WO2006123644A1 - 低酸素ストレス応答に関与するInt6タンパク質、およびその利用 - Google Patents

低酸素ストレス応答に関与するInt6タンパク質、およびその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2006123644A1
WO2006123644A1 PCT/JP2006/309720 JP2006309720W WO2006123644A1 WO 2006123644 A1 WO2006123644 A1 WO 2006123644A1 JP 2006309720 W JP2006309720 W JP 2006309720W WO 2006123644 A1 WO2006123644 A1 WO 2006123644A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
int6
protein
gene
expression
angiogenesis
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/309720
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Futoshi Shibasaki
Li Chen
Kazuhiko Sakata
Original Assignee
Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Caretis Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research, Caretis Co., Ltd. filed Critical Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Priority to JP2007516291A priority Critical patent/JPWO2006123644A1/ja
Priority to AU2006248487A priority patent/AU2006248487A1/en
Priority to EP06746434A priority patent/EP1902729A1/en
Priority to CA002609102A priority patent/CA2609102A1/en
Publication of WO2006123644A1 publication Critical patent/WO2006123644A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to an Int6 protein that controls hypoxic stress response, a vascular disease therapeutic agent or anticancer agent containing a substance that controls the expression or function of the protein, and a screening method for the agent.
  • oxygen deficiency is an important issue related to the survival of life.
  • Possible causes of hypoxia in an organism include anemia, abnormal cardiopulmonary function, and highland life.
  • each cell in the body tries to adapt to hypoxic stress by changing the expression pattern of various genes. For example, activation of glycolysis and induction of angiogenesis occur as a response to cellular hypoxic stress.
  • HRE hypoxic stress response elements
  • Transcription factor HIF hyperoxia-inducible factor; hypoxia-responsive factor
  • HIF has been analyzed in detail, creating VEGF (vascular endothelial growth factor), which is essential for tumor angiogenesis, and transcription of many glycolytic enzymes involved in mitochondrial energy metabolism. It is known to perform control.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HIF plays a variety of roles in the cell, such as energy metabolism, erythrocyte proliferation, iron metabolism, cell proliferation, cell death, and dopamine.
  • HIF1 hypoxia inducible factor 1
  • HLF HLF1 like factor
  • GATA-2 GATA-2
  • pVHL binds to HIF1a, and HIF1a is degraded by ubiquitination.
  • PHD proline hydroxylase
  • HIF is broadly divided into three types: HIF1 a, HIF2 a, and HIF3 a.
  • HIF2 a is expressed in vascular endothelial cells, skeletal muscle, myocardium, etc.
  • ischemic diseases such as cerebral infarction or myocardial infarction (see Non-Patent Documents 1 to 4).
  • HIF2a is involved in cancer angiogenesis among diseases associated with hypoxic stress (see Non-Patent Document 5).
  • HIF2 ct several factors that bind to it have been reported, but the factors that control its function have been clarified.
  • Patent ⁇ ! 3 ⁇ 4U Semenza GL. ⁇ , “HI _l and mechanisms of hypoxia sensing.”, Curr Opin Cell BioL, 2001 Apr, Vol.13 (2), p.167-71.
  • Non-Patent Document 2 Giaccia A, 2 other authors, "HIF_1 as a target for drug development.”, 2003 Oct, 2 (10), p.803-11.
  • Non-Patent Document 3 Jelkmann W., "Effects of erythropoietin on brain function.”, Curr P harm Biotechnol., 2005 Feb, Vol. 6 (l), p.65- 79
  • Non-Patent Document 4 Marti HH., “Erythropoietin and the hypoxic brain.”, J Exp Biol., 2004, Aug., Vol. 207 (Pt 18), p.3233—42.
  • Non-Special Terms 5 Favier J, 3 others, ⁇ Coexpression of endothelial PAS protein 1 with e ssential angiogenic factors suggests its involvement in human vascular development. '', Dev Dyn., 2001 Nov, VoL222 (3), p.377-88
  • the present invention has been made in view of these circumstances, and aims to elucidate the mechanism of gene expression response during hypoxic stress related to angiogenesis.
  • the purpose is to identify factors that control the function of HIF2a that promotes the oxygen stress response. More specifically, a drug for controlling a hypoxic stress response, a drug having a therapeutic effect on a vascular disease, and a means for solving the problems to be provided as a screening method for the drug
  • the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and as a result, as a factor involved in the hypoxic stress response that promotes angiogenesis, Int6 having binding activity with HIF2a is newly added. Successfully identified.
  • Substances that inhibit Int6 gene expression or Int6 function enhance the angiogenic effect by enhancing the transcriptional action of HIF2a on hypoxic stress response gene It is expected.
  • the substance is expected to have a high angiogenic effect, and is expected to have a therapeutic effect on various vascular diseases such as obstructive arteriosclerosis, restenosis after percutaneous vasodilatation (PCT), myocardial infarction and the like.
  • PCT percutaneous vasodilatation
  • the present inventors produced an experimental animal in which the expression of Int6 gene was suppressed by siRNA, and found that the angiogenic effect was actually increased in the experimental animal. Therefore, a substance that inhibits the expression or function of Int6 has been successfully confirmed at the level of animal experiments to actually effectively increase the angiogenic effect.
  • siRNA which is expected to suppress the expression of the Int6 gene specifically, mimics the expression of transcription regulators. It is highly expected to become a completely new therapeutic agent for vascular diseases that enhances the expression of genes that have therapeutic effects on vascular diseases.
  • a substance that enhances the expression or function of Int6 is expected to suppress the angiogenic effect by decreasing the hypoxic stress response gene transcription promoting action of HIF2a. Since the angiogenic effect is increased in cancer tissues, the substance is considered to be a new anticancer agent whose mechanism is to suppress angiogenesis.
  • female hormones enhance the hypoxic stress response gene transcription promoting action of HIF2a by suppressing the expression of Int6 gene, thereby promoting angiogenesis. Therefore, female hormones are effective in the treatment of diseases (such as obstructive arteriosclerosis) that can improve the disease state by improving blood volume, for example.
  • diseases such as obstructive arteriosclerosis
  • female hormone inhibitors are expected to have, for example, an anticancer effect by inhibiting angiogenesis.
  • the present invention relates to a drug that controls a hypoxic stress response, a drug that has a therapeutic effect on vascular disease or cancer, and a screening method for the drug.
  • Int6 protein function inhibitor is selected from the group consisting of the following (a) to (c) The hypoxic stress response promoter according to [1], which is a compound,
  • hypoxic stress response promoter according to any one of [1] to [4], wherein the hypoxic stress response promotion is induction of angiogenesis
  • a hypoxic stress response inhibitor comprising an Int6 protein expression enhancing substance or a function enhancing substance as an active ingredient
  • hypoxic stress response inhibitor according to [7], wherein the hypoxic stress response suppression is suppression of angiogenesis
  • a therapeutic agent for vascular disease comprising the hypoxic stress response promoter according to any one of [1] to [5] as an active ingredient,
  • the therapeutic agent for vascular disease according to [9], wherein the vascular disease is ischemic brain or heart disease, neurodegenerative disease, traumatic brain disorder, or liver, knee, muscle, or skin disease, 1 1]
  • An angiogenesis-related disease therapeutic agent for example, an anticancer agent
  • a screening method for a therapeutic agent for vascular diseases comprising selecting a compound that decreases the expression level of Int6 gene or the activity of Int6 protein,
  • a screening method for a therapeutic agent for vascular disease comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a therapeutic agent for vascular disease comprising the following steps (a) to (c):
  • (c) a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared to the case where measurement is performed in the absence of the test compound.
  • a screening method for a therapeutic agent for vascular diseases comprising the following steps (a) to (c):
  • (c) a step of selecting a compound that reduces the activity of the protein as compared to the case where it is measured in the absence of the test compound.
  • a screening method for a therapeutic agent for vascular disease comprising selecting a compound that suppresses the binding activity between Int6 protein and HIF2 ⁇ protein,
  • a screening method for a therapeutic agent for vascular disease comprising the following steps (a) to (c):
  • (c) a step of selecting a compound that reduces the binding activity as compared with the case where it is measured in the absence of the test compound.
  • a screening method for an angiogenesis-related disease therapeutic drug comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for an angiogenesis-related disease therapeutic drug comprising the following steps (a) to (c):
  • (c) a step of selecting a compound that increases the expression level as compared with the case where it is measured in the absence of the test compound.
  • a screening method for an angiogenesis-related disease therapeutic drug comprising the following steps (a) to (c):
  • (c) a step of selecting a compound that increases the activity of the protein as compared to the measurement in the absence of the test compound.
  • a screening method for a therapeutic agent for angiogenesis-related diseases comprising selecting a compound that enhances the binding activity between Int6 protein and HIF2 ⁇ protein,
  • a screening method for an angiogenesis-related disease therapeutic drug comprising the following steps (a) to (c):
  • (c) a step of selecting a compound that increases the binding activity as compared to the measurement in the absence of the test compound.
  • a screening method for an angiogenesis-related disease therapeutic drug comprising the following steps (a) to (c):
  • the present invention provides the following.
  • An angiogenesis inducer comprising a dominant negative mutant of Int6 as an active ingredient.
  • An angiogenesis inhibitor comprising an Int6 protein or a vector expressing Int6 protein as an active ingredient. (Preferably, an angiogenesis inhibitor in cancer cells)
  • An angiogenesis inhibitor in cancer cells [32] A carrier cell characterized in that expression of Int6 gene is suppressed and angiogenesis is induced.
  • a therapeutic agent for vascular diseases comprising the angiogenesis inhibitor according to [31] or the carrier cell according to [32] or [33] as an active ingredient.
  • a method for producing a therapeutic agent for vascular diseases comprising a step of introducing siRNA for the Int6 gene into an isolated carrier cell.
  • a method for treating a vascular disease comprising a step of administering an effective amount of the following (a) to (c): (a) Hypoxic stress response promoter of the present invention
  • a method for treating a vascular disease comprising the following steps (a) and (b):
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a siRNA expression vector that suppresses Int6 gene expression (layout 1J).
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of suppressing transcriptional activity of HIF2a by Int6.
  • FIG. 3 is a diagram and a photograph showing the effect of suppressing the expression of endogenous Int6 gene by Int6 siRNA.
  • FIG. 4 is a photograph showing the anti-angiogenic effect of Int6 by siRNA.
  • FIG. 5 shows cells treated with estradione monole (E2), progesteron (Progestin), or estrogen receptor inhibitor tamoxifen (40H-TAM) and cultured for 24 hours.
  • E2 estradione monole
  • Progestin progesteron
  • 40H-TAM estrogen receptor inhibitor tamoxifen
  • FIG. 6 is a diagram showing a mechanism of HIF regulation by ubiquitin and factors induced by transcriptional activity.
  • FIG. 7 summarizes the matters relating to the novel HIF2a binding factor identified by the yeast Two Hybrid method.
  • FIG. 8 is a diagram showing the relationship between Int6 mutation by MMTV and HIF2a.
  • FIG. 9 shows that siRNA treatment secretes angiogenic factors by introducing synthetic Int6-siRNA.
  • FIG. 3 is a diagram showing a basic concept of a neovascular bypass treatment method by autotransplantation using “angiogenesis-inducing cells”.
  • FIG. 10 is a conceptual diagram of neovascular bypass therapy using siRNA-treated angiogenesis-inducing cells.
  • FIG. 11 is a diagram showing the binding characteristics of Int6 to HIF2.
  • FIG. 12 is a diagram showing a HIF2 binding site of Int6.
  • Fig. 13 shows transcription of HIFla, HIF2a, and HI F3a of Int6 wild-type and constitutively inactivated (dominant negative) mutant Int6 AC in normoxia or hypoxia It is a graph which shows activity.
  • FIG. 14 is a photograph showing the result of remarkable angiogenesis induction in the subcutaneous mouse using an Int6-siRNA expression vector.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of quantitative analysis of angiogenesis by Int6-siRNA.
  • the left graph shows neovascular area (AREA), and the right graph shows neovascular length (LENGTH).
  • FIG. 16 is a photograph showing a histopathological image of a blood vessel born by Int6-siRNA. Arrows in the picture indicate newly born blood vessels.
  • a substance that suppresses (inhibits) the expression or function (activity) of Int6 has a function of promoting a hypoxic stress response by enhancing the function of a HIF2 transcriptional regulatory factor. It was issued.
  • the present invention provides a hypoxic stress response promoter containing a substance that suppresses the expression of Int6 protein or a substance that suppresses function as an active ingredient.
  • the Int6 gene of the present invention is known to exist in various organisms including humans.
  • the Int6 gene is known to be the same gene as eIF3e / p48, which is one of the components of the translation regulatory factor Translation Initiation Factor, and is equivalent to the Int6 gene in humans, mice, rats, and force L A gene (homologous gene, homolog) has been identified.
  • the Int6 protein of the present invention is preferably a Hnt6 protein.
  • human Hnt6 protein such as mammals such as orangutans, chimpanzees, dogs, mice, and rats (rats), birds such as chickens, and African animals. Even homologues in amphibians such as mega frogs.
  • GenBank has an accession number of NM_0 01568. The names of gene databases related to Int6 homologues in the above non-human species and the accession numbers in the gene database are shown below.
  • Orangutan emb: CR860517.1
  • Inu ref: XM_532304.1
  • Rat gb: BC082087.1
  • Mouse ref : NM—008388.1
  • chimpanzee ref: XM—519906.1
  • chicken emb: AJ719829.11, ref: NM_001006349.1
  • African frog gb: AF162775.1, AF162775
  • the nucleotide sequence of a gene encoding Int6 in human is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Even proteins other than those described above exhibit high homology (usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more) with the sequences described in the sequence listing of the present application.
  • a protein having a function possessed by Int6 (for example, a function of binding to HIF2a protein) is included in Int6 of the present invention.
  • the protein is a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are appended, deleted, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, for example, and the number of normally changing amino acids is 30 amino acids Within 10 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids, most preferably within 3 amino acids.
  • the "Int6 protein" of the present invention can be prepared not only as a natural protein but also as a recombinant protein using a gene recombination technique. Natural proteins can be prepared by, for example, using affinity chromatography using antibodies against Int6 protein against cell (tissue) extracts that are thought to express Int6 protein. It is. On the other hand, the recombinant protein can be prepared by culturing cells transformed with DNA encoding Int6 protein.
  • hypoxic stress responsive agent is more specifically a gene that responds due to hypoxic stress (referred to as “hypoxic stress responsive gene” in the present specification). It can be said that it is a drug having a function of increasing the expression of (in some cases). More specifically, the hypoxic stress response gene in the present invention is a gene whose transcription is controlled by HIF2 and is usually a gene involved in induction of angiogenesis. There are usually multiple hypoxic stress response genes in various organisms.
  • the hypoxic stress response gene of the present invention includes, for example, human VEGF (Vascular endothelial growth factor) ⁇ erythropoietin, IGF, insulin growth factor-1
  • human VEGF Vascular endothelial growth factor
  • IGF erythropoietin
  • IGF insulin growth factor-1
  • examples thereof include a gene encoding a glucose transporter carbonic anhydrase IX, a transforming growth factor.
  • the substance that suppresses the expression or function of Int6 of the present invention has a function of enhancing the expression of the above-mentioned gene, for example.
  • ischemia in which blood flow is generally decreased is accompanied by improvement in blood volume by angiogenesis.
  • diseases that can improve the pathological condition For example, a vascular disease etc. are mentioned.
  • obstructive arteriosclerosis restenosis after percutaneous vasodilation, myocardial infarction, cerebral infarction or ischemic brain disease such as cerebral hemorrhage, Alzheimer's disease or Parkinson's disease, or spinocerebellar degeneration
  • Neurodegenerative diseases such as infectious diseases, neurological diseases including traumatic brain disorders such as spinal cord injury or brain contusion, liver diseases such as cirrhosis, and atrophic muscle disease.
  • the Int6 protein expression-suppressing substance includes, for example, a substance that inhibits Int6 transcription or translation from the transcription product.
  • Preferred examples and embodiments of the expression-suppressing substance of the present invention include a compound (nucleic acid) selected from the group consisting of the following (a) to (c).
  • Nucleic acid in the present invention means RNA or DNA. Chemically synthesized nucleic acid analogs such as so-called PNA (p-marked tide nucleic acid) are also included in the nucleic acids of the present invention. PNA is a nucleic acid The basic skeletal structure pentose / phosphate skeleton is replaced with a polyamide skeleton with glycine units, and it has a three-dimensional structure very similar to nucleic acid.
  • the nucleic acid of the present invention also includes so-called LNA (Locked Nucleic Acid).
  • antisense nucleic acids inhibit the expression of target genes by inhibiting various processes such as transcription, splicing or translation (Hirashima and Inoue, Shinsei Kagaku Kogaku Kenkyu 2 Nucleic acid IV gene replication and expression, Japan (Biochemical Society, Tokyo Chemical Doujin, 1993, 319-347.)
  • the antisense nucleic acid used in the present invention may inhibit the expression of the Int6 gene by any of the actions described above. In one embodiment, it is considered effective to inhibit gene translation if an antisense probe complementary to the non-translation region near the 5 ′ end of the Int6 gene mRNA is designed. In addition, it is possible to use a cage complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region. Thus, the nucleic acid containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the Int6 gene is also included in the antisense nucleic acid used in the present invention.
  • the antisense nucleic acid to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal by using a known method.
  • Sequence of antisense nucleic acid Is preferably a sequence complementary to the endogenous Int6 gene or a part thereof possessed by the animal to be transformed, but may not be completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed.
  • the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcript of the target gene.
  • the length of the antisense nucleic acid is preferably at least 15 bases and less than 25 bases. Is not necessarily limited to this length, and may be, for example, 100 bases or more, or 500 bases or more.
  • the antisense of the present invention is not particularly limited, but can be prepared, for example, based on the base sequence of the Int6 gene obtained with GenBank accession number NM001568.
  • Ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Some ribozymes have various activities, but research focused on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner. Some ribozymes have a size of 400 nucleotides or more, such as group I introns and Ml RNA contained in RNase P. Some have a 40-nucleotide active domain called hammerhead or hepin. (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 1990, 35, 2191.).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme has the ability to cleave 3 'of C15 in the sequence G13U14C15.
  • base pairing between U14 and A9 is important. It has been shown that A15 or U15 can also be cleaved instead of (Koizumi, Tsuji et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.).
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention.
  • This ribozyme is an example For example, it is found in the minus strand of the satellite RNA of tobacco ring spot virus (Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.). It has been shown that hairpin ribozyme can also generate target-specific RNA cleavage ribozymes (Kikuchi, Y. & Sasaki, Tsuji, Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751., Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1992, 30, 112.). Thus, the expression of the gene can be inhibited by specifically cleaving the transcript of the Int6 gene in the present invention using a ribozyme.
  • RNA interference (hereinafter abbreviated as “R NAij”) has attracted attention as a technique that can suppress gene expression more effectively.
  • RNAi is a short double-stranded RNA consisting of a sense RNA composed of a sequence homologous to the mRNA of the target gene and an antisense RNA composed of a complementary sequence (hereinafter abbreviated as “dsRNA”). Is a phenomenon that can induce the destruction of the target gene mRNA and suppress the expression of the target gene.
  • RNAi can suppress the expression of target genes in this way, it can be used as a simple gene knockout method instead of the conventional complicated and low efficiency homologous recombination method or applied to gene therapy. It attracts attention as a possible method.
  • the RNA used for RNAi is not necessarily completely identical to the Int6 gene or a partial region of the gene, but preferably has complete homology.
  • RNAiRNA double-stranded RNA
  • siRNA capable of sense RNA and anti-sense RNA against the partial sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the power of DICER comes into contact with double-stranded RNA, and the double-stranded RNA is small iterfering RNA or It is thought to be broken down into small fragments called siRNAs.
  • the double-stranded RNA having the RNAi effect in the present invention includes double-stranded RNA before being digested by DICER as described above. That is, there is no RNAi effect in the length as it is Since such a long RNA is expected to be degraded into siRNA having an RNAi effect in cells, the length of the double-stranded RNA in the present invention is not particularly limited.
  • RNA corresponding to the full length or almost full length region of the mRNA of the Int6 gene of the present invention is decomposed in advance with, for example, DICER, and the degradation product is used as the drug of the present invention.
  • This degradation product is expected to contain double-stranded RNA molecules (siRNA) having the RNAi effect.
  • siRNA double-stranded RNA molecules
  • it is not necessary to particularly select a region on mRNA that is expected to have an RNAi effect. That is, the region on the mRNA of the Int6 gene of the present invention having an RNAi effect does not necessarily have to be accurately defined.
  • RNA molecules having one end closed in the above RNA molecule for example, siRNA (shRNA) having a hairpin structure is also included in the present invention. That is, a single-stranded RNA molecule that can form a double-stranded RNA structure in the molecule is also included in the present invention.
  • shRNA siRNA
  • double-stranded RNA that can be suppressed by the RNAi effect is appropriately prepared by those skilled in the art based on the base sequence of the Int6 gene of the present invention that is the target of the double-stranded RNA. That's the power S.
  • the double-stranded RNA of the present invention can be prepared based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • DNA (vector) capable of expressing the RNA of the present invention is also included in a preferred embodiment of the compound capable of suppressing the expression of the Int6 gene of the present invention.
  • the DNA (vector) capable of expressing the double-stranded RNA of the present invention has a DNA that encodes one strand of the double-stranded RNA and a DNA force that encodes the other strand of the double-stranded RNA. So that each can express DNA with a structure linked to a promoter.
  • the above DNA of the present invention can be appropriately prepared by those skilled in the art using general genetic engineering techniques. More specifically, the expression vector of the present invention can be prepared by appropriately inserting a DNA encoding the RNA of the present invention into various known expression vectors.
  • the expression-suppressing substance of the present invention includes, for example, a compound that suppresses Int6 expression by binding to an Int6 expression regulatory region (for example, a promoter region).
  • the compound can be obtained, for example, by a screening method using an Int6 promoter DNA fragment and the binding activity with the DNA fragment as an index.
  • those skilled in the art can appropriately determine whether or not the expression of Int6 of the present invention is suppressed for a desired compound by a known method such as a reporter assay method.
  • a DNA (vector) capable of expressing the RNA of the present invention is also included in a preferred embodiment of the compound capable of suppressing the expression of the Int6 gene of the present invention.
  • the DNA (vector) capable of expressing the double-stranded RNA of the present invention has a DNA that encodes one strand of the double-stranded RNA and a DNA force that encodes the other strand of the double-stranded RNA.
  • Each DNA has a structure linked to a promoter so that it can be expressed.
  • the above DNA of the present invention can be appropriately prepared by those skilled in the art using general genetic engineering techniques. More specifically, the expression vector of the present invention can be prepared by appropriately inserting DNA encoding the RNA of the present invention into various known expression vectors.
  • a preferred embodiment of the vector of the present invention includes a vector that expresses siRNA that suppresses Int6 expression.
  • the base sequence of the region expressing siRNA in the vector can include the sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NOs: 5 to 7), but is not particularly limited thereto.
  • siRNA of the present invention an siRNA having a structure in which the sequences of the regions described as sense oligo and antisense oligo in each base sequence shown in Fig. 1 are hybridized is preferably used. Can show.
  • the expression-suppressing substance of the present invention includes, for example, a compound that suppresses Int6 expression by binding to an Int6 expression regulatory region (for example, a promoter region).
  • an Int6 expression regulatory region for example, a promoter region
  • the compound uses an Int6 promoter DNA fragment and exhibits binding activity to the DNA fragment. It can be obtained by a screening method used as an index.
  • those skilled in the art can appropriately determine whether or not the expression of Int6 of the present invention is suppressed for a desired compound by a known method such as a reporter assay method.
  • the present invention also provides a hypoxic stress response promoter containing an Int6 protein function inhibitor as an active ingredient. Since Int6 protein binds to HIF2a and has the function of suppressing the function of HIF2a, suppressing the function of Int6 protein activates the function of HIF2 and transcribes the transcription function of the hypoxic stress response gene. Be enhanced. Therefore, a substance that suppresses the function of Int6 protein is considered to be effective as a hypoxic stress response promoter.
  • Examples of the function inhibitor of Int6 protein in the present invention include the following compounds (a) to (c).
  • Antibodies that bind to Int6 protein can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a polyclonal antibody can be obtained, for example, as follows. Serum is obtained by immunizing small animals such as rabbits with recombinant (recombinant) Int6 protein expressed in microorganisms such as Escherichia coli as a fusion protein with natural Int6 protein or GST. This is prepared by, for example, purification using ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with Int6 protein or synthetic peptide, or the like.
  • a monoclonal antibody for example, a small animal such as a mouse is immunized with the Int6 protein or a partial peptide thereof, the spleen is removed from the mouse, and this is ground to separate the cells.
  • a myeloma cell is fused with a reagent such as polyethylene glycol, and a clone that produces an antibody that binds to the Int6 protein is selected from the resulting fused cell (neubridoma).
  • the obtained hybridoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the resulting monoclonal antibody was purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange gel. It can be prepared by purification with a mouth column, affinity column coupled with Int6 protein or synthetic peptide.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it binds to the Int6 protein of the present invention.
  • a human antibody, a humanized antibody by genetic recombination, and an antibody fragment or antibody thereof Modified products are also included.
  • the Int6 protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or a human. Derived proteins are preferred. Those skilled in the art can appropriately obtain human-derived proteins using the gene sequences or amino acid sequences disclosed in the present specification.
  • the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein.
  • the partial peptide of the protein include an amino group (N) terminal fragment and a carboxy (C) terminal fragment of the protein.
  • antibody means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • human lymphocytes such as human lymphocytes infected with EB virus are sensitized in vitro with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof. And sensitized lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells having permanent mitotic activity, such as U266, to obtain a hyperidoma that produces a desired human antibody having a protein binding activity.
  • the antibody against the Int6 protein of the present invention inhibits the function of the Int6 protein by binding to the Int6 protein, and is expected, for example, to treat or improve vascular diseases.
  • a human antibody or a human type antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
  • the present invention also includes a low molecular weight substance (low molecular weight compound) that binds to Int6 protein as a substance that can inhibit the function of Int6 protein.
  • the low molecular weight substance that binds to the Int6 protein of the present invention may be a natural or artificial compound. Usually, it is a compound that can be produced or obtained by using methods known to those skilled in the art. The present invention The compound can also be obtained by the screening method described below.
  • Examples of the low molecular weight compound that binds to Int6 protein (b) and suppresses its function include compounds having high affinity for Int6.
  • a preferred embodiment of the Int6 function-suppressing substance of the present invention includes a compound that inhibits the binding (interaction) between Int6 and HIF2a. This compound is thought to increase the amount of HIF2a that functions as a transcription factor in a free state by inhibiting the binding to HIF2 human Int6, and as a result, promotes the transcription of hypoxic stress response genes. .
  • an Int6 protein mutant having a dominant negative property with respect to the Int6 protein
  • “Int6 protein mutant having a dominant negative property with respect to Int6 protein” means a protein having a function of eliminating or reducing the activity of an endogenous wild-type protein by expressing a gene encoding the protein. Point to. More specifically, examples of the Int6 dominant negative protein include proteins that have lost the binding activity to HIF2a.
  • Int6 dominant negative protein examples include proteins lacking the C-terminal of Int6 protein ( ⁇ 6- ⁇ .
  • Int6_AC is the C-terminal region of Int6 protein.
  • Int6 protein mutants lacking the PINT region see Fig. 2.
  • hypoxic stress response promoter provided by the present invention has an effect of inducing (promoting) angiogenesis, it is expected to have a therapeutic effect on vascular diseases.
  • the present invention provides a vascular disease therapeutic agent (pharmaceutical composition) containing the hypoxic stress response promoter of the present invention as an active ingredient.
  • the substance that enhances the expression or function of Int6 of the present invention is expected to have a function of reducing the hypoxic stress response by reducing the function of the HIF2 ⁇ transcriptional regulatory factor.
  • a hypoxic stress response inhibitor comprising: The above “enhancement of protein expression” includes enhancement of transcription from a gene and enhancement of translation from the transcription product.
  • Examples of the substance include substances that promote the binding (interaction) between Int6 and HIF2a.
  • the substance can be appropriately obtained by screening a substance that enhances the binding activity using the binding activity between Int6 protein and HIF2 protein as an index.
  • the hypoxic stress response inhibitor provided by the present invention has an effect of inhibiting (inhibiting) angiogenesis, it is useful for diseases associated with angiogenesis (angiogenesis-related diseases) such as cancer. It is expected to have a therapeutic effect on it.
  • diseases associated with angiogenesis include breast cancer, colon cancer, oral cancer, pharyngeal / laryngeal cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer and the like.
  • diseases that can be expected to have a therapeutic effect by suppressing angiogenesis include diseases in which abnormal blood vessels increase in the retina, such as diabetic retinopathy, and pulmonary hypertension.
  • suppression of the function of the HIF2a transcriptional regulatory factor may have an effect on erythrocytosis or abnormal glucose metabolism in diabetes, which not only suppress (inhibit) angiogenesis.
  • female hormones suppress the expression of Int6. That is, it is considered that female hormones enhance the hypoxic stress response gene transcription promoting action of HIF2 ⁇ by suppressing the expression of Int6 gene and, as a result, promote angiogenesis. Therefore, female hormones are effective for the treatment of diseases (for example, obstructive arteriosclerosis, etc.) that can improve the pathological condition by improving blood volume, for example.
  • diseases for example, obstructive arteriosclerosis, etc.
  • female hormones can be preferably shown. More specifically, the female hormone can be exemplified by estrogen, progesterone and the like. In addition to female hormones, examples of substances that enhance the expression or function of Int6 protein include female hormone secretion promoters and female hormone receptor agonists.
  • female hormone inhibitors are expected to reduce the hypoxic stress response gene transcription promoting action of HIF2a by enhancing the expression of Int6 gene, and as a result, to reduce angiogenesis. . Therefore, female hormone inhibitors can be used, for example, to suppress angiogenesis. Therefore, it is effective for treatment of diseases (for example, cancer diseases) that can improve the pathological condition.
  • diseases for example, cancer diseases
  • the present invention relates to a carrier cell characterized in that the expression of the Int6 gene is suppressed and angiogenesis is induced.
  • the cells are expected to have a therapeutic effect on vascular diseases.
  • the “carrier cell” in the present invention include fibroblasts and glial cells.
  • Int6 gene expression can be suppressed using, for example, siRNA against the Int6 gene.
  • the present invention provides a therapeutic agent for angiogenesis-related diseases (eg, anticancer agent, antitumor pharmaceutical composition) containing the hypoxic stress response inhibitor of the present invention as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for angiogenesis-related diseases eg, anticancer agent, antitumor pharmaceutical composition
  • the therapeutic agent for angiogenesis-related diseases includes a therapeutic agent for angiogenesis-related diseases, which contains a female hormone inhibitor as an active ingredient.
  • transgenic non-human animal in the present specification, “transgenic non-human animal”, “ Knockout non-human animals ", or simply” animals ").
  • transgenic non-human animal of the present invention can be suitably used, for example, for screening a drug for the treatment of a disease requiring control of a hypoxic stress response. It is also very useful as an experimental model animal for studying the hypoxic stress response and elucidating the mechanism of the above-mentioned diseases.
  • Transgenic non-human animals in the present invention include so-called “knock-down animals” in which gene expression is suppressed by the action of antisense RNA or siRNA.
  • int6 gene expression is artificially suppressed means, for example, (1) nucleotide insertion, deletion, substitution, etc. in one or both of the 1 nt6 gene pairs A state in which the gene expression is suppressed by having a gene mutation, (2) a state in which the gene expression is suppressed by the action of the nucleic acid of the present invention (for example, antisense RNA or siRNA), etc. Can be mentioned.
  • the expression of Int6 gene is completely suppressed, and the expression level of Int6 in the animal of the present invention is the same as the expression level of Int6 gene in the wild-type animal. In the case where it is significantly decreased as compared, it is included.
  • the site where the gene mutation is present in the present invention is not particularly limited as long as the expression of the gene is suppressed, and examples thereof include an exon site and a promoter site.
  • the transgenic non-human animal of the present invention can be produced by those skilled in the art by generally known genetic engineering techniques.
  • a gene knockout mouse can be prepared as follows. First, a DNA containing the exon portion of the Int6 gene of the present invention is isolated from a mouse, and an appropriate marker gene is inserted into this DNA fragment to construct a targeting vector. This targeting vector is introduced into a mouse ES cell line by, for example, the electopore position method, and a cell line that has undergone homologous recombination is selected.
  • the marker gene to be inserted is preferably an antibiotic resistance gene such as a neomycin resistance gene.
  • the obtained ES cell line can be injected into a mouse blastoderm to obtain a chimeric mouse.
  • a mouse in which one of the Int6 gene pair of the present invention is inactivated can be obtained.
  • mice in which both gene pairs of the gene of the present invention are inactivated Genetic modification can also be carried out in the same manner in animals in which ES cells other than mice have been established.
  • the knockout animal of the present invention is preferably a knockout (knockdown) animal characterized in that expression of the Int6 gene is suppressed by introducing the nucleic acid of the present invention into a non-human animal. It is. [0077]
  • the knockdown animal can also be produced by introducing a vector having a structure capable of expressing the nucleic acid of the present invention (such as antisense RNA or siRNA) into a non-human animal.
  • a non-human animal with reduced expression of Int6 is produced by injecting a siRNA expression vector having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 5 to 7 into the neck of the non-human animal subcutaneously. can do. More specifically, the transgenic non-human animal of the present invention can be produced by the method described in the examples described later.
  • the kind of the transgenic animal of the present invention is not particularly limited as long as it is a non-human animal, but is usually a mammal, preferably a primate. More specifically, the animal of the present invention is preferably a mouse, a rat, a fly, a nematode (C. Elegans), a rabbit, a pig, a bird, or a hedge, and more preferably a mouse.
  • a knockdown (transgenic) plant targeting the gene can also be produced.
  • the transgenic non-human animal of the present invention is not particularly limited, but the expression of the Int6 gene is caused by the action of any of the following nucleic acids (a) to (c). Is an animal that is suppressed.
  • the present invention also provides a method for screening a therapeutic agent for vascular diseases using the expression level or activity of Int6 as an index.
  • a compound that decreases (suppresses) the expression level of the Int6 gene is expected to be a drug for the treatment of vascular diseases. Conversely, compounds that increase (enhance) the expression level of the Int6 gene are expected to be drugs for the treatment of diseases caused by angiogenesis, such as cancer.
  • a preferred embodiment of the above method of the present invention is a screening method for a therapeutic agent for vascular disease, comprising the following steps (a) to (c).
  • Another embodiment of the method of the present invention is a screening method for an angiogenesis-related disease therapeutic drug (for example, an anticancer drug) comprising the following steps (a) to (c).
  • an angiogenesis-related disease therapeutic drug for example, an anticancer drug
  • a test compound is brought into contact with cells expressing the Int6 gene.
  • cells expressing the Int6 gene examples include cells derived from humans, mice, rats, etc., and are not particularly limited to cells derived from these, and E. coli transformed to express Int6. It is also possible to use microbial cells such as yeast.
  • microbial cells such as yeast.
  • a cell expressing the Int6 gene a cell expressing the endogenous Int6 gene or a cell into which an exogenous Int6 gene has been introduced and expressing the gene can be used.
  • a cell in which an exogenous Int6 gene is expressed can usually be prepared by introducing an expression vector in which an Int6 gene is inserted into a host cell.
  • the expression vector can be produced by general genetic engineering techniques.
  • the expression level of the Int6 gene is then measured.
  • gene expression includes both transcription and translation.
  • the gene expression level can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA is extracted from cells expressing Int6 gene according to a standard method, and the transcription amount of the gene is measured by performing Northern hybridization method or RT-PCR method using this mRNA as a cocoon. be able to.
  • the amount of translation of the gene can be measured by collecting the protein fraction from cells expressing the Int6 gene and detecting the expression of the Int6 protein by electrophoresis such as SDS-PAGE.
  • an antibody used for detecting Int6 protein any antibody can be used as long as it is a detectable antibody.
  • a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
  • a compound that decreases the expression level or a compound that increases the level is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control).
  • a compound that lowers becomes a drug for the treatment of vascular diseases, while a compound that increases increases a therapeutic agent for diseases (for example, cancer) that can exert a therapeutic effect by suppressing angiogenesis.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method of selecting a compound that decreases or increases the expression level of the Int6 gene of the present invention using reporter gene expression as an indicator.
  • a preferred embodiment of the method of the present invention is a screening method for a therapeutic agent for vascular disease, comprising the following steps (a) to (c).
  • Cells containing DNA having a structure in which a transcriptional regulatory region of the Int6 gene and a reporter gene are functionally linked include cells in which the structure is inserted into the chromosome.
  • the insertion of DNA structures into chromosomes is commonly used by those skilled in the art. For example, gene transfer using homologous recombination.
  • a cell extract containing DNA having a structure in which a transcriptional regulatory region of an Int6 gene and a reporter gene are functionally linked refers to, for example, a cell extract contained in a commercially available in vitro transcription / translation kit.
  • a cell extract contained in a commercially available in vitro transcription / translation kit there may be mentioned those obtained by adding DNA having a structure in which the transcriptional regulatory region of the Int6 gene and the reporter gene are functionally linked.
  • Another embodiment of the above-described method of the present invention is a screening method for an angiogenesis-related disease therapeutic drug (for example, an anticancer drug) including, for example, the following steps (a) to (c).
  • an angiogenesis-related disease therapeutic drug for example, an anticancer drug
  • (c) a step of selecting a compound that increases the activity of the protein as compared to the measurement in the absence of the test compound.
  • Examples include binding activity with F2a (interaction activity).
  • interaction activity Those skilled in the art can appropriately measure the activity by a known method such as immunoprecipitation or yeast two-hybrid method.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using the binding activity between Int6 protein and HIF2 ⁇ protein as an index.
  • the Int6 protein of the present invention is a protein having a binding (interaction) activity to HIF2 protein. Therefore, by using the binding activity of Int6 protein and HIF2a protein as an index, by selecting a substance that enhances or decreases (suppresses) the binding activity, it suppresses drugs or angiogenesis for the treatment of vascular diseases. By doing so, it is possible to screen for therapeutic agents for diseases (for example, cancer, etc.) that can exert therapeutic effects.
  • diseases for example, cancer, etc.
  • the above-described method of the present invention is, for example, a screening method for a therapeutic agent for vascular diseases, comprising the following steps (a) to (c).
  • Examples of the method of the present invention include a screening method for an angiogenesis-related disease therapeutic drug (for example, an anticancer drug) including the following steps (a) to (c).
  • an angiogenesis-related disease therapeutic drug for example, an anticancer drug
  • (c) a step of selecting a compound that increases the binding activity as compared to the measurement in the absence of the test compound.
  • Int6 protein and HIF2 a protein used in the above method contain mutations. However, it is preferably a wild-type protein, but may be a protein (polypeptide) in which a part of the amino acid sequence of these proteins is substituted 'deleted as long as it has interactive activity.
  • the Int6 protein used in the above method is a wild-type protein containing no mutation.
  • the region in Int6 protein involved in binding to HIF2 a protein is usually a region called “Domainl” present at the N-terminus. Therefore, the Int6 protein used in the above method may be a partial fragment peptide of the protein including “Domainl”.
  • the “0 01 1 ⁇ 111” is a region corresponding to positions 1 to 80 in the amino acid sequence of Int6 protein described in SEQ ID NO: 2.
  • the expression of the Int6 gene is suppressed, and as a result, a high angiogenic effect is observed.
  • the transgenic non-human animal it is possible to efficiently screen for compounds that suppress angiogenesis.
  • Compounds obtained by this screening method are expected as therapeutic agents for angiogenesis-related diseases (for example, anticancer agents).
  • the screening method of the present invention is a method using the transgenic non-human animal of the present invention and using Int 6 expression or function (activity) or angiogenic effect as an index.
  • the above method is a method for screening a therapeutic agent for vascular diseases, comprising the following steps (a) to (c).
  • a test compound is administered to a transgene non-human animal.
  • the test compound can be administered either orally or parenterally, but parenteral administration is preferred when the test compound is a peptide.
  • Specific examples include vascular administration, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • Examples of vascular administration include, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • a compound that decreases the expression level or activity of the Int6 gene or a compound that suppresses angiogenesis is selected compared to the case where the test compound is not administered (control).
  • the drug of the present invention can be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, diluents and the like, and can be administered orally or parenterally as a pharmaceutical composition.
  • Oral preparations can be made into dosage forms such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions.
  • a parenteral preparation a dosage form such as an injection, a drip infusion, an external medicine, or a suppository can be selected. Examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections.
  • injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections.
  • topical drugs it is possible to indicate nasal agents or ointments.
  • the preparation technique of the above dosage form so as to include the drug of the present invention as the main component is known.
  • a tablet for oral administration can be produced by adding an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, and the like to the drug of the present invention, mixing, and compression-molding.
  • excipients In general, lactose, starch, mannitol or the like is used.
  • disintegrant calcium carbonate or carboxymethyl cellulose calcium is generally used.
  • lubricant talc magnesium stearate and the like are known.
  • an injection can be obtained by dissolving the agent of the present invention as a main component together with an appropriate dispersant, or dissolving or dispersing in a dispersion medium.
  • aqueous solvent distilled water, physiological saline, Ringer's solution, or the like is used as a dispersion medium.
  • oil-based solvents various vegetable oils such as propylene glycol are used as dispersion media.
  • a preservative such as paraben can be added as necessary.
  • a known isotonic agent such as sodium salt sodium glucose can be added to the injection.
  • a soothing agent such as benzanoreconium chloride hydrochloride can be added.
  • an external preparation can be obtained by making the agent of the present invention into a solid, liquid or semi-solid composition.
  • a solid or liquid composition it can be set as an external preparation by setting it as the composition similar to what was described previously.
  • a semi-solid composition can be prepared by adding a thickener to an appropriate solvent as required.
  • the solvent water, ethyl alcohol, polyethylene glycol, or the like can be used.
  • the thickener bentonite, polybutyl alcohol, acrylic acid, methacrylic acid, or polyvinyl pyrrolidone is generally used.
  • a preservative such as salt or benzanoreconium.
  • a suppository can also be obtained by combining an oily base material such as cacao butter or an aqueous gel base material such as cellulose derivative as a carrier.
  • the necessary amount of the drug of the present invention is administered to mammals including humans within the safe dose range.
  • the dosage of the drug of the present invention can be appropriately determined finally by the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.
  • the "therapeutic agent" in the present invention includes not only a drug having a therapeutic effect but also a drug having a preventive effect.
  • Example 2 HIF1 a, HIF2 ⁇ , and specific interaction between HIF3 a and Int6 in yeast cells
  • Plasmid pM-marked HA-Int6wt was transfected into three types of cells: MCF7, A549, and COS7. Later, it was found that Int6 is expressed mainly in cell cytosol. However, due to cell death, confirmation on IF was difficult. However, Int6, which partially migrated to the nucleus, was observed to co-localize with HI F2 a.
  • Int6 was found to regulate HIF2a transcriptional activity through the PINT (PCI) domain (Fig. 2).
  • Int6_AC also promoted transcriptional activity of HIF2 ⁇ in both normoxia and hypoxia by co-expression of HIF2 human.
  • Int6 wt is also responsible for cell death of MCF7 cells. It caused the transcriptional activity of HIF2 ⁇ to be suppressed under normoxic and hypoxic conditions (Fig. 2).
  • siRNA expression plasmid and Int6_AC were co-transformed into MCF7 cells
  • the underline represents "sense oligo” and "antisense oligo”.
  • An RNA molecule having a double-stranded region functions as an siRNA.
  • HVJ-E encapsulated siRNA for one mouse was prepared as follows.
  • mice Ten-week-old female BALB / C mice (body weight around 25 g) were used in the experiment. The day before the subcutaneous injection of Int6 vector 1 siRNA, the back of the neck of the mouse was treated with a hair removal cream. On the day of the experiment, mice were anesthetized with halothane, and siRNA encapsulated in 50 ⁇ l of HVJ-E was injected subcutaneously into the back of the neck with a 27GX3 / 4 syringe. After that, they were raised for 5 days with normal feeding. Subsequently, the mouse was sacrificed by cervical dislocation, and about 1.5 cm 2 of skin was excised centering on the siRNA injection site. After photographing the back of the skin, it was fixed with formalin.
  • the mouse Int6 oligo sequence used is shown below. Each oligo sequence was prepared based on the mouse sequence.
  • estrogen estradiol, E2
  • progesteron Progestin
  • estrogen receptor inhibitor tamoxifen 40H-TAM
  • Int6 interacts directly with HIF2a (Fig. 11), and there is a binding site in the region of 571_640a at the C-terminus of HIF2 ⁇ . (Fig. 12), and it was found that the transcription of the hypoxic stress response gene of HIF2a was strongly repressed in the same manner as VHL in HIF1a.
  • Int6 has a C-terminal region that binds to the lid of the proteasome (the lid), and HIF2 a bound to Int6 can be decomposed by pulling it into the proteasome. It can be understood that it is the essence of ⁇ control.
  • hypoxia-independent aspect of HIF2a has been reported.However, the present inventors have shown that HIF1 ⁇ is 100% hypoxia-dependent, whereas HIF2a is not hypoxia-independent. It became clear that it was controlled by Int6. In other words, HIF2a is controlled mainly by Int6.
  • Substances that inhibit Int6 gene expression or Int6 function promote the expression of HIF2 regardless of hypoxia and translocation into the nucleus, resulting in a hypoxic stress response. It is expected to promote transcription of genes and exhibit angiogenic effects. Such substances are expected to have high angiogenic effects and specificity, and have therapeutic effects on various vascular diseases such as obstructive arteriosclerosis, restenosis after percutaneous vasodilatation (PCT), and myocardial infarction. It is expected to have.
  • PCT percutaneous vasodilatation
  • Int6 acts as a tumor suppressor during breast cancer and other cancerations. This is a concern that when specific siRNA is introduced into cells, it may cause canceration. This can be a big problem especially in clinical application.
  • the present inventors introduced a vector-type siRNA that always expresses Int6_siRNA at the time of cell introduction into the cell and observed it for a long time.
  • the introduction of vector-type siRNA that completely suppresses endogenous Int 6 shortens cell survival and stops cell growth within 7 weeks. Induced. This is because translational regulation is one of the roles of Int6, and complete suppression is due to abnormal translational regulation.
  • Int6 is one of the translational regulators, eIF3e / p48.
  • MMTV mouse Mammalian Tumor Virus
  • Int6 integrates into 9 genetic loci ( integration) to destroy the target gene at that location.
  • the ability to hit the 6th integration site of this disrupted gene was named Int6.
  • Int6 lacked a part of the C-terminus due to MMTV infection, so-called a constitutively inactivated (dominant negative) mutant (Int6- ⁇ C), and developed breast cancer (Fig. 8). .
  • the mechanism for why this mutant develops breast cancer was unknown.
  • substances having an inhibitory effect on the expression of Int6 are expected to have high levels and angiogenic effects, and are suitable for treatment of obstructive arteriosclerosis, restenosis after percutaneous vasodilatation (PCT), myocardial infarction, etc Is expected to be applied.
  • siRNA which is expected to inhibit Int6's specific expression, may be a therapeutic agent with a completely new concept of enhancing the expression of genes with therapeutic effects by suppressing the function of transcriptional regulators.
  • the present inventors completely reduced canceration by knocking down Int6, which has been reported as a translational regulatory factor (eIF3e) or a breast cancer suppressor, with an siRNA expression vector. It was shown by animal experiments using mice that normal arteries can be regenerated. In addition, the siRNA target cells were revealed to be carrier cells such as fibroblasts. This strongly demonstrates the possibility that new arteries can be generated by culturing and proliferating carrier cells such as fibroblasts collected from patients, introducing ex vivo synthetic siRNA, and then autotransplanting into the affected area. It is. If autologous transplantation is used to return cells (siRNA-treated angiogenesis-inducing cells) collected from patients into which siRNA has been introduced to the affected area, carrier development, which is a bottleneck for siRNA drug development, will be unnecessary.
  • siRNA target cells such as fibroblasts
  • obstructive arteriosclerosis myocardial infarction
  • cerebral infarction aiming at the development of treatment methods are expected to increase in the number of patients with the increase in lifestyle-related diseases, and new blood vessels will be constructed in the future. It is a disease that is expected to be cured. In addition, it can be expected to be applied to muscle regeneration by revascularization of liver parenchymal cells in cirrhosis and vascularization in neuromuscular degenerative diseases.
  • ES cells embryonic stem cells
  • stromal stem cells angiogenesis is indispensable for ensuring blood circulation to the reconstructed tissue.
  • carrier cells such as patient's own fibroblasts treated with synthetic siRNA for Int6 are self-transplanted, so that obstructive arteriosclerosis, myocardial infarction, brain
  • siRNA-treated angiogenesis-inducing cells such as patient's own fibroblasts treated with synthetic siRNA for Int6 are self-transplanted, so that obstructive arteriosclerosis, myocardial infarction, brain
  • siRNA for Int6 are self-transplanted, so that obstructive arteriosclerosis, myocardial infarction, brain
  • siRNA for Int6 are self-transplanted, so that obstructive arteriosclerosis, myocardial infarction, brain
  • neovascular bypass therapy applicable to regenerative medicine such as infarct treatment and liver regeneration.
  • Autologous carrier cells such as fibroblasts have already been used as artificial skin, and it is considered possible to prepare "siRNA-treated angiogenesis-inducing cells" according to the protocol at that time. It is done. Specifically, carrier cells such as fibroblasts are collected from the patient's own virus test negative skin pieces and cultured in large quantities to create a master cell and a working cell. The master cell is again tested for viruses and confirmed to be negative, and then the working cells are thawed sequentially and subcultured to prepare carrier cells for “siRNA-treated angiogenesis-inducing cells”. During preparation, it is necessary to perform a mycoplasma test and a bacterial / fungal test to confirm that it is negative. Carrier cells for prepared “siRNA-treated angiogenesis-inducing cells” can be stored frozen and supplied as needed.
  • Int6 has been found to be a suitable target molecule for drug discovery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

　血管新生を促進する低酸素ストレス応答に関与する因子として、HIF2α結合因子と結合活性を有するInt6を新たに同定することに成功した。また、Int6は、HIF2αとの相互作用を介して、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子の転写を抑制することを見出した。Int6の発現もしくは機能を阻害する物質は、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を増強させることにより、血管新生を促進し、心筋梗塞等の種々の血管疾患に対して治療効果を有することが期待される。

Description

明 細 書
低酸素ストレス応答に関与する Int6タンパク質、およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、低酸素ストレス応答を制御する Int6タンパク質、および該タンパク質の発 現もしくは機能を制御する物質を含有する血管疾患治療剤または抗癌剤、並びに、 該薬剤のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 生物は様々な環境の変化に適応しながらその生命を維持し続けている。それら環 境ストレスへの応答反応は生理的レベルのみならず、細胞レベルでも行われており、 今日においてその分子レベルでのストレス応答機構が解明されつつある。その中で も酸素の存在は地球上で生存する全ての生物にとって最も重要な環境因子の一つ である。
[0003] 生物にとって酸素は細胞機能の存続に必要なエネルギー源であるため、酸素の欠 乏は生命の存続に関わる重要な問題である。生体が低酸素状態になる原因としては 貧血や心肺機能の異常、高地生活などが挙げられる。このとき、生体内の各細胞は 様々な遺伝子の発現様式を変化させ、低酸素ストレスに適応しょうとする。例えば、 細胞の低酸素ストレス応答反応として、解糖系の活性化や血管新生の誘導などが起 こる。
[0004] 低酸素ストレス応答に関与するような遺伝子の中には、上流に HRE (hypoxia respo nse elements)が存在するものがある。この HREに転写因子 HIF (hypoxia-inducible fac tor ;低酸素反応性因子）が結合し、転写を促進させる。 HIFについては詳細な解析が 行われており、腫瘍の血管新生に必須である VEGF (血管内皮細胞増殖因子）を作り 出し、さらには、ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関わる多くの解糖系酵素の転写 制御を行うことが知られている。固形腫瘍 (例えば癌）では、血流が豊富にあるにも関 わらず、腫瘍内部ではかなり低酸素状態となっており、この状態が更に血管新生を促 す結果となっている。血管新生のほかにも、 HIFは細胞内においてさまざまな役割を 担っており、エネルギー代謝系、赤血球増殖、鉄代謝、細胞増殖、細胞死、ドーパミ ン代謝等に関与しているという報告がある。例えば低酸素時の赤血球増殖にはエリス ロポェチン遺伝子の発現亢進が必要であり、血管新生には VEGF遺伝子の発現増加 が重要である。これら低酸素応答性遺伝子の発現調節には、転写因子 HIF1ひ （hypo xia inducible factor 1ひ）や HLF (HIF1 like factor)、 GATA-2などが重要な役割を果 たしていることが知られている。 HIF1 αは低酸素による細胞の応答に深く関与し、通 常の酸素濃度 (21%)ではュビキチン'プロテアソームによって分解されている力 低酸 素状態ではこの分解から免れ核に移行し転写因子としてさまざまな因子の誘導を惹 起する。
[0005] 通常の酸素濃度で HIF1 aを分解する因子の一つとして pVHLがあげられる。 pVHL は HIF1 aに結合し、ュビキチン化することにより HIF1 aは分解される。このとき PHD ( proline hydroxylase)が HIF1 aのプロリン残基を水酸化することによって、 pVHLがそ の部位を認識することができるようになる。
[0006] HIFは HIF1 a、 HIF2 a、 HIF3 aの 3種に大きく分かれ、 HIF1 aがュビキタスに発現 するのと異なり、 HIF2 aは血管内皮細胞、骨格筋、心筋などに、 HIF3 aは脳神経系 に特異的に発現する。 HIF1 aは脳梗塞あるいは心筋梗塞等の虚血疾患に関連する ことが明ら力となっている（非特許文献 1〜4参照）。 HIF2 aは、低酸素ストレスが関連 する疾患の中でも癌の血管新生に関与する（非特許文献 5参照）。この HIF2 ctに関し ては、結合する因子が幾つか報告されているものの、その機能を制御する因子に関 しては明らかになってレ、なレ、。
[0007] 特許乂! ¾U： Semenza GL.奢、「HI _l and mechanisms of hypoxia sensing.」、 Curr Opin Cell BioL、 2001年 Apr、 Vol.13(2), p.167-71.
非特許文献 2 : Giaccia A，外 2名著、「HIF_1 as a target for drug development.」、 2003 年 Oct、 2(10)、 p.803-11.
非特許文献 3 : Jelkmann W.著、「Effects of erythropoietin on brain function.」、 Curr P harm Biotechnol.、 2005年 Feb、 Vol.6(l)、 p.65- 79
非特許文献 4 : Marti HH.著、「 Erythropoietin and the hypoxic brain.」、 J Exp Biol.、 2 004年 Aug、 Vol.207(Pt 18)、 p.3233— 42.
非特言午文献 5 : Favier J,外 3名者、「Coexpression of endothelial PAS protein 1 with e ssential angiogenic factors suggests its involvement in human vascular development. 」、 Dev Dyn.、 2001年 Nov、 VoL222(3)、 p.377-88
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、血管新生に関連する低酸素 ストレス時の遺伝子発現応答のメカニズムの解明を目的とし、さらに、特に血管新生 を誘導する低酸素ストレス応答を促進する HIF2 aの機能を制御する因子の同定を目 的とする。より詳しくは、低酸素ストレス応答を制御する薬剤、および血管疾患に対し て治療効果を有する薬剤、並びに、該薬剤のスクリーニング方法の提供を課題とする 課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、その結果、血管新生を促 進する低酸素ストレス応答に関与する因子として、 HIF2 aと結合活性を有する Int6を 新たに同定することに成功した。
[0010] 低酸素ストレス下においては、 HIF2 aの働きによって、低酸素応答遺伝子の転写 が促進されることが知られている。本発明により、その際の HIF2 aの転写機能を Int6 が制御していることが明らかとなった。より詳しくは、 Int6は、 HIF2ひとの相互作用を介 して、 HIF2 aの低酸素ストレス応答遺伝子の転写を抑制することを見出した。
[0011] Int6遺伝子の発現、もしくは Int6の機能 (例えば、 HIF2ひとの結合活性）を阻害する 物質は、 HIF2 aの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を増強させることにより、 血管新生効果を上昇させることが期待される。該物質は、高い血管新生効果が期待 され、閉塞性動脈硬化症、経皮的血管拡張術 (PCT)後再狭窄、心筋梗塞等の種々 の血管疾患に対して治療効果を有することが期待される。
[0012] また、本発明者らは、 Int6遺伝子の発現が siRNAによって抑制された実験動物を作 製し、該実験動物において実際に血管新生効果が上昇していることを見出した。従 つて、 Int6の発現もしくは機能を阻害する物質は、実際に血管新生効果を効果的に 上昇させることを、動物実験レベルで確認することに成功した。とりわけ、 Int6遺伝子 の特異的発現抑制効果が期待される siRNAは、転写制御因子の発現抑制により、血 管疾患に対して治療効果を有する遺伝子の発現を亢進させるという、全く新しいコン セブトの血管疾患治療薬となることが大いに期待される。
[0013] また、 Int6の発現もしくは機能を亢進させる物質は、 HIF2 aの低酸素ストレス応答遺 伝子転写促進作用を低下させることにより、血管新生効果を抑制させることが期待さ れる。癌組織において血管新生効果が上昇していることから、該物質は、血管新生を 抑制することを機序とする新たな抗癌剤となるものと考えられる。
[0014] さらに本発明者らは、女性ホルモンが Int6の発現を抑制することを初めて見出した。
即ち、女性ホルモンは、 Int6遺伝子の発現を抑制することにより、 HIF2 aの低酸素ス トレス応答遺伝子転写促進作用を亢進させ、その結果、血管新生を促進させるものと 考えられる。従って、女性ホルモンは、例えば、血量の改善によって病態を改善し得 る疾患（閉塞性動脈硬化症等）の治療に有効である。一方、女性ホルモン抑制剤は、 血管新生を抑制することにより、例えば、抗癌作用を有することが期待される。
[0015] また、本発明者らによって見出された上記知見を基に、血管疾患治療剤もしくは抗 癌剤等のスクリーニングを実施することが可能である。
[0016] 本発明は、低酸素ストレス応答を制御する薬剤、および血管疾患もしくは癌に対し て治療効果を有する薬剤、並びに、該薬剤のスクリーニング方法に関し、より詳しくは
〔1〕 Int6タンパク質の発現抑制物質または機能抑制物質を有効成分として含有す る、低酸素ストレス応答促進剤、
〔2〕 Int6タンパク質の発現抑制物質が、以下の（a)〜（c)からなる群より選択される 化合物である、〔1〕に記載の低酸素ストレス応答促進剤、
(a) Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b) Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c) Int6遺伝子の発現を RNAi効果による阻害作用を有する核酸
〔3〕 Int6タンパク質の発現抑制物質が、女性ホルモン、女性ホルモン分泌促進剤、 または女性ホルモン受容体ァゴニストである、〔1〕に記載の低酸素ストレス応答促進 剤、
〔4〕 Int6タンパク質の機能抑制物質が、以下の（a)〜（c)からなる群より選択される 化合物である、〔1〕に記載の低酸素ストレス応答促進剤、
(a) Int6タンパク質と結合する抗体
(b) Int6タンパク質と結合する低分子化合物
(c) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を阻害する化合物
[5] 低酸素ストレス応答促進が血管新生の誘導である、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記 載の低酸素ストレス応答促進剤、
〔6〕 Int6タンパク質の発現亢進物質または機能亢進物質を有効成分として含有す る、低酸素ストレス応答抑制剤、
[7] Int6タンパク質の発現亢進物質力 女性ホルモン抑制剤である、〔6〕に記載の 低酸素ストレス応答抑制剤、
〔8〕 低酸素ストレス応答抑制が血管新生の抑制である、〔7〕に記載の低酸素ストレ ス応答抑制剤、
〔9〕 〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の低酸素ストレス応答促進剤を有効成分として含 有する、血管疾患治療薬、
〔10〕 血管疾患が、虚血性脳もしくは心疾患、神経変性疾患、外傷性脳障害、また は、肝、膝、筋肉、もしくは皮膚疾患である、 〔9〕に記載の血管疾患治療薬、 〔1 1〕 〔6〕〜〔8〕のいずれかに記載の低酸素ストレス応答抑制剤を有効成分として 含有する、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤）、
[ 12] 血管新生関連疾患が癌疾患である、〔1 1〕に記載の血管新生関連疾患治療 薬、
〔13〕 Int6遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、トランスジェニ ック非ヒト動物、
〔14〕 以下の（a)〜（c)のいずれかの核酸の作用により、 Int6遺伝子の発現が抑制 されていることを特徴とする、〔13〕に記載のトランスジヱニック非ヒト動物、
(a) Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b) Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c) Int6遺伝子の発現を RNAi効果によって阻害する作用を有する核酸
〔15〕 血管新生効果が促進されていることを特徴とする、 〔13〕または〔14〕に記載の トランスジエニック非ヒト動物、
〔16〕 Int6遺伝子の発現量もしくは Int6タンパク質の活性を低下させる化合物を選択 することを特徴とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
[ 17] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
(a) Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における Int6遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる 化合物を選択する工程
〔18〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
(a) Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有 する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程
〔19〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
(a) Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検 化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活 性を低下させる化合物を選択する工程
[20] Int6タンパク質と HIF2 αタンパク質との結合活性を抑制する化合物を選択す ることを特徴とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
〔21〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
(a) Int6タンパク質および HIF2ひタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下 させる化合物を選択する工程
〔22〕 Int6遺伝子の発現量もしくは Int6タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択 することを特徴とする、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤）のスクリーニング方 法、
〔23〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤） のスクリーニング方法、
(a) Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における Int6遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる 化合物を選択する工程
〔24〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤） のスクリーニング方法、
(a) Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有 する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを上 昇させる化合物を選択する工程
〔25〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤） のスクリーニング方法、
(a) Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検 化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活 性を上昇させる化合物を選択する工程
〔26〕 Int6タンパク質と HIF2 αタンパク質との結合活性を亢進させる化合物を選択 することを特徴とする、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤）のスクリーニング方 法、
[27] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤） のスクリーニング方法、
(a) Int6タンパク質および HIF2 αタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程 (b) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇 させる化合物を選択する工程
〔28〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤） のスクリーニング方法、
(a)〔13〕〜〔： 15〕のいずれかに記載のトランスジエニック非ヒト動物に被検化合物を投 与する工程
(b)前記トランスジエニック非ヒト動物における Int6の発現量もしくは活性、あるいは、 該動物における血管新生効果を測定する工程
(c)被検化合物を投与しない場合 (対照）と比較して、 Int6の発現量もしくは活性を上 昇させる化合物、あるいは、血管新生効果を低下させる化合物を選択する工程、を 提供するものである。
さらに本発明は、以下を提供する。
〔29〕 Int6のドミナントネガティブ変異体を有効成分として含有する、血管新生誘導 剤。
〔30〕 Int6のドミナントネガティブ変異体力 Int6タンパク質の C末領域の PINT領域が 欠損された Int6タンパク質変異体である、〔29〕に記載の血管新生誘導剤。
〔31〕 Int6タンパク質、または、 Int6タンパク質を発現するベクターを有効成分として 含有する、血管新生抑制剤。 （好ましくは、癌細胞における血管新生抑制剤） 〔32〕 Int6遺伝子の発現が抑制され血管新生が誘導されていることを特徴とするキ ャリヤー細胞。
〔33〕 Int6遺伝子に対する siRNAが導入された、 〔32〕に記載のキヤリヤー細胞。 〔34〕 〔31〕に記載の血管新生抑制剤、または、〔32〕もしくは〔33〕に記載のキヤリャ 一細胞を有効成分として含有する、血管疾患治療薬。
[35] 単離されたキヤリヤー細胞へ、 Int6遺伝子に対する siRNAを導入する工程を含 む、血管疾患治療薬の製造方法。
〔36〕 以下の（a)〜（c)のレ、ずれかを有効量投与する工程を含む、血管疾患の治療 方法。 (a)本発明の低酸素ストレス応答促進剤
(b)本発明の血管新生誘導剤
(c)本発明のキヤリヤー細胞
[37] 以下の工程 (a)および (b)を含む、血管疾患の治療方法。
(a)単離されたキヤリヤー細胞へ、 Int6遺伝子に対する siRNAを導入する工程
(b)工程 (a)の siRNAが導入されたキヤリヤー細胞を、有効量投与する工程 〔38〕 以下の工程 (a)〜（c)を含む、自家移植療法。
(a)キヤリヤー細胞を採取する工程
(b)採取したキヤリヤー細胞へ、 Int6遺伝子に対する siRNAを導入する工程
(c)工程 (a)の siRNAが導入されたキヤリヤー細胞を、有効量投与する工程 図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、 Int6遺伝子の発現を抑制する siRNA発現ベクターの構造 (配歹 1J)を示す 図である。
[図 2]図 2は、 Int6による HIF2 aの転写活性の抑制効果を示す図である。
[図 3]図 3は、 Int6の siRNAによる内在性 Int6遺伝子の発現抑制効果を示す図および 写真である。
[図 4]図 4は、 Int6の siRNAによる血管新生促進効果を示す写真である。
[図 5]図 5は、 MCF-7細胞を、ェストラジオ一ノレ（E2)、 progesteron (Progestin),あるい は estrogen受容体抑制剤タモキシフェン (40H-TAM)で処理し、 24時間培養した細 胞の Int6 mRNAの発現を定量した結果を示すグラフである。横軸に示す記号は、以 下の通りである。 A-1： E2(- )、 A-2： E2(lnM)、 A_4： Progestin(lnM), A_5： E2(lnM) +Progestin(lnM)、 A- 8： 40H-TAM(1 μ M)、 A— 12: E2(lnM)+40H-TAM(l μ M)。
[図 6]図 6は、ュビキチンによる HIFの制御機構と転写活性により誘導される因子群を 表す図である。
[図 7]図 7は、酵母 Two Hybrid法にて同定された新規 HIF2 a結合因子に関する事項 をまとめた図である。
[図 8]図 8は、 MMTVによる Int6の変異と HIF2 aとの関連を示す図である。
[図 9]図 9は、合成 Int6-siRNAの導入により血管新生因子群を分泌する「siRNA処理 血管新生誘導細胞」を用いた自家移植による新生血管バイパス治療法の基本概念 を示す図である。
[図 10]図 10は、 siRNA処理血管新生誘導細胞による新生血管バイパス治療法の概 念図である。
[図 11]図 11は、 Int6の HIF2ひに対する結合特性を表す図である。
[図 12]図 12は、 Int6の HIF2ひ結合部位を示す図である。
[図 13]図 13は、正常酸素状態あるいは低酸素状態における、 Int6野生型、および恒 常不活性化型（ドミナントネガティブ）変異体 Int6 A Cの、 HIFl a、 HIF2 a、および HI F3 aの転写活性を示すグラフである。
[図 14]図 14は、 Int6-siRNA発現ベクターによるマウス皮下の顕著な血管新生誘導の 結果を示す写真である。
[図 15]図 15は、 Int6-siRNAによる血管新生の定量的解析結果を示すグラフである。 左側グラフが新生血管面積 (AREA)を示し、右側グラフが新生血管長（LENGTH)を 示す。
[図 16]図 16は、 Int6-siRNAによって新生した血管の病理組織像を示す写真である。 写真内の矢印は新生された血管を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明によって、 Int6の発現もしくは機能 (活性）を抑制（阻害）する物質は、 HIF2ひ 転写制御因子の機能を亢進させることにより、低酸素ストレス応答を促進させる機能 を有することが見出された。
従って本発明は、 Int6タンパク質の発現を抑制する物質または機能を抑制する物 質を有効成分として含有する、低酸素ストレス応答促進剤を提供する。
[0019] 本発明の Int6遺伝子は、ヒトをはじめとする種々の生物において存在することが知ら れている。 Int6遺伝子は、翻訳調節因子 Translation Initiation Factorのコンポーネン トの一つである eIF3e/p48と同一の遺伝子であることが知られており、ヒト、マウス、ラッ ト、力エル等において Int6遺伝子に相当する遺伝子 (相同遺伝子、ホモログ）が同定 されている。
[0020] 本発明の Int6タンパク質は、ヒ Hnt6タンパク質であることが好ましいが、その由来す る生物種は特に制限されず、ヒ Hnt6タンパク質のヒト以外の生物種、例えば、オラン ウータン、チンパンジー、ィヌ、マウス、ドブネズミ（ラット）等の哺乳動物、あるいはニヮ トリ等の鳥類、アフリカッメガエル等の両生類におけるホモログ等であってもよレ、。ヒト I nt6遺伝子の公共遺伝子データベース GenBankにおけるァクセッション番号は、 NM_0 01568である。なお上記ヒト以外の生物種における Int6ホモログに関する遺伝子デー タベースの名称および該遺伝子データベースにおけるァクセッション番号を以下に 示す。 （gbは GenBank、 embは EMBL、 refは RefSeqデータベースを示す。）オランウー タン (emb： CR860517.1)、ィヌ (ref: XM_532304.1)、ドブネズミ (gb： BC082087.1)、マ ウス（ref: NM— 008388.1)、チンパンジー（ref: XM— 519906.1)、ニヮトリ（emb :AJ719829. 1、 ref: NM_001006349.1)、アフリカッメガエル（gb :AF162775.1、 AF162775) 0
[0021] ヒトにおける Int6をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号： 1に示す。また該塩基 配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。上記以外 のタンパク質であっても、例えば本願配列表に記載された配列と高い相同性（通常 7 0%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上）を 有し、かつ Int6が有する機能（例えば、 HIF2 aタンパク質と結合する機能）を持つタン ノ ク質は、本発明の Int6に含まれる。上記タンパク質とは、例えば配列番号： 2に記載 のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が付カロ、欠失、置換、挿入されたアミノ酸 配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数は 30アミノ酸以内、好まし くは 10アミノ酸以内、より好ましくは 5アミノ酸以内、最も好ましくは 3アミノ酸以内である
[0022] 本発明の「Int6タンパク質」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組換え技術を利用し た組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば Int6タ ンパク質が発現していると考えられる細胞 (組織）の抽出液に対し、 Int6タンパク質に 対する抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを用いる方法により調製すること が可能である。一方、組換えタンパク質は、 Int6タンパク質をコードする DNAで形質転 換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
[0023] 本発明において低酸素ストレス応答剤とは、より具体的には、低酸素ストレスに起因 して応答する遺伝子 (本明細書にぉレ、て、「低酸素ストレス応答遺伝子」と記載する 場合あり）の発現を上昇させるような機能を有する薬剤であると言うことができる。さら に詳細には、本発明における該低酸素ストレス応答遺伝子は、 HIF2ひによって転写 が制御されている遺伝子であり、通常、血管新生の誘導に関与する遺伝子である。 通常、種々の生物において複数の低酸素ストレス応答遺伝子が存在する。
[0024] 本発明の低酸素ストレス応答遺伝子としては、例えば、ヒトの VEGF (血管内皮増殖 因子； Vascular endothelial growth factor) Λエリスロホェチン (erythropoietin)、 IGF、ィ ンシュリン成長因子； insulin growth factor)- 1,グルコース輸送体炭酸脱水酵素 (gluco se transporter carbonic anhydraseノ IX、形質転換成 因子 (Transforming growtn fact or)をコードする遺伝子を例示することができる。
[0025] 即ち、本発明の Int6の発現もしくは機能を抑制する物質は、例えば、上述の遺伝子 の発現を亢進させる機能を有する。
[0026] 本発明の低酸素ストレス応答促進剤によって、治療効果が期待される疾患としては 、一般的に血流が少なくなる虚血が伴い、その虚血を血管新生による血量の改善に よって病態を改善し得る疾患が挙げられる。例えば血管疾患等が挙げられる。より具 体的には、閉塞性動脈硬化症、経皮的血管拡張術後再狭窄、心筋梗塞、脳梗塞あ るいは脳出血などの虚血性脳疾患、アルツハイマー病あるいはパーキンソン病、また は脊髄小脳変性症などの神経変性疾患、脊髄損傷あるいは脳挫傷など外傷性脳障 害を含めた神経疾患、肝硬変などの肝疾患、萎縮性筋肉疾患等を挙げることができ る。
[0027] 本発明において Int6タンパク質の発現抑制物質には、例えば Int6の転写もしくは該 転写産物からの翻訳を阻害する物質が含まれる。本発明の上記発現抑制物質の好 ましレ、態様として、例えば以下の（a)〜（c)からなる群より選択される化合物 (核酸）を 挙げることができる。
(a) Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b) Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c) Int6遺伝子の発現を RNAi効果による阻害作用を有する核酸 (siRNA)
[0028] 本発明における「核酸」とは RNAまたは DNAを意味する。また所謂 PNA (p印 tide nu cleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。 PNAは、核酸の 基本骨格構造である五単糖 ·リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置 換したもので、核酸によく似た 3次元構造を有する。また本発明の核酸には、所謂 LN A(Locked Nucleic Acid)も含まれる。
[0029] 特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用す る方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害 する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転 写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位と のハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成に よる転写阻害、イントロンとエタソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプラ イシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻 害、 mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キヤッビング部位 やポリ (A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結 合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合 部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位 とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互 作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセ ンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標 的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上，新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝子 の複製と発現， 日本生化学会編，東京化学同人， 1993， 319-347.)
[0030] 本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により Int6遺伝子の 発現を阻害してもよい。一つの態様としては、 Int6遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻 訳領域に相補的なアンチセンス配歹を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と 考えられる。また、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配歹も使用する こと力 Sできる。このように、 Int6遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアン チセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用 されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側 に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公 知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列 は、形質転換される動物が持つ内在性 Int6遺伝子またはその一部と相補的な配列で あることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補 的でなくてもよい。転写された RNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90 %以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的 遺伝子 (Int6)の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも 1 5塩基以上 25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は、必ず しもこの長さに限定されず、例えば、 100塩基以上、または 500塩基以上であってもよ い。
[0031] 本発明のアンチセンスは、特に制限されないが、例えば、 GenBankのァクセッション 番号 NM001568で取得される Int6遺伝子の塩基配列等を基に作成することができる
[0032] また、 Int6遺伝子の発現の阻害は、リボザィム、またはリボザィムをコードする DNAを 利用して行うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子を指す。リ ボザィムには種々の活性を有するものが存在するが、中でも RNAを切断する酵素とし てのリボザィムに焦点を当てた研究により、 RNAを部位特異的に切断するリボザィム の設計が可能となった。リボザィムには、グループ Iイントロン型や RNase Pに含まれる Ml RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもある力 ハンマーヘッド型やへ ァピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠お よび大塚栄子，タンパク質核酸酵素， 1990， 35, 2191.)。
[0033] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C 15という配列 の C 15の 3'側を切断する力 その活性には U14と A9との塩基対形成が重要とされ、 C 1 5の代わりに A15または U15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, Μ· et al.， FEBS Lett, 1988， 228, 228.)。基質結合部位が標的部位近傍の RNA配列と相補的 なリボザィムを設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識する制 限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することができる（Koizumi, Μ· et al.， FEBS Le tt, 1988， 239, 285.、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素， 1990, 35， 2191. 、 Koizumi, M. et al. , Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059·)。
[0034] また、ヘアピン型リボザィムも本発明の目的に有用である。このリボザィムは、例え ばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM.， Nature, 1986， 323, 349.)。ヘアピン型リボザィム力 も、標的特異的な RNA切断 リボザィムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. & Sasaki, Ν·, Nucl Acids Res , 1991， 19， 6751.、菊池洋，化学と生物， 1992, 30, 112.)。このように、リボザィムを用 いて本発明における Int6遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の 発現を阻害することができる。
[0035] 遺伝子の発現を特異的に抑制する方法としては、リボザィムを用いる方法が用いら れて来た（Beger C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 130-135, 2001)が、最近、よ り効果的に遺伝子発現を抑制できる手法として RNA干渉（RNA interference,以下「R NAijと略称する）が脚光を浴びている。 RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、 一般的に siRNAとも呼ばれる。 RNAiは、標的遺伝子の mRNAと相同な配列からなるセ ンス RNAとこれと相補的な配列力らなるアンチセンス RNAとからなる短鎖二本鎖 RNA ( 以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子 mRNAの破 壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このように RNAiは、標的遺 伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝 子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への 応用可能な方法として注目を集めている。 RNAiに用いる RNAは、 Int6遺伝子もしくは 該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有 することが好ましい。
[0036] 本発明の上記（c)の核酸 (siRNA)の好ましい態様として、 Int6遺伝子に対して RNAi 効果を有する二本鎖 RNA (siRNA)を挙げることができる。より具体的には、配列番号： 1に記載の塩基配列の部分配列に対するセンス RNAおよびアンチセンス RNA力 な る二本鎖 RNA(siRNA)を挙げることができる。
[0037] RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もある力 DICERといわれる酵素（R Nase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖 RNAと接触し、二本鎖 RNAが small i nterfering RNAまたは siRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている 。本発明における RNAi効果を有する二本鎖 RNAには、このように DICERによって分 解される前の二本鎖 RNAも含まれる。即ち、そのままの長さでは RNAi効果を有さない ような長鎖の RNAであっても、細胞において RNAi効果を有する siRNAへ分解されるこ とが期待されるため、本発明における二本鎖 RNAの長さは、特に制限されない。
[0038] 例えば、本発明の Int6遺伝子の mRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する 長鎖二本鎖 RNAを、例えば、予め DICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤 として利用することが可能である。この分解産物には、 RNAi効果を有する二本鎖 RNA 分子 (siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、 RNAi効果を有すること が期待される mRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、 RNAi効果を有する 本発明の Int6遺伝子の mRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
[0039] なお、上記 RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構 造を有する siRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖 RNA構 造を形成し得る一本鎖 RNA分子もまた本発明に含まれる。
[0040] 本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖 RNA」は、当業者においては、該 二本鎖 RNAの標的となる本発明の Int6遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製すること 力 Sできる。一例を示せば、配列番号： 1に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖 RNAを作製することができる。即ち、配列番号： 1に記載の塩基配列をもとに、該配列 の転写産物である mRNAの任意の連続する RNA領域を選択し、この領域に対応する 二本鎖 RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適 宜行レ、得ることである。また、該配列の転写産物である mRNA配列から、より強レ、 RNA i効果を有する siRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって 適宜実施することが可能である。また、一方の鎖（例えば、配列番号： 1に記載の塩基 配列）が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖 (相補鎖）の塩基配列 を知ることができる。 siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作 製することが可能である。また、所望の RNAの合成については、一般の合成受託サ 一ビスを利用することができる。
[0041] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター）もまた、本発明の Int6遺伝 子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二 本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖をコードする DN A、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力 それぞれ発現し得るように プロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当業者に おいては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的 には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜揷入する ことによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
[0042] また、本発明の発現抑制物質には、例えば、 Int6の発現調節領域 (例えば、プロモ 一ター領域）と結合することにより、 Int6の発現を抑制する化合物が含まれる。該化合 物は、例えば、 Int6のプロモーター DNA断片を用いて、該 DNA断片との結合活性を 指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者にお いては、所望の化合物について、本発明の Int6の発現を抑制するか否かの判定を、 公知の方法、例えば、レポーターアツセィ法等により適宜実施することができる。
[0043] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター）もまた、本発明の Int6遺伝 子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二 本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖をコードする DN A、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力 それぞれ発現し得るように プロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当業者に おいては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的 には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入する ことによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
[0044] 本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、 Int6の発現を抑制する siRNAを発 現するベクターを挙げることができる。一例を示せば、該ベクターにおいて siRNAを発 現する領域の塩基配列として、図 1に示す配列（配列番号： 5〜7)を挙げることができ るが、これらに特に限定されるものではない。
[0045] 本発明の siRNAとしては、一例を示せば、図 1に示す各塩基配列において、センス オリゴおよびアンチセンスオリゴと記載された領域のそれぞれの配列がハイブリダィズ された構造からなる siRNAを好適に示すことができる。
[0046] また、本発明の発現抑制物質には、例えば、 Int6の発現調節領域 (例えば、プロモ 一ター領域）と結合することにより、 Int6の発現を抑制する化合物が含まれる。該化合 物は、例えば、 Int6のプロモーター DNA断片を用いて、該 DNA断片との結合活性を 指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者にお いては、所望の化合物について、本発明の Int6の発現を抑制するか否かの判定を、 公知の方法、例えば、レポーターアツセィ法等により適宜実施することができる。
[0047] また本発明は、 Int6タンパク質の機能抑制物質を有効成分として含む低酸素ストレ ス応答促進剤を提供する。 Int6タンパク質が HIF2 aと結合し、 HIF2 aの機能を抑制 する機能を有することから、 Int6タンパク質の機能を抑制することにより、 HIF2ひの機 能が活性化され低酸素ストレス応答遺伝子の転写機能が亢進される。従って、 Int6タ ンパク質の機能を抑制する物質は、低酸素ストレス応答促進剤として有効であるもの と考えられる。
[0048] 本発明における Int6タンパク質の機能抑制物質としては、例えば以下の（a)〜（c) の化合物を挙げることができる。
(a) Int6タンパク質と結合する抗体
(b) Int6タンパク質と結合する低分子化合物
(c) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を阻害する化合物
[0049] Int6タンパク質に結合する抗体 (抗 Int6抗体）は、当業者に公知の方法により調製す ることが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることが できる。天然の Int6タンパク質、あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微 生物において発現させたリコンビナント (組み換え） Int6タンパク質、またはその部分 ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロ ティン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 Int6タンパク質や 合成ペプチドをカップリングしたァフィ二ティーカラム等により精製することにより調製 する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、 Int6タンパク質若しくはその部分 ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行レ、、同マウスより脾臓を摘出し、これをすり つぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等 の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ノヽイブリドーマ）の中から、 Int6 タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブ リドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナ ル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換ク 口マトグラフィー、 Int6タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたァフィ二ティーカラ ム等により精製することで、調製することが可能である。
[0050] 本発明の抗体は、本発明の Int6タンパク質に結合する限り特に制限はな 上記ポ リクローナル抗体、モノクローナル抗体の他に、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト 型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。
[0051] 抗体取得の感作抗原として使用される本発明の Int6タンパク質は、その由来となる 動物種について制限されなレ、が、哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が 好ましぐ特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者にお いては、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて、適宜、取得 すること力 Sできる。
[0052] 本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるい はタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例 えば、タンパク質のアミノ基 (N)末端断片やカルボキシ (C)末端断片が挙げられる。 本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味す る。
[0053] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 、例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでタンパク質、タンパク質発現細 胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエロー マ細胞、例えば U266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を 産生するハイプリドーマを得ることもできる。
[0054] 本発明の Int6タンパク質に対する抗体は、 Int6タンパク質と結合することにより、 Int6 タンパク質の機能を阻害し、例えば、血管疾患の治療や改善効果が期待される。得 られた抗体を人体に投与する目的 (抗体治療)で使用する場合には、免疫原性を低 下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
[0055] さらに本発明は、 Int6タンパク質の機能を阻害し得る物質として、 Int6タンパク質に 結合する低分子量物質 (低分子化合物)も含有する。本発明の Int6タンパク質に結合 する低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公 知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の 化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。
[0056] 上記 (b)の Int6タンパク質に結合し、その機能を抑制する低分子化合物としては、 例えば Int6に対して親和性が高い化合物等が挙げられる。
[0057] また本発明の Int6機能抑制物質の好ましい態様としては、 Int6と HIF2 aとの結合（ 相互作用）を阻害する化合物が挙げられる。該化合物は、 HIF2ひと Int6との結合を阻 害することにより、フリーな状態で転写因子として機能する HIF2 aの量を上昇させ、 その結果、低酸素ストレス応答遺伝子の転写を促進するものと考えられる。
[0058] さらに、本発明の Int6タンパク質の機能を抑制し得る物質として、 Int6タンパク質に 対してドミナントネガティブの性質を有する Int6タンパク質変異体 (Int6ドミナントネガ ティブタンパク質）を挙げることができる。「Int6タンパク質に対してドミナントネガティブ の性質を有する Int6タンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現 させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機 能を有するタンパク質を指す。より具体的には、該 Int6ドミナントネガティブタンパク質 としては、例えば、 HIF2 aとの結合活性が消失しているようなタンパク質を挙げること ができる。
[0059] 上記 Int6ドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、 Int6タンパク質の C末が欠 損したタンパク質 (Ιηΐ6- Δ θを挙げることができる。該 Int6_ A Cは、具体的には、 Int6 タンパク質の C末領域の PINT領域が欠損された Int6タンパク質変異体（図 2参照）を 挙げることができる。
[0060] また、本発明によって提供される低酸素ストレス応答促進剤は、血管新生を誘導（ 促進)する効果を有することから、血管疾患に対して治療効果を有することが期待さ れる。
従って本発明は、本発明の低酸素ストレス応答促進剤を有効成分として含有する、 血管疾患治療薬（医薬組成物)を提供する。
[0061] また、本発明の Int6の発現もしくは機能を亢進させる物質は、 HIF2 α転写制御因子 の機能を低下させることにより、低酸素ストレス応答を低下させる機能を有するものと 期待される。
従って本発明は、 Int6タンパク質の発現もしくは機能を亢進させる物質を有効成分 として含む、低酸素ストレス応答抑制剤を提供する。上記「タンパク質の発現亢進」に は、遺伝子からの転写の亢進、および該転写産物からの翻訳の亢進が含まれる。
[0062] 上記物質としては、例えば、 Int6と HIF2 aとの結合（相互作用）を促進させる物質等 が挙げられる。該物質は、 Int6タンパク質と HIF2ひタンパク質との結合活性を指標とし て、結合活性が亢進される物質をスクリーニングすることにより、適宜取得することが できる。
[0063] また、本発明によって提供される低酸素ストレス応答抑制剤は、血管新生を抑制（ 阻害)する効果を有することから、血管新生に関連する疾患 (血管新生関連疾患）、 例えば、癌に対して治療効果を有することが期待される。治療効果の期待される癌と して好ましくは、乳癌、大腸癌、 口腔内癌、咽頭 ·喉頭癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、腎 癌、膀胱癌、子宮癌等を挙げることができる。癌以外にも、血管新生を抑制すること により治療効果が期待できる疾患として、例えば糖尿病性の網膜症などの網膜に異 常な血管が増加する疾患、肺高血圧症等を挙げることができる。なお、 HIF2 a転写 制御因子の機能の抑制は、血管新生を抑制（阻害)するだけでなぐ赤血球増加症 や糖尿病におけるブドウ糖代謝異常などにも効果を有する可能性が考えられる。
[0064] 本発明者らは、女性ホルモンが Int6の発現を抑制することを見出した。即ち、女性 ホルモンは、 Int6遺伝子の発現を抑制することにより、 HIF2 αの低酸素ストレス応答 遺伝子転写促進作用を亢進させ、その結果、血管新生を促進させるものと考えられ る。従って、女性ホルモンは、例えば、血量の改善によって病態を改善し得る疾患（ 例えば、閉塞性動脈硬化症等）の治療に有効である。
[0065] 本発明における Int6の発現抑制物質としては、女性ホルモンを好適に示すことがで きる。女性ホルモンは、より具体的には、エストロゲン、プロゲステロン等を例示するこ とができる。また、 Int6タンパク質の発現もしくは機能を亢進させる物質としては、女性 ホルモン以外にも、例えば、女性ホルモン分泌促進剤、女性ホルモン受容体のァゴ 二スト等を示すことができる。
[0066] また、女性ホルモン抑制剤は、 Int6遺伝子の発現を亢進することにより、 HIF2 aの 低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を低下させ、その結果、血管新生を低下さ せることが期待される。従って、女性ホルモン抑制剤は、例えば、血管新生の抑制に よって病態を改善し得る疾患（例えば、癌疾患等）の治療に有効である。
さらに本発明は、 Int6遺伝子の発現が抑制され、血管新生が誘導されていることを 特徴とするキヤリヤー細胞に関する。該細胞は、血管疾患に対する治療効果が期待 される。本発明における「キヤリヤー細胞」とは、例えば、線維芽細胞、グリア細胞等を 挙げることができる。 Int6遺伝子の発現抑制は、例えば、 Int6遺伝子に対する siRNA を用いて行うことができる。
[0067] 本発明は、本発明の低酸素ストレス応答抑制剤を有効成分として含有する、血管 新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤、抗腫瘍医薬組成物)を提供する。該血管新生 関連疾患治療薬の好ましい一つの態様としては、女性ホルモン抑制剤を有効成分と して含有する、血管新生関連疾患治療薬を挙げることができる。
[0068] さらに本発明は、 Int6遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、ト ランスジエニック非ヒト動物（本明細書においては、「トランスジエニック非ヒト動物」、「 ノックアウト非ヒト動物」、あるいは単に「動物」と記載する場合あり）を提供する。
[0069] 本発明の上記トランスジエニック非ヒト動物は、例えば低酸素ストレス応答を制御す ることを必要とする疾患の治療のための薬剤のスクリーニングに好適に用いることが 可能である。また、低酸素ストレス応答、および上記疾患のメカニズム解明の研究の ための実験モデル動物として、非常に有用である。
[0070] 本発明におけるトランスジエニック非ヒト動物には、アンチセンス RNAもしくは siRNA の作用により遺伝子の発現が抑制された所謂「ノックダウン動物」も含まれる。
[0071] 本発明において「Int6遺伝子の発現が人為的に抑制されている」には、例えば（1) 1 nt6遺伝子の遺伝子対の一方または双方に、ヌクレオチドの揷入、欠失、置換等の遺 伝子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態、（2)本発明の 核酸（例えば、アンチセンス RNAまたは siRNA等）の作用により遺伝子の発現が抑制 されている状態、等を挙げることができる。
[0072] 本発明における「抑制」には、 Int6遺伝子の発現が完全に抑制されてレ、る場合、お よび、本発明の動物における Int6の発現量が野生型動物における Int6遺伝子の発現 量と比較して有意に低下している場合、が含まれる。
[0073] 上記（1)には、 Int6遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されてい る場合も含まれる。本発明における遺伝子変異の存在する部位は、該遺伝子の発現 が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばェクソン部位、プロモータ 一部位等を挙げることができる。
[0074] 本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝 子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子ノックアウト マウスを作製することができる。まず、マウスから本発明の Int6遺伝子のェクソン部分 を含む DNAを単離し、この DNA断片に適当なマーカー遺伝子を揷入し、ターゲッティ ングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクト口ポレーシヨン法な どによりマウスの ES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入 するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子 が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培 養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率 的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを 結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排 除することができる。また、 PCRおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を 行い、本発明の遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得るこ とちできる。
[0075] 相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝 子揷入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメ ラ作製を行うことが好ましレ、。得られた ES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションし、 キメラマウスを得ること力できる。このキメラマウスを交配させることで、本発明の Int6遺 伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウス を交配させることで、本発明の遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取 得することができる。マウス以外の ES細胞が樹立された動物においても、同様の手法 により、遺伝子改変を行うことができる。
[0076] 本発明の上記ノックアウト動物は、好ましくは、本発明の上記核酸を非ヒト動物へ導 入することによって Int6遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、ノックアウト (ノックダウン)動物である。 [0077] 上記ノックダウン動物は、本発明の核酸（アンチセンス RNAまたは siRNA等）を発現 し得る構造のベクターを、非ヒト動物へ導入することによつても作製することができる。
[0078] 一例を示せば、配列番号： 5〜7に記載の塩基配列を有する siRNA発現ベクターを 、非ヒト動物の頸背部皮下へ注入することにより、 Int6の発現が低下した非ヒト動物を 作製することができる。より詳しくは、後述の実施例に記載の方法によって、本発明の トランスジエニック非ヒト動物を作製することができる。
[0079] 本発明のトランスジェニック動物の種類は、非ヒト動物であれば特に制限されないが 、通常、哺乳類であり、好ましくは霊長類である。より具体的には、本発明の動物とし て、好ましくはマウス、ラット、ハエ、線虫（C. Elegans)、ゥシ、ブタ、トリ、ヒッジであり、 より好ましくは、マウスである。また、植物において Int6に相当する遺伝子が存在する 場合、該遺伝子をターゲットとするノックダウン (トランスジエニック)植物を作製するこ とも可能である。
[0080] 好ましい態様においては、本発明のトランスジエニック非ヒト動物は、特に限定され るものではないが、以下の（a)〜（c)のいずれかの核酸の作用により、 Int6遺伝子の 発現が抑制されている動物である。
(a) Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b) Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c) Int6遺伝子の発現を RNAi効果による阻害作用を有する核酸
[0081] 本発明のトランスジヱニック非ヒト動物は、 Int6遺伝子の発現が抑制され血管新生が 誘導されているため、例えば、血管新生を阻害する物質あるいは薬剤（血管新生関 連疾患治療薬 (例えば抗癌剤））のスクリーニング、および、血管新生のメカニズムの 解析に非常に有用である。
[0082] また本発明は、 Int6の発現量もしくは活性を指標とする、血管疾患治療薬のスクリー ニング方法を提供する。
[0083] Int6遺伝子の発現量を低下 (抑制）させる化合物は、血管疾患治療のための薬剤と なることが期待される。反対に Int6遺伝子の発現量を上昇 (亢進）させる化合物は血 管新生に起因する疾患、例えば、癌等に対する治療のための薬剤となることが期待 される。 [0084] 本発明の上記方法の好ましい態様は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患 治療薬のスクリーニング方法である。
(a) Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における Int6遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる 化合物を選択する工程
[0085] また本発明の方法の別の態様としては、以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生 関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤）のスクリーニング方法である。
(a) Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における Int6遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる 化合物を選択する工程
[0086] 上記方法においては、まず Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させ る。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げら れるカ S、これらに由来する細胞に特に制限されず、 Int6を発現するように形質転換さ れた大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。「Int6遺伝子を発現 する細胞」としては、内在性の Int6遺伝子を発現している細胞、または外来性の Int6 遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性の Int6遺伝子が発現した細胞は、通常、 Int6遺伝子が揷入された発現ベクターを宿主 細胞へ導入することにより作製することができる。該発現べクタ一は、一般的な遺伝 子工学技術によって作製することができる。
[0087] 本方法に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、 有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物 ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微 生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
[0088] Int6遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、 Int6遺伝子を発現 する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定され ない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現する DNAベクター を、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
[0089] 本方法においては、次いで、該 Int6遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の 発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者 に公知の方法によって行うことができる。例えば、 Int6遺伝子を発現する細胞から mR NAを定法に従って抽出し、この mRNAを鎳型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法 または RT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができ る。また、 Int6遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、 Int6タンパク質の 発現を SDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を 行うこともできる。さらに、 Int6タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティ ング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳 量の測定を行うことも可能である。 Int6タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出 可能な抗体であれば、特に制限はなレ、が、例えばモノクローナル抗体、またはポリク ローナル抗体の両方を利用することができる。
[0090] 本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合 (対照）と比較して、 該発現量を低下させる化合物あるいは上昇させる化合物を選択する。低下させる化 合物は、血管疾患治療のための薬剤となり、反対に上昇させる化合物は、血管新生 を抑制することによって治療効果を発揮し得る疾患 (例えば、癌等）に対する治療薬 となる。
[0091] 本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明の Int6遺伝子の発現レベルを 低下あるいは上昇させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として選択する 方法である。
[0092] 本発明の上記方法の好ましい態様は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患 治療薬のスクリーニング方法である。
(a) Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有 する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程 [0093] また本発明の上記方法の別の態様は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生 関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤）のスクリーニング方法である。
(a) Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有 する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを上 昇させる化合物を選択する工程
[0094] 本方法においては、まず、 Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機 能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を 接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、 Int6遺伝子の転写調節領域に転写因 子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、 Int6遺伝子の 転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺 伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する 場合であっても、 Int6遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該 融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に 含まれる。 Int6遺伝子の cDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に 存在する Int6遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である
[0095] 本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制 限はなぐ例えば、 CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、および GFP遺 伝子等が挙げられる。 「Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的 に結合した構造を有する DNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が揷入され たベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方 法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、 リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リボフヱタミン法、マイクロインジヱクショ ン法等によって実施することができる。 「Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺 伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」には、染色体に該構造が 挿入された細胞も含まれる。染色体への DNA構造の挿入は、当業者に一般的に用 いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができ る。
[0096] 「Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有 する DNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含ま れる細胞抽出液に、 Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結 合した構造を有する DNAを添カ卩したものを挙げることができる。
[0097] 本方法における「接触」は、「Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機 能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、 または該 DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することによ り行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発 現する DNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
[0098] 本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポ 一ター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知 の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT遺伝子である 場合には、該遺伝子産物によるクロラムフエ二コールのァセチルイ匕を検出することに よって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子が lac Z遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色 を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現 産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、 GFP遺伝子 である場合には、 GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子 の発現量を測定することができる。
[0099] 本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化 合物の非存在下におレ、て測定した場合と比較して、低下（抑制）あるいは上昇 (亢進 )させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる化合物は、血管疾患治療のための薬 剤となり、反対に上昇 (亢進）させる化合物は、血管新生を抑制することによって治療 効果を発揮し得る疾患 (例えば、癌等）に対する治療薬となる。
[0100] 本発明のスクリーニング方法の他の態様は、 Int6タンパク質の活性を指標とする方 法である。上記方法は、例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬の スクリーニング方法である。
(a) Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と被検化 合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活 性を低下させる化合物を選択する工程
[0101] また本発明の上記方法の別の態様としては、例えば以下の（a)〜（c)の工程を含 む、血管新生関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤）のスクリーニング方法である。
(a) Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検 化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活 性を上昇させる化合物を選択する工程
[0102] 本方法においては、まず、 Int6タンパク質または該タンパク質を発現する細胞もしく は細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。
[0103] 次いで Int6タンパク質の活性を測定する。 Int6タンパク質の活性としては、例えば HI
F2 aとの結合活性 (相互作用活性)等が挙げられる。該活性の測定は当業者におい ては、公知の手法、例えば、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッド法等によって適宜実 施すること力 Sできる。
[0104] Int6との結合に関与する HIF2 α上のアミノ酸領域は、 HIF2 aのアミノ酸領域（配列 番号： 4)の 571〜700位である。従って、例えば、 HIF2ひタンパク質の前記アミノ酸領 域を含むポリペプチド断片を利用して、上記結合活性を測定することができる。なお 、 HIF2ひ遺伝子の塩基配列を配列番号： 3に、該遺伝子によってコードされるタンパ ク質のアミノ酸配列を配列番号: 4に記載する。なお、 HIF2ひ遺伝子の公共の遺伝子 データベースにおけるァクセッション番号は NM_001430である。
[0105] さらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該タンパク質の 活性を低下 (抑制）あるいは上昇 (亢進）させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる 化合物は血管疾患治療のための薬剤となり、反対に上昇 (亢進）させる化合物は血 管新生を抑制することによって治療効果を発揮し得る疾患 (例えば、癌等）に対する 治療薬となる。
[0106] また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、 Int6タンパク質と HIF2 αタン パク質との結合活性を指標とする方法を挙げることができる。本発明の Int6タンパク質 は、 HIF2ひタンパク質に対して結合 (相互作用）活性を有するタンパク質である。従つ て、 Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質の結合活性を指標として、該結合活性を増強 させる物質、あるいは低下（抑制）させる物質を選択することにより、血管疾患治療の ための薬剤もしくは血管新生を抑制することにより治療効果を発揮し得る疾患 (例え ば、癌等）に対する治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。
[0107] 本発明の上記方法は例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のス クリーニング方法である。
(a) Int6タンパク質および HIF2 αタンパク質と、被検化合物を接触させる工程
(b) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下 させる化合物を選択する工程
[0108] また本発明の上記方法としては、例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生 関連疾患治療薬 (例えば抗癌剤）のスクリーニング方法を挙げることができる。
(a) Int6タンパク質および HIF2ひタンパク質と、被検化合物を接触させる工程
(b) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇 させる化合物を選択する工程
[0109] 本方法においてはまず、 Int6タンパク質および HIF2ひタンパク質と、被検化合物を 接触させる。次いで、 Int6タンパク質と HIF2ひタンパク質との結合活性を測定する。
[0110] 通常、 Int6タンパク質と HIF2ひタンパク質の結合 (相互作用）活性を測定することは 、当業者においては簡便に行い得ることであり、上記工程 (b)の結合活性の測定は、 一般的な方法、例えば免疫共沈降方法等を利用して、適宜、実施することが可能で ある。
[0111] また、上記方法に使用する Int6タンパク質および HIF2 aタンパク質は、変異を含ま なレ、野生型タンパク質であることが好ましいが、相互作用活性を有するものであれば 、これらタンパク質の一部のアミノ酸配列が置換'欠失されたタンパク質（ポリペプチド )であってもよい。
[0112] 上記方法において用いられる Int6タンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質
(全長タンパク質)であることが好ましいが、 HIF2ひタンパク質との結合活性を保持し ている限り、その部分断片ペプチドであってもよぐまた、タンパク質の一部のアミノ酸 配列が置換 '欠失されたタンパク質 (ポリペプチド）であってもよい。
HIF2 aタンパク質との結合に関与する Int6タンパク質における領域は、通常、 N末に 存在する「Domainl」と呼ばれる領域である。従って、上記方法において使用する Int6 タンパク質は、「Domainl」を含む該タンパク質の部分断片ペプチドであってもよい。 なお、該「0011^111」は、配列番号： 2に記載の Int6タンパク質のアミノ酸配列において 、 1位〜 80位に相当する領域である。
[0113] 上記方法は次いで、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該 結合活性を低下 (抑制）あるいは上昇 (亢進）させる化合物を選択する。低下 (抑制） させる化合物は血管疾患治療のための薬剤となり、上昇 (亢進）させる化合物は血管 新生を抑制することによって治療効果を発揮し得る疾患 (例えば、癌等）に対する治 療薬となる。
[0114] 本発明の上記トランスジェニック非ヒト動物は、 Int6遺伝子の発現が抑制されており 、その結果、高い血管新生効果が観察される。該トランスジヱニック非ヒト動物を用い ることにより、血管新生を抑制させる化合物を、効率的にスクリーニングすることが可 能である。該スクリーニング方法によって取得される化合物は、血管新生関連疾患治 療薬 (例えば抗癌剤）として期待される。
[0115] 本発明のスクリーニング方法は、本発明のトランスジエニック非ヒト動物を利用し、 Int 6発現もしくは機能（活性）、あるいは、血管新生効果を指標とする方法である。
[0116] 例えば、上記方法は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリー ニング方法である。
(a)本発明のトランスジエニック非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
(b)前記トランスジヱニック非ヒト動物における Int6の発現量もしくは活性、あるいは、 該動物における血管新生効果を測定する工程
(c)被検化合物を投与しない場合 (対照）と比較して、 Int6の発現量もしくは活性を上 昇させる化合物、あるいは、血管新生効果を低下させる化合物を選択する工程
[0117] 本方法においてはまず、トランスジエニック非ヒト動物に被検化合物を投与する。被 検化合物の投与は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、被検化合物が ペプチドである場合には、非経口投与が好ましい。具体的には、血管投与、経鼻投 与、経肺投与、経皮投与等が挙げられる。血管投与の例としては、例えば、静脈内 注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等が挙げられ、全身または局部的に投 与すること力 Sできる。
[0118] 被検化合物が DNAである場合、生体内に投与する場合には、レトロウイルス、アデ ノウィルス、センダイウィルスなどのウィルスベクターやリボソームなどの非ウィルスべ クタ一を利用することができる。投与方法としては、 in vivo法および ex vivo法を例示 すること力 Sできる。
[0119] 次いで、トランスジエニック非ヒト動物（または該動物由来の組織もしくは細胞）にお ける Int6の発現量もしくは活性を測定する。あるいは、該動物（または該動物由来の 組織）における血管新生効果を観察する。
[0120] 次いで、被検化合物を投与しない場合 (対照）と比較して、 Int6遺伝子の発現量もし くは活性を低下させる化合物、あるいは、血管新生を抑制させる化合物を選択する。
[0121] 本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合 し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤として は、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とする こと力 Sできる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤 型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内 注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示 すこと力 Sできる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技 術は公知である。
[0122] 例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および 滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤に は、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、 炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結 合斉 ljには、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビュルピロリドン が用いられる。滑沢剤としては、タルクゃステアリン酸マグネシウム等が公知である。
[0123] 本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコー ティングを施すことができる。コーティング剤には、ェチルセルロースやポリオキシェ チレングリコール等を用いることができる。
[0124] また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒 に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶 剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生 理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油ゃプ ロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存 剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩ィ匕ナトリウムゃブドウ糖等の公知の 等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザノレコニゥムゃ塩酸プロ力インのよう な無痛化剤を添加することができる。
[0125] また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外 用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたもの と同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当 な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、ェチル アルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、 一般にベントナイト、ポリビュルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビ ニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩ィ匕ベンザノレコニゥム等の保存剤 を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロー ス誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
[0126] 本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物 に対して、必要量が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法 、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の 判断により適宜決定することができる。 [0127] なお、本発明における「治療薬」とは、治療効果を有する薬剤のほかに、予防効果 を有するものも含まれる。
[0128] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0129] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限 されるものではない。
〔実施例 1〕 酵母を用いたツーハイブリッドライブラリースクリーニング
酵母ツーハイブリッド法 (Clontech社)を用いて、タカラ社のヒト心臓または脳由来の ライブラリー（pACT2-cDNA)を用いて 1.2xl06個の遺伝子をスクリーニングしたところ 、 CL263クローンを得ることができた。シークェンスの結果、 CL263クローンが HIF2ひ と結合している領域のアミノ酸配列が Int6の 3aa_151aaと一致していたため、 CL263ク ローンは Int6であることが分かった。 Int6の機能は大部分が未解明である。今までに、 Int6が 3つのパーツを有することが知られている。レ、くつかの証拠から、正常な Int6の 機能はマウスやヒトの乳腺腫瘍発生の予防に重要であることが示唆されている。
[0130] 〔実施例 2〕 酵母細胞における HIF1 a、 HIF2 α、および HIF3 aと Int6の特異的な相 互作用
酵母ツーハイブリッド法によって、 Int6と HIF2 αとの結合 (相互作用）活性を評価し た。結果を表 1に示す。
[0131] [表 1]
Figure imgf000035_0001
その結果、 HIF2 aおよび Int6の組み合わせだけ、 aガラクトシダーゼ活性および β - aガラクトシダーゼ活性を有することが分かり、 HIF2 aと Int6が相互作用することが 判明した。
[0132] 〔実施例 3〕 MCF7、 A549、 COS7細胞における HIF2 αと Int6の相互作用
プラスミド pM印 HA-Int6wtを、 MCF7、 A549、 COS7の 3種の細胞にトランスフエクショ ンした。その後、 Int6は主に細胞のサイトソルで発現することが分かった。しかし細胞 死を起こしたため、 IF上での確認が困難であった。しかし一部核へ移行した Int6は HI F2 aとの共局在が観察された。
また、 Int6は HIF2 aと共にコトランスフエクシヨンすると、 HIF2 aの発現を抑えること が分かった (表 2)。
[0133] [表 2]
Figure imgf000036_0001
[0134] 〔実施例 4〕 Int6による HIF2ひの転写活性の制御
MCF7細胞において、 Int6の PINT (PCI)ドメインの有無が HIF2 a転写活性に影響を 及ぼすか否か、また、 Int6によって HIF2ひの転写活性が制御されるか否かについて 実験を行った。 HIF2 a 、 Int6PINT(PCI)ドメインが存在する Int6野生型（Int6 wt)、およ び Int6 PINT(PCI)ドメインを分子生物学的に削除した変異体 (Int6_ Δ C)を用いて、 酸素正常状態および低酸素状態で 4時間あるいは 24時間 MCF7細胞を培養した。
[0135] その結果、 Int6は、 PINT (PCI)ドメインを介して HIF2 a転写活性を調節することが分 力 た（図 2)。また Int6_ A Cは HIF2ひとの共発現により、正常酸素状態でも低酸素 状態下でも HIF2 αの転写活性を促進した。また、 Int6 wtは、 MCF7細胞の細胞死を 起こし、正常酸素状態でも低酸素状態下でも HIF2 αの転写活性を抑制した（図 2)。
[0136] 〔実施例 5〕 Int6の siRNAによる内在性 Int6遺伝子の発現抑制
siRNAによって、内在性 Int6が抑制されるか否かについて実験を行った。 Ambion社 の pSilence2.1-U6のベクターを用いて、ヘアピン siRNAl (Int6 siRNA 145)、 2 (Int6 si RNA 219)、 3 (Int6 siRNA 358)のインサートを設計し、 siRNA発現プラスミドを作製し た。そして、 siRNA発現プラスミドと Int6_ A Cを MCF7細胞にコトランスフエクシヨンした
[0137] 正常酸素状態あるいは低酸素状態で HRE (hypoxia response elements)ルシフェラ ーゼ活性を確認したところ、 siRNA2が正常酸素状態でも低酸素状態でも内在性 Int6 を最も抑制することが分かった（図 3A)。また正常酸素状態で、 MCF7細胞における I nt6- A Cの発現が、免疫染色法により確認された力 siRNA2によって Int6- A Cの発 現は確認されなかった（図 3B)。さらに低酸素状態で、 MCF7細胞における HIF2 aの 発現が siRNA2によって増加したことが確認された（図 3C)。
[0138] siRNAの in vitro抑制効果について、免疫染色法により確認した。その結果、 Int6- A Cの発現率は siRNAl、 2、 3によって 50%、 100%、 70%抑制されることが示された。 使用したヒ Hnt6オリゴ配列は以下の通りである。
[0139] 1. 5-Int6RNAi-145:
gAT CCC I AAC ATg gTA gAC TTT gCT A / TTC AAg AgA I T AgC AAA gTC TAC CAT gTT / TTT TTT / ggA AA (配列番号： 8)
2. 5-Int6RNAi-219:
gAT CCC I AAg AAC CAC AgT ggT TgC A I TTC AAg AgA I T gCA ACC ACT gTg gTT CTT / TTT TTT / ggA AA (配列番号： 5)
3. 5-Int6RNAi-358:
gAT CCC I AAg CAT ggT TTT Agg CAg g I TTC AAg AgA I C CTg CCT AAA
ACC ATg CTT I TTT TTT I ggA AA (配列番号： 6)
[0140] 上記のそれぞれの塩基配列において、下線は「センスオリゴ」および「アンチセンス オリゴ」を表す。該領域を二本鎖とする RNA分子は、 siRNAとして機能する。
[0141] 〔実施例 6〕 siRNAによる Int6遺伝子発現ノックダウン動物 (1) HVJ-E封入 siRNAの調製
マウス 1匹分の HVJ-E封入 siRNAの調製を以下のように行った。
40 μ 1： 1AU HVJ Envelope(HVJ-E)： GenomONE-Neo (石原産業）をマイクロチューブ にとる
i遠心： 12,000rpm、 4°C、 5分間
Ppt
丄 ΙΟ μ Ι 0.5mg/mlの psilencerl.0V6 mouse Int6_219あるいは対照として psilencerl.O V6 mouseGAPDHを加える
混合
丄 Ι μ ΐ試薬 B (封入剤）
混合
I遠心： 12, 000卬 m、 4°C、 5分間
Ppt
40 μ 1の PBSをカロえ、 20-30回のピペッティングで懸濁する。
以上は、 GenomONE-Neo (石原産業）の使用書に従って行った。
[0142] (2) siRNA (lnt6)のマウス血管新生作用の検討
生後 10週令のメス BALB/Cマウス（体重 25g前後）を実験に使用した。 Int6のべクタ 一型 siRNAを皮下注射する前々日に、マウスの頸背部分を除毛クリームで処理した。 実験当日に、マウスをハロセン麻酔し、頸背部皮下に 27GX3/4のシリンジで、 50 μ 1の HVJ-Eに封入した siRNAを注入した。その後、普通給餌'給水で 5日間飼育した。続 いて、該マウスを頸椎脱臼により屠殺し、 siRNA注入部を中心に 1.5cm2ほどの皮膚を 切除した。皮膚裏面を撮影後、ホルマリンで固定した。
対照 siRNAと比較した結果、 Int6 siRNA 1, Int6 siRNA3、 Int6 siRNA2の順に血管新 生を高く促進することが示された。
[0143] 使用したマウス Int6オリゴ配列を以下に示す。各オリゴ配列はマウスの配列をもとに 作製した。
(l) Int6 siRNA 1 145
5，— AAT ATg gTg gAC TTT ^CT A/TTC AAg AgA/T AgC AAA gTC CAC CAT A TT/TTT TTT (配歹' J番号： 9)
(2) Int6 siRNAi -2-219:
5' -AAg AAC CAC AgT TgT TgC g I TTC AAg AgA I C gCA ACA ACT gTg gTT CTT / TTT TTT (配列番号： 10)
(3) Int6 siRNAi -3 358
5， -AAA CAT ggg TTT Agg CAA g/TTC AAg AgA/C TTg CCT AAA CCC ATg T TT/TTT TTT (配列番号：11)
上記のそれぞれの塩基配列において、下線は「センスオリゴ」および「アンチセンス オリゴ」を表す。該領域を二本鎖とする RNA分子は、 siRNAとして機能する。
[0144] 〔実施例 7〕ホルモン処理による Int6 mRNAの発現抑制
乳癌の培養細胞株 MCF-7に estrogen (エストラジオール、 E2)、または progesteron ( Progestin), estrogen受容体抑制剤タモキシフェン (40H-TAM)を加え、 24時間培養 した後、細胞の mRNAを抽出し、 Real Time PCRにて mRNA量を定量した。
その結果、図 5に示すように各種女性ホルモン処理によって、 Int6遺伝子の発現が 抑制されることが分った。また、エストラジオール (E2)よりも progesteronによる抑制効 果がより明確に観察された。
[0145] 〔実施例 8〕 HIF2 aを介した Int6の血管新生の制御機構
酵母 Two Hybrid法および VEGFプロモーターアツセィを用いた研究結果から、 Int6 は HIF2 aと直接相互作用をすること（図 11)、および、 HIF2 αの C端にある 571_640a aの領域に結合部位があること（図 12)が判明し、さらに HIF1 aにおける VHLと同様に 、 HIF2 aの低酸素ストレス応答遺伝子の転写を強く抑制することを見出した。
一方、 MMTVで変異した際に作られる C末端の欠損した恒常不活化型（ドミナントネ ガティブ）変異体は、野生型とは正反対に、 HIF2ひの発現と転写活性を約 2倍に上 昇させた（図 13)。この結果は、 MMTVのゲノムへのインテグレート (integration)の際 に起こる Int6の変異が、 HIF2 aの長期間にわたる活性上昇による細胞増殖、血管新 生を誘導し、癌化に至るという新たな癌化の機序を明らかにするものである。
Int6は C末端にプロテアゾームのリツド（蓋の部分）に結合する領域を持ち、 Int6に結 合した HIF2 aをプロテアゾームに引き込むことによって分解させることが Int6の HIF2 α制御の本質であると理解できる。これまでは HIF2 aの低酸素非依存的側面が報告 されていたが、本発明者らによって、 HIF1 αが 100%低酸素依存的であることに反し、 HIF2 aの低酸素非依存的分解は Int6で制御されていることが明らかになった。即ち、 HIF2 aの制御は主として Int6により行われてレ、ると考えられる。
Int6遺伝子の発現もしくは Int6の機能 (HIF2 aとの結合活性等）を阻害する物質は 、低酸素とは関係なく HIF2ひの発現、核内への移行を促進することにより、低酸素ス トレス応答遺伝子群の転写を促進させ、血管新生効果を示すことが期待される。この ような物質は、高い血管新生効果と特異性が期待され、閉塞性動脈硬化症、経皮的 血管拡張術 (PCT)後再狭窄、心筋梗塞等の種々の血管疾患に対して治療効果を有 することが期待される。
[0146] 〔実施例 9〕 Int6遺伝子に対するマウス siRNA(Int6-siRNA)のマウス皮下導入による正 常血管新生
siRNAの発現ベクターをマウスの皮下に GenomeOne (HVJ-エンベロープ遺伝子導 入試薬:石原産業)を用いて遺伝子導入したところ、導入 5日後には、顕著な血管新 生効果が得られることを見出した（図 14)。新生血管の解析ソフト (クラボウ）を用いた 結果、血管面積、血管長とも 5-10倍の増加が有意に認められた（図 15)。
これらの結果は導入したベクターの量に比例し、発現した siRNAの効果依存性が明 確に観察された。また、 in vitro血管新生解析キット（クラボウ）を用いて詳細な解析を 行った結果、合成型 siRNAによる効果も容量依存的に確認され、さらに、 HIF2ひの過 剰発現による血管新生効果も明確であり、 Int6_siRNAが内因性の HIF2 αの発現誘 導を起こし、血管新生因子群が誘導されたことが強く示唆された。
病理学的解析では、新生された血管は、内皮、弾力繊維を持つ正常動脈であり、 腫瘍性血管新生で見られるような出血斑は皆無であった。また、 Int6の siRNA発現べ クタ一は主として血管内皮の線維芽細胞に導入され、この線維芽細胞から血管新生 因子群が分泌されてレ、ることが示唆された（図 16)。
[0147] 〔実施例 l l〕Int6_siRNAの細胞導入による癌化の否定の確認
Int6は、乳がんやその他の癌化の際に癌抑制因子として作用することが明確になつ た。このことは、特異的 siRNAの細胞への導入の際に、癌化を起こす恐れが懸念され 、特に臨床応用される場合には大きな問題となりうる。この問題を詳細に検討するた め、本発明者らは、細胞導入時に常時 Int6_siRNAを発現するベクター型 siRNAを細 胞に導入し長期間観察した。 MCF-7や HeLa細胞などの癌化細胞株では、内因性 Int 6を完全に抑制するベクター型 siRNAの導入によって、細胞の生存が短縮され、 7週 間以内に細胞の増殖が止まり、細胞死を誘導した。これは、 Int6の役割のひとつとし て翻訳調節があり、完全な抑制は翻訳調節に異常をきたすことによるためと解釈でき る。
さらにマウスから得られた初代培養線維芽細胞を用いた実験、およびクラボウ社の 血管新生解析用培養細胞を用いた実験では、 11日間の観察の結果、 siRNA発現べ クタ一及び合成型 siRNAの導入にて、有効な血管新生が見られたものの、癌化は全 く観察されなかった。
産業上の利用可能性
[0148] 低酸素ストレス応答に関与する遺伝子の中に転写因子 HIF (hypoxia-inducible fact or;低酸素反応性因子）が報告されている。この因子は、腫瘍の血管新生に必須であ る VEGF (血管内皮細胞増殖因子）を作り出し、さらには、ミトコンドリアでのエネルギ 一代謝に関わる多くの解糖系酵素の転写制御を行うことが知られている。固形腫瘍（ 例えば癌）では、血流が豊富にあるにも関わらず、腫瘍内部ではかなり低酸素状態と なっており、この状態が更に血管新生を促す結果となっている。血管新生のほかにも 、 HIFは細胞内においてさまざまな役割を担っており、例えば低酸素時の赤血球増 殖にはエリスロポエチン遺伝子の発現亢進が必要であり、血管新生には VEGF遺伝 子の発現増加が重要である（図 6)。
[0149] HIF1 aは、通常の酸素濃度 (21%)ではュビキチン'プロテアソームによって分解され ているが、低酸素状態ではこの分解から免れて核内に移行することにより転写因子と してさまざまな因子の誘導を惹起する。 HIF自体は HIF1 a、 HIF2 a、 HIF3 aの 3種に 大きく分かれ、 HIF1 aがュビキタスに発現するのと異なり、 HIF2 aは血管内皮、脳の グリア、線維芽細胞、骨格筋や心筋に、 HIF3 aは脳神経系に特異的に発現する。 HI Fl aは脳梗塞あるいは心筋梗塞等の虚血疾患に関連することが明らかとなっている 。一方、 HIF2 aは、低酸素ストレスが関連する疾患の中でも癌の血管新生に関与す る。 HIF1 αの細部内挙動が明らかにされつつあるのに対し、 HIF2 αに関しては結合 する因子が幾つか報告されているものの、その機能を制御する因子に関しては全く 明らかにされていなレ、。 HIF2ひは血管新生に深く関与することから、その細胞内挙動 を制御することにより、新たな血管新生の誘導が可能となることが予想されたため、本 発明者らはこの HIF2 αに関して新たな制御因子の解析を行った。
[0150] 本発明者らは、酵母 Two Hybrid法を用いて、ヒトの心筋または脳のライブラリーから 、 HIF2ひと相互作用を示す因子として新たに 6因子の同定に成功した（図 7)。この中 で Int6はマウス及びヒトにて乳がんの癌抑制因子として報告されてきた力 作用機序 は全く不明のままであった。
[0151] Int6はもともと翻訳調節因子の 1つである eIF3e/p48である力 マウス乳がん発症ウイ ルス (MMTV:Mouse Mammalian Tumor Virus)がマウスに感染した際に 9力所の遺伝 子座にインテグレート (integration)され、その箇所の標的遺伝子を破壊する。この破 壊された遺伝子の 6番目のインテグレート (integration)サイトに当たること力ら Int6とし て命名された。 MMTVの感染により Int6は C末端の一部が欠損した、いわば恒常不活 化型 (ドミナントネガティブ)変異体 (Int6- Δ C)が生じ、乳がんを発症することが発見さ れた（図 8)。し力 ながら、何故この変異体が乳がんを発症するかについての機序は 不明であった。
[0152] 本発明によって、 HIF2ひに結合する因子として Int6タンパク質が同定され、さらに In t6の発現もしくは機能を阻害する物質、および Int6のドミナントネガティブ変異体 (Int6 _ Δ は、 HIF2ひの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を増強させることにより 、血管新生効果を上昇させることが可能であることが初めて見出された。
[0153] 特に、 Int6の発現抑制効果を有する物質は、高レ、血管新生効果が期待され、閉塞 性動脈硬化症、経皮的血管拡張術 (PCT)後再狭窄、心筋梗塞等の治療への応用 が期待される。中でも、 Int6の特異的発現抑制効果が期待される siRNAは、転写制御 因子の機能抑制により、治療効果を有する遺伝子の発現を亢進させるという、全く新 しいコンセプトの治療薬となる可能性がある。
[0154] また本発明者らは、従来、翻訳調節因子（eIF3e)、あるいは乳がん癌抑制因子とし て報告された Int6を、 siRNA発現ベクターでノックダウンすることにより、癌化を全くお こさず正常な動脈の新生が可能であることをマウスを用いた動物実験で示した。また 、 siRNAの標的細胞は線維芽細胞等のキヤリヤー細胞であることを明らかにした。この ことは、患者から採取した線維芽細胞等のキヤリヤー細胞を培養 ·増殖させ、 ex vivo で合成 siRNAを導入後、患部に自家移植することにより、新しい動脈を発生させうる 可能性を強く示すものである。 siRNAを導入した患者から採取した細胞（siRNA処理 血管新生誘導細胞）を患部に戻す自家移植法を行えば、 siRNA薬開発のボトルネッ クであるキャリアー開発は不要となる。
[0155] 治療法の開発を目指す閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞などの疾患は、生 活習慣病の増加に伴い、今後、益々患者数の増加が見込まれ、新生血管を構築す ることにより治癒が期待される疾患である。また、肝硬変における肝実質細胞への血 流再開や神経筋変性疾患の際の血管造成による筋肉再生にも応用が期待できる。 一方、胎生幹細胞 (ES細胞)や間質幹細胞を用いた再生医療においても、再構築さ れた組織への血液循環を確保する上で、血管新生は不可欠である。
[0156] 本発明においては、 Int6に対する合成 siRNAで処理した患者自身の線維芽細胞等 のキヤリヤー細胞（siRNA処理血管新生誘導細胞）を自家移植することにより、閉塞性 動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞の治療、肝臓再生など再生医療に応用可能な新生 血管バイパス治療法を提供する。本発明の新生血管バイパス治療法の一例として、 該方法の基本概念図を図 9に示す。
[0157] 本願の実施例で示すように、本発明者らは、 Int6の発現若しくは機能を阻害する物 質が、動脈性血管新生を効果的に上昇させること、および、動物実験レベルで確認 することを実証した。とりわけ、 Int6遺伝子の特異的発現抑制効果が期待される siRN Aは、転写制御因子の発現抑制により、血管疾患に対して治療効果を有する遺伝子 群の発現を亢進させるという、全く新しいコンセプトの血管疾患治療薬となることが大 いに期待される。従来の血管新生を目的とした遺伝子治療が、 目的遺伝子のみを強 制的に発現させていたのに対し、本コンセプトの siRNA薬（血管新生誘導 siRNA薬） は、標的遺伝子の発現を特異的に抑制することにより血管新生に必須な目的遺伝子 群の発現を全体的に上昇させることが可能であることから、高い治療効果が得られる ことが期待される。 [0158] 本発明の動物実験の結果の詳細な検討から、血管新生誘導 siRNAは繊維芽細胞 において効果を発現している可能性が示唆された。このことは、繊維芽細胞において Int6遺伝子の発現を特異的に抑制することにより、血管新生に効果的な低酸素ストレ ス応答遺伝子群を網羅的に発現する、全く新しいコンセプトの「siRNA処理血管新生 誘導細胞」として利用できる可能性を示している（図 10)。繊維芽細胞は患者自身か ら入手し、増殖させた後、 自家移植が容易であることから、「siRNA処理血管新生誘 導細胞」移植時の拒絶反応等の可能性は低いと予想される。
[0159] 線維芽細胞等のキヤリヤー細胞の自家移植に関しては、既に人工皮膚として利用 されている実績があり、その際のプロトコールに従って「siRNA処理血管新生誘導細 胞」の調製が可能であると考えられる。具体的には、患者自身のウィルス検査陰性の 皮膚小片から線維芽細胞等のキヤリヤー細胞を採取し、大量培養してマスターセル とワーキングセルを作成する。このマスターセルについては、再度ウィルス検査を行 い陰性であることを確認した後、ワーキングセルを順次解凍して継代培養して「siRNA 処理血管新生誘導細胞」用のキヤリヤー細胞を調製する。調製の際、マイコプラズマ 検査ならびに細菌 ·真菌検査を行い陰性であることを確認することが必要となる。調 製した「siRNA処理血管新生誘導細胞」用のキヤリヤー細胞は凍結保存し、必要に応 じて供給が可能である。
[0160] さらに、血管新生誘導性 siRNAの患者由来繊維芽細胞への導入を、 ex vivoでのェ レクト口ポレーシヨン法等を介して行うことにより、高い導入効率が達成可能である。こ の方法は、 目的遺伝子発現ベクターにより移植用の細胞を調製する方法 (遺伝子治 療法）と比較して、 siRNAによる一過性の「siRNA処理血管新生誘導細胞」化であるた め、遺伝子改変による細胞の癌化等の可能性が低ぐ極めて安全性の高い方法であ ると言える。同時に、従来の siRNA薬開発において問題といわれていた特殊なデリバ リーシステムを必要としない。
[0161] また、本発明の「siRNA処理血管新生誘導細胞」におけるキヤリヤー細胞は、患者 力もの採取および増幅が容易である。また骨髄単核球細胞移植においては、血管新 生効果を発揮する本体である血管内皮前駆細胞が血流を通じて供給されるため、著 しく血流が停滞した部分には効果が発揮しにくいことが予想される。また、本実用化 研究における「siRNA処理血管新生誘導細胞」は、直接注射により任意の部位に移 植することが可能であるため、血流の停滞部位にも効果が期待される。カロえて、血流 停滞部では低酸素状態になっており、この低酸素状態がさらに「siRNA処理血管新 生誘導細胞」の内因性 HIF2 a活性を上昇させることが期待でき、相乗的な効果を得 られる可能性が考えられる。
本発明によって Int6が、創薬のための好適なターゲット分子となることが見出された
。本発明によって見出された各種知見は、低酸素ストレス応答のメカニズムの解明の ための学術的な知見としても非常に有用である。

Claims

請求の範囲
[1] Int6タンパク質の発現抑制物質または機能抑制物質を有効成分として含有する、 低酸素ストレス応答促進剤。
[2] Int6タンパク質の発現抑制物質が、以下の（a)〜（c)からなる群より選択される化合 物である、請求項 1に記載の低酸素ストレス応答促進剤。
(a) Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b) Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c) Int6遺伝子の発現を RNAi効果による阻害作用を有する核酸
[3] Int6タンパク質の発現抑制物質が、女性ホルモン、女性ホルモン分泌促進剤、また は女性ホルモン受容体ァゴニストである、請求項 1に記載の低酸素ストレス応答促進 剤。
[4] Int6タンパク質の機能抑制物質が、以下の（a)〜（c)からなる群より選択される化合 物である、請求項 1に記載の低酸素ストレス応答促進剤。
(a) Int6タンパク質と結合する抗体
(b) Int6タンパク質と結合する低分子化合物
(c) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を阻害する化合物
[5] 低酸素ストレス応答促進が血管新生の誘導である、請求項:!〜 4のいずれかに記載 の低酸素ストレス応答促進剤。
[6] Int6タンパク質の発現亢進物質または機能亢進物質を有効成分として含有する、 低酸素ストレス応答抑制剤。
[7] Int6タンパク質の発現亢進物質力 女性ホルモン抑制剤である、請求項 6に記載の 低酸素ストレス応答抑制剤。
[8] 低酸素ストレス応答抑制が血管新生の抑制である、請求項 7に記載の低酸素ストレ ス応答抑制剤。
[9] 請求項：!〜 5のいずれかに記載の低酸素ストレス応答促進剤を有効成分として含有 する、血管疾患治療薬。
[10] 血管疾患が、虚血性脳もしくは心疾患、神経変性疾患、外傷性脳障害、または、肝
、膝、筋肉、もしくは皮膚疾患である、請求項 9に記載の血管疾患治療薬。
[11] 請求項 6〜8のいずれかに記載の低酸素ストレス応答抑制剤を有効成分として含有 する、血管新生関連疾患治療薬。
[12] 血管新生関連疾患が癌疾患である、請求項 11に記載の血管新生関連疾患治療 薬。
[13] Int6遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、トランスジェニック 非ヒト動物。
[14] 以下の（a)〜（c)のいずれかの核酸の作用により、 Int6遺伝子の発現が抑制されて レ、ることを特徴とする、請求項 13に記載のトランスジエニック非ヒト動物。
(a) Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b) Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c) Int6遺伝子の発現を RNAi効果によって阻害する作用を有する核酸
[15] 血管新生効果が促進されていることを特徴とする、請求項 13または 14に記載のトラ ンスジエニック非ヒト動物。
[16] Int6遺伝子の発現量もしくは Int6タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する ことを特徴とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
[17] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a) Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における Int6遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる 化合物を選択する工程
[18] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a) Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有 する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程
[19] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a) Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検 化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活 性を低下させる化合物を選択する工程
[20] Int6タンパク質と HIF2 αタンパク質との結合活性を抑制する化合物を選択すること を特徴とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
[21] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a) Int6タンパク質および HIF2 αタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下 させる化合物を選択する工程
[22] Int6遺伝子の発現量もしくは Int6タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択する ことを特徴とする、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
[23] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a) Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における Int6遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる 化合物を選択する工程
[24] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a) Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有 する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを上 昇させる化合物を選択する工程
[25] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a) Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検 化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程 (c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活 性を上昇させる化合物を選択する工程
[26] Int6タンパク質と HIF2 αタンパク質との結合活性を亢進させる化合物を選択するこ とを特徴とする、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
[27] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a) Int6タンパク質および HIF2ひタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b) Int6タンパク質と HIF2 aタンパク質との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇 させる化合物を選択する工程
[28] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
(a)請求項 13〜： 15のいずれかに記載のトランスジエニック非ヒト動物に被検化合物を 投与する工程
(b)前記トランスジヱニック非ヒト動物における Int6の発現量もしくは活性、あるいは、 該動物における血管新生効果を測定する工程
(c)被検化合物を投与しなレ、場合と比較して、 Int6の発現量もしくは活性を上昇させ る化合物、あるいは、血管新生効果を低下させる化合物を選択する工程
[29] Int6のドミナントネガティブ変異体を有効成分として含有する、血管新生誘導剤。
[30] Int6のドミナントネガティブ変異体力 Int6タンパク質の C末領域の PINT領域が欠損 された Int6タンパク質変異体である、請求項 29に記載の血管新生誘導剤。
[31] Int6タンパク質、または、 Int6タンパク質を発現するベクターを有効成分として含有 する、血管新生抑制剤。
[32] Int6遺伝子の発現が抑制され血管新生が誘導されてレ、ることを特徴とするキヤリャ 一細胞。
[33] Int6遺伝子に対する siRNAが導入された、請求項 32に記載のキヤリヤー細胞。
[34] 請求項 31に記載の血管新生抑制剤、または、請求項 32もしくは 33に記載のキヤリ ヤー細胞を有効成分として含有する、血管疾患治療薬。
[35] 単離されたキヤリヤー細胞へ、 Int6遺伝子に対する siRNAを導入する工程を含む、 血管疾患治療薬の製造方法。
PCT/JP2006/309720 2005-05-16 2006-05-16 低酸素ストレス応答に関与するInt6タンパク質、およびその利用 WO2006123644A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007516291A JPWO2006123644A1 (ja) 2005-05-16 2006-05-16 低酸素ストレス応答に関与するＩｎｔ６タンパク質、およびその利用
AU2006248487A AU2006248487A1 (en) 2005-05-16 2006-05-16 Int6 protein involved in hypoxia stress response and use thereof
EP06746434A EP1902729A1 (en) 2005-05-16 2006-05-16 Int6 PROTEIN INVOLVED IN HYPOXIA STRESS INDUCTION AND USE THEREOF
CA002609102A CA2609102A1 (en) 2005-05-16 2006-05-16 Int6 protein involved in hypoxia stress induction and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-142553 2005-05-16
JP2005142553 2005-05-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006123644A1 true WO2006123644A1 (ja) 2006-11-23

Family

ID=37431216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/309720 WO2006123644A1 (ja) 2005-05-16 2006-05-16 低酸素ストレス応答に関与するInt6タンパク質、およびその利用

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1902729A1 (ja)
JP (1) JPWO2006123644A1 (ja)
KR (1) KR20080044205A (ja)
CN (1) CN101237884A (ja)
AU (1) AU2006248487A1 (ja)
CA (1) CA2609102A1 (ja)
WO (1) WO2006123644A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010110268A1 (ja) * 2009-03-23 2010-09-30 財団法人東京都医学研究機構 細胞死を予防するための医薬剤

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11866707B2 (en) 2022-05-18 2024-01-09 Zhejiang Cancer Hospital Use of non-coding RNA SNHG17 as biomarker and therapeutic target

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11500004A (ja) * 1995-02-09 1999-01-06 アメリカ合衆国 腫瘍遺伝子Ｉｎｔ６のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11500004A (ja) * 1995-02-09 1999-01-06 アメリカ合衆国 腫瘍遺伝子Ｉｎｔ６のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN L. ET AL.: "Suppression of Int6 by SiRNA induces potent angiogenesis through HIF2alpha", SEIKAGAKU, vol. 77, no. 8, 25 August 2005 (2005-08-25), pages 848, 2P-645, XP008073185 *
ISHIKAWA Y. ET AL.: "Analysis of novel angiogenic factors regulated by Int6 in DNA microarray", SEIKAGAKU, vol. 77, no. 8, 25 August 2005 (2005-08-25), pages 1038, 4P-262, XP008073187 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010110268A1 (ja) * 2009-03-23 2010-09-30 財団法人東京都医学研究機構 細胞死を予防するための医薬剤
JP2010222289A (ja) * 2009-03-23 2010-10-07 Tokyoto Igaku Kenkyu Kiko 細胞死を予防するための医薬剤

Also Published As

Publication number Publication date
CN101237884A (zh) 2008-08-06
KR20080044205A (ko) 2008-05-20
AU2006248487A1 (en) 2006-11-23
JPWO2006123644A1 (ja) 2008-12-25
EP1902729A1 (en) 2008-03-26
CA2609102A1 (en) 2006-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tiwari et al. Loss of HIF1A from pancreatic cancer cells increases expression of PPP1R1B and degradation of p53 to promote invasion and metastasis
KR101573009B1 (ko) 세포막 재봉합을 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP4351896B2 (ja) ｐ３８／ＪＴＶ−１を有効成分とする癌治療用薬学的組成物及び癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法
JP2007195555A (ja) 遺伝子発現を誘導するための組成物および方法
JP2013121357A (ja) タンパク質、それをコードする核酸および関連する使用方法
KR20160007671A (ko) 당쇄 관련 유전자, 및 그의 이용
EP1900374B1 (en) Angiogenetic agent containing adrenomedulin as the active ingredient
Stavarache et al. The tumor suppressor PTEN regulates motor responses to striatal dopamine in normal and Parkinsonian animals
US7345158B2 (en) Actin related cytoskeletal protein “LACS”
JP2006213621A (ja) Ａｄｏｐｌｉｎタンパク質、およびその利用
WO2020121546A1 (ja) 活性型肝星細胞の脱活性化方法
US8232447B2 (en) Animal having modification in MGAT2 gene
WO2006123644A1 (ja) 低酸素ストレス応答に関与するInt6タンパク質、およびその利用
US20230192784A1 (en) KLF Induced Cardiomyogenesis
CN110812470A (zh) 用于代谢调节的方法和组合物
US20040115195A1 (en) Pharmaceutical compositions and methods of using secreted frizzled related protein
CN115381949A (zh) 靶向抑制色素上皮衍生因子在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用
JP2022550954A (ja) 治療
US20040241797A1 (en) Use of alphacp1, alphacp2, and hur for modulating gene expression and inducing angiogenesis
WO2019024518A1 (zh) 通过调控yb-1磷酸化治疗mcp-1参与的疾病的药物
WO2017126655A1 (ja) 疼痛の予防または治療用医薬組成物およびＲｏｂｏ４を用いる疼痛抑制物質のスクリーニング方法
EP3978018A1 (en) Novel therapeutic agent for digestive organ cancer, and screening method for same
JPWO2006006337A1 (ja) 神経疾患の予防又は治療薬
US11207426B2 (en) Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression
Zhang et al. Phosphorylation dependent mitochondrial translocation of Nr4a3 provokes cardiomyocyte death

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680025660.9

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007516291

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2609102

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 8799/DELNP/2007

Country of ref document: IN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006248487

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006746434

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020077029242

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006248487

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20060516

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006248487

Country of ref document: AU