WO2017126655A1 - 疼痛の予防または治療用医薬組成物およびＲｏｂｏ４を用いる疼痛抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2017126655A1
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robo4
substance
unc5b
pain
expression
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PCT/JP2017/001930
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山下　俊英
泰史 早野
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国立大学法人大阪大学
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating pain.
  • the present invention also relates to a method for screening a pain suppressor using Robo4.
  • QOL Quality Of Life
  • establishing a pain therapy is a very important medical issue.
  • there is a very high medical need for neuropathic pain which has a low therapeutic effect with nonsteroidal anti-inflammatory drugs and opioid analgesics.
  • Non-patent Document 1 Clarifying the molecular mechanisms involved in the onset and maintenance of neuropathic pain will lead to the development of breakthrough therapeutics, which will lead to the solution of one of the greatest medical challenges in the 21st century.
  • the dorsal horn of the spinal cord is considered to be one of the main causes of neuropathic pain (Non-Patent Document 2). Sensory input from the periphery is transmitted to the brain after various modifications such as amplification, inhibition, and integration in the dorsal horn of the spinal cord.
  • Non-Patent Document 2 Sensory input from the periphery is transmitted to the brain after various modifications such as amplification, inhibition, and integration in the dorsal horn of the spinal cord.
  • the neural network in the dorsal horn of the spinal cord changes such as abnormal axon side branch formation and increased synaptic transmission, leading to pain.
  • Reference 3 From this, it is expected that the elucidation of a novel molecular mechanism that controls the neural circuit in the dorsal horn of the spinal cord will lead to the creation of a new target molecule necessary for the development of a breakthrough therapeutic drug for pain.
  • Robo4 (Round-about IV4) is a single transmembrane protein (Non-patent Document 4). Although it has been classified into one of the Robo family, which is a receptor for the axon repulsion factor Slit, it has recently been reported to have a binding domain with Slit and bind to the Unc5B receptor (Non-patent Document 5). ). Robo4 has been reported to be expressed specifically in vascular endothelial cells, and has been reported to have a function of inhibiting angiogenesis (Non-patent Documents 6 and 7). However, there has been no research report that clarifies the function of Robo4 in the adult spinal cord, and it has not been elucidated at all whether it is involved in the development of neuropathic pain.
  • Robo4 maintains vessel integrity and inhibits angiogenesis by interacting with UNC5B. Dev. Cell 20, 33-46 (2011). Okada, Y. et al. A three-kilobase fragment of the human Robo4 promoter directs cell type-specific expression in endothelium. Circ. Res. 100, 1712-22 (2007). Okada, Y. Regulation of Endothelial Cell-specific Robo Gene Expression by DNA Methylation and Non-lineage Specific Transcription Factors. Yakugaku Zasshi 134, 817-21 (2014).
  • An object of the present invention is to find a molecule involved in the onset of pain and provide a screening method for a pain suppressing substance. It is another object of the present invention to provide a novel pharmaceutical composition for preventing or treating pain.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating pain comprising as an active ingredient a substance that inhibits the expression of Robo4 or a substance that inhibits the binding of Robo4 and Unc5B.
  • the substance that inhibits Robo4 expression is a nucleic acid that inhibits Robo4 expression or a substance that inhibits a transcription promoter of the Robo4 gene.
  • the substance that inhibits the binding between Robo4 and Unc5B is an antibody or peptide that specifically binds to Robo4.
  • a pain suppressing substance useful as a preventive or therapeutic agent for pain can be obtained.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for the prevention or treatment of pain.
  • the present inventors have reported that Robo4, which is reported to be expressed specifically in vascular endothelial cells, is a neuropathic pain model rat (Seltzer. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 43 , 205-218 (1990)), Robo4 positive cells were observed in the dorsal horn of the spinal cord on the sciatic nerve injury side, and the Robo4 positive cells were found to be astrocytes. Furthermore, the present inventors conducted various confirmation experiments, and that Robo4 has an action of enhancing the pain response in the spinal cord, and that the pain response enhancement signal of Robo4 is transmitted downstream by binding of Robo4 to the Unc5B receptor. It revealed that.
  • the present invention provides a screening method for a pain suppressing substance.
  • the screening method of the present invention only needs to use Robo4.
  • Robo4 used in the screening method of the present invention may be a protein or a gene. When Robo4 is a protein, it may be a full-length protein or a functional fragment.
  • Robo4 used in the screening method of the present invention may be any organism-derived Robo4 and is not particularly limited, but mammalian Robo4 is preferable. As mammals, humans, chimpanzees, monkeys, dogs, cows, mice, rats, guinea pigs and the like are preferable, and humans are more preferable. Information on the base sequence and amino acid sequence of the gene encoding Robo4 of various animals can be obtained from a known database (DDBJ / GenBank / EMBL, etc.) with accession numbers shown in Table 1, for example.
  • test substances for example, nucleic acids, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, mammalian tissue extracts, plasma, etc. are preferably used. be able to. However, it is not limited to these.
  • the test substance may be a novel substance or a known substance. These test substances may form a salt.
  • a salt of a test substance a salt with a physiologically acceptable acid or base is used.
  • the present inventors suppress the pain when Robo4 siRNA is administered into the spinal cord cavity of a neuropathic pain model rat to inhibit the expression of Robo4, and the transcription factor of the Robo4 gene is added to the neuropathic pain model rat. It has been confirmed that pain is suppressed when an inhibitor is administered to inhibit the expression of Robo4 (see Examples). Therefore, it is considered that a substance that inhibits the expression of Robo4 can suppress pain.
  • a substance that inhibits the binding between Robo4 and Unc5B by the screening method of the present invention.
  • the inventors of the present invention have shown that administration of Unc5B siRNA into the spinal cord can inhibit the expression of Unc5B, and then administration of Robo4 protein into the spinal cord can suppress the enhancement of pain response by administration of Robo4 protein. Confirmed (see Examples). Therefore, it is considered that a substance that inhibits the binding between Robo4 and Unc5B can inhibit signal transmission downstream of Robo4 and suppress pain caused by peripheral neuropathy.
  • a step of contacting a test substance with a cell expressing Robo4 a step of measuring the expression level of Robo4 in the cell, and the expression
  • a screening method comprising a step of comparing the expression level of Robo4 in the cells not brought into contact with the test substance and selecting a test substance that decreases the expression level of Robo4 can be used.
  • Cells expressing Robo4 may be in vivo cells or cultured cells. The cultured cells may be primary cultured cells or cell lines.
  • Examples of primary cultured cells include human umbilical artery endothelial cells (HUAEC), and examples of cell lines include Hela cells, HEK293 cells, and COS7 cells.
  • Robo4 expression transformed cells transformed with a recombinant expression vector containing DNA encoding Robo4 can be used.
  • the method for bringing the test substance into contact with the cells is not particularly limited as long as the test substance can be brought into contact with the cells.
  • a method of adding a test substance to the medium can be mentioned.
  • examples include systemic administration such as oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, and local administration to a target organ or target tissue.
  • the amount of Robo4 expressed may be measured by measuring the amount of Robo4 protein or by measuring the amount of Robo4 mRNA.
  • the protein can be extracted from the cell by a known method and quantified using a known method for measuring the amount of protein.
  • known protein amount measurement methods include Western blot method, EIA method, ELISA method, RIA method, and a method using a protein measurement reagent.
  • RNA can be extracted from the cells by a known method and quantified using a known method for measuring the amount of mRNA.
  • Known methods for measuring the amount of mRNA include Northern blotting, RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNase protection assay, and the like.
  • the test substance is selected as the target substance Can be rubbed.
  • the degree to which the test substance decreases the amount of protein or mRNA of Robo4 is not particularly limited.
  • a test substance that reduces the amount of protein or mRNA to 50% or less of cells not contacted with the test substance is preferable. More preferably, the test substance is reduced to 25% or less.
  • a step of contacting a test substance with Robo4 and Unc5B, a step of confirming the binding between Robo4 and Unc5B, and Robo4 A screening method including a step of selecting a test substance that inhibits binding to Unc5B can be used.
  • Robo4 and Unc5B to be used may be either a natural protein or a recombinant protein.
  • the natural protein can be obtained from a culture supernatant or cell extract of cells expressing Robo4 and / or Unc5B using a known method (for example, an affinity column).
  • the recombinant protein can be obtained from a culture supernatant or cell extract of a cell into which a Robo4 expression vector or Unc5B expression vector has been introduced using a known method.
  • the recombinant protein of Robo4 can be produced by using genetic information (see Table 1) obtained from a known database (DDBJ / GenBank / EMBL, etc.) and a known genetic recombination technique.
  • information on the nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene encoding Unc5B of various animals can be obtained from known databases (DDBJ / GenBank / EMBL, etc.) with accession numbers shown in Table 2, for example.
  • Unc5B recombinant protein can be produced by using information and known gene recombination techniques.
  • the method for bringing the test substance into contact with Robo4 and Unc5B is not particularly limited.
  • a method of preparing a reaction system containing Robo4 and Unc5B and adding a test substance thereto can be mentioned.
  • the contact time and the contact temperature are not particularly limited and may be appropriately selected.
  • the method for confirming the binding between Robo4 and Unc5B is not particularly limited, and a known method capable of confirming the binding level between Robo4 and Unc5B can be appropriately selected and used.
  • a known method capable of confirming the binding level between Robo4 and Unc5B can be appropriately selected and used.
  • an ELISA method or a fluorescence polarization method can be suitably used.
  • the ELISA method either one of Robo4 and Unc5B is immobilized, and the other and a test substance are added and reacted, and the binding level of Robo4 and Unc5B is detected using an appropriate primary antibody and secondary antibody. do it.
  • the method for selecting a test substance that inhibits the binding between Robo4 and Unc5B is not particularly limited. For example, if the binding level of Robo4 and Unc5B is reduced when the test substance is contacted as compared to the binding level of Robo4 and Unc5B in the control group not contacted with the test substance, the test substance Can be selected as.
  • the degree to which the test substance lowers the binding level between Robo4 and Unc5B is not particularly limited. For example, a test that reduces the binding level to 50% or less compared to the binding level of both when the test substance is not contacted. Substances are preferred, and test substances that reduce to 25% or less are more preferred.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating pain comprising as an active ingredient a substance that inhibits the expression of Robo4 or a substance that inhibits the binding of Robo4 and Unc5B.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably comprises a substance selected using the screening method of the present invention as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated according to conventional means using as an active ingredient a substance that inhibits the expression of Robo4 or a substance that inhibits the binding of Robo4 and Unc5B.
  • preparations for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), Examples include syrups, emulsions, and suspensions.
  • These preparations are produced by a known method and contain carriers, diluents or excipients usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • injections for example, injections, suppositories and the like are used, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, intraarticular injections. And other dosage forms.
  • Such an injection is prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the active ingredient in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and suitable solubilizers such as alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, , Propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50, etc.) and the like.
  • suitable solubilizers such as alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, , Propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50, etc.) and the like.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • Suppositories used for rectal administration are prepared by mixing the above-mentioned active ingredients with a normal suppository base. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, it is orally administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Or it can be administered parenterally.
  • mammals eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.
  • it can be administered parenterally.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably a nucleic acid that inhibits the expression of Robo4.
  • nucleic acid that inhibits the expression of Robo4 include siRNA (short interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), antisense oligonucleotide and the like of Robo4 gene.
  • the base sequence of the Robo4 gene of the animal to be administered can be easily obtained from a known database (DDBJ / GenBank / EMBL etc.).
  • siRNA is a double-stranded RNA having a length of about 20 bases (for example, about 21 to 23 bases) or less, and by expressing such siRNA in a cell, a gene (this In the invention, the expression of Robo4 gene) can be suppressed.
  • shRNA is a single-stranded RNA that contains a partially palindromic base sequence, so that it has a double-stranded structure in the molecule and a short hairpin structure having a protruding portion at the 3 ′ end. It refers to the above molecules.
  • siRNA and shRNA may be in any form as long as it can suppress the expression of Robo4.
  • siRNA or shRNA can be designed by a known method based on the base sequence of the target gene.
  • siRNA or shRNA can be artificially chemically synthesized.
  • antisense and sense RNA can be synthesized in vitro from template DNA using T7 RNA polymerase and T7 promoter.
  • the antisense oligonucleotide may be any nucleotide that is complementary to or hybridizes to a continuous 5 to 100 nucleotide sequence in the DNA sequence of the Robo4 gene, and may be either DNA or RNA. Moreover, it may be modified as long as the function is not hindered. Antisense oligonucleotides can be synthesized by conventional methods, for example, can be easily synthesized by a commercially available DNA synthesizer.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is a nucleic acid that inhibits the expression of Robo4, it can be administered in the form of a non-viral vector or a viral vector.
  • a method for introducing nucleic acid molecules using liposomes liposome method, HVJ-liposome method, cationic liposome method, lipofection method, lipofectamine method, etc.
  • microinjection method gene gun
  • a method of transferring a nucleic acid molecule into a cell together with a carrier (metal particle) can be used with (Gene Gun).
  • a viral vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus
  • DNA expressing siRNA or shRNA is added to DNA viruses or RNA viruses such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, Sindbis virus, Sendai virus, SV40, etc.
  • a gene can be introduced into a cell or tissue by introducing and infecting the cell or tissue with this recombinant virus.
  • the present inventors have demonstrated that pain is suppressed by administering siRNA of rat Robo4 gene to a neuropathic pain model rat (see Examples). Therefore, the siRNA of Robo4 gene is useful as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the base sequence of the human gene corresponding to the target sequence of siRNA targeting rat used in the Examples by the present inventors can be the target sequence of siRNA targeting human.
  • siRNA (sense strand: CCUGCUUCCAGACACCAGCACUUUU (SEQ ID NO: 1), antisense strand: AAAAGUGCUGGUGUCUGGAAGCAGG (SEQ ID NO: 2)) whose target sequence is positions 1859 to 1884 of the base sequence of the human Robo4 gene (SEQ ID NO: 11) is: It is suitable as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • siRNA used for knockdown of the Robo4 gene of human astrocytes in the Examples was used in the Examples of the present invention. It is suitable as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • siRNA which inhibits the expression of Robo4 is not limited to these.
  • An siRNA suitable as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention can be designed by a known method based on the base sequence of the human Robo4 gene (SEQ ID NO: 11).
  • the siRNA may have the same or different base length in the sense strand and the antisense strand, and the total length is 30 bases or less, preferably 25 bases or less, more preferably 23 bases or less, and even more preferably 21. It is a base. Both ends of the sense strand and the antisense strand may be blunt ends, or the 3 'side of each strand may be an overhang (protruding end).
  • the number of bases at the protruding end is 1 to 10 bases, preferably 1 to 4 bases, and more preferably 1 to 2 bases. The length of the protruding end is irrelevant between the two chains and may be different from each other.
  • the nucleotide at the protruding end may be RNA or DNA, and is preferably a base complementary to the mRNA of the target gene, but may be a base that is not complementary as long as it retains RNA interference ability.
  • the siRNA may be a single-stranded RNA composed of two separate strands, or may be a double-stranded RNA formed by one strand having a stem-loop structure.
  • siRNA and the target sequence are desirably the same, but may not be completely the same sequence as long as RNA interference can be induced.
  • siRNA includes those in which 1 to several bases are substituted, added or deleted from the target sequence and can induce RNA interference.
  • siRNA includes those having sequence identity of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more, and can induce RNA interference with the target sequence. .
  • siRNA is obtained by converting all nucleotides of either the sense strand or antisense strand to DNA (hybrid type), or some nucleotides of the sense strand and / or antisense strand as DNA.
  • hybrid type is preferably one in which the nucleotide of the sense strand is converted to DNA.
  • chimeric type include those obtained by converting a part of nucleotides on the downstream side (3 ′ end side of the sense strand, 5 ′ end side of the antisense strand) into DNA.
  • the nucleotides on the 3 ′ end side of the sense strand and the 5 ′ end side of the antisense strand are both converted to DNA, either the 3 ′ end side of the sense strand or the 5 ′ end side of the antisense strand And those obtained by converting nucleotides into DNA.
  • the nucleotide length to be converted is preferably an arbitrary length up to a nucleotide corresponding to 1/2 of the RNA molecule.
  • the nucleotide may be a nucleotide analog in which sugar, base and / or phosphate are chemically modified.
  • Base modified nucleotide analogs include, for example, 5-position modified uridine or cytidine (eg, 5-propynyluridine, 5-propynylcytidine, 5-methylcytidine, 5-methyluridine, 5- (2-amino) propyl Uridine, 5-halocytidine, 5-halouridine, 5-methyloxyuridine, etc .; 8-position modified adenosine or guanosine (eg, 8-bromognosin, etc.); Deazanucleotide (eg, 7-deaza-adenosine, etc.); O- and N -Alkylated nucleotides (eg N6-methyladenosine etc.) and the like.
  • nucleotide analogues modified with sugar include, for example, 2′-OH of ribonucleotide is H, OR, R, halogen atom, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , or CN (where , R represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group or an alkynyl group) and the like, and a 5′-terminal phosphorylation modification in which the 5′-terminal is monophosphorylated.
  • nucleotide analogs modified with phosphate include those in which the phosphoester group that binds adjacent ribonucleotides is replaced with a phosphothioate group.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably a substance that inhibits the transcription promoter of Robo4 gene.
  • transcriptional promoters for the Robo4 gene include Sp1 (Okada, Y. et al. A GABP-binding element in the Robo4 promoter is necessary for endothelial expression in vivo. Blood 112, 2336-9 (2008)).
  • GA-Binding protein (GABP) is also mentioned as a transcriptional promoter of Robo4 (Okada, Y. et al. A GABP-binding element in the Robo4 promoter is necessary for endothelial expression in vivo.
  • WP631 and diethyl maleate are also considered suitable as the active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the substance which inhibits the transcriptional promoter of Robo4 gene is not limited to mitramycin, WP631, and diethyl maleate. A substance that inhibits the transcriptional promoter of the Robo4 gene can be easily found using the screening method of the present invention.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably an antibody or peptide that specifically binds to Robo4.
  • the antibody that specifically binds to Robo4 may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Further, it may be a complete antibody molecule or an antibody fragment (for example, Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fv, scFv, etc.) that can specifically bind to Robo4.
  • the antibody is preferably a human chimeric antibody or a humanized antibody. Both antibodies and peptides can be produced by known methods.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is a peptide or an antibody
  • it is a parenteral route of administration, for example, intravenous, intramuscular, intradermal, as an injection or infusion formulated with a pharmaceutically acceptable carrier. It is preferable to administer intraperitoneally, subcutaneously or locally.
  • the active ingredient can be contained in an amount of 0.001 to 50% by mass, preferably 0.01 to 10% by mass, more preferably 0.1 to 1% by mass.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately determined in consideration of the purpose, the type of disease, the severity of the disease, the age, weight, sex, medical history, type of active ingredient, etc. of the patient.
  • an average human having a body weight of about 65 to 70 kg is used as a target, about 0.02 mg to 4000 mg per day is preferable, and about 0.1 mg to 200 mg is more preferable.
  • the total daily dose may be a single dose or divided doses.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for preventing or treating pain comprising a step of administering an effective amount of a substance that inhibits the expression of Robo4 or a substance that inhibits the binding between Robo4 and Unc5B.
  • B A substance that inhibits the expression of Robo4 or a substance that inhibits the binding of Robo4 and Unc5B for use in the prevention or treatment of pain.
  • C Use of a substance that inhibits the expression of Robo4 or a substance that inhibits the binding of Robo4 and Unc5B to produce a pharmaceutical composition for preventing or treating pain.
  • neuropathic pain model As a neuropathic pain model, a sciatic nerve partial strangulation model rat (Seltzer. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 43, 205-218 (1990)). Under inhalation anesthesia with a mixed gas of isoflurane and oxygen, the left hind leg thigh of Wistar / ST strain 8-week-old male rat and its base were shaved and disinfected with alcohol. The skin and muscles at the joints of the femur and lumbar bone were incised to expose the sciatic nerve running along the femur.
  • One half to one third of the sciatic nerve was ligated with 4-0 nylon suture, and the muscle and skin were sutured.
  • the sciatic nerve of the right hind limb on the opposite side was made only by incision of the skin and muscle, and was set as the sham operation side.
  • the solution dissolved in the solution was replaced and shaken at 4 ° C. overnight.
  • the lumbar spinal cord tissue was embedded in an OCT compound (Sakura Finetech Japan) and frozen, and then a thin section having a thickness of 20 ⁇ m was prepared with a frozen thin section preparation apparatus and attached to a slide glass (Matsunami glass).
  • BSA bovine serum albumin
  • Robo4 purified protein (R & D, 2366-RB) was dissolved in physiological saline to a concentration of 40 ng / ⁇ L, and 10 ⁇ L of this solution was administered from the rear end of the tube intubated into the medullary canal. A control group of animals was administered 10 ⁇ L of physiological saline. The von Frey filament test was conducted 12, 24, and 48 hours after administration to examine changes in the escape threshold.
  • siRNA that binds to Robo4 mRNA was administered into the spinal cord spinal cord together with a gene introduction reagent. Under inhalation anesthesia with a mixed gas of isoflurane and oxygen, the backs of 8-week-old Wistar male rats were shaved and disinfected with alcohol. Insert a 19G needle (Terumo) between the 5th and 6th lumbar vertebrae, and insert it into the spinal cord through a polyethylene tube filled with physiological saline (BECKTON DICKINSON Intramedic Polyethylene Tubing, PE-10). Intubated.
  • Mitramycin was used after being dissolved in physiological saline so as to have a concentration of 100 ⁇ g / mL.
  • a physiological saline was intraperitoneally administered to the control group.
  • the von Frey filament test was performed on the 4th and 7th days to examine changes in the escape threshold.
  • Example 2 Identification of receptors that transmit signals that enhance the pain response of Robo4]
  • (1) Suppression of Unc5B gene expression by siRNA In order to elucidate through which receptor the enhancement signal of pain response controlled by Robo4 in the spinal cord is transmitted downstream, the gene of candidate receptor of Robo4 It was examined whether the effect of Robo4 intrathecal administration was counteracted by suppressing the expression.
  • Unc5B which is known to bind to Robo4
  • siRNA that binds to Unc5B mRNA was prepared.
  • Example 2 Using the same method as the experimental method (5) of Example 1, a rat with a tube inserted into the spinal cord canal was prepared, and after one week from the tube intubation, a von Frey filament test was performed to examine movement disorders and pain due to tube intubation. Experiments were performed using individuals that were confirmed to have not occurred.
  • the rat Unc5B protein labeled with Fc tag was replaced with PBST containing 0, 20, 40, 80 or 160 ng and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction, the plate was washed 5 times with PBST, then replaced with a diluted anti-Fc antibody solution, and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the plate was washed 5 times with PBST, replaced with a solution containing a secondary antibody labeled with HRP, and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the plate was washed 5 times with PBST, replaced with TMB coloring solution (R & D), and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • TMB coloring solution R & D
  • the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured with a plate reader.
  • Fc protein was used as a control group.
  • the antibodies used for the ELISA are anti-Fc antibody (1: 500, Sigma) and HRP-labeled goat IgG antibody (1: 1000, Molecular Probes).
  • HEK293T cells into which only the GFP gene was introduced were used.
  • the antibodies used for immune cell staining are anti-Fc antibody (1: 200, Sigma) and fluorescently labeled anti-rabbit IgG antibody (1: 500, Molecular Probes).
  • the results are shown in FIG.
  • the upper row is a control group into which only the GFP gene is introduced
  • the lower row is a group into which the rat Unc5B gene (Unc5B-GFP) to which the GFP gene has been added is introduced.
  • Unc5B-GFP the rat Unc5B gene
  • Example 3 Gene expression change in astrocyte pain inducer due to inhibition of Robo4
  • Human astrocyte cell line U251MG (ECACC strain number: 09063001, hereinafter referred to as “U251MG cell”) was used as an astrocyte.
  • the culture solution used was Eagle's minimum essential medium (MEM, GIBCO) with Fetal bovine serum (GIBCO) added to a concentration of 10%. Cultivation was carried out in an incubator with an internal temperature of 37 ° C. maintaining a CO 2 concentration of 5%.
  • MEM Eagle's minimum essential medium
  • GIBCO Fetal bovine serum
  • siRNA [sense strand: CCUCAGAGUUCACGGACAUtt (SEQ ID NO: 3), antisense strand: AUGUCCGUGAACUCUGAGGtt (SEQ ID NO: 4)] to the human Robo4 gene was transferred to U251MG cells using a gene introduction reagent lipofectamine2000 (Life Technologies). The gene was introduced into.
  • Control siRNA [sense strand: UUCUCCGAACGUGUCACGUtt (SEQ ID NO: 9), antisense strand: ACGUGACACGUUCGGAGAAtt (SEQ ID NO: 10)] was introduced into U251MG cells using lipofectamine2000.
  • lipopolysaccharide Sigma, L4524 was added to the culture solution to a concentration of 1 ⁇ g / mL in order to activate astrocytes (U251MG cells). Twelve hours after the addition of lipopolysaccharide, RNA was extracted from U251MG cells using a reagent (TRIZOL, Life Technologies), and then cDNA was synthesized by reverse transcriptase (High-capacity Reverse Transcription Kit, Life Technologies).
  • GM-CSF Granulocyte Macroophage Colony-Stimulating Factor
  • CXCL1 The CXC motif Ligand 1
  • TNF ⁇ Tumor Necrosis Factor- ⁇
  • MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1 Quantification was performed from the ⁇ Ct value. The expression level of each gene was corrected by the housekeeping gene human GAPDH expression level.

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Abstract

本発明は、Ｒｏｂｏ４を用い、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を選択することを特徴とする疼痛抑制物質のスクリーニング方法、および、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする疼痛の予防または治療用医薬組成物を提供する。

Description

疼痛の予防または治療用医薬組成物およびＲｏｂｏ４を用いる疼痛抑制物質のスクリーニング方法
　本発明は、疼痛の予防または治療用医薬組成物に関するものである。また、本発明は、Ｒｏｂｏ４を用いる疼痛抑制物質のスクリーニング方法に関するものである。
　疼痛は、その激しい痛みから身体の生理機能と精神状態に著しい影響を及ぼし、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏｆ Ｌｉｆｅ）を低下させる。慢性疼痛の患者数は全世界で２０００万人を超えると報告されており、疼痛治療薬の市場規模は日米欧で約２兆円と言われている。また、脳卒中、がん、糖尿病、ウイルス感染症といった疼痛発症の原因となり得る基礎疾患の患者数が増加していることから、疼痛治療法の確立は非常に重要な医療課題である。特に非ステロイド性抗炎症薬やオピオイド鎮痛薬による治療効果が低い神経障害性疼痛に対する医療ニーズは非常に高い。しかしながら、神経障害性疼痛の発症原因は多岐にわたり、その分子作用機序も非常に複雑であることから、未だに根本的な治療薬は開発されていない（非特許文献１）。神経障害性疼痛の発症・維持に関与する分子メカニズムを明らかにすることは画期的な治療薬の開発につながり、２１世紀における医療の最大課題の一つを解決へ導くと考えられる。
　脊髄の後角は神経障害性疼痛の主要な原因箇所の一つであると考えられている（非特許文献２）。末梢からの感覚入力は脊髄後角内で増幅・抑制・統合など様々な修飾を受けてから脳へと伝達される。しかし末梢神経が傷害されると、異常な軸索側枝形成、シナプス伝達の亢進など脊髄後角の神経回路網が変化して疼痛の惹起に繋がってしまうことが過去に報告されている（非特許文献３）。このことから、脊髄後角内の神経回路を制御する新規分子メカニズムを明らかにすることは、画期的な疼痛治療薬の開発に必要な新しいターゲット分子の創出に繋がることが期待される。
　Ｒｏｂｏ４（Round-about 4）は１回膜貫通型タンパク質である（非特許文献４）。軸索反発因子Ｓｌｉｔの受容体であるＲｏｂｏファミリーの１つに分類されているが、Ｓｌｉｔとの結合ドメインを持っておらず、Ｕｎｃ５Ｂ受容体と結合することが近年報告された（非特許文献５）。Ｒｏｂｏ４は血管内皮細胞特異的に発現することが報告されており、血管形成を阻害する働きがあることが報告されている（非特許文献６、７）。しかしながら、Ｒｏｂｏ４の成体脊髄での働きについて明らかにした研究報告はこれまでに無く、神経障害性疼痛の発症に関与しているかどうかについても全く解明されていない。
Dworkin, R. H. et al. Pharmacologic management of neuropathic pain: evidence-based recommendations. Pain 132, 237-51 (2007). Woolf, C. J. Neuronal Plasticity: Increasing the Gain in Pain. Science 288, 1765-1768 (2000). Markman, J. D. & Dworkin, R. H. Ion channel targets and treatment efficacy in neuropathic pain. The journal of pain 7, S38-47 (2006). Huminiecki, L. et al. Magic roundabout is a new member of the roundabout receptor family that is endothelial specific and expressed at sites of active angiogenesis. Genomics 79, 547-52 (2002). Koch, A. W. et al. Robo4 maintains vessel integrity and inhibits angiogenesis by interacting with UNC5B. Dev. Cell 20, 33-46 (2011). Okada, Y. et al. A three-kilobase fragment of the human Robo4 promoter directs cell type-specific expression in endothelium. Circ. Res. 100, 1712-22 (2007). Okada, Y. Regulation of Endothelial Cell-specific Robo4 Gene Expression by DNA Methylation and Non-lineage Specific Transcription Factors. Yakugaku Zasshi 134, 817-21 (2014).
　本発明は、疼痛の発症に関与する分子を見出し、疼痛抑制物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。また、新規な疼痛の予防または治療用医薬組成物を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする疼痛の予防または治療用医薬組成物。
［２］Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質が、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する核酸またはＲｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子を阻害する物質である前記［１］に記載の医薬組成物。
［３］Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質が、Ｒｏｂｏ４と特異的に結合する抗体またはペプチドである前記［１］に記載の医薬組成物。
［４］疼痛抑制物質のスクリーニング方法であって、Ｒｏｂｏ４を用いることを特徴とする方法。
［５］Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を選択することを特徴とする前記［４］に記載の方法。
［６］被験物質とＲｏｂｏ４を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のＲｏｂｏ４の発現量を測定する工程と、該発現量を被験物質と接触させない前記細胞におけるＲｏｂｏ４の発現量と比較し、Ｒｏｂｏ４の発現量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする前記［５］に記載の方法。
［７］被験物質とＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂを接触させる工程と、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を確認する工程と、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記［５］に記載の方法。
　本発明のスクリーニング方法によれば、疼痛の予防または治療薬として有用な疼痛抑制物質を取得することができる。また、本発明の医薬組成物は、疼痛の予防または治療に有用である。
神経障害性疼痛モデルラットから採取した脊髄を免疫組織染色した結果を示す図であり、上段および下段左は抗Ｒｏｂｏ４抗体による染色結果、下段中は抗ＧＦＡＰ抗体による染色結果、下段右はＤＡＰＩによる染色結果である。 Ｒｏｂｏ４タンパク質を脊髄髄腔内に投与したラットを用いてｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化を調べた結果を示す図である。 Ｒｏｂｏ４ ｓｉＲＮＡを脊髄髄腔内に投与した神経障害性疼痛モデルラットを用いてｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化を調べた結果を示す図である。 Ｒｏｂｏ４遺伝子の転写因子阻害剤であるミトラマイシンを腹腔内投与した神経障害性疼痛モデルラットを用いてｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化を調べた結果を示す図である。 Ｕｎｃ５Ｂ ｓｉＲＮＡをラットの脊髄髄腔内に投与し、その２日後にＲｏｂｏ４を脊髄髄腔内に投与して逃避閾値の変化を調べた結果を示す図である。 Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂの結合を、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡにて確認した結果を示す図である。 Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂの結合を、Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇアッセイにて確認した結果を示す図である。 Ｒｏｂｏ４ ｓｉＲＮＡをアストロサイトに導入し、疼痛惹起因子の遺伝子発現量を調べた結果を示す図である。
　本発明者らは、血管内皮細胞特異的に発現することが報告されているＲｏｂｏ４が神経障害性疼痛モデルラット（Seltzer. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 43, 205-218 (1990)）において、坐骨神経損傷側の脊髄後角にＲｏｂｏ４陽性細胞が観察され、当該Ｒｏｂｏ４陽性細胞はアストロサイトであることを見出した。さらに、本発明者らは各種確認実験を行い、Ｒｏｂｏ４は脊髄内において痛覚応答を増強させる作用を有すること、Ｒｏｂｏ４の痛覚応答増強シグナルはＲｏｂｏ４がＵｎｃ５Ｂ受容体に結合することにより下流に伝達されることを明らかにした。
〔スクリーニング方法〕
　本発明は疼痛抑制物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Ｒｏｂｏ４を用いるものであればよい。本発明のスクリーニング方法で用いるＲｏｂｏ４はタンパク質でもよく、遺伝子でもよい。また、Ｒｏｂｏ４がタンパク質の場合、全長タンパク質でもよく、機能断片でもよい。
　本発明のスクリーニング方法に用いるＲｏｂｏ４は、どのような生物由来のＲｏｂｏ４でもよく、特に限定されないが、哺乳動物のＲｏｂｏ４が好ましい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが好ましく、より好ましくはヒトである。各種動物のＲｏｂｏ４をコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の情報は、例えば表１に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　被験物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等を好ましく用いることができる。ただし、これらに限定されない。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
　本発明のスクリーニング方法により、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質を選択することが好ましい。本発明者らは、神経障害性疼痛モデルラットの脊髄髄腔内にＲｏｂｏ４ ｓｉＲＮＡを投与してＲｏｂｏ４の発現を阻害すると疼痛が抑制されること、また神経障害性疼痛モデルラットにＲｏｂｏ４遺伝子の転写因子阻害剤を投与してＲｏｂｏ４の発現を阻害するすると疼痛が抑制されることを確認している（実施例参照）。したがって、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質は、疼痛を抑制することができると考えられる。
　また、本発明のスクリーニング方法により、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を選択することが好ましい。本発明者らは、脊髄髄腔内にＵｎｃ５Ｂ ｓｉＲＮＡに投与してＵｎｃ５Ｂの発現を阻害した後に、脊髄髄腔内にＲｏｂｏ４タンパク質を投与すると、Ｒｏｂｏ４タンパク質投与による痛覚応答の増強が抑制されることを確認している（実施例参照）。したがって、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質は、Ｒｏｂｏ４の下流へのシグナル伝達を阻害することができ、末梢神経障害に起因する疼痛を抑制することができると考えられる。
　本発明のスクリーニング方法により、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質を選択する場合、例えば、被験物質とＲｏｂｏ４を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のＲｏｂｏ４の発現量を測定する工程と、該発現量を被験物質と接触させない前記細胞におけるＲｏｂｏ４の発現量と比較し、Ｒｏｂｏ４の発現量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むスクリーニング方法を用いることができる。Ｒｏｂｏ４を発現する細胞は、生体内の細胞でもよく、培養細胞でもよい。培養細胞は、初代培養細胞でもよく、細胞株でもよい。初代培養細胞として、例えば、ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）などが挙げられ、細胞株として、例えば、Ｈｅｌａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ７細胞などが挙げられる。また、Ｒｏｂｏ４をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換したＲｏｂｏ４発現形質転換細胞を用いることができる。
　被験物質と細胞を接触させる方法は、被験物質と細胞が接触できる方法であればどのような方法でもよく、特に限定されない。例えば、培養細胞を用いる場合には、培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。例えば、非ヒト動物の生体において被験物質と細胞とを接触させる場合には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の全身投与、標的臓器や標的組織への局所投与などが挙げられる。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
　Ｒｏｂｏ４の発現量の測定は、Ｒｏｂｏ４のタンパク質量を測定してもよく、Ｒｏｂｏ４のｍＲＮＡ量を測定してもよい。タンパク質量を測定する場合は、公知の方法で細胞からタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。ｍＲＮＡ量を測定する場合は、公知の方法で細胞からＲＮＡを抽出し、公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて定量することができる。公知のｍＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどが挙げられる。
　被験物質を接触させない対照群におけるＲｏｂｏ４のタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して、被験物質を接触させた場合にＲｏｂｏ４のタンパク質量またはｍＲＮＡ量が減少していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。被験物質がＲｏｂｏ４のタンパク質量またはｍＲＮＡ量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞のタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して５０％以下に減少させる被験物質が好ましく、２５％以下に減少させる被験物質がより好ましい。
　本発明のスクリーニング方法により、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質をスクリーニングする場合、例えば、被験物質とＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂを接触させる工程と、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を確認する工程と、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する被験物質を選択する工程を含むスクリーニング方法を用いることができる。用いるＲｏｂｏ４およびＵｎｃ５Ｂは、天然タンパク質および組み換えタンパク質のいずれでもよい。天然タンパク質を用いる場合、Ｒｏｂｏ４および／またはＵｎｃ５Ｂを発現している細胞の培養上清または細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）を用いて天然タンパク質を取得することができる。組み換えタンパク質を用いる場合、Ｒｏｂｏ４発現ベクターまたはＵｎｃ５Ｂ発現ベクターが導入された細胞の培養上清または細胞抽出物から公知の方法を用いて組み換えタンパク質を取得することができる。Ｒｏｂｏ４の組み換えタンパク質は公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から得られる遺伝情報（表１参照）および公知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、製造することができる。また、各種動物のＵｎｃ５Ｂをコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の情報は、例えば表２に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができ、これらの遺伝情報および公知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、Ｕｎｃ５Ｂの組み換えタンパク質を製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　被験物質とＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとを接触させる方法は特に限定されない。例えば、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとを含む反応系を準備し、ここに被験物質を添加する方法が挙げられる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
　Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を確認する方法は特に限定されず、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合レベルを確認できる公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、蛍光偏光法などを好適に用いることができる。ＥＬＩＳＡ法を用いる場合、Ｒｏｂｏ４およびＵｎｃ５Ｂのいずれか一方を固相化し、そこに他方および被験物質を添加して反応させ、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂの結合レベルを適当な一次抗体および二次抗体を用いて検出すればよい。
　Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する被験物質を選択する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群におけるＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合レベルと比較して、被験物質を接触させた場合にＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合レベルが低下していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。被験物質がＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合レベルを低下させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない場合の両者の結合レベルと比較して、結合レベルを５０％以下に低下させる被験物質が好ましく、２５％以下に低下させる被験物質がより好ましい。
〔疼痛の予防または治療用医薬組成物〕
　本発明は、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を有効成分として含有する疼痛の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、上記本発明のスクリーニング方法を用いて選択される物質を有効成分とすることが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を有効成分とし、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
　本発明の医薬組成物の有効成分は、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する核酸であることが好ましい。Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する核酸としては、Ｒｏｂｏ４遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。投与対象動物のＲｏｂｏ４遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から容易に取得することができる。ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１～２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡを細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子（本発明においてはＲｏｂｏ４遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からからなる約２０塩基対以上の分子のことをいう。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様に標的となる遺伝子（本発明においてはＲｏｂｏ４遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、Ｒｏｂｏ４の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列に基づいて、公知の方法により設計することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成することができる。また、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｒｏｂｏ４遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。
　本発明の医薬組成物の有効成分が、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する核酸である場合、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクターの形態で投与する場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ－リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
　本発明者らは、ラットＲｏｂｏ４遺伝子のｓｉＲＮＡを神経障害性疼痛モデルラットに投与することにより、疼痛が抑制されることを実証している（実施例参照）。したがって、Ｒｏｂｏ４遺伝子のｓｉＲＮＡは、本発明の医薬組成物の有効成分として有用である。本発明者らが実施例において使用したラットを対象とするｓｉＲＮＡの標的配列に相当するヒト遺伝子の塩基配列は、ヒトを対象とするｓｉＲＮＡの標的配列になり得る。したがって、ヒトＲｏｂｏ４遺伝子の塩基配列（配列番号１１）の第１８５９位～第１８８４位を標的配列とするｓｉＲＮＡ（センス鎖：CCUGCUUCCAGACACCAGCACUUUU（配列番号１）、アンチセンス鎖：AAAAGUGCUGGUGUCUGGAAGCAGG（配列番号２））は、本発明の医薬組成物の有効成分として好適である。また、本発明者らが実施例においてヒトアストロサイトのＲｏｂｏ４遺伝子のノックダウンに使用したｓｉＲＮＡ（センス鎖：CCUCAGAGUUCACGGACAUtt（配列番号３）、アンチセンス鎖：AUGUCCGUGAACUCUGAGGtt（配列番号４））は、本発明の医薬組成物の有効成分として好適である。なお、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害するｓｉＲＮＡはこれらに限定されない。本発明の医薬組成物の有効成分として好適なｓｉＲＮＡは、ヒトＲｏｂｏ４遺伝子の塩基配列（配列番号１１）に基づいて、公知の方法で設計することができる。
　ｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖が同一の塩基長であっても異なっていてもよく、その全長は３０塩基以下であり、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２３塩基以下、さらに好ましくは２１塩基である。センス鎖およびアンチセンス鎖の両端は、平滑末端でもよいし、それぞれの鎖の３’側がオーバーハング（突出末端）であってもよい。突出末端部分の塩基数は１～１０塩基であり、好ましくは１～４塩基であり、さらに好ましくは１～２塩基である。なお、突出末端の長さは二つの鎖の間で無関係であり、互いに異なる長さであってもよい。突出末端部分のヌクレオチドはＲＮＡでも、ＤＮＡでもよく、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基が好ましいが、ＲＮＡ干渉能を保持する限り相補的でない塩基であってもよい。また、ｓｉＲＮＡは、２つの別個の鎖から構成される１つの二本鎖ＲＮＡである他、１本の鎖がステムループ構造をとることにより形成される二本鎖ＲＮＡであってもよい。
　ｓｉＲＮＡと標的配列は同一であることが望ましいが、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、完全に同一な配列でなくてもよい。具体的には、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り、１～数個（例えば、２、３、４個）のミスマッチがあってもよい。すなわち、ｓｉＲＮＡには、標的配列に対して１～数個の塩基が置換、付加もしくは欠失したものであってＲＮＡ干渉を誘導できるものが含まれる。また、ｓｉＲＮＡには、標的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつＲＮＡ干渉を誘導できるものが含まれる。
　ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか一方のヌクレオチドを全てＤＮＡに変換したもの（ハイブリッド型）や、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したもの（キメラ型）であってもよい。ハイブリッド型としては、センス鎖のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが好ましい。キメラ型としては、下流側（センス鎖の３’末端側、アンチセンス鎖の５’末端側）の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。具体的には、センス鎖の３’末端側およびアンチセンス鎖の５’末端側のヌクレオチドを共にＤＮＡに変換したもの、センス鎖の３’末端側またはアンチセンス鎖の５’末端側の何れかのヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。また、変換するヌクレオチド長は、ＲＮＡ分子の１／２に相当するヌクレオチドまでの任意長とするのが好ましい。
　ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、そのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）が、糖、塩基および／またはリン酸塩が化学修飾されたヌクレオチド類似体であってもよい。塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジンまたはシチジン（例えば、５－プロピニルウリジン、５－プロピニルシチジン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ハロシチジン、５－ハロウリジン、５－メチルオキシウリジン等）；８位修飾アデノシンまたはグアノシン（例えば、８－ブロモグノシン等）；デアザヌクレオチド（例えば７－デアザ－アデノシン等）；Ｏ－およびＮ－アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６－メチルアデノシン等）等が挙げられる。また、糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、リボヌクレオチドの２’－ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、もしくはＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１－６のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を示す）等によって置換された２’位糖修飾、５’末端がモノリン酸化された５’末端リン酸化修飾が挙げられる。リン酸塩が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。
　本発明の医薬組成物の有効成分は、Ｒｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子を阻害する物質であることが好ましい。Ｒｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子としては、例えばＳｐ１が挙げられる（Okada, Y. et al. A GABP-binding element in the Robo4 promoter is necessary for endothelial expression in vivo. Blood 112, 2336-9 (2008)）。またＧＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＡＢＰ）もＲｏｂｏ４の転写促進因子として挙げられる（Okada, Y. et al. A GABP-binding element in the Robo4 promoter is necessary for endothelial expression in vivo. Blood 112, 2336-9 (2008)）本発明者らは、Ｓｐ１の阻害剤であるミトラマイシンを神経障害性疼痛モデルラットに投与することにより、疼痛が抑制されることを実証している（実施例参照）。したがって、ミトラマイシンは本発明の医薬組成物の有効成分として好適である。またＷＰ６３１（dimethanesulfonate）もＳｐ１による転写調節を抑制することが報告されている（Martin et al._1999_Bisanthracycline WP631 inhibits basal and Sp1-activated transcription initiation in vitro. Nucleic Acids Res. 1999 Sep 1; 27(17): 3402-3409.）。さらに、マレイン酸ジエチル（Diethyl maleate）がＧＡＢＰの働きを阻害することが報告されている（Martin et al._1996_Molecular Genetics Redox Regulation of GA-binding Protein- α DNA Binding Activity, J Biol Chem. 1996 Oct 11;271(41):25617-23.）したがって、ＷＰ６３１およびマレイン酸ジエチルも本発明の医薬組成物の有効成分として好適であると考えられる。なお、Ｒｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子を阻害する物質はミトラマイシン、ＷＰ６３１およびマレイン酸ジエチルに限定されない。Ｒｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子を阻害する物質は、上記本発明のスクリーニング方法を用いて容易に見出すことができる。
　本発明の医薬組成物の有効成分は、Ｒｏｂｏ４と特異的に結合する抗体またはペプチドであることが好ましい。抗体またはペプチドがＲｏｂｏ４と結合することにより、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害することができる。Ｒｏｂｏ４と特異的に結合する抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、Ｒｏｂｏ４に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。抗体はヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。抗体およびペプチドは、いずれも公知の方法により製造することができる。本発明の医薬組成物の有効成分がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。
　本発明の医薬組成物には、有効成分を０．００１～５０質量％、好ましくは０．０１～１０質量％、更に好ましくは０．１～１質量％含有することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、目的、疾患の種類、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５～７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０２ｍｇ～４０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ～２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
　本発明には、以下の各発明が含まれる。
（Ａ）Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする疼痛の予防または治療方法。
（Ｂ）疼痛の予防または治療に使用するための、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質。
（Ｃ）疼痛の予防または治療用医薬組成物を製造するための、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質の使用。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：痛覚応答に対するＲｏｂｏ４の関与〕
１－１　実験方法
（１）神経障害性疼痛モデルの作製
　神経障害性疼痛モデルとして、坐骨神経部分絞扼モデルラット（Seltzer. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 43, 205-218 (1990)）を用いた。イソフルランと酸素の混合ガスによる吸気麻酔下で、Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ系統８週齢雄ラットの左後肢大腿部とその付け根付近を剃毛し、アルコールで消毒した。大腿骨と腰骨の関節部分の皮膚と筋肉を切開し、大腿骨に沿って走る坐骨神経を露出させた。４－０号ナイロン縫合糸で坐骨神経の１／２～１／３を結紮し、筋肉および皮膚を縫合した。対側である右後肢の坐骨神経は皮膚と筋肉の切開だけ行って、偽手術側とした。
（２）痛み関連行動の計測
　機械性刺激に対する応答を計測するために、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行った。金網の上にプラスチックケースを置き、疼痛モデルラットをケースに入れて落ち着くまで５～１０分間慣らした。フィラメント（Semmes-Weinstein Von Frey Anesthesiometer、室町機械）を後肢足裏中央に３～５秒間押し当てて逃避反応を起こす刺激閾値（ｇ）についてアップダウン法を用いて測定した。
（３）免疫組織染色
　術後１４日目の神経障害性疼痛モデルを用いた。ペントバルビタール液の腹腔内投与によりラットを深く麻酔した後、還流固定した。まず０．１Ｍリン酸緩衝液で潅流した後、４％ＰＦＡ液（パラホルムアルデヒド（ナカライテスク）を４％の濃度になるように０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解したもの）を還流して固定した。還流固定後、脊髄腰膨大部を剖出して４％ＰＦＡ液に漬けてさらに６時間固定し、４％ＰＦＡ液をスクロース（ナカライテスク）を３０％の濃度になるように０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解したものに置換して、二晩４℃で振盪した。腰髄組織をＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン）に包埋して凍結させた後、凍結薄切片作製装置で２０μｍの厚さの薄切片を作製してスライドガラス（松浪ガラス）に貼りつけた。５％ＢＳＡ液（５％の濃度になるようにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Sigma-Aldrich）を０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解したもの）に漬けて２時間室温に置いた後、一次抗体を加えた５％ＢＳＡ液に置換して４℃で二晩反応させた。反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄してから二次抗体を加えた５％ＢＳＡ液に置換して４℃で一晩反応させた。二次抗体反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄してから封入し、蛍光顕微鏡で観察した。免疫染色には、抗Ｒｏｂｏ４抗体（1:200、Abcam）、抗ＧＦＡＰ抗体（1:1000、Sigma-Aldrich）、蛍光標識抗ラビットＩｇＧ抗体（1:500、Molecular Probes）、および蛍光標識抗マウスＩｇＧ抗体（1:500、Molecular Probes）を使用した。
（４）脊髄髄腔内へのＲｏｂｏ４タンパク質投与
　Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ系統８週齢雄ラットの第４腰椎と第５腰椎の隙間から脊髄髄腔内にポリエチレンチューブを挿管し、チューブ先端が腰髄膨大部近辺に来るように配置させた（Milligan, E. D., Hinde, J. L., Mehmert, K. K., Maier, S. F. & Watkins, L. R. A method for increasing the viability of the external portion of lumbar catheters placed in the spinal subarachnoid space of rats. Journal of neuroscience methods 90, 81-6 (1999)）。挿管してから１週間後にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、挿管による運動異常または感覚異常が無いことが確認できた個体を実験に使用した。Ｒｏｂｏ４精製タンパク質（R&D, 2366-RB）を生理食塩水で４０ｎｇ／μＬの濃度になるように溶解し、この溶液を１０μＬだけ髄腔内に挿管したチューブの後端から投与した。対照群の動物には生理食塩水を１０μＬ投与した。投与後１２，２４，４８時間目にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化について調べた。
（５）ｓｉＲＮＡによるＲｏｂｏ４遺伝子の発現抑制
　Ｒｏｂｏ４遺伝子の発現を抑制するために、Ｒｏｂｏ４ ｍＲＮＡと結合するｓｉＲＮＡを脊髄髄腔内に遺伝子導入試薬と共に投与した。イソフルランと酸素の混合ガスによる吸気麻酔下で、８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットの背中を剃毛し、アルコールで消毒した。第５腰椎骨と第６腰椎骨の間に１９Ｇ注射針（テルモ）を挿入し、針の中に生理食塩水を満たしたポリエチレンチューブ（BECKTON DICKINSON Intramedic Polyethylene Tubing, PE-10）を通して脊髄髄腔内に挿管した。ポリエチレンチューブの先端が脊髄腰膨大部に位置しているかどうか確認するために、局所麻酔剤の２％キシロカイン注射液（アストラゼネカ）２０μＬをチューブ後端から投与し、後肢に麻痺が起こることを確認してから動物をケージに戻した。チューブ挿管から１週間後にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌｅｍｅｎｔテストを行って、チューブの挿管による運動障害や疼痛が起こっていないことを確認した後、上記（１）に記載の通り、左後肢の坐骨神経を部分結紮し、右後肢に偽手術を施した。坐骨神経の部分結紮から１週間後にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを用いて痛覚過敏が起こっていることを確認した。遺伝子導入試薬ＨＶＪ－Ｅ（GenomeONE-Neo、石原産業）とＲｏｂｏ４ ｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi siRNA、invitrogen、センス鎖：CCUGCUUCCAGACACUAGCACGUUU（配列番号５）、アンチセンス鎖：AAACGUGCUAGUGUCUGGAAGCAGG（配列番号６））各１μｇを混合した液を、挿管したチューブの後端から１０μＬ注入して、脊髄髄腔内に投与した。対照群の動物にはＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi siRNA Negative Control、invitrogen）とＨＶＪ－Ｅの混合液を同じ量だけ投与した。投与後チューブの後端を閉じ、皮膚を縫合した。投与後１日目、２日目、３日目、４日目にそれぞれｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化について調べた。
（６）Ｒｏｂｏ４遺伝子の転写因子阻害による発現抑制
　転写因子Ｓｐ１がＲｏｂｏ４遺伝子のプロモーター領域へ結合することによりＲｏｂｏ４遺伝子の転写が開始されることが報告されている（Okada, Y. et al. A GABP-binding element in the Robo4 promoter is necessary for endothelial expression in vivo. Blood 112, 2336-9 (2008)）。このＳｐ１の阻害剤であるミトラマイシンを神経障害性疼痛モデルラットに投与してＲｏｂｏ４遺伝子の発現抑制を試みた。神経障害性疼痛モデル作製後、２００μｇ／ｋｇ・ｄａｙのミトラマイシン（和光純薬、132-17101）を毎日腹腔内投与した。ミトラマイシンは濃度が１００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解して使用した。対照群には生理食塩水を腹腔内投与した。神経障害性疼痛モデル作製後、４日目および７日目にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化について調べた。
１－２　実験結果
（１）神経障害性疼痛モデルの脊髄におけるＲｏｂｏ４の免疫組織染色
　術後１４日目の神経障害性疼痛モデルラットの脊髄組織におけるＲｏｂｏ４の免疫組織染色の結果を図１に示した。坐骨神経が損傷した側の脊髄後角でＲｏｂｏ４陽性細胞が観察された（上段）。また、Ｒｏｂｏ４タンパク質はＧＦＡＰ陽性のアストロサイトで特異的に発現していることが明らかになった（下段）。
（２）脊髄髄腔内へのＲｏｂｏ４タンパク質投与
　ラットの脊髄髄腔内へＲｏｂｏ４タンパク質を投与し、投与後１２，２４，４８時間目にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って逃避閾値の変化を検討した。結果を図２に示した。Ｒｏｂｏ４タンパク質投与群は、投与後経時的に逃避閾値が低下した。対照群と比較したところ、投与後１２，２４，４８時間目において有意に逃避閾値が低下していることが示された（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。この結果から、Ｒｏｂｏ４タンパク質は脊髄内において動物の痛覚応答を増強させ、疼痛を引き起こす働きがあることが明らかになった。
（３）ｓｉＲＮＡによるＲｏｂｏ４遺伝子の発現抑制
　神経障害性疼痛モデルラットの脊髄髄腔内にＲｏｂｏ４ ｓｉＲＮＡまたはＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを投与し、投与後１日目、２日目、３日目、４日目にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って逃避閾値の変化を検討した。結果を図３に示した。図中、「損傷側」は坐骨神経を部分結紮した左後肢であり、「対照側」は非損傷の右後肢を表す。坐骨神経を部分結紮の７日後では、損傷側の逃避閾値が大きく低下したが、Ｒｏｂｏ４ ｓｉＲＮＡを投与することにより、ｓｉＲＮＡ投与後１日目から４日目（損傷後８－１１日）において有意に上昇していることが示された（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。一方、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを投与した場合は逃避閾値の上昇は認められなかった。また、対照側の逃避閾値は、ｓｉＲＮＡ投与後もほとんど変動がなかった。
（４）Ｒｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子の阻害による発現抑制
　Ｒｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子であるＳｐ１をミトラマイシンで阻害することでＲｏｂｏ４遺伝子の発現を抑制し、神経障害性疼痛を緩和することができるのかを検証した。結果を図４に示した。神経障害性疼痛モデル作製後４日目および７日目において、ミトラマイシン投与群は対照群と比較して有意な逃避閾値の上昇が観察された（T検定、*Ｐ<0.05）。この結果からＲｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子の薬理阻害によって神経障害性疼痛における鎮痛効果が得られることが示された。
〔実施例２：Ｒｏｂｏ４の痛覚応答を増強するシグナルを伝達する受容体の同定〕
（１）ｓｉＲＮＡによるＵｎｃ５Ｂ遺伝子の発現抑制
　脊髄内のＲｏｂｏ４が司る痛覚応答の増強シグナルがどのような受容体を介して下流に伝わっていくのかを明らかにするために、Ｒｏｂｏ４の候補受容体の遺伝子発現を抑制してＲｏｂｏ４脊髄内投与の効果が打ち消されるかどうかを調べた。Ｒｏｂｏ４に結合することが知られているＵｎｃ５Ｂを候補受容体とし、Ｕｎｃ５Ｂ ｍＲＮＡと結合するｓｉＲＮＡを作製した。
　実施例１の実験方法（５）と同じ方法で、脊髄髄腔内にチューブを挿管したラットを作製し、チューブ挿管から１週間後にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌｅｍｅｎｔテストを行って、チューブの挿管による運動障害や疼痛が起こっていないことを確認した個体を用いて実験を行った。遺伝子導入試薬ＨＶＪ－Ｅ（GenomeONE-Neo、石原産業）とＵｎｃ５Ｂ ｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi siRNA、invitrogen、センス鎖：CCGUCUUUGUGGUUCUGGCAGUUCU（配列番号７）、アンチセンス鎖：AGAACUGCCAGAACCACAAAGACGG（配列番号８））各１μｇを混合した液を、挿管したチューブの後端から１０μＬ注入して、脊髄髄腔内に投与した。対照群の動物にはＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi siRNA Negative Control、invitrogen）とＨＶＪ－Ｅの混合液を同じ量だけ投与した。投与後チューブの後端を閉じ、皮膚を縫合した。ｓｉＲＮＡ投与２日後にＲｏｂｏ４精製タンパク質（R&D, 2366-RB）を生理食塩水に溶解した液（４０ｎｇ／μＬ）１０μＬを挿管したチューブの後端から投与した。Ｒｏｂｏ４タンパク質投与後１２，２４，４８時間目にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化について調べた。
　結果を図５に示した。Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ投与群はＲｏｂｏ４タンパク質投与後逃避閾値が低下したが、Ｕｎｃ５Ｂ ｓｉＲＮＡ投与群はＲｏｂｏ４タンパク質投与による逃避閾値の低下が、２４時間目および４８時間目において有意に抑制された（Tukey-Kramer検定、*Ｐ<0.05）。この結果から、Ｒｏｂｏ４の痛覚応答増強シグナルはＲｏｂｏ４タンパク質がＵｎｃ５Ｂ受容体に結合することにより下流に伝達される可能性が示唆された。
（２）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ
　Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂが実際に結合するのかどうか明らかにするために、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡを行った。
　９６ウェルプラスチックプレートにＨｉｓタグが標識されたヒトＲｏｂｏ４精製タンパク質（2μg/mL）を含む液を塗布し、４℃で一晩静置した。界面活性剤の入ったリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で５回洗浄してから、ブロックエース（商品名、10 mg/mL、大日本住友製薬）を含むＰＢＳＴに置換して室温で１時間反応させた。さらにＦｃタグが標識されたラットＵｎｃ５Ｂタンパク質を０、２０、４０、８０または１６０ｎｇ含むＰＢＳＴと置換して室温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで５回洗浄してから抗Ｆｃ抗体を希釈した液に置換して室温で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで５回洗浄してからＨＲＰ標識された二次抗体を含む液に置換して室温で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで５回洗浄してからＴＭＢ発色液（R&D）と置換させて室温で３０分間反応させた。反応停止液（R&D）を加えてから、プレートリーダーで波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照群としてＦｃタンパク質を用いた。ＥＬＩＳＡに使用した抗体は、抗Ｆｃ抗体（1:500、Sigma）およびＨＲＰ標識ヤギＩｇＧ抗体（1:1000、Molecular Probes）である。
　結果を図６に示した。添加したＵｎｃ５Ｂの濃度依存的に吸光度が増加した。このような増加曲線は対照群（Control-Fc）では観察されなかったので、吸光度の増加はＲｏｂｏ４－Ｕｎｃ５Ｂ間の結合を示していると考えられた。この結果からＲｏｂｏ４タンパク質とＵｎｃ５Ｂタンパク質が実際に結合する能力があることが明らかになった。
（３）Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇアッセイ
　Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂが実際に結合するのかどうか明らかにするために、Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇアッセイを行った。
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＧＦＰ遺伝子配列を付加したラットＵｎｃ５Ｂ遺伝子を、lipofection 法を用いて形質導入した。遺伝子導入４８時間後に、Ｆｃタグが標識されたヒトＲｏｂｏ４タンパク質（濃度2μg/mL、R&D）を含むリン酸緩衝液と培地を置換して３７℃で１時間反応させた。反応後、４％ＰＦＡ／０．１ Ｍ ＰＢＳで細胞を固定し、５％ＢＳＡ液で１時間ブロッキングしてから一次抗体を加えた液に置換して４℃で一晩反応させた。反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄し、５％ＢＳＡ液に二次抗体を加えた液に置換して４℃で一晩反応させた。二次抗体反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄して封入し、蛍光顕微鏡で観察した。対照群としてＧＦＰ遺伝子のみを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。免疫細胞染色に使用した抗体は、抗Ｆｃ抗体（1:200、Sigma）および蛍光標識抗ラビットＩｇＧ抗体（1:500、Molecular Probes）である。
　結果を図７に示した。上段がＧＦＰ遺伝子ののみを導入した対照群、下段がＧＦＰ遺伝子を付加したラットＵｎｃ５Ｂ遺伝子（Unc5B-GFP）を導入した群である。対照群では細胞表面に結合するＲｏｂｏ４はほとんど観察されなかったが、Ｕｎｃ５Ｂ－ＧＦＰを発現させた細胞の表面にはＲｏｂｏ４のシグナルが確認された。この結果から、生細胞においてもＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂが結合することが明らかになった。
〔実施例３：Ｒｏｂｏ４の抑制によるアストロサイト内疼痛惹起因子の遺伝子発現変化〕
　Ｒｏｂｏ４の発現がアストロサイトにどのような性質の変化をもたらすのか明らかにするために、Ｒｏｂｏ４遺伝子の発現を抑制したアストロサイトの疼痛惹起因子の遺伝子発現量を調べた。アストロサイトには、ヒトアストロサイト株化細胞Ｕ２５１ＭＧ（ECACC株番号：09063001、以下「Ｕ２５１ＭＧ細胞」と記す）を使用した。培養液はEagle's minimum essential medium（MEM, GIBCO）にFetal bovine serum（GIBCO）を１０％の濃度になるように添加したものを使用した。５％のＣＯ２濃度を保った庫内温度３７℃のインキュベーターにて培養を行った。
　Ｒｏｂｏ４遺伝子をノックダウンするために、ヒトＲｏｂｏ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡ［センス鎖：CCUCAGAGUUCACGGACAUtt（配列番号３）、アンチセンス鎖：AUGUCCGUGAACUCUGAGGtt（配列番号４）］を遺伝子導入試薬 lipofectamine2000（Life Technologies）を用いてＵ２５１ＭＧ細胞に遺伝子導入した。また対照群として、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ［センス鎖：UUCUCCGAACGUGUCACGUtt（配列番号９）、アンチセンス鎖：ACGUGACACGUUCGGAGAAtt（配列番号１０）］をlipofectamine2000を用いてＵ２５１ＭＧ細胞に導入した。ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後に、アストロサイト（Ｕ２５１ＭＧ細胞）を活性化させるためにリポポリサッカリド（Sigma, L4524）を１μｇ／ｍＬの濃度になるように培養液に添加した。リポポリサッカリド添加の１２時間後に、Ｕ２５１ＭＧ細胞から試薬（TRIZOL, Life Technologies）を用いてＲＮＡを抽出後、逆転写酵素（High-capacity Reverse Transcription Kit, Life Technologies）によりｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ法を用いてＧＭ－ＣＳＦ（Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor）、ＣＸＣＬ１（The C-X-C motif Ligand 1）、ＴＮＦα（Tumor Necrosis Factor-α）、ＭＣＰ－１（Monocyte Chemoattractant Protein-1）の遺伝子発現量をΔΔＣｔ値から定量を行った。各遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子ヒトＧＡＰＤＨ発現量によって補正した。
　結果を図８に示した。図８から明らかなように、Ｒｏｂｏ４ ｓｉＲＮＡを導入したアストロサイトは、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを導入したアストロサイトと比較して、ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＸＣＬ１、ＴＮＦαおよびＭＣＰ－１の各遺伝子の発現量が有意に減少していることが示された（T検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。この結果からＲｏｂｏ４はアストロサイトにおける疼痛惹起因子の発現を増加させる働きがあることが示唆された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (7)

  1. 　Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする疼痛の予防または治療用医薬組成物。
  2. 　Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質が、Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する核酸またはＲｏｂｏ４遺伝子の転写促進因子を阻害する物質である請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質が、Ｒｏｂｏ４と特異的に結合する抗体またはペプチドである請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 　疼痛抑制物質のスクリーニング方法であって、Ｒｏｂｏ４を用いることを特徴とする方法。
  5. 　Ｒｏｂｏ４の発現を阻害する物質またはＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を選択することを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 　被験物質とＲｏｂｏ４を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のＲｏｂｏ４の発現量を測定する工程と、該発現量を被験物質と接触させない前記細胞におけるＲｏｂｏ４の発現量と比較し、Ｒｏｂｏ４の発現量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 　被験物質とＲｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂを接触させる工程と、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を確認する工程と、Ｒｏｂｏ４とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
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