例としては、リシンおよびシュ ードモナスエンドトキシンであるが、これらに限定されない。薬剤または化学治 療剤の例としては、アドリアマイシンが挙げられるが、これに限定されない。ラ ジオアイソトープの例としては、¹³¹Ｉが挙げられるが、これに限定されない。 上記試薬に共有結合により結合した抗体は、癌の化学治療において使用すること ができる。抗体はまた、下記に説明するような免疫分析において治療用途そして 診断用途のために、Ｉｎｔ６タンパク質を精製するための免疫親和剤としても使 用することができる。 従って、本発明は、Ｉｎｔ６タンパク質発現における変化について被験体のタ ンパク質を分析することを含む、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するための第 ３の方法に関する。 この方法によるタンパク質の分析のためには、タンパク質は腫瘍ビオプシー試 料などのような生物学的試料から得られる。タンパク質は、粗製ライセートとし て得ることができ、またはそれは当業者に既知の方法によってさらに精製するこ とができる（Sambrook，J．et al．（1989）in「Molecular Cloning，Alaborato ry Manual」，Cold Spring Harbor press，Plainview，NY）。 粗製タンパク質ライセートは、抗−Ｉｎｔ６抗体を使用する免疫分析によって Ｉｎｔ６タンパク質について分析することができる。 本発明の免疫分析は、放射免疫分析、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光分析 、酵素免疫分析、化学発光分析、免疫組織化学分析などが挙げられる。ＥＬＩＳ Ａについて当業者に既知の標準的技術は、Methods in Immunodiagnosis，第２版 、Rose および Bigazzi，eds.，John Wiley およびSons，1980 およびCampbell et al.，Methods of Immunology，W.A．Benjamin，Inc.，1964に記載されており 、これらは共に引用により本明細書中に取り込まれる。このような分析は、技術 文献に記載されているように直接、間接、競合、または非競合免疫分析でもよい （Oellerich，M．1984．J ．Clin．Chem．Clin．Biochem．22: 895-904）。 形成したＩｎｔ６タンパク質抗Iｎｔ６抗体複合体の検出は、複合体と標識抗 ラビット抗体などの２次抗体との反応により達成することができる。標識は、好 適な蛍光または発色試薬の存在中で複合体をインキュベートすることによって検 出される酵素であればよい。他の検出可能な標識、例えば、放射標識または金コ ロイドなども使用できる。標識されたＩｎｔ６タンパク質−抗Ｉｎｔ６抗体複合 体は次いで、オートラジオグラフィーによって視覚化される。 本発明はまた、Ｉｎｔ６タンパク質、Ｉｎｔ６タンパク質の宿主生物合成を指 令できる核酸配列を含む発現ベクター、または抗−Ｉｎｔ６抗体を、治療的に有 効量において含む医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法を包含する。 治療的に付与される場合、ラジオアイソトープ、毒素分子または薬剤に結合した Ｉｎｔ６タンパク質、Ｉｎｔ６タンパク質をコードする発現ベクター、または抗 Ｉｎｔ６抗体は、感染の発症時（またはその直後）、または癌に起因する感染ま たは疾患の任意の症状の発症時に付与される。Ｉｎｔ６タンパク質、Ｉｎｔ６タ ンパク質をコードする発現ベクター、または抗Ｉｎｔ６抗体の治療的投与は感染 または疾患を減衰させるのに役立つ。 本発明はまた、癌を有する被験者を治療する別の方法であって、 （ａ）特異的Ｔ細胞応答を引き出すのに有効な量のＩｎｔ６タンパク質またはＩ ｎｔ６タンパク質の宿主生物合成を指令できる発現ベクターにより被験者を免疫 し； （ｂ）上記Ｔ細胞を上記免疫された被験者から単離し；そして （ｃ）上記Ｔ細胞を上記免疫された被験者または非免疫被験者に治療的な有効な 量において投与する、 ことを含む方法を包含する。 Ｉｎｔ６タンパク質に対して反応性であるＴ細胞集団を、Ｉｎｔ６タンパク質 で免疫した提供者の抹消血液試料または脾臓細胞から単離することができる。エ プスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を使用してヒトリンパ球を不死化することが でき、ヒト融合パートナーを使用して、ヒト−ヒトハイブリドーマを作製するこ とができる。Ｉｎｔ６タンパク質による１次ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作もまた、 Ｉｎｔ６タンパク質に対して反応性であるＴ細胞の生成において使用することが できる。 Ｔ細胞は約７日〜約９０日まで培養し（Yanelli，J.R．J．Immunol．Methods 139: 1-16(1991)）、次いでスクリーニングして、Ｔ細胞応答性を分析する既知 の方法を使用して免疫原性キメラタンパク質中に含まれる他のペプチドに対する 所望の反応性を有するクローンを決定する；かくして、所望の応答性を産生する Ｔ細胞が選択される。 上記のＴ細胞は、Ｔ細胞を哺乳動物に静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下投与 することによって、癌に罹患した個人の治療としてｉｎ ｖｉｖｏ使用のために 使用することができる。好ましい投与経路は、静脈内または腹腔内である。 本発明はまた、野生型Ｉｎｔ６遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターをＩ ｎｔ６遺伝子の突然変異を有する被験者に投与する、遺伝子治療方法に関する。 野生型Ｉｎｔ６遺伝子を表す核酸配列は、配列番号１および配列番号３に示され ているものである。そのような核酸配列は当業者に既知の方法によって好適な発 現ベクター中に挿入することができる。高効率遺伝子移入をｉｎ ｖｉｖｏで生 み出すのに好適な発現ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルスおよ びワクシニアウイルスのベクターが挙げられる。 野生型Ｉｎｔ６遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターは、静脈内、筋肉内 、皮下、腹腔内または経口的に投与することができる。好ましい投与経路は静脈 内である。 本発明はまた、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異を検出するための診断キットを提供 する。この診断キットは、Ｉｎｔ６疾患遺伝子の突然変異についてＤＮＡまたは ＲＮＡを分析する際におけるＰＣＲプライマーとして有用な精製かつ単離された 核酸配列を含む。 本明細書中に引用された如何なる文献または特許は引用により取り込まれる。 以下の実施例は本発明の多様な側面を例示するために提示されるものであり、本 発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。 実施例 実施例１ ＭＭＴＶゲノムの新規の挿入部位の同定 高率のガンの表現型による選択的な同型交配によって偏向していない、乳癌Ｄ ＮＡにおける新規Ｉｎｔ遺伝子座を同定するため、チェコスロバキアで捕獲され たM．musculus(CZECH II)(Gallahan，D．and Callahan，R．（1987）J ．Virol. ，61:66-74)の単一家系のつがい由来の野生のマウス株を利用した。高発現率の 同型交配マウス株とは異なり、CZECH IIマウスは内因性のＭＭＴＶゲノムを欠い ているが、乳を通して先天的に受け継がれるＭＭＴＶの感染性の株を保持する(C allahan，R．et al．（1982）Proc ．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，79: 4113-411 7)。CZECH IIマウスにおいては、腫瘍形成に先立って、安定で、クローン優性で 、時には肺に転移するフォーカス乳癌を形成する過増殖外殖ライン（ＨＯＧ）が 発達していた。ＨＯＧまたはＨＯＧ由来の腫瘍、またはＨＯＧ由来の腫瘍をもつ マウスの肺転移における、ゲノムＤＮＡへのＭＭＴＶプロウイルスゲノムの挿入 を検出するために、ＣＺＺ１と呼称するＣＺＥＣＨ ＩＩ ＨＯＧライン、また はＣＺＺ−１由来の悪性腫瘍または肺転移から細胞ＤＮＡを単離して、以下のよ うにサザンブロットにより解析した。１０μｇの細胞ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化 し、０．８％アガロースゲルで泳動し、ナイロン膜に吸着させ、Gallahan，D．a nd Callahan，R．（J ．Virol．（１９８７）６１：６６−７４）に記載されてい るように、ＭＭＴＶ ＬＴＲプローブでハイブリダイゼーションを行った。簡略 には、ハイブリダイゼーションの前に、フィルターを３７℃で４から２４時間、 ３×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄ ［ｐＨ７．４］、および１ｍＭのＥＤＴＡからなる）、５×デンハルト溶液（０ ．０２％ファイコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、および０．０２％牛 血清アルブミン）、２．５％デキストラン硫酸、および５０％ホルムアミドを含 むプレハイブリダイゼーション溶液中に浸した。４０％ホルムアミドを含む以外 はプレハイブリダイゼーション溶液と同様の溶液に、変性させたプローブを加え た。こ の混合液をプレハイブリダイゼーションしたフィルターを含むプラスチックバッ グに加え、３７℃で２４時間保温した。フィルターを、６５℃で０．１×ＳＳＣ （１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌと０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムから なる）と０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを３回取り替え（２０から３０分の洗 浄ごとに取り替えた）、ストリンジェント条件下で洗浄した。フィルターは、コ ダックＸＡＲ−５ Ｃ線フィルムに一晩から数日間露光した。これらのサザンブ ロットの結果を図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａに示す結果は、３個のＭＭＴＶ プロウイルスゲノム（６個のＥｃｏＲＩ制限酵素断片）を有する、一つのＣＺＺ −１ ＨＯＧラインのＤＮＡが細胞ＤＮＡへ挿入されていることと、これらのプ ロウイルスゲノムがまた、ＨＯＧ内で独立に発生した原発腫瘍中にも存在するこ とを示す。この結果はさらに、これらの６個のＭＭＴＶ関連断片がもともとの外 殖物中やそれぞれの継代移植世代中にも再現性良く認められるため、ＣＺＺ−１ が腫瘍形成に先立つ細胞中でクローン優性集団であることを示す。実際、ＣＺＺ −１ ＨＯＧのクローン優性な性質は、４．８および２．８ｋｂのＥｃｏＲＩ制 限酵素断片に相当する一つの完全なプロウイルスゲノムを欠いた、腫瘍１２６２ （図１Ａレーン３）により明らかにされている。図１Ａで解析された１３の腫瘍 ＤＮＡのうち５つ、および腫瘍４９７３をもつマウスの肺の１１の独立な転移部 位のうち５つ（図１Ｂ）が付加的な挿入ＭＭＴＶゲノムを有するという観察は、 付加的挿入が付加的な細胞遺伝子を活性化（または不活性化）することによって 腫瘍の進行に寄与していることを示唆する。しかし、既知の共通の挿入部位（Ｗ ｎｔ−１、Ｆｇｆ−３、Ｉｎｔ３、Ｗｎｔ−３およびＦｇｆ−４）はいずれもＣ ＺＺ−１ ＨＯＧ中でＭＭＴＶにより組換えられていないので、それぞれのＣＺ Ｚ−１ ＨＯＧのＥｃｏＲＩ宿主−ＭＭＴＶ結合制限酵素断片の組換え体クロー ンを得て、宿主配列のサブクローンをＭＭＴＶ誘導ＤＮＡ組換えの証拠として、 独立のＭＭＴＶ誘導乳癌ＤＮＡのサザンブロットをスクリーニングするためのプ ローブとして用いた。 この手法を利用して、ＣＺＺ−１ ＨＯＧの一つのＭＭＴＶプロウイルスの近 傍の宿主配列（すなわち、図１Ａに示す３．０ｋｂ断片）からなるプローブを、 ＣＺＺ−１ ＨＯＧ由来の腫瘍２２（図２Ａ、レーン２および３）、および独立 の乳癌１１３９（図２Ｂ，レーン２および３）および３１４４（図２Ｃ）レーン ２および３）のＩｎｔ６共通挿入部位を同定するのに用いた。簡略には、腫瘍Ｄ ＮＡおよび正常な肝臓ＤＮＡ（各パネルのレーン１）由来の細胞ＤＮＡ（１０μ ｇ）をＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲルで泳動し、ナイロン膜上に ブロットした。図２Ａおよび２Ｂのブロットのレーン１および２は、宿主近傍配 列に相当するプローブＤでハイブリダイゼーションした。 その後、図２Ａおよ び２Ｂのレーン２を、ＭＭＴＶ ｇａg配列（Gallahan and Callahan（１９８７ ）J ．Virol.６１：６６−７４）を用いてハイブリダイゼーションし、その結果 を図２Ａおよび２Ｂのレーン３に示す。図２Ｃのレーン１および２はプローブＣ でハイブリダイゼーションした。その後、レーン２はＭＭＴＶｅｎｖ配列（Gall ahanおよびCallahan（１９８７）J ．Virol.６１：６６−７４）を用いてハイブ リダイゼーションし、その結果を図２Ｃのレーン３に示す。最初のプローブでの それぞれのブロットのハイブリダイゼーションはこの実施例の前述の記載（Gall ahanおよびCallahan（１９８７）J ．Virol.６１：６６−７４）に従い実施した 。その後ブロットを第二のプローブでハイブリダイゼーションする場合、ブロッ トをGallahanおよびCallahan（（１９８７）J．Virol.６１：６６−７４）に従 い、以下のように再びプローブを加えた。簡略には、フィルターを１００ｍｌの ０．４ＮのＮａＯＨ中に浸し、室温で２０分間保温することによってジェネトラ ンフィルターからプローブＤＮＡを除去した。この溶液を捨て、０．１ＭのＴｒ ｉｓ（ｐＨ７．５）−０．１×ＳＳＣ−０．５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液に 取り替えてフィルターを中和した。フィルターを室温で１５分間保温した後、中 和溶液を取り替えて保温をさらに１５分間続けた。その後、この実施例で以前に 記載したようにフィルターをプレハイブリダイゼーションし、ハイブリダイゼー ションした。この方法で処理したジェネトランフィルターはＤＮＡが顕著に失わ れるまで、少なくとも５回は再使用し得る。 結果は、ＭＭＴＶ誘導再構成（図２Ａから２Ｃにおいて矢印で示す）が二つの 独立のＭＭＴＶ誘導乳癌ＤＮＡ（図２Ｂおよび２Ｃのレーン２と３）で検出され たことを表す。興味深いことに、ＭＭＴＶ誘導型再構成が検出されたそれぞれの 場合、再構成した制限酵素断片はＭＭＴＶｇａｇ又はｅｎｖ配列を含む断片と一 緒に泳動されていた。これらの結果は、各腫瘍におけるウイルスゲノムの転写の 向きが同じ方向であることを表す。すなわち、挿入されたＭＭＴＶゲノムに近接 した宿主配列は、Ｉｎｔ６と名付けられた、ＭＭＴＶの新しい共通の挿入部位を 示す。 実施例２ ネズミＩｎｔ６遺伝子の単離 Ｉｎｔ６遺伝子座の組換えゲノムクローンを得るため、宿主近傍配列を含む３ ．０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（図１Ａに示す）のサブクローン（すなわち、プロー ブＤ、図３）を、マウス株１２９／ｓｖ由来のゲノムＤＮＡのラムダファージラ イブラリー（Stratagene，LaJolla，CA）をプローブ探査するのに用いた。この ゲノムＤＮＡは、ヌクレオチド配列解析によって決定されたように野生型Ｉｎｔ ６ＤＮＡを含む。Ｉｎｔ６遺伝子座の４７ｋｂを覆うような重なりあうラムダク ローンがさらに３つ、プローブＡ−Ｃ（図３）を用いて得られた。これらの４つ の重複するラムダクローンは、図３に示すようにネズミＩｎｔ６遺伝子を覆う。 遺伝子はマウスの１５番染色体上のｍｙｃガン原遺伝子の動原体部位に位置する 。Ｉｎｔ６遺伝子座のゲノムクローンのさらなるヌクレオチド配列解析から、こ の遺伝子は図３に示すようにゲノムＤＮＡの３４ｋｂにおよぶ１３のエキソンを もつことが示された。 実施例３ CZECH II 乳ガンにおけるＩｎｔ６遺伝子の発現 ＣＺＥＣＨ ＩＩ乳ガンにおけるＩｎｔ６遺伝子の発現を研究するため、Ｉｎ ｔ６陰性腫瘍（腫瘍１７８）および、Ｉｎｔ６上にウィルスの挿入されたＩｎｔ ６陽性腫瘍（２２および１１３９）から調製された総ＲＮＡ（２０μｇ）をホル ムアルデヒド存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで 泳動した。ＲＮＡをナイロン膜に吸着させ、Gallahan,D.およびCallahan,R．（ １ ９８７）J.Virol.，６１：６６−７４に記載されたようにプローブＡとハイブリ ダイゼーションを行った（図３）。ノーザンブロット解析の結果を図４に示す。 簡略には、３つの腫瘍の各々において、プローブＡでのハイブリダイゼーション によって１．４ｋｂの型のＲＮＡが検出され、腫瘍１１３９にはさらにプローブ Ａの配列に関係する０．９ｋｂの型のＲＮＡが含まれた。ウィルスによるＩｎｔ ６の再構成を伴わない腫瘍１７８（図４）、およびＭＭＴＶによって誘導される いくつかの他の乳ガンでは、プローブＡによって検出される１．４ｋｂの型のＲ ＮＡを発現したという観察結果から、腫瘍２２および１１３９におけるＩｎｔ６ 遺伝子の発現レベルはこの遺伝子座へのウィルスの挿入による重要な結果ではな いことが示唆される。 実施例４ 野生型ネズミＩｎｔ６のｃＤＮＡの単離 野生型１．４ｋｂのＩｎｔ６ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを単離するため、ＭＭ ＴＶによるＩｎｔ６の再構成を伴わない、ＭＭＴＶによって誘導された乳ガンの ネズミｃＤＮＡライブラリーを、標準的な方法（Sambrook et al（１９８９）"M olecular Cloning,A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor Press,Plainvie w NY）を用いて調製し、プローブＡを用いてプローブ探査した（プローブＡは図 ３に示したＸｂａＩ断片である）。ネズミＩｎｔ６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配 列を決定し、これを図５に示す。１．４ｋｂの型のＩｎｔ６ＲＮＡの翻訳から、 ４３．５キロダルトンのタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム が発見された。図５に示すように、このタンパク質には２つのＮ−グリコシル化 され得る部位（Chem.，２６０：１２４９２−１２４９９）、チロシンキナーゼ （Hunter,T.およびCooper,J.A．（１９８５）Ann.Rev.Biochem ，５４：８９７− ９３０）、およびカゼインキナーゼＩＩ（Pinna,L.A．（１９９０）Biochem Bio phys Acta ,１０５４：２６７−２８４）が含まれる。 実施例５ 種間に渡るＩｎｔ６ｃＤＮＡの保存 ネズミの乳ガンにおいて、ＭＭＴＶの挿入によって発現が影響されまたは変化 する全ての遺伝子は進化を通じて高度に保存されている（Dickson,C．and Peter s,G．（１９８７）Nature ３２６：８８３；Rijsewizk,K.F．et al（１９８７）Cell ，５０：６４９−６５７：Robbins,J．et al（１９９２）J.Virol，６６： ２５９４−２５９９）ため、異種間のゲノムＤＮＡにおけるＩｎｔ６遺伝子の保 存性をサザンブロット解析によって研究した。線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，ショウ ジョウバエ，アフリカツメガエル，ニワトリ、ネズミ、およびヒト由来の細胞Ｄ ＮＡ（各１０μｇ）をＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲルで泳動し、 ナイロン膜に吸着させ、３×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１８０ｍＭのＮａＣｌ， １０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ７．４），１ｍＭのＥＤＴＡ）、５×Ｄｅｎｈａ ｒｄｔ液（０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ，０．０２％ポリビニルピロリドン，０．０ ２％ウシ血清アルブミン）、５％デキストラン硫酸、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸 ナトリウム）中でＩｎｔ６ｃＤＮＡと６５℃で一晩ハイブリダイゼーションした 。ハイブリダイゼーション後、膜をストリンジェント条件下で０．５×ＳＳＣ（ １×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ，０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）プラ ス０．５％ＳＤＳで３回（洗液は２０から３０分の洗浄ごとに換えた）６５℃で 洗浄した。Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−５フィルムに３日間感光させた。図６に示すよ うに、Ｉｎｔ６に関連する配列が、検査した全ての真核生物種において検出され た。また、Ｉｎｔ６関連配列を含む酵母ＤＮＡの制限酵素消化断片がサザンブロ ット解析によって検出された（データは示さない）。 さらに、ショウジョウバエのＩｎｔ６相同遺伝子のｃＤＮＡクローンのヌクレ オチド配列を決定し（データは示さない）、ショウジョウバエのＩｎｔ６タンパ ク質の推定アミノ酸配列はヒト／ネズミの推定アミノ酸配列と６０％同一であっ た。併せて考えると、これらの結果によって、Ｉｎｔ６遺伝子の幅広い進化的保 存性が証明され、Ｉｎｔ６が基本的な生命機能を果たすことが示唆される。 実施例６ 標的組織におけるＩｎｔ６特異的なｍＲＮＡの発現の検出 ＭＭＴＶによる遺伝子の再構成を伴わない腫瘍中のＩｎｔ６の１．４ｋｂの型 のＲＮＡを検出した（すなわち図４の腫瘍１７８）ため、正常な成体の組織およ び発生の各段階の胚のＩｎｔ６ ＲＮＡの発現を以下のようにノザンブロット解 析によって調査した。各組織から総ＲＮＡ（各１０μｇ）を調製した。ＲＮＡを ホルムアルデヒド存在下で変性させ、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲ ルで泳動した。このＲＮＡ試料をナイロン膜に吸着させ、最初にβ−アクチンプ ローブと、続いてＩｎｔ６ ｃＤＮＡプローブと、GallahanおよびCallahan（J. Virol. ，６１：６６−７４（１９８７））に記載された条件でハイブリダイゼー ションした。図７に示すように、Ｉｎｔ６ ＲＮＡは乳腺を含む成体の調査した 全ての組織で発現しており、胚におけるＩｎｔ６ ＲＮＡの発現は発生の８日目 にすでに検出された。 実施例７ 標的組織におけるＩｎｔ６特異的なｍＲＮＡの発現の検出 Ｉｎｔ６特異的なｍＲＮＡの発現を検出するために、種々の組織由来の総ＲＮ Ａを用いてランダムプライミングしたｃＤＮＡを調製する。Ｉｎｔ６ネズミｃＤ ＮＡの７００ｂｐ断片を、配列番号２９ ＴＧＴＣＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＡＣＧ ＣＴＡおよび配列番号３０ ＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＡＴＡＣＡとして 示すプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲの条件は：変性９４℃ １分、アニーリング５５℃１分、伸長７２℃２分を３０サイクルである。最後の サイクルの後、２分の伸長反応を追加する。ＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲ ルで泳動する。エチジウムブロミド染色の後、ゲルの写真撮影によってＲＴ−Ｐ ＣＲ産物を検出する。 実施例８ ＭＭＴＶによるＩｎｔ６の再構成が乳癌において 新種のＩｎｔ６ＲＮＡの発現をもたらす 図３に示したようなネズミのＩｎｔ６遺伝子のマッピングデータの検査によっ て、全てのウイルスの挿入がＩｎｔ６遺伝子のイントロン中で起こること、およ び、取り込まれたウイルスゲノムの転写方向はＩｎｔ６遺伝子のそれと反対方向 であることが明らかである。Ｉｎｔ６遺伝子座でのＭＭＴＶの果たす役割につい て少なくとも４つの可能な仮説がある。第一の仮説では、Ｉｎｔ６遺伝子は実際 はＭＭＴＶが作用する標的遺伝子ではない。Ｗｎｔ１、Ｆｇｆ−３、およびＦｇ ｆ−４遺伝子座（Dickson,C.,etal．（１９８４）Cell．37: 529-536; Nusse，R .，et al．（１９８２）Cell，３１：９９−１０９；Peters，G.,et al．（１９ ８９）Proc.Natl.Acad.Sci．USA．８６：５６７８−５６８２）において、ＭＭ ＴＶ挿入部位は標的遺伝子の周囲に規則的様式で集まり、標的遺伝子の５’側に 挿入されたウイルスゲノムの転写方向は標的遺伝子のそれと反対方向であるが、 標的遺伝子の３’側に挿入されたものは同じ転写方向である。さらに、公表され た報告に基づくと、ＭＭＴＶ挿入部位は特定の標的遺伝子から１５ｋｂ以内にあ る。しかしＩｎｔ６遺伝子の３’側１３ｋｂまでの配列に対応するＲＮＡの発現 の活性化の証拠が発見されていないため、推定上の標的遺伝子の位置は挿入され たＭＭＴＶゲノムから、ＣＺＺ−１ ＨＯＧの場合は２４ｋｂ以上、腫瘍１１３ ９の場合は３０ｋｂ以上離れていなければならず（図３参照）、従ってこの可能 性は非常に少ない。 Ｉｎｔ６遺伝子へのＭＭＴＶの挿入に起因し得る二番目の結果は、挿入された ウイルスゲノムの３’ＬＴＲから開始する、Ｉｎｔ６の新たなキメラＲＮＡ転写 物の発現の活性化である。Ｉｎｔ６の場合以外では、類似した状況がＭＭＴＶに よって誘導されるＩｎｔ−３の再構成の場合に起き（Robbins,J.,et al．（１９ ９２）J.Virol.，６６：２５９４−２５９９）、ウイルスゲノムの転写方向がＩ ｎｔ６の転写方向と反対であるため、Ｉｎｔ６アンチセンスＲＮＡの発現を引き 起こすと考えられる。このような結果は、対立遺伝子の両者の発現を不活性化す るトランス優性な突然変異を表すと考えられる。しかし、種々の方法を用いたが 、ＭＭＴＶによって誘導されるＩｎｔ６アンチセンスＲＮＡの発現は検出され なかった。 三番目の可能性によると、Ｉｎｔ６遺伝子はＩｎｔ遺伝子座内のＭＭＴＶの挿 入の標的であると仮定される。この場合ウイルスの挿入は一つの対立遺伝子の発 現を阻害し、もう一方の対立遺伝子に劣性の自発的な突然変異が存在することが 明らかになると考えられる。この可能性を調べるために、腫瘍２２および腫瘍１ １３９内の再構成されていないＩｎｔ６の対立遺伝子に対応するｃＤＮＡヌクレ オチド配列が決定され、どちらの場合も突然変異は見つからなかった。 ４番目のよりあり得る仮説は、Ｉｎｔ６遺伝子へのＭＭＴＶの挿入が、乳上皮 細胞の増殖の正常な制御を失わせるような、生物学的に活性化された遺伝子産物 （Ｉｎｔ３のような（Robbins,J.,et al．（１９９２）J.Virol.，６６：２５９ ４−２５９９））または優性ネガティブ遺伝子産物の発現を引き起こし、影響を 受けた乳上皮細胞の過形成をもたらすというものである。これによって、乳ガン の発達を引き起こし得る前悪性の上皮細胞集団が発生する。 ＭＭＴＶのＩｎｔ６遺伝子への挿入によって、変化したＲＮＡ種が発生するか どうかを調べるために、腫瘍１１３９および腫瘍２２からのＩｎｔ６ ＲＮＡの ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列が決定された。それぞれの場合において再 構成された対立遺伝子の転写によって、ＭＭＴＶ ＬＴＲの逆転したＵ３部位中 の隠れた転写終止シグナルで終止したキメラＲＮＡ種の発現が起こった（図８） 。興味深いことに類似した隠れた終止シグナルが、ＭＭＴＶによって誘導される Ｆｇｆ−３のいくつかの再構成において活性であることが以前に示されている（ Clausse,N.，（１９９３）Virology，１９４：１５７−１６５）。 図９Ａおよび９Ｂは、腫瘍１１３９（図９Ａ）および２２（図９Ｂ）中に検出 されたＩｎｔ６−ＭＭＴＶ ＬＴＲ ＲＮＡ種のヌクレオチド配列を示す。図９ Ａにおいては再構成された対立遺伝子由来の二つのＲＮＡ種（図Ａ、９００ｂｐ および９６５ｂｐ）が検出された。９００ｂｐのＲＮＡ種に対応するＲＮＡ種が 図４においてノザンブロット解析によって検出された。一つのＲＮＡ種において は、エキソン５はＭＭＴＶ ＬＴＲのＵ５部位の末端にスプライシングされ、も う一つの種においてはイントロン５中の隠れたスプライシング受容部位において スプライシングが起こった。同様に図９、ＣＺＺ−１ではエキソン９がイントロ ン９中の隠れた三つの異なるスプライシング受容部位のうちの一つにスプライシ ングされた三つのキメラＲＮＡ種が存在した。キメラ腫瘍ＲＮＡ種の大きさは正 常なＩｎｔ６ＲＮＡのそれに類似しているため、図４の腫瘍２２ＲＮＡのノザン ブロット解析では検出されなかった。 再構成したＩｎｔ６ ＲＮＡの仮想されるタンパク質への翻訳によって、すべ ての５つの種からの産物は、Ｉｎｔ６のイントロンおよび／または逆転したＭＭ ＴＶ ＬＴＲヌクレオチド配列によってコードされる新規のアミノ酸配列にＩｎ ｔ６アミノ酸配列が連結された短縮型のキメラであることが明らかになった。９ ６５ｂｐのＲＮＡ種が腫瘍１１３９中に存在することはＩｎｔ６遺伝子産物の短 縮がＭＭＴＶの挿入の重要な結果であることを示唆する。 実施例９ ヒトＩｎｔ６遺伝子の単離 マウスＩｎｔ６ｃＤＮＡをラムダファージ中のヒト肺ＲＮＡのｃＤＮＡライブ ラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）をプローブ探査するために用い、ヒト肺 ｃＤＮＡライブラリーからクローン化したヒトＩｎｔ６ ｃＤＮＡに特異的なプ ライマー（配列番号３）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡのＰ１ファージライブラリ ーを、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に よってＩｎｔ６関連クローンについてＰＣＲによってスクリーニングした。この 方法を用いて５０ｋｂ以上のヒトゲノムＤＮＡを含むひとつのＰ１ファージクロ ーンおよび二つのラムダクローンが得られた。これらのクローンのヌクレオチド 配列解析によって、ヒトＩｎｔ６遺伝子が図１０に示されたような構成であるこ とが明らかになった。マウスゲノム中と同様にヒトＩｎｔ６遺伝子は１３のエキ ソンから構成される。ヒトＩｎｔ６遺伝子はまた、七番目のイントロン中にＣＡ 反復配列を含む（図１０）。 実施例１０ イントロン７に含まれるＣＡ反復配列の大きさの多型 ヒトＩｎｔ６遺伝子のイントロン７中のＣＡ反復配列の周辺の核酸配列に相補 的で（図１）、配列番号３１ ＧＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡ Ｇおよび配列番号３２ ＴＧＣＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＧＣを有するプ ライマーが、ヒトゲノムＤＮＡ中のＣＡ反復配列を含むＩｎｔ６遺伝子の部位を ＰＣＲ増幅するために用いられた。ＰＣＲの条件は、９４℃１分間の変性、５５ ℃１分間のアニーリング、７２℃２分間の伸長を３０サイクル行った。最後のサ イクルの後、２分間の伸長時間を加えた。非変性６％ポリアクリルアミドゲル電 気泳動によるＰＣＲ産物の分離によって、解析された８４の個々のＤＮＡのうち ４６が異なる大きさの（情報を含む）対立遺伝子のヘテロ接合体であることを明 らかにした。 実施例１１ ヒトＩｎｔ６遺伝子の染色体上の局在 ヒトＩｎｔ６遺伝子の染色体上の局在を決定するために、ヒトＤＮＡおよび個 々のヒト染色体を含む齧歯類−ヒト体細胞融合細胞から単離したＤＮＡのサザン ブロット解析が行われた。簡略には、齧歯類−ヒト体細胞融合細胞ＤＮＡまたは ヒトＤＮＡをＨｉｎｄIIIによって消化し、３ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄ ｔ溶液、２．５％デキストラン硫酸および４０％ホルムアミド中でヒトＩｎｔ６ ｃＤＮＡと３７℃で２４時間ハイブリダイゼーションした。ブロットを６５℃３ 回の０．１ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの液交換を含む（それぞれの液交換は２０ から３０分毎に行われた）ストリンジェント条件下で洗浄した。このサザンブロ ットの結果を図１２に示す。レーン１およびレーン２はヒト６番染色体（レーン １）または８番染色体（レーン２）を含むチャイニーズハムスター−ヒト体細胞 ハイブリッドＤＮＡを含み、レーン３はヒト３、７、８、１５および１７番染色 体を含むマウス−ヒト体細胞ハイブリッドからのＤＮＡを含み、レーン４はヒト ゲノムＤＮＡを含む。レーン４に見られる２３ｋｂ断片はＩｎｔ６関連偽遺伝子 を含み、Ｉｎｔ６遺伝子をコードする配列はレーン４に見られた４．５、３．５ およ び３．０ｋｂ断片により特定される。この結果から、２３ｋｂ断片がレーン１（ ヒト６番染色体を含むハイブリッド）だけにしか検出されない一方、４．５ｋｂ および３．５ｋｂ断片はレーン２（ヒト８番染色体を含むハイブリッド）に検出 されたことがわかる。さらに、３．０ｋｂヒト断片（レーン４参照）はまた、レ ーン１およびレーン２の両方に検出された。しかし、マウスＤＮＡはＩｎｔ６関 連３．０ｋｂＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を含まないことが示されているため、レーン ３において３．０ｋｂ断片が検出されたことから、３．０ｋｂ断片が、チャイニ ーズハムスターの配列ではなくヒトＩｎｔ６関連配列を有することが示された。 これらの結果は、ヒトＩｎｔ６遺伝子が８番染色体上に位置することを示す。こ の染色体上の局在は実施例１０に記載されたＣＡ反復配列多型をもちいた連鎖解 析によって確認され、さらに精密には８番染色体ｑ２２−ｑ２４にあることが示 された。 実施例１２ ヘテロ接合性の欠失を引き起こすヒト胸部腫瘍ＤＮＡの Ｉｎｔ６遺伝子中の突然変異の検出 以前に示されたＭＭＴＶ誘導型マウス乳癌の結果に基づき、Ｉｎｔ６遺伝子が ヒト胸部腫瘍の悪性腫瘍化の間の変異の標的となるかどうかを決定するために、 ヒト胸部腫瘍の生体採取試料由来のＤＮＡを解析した。簡略には、原発ヒト胸部 腫瘍由来および、Ｉｎｔ６のＣＡ繰返し配列が既知である４０人の対応する正常 組織由来のＤＮＡを、実施例１０で使用したＰＣＲ法により腫瘍ＤＮＡ中にヘテ ロ接合性の欠失（ＬＯＨ）の存在について解析した。これらの腫瘍のうち１１に ついて（２５％）完全な欠失または対応した正常ＤＮＡと比較して、有意な遺伝 子座のシグナルの減少が認められた。これら１１中の５つの腫瘍ＤＮＡ（Ｔ）と それらに対応した正常試料（Ｌ）を図１３に示す。これらの結果はヒト胸部腫瘍 の悪性化の進行のあいだＩｎｔ６遺伝子が変異の標的となることを示す。さらに 、Ｉｎｔ６遺伝子の発現がすべての解析を行った組織で検出されるため（図７参 照）、Ｉｎｔ６遺伝子の突然変異は他の組織に見られるガンの進行のあいだに引 き起 こされるのだと考えられる。 実施例１３ Ｉｎｔ６遺伝子のエキソンに結合する配列に由来するプライマーの組を 用いたＰＣＲ−ＳＳＣＰによるヒトＩｎｔ６遺伝子の突然変異の解析 １３のヒトＩｎｔ６エキソン（図１４）うち１２に結合する核酸配列に相補的 なプライマーの組をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５−２８に示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：５−２８から選択されたプライマーの組を用いて、エキソン７以外のＩｎｔ６ 遺伝子の各エキソンを、Ｉｎｔ６遺伝子にヘテロ接合性の欠失を有する１１の原 発胸部腫瘍ＤＮＡ（実施例１２参照）、および対応する正常組織試料のＤＮＡか らＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ り１本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）について解析を行った。エキソン７は、ヒトＩｎ ｔ６のｃＤＮＡのエキソン７に一致する部分を用いたハイブリッドミスマッチ法 により解析を行った。Ｉｎｔ６遺伝子にヘテロ接合性の欠失を有する原発胸部腫 瘍ＤＮＡの、１本鎖構造多型解析（ＳＳＣＰ）とハイブリッドミスマッチ法の両 方の解析においては、残りの遺伝子座に点変異は一つも検出されなかった（デー タは示さない）。しかし、残りの遺伝子座におけるプロモーターおよびイントロ ン領域の突然変異に関する解析は行わなかった。Ｉｎｔ６遺伝子のプロモーター 、イントロンおよび／またはコード領域の変異が腫瘍試料中に検出された場合に は当然、これらの突然変異は腫瘍および対応する正常組織ＤＮＡ中の変異遺伝子 座の塩基配列解析により確かめることが可能である。 実施例１４ ヒト胸部および肺腫瘍試料におけるＩｎｔ６のｍＲＮＡの発現の欠失 ３６人の悪性ヒト胸部腫瘍と２人の新生物発生前障害（高度形成異常症）、お よび対応する正常組織から単離した全ＲＮＡを、Ｉｎｔ６ｍＲＮＡの発現に関し て、β−アクチンおよびヒトＩｎｔ６のｃＤＮＡプローブでGallahanおよびCall ahan（J.Virol ．６１：６６−７４）に記載された条件で行った連続ハイブリダ イゼーションを用いたノーザンブロット解析により解析した。これら３８試料中 １４（３７％）はＩｎｔ６ｍＲＮＡの発現について、対応する正常組織試料と比 較して有意な減少または検出不能を示した。 これら１４の場合のうち、８は浸潤性導管ガン（ＩＤＣ）で、２はコメド癌（ 広い導管内成分を有するＩＤＣ）、２は小葉ガン、２つは新生物発生前障害であ った。図１５にノーザンブロットの結果をしめす。 別の研究において、４７つの非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）および対応する正 常組織におけるＩｎｔ６ ｍＲＮＡの発現を、本実施例中で上記のように１０μ ｇの総ＲＮＡのノーザン解析により測定した。ノーザンブロットの表示を図１６ に、４７つのＮＳＣＬＣ試料のノーザン解析の結果は表１にまとめた。 興味深いことに、４７ＮＳＣＬＣ中１４がＩｎｔ６ｍＲＮＡの発現の欠失を示 し、Ｉｎｔ６ｍＲＮＡの発現の欠失は特異的組織学的サブタイプと非常に有意な 関係（Ｐ＝０．００３）が見られた。（表１、NSCLCのアデノカルシノーマ） 本実施例で示した結果は、Ｉｎｔ６の発現の欠失はヒト胸部ガンの初期の現象 であり、肺ガンのような他の腫瘍形成に寄与する要素であるという結論に一致す る。 実施例１５ ネズミＩｎｔ６タンパク質の特性 Ｉｎｔ６遺伝子は５０ＫＤａのタンパク質をコードし、３つの翻訳開始点と考 えられ得る部位（マウスの配列の２７ｂｐ，１７４ｂｐおよび１８９ｂｐ）を有 する。これらの各々のポリペプチドは、ウサギの網赤血球システムにおけるＩｎ ｔ６ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳の産物として検出された。マウスのＩｎｔ６ の５７−７１（ペプチド４７）残基および、２６２−２８１（ペプチド２０）残 基のアミノ酸に一致する合成ペプチドに対するウサギのポリクローン血清を調製 し、Ｉｎｔ６のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物の免疫沈降に用いた。この免疫沈降は 対応するペプチドにより競合される。大人のマウス組織（脳、肺、腎臓、筋肉、 心臓及び乳腺）のタンパク質抽出液のペプチド２０（ｒＡＢ２０）に対する抗体 を用いたウェスタンブロット解析で、８０ｋＤのポリペプチドの３量体同様に主 要な４０ｋＤａポリペプチドが検出された。これらのポリペプチドとの反応はペ プチド２０により競合される。興味深いことに、唾液線抽出液のウェスタンブロ ットで３０ＫＤのＩｎｔ６関連ポリペプチドの発現もまた観察された。４０ＫＤ ポリペプチドは５０ＫＤａ前駆体の切断産物であり、８０ＫＤの交差反応したポ リペプチドは４０ＫＤのペプチドの２量体であると考えられる。 さらに、細胞画分研究および上記のペプチドに対する抗体を用いた免疫蛍光の 研究で、Ｉｎｔ６は主に細胞質に局在する事が示された。さらにマウス胚の免疫 蛍光研究で、Ｉｎｔ６タンパク質はゴルジ体に局在する事が示された。 最後にタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位の３つの候補を含むＩｎ ｔ６タンパク質を、QUIA Express Type ４ベクター（Quiagen,Chatsworth CA） をもちいて細菌中で発現し、精製し、ＰＫＣによりリン酸化されることが示され た（データは示さない）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 51/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/574 Ａ６１Ｋ 39/395 33/577 43/00 // Ａ６１Ｋ 39/395 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブッティッタ，フィアマ イタリア国イ−ヴィアレッジオ，ヴィア・ デル・パルティジアーニ 29ア (72)発明者 スミス，ギルバート・エイチ アメリカ合衆国ヴァージニア州20073，フ ォールズ・チャーチ，ロックモント・コー ト 6607 (72)発明者 キャラハン，ロバート アメリカ合衆国ヴァージニア州22302，ア レクサンドリア，ウッドランド・テラス 514

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 精製かつ単離されたＩｎｔ６遺伝子。 ２． 配列番号：３に記載の核酸配列を含む精製かつ単離されたＩｎｔ６遺伝子 。 ３． 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする精製 かつ単離されたＩｎｔ６遺伝子。 ４． 配列番号：３に記載の配列を有するｃＤＮＡ。 ５． 上記ｃＤＮＡがＡＴＣＣ受託番号９７０２９および９７０３０を有する、 請求の範囲第４項記載のｃＤＮＡ。 ６． 試料をＩｎｔ６遺伝子から誘導された少なくとも１個のヌクレオチド配列 と接触させることを含む、試料の分析方法。 ７． 上記分析の工程がサザンブロット分析におけるプローブとして上記ヌクレ オチド配列を使用することを含む、請求の範囲第６項記載の方法。 ８． 使用される上記プローブが野生型Ｉｎｔ６遺伝子配列から誘導される、請 求の範囲第７項記載の方法。 ９． 上記配列がｃＤＮＡである、請求の範囲第８項記載の方法。 １０． 上記ｃＤＮＡが配列番号：３に記載の配列を含む。請求の範囲第９項記 載の方法。 １１． 上記分析の工程がノザンブロット分析におけるプローブとして上記ヌク レオチド配列を使用することを含む、請求の範囲第６項記載の方法。 １２． 上記プローブが配列番号３に記載の配列を有するｃＤＮＡから誘導され る、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３． 上記分析の工程がＰＣＲプライマーとして上記ヌクレオチド配列を使用 することを含む、請求の範囲第６項記載の方法。 １４． 上記プライマーが野生型Ｉｎｔ６遺伝子配列から誘導される、請求の範 囲第１３項記載の方法。 １５． 上記分析の工程がＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析における上記プライマーを使用 することを含む、請求の範囲第１４項記載の方法。 １６． 上記プライマーが配列番号：５から配列番号２８の中から選択される、 請求の範囲第１５項記載の方法。 １７． 上記配列が配列番号：３に記載のｃＤＮＡ配列である、請求の範囲第１ ４項記載の方法。 １８． 上記分析の工程がＲＴ−ＰＣＲ分析において上記プライマーを使用する ことを含む、請求の範囲第１７項記載の方法。 １９． 上記分析の工程がＲＴ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析において上記プライマー を使用することを含む、請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０． Ｉｎｔ６遺伝子配列から誘導された精製かつ単離されたプライマーであ って、Ｉｎｔ６遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることができる上記プラ イマー。 ２１． 上記配列が野生型Ｉｎｔ６遺伝子のイントロン配列である、請求の範囲 第２０項記載のプライマー。 ２２． 上記プライマーが、配列番号：５から２８および配列番号：３１および ３２に示される配列を有している、請求の範囲第２１項記載のプライマー。 ２３． 試料を分析するために有用な診断キットにおいて、配列番号：５から２ ８および配列番号：３１および３２から成る群から選択される核酸配列を有する プライマーを含む上記のキット。 ２４． 上記配列がｃＤＮＡである、請求の範囲第２０項記載のプライマー。 ２５． 上記ｃＤＮＡが配列番号：３に記載の配列を有する、請求の範囲第２４ 項記載のプライマー。 ２６． 試料を分析するために有用な診断キットにおいて、配列番号：３に示さ れるコード配列を有するＩｎｔ６遺伝子配列から誘導された少なくとも１個の核 酸配列であって、Ｉｎｔ６遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる上 記核酸配列、を含む上記のキット。 ２７． Ｉｎｔ６タンパク質に対してまたはそれから誘導されたペプチド断片に 対して指向した抗体を試料と接触させることを含む試料の分析方法。 ２８． 上記分析の工程が免疫組織化学分析を含む、請求の範囲第２７項記載の 方法。 ２９． 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する組み換えＩｎｔ６タンパク 質またはそのペプチド断片。 ３０． Ｉｎｔ６タンパク質またはそれから誘導されたペプチドの宿主生物合成 を指令できる精製かつ単離された核酸配列。 ３１． 請求の範囲第３０項の核酸配列を含む組み換え発現ベクター。 ３２． 上記核酸配列が配列番号：３に含まれている、請求の範囲第３１項記載 の組み換え発現ベクター。 ３３． 請求の範囲第３０項の組み換え発現ベクターを含む医薬組成物。 ３４． Ｉｎｔ６タンパク質またはそれから誘導されたペプチドに対する特異的 結合親和性を有する抗体。 ３５． 上記抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第３４項記載の抗体 。 ３６． 毒素、放射ヌクレオチドまたは医薬に結合した請求の範囲第３４項記載 の抗体を含む医薬組成物。 ３７． 請求の範囲第２９項記載の組み換えＩｎｔ６タンパク質を含む医薬組成 物。 ３８． 薬学的に許容できる担体中に請求の範囲第２８項記載の組み換えタンパ ク質を含むワクチン。 ３９． 薬学的に許容できる担体中に請求の範囲第３１項記載の組み換え発現ベ クターを含むワクチン。 ４０． 癌を有する被験者のための免疫治療の方法において、上記被験者に請求 の範囲第３３項記載の医薬組成物を有効量において投与することを含む上記の方 法。 ４１． 癌を有する被験者のための免疫治療の方法において、上記被験者に請求 の範囲第３６項記載の医薬組成物を有効量において投与することを含む上記の方 法。 ４２． 癌を有する被験者のための免疫治療の方法において、上記被験者に請求 の範囲第３７項記載の医薬組成物を有効量において投与することを含む上記の方 法。 ４３． 請求の範囲第３１項記載の組み換えベクターで形質転換またはトランス フェクトした宿主細胞。 ４４． 上記細胞が原核細胞である、請求の範囲第４３項記載の宿主細胞。 ４５． 上記細胞が真核細胞である、請求の範囲第４３項記載の宿主細胞。