RU2736499C1 - Специфические ингибиторы гексокиназы-2 для применения при остром повреждении центральной нервной системы - Google Patents
Специфические ингибиторы гексокиназы-2 для применения при остром повреждении центральной нервной системы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2736499C1 RU2736499C1 RU2019128326A RU2019128326A RU2736499C1 RU 2736499 C1 RU2736499 C1 RU 2736499C1 RU 2019128326 A RU2019128326 A RU 2019128326A RU 2019128326 A RU2019128326 A RU 2019128326A RU 2736499 C1 RU2736499 C1 RU 2736499C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hexokinase
- microglia
- hypoxia
- acute
- cells
- Prior art date
Links
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 102100029242 Hexokinase-2 Human genes 0.000 title claims description 68
- 101710198385 Hexokinase-2 Proteins 0.000 title claims description 35
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims description 18
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 77
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 26
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 25
- WDRYRZXSPDWGEB-UHFFFAOYSA-N lonidamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(C(=O)O)=NN1CC1=CC=C(Cl)C=C1Cl WDRYRZXSPDWGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229960003538 lonidamine Drugs 0.000 claims description 24
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 19
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 14
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 11
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 claims description 9
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 claims description 7
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 6
- PRRZDZJYSJLDBS-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-2-oxopropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CBr PRRZDZJYSJLDBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- GEWDNTWNSAZUDX-WQMVXFAESA-N (-)-methyl jasmonate Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(=O)OC)CCC1=O GEWDNTWNSAZUDX-WQMVXFAESA-N 0.000 claims description 2
- IJJLRUSZMLMXCN-SLPGGIOYSA-N (2r,3r,4s,5r)-2,3,4,6-tetrahydroxy-5-sulfanylhexanal Chemical compound OC[C@@H](S)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O IJJLRUSZMLMXCN-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 2
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010070511 Hypoxic-ischaemic encephalopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 claims description 2
- 208000004552 Lacunar Stroke Diseases 0.000 claims description 2
- 206010051078 Lacunar infarction Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037212 Neonatal hypoxic and ischemic brain injury Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007125 Neurotoxicity Syndromes Diseases 0.000 claims description 2
- 206010057430 Retinal injury Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020339 Spinal injury Diseases 0.000 claims description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000076 Toxic encephalopathy Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009973 brain hypoxia - ischemia Diseases 0.000 claims description 2
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 claims description 2
- GEWDNTWNSAZUDX-UHFFFAOYSA-N methyl 7-epi-jasmonate Natural products CCC=CCC1C(CC(=O)OC)CCC1=O GEWDNTWNSAZUDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000033300 perinatal asphyxia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 claims description 2
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims 2
- 208000002381 Brain Hypoxia Diseases 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims 1
- 229940119173 Hexokinase 2 inhibitor Drugs 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 64
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 34
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 24
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 24
- 102100039329 Glycerol kinase 2 Human genes 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 16
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 14
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 14
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 102100030338 Hexokinase-1 Human genes 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 102100029236 Hexokinase-3 Human genes 0.000 description 10
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 10
- 210000000269 carotid artery external Anatomy 0.000 description 10
- 210000004004 carotid artery internal Anatomy 0.000 description 10
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- QUTFFEUUGHUPQC-ILWYWAAHSA-N (2r,3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-[(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl)amino]hexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C2=NON=C12 QUTFFEUUGHUPQC-ILWYWAAHSA-N 0.000 description 7
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- HJUFTIJOISQSKQ-UHFFFAOYSA-N fenoxycarb Chemical compound C1=CC(OCCNC(=O)OCC)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 HJUFTIJOISQSKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 6
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 6
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 6
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 6
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 6
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 5
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 5
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 4
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 4
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000006195 histone acetylation Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000006724 microglial activation Effects 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 3
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 3
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 3
- 206010008089 Cerebral artery occlusion Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102100023903 Glycerol kinase Human genes 0.000 description 3
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 3
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 208000001738 Nervous System Trauma Diseases 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 201000007309 middle cerebral artery infarction Diseases 0.000 description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 3
- 208000028412 nervous system injury Diseases 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- 102100032922 ATP-dependent 6-phosphofructokinase, muscle type Human genes 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 101710198391 Hexokinase-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710198398 Hexokinase-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000730838 Homo sapiens ATP-dependent 6-phosphofructokinase, muscle type Proteins 0.000 description 2
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101150012417 IL1B gene Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 2
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 210000001642 activated microglia Anatomy 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007959 normoxia Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical group ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEPMSUUWSGUYKQ-IWXIMVSXSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl)amino]hexanal Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C2=NON=C12 DEPMSUUWSGUYKQ-IWXIMVSXSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 102100032921 ATP-dependent 6-phosphofructokinase, liver type Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N D-fructose 1,6-bisphosphate Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(=O)COP(O)(O)=O XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124602 FDA-approved drug Drugs 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 101000730830 Homo sapiens ATP-dependent 6-phosphofructokinase, liver type Proteins 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101000840556 Oryza sativa subsp. japonica Hexokinase-4, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101150033527 TNF gene Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 1
- 229960000556 fingolimod Drugs 0.000 description 1
- KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N fingolimod Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(CCC(N)(CO)CO)C=C1 KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N fructose-1,6-phosphate Natural products OC1C(O)C(O)(COP(O)(O)=O)OC1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009524 hypoxic brain injury Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 238000007884 metabolite profiling Methods 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 1
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 1
- 230000003962 neuroinflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 210000001243 pseudopodia Anatomy 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 208000026507 restrictive cardiomyopathy 2 Diseases 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/415—1,2-Diazoles
- A61K31/416—1,2-Diazoles condensed with carbocyclic ring systems, e.g. indazole
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7004—Monosaccharides having only carbon, hydrogen and oxygen atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к лечению острого повреждения центральной нервной системы. Раскрыто применение специфического ингибитора гексокиназы-2 для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения острого повреждения центральной нервной системы, опосредованного активацией микроглии. Также раскрыто применение композиции, содержащей специфический ингибитор гексокиназы-2, для изготовления лекарственного средства для профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы, опосредованного активацией микроглии. Группа изобретений обеспечивает нейропротекторное действие. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биомедицины и связано с применением специфических ингибиторов гексокиназы-2 для профилактики и лечения острых повреждений центральной нервной системы (ЦНС).
Уровень техники
Инсульт, ишемический или геморрагический, является острым цереброваскулярным заболеванием, сопровождающимся повреждением головного мозга, вызванным разрывом кровеносных сосудов в головном мозге или уменьшением кровоснабжения из-за сосудистой окклюзии. Ишемический инсульт составляет около 85% от общего числа случаев. Тканевой активатор плазминогена (t-PA) представляет собой лекарственное средство, одобренное управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для лечения ишемического инсульта. Однако, t-PA подходит для применения только в первые 3-6 часов после инсульта, кроме того, существует риск церебрального кровотечения и церебрального отека после лечения. Эти недостатки сильно ограничивают применение t-PA, и очень немногие пациенты получают терапевтический эффект от его приема. Поэтому существует потребность в безопасных и эффективных препаратах, которые могут применяться для профилактики и лечения острого ишемического инсульта.
Воспалительная реакция, опосредованная иммунной системой после острого ишемического инсульта, является широко изученной терапевтической мишенью. Однако результаты клинических испытаний препаратов, использующих этот механизм в качестве терапевтических мишеней, не являются удовлетворительными. Например, Финголимод и Натализумаб, оба являющиеся агентами, нацеленными на воспалительный ответ периферической иммунной системы, эффективны в ингибировании проникновения лимфоцитов в паренхиму головного мозга, однако клинические испытания показали, что для пациентов с инсультом такое лечение неэффективно. Таким образом, углубленное изучение воспалительной реакции центральной нервной системы, опосредованной микроглией, после ишемии, как ожидается, обеспечит новые терапевтические цели и стратегии для профилактики и лечения острого ишемического инсульта.
Краткое описание изобретения
Авторы настоящего изобретения провели скрининг ряда генов гликолитического пути и установили, что селективная позитивная регуляция гексокиназы 2 опосредует процесс индуцированной гипоксией активации микроглии. Авторы изобретения подтвердили, что ряд биологически активных веществ, обладающих селективно ингибирующей активностью в отношении гексокиназы 2, может ингибировать вызванную гипоксией активацию микроглии. Кроме того, авторы изобретения также обнаружили, что интерференция обоих ферментов, гексокиназы 1 и 3, не может ингибировать вызванную гипоксией активацию микроглии.
Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложено применение специфического ингибитора гексокиназы 2 для изготовления лекарственного средства для профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей специфический ингибитор гексокиназы 2, для изготовления лекарственного средства для профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, профилактически или терапевтически эффективного количества специфического ингибитора гексокиназы 2 или фармацевтической композиции, содержащей специфический ингибитор гексокиназы 2.
Авторы настоящего изобретения обнаружили нейропротекторное действие специфического ингибитора гексокиназы 2 при профилактике и лечении острого повреждения центральной нервной системы. Цитологические и in vivo эксперименты на животных показали, что селективно повышенная экспрессия гексокиназы 2 регулирует вызванную гипоксией активацию микроглии и опосредованные микроглией нейровоспалительные реакции после ишемии, тогда как селективные ингибиторы гексокиназы 2 и нокдаун генов значительно ингибируют опосредованные микроглией воспалительные реакции и тем самым оказывают нейропротекторное действие.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Увеличенный гликолитический поток необходим для вызванной гипоксией активации микроглии. (А) Типовые изображения микроглии BV 2, подвергавшейся воздействию гипоксии в течение указанного времени. Масштаб, 100 мкм (n=4). (В) Количественное определение процентного содержания клеток микроглии с морфологическими изменениями, показанными в (А) (n=4). (С) вызванная гипоксией активация микроглии была верифицирована посредством повышения экспрессии молекулярного маркера CD 11b. Масштаб, 25 мкм (n=3). (D) Провоспалительные цитокины были заметно индуцированы гипоксией в клетках BV 2 в зависимости от времени (n=3). (E-F) Гипоксия не оказывала влияния на жизнеспособность клеток BV 2. Анализ по методу проточной цитометрии не показал значительного увеличения количества Аннексии V+ или PI+ клеток после воздействия 1% кислорода в течение 24 часов (n=3). (G) Типовые изображения анализа поглощения 2-[N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил) амино]-2-дезокси-D-глюкозы (2-NBDG) в клетках, инкубированных с 2-NBDG, подвергавшихся нормоксии или гипоксии в течение 1 часа. Масштаб 100 мкм. (Н) Средняя интенсивность флуоресценции в (G) была количественно определена с помощью считывателя микропланшетов с несколькими детекторами (n=4). (I) Графики, иллюстрирующие ключевые метаболиты в гликолитическом пути; значительно повышенные метаболиты были отмечены после воздействия гипоксии в течение 6 часов (n=4). (J-L) 2-DG, ингибитор гликолитического пути, значительно блокирует активацию микроглии во время гипоксии. (J) Фазово-контрастные изображения клеток BV 2, подвергавшихся воздействию 1% кислорода с 2-DG или без него. (K) Уменьшенный процент активированных клеток после обработки 2-DG в (J). Масштаб, 50 мкм (n=4). (L) Продукция провоспалительных цитокинов была значительно нарушена 2-DG при гипоксии. *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
Фиг. 2. Повышенная экспрессия членов семейства гексокиназ была вовлечена в процесс вызванной гипоксией активации микроглии. (А) Анализы уровней мРНК ферментов методом количественной ПЦР с детекцией в реальном времени (qRT-PCR). Графики, показывающие общее повышение уровня мРНК этих генов при гипоксии в течение 6 ч (n=3). (В-С) Уровни белка ГК1 (HK1), ГК2 (HK2) и ГК3 (HK3) в клетках BV 2 и первичной микроглии (pMG), подвергавшихся гипоксии в течение указанного времени (n=4).
Фиг. 3. Интерференция гексокиназы 2 эффективно ингибировала индуцированную гипоксией активацию микроглии. (А) Специфического нокдауна ГК2 (HK2) было достаточно для блокирования активированного фенотипа микроглии BV 2 (n=3). Указанные уровни белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга после того, как клетки BV 2 трансфицировали ГК2 (HK2) киРНК или без в течение 24 ч и стимулировали гипоксией в течение еще 24 часов. (В) Трансфекция клеток BV2 различными интерферирующими фрагментами ГК2 (HK2) эффективно подавляет морфологические изменения, вызванные гипоксией. (С) Сниженный процент активированной морфологии микроглии в клетках с нокдауном ГК2 (HK2) при гипоксии. (D) Нокдаун ГК2 (HK2) заметно подавлял экспрессию CD 11b.
Фиг. 4. Ни интерференция ГК1 (HK1), ни интерференция ГК3 (HK3) не могли подавить вызванную гипоксией активацию микроглии. Вызванная гипоксией активация, связанная с морфологическими изменениями микроглии (В и D, n=3), не могла быть эффективно подавлена интерферирующими фрагментами ГК1 (HK1) и ГК3 (HK3) соответственно (А и С).
Фиг. 5. Интерференция РКМ2 не могла ингибировать вызванную гипоксией активацию микроглии. (А) Иммуноблот-анализ экспрессии белка РKМ2 в стимулированных гипоксией клетках BV 2. (В) Нокдаун РКМ2 не влиял на индуцированную гипоксией позитивную регуляцию CD 11b. (С) Типовые изображения, показывающие, что нокдаун РKМ2 не мог подавлять морфологические изменения, вызванные гипоксией. Масштаб, 50 мкм.
Фиг. 6. Лонидамин, ингибитор ГК2 (HK2), может эффективно ингибировать вызванную гипоксией активацию микроглии. (А) Активированное состояние культур pMG и BV 2 было заметно ингибировано в присутствии лонидамина (50 мкм) во время гипоксии. Масштаб, 50 мкм. (В) Графики, показывающие снижение процентного содержания активированных клеток микроглии, обработанных лонидамином в (А). (С) Иммунофлуоресцентный анализ, иллюстрирующий снижение экспрессии CD 11b в присутствии лонидамина в клетках BV 2 и pMG при стимуляции гипоксией. Масштаб, 50 мкм. *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
Фиг.7. Индукция ГК2 (HK2) приводит к повышенному уровню ацетилирования гистонов и транскрипционной активации провоспалительного цитокина Il-lb. (А) Метаболическое профилирование цикла гликолиза и ТСА после того, как клетки BV 2 подвергались гипоксии в течение 6 часов. Данные представлены в виде кратности изменений при гипоксии по сравнению с нормоксией. Негативно регулируемые представлены зелеными квадратами, а позитивно регулируемые - красными квадратами (n=4). (В) (D) Ингибирование ГК2 (HK2) обратило внутриклеточное накопление ацетил-КоА и ингибировало положительно регулируемые ацетилированные гистоны в клетках BV 2 (n=4). (С) Уровни экспрессии ацетилирования гистонов после воздействия гипоксии в клетках BV 2 и клетках первичной микроглии (pMG) (n=3). (Е) вызванная гипоксией позитивная регуляция Il 1b на уровне мРНК может быть значительно снижена ингибированием ГК2 (HK2) (n=3). (F) Предварительная обработка Лонидамином уменьшила ассоциацию АсН3 и АсН4 с промотором Il 1b. Содержание промотора Il 1b с АсН3 или АсН4 в каждой лечебной группе соотносилось с исходными образцами с тем же праймером (n=3). *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
Фиг. 8. Лонидамин эффективно защищал крыс от повреждения головного мозга, вызванного окклюзией средней мозговой артерии оСМА (МСАо). (А) Типовые изображения 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ (ТТС))-окрашенных участков мозга в каждой лечебной группе. (В) Количественное определение размера инфаркта в каждой группе, показывающее, что введение лонидамина значительно уменьшило размер инфарктов, вызванных оСМА (МСАо). (n=6 на группу) *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
Фиг. 9. Нокдаун ГК2 (HK2) in vivo эффективно защищал крыс от повреждения головного мозга, вызванного окклюзией средней мозговой артерии (оСМА (МСАо)). (А) Распределение вируса контролировали с помощью визуализации всего мозга на основе экспрессии уЗФБ (eGFP) через 21 день после инъекции векторов AAV (n=3). (В) Срезы мозга через стриатум, окрашенные для ГК2 (HK2) и CD 11b, показывающие, что CD 11b положительно коррелирует с экспрессией ГК2 (HK2) в микроглии (n=6/группа). Масштаб, 20 мкм. (С) окрашивание ТТХ (ТТС), показывающее уменьшение размера инфаркта в лечебной группе AAVshHK2 после операции оСМА (МСАо) (n=6/group). (D) Количественное определение размера инфаркта в (С) (n=6/группа). (Е) Иммунореактивность Iba-1 в стриатуме показывает, что обработка AAV-shHK2 существенно блокирует микроглиальную активацию в полушарии инфаркта. Масштаб, 50 мкм. (F) Типовые изображения, полученные из кортекса и стриатума в ишемических полушариях, показывающие снижение продукцию IL-1b после лечения AAV2/9-shHK2 в модели оСМА (МСАо) крыс. *<0,05; **<0,01; ***<0,001.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие варианты осуществления, которые не следует расценивать как ограничивающие объем изобретения. Любые эквивалентные изменения или варианты, реализованные в соответствии с принципом или сущностью изобретения, рассматриваются в рамках настоящего изобретения.
В соответствии с одним аспектом изобретения предложено применение специфического ингибитора гексокиназы 2 для изготовления лекарственного средства для профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы. Применяемый здесь специфический ингибитор гексокиназы 2 относится к веществу, способному специфически или селективно ингибировать биологическую активность гексокиназы 2 (также называемой гексокиназой II или HK2 (ГК2)).
В некоторых вариантах осуществления специфический ингибитор гексокиназы 2 содержит антитело к гексокиназе 2 или его фрагмент. Антитело относится к белку, способному специфически связываться с гексокиназой 2 и ингибировать или гасить активность гексокиназы 2. Фрагмент антитела может включать, например, Fab, Fab', (Fab')2, и Fv. Получение и очистка антител или их фрагментов известны в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления антитело к гексокиназе 2 согласно изобретению может быть также представлено в форме аминокислотной или нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело, или вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную или аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления антитело к гексокиназе 2, описанное в настоящем изобретении, может также присутствовать в экспрессионном векторе или клетке-хозяине в форме слитого белка.
В некоторых вариантах осуществления специфический ингибитор гексокиназы 2 содержит вещество, способное специфически ингибировать трансляцию мРНК гексокиназы 2, или вещество, способное специфически деградировать мРНК гексокиназы 2, такое как киРНК, кшРНК, микроРНК или их модификации, тем самым препятствуя синтезу гексокиназы 2 по механизму РНКи. киРНК, кшРНК или микроРНК могут быть получены методами синтеза in vitro, которые хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления киРНК, кшРНК или микроРНК, описанные в настоящем изобретении, присутствуют в конкретном векторе, таком как клетка.
В некоторых вариантах осуществления острое повреждение центральной нервной системы относится к заболеванию или состоянию повреждения центральной нервной системы, вызванного острой ишемией или гипоксией, включая, но не ограничиваясь, повреждение головного/спинного мозга, вызванное острой травмой позвоночника, травмой головного мозга, повреждением сетчатки, гипоксическим повреждением головного мозга, острым ишемическим повреждением головного мозга, ишемическим инсультом, гипоксическим инсультом, неонатальной гипоксической ишемической энцефалопатией, токсической энцефалопатией, острым инфарктом головного мозга, лакунарным инфарктом, транзиторной ишемической атакой, тяжелой черепно-мозговой травмой, цереброспинальной хирургией и лучевой терапией головного/спинного мозга.
В соответствии с другим аспектом изобретения предложено применение композиции, содержащей специфический ингибитор гексокиназы 2, для изготовления лекарственного средства для профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы.
В некоторых вариантах осуществления специфическими ингибиторами гексокиназы 2, содержащимися в композиции, являются такие, которые описаны выше, и композиция может дополнительно содержать другие ингибиторы гексокиназы 2, включая, но не ограничиваясь, 2-дезоксиглюкозу, Лонидамин, бромпировиноградную кислоту, глюкозо-6-фосфат, Иматиниб, 5-тио-глюкозу и метилжасмонат.
Еще одним аспектом изобретения является способ профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, профилактически эффективного количества или терапевтически эффективного количества специфического ингибитора гексокиназы 2 или композиции, содержащей специфический ингибитор гексокиназы 2.
В некоторых вариантах осуществления субъект является млекопитающим, таким как человек. Введение осуществляют подкожно, трансдермально, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, сублингвально, буккально, через желудочно-кишечный тракт или аналогично, например, человеку. В некоторых вариантах осуществления специфический ингибитор гексокиназы 2 (например, в форме нуклеиновой кислоты) может быть введен субъекту в качестве генной терапии для лечения или профилактики.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы, включающий селективное или специфическое снижение или инактивацию активности гексокиназы 2 у нуждающегося в этом субъекта. Это снижение или инактивация активности гексокиназы может быть достигнуто, например, с помощью генно-инженерных подходов для уменьшения или устранения экспрессии белка гексокиназы 2. Примером такого подхода является изменение последовательности нуклеотидов, кодирующих гексокиназу 2, посредством сайтнаправленного мутагенеза. Другим примером является вмешательство в процесс трансляции мРНК гексокиназы 2 с помощью технологии РНКи. Любой способ, известный специалистам в данной области техники для снижения экспрессии конкретного белка в клетке, рассматривается для применения в способах согласно изобретению.
Примеры
Материалы и методы, применяемые в настоящем изобретении, являются общепринятыми материалами и методами, если не указано иное.
Пример 1. Усиленный гликолитический поток необходим для активации микроглии, индуцированной гипоксией
Материалы
Клетки микроглии мыши BV2, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Gibco, 11965-118), фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099-141), 2-дезокси-D-глюкоза (Sigma-Aldrich, D8375), 2-[N-(7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино]-2-дезокси-D-глюкоза (2-NBDG, Thermo Fisher Scientific, N13195), набор для обнаружения Аннексин/PI (Biotool, В32115), проточный цитометр (CytoFLEX Ы), лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (Nikon A1 Spectral Confocal Microscope), бескислородная камера (Coy Laboratory Products).
Антитела, использованные в вестерн-блоттинге и иммунофлюоресценции:
Антитело к CD 11b (Novus biologicals, NB 110-89474);
Антитело к TNF-α (CST, 11498);
Антитело к IL-1β (CST, 12507);
Антитело к IL-6 (Bioss, bs-6309R);
Антитело к α-тубулину (Bioworld, AP0064)
Методы
a) Клеточная культура: Клетки BV2 выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС (FBS)), помещали в 5% СО2, культивировали в инкубаторе при постоянной температуре 37°С (относительная влажность составляла 95%) и наблюдали под инвертированным микроскопом. Пассажи проводили примерно через 2-3 дня, а логарифмическую фазу роста клеток использовали для формальных экспериментов. Клетки в группе гипоксической обработки помещали в бескислородную камеру Coy с 1% О2, 5% СО2 и 94% N2; другие условия были такими же, как и нормальные условия культивирования.
b) Экстракция белка и анализ экспрессии провоспалительных цитокинов: После инкубации на 3 5 мм культуральных чашках и размещения на 24 часа клетки подвергали гипоксии в течение указанного времени. Затем общий клеточный белок экстрагировали для выявления экспрессии белка провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6.
c) Экспрессия CD 11b, обнаруженная при помощи иммунофлуоресценции: Клетки BV2 высевали в лазерную конфокально-специфическую культуральную пластинку и подвергали гипоксии на протяжении 24 часов, фиксировали в 4% параформальдегиде при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем трижды промывали ФСБТ (фосфатно-солевой буфер с твином) в течение 5 минут каждый раз. После промывки добавляли антитело к CD 11b, разбавленное разбавителем антител DAKO, и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующий день образцы инкубировали с указанным флуоресцентно меченым вторичным антителом при 37°С в течение 1 часа. После инкубации добавляли рабочий раствор DAPI для окрашивания ядер в течение 10 минут. Затем образцы трижды промывали ФСБТ (фосфатно-солевой буфер с твином) и визуализировали с помощью лазерного конфокального микроскопа.
d) Анализ поглощения 2-NBDG: Клетки BV2 высевали в 96-луночную культуральную пластину (черная по бокам, прозрачная по дну) и через 24 часа клеточную среду заменяли буфером DPBS, содержащим 200 мкм 2-NBDG. Затем клетки культивировали в нормоксических или гипоксических условиях. После 1 часа инкубации среду меняли на свежий ФСБД (фосфатно-солевой буфер Дульбекко). Далее, получали изображения и количественно определяли поглощение 2-NBDG с помощью анализа флуоресценции микропластин.
e) Окрашивание Аннексином/PI: Клетки высевали в 35 мм культуральную чашку и культивировали в течение 24 часов, а затем культивировали в гипоксическом состоянии в течение 24 часов. Клетки собирали с 0,25% трипсином и окрашивали Аннексином и красителем PI в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем. Анализ с применением проточной цитометрии проводили через 30 минут, чтобы определить, вызвала ли гипоксия гибель клеток.
f) Экстракция и профилирование метаболитов: Клетки BV2 высевали в 60 мм культуральные чашки и культивировали в течение 24 часов, а затем культивировали в нормоксических или гипоксических условиях в течение 6 часов. Для профилирования метаболитов метаболиты экстрагировали с использованием 1,5 мл ледяного 80% метанола. После инкубации при -80°С в течение 30 минут клетки отбирали и центрифугировали при 14000 g в течение 15 минут при 4°С. Верхнюю метанольно-водную фазу переносили в новые пробирки и инкубировали при -80°С еще 30 минут. Верхние фазы центрифугировали и сушили под азотным газом, а высушенные образцы хранили при -80°С до проведения анализа ЖХ-МС.
Результаты
Как показано на фиг. 1А, стимуляция гипоксией привела к глубоким морфологическим изменениям в клетках BV 2, с увеличением клеточных тел и формированием филоподий или ламеллоподий. Морфологические изменения были зависимыми от времени, и число клеток микроглии с морфологическими изменениями увеличилось примерно до 52% от общего числа клеток после 24 часов воздействия гипоксии (фиг. 1В). Кроме того, наблюдалась повышенная экспрессия CD 11b, молекулярного маркера активации микроглии, после 24 часов воздействия гипоксии. Кроме того, как показано на фиг. 1D, продукция провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6 была заметно индуцирована зависимым от времени образом. Примечательно, что воздействие 1% кислорода в течение 24 часов не вызывало очевидной гибели клеток (фиг. 1Е и 1F). Результаты выше показали, что воздействие гипоксии привело к воспалительному активированному фенотипу микроглии.
Аэробный путь гликолиза в клетках BV2 был значительно повышен после воздействия гипоксии. Как показано на фиг. 1G и 1H, 2 Поглощение NBDG увеличивалось в 1,6 раза после 1 часа гипоксического
воздействия. Метаболическое профилирование также показало значительно повышенное содержание метаболических интермедиатов гликолитического пути после 6 часов гипоксического воздействия, включая фруктозо-1,6-бифосфат, дигидроксиацетонфосфат и глицеральдегид-3-фосфат (Г-3-Ф) (фиг. 1I). В присутствии 500 мкм 2-дезоксиглюкозы (2-ДГ), эффективного ингибитора гликолиза, процент клеток BV 2 с активированными морфологическими изменениями был значительно снижен (фиг. 1J-L). В совокупности эти данные демонстрируют, что усиленный гликолиз необходим для активации микроглии после воздействия гипоксии.
Пример 2. Положительная регуляция членов семейства гексокиназ вовлечена в активации микроглии после воздействия гипоксии
Материалы
Клеточная линия микроглии мыши BV2, культура первичной микроглии мыши, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (Gibco, 11965-118), фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099-141), реагент для экстракции РHK Тризол (TRIzol) (Thermo Fisher Scientific, 15596-018), набор для количественного определения РHK (Thermo Fisher Scientific, Q10211), SuperReal qPCRPreMix (SYBR Green) (Tiangen, FP202-01), система ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems), бескислородная камера (Coy Laboratory Products)
Антитела, использованные в вестерн-блоттинге:
Антитело к гексокиназе 1 (Abcam, 150423),
Антитело к гексокиназе 2 (CST, 2867s),
Антитело к гексокиназе 3 (Santa Cruz, sc-28890),
Антитело к α-Тубулину (Bioworld, АР0064).
Для ПЦР в реальном времени использовали следующие последовательности праймеров генов мыши.
Методы
а) Клеточная культура: Клетки BV2 выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС (FBS)), помещали в 5% СО2, культивировали в инкубаторе при постоянной температуре 37°С (относительная влажность составляла 95%) и наблюдали под инвертированным микроскопом. Пассажи проводили примерно через 2-3 дня, а логарифмическую фазу роста клеток использовали для формальных экспериментов.
Для выделения и культивирования первичной микроглии клетки выделяли из новорожденных мышей C57BL/6J. Вкратце, кора головного мозга мышей Р0-2, лишенная мозговых оболочек и кровеносных сосудов, была отделена и расщеплялась 0,125% трипсином при 37°С в течение 15 минут. Расщепление останавливали добавлением среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащего 10% ФБС (FBS), и изолированные одиночные клетки высевали в культуральные чашки. После слияния смешанных культур микроглию отделяли от других типов клеток легким встряхиванием и очищение определяли по специфичному для микроглии маркеру CD 11b.
b) Полная экстракция белка и анализ экспрессии белков семейства гексокиназ: Клетки высевали в 35 мм культуральные чашки на 24 часа и стимулировали гипоксией в течение указанного времени. Затем общий белок экстрагировали для выявления экспрессии белка семейства гексокиназ.
Результаты
После 6 часов гипоксии была обнаружена общая позитивная регуляция уровней мРНК этих ферментов. Все три тестируемые изоформы ГК (HK) демонстрировали значительно повышенную экспрессию мРНК (фиг. 2А). Дальнейшие результаты показали, что экспрессия белка этих изоформ также демонстрировала транзиторное или устойчивое увеличение в клетках BV 2 (фиг. 2b) и первичных клетках микроглии (фиг. 2С).
Пример 3 Гексокиназа 2, вместо других членов семейства гексокиназ, опосредовала вызванную гипоксией активацию микроглии
(1) Интерференция гексокиназы 2 смогла эффектно заблокировать вызванный гипоксией процесс активации микроглии
Материалы
Клеточная линия микроглии мыши BV2, культура первичной микроглии мыши, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (Gibco, 11965-118), фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099-141), фрагменты киРНК, реагент для трансфекции киРНК (Lipofectamine RNAiMAX Reagent, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), инвертированный фазово-контрастный микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti Microscope), лазерный конфокальный микроскоп (Nikon Al Spectral Confocal Microscope), бескислородная камера (Coy Laboratory Products).
Антитела, использованные в вестерн-блоттинге:
Антитело к гексокиназе 1 (Abcam, 150423),
Антитело к гексокиназе 2 (CST, 2867s),
Антитело к гексокиназе 3 (Santa Cruz, sc-28890),
Антитело к CD 11b (Novus biologicals, NB 110-89474),
Антитело к α-Тубулину (Bioworld, AP0064).
Методы
a) Клеточная культура: Клетки BV2 выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС (FBS)), помещали в 5% СО2, культивировали в инкубаторе при постоянной температуре 37°С (относительная влажность составляла 95%) и наблюдали под инвертированным микроскопом. Пассажи проводили примерно через 2-3 дня, а логарифмическую фазу роста клеток использовали для формальных экспериментов.
b) РHK-интерференция: Клетки высевали в 35 мм культуральную чашку на 24 часа. Малые интерферирующие РHK (siRNA) были трансфицированы при помощи реактива RNAiMAX. В качестве контроля использовалась скремблированная РHK. Культуры были трансфицированы в общей сложности 50 нм киРНК, и через 12 часов среда была заменена свежей средой. Затем клетки стимулировали гипоксией в течение 24 часов для определения уровня экспрессии указанных белков.
Результаты
Как показано на фиг. 3A-3D, уменьшение экспрессии ГК2 (HK2) с использованием различных фрагментов приводило к значительному ингибированию активированной морфологии микроглии, что также сопровождалось снижением экспрессии CD 11b. Примечательно, что киРНК, нацеленные на ГК2 (HK2), не влияли на экспрессию ГК1 (HK1) и ГК3 (HK3).
(2) взаимодействие гексокиназы 1 и гексокиназы 3 не смогло заблокировать вызванную гипоксией активацию микроглии
Материалы
Клеточная линия микроглии мыши BV2, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (Gibco, 11965-118), фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099-141), фрагменты малых интерферирующих РHK (киРНК), реагент для трансфекции малых интерферирующих РHK (киРНК) (Lipofectamine RNAiMAX Reagent, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), инвертированный фазово-контрастный микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti Microscope), лазерный конфокальный микроскоп (Nikon Al Spectral Confocal Microscope), бескислородная камера (Coy Laboratory Products).
Антитела, использованные в вестерн-блоттинге: Антитело к гексокиназе 1 (Abcam, 150423), Антитело к гексокиназе 2 (CST, 2867s), Антитело к гексокиназе 3 (Santa Cruz, sc-28890),
Антитело к α-Тубулину (Bioworld, АР0064).
Методы
a) Клеточная культура: Клетки BV2 выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС (FBS)), помещали в 5% СО2, культивировали в инкубаторе при постоянной температуре 37°С (относительная влажность составляла 95%) и наблюдали под инвертированным микроскопом. Пассажи проводили примерно через 2-3 дня, а логарифмическую фазу роста клеток использовали для формальных экспериментов.
b) РHK-интерференция: Клетки инокулировали в 35 мм культуральную чашку на 24 часа. Малые интерферирующие РHK (киРНК) были трансфицированы при помощи реактива RNAiMAX. В качестве контроля использовалась скремблированная РHK. В общей сложности 50 нм киРНК трансфицировали в культуры, и через 12 часов среда была заменена свежей средой. Затем клетки стимулировали гипоксией в течение 24 часов для определения уровня экспрессии указанных белков.
Результаты
Как показано на фиг. 4A-4D, ни нокдаун ГК1 (HK1), ни нокдаун ГКЗ (HKЗ) не были способны блокировать активацию микроглии.
(3) Интерференция пируваткиназы подтипа М2 (РКМ2) не смогла ингибировать вызванную гипоксией активацию микроглии
Материалы
Клеточная линия микроглии мыши BV2, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (Gibco, 11965-118), фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099-141), фрагменты малых интерферирующих РHK (киРНК), реагент для трансфекции малых интерферирующих РHK (киРНК) (Lipofectamine RNAiMAX Reagent, Thermo Fisher Scientific, 13778-500), инвертированный фазово-контрастный микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti Microscope), лазерный конфокальный микроскоп (Nikon Al Spectral Confocal Microscope), бескислородная камера (Coy Laboratory Products).
Антитела, используемые в вестерн-блоттинге: Антитело к PKM2 (Abcam, 150423), антитело к CD 11b (Novus biologicals, NB 110-89474), антитело к α-Тубулину (Bioworld, АР0064).
Методы
a) Клеточная культура: Клетки BV2 выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), помещали в 5% СО2, культивировали в инкубаторе с постоянной температурой 37°С (относительная влажность 95%) и наблюдали под инвертированным микроскопом. Пассажи проводили примерно через 2-3 дня, а логарифмическую фазу роста клеток использовали для формальных экспериментов.
b) РHK-интерференция: Клетки инокулировали на 35 мм культуральную чашку на 24 часа. Малые интерферирующие РHK (siRNA) были трансфицированы при помощи реактива RNAiMAX. В качестве контроля использовалась скремблированная РHK. Культуры были трансфицированы в общей сложности 50 нм киРНК, и через 12 часов среда была заменена свежей средой. Затем клетки стимулировали гипоксией в течение 24 часов для определения уровня экспрессии указанных белков.
Результаты
Результаты показали, что экспрессия белка РКМ2 демонстрировала транзиторное увеличение в стимулированных гипоксией клетках BV 2 (Фиг. 5А). Удивительно, но морфологические изменения, вызванные гипоксией, не были ингибированы нокдауном РКМ2 (Фиг. 5В-С).
(4) Лонидамин, ингибитор гексокиназы 2, был эффективен для ингибирования активации микроглии. вызванной гипоксией.
Материалы
Клеточная линия микроглии мыши BV2, культура первичной микроглии мыши, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (Gibco, 11965-118), фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099-141), лонидамин (Selleck, S2610), инвертированный фазово-контрастный микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti Microscope), лазерный конфокальный микроскоп (Nikon Al Spectral Confocal Microscope), бескислородная камера (Coy Laboratory Products). Антитела, использованные в вестерн-блоттинге: Антитело к CD 11b (Novus biologicals, NB 110-89474), антитело к α-Тубулину (Bioworld, АР0064).
Методы
a) Клеточная культура: Клетки BV2 выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС (FBS)), помещали в 5% СО2, культивировали в инкубаторе при постоянной температуре 37°С (относительная влажность составляла 95%) и наблюдали под инвертированным микроскопом. Пассажи проводили примерно через 2-3 дня, а логарифмическую фазу роста клеток использовали для формальных экспериментов.
Для выделения и культивирования первичной микроглии клетки выделяли из новорожденных мышей C57BL/6J. Вкратце, кора головного мозга мышей Р0-2, лишенная мозговых оболочек и кровеносных сосудов, была отделена и расщеплялась 0,125% трипсином при 37°С в течение 15 минут.Расщепление останавливали добавлением среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% ФБС (FBS), и изолированные одиночные клетки высевали в культуральные чашки. После слияния смешанных культур микроглию отделяли от других типов клеток легким встряхиванием и очищение определяли по специфичному для микроглии маркеру CD 11b.
b) экспрессия CD 11b, обнаруженная с помощью иммунофлуоресценции: Клетки BV2 высевали в лазерную конфокально-специфическую культуральную пластинку и подвергали гипоксии на протяжении 24 часов, фиксировали в 4% параформальдегиде при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем трижды промывали ФСБТ (фосфатно-солевой буфер с твином) в течение 5 минут каждый раз. После промывки добавляли антитело к CD 11b, разбавленное разбавителем антител DAKO, и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующий день образцы инкубировали с указанным флуоресцентно меченым вторичным антителом при 37°С в течение 1 часа. После инкубации добавляли рабочий раствор DAPI для окрашивания ядер в течение 10 минут. Затем образцы трижды промывали ФСБТ (фосфатно-солевой буфер с твином) и визуализировали с помощью лазерного конфокального микроскопа.
Результаты
Стимуляция гипоксией приводила к глубоким морфологическим изменениям в клетках BV 2 и pMG, а также к усилению экспрессии CD 11b (фиг. 6А-В). Иммунофлуоресцентный анализ иллюстрировал снижение экспрессии CD 11b в присутствии лонидамина (50 мкм, ДМСО в качестве растворителя), в то время как ДМСО в качестве контроля не оказывал влияния на экспрессию CD 11b.
Пример 4 Индукция гексокиназы 2 привела к усилению ацетилирования гистонов и трансляционной активации Il 1b
Материалы
Клеточная линия микроглии мыши BV2, культура первичной микроглии мыши, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (Gibco, 11965-118), фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099-141), лонидамин (Selleck, S2610), 3-бромопируват (Sigma, 16490), реагент для экстракции РHK TRIzol (Thermo Fisher Scientific, 15596-018), набор для количественного определения РHK (Thermo Fisher Scientific, Q10211), SuperReal qPCR PreMix (SYBR Green) (Tiangen, FP202-01), система ПНР в реальном времени (Applied Biosystems), набор для преципитации хроматина (Millipore, 17-245), бескислородная камера (Coy Laboratory Products), инвертированный фазово-контрастный микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti Microscope). Антитела, используемые в вестерн-блоттинге: антитело к ацетил-гистону Н3 (Millipore, 06-599); антитело к ацетил-гистону Н4 (Millipore, 06-866); антитело к α-Тубулину (Bioworld, АР0064).
Методы
а) Клеточная культура: Клетки BV2 выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС (FBS)), помещали в 5% СО2, культивировали в инкубаторе при постоянной температуре 37°С (относительная влажность составляла 95%) и наблюдали под инвертированным микроскопом. Пассажи проводили примерно через 2-3 дня, а логарифмическую фазу роста клеток использовали для формальных экспериментов.
Для выделения и культивирования первичной микроглии клетки выделяли из новорожденных мышей C57BL/6J. Вкратце, кора головного мозга мышей Р0-2, лишенная мозговых оболочек и кровеносных сосудов, была отделена и расщеплялась 0,125% трипсином при 37°С в течение 15 минут. Расщепление останавливали добавлением среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% ФБС (FBS), и изолированные одиночные клетки высевали в культуральные чашки. После слияния смешанных культур микроглию отделяли от других типов клеток легким встряхиванием и очищение определяли по специфичному для микроглии маркеру CD 11b.
б) Экстракция общего белка и анализ экспрессии ацетилированного гистона: Клетки инкубировали в 35 мм культуральной пластине в течение 24 часов и стимулировали гипоксией в течение указанного времени. Затем общий белок экстрагировали для определения экспрессии белка ацетилированного гистона.
c) Профилирование метаболитов: Клетки BV2 высевали в 60 мм культуральную чашку и культивировали в течение 24 часов, а затем культивировали в нормоксических или гипоксических условиях в течение 6 часов. Метаболиты экстрагировали с использованием 1,5 мл ледяного 80% метанола. После инкубации при -80°С в течение 30 минут клетки отбирали и центрифугировали при 14000 g в течение 15 мин при 4°С. Верхнюю метанольно-водную фазу переносили в новые пробирки и инкубировали при -80°С еще 30 минут. Верхние фазы центрифугировали и сушили под азотным газом, а высушенные образцы хранили при -80°С до проведения анализа ЖХ-МС.
d) Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP): Клетки BV 2 обрабатывали диметилсульфоксидом или лонидамином в течение 1 часа перед гипоксическим воздействием длительностью 6 часов. Затем клетки сшивали с 1% раствором формальдегида (Sigma, F8775) в течение 10 минут при 37°С. Клеточные лизаты подвергали ультразвуковому воздействию для получения 100-1000 bp фрагментов ДHK. Образцы разбавляли, и 10% от общего количества оставляли для введения. Оставшиеся части каждого образца предварительно очищали и добавляли антитела к Н3 или к Н4; в качестве отрицательного контроля одновременно использовали нормальное кроличье антитело к IgG. На следующий день добавляли protein G agarose и после 2 часов инкубации образцы промывали. Поперечные связи затем реверсировали путем инкубации при 65°С в течение 4 часов в 0,2 М NaCl. ДHK была извлечена из входных и IP-образцов, и был проведен анализ при помощи количественной ПЦР (qPCR). Последовательности праймеров промотора Il lb были следующими: 5' - AGGTCAAAGGTTTGGAAGCAG-3' (прямой) и 5'-ATGGAAGTCTGTCTGCTCAGTATTG-3' (обратный).
Результаты
Как показано на фиг. 7А, после стимуляции гипоксией в течение 6 часов наблюдались метаболические изменения в гликолизе, ЦТК (ТСА) и пентозофосфатном пути, в которых ацетил-коэнзим А был наиболее значительно подвержен влиянию гипоксии. В присутствии ингибиторов ГК2 (HK2), лонидамина (50 мкм) и 3-Br-пирувата (BrPA, 10 мкм), вызванное гипоксией накопление ацетил-коэнзима А было заметно нарушено (фиг. 7В). Как показано на фиг. 7С, ацетилированные гистоны 3 и 4 временно или непрерывно позитивно регулировались в клетках BV 2 и pMG во время воздействия гипоксии. В клетках BV 2 индуцированное гипоксией накопление ацетилирования гистонов также было инвертировано ингибиторами ГК2 (HK2) (фиг. 7D).
Затем были проведены количественные анализы полимеразной цепной реакции обратной транскрипции для изучения уровней мРНК нескольких провоспалительных цитокинов в присутствии или отсутствии ингибиторов ГК2 (HK2). Лонидамин (50 мкм) и 3-BrPA (10 мкм) существенно ингибировали индуцированную гипоксией экспрессию Il lb на уровне мРHK, но не оказывали влияния на экспрессию Tnfa и Il6. Для изучения эндогенного связывания ацетилированных гистонов с промотором Illb проводили иммунопреципитационный анализ хроматина. Связывание АсН3 и АсН4 с промотором Illb увеличивалось во время гипоксии, при этом его можно было уменьшить путем предварительной обработки лонидамином (фиг. 7F).
Пример 5. Блокада гексокиназы 2 предотвращала ишемическое повреждение головного мозга путем подавления опосредованного микроглией нейровоспаления в экспериментальной модели инсульта
(1) Лонидамин защищает мозг от ишемического повреждения в модели оСМА (МСАо) крысы
Материалы
Лонидамин (Selleck, S2610), здоровые СПФ (SPF) самцы крыс Spague-Dawley (SD), 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) (ТТС)) (аналитически чистый), хлоралгидрат (аналитическая степень чистоты) (приобретен в Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd.), нейлоновое моноволокно для оСМА (МСАо).
Методы
a) модель окклюзии средней мозговой артерии (оСМА (МСАо)) была получена посредством методики интралюминальной нити из правой внутренней сонной артерии. Перед операцией крысы SD голодали в течение 12 часов, но имели свободный доступ к питьевой воде. Животных анестезировали внутрибрюшинным введением 10% хлоралгидрата и помещали в положение лежа на термостатическом операционном столе при температуре 37°С для поддержания ровного дыхания. Под операционным микроскопом правая общая сонная артерия (ОСА (ССА)) была обнажена через срединный разрез и окклюзирована микрососудистым зажимом. Правая наружная сонная артерия была обнажена и перевязана на дистальном конце. Между бифуркацией правой общей сонной артерии и лигатурой передней наружной сонной артерии был завязан свободный узел. Правую внутреннюю сонную артерию рассекали и зажимали микрососудистым зажимом. Микроскопическими офтальмологическими хирургическими ножницами вырезали небольшое отверстие между двумя лигатурами, а нейлоновую нить вставляли вниз к общей сонной артерии. Затем свободный узел затягивали, и правую наружную сонную артерию перерезали под дистальной перевязкой наружной сонной артерии, но выше места введения нити. Затем микрососудистый зажим на внутренней сонной артерии удаляли, а вставной конец нити помещали в бифуркацию правой общей сонной артерии. Наружная сонная артерия была выведена наружу и вниз так, чтобы она была на одной линии с внутренней сонной артерией. Нейлоновую моноволоконную нить вводили во внутреннюю сонную артерию до тех пор, пока не ощущалось легкое сопротивление. Чтобы предотвратить кровотечение, нить затягивали. Микрососудистый зажим удаляли и разрез зашивали. Через два часа после операции вводили лонидамин или указанный контрольный растворитель в дозе 10 мг/кг, а затем нить отводили, и объем инфаркта головного мозга измеряли через 24 часа после перфузии.
b) Измерение объем инфаркта: Крыс декапитировали, мозг быстро удаляли и помещали в замороженный физиологический раствор на 10 минут.Ткани мозга замораживали и разрезали на коронарные срезы (толщиной 2 мм). Затем срезы инкубировали в 1,0% 2,3,5-трифенилтетразолий хлориде (ТТХ) при 37°С в течение 30 минут и фиксировали в 4,0% растворе параформальдегида в течение ночи. Для каждого коронарного среза ткань инфаркта (неокрашенная область) и общая двухполушарная область были очерчены на сканированном изображении с помощью Adobe Photoshop CS6. Объем инфаркта был рассчитан как отношение общей неокрашенной площади (белого цвета) к общей двухполушарной площади. Результаты
Как показано на фиг. 8А, очевидная зона инфаркта наблюдалась при помощи окрашивания ТТХ через 24 часа после 2 часов церебральной ишемии-реперфузии как у крыс оСМА (МСАо), так и в контрольной группе. Введение лонидамина значительно уменьшало размер инфаркта. 10 мг/кг лонидамина может эффективно защитить мозг крысы от ишемического повреждения (фиг. 8 В).
(2) In vivo нокдаун гексокиназы 2 эффектно защитил крыс от повреждения мозга в крысиной модели оСМА (МСАо)
Материалы
Лонидамин (Selleck, S2610), здоровые СПФ самцы крыс Spague-Dawley (SD), 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) аналитически чистый, хлоралгидрат (аналитическая степень чистоты) (приобретен в Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd.), нейлоновый шовный материал для оСМА (МСАо), рекомбинантный аденоассоциированный вирус серотипа 9 содержащий shHK2 фрагмент (rAAV-shHK2), рекомбинантный аденоассоциированный вирус серотипа 9 содержащий скремблированные контрольные фрагменты (rAAV-shNC), набор для иммуногистохимии (Abcam, ab80436), стереотаксическая система для головного мозга, инвертированный фазово-контрастный микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti Microscop), лазерный конфокальный микроскоп (Nikon Al Spectral Confocal Microscope).
Методы
а) модель окклюзии средней мозговой артерии (оСМА (МСАо)) была установлена методом интралюминальной нити из правой внутренней сонной артерии. Перед операцией крысы SD голодали в течение 12 часов, но имели свободный доступ к питьевой воде. Животных анестезировали внутрибрюшинным введением 10% хлоралгидрата и помещали в положение лежа на термостатическом операционном столе при температуре 37°С для поддержания ровного дыхания. Под операционным микроскопом правая ОСА (ССА) была экспонирована через срединный разрез и окклюзирована микрососудистым зажимом. Правая наружная сонная артерия была обнажена и перевязана на дистальном конце. Между бифуркацией правой общей сонной артерии и лигатурой передней наружной сонной артерии был завязан свободный узел. Правую внутреннюю сонную артерию рассекали и зажимали микрососудистым зажимом. Микроскопическими офтальмологическими хирургическими ножницами вырезали небольшое отверстие между двумя лигатурами, а нейлоновую нить вставляли вниз к общей сонной артерии. Затем свободный узел затягивали, и правую наружную сонную артерию перерезали под дистальной перевязкой наружной сонной артерии, но выше места введения нити. Затем микрососудистый зажим на внутренней сонной артерии удаляли, а вставной конец нити помещали в бифуркацию правой общей сонной артерии. Наружная сонная артерия была вытянута наружу и вниз так, чтобы она была на одной линии с внутренней сонной артерией. Нейлоновую моноволоконную нить вводили во внутреннюю сонную артерию до тех пор, пока не ощущалось легкое сопротивление. Чтобы предотвратить кровотечение, нить затягивали. Микрососудистый зажим удаляли, и разрез зашивали. Через два часа после операции вводили лонидамин или указанный контрольный растворитель в дозе 10 мг/кг, а затем нить отводили, и объем инфаркта головного мозга измеряли через 24 часа после перфузии.
b) Измерение объема инфаркта: Крыс декапитировали, мозг быстро удаляли и помещали в замороженный физиологический раствор на 10 минут. Ткани мозга замораживали и разрезали на коронарные срезы (толщиной 2 мм). Затем срезы инкубировали в 1,0% 2,3,5-трифенилтетразолий хлориде (ТТХ) при 37°С в течение 30 минут и фиксировали в 4,0% растворе параформальдегида в течение ночи. Для каждого коронарного среза ткань инфаркта (неокрашенная область) и общая двухполушарная область были очерчены на сканированном изображении с помощью Adobe Photoshop CS6. Объем инфаркта был рассчитан как отношение общей неокрашенной площади (белого цвета) к общей двухполушарной площади.
c) Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) продуцировали в клетках 293Т. При помощи метода количественной ПЦР (qPCR) было определено, что геномные титры вирусов варьировались от 3,2×1012 до 3,5×1012 В.Г./мл. Для построения векторов AAV2/9 использовались следующие последовательности, нацеленные на ГК2 (HK2): 5'-GCGCAACATTCTCATCGATTT-3' и 5' - AAATCGATGAGAATGTTGCGC-3'. Контрольная последовательность кшРНК представляла собой 5' -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'. В общей сложности 2 мкл вирусных векторов вводили с одной стороны в стриатум анестезированных крыс, закрепленных в стереотаксической рамке.
Координаты места инъекции: 1,0 мм рострально к брегме, 3,0 мм латерально к срединной линии и 4,5 мм вентрально к твердой мозговой оболочке, зубную планку устанавливали на ноль. Микроинъекции проводили со скоростью 0,2 мкл/мин. После инъекции микрошприцы оставались in situ еще в течение 5 минут, прежде чем их удаляли.
d) Тканевая иммунофлуоресценция использовалась для выявления распределения вируса в головном мозге (уЗФБ (eGFP)) и экспрессии гексокиназы 2 и Iba-1 (другого молекулярного маркера активации микроглии): после ишемии в течение 2 часов и реперфузии в течение 24 часов интактную мозговую ткань удаляли под наркозом и погружали в парафиновую оболочку для получения срезов. Толщина срезов головного мозга составляла примерно 4 мкм. Срезы мозга депарафинизировали, гидратировали и подвергали извлечению антигена. Образцы инкубировали с указанными антителами при 4°С в течение ночи. На следующий день добавляли флуоресцентно меченое вторичное антитело и образцы инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После инкубации добавляли рабочий раствор DAPI для окрашивания ядер в течение 10 минут. В конце обработки образцы промывали три раза ФСБТ (фосфатно-солевой буфер с твином) и визуализировали с помощью лазерного конфокального микроскопа.
e) Иммуногистохимическое определение экспрессии IL-1β: После ишемии в течение 2 часов и реперфузии в течение 24 часов интактную мозговую ткань удаляли под наркозом и погружали в парафиновую оболочку для получения срезов. Толщина срезов головного мозга составляла примерно 4 мкм. Срезы мозга депарафинизировали, гидратировали и подвергали извлечению антигена. Образцы инкубировали с указанными первичными антителами в течение ночи при 4°С. На следующий день образцы промывали в фосфатно-буферном физиологическом растворе, подвергали последовательной инкубации в комплементе и конъюгате пероксидазы хрена (HRP). После инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре образцы инкубировали с проявочным раствором DAB в течение 1 минуты. Наконец, образцы окрашивали гематоксилином и визуализировали с помощью микроскопа Nikon.
Результаты
Вес животных контролировали постоянно, и статистическая значимость не была обнаружена через 20 дней после инъекций rAAV9-shHK2 и rAAV9-shNC. (Вес животных в группах AAV2/9-shNC и AAV2/9-shHK2 составил 273,2±6,9 г и 269,3±5,0 г соответственно). Перед операцией собирали цельные ткани головного мозга крыс для выявления распространения AAVs с использованием технологии оптической визуализации in vivo, основанной на экспрессии уЗФБ (eGFP) (фиг. 9А). Окрашивание срезов головного мозга показало, что ГК2 (HK2) значительно регулируется операцией оСМА (МСАо). Изза рассеянного распределения AAVs, однако, позитивная регуляция ГК2 (HK2) операцией оСМА (МСАо) эффективно ингибировалась в группе rAAV9-shHK2, тогда как инъекция rAAV9-shNC не оказывала никакого значительного влияния на ингибирование ГК2 (HK2) (фиг. 9В). Подобно ингибированию ГК2 (HK2), окрашивание ТТХ показало, что размеры инфаркта значительно уменьшились у крыс с нокдауном ГК2 (HK2) по сравнению с аналогичными им, которым вводили AAVs, несущие контрольную кшРНК (фиг. 9С-0).
Как показано на фиг. 9Е, микроглия в группе rAAV9-shNC имела морфологическую характеристику активированной микроглии, с увеличением тел клеток и ретракцией проекций, тогда как их активированная морфология была заметно подавлена в группе обработки shHK2. Нейропротекторный эффект нокдауна ГК2 (HK2) был связан с выраженным ингибированием экспрессии Iba-1 (Рис. 9Е). Как показано на фиг. 9, иммуногистохимическое окрашивание Il-1β в области кортекса и стриатума показало, что нейропротекция, опосредованная нокдауном эндогенной гексокиназы 2, связана со снижением экспрессии Il-1β; в контрольной группе Il-1β распределен в кортексе и стриатуме, тогда как в группе rAAV9-shHK2 экспрессия Ik-1β была значительно ингибирована.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ГУАНЧЖОУ СЕЛЛПРОТЕК ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД (GUANGZHOU CELLPROTEK PHARMACEUTICAL CO., LTD)
<120> СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИНГИБИТОРЫ ГЕКСОКИНАЗЫ-2 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ОСТРОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ
<130> 191414РУ
<160> 23
<170> Патент версия 3.5
<210> 1
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> прямые праймеры HK1
<400> 1
gtaggggtac gcttaggtgg 20
<210> 2
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры HK1
<400> 2
acccaggagt ccataaagcc 20
<210> 3
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> прямые праймеры HK2
<400> 3
agcatcgtgg gagaaagctc 20
<210> 4
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры HK2
<400> 4
tccatttgta ctccgtggct 20
<210> 5
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> прямые праймеры HK3
<400> 5
gctccgttga gagcagattt 20
<210> 6
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры HK3
<400> 6
ttgctgcaag cattccagtt 20
<210> 7
<211> 21
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> прямые праймеры PFKM
<400> 7
gtttggaagc ctctcctcct с 21
<210> 8
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры PFKM
<400> 8
gacggcagca ttcatacctt 20
<210> 9
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> прямые праймеры PKKFL
<400> 9
cgcaaggtat gaatgctgct 20
<210> 10
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры PFKL
<400> 10
cgatggtcaa gtgtgcgtag 20
<210> 11
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
<223> прямые праймеры PGK1
<400> 11
cgagcctcac tgtccaaact 20
<210> 12
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры PGK1
<400> 12
gtctgcaact ttagcgcctc 20
<210> 13
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> прямые праймеры PKM1
<400> 13
cgtccgcagg tttgatgaga 20
<210> 14
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры PKM1
<400> 14
ttcaaacagc agacggtgga 20
<210> 15
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> прямые праймеры PKM2
<400> 15
ggctcctatc attgccgtga 20
<210> 16
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры PKM2
<400> 16
aaggtacagg cactacacgc 20
<210> 17
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> прямые праймеры Actb
<400> 17
tgagctgcgt tttacaccct 20
<210> 18
<211> 20
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> обратные праймеры Actb
<400> 18
tttgggggat gtttgctcca 20
<210> 19
<211> 21
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> промоторный праймер Il1b (прямой)
<400> 19
aggtcaaagg tttggaagca g 21
<210> 20
<211> 25
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
< 223> промоторный праймер Il1b (обратный)
<400> 20
atggaagtct gtctgctcag tattg 25
<210> 21
<211> 21
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
<223> последовательности, нацеленные на HK2
<400> 21
gcgcaacatt ctcatcgatt t 21
<210> 22
<211> 21
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
<223> последовательности, нацеленные на HK2
<400> 22
aaatcgatga gaatgttgcg c 21
<210> 23
<211> 19
< 212> ДНК
< 213> Искусственная Последовательность
<220>
<223 > контрольная последовательность shРНК
<400> 23
ttctccgaac gtgtcacgt 19
<---
Claims (9)
1. Применение специфического ингибитора гексокиназы-2 для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения острого повреждения центральной нервной системы, опосредованного активацией микроглии.
2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что специфическим ингибитором гексокиназы-2 является антитело к гексокиназе 2 или его фрагмент, или киРНК, кшРНК, микроРНК, или их вариант, который интерферирует с мРНК гексокиназы-2.
3. Применение по п. 2, отличающееся тем, что антитело к гексокиназе 2 кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащейся в векторе.
4. Применение по п. 2, отличающееся тем, что фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab', (Fab')2 или Fv.
5. Применение по п. 2, отличающееся тем, что киРНК, кшРНК, микроРНК или их вариант содержится в векторе.
6. Применение по п. 1, отличающееся тем, что острое повреждение центральной нервной системы, опосредованное активацией микроглии, представляет собой повреждение головного/спинного мозга, вызванное любой причиной из группы, состоящей из острой травмы позвоночника, травмы головного мозга, повреждения сетчатки, гипоксического повреждения головного мозга, острого ишемического повреждения головного мозга, ишемического инсульта, гипоксического инсульта, неонатальной гипоксической ишемической энцефалопатии, токсической энцефалопатии, острого инфаркта головного мозга, лакунарного инфаркта, транзиторной ишемической атаки, тяжелой черепно-мозговой травмы, цереброспинальной хирургии и лучевой терапии головного/спинного мозга.
7. Применение по п. 1, отличающееся тем, что специфическим ингибитором гексокиназы-2 является лонидамин.
8. Применение композиции, содержащей специфический ингибитор гексокиназы-2, для изготовления лекарственного средства для профилактики и лечения острого повреждения центральной нервной системы, опосредованного активацией микроглии.
9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что композиция дополнительно содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из 2-дезоксиглюкозы, бромпировиноградной кислоты, глюкозо-6-фосфата, Иматиниба, 5-тио-глюкозы и метилжасмоната.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710099324.9A CN106860867A (zh) | 2017-02-23 | 2017-02-23 | 己糖激酶2特异性抑制剂在急性中枢神经系统损伤疾病中的应用 |
CN201710099324.9 | 2017-02-23 | ||
PCT/CN2018/075401 WO2018153244A1 (zh) | 2017-02-23 | 2018-02-06 | 己糖激酶2特异性抑制剂在急性中枢神经系统损伤疾病中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2736499C1 true RU2736499C1 (ru) | 2020-11-17 |
Family
ID=59168385
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019128326A RU2736499C1 (ru) | 2017-02-23 | 2018-02-06 | Специфические ингибиторы гексокиназы-2 для применения при остром повреждении центральной нервной системы |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11584802B2 (ru) |
EP (1) | EP3586873A4 (ru) |
JP (2) | JP6932197B2 (ru) |
KR (1) | KR102359994B1 (ru) |
CN (1) | CN106860867A (ru) |
AU (2) | AU2018223394B2 (ru) |
BR (1) | BR112019017661A2 (ru) |
CA (1) | CA3053866C (ru) |
IL (1) | IL268753B1 (ru) |
NZ (1) | NZ756855A (ru) |
RU (1) | RU2736499C1 (ru) |
SG (2) | SG11201907581VA (ru) |
TW (1) | TWI761444B (ru) |
WO (1) | WO2018153244A1 (ru) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106860867A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-06-20 | 中山大学 | 己糖激酶2特异性抑制剂在急性中枢神经系统损伤疾病中的应用 |
CN108029638B (zh) * | 2017-12-04 | 2020-04-21 | 四川省人民医院 | 一种视网膜色素变性疾病动物模型的构建方法及应用 |
JP6997643B2 (ja) * | 2018-01-31 | 2022-01-17 | Toyo Tire株式会社 | タイヤ用ゴム組成物及び空気入りタイヤ |
JP6997644B2 (ja) * | 2018-01-31 | 2022-01-17 | Toyo Tire株式会社 | タイヤ用ゴム組成物及び空気入りタイヤ |
JP6997645B2 (ja) * | 2018-01-31 | 2022-01-17 | Toyo Tire株式会社 | タイヤ用ゴム組成物及び空気入りタイヤ |
CN111358784B (zh) * | 2020-02-21 | 2021-03-30 | 厦门大学 | 己糖激酶抑制剂在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途 |
CN113373209B (zh) * | 2020-03-09 | 2023-03-28 | 南京腾辰生物科技有限公司 | 血液骨架蛋白基因甲基化作为脑卒中早期诊断的潜在标志物 |
CN113567675B (zh) * | 2020-04-28 | 2023-09-22 | 苏州浚惠生物科技有限公司 | 用于肿瘤的己糖激酶2抑制剂液体活检伴随诊断和试剂盒 |
CN114805588B (zh) * | 2022-06-11 | 2023-07-04 | 北京大学 | 一种己糖激酶2(hk2)乙酰化位点特异性抗体及其制备方法和用途 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100233156A1 (en) * | 2009-03-09 | 2010-09-16 | Georgetown University | Treating Central Nervous System Injury with Beta and Gamma Secretase Inhibitors |
RU2010116245A (ru) * | 2007-09-24 | 2011-11-10 | Ноксон Фарма Аг (De) | НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ C5a |
WO2016126618A1 (en) * | 2015-02-02 | 2016-08-11 | Mei Pharma, Inc. | Combination therapies |
WO2016196890A1 (en) * | 2015-06-04 | 2016-12-08 | Vtv Therapeutics Llc | Inhibitors of hexokinase and methods of use thereof |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106344573A (zh) * | 2016-08-12 | 2017-01-25 | 上海交通大学 | Adjudin在制备抑制胶质瘢痕形成药物中的应用 |
CN106860867A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-06-20 | 中山大学 | 己糖激酶2特异性抑制剂在急性中枢神经系统损伤疾病中的应用 |
-
2017
- 2017-02-23 CN CN201710099324.9A patent/CN106860867A/zh active Pending
-
2018
- 2018-02-06 IL IL268753A patent/IL268753B1/en unknown
- 2018-02-06 KR KR1020197027839A patent/KR102359994B1/ko active IP Right Grant
- 2018-02-06 EP EP18757439.7A patent/EP3586873A4/en active Pending
- 2018-02-06 SG SG11201907581VA patent/SG11201907581VA/en unknown
- 2018-02-06 JP JP2019546304A patent/JP6932197B2/ja active Active
- 2018-02-06 RU RU2019128326A patent/RU2736499C1/ru active
- 2018-02-06 US US16/488,011 patent/US11584802B2/en active Active
- 2018-02-06 TW TW107104211A patent/TWI761444B/zh active
- 2018-02-06 NZ NZ756855A patent/NZ756855A/en unknown
- 2018-02-06 SG SG10202103838PA patent/SG10202103838PA/en unknown
- 2018-02-06 CA CA3053866A patent/CA3053866C/en active Active
- 2018-02-06 AU AU2018223394A patent/AU2018223394B2/en active Active
- 2018-02-06 BR BR112019017661-6A patent/BR112019017661A2/pt active Search and Examination
- 2018-02-06 WO PCT/CN2018/075401 patent/WO2018153244A1/zh unknown
-
2020
- 2020-04-16 AU AU2020202576A patent/AU2020202576B2/en active Active
-
2021
- 2021-08-17 JP JP2021132508A patent/JP2021183629A/ja active Pending
-
2023
- 2023-01-11 US US18/095,660 patent/US20230167195A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2010116245A (ru) * | 2007-09-24 | 2011-11-10 | Ноксон Фарма Аг (De) | НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ C5a |
US20100233156A1 (en) * | 2009-03-09 | 2010-09-16 | Georgetown University | Treating Central Nervous System Injury with Beta and Gamma Secretase Inhibitors |
WO2016126618A1 (en) * | 2015-02-02 | 2016-08-11 | Mei Pharma, Inc. | Combination therapies |
WO2016196890A1 (en) * | 2015-06-04 | 2016-12-08 | Vtv Therapeutics Llc | Inhibitors of hexokinase and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Матвеева Т.В. и др. Острые проявления поражений нервной системы в практике врача-терапевта // Вестник современной клинической медицины, Т.7, 2014, с. 121-123. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20230167195A1 (en) | 2023-06-01 |
EP3586873A1 (en) | 2020-01-01 |
AU2018223394B2 (en) | 2020-02-20 |
SG10202103838PA (en) | 2021-05-28 |
US11584802B2 (en) | 2023-02-21 |
KR20190121353A (ko) | 2019-10-25 |
JP2021183629A (ja) | 2021-12-02 |
JP6932197B2 (ja) | 2021-09-08 |
AU2018223394A1 (en) | 2019-09-19 |
IL268753A (en) | 2019-10-31 |
CA3053866A1 (en) | 2018-08-30 |
TWI761444B (zh) | 2022-04-21 |
KR102359994B1 (ko) | 2022-02-07 |
SG11201907581VA (en) | 2019-09-27 |
JP2020512304A (ja) | 2020-04-23 |
EP3586873A4 (en) | 2020-12-30 |
BR112019017661A2 (pt) | 2020-03-31 |
AU2020202576B2 (en) | 2021-11-18 |
TW201831203A (zh) | 2018-09-01 |
WO2018153244A1 (zh) | 2018-08-30 |
US20200392250A1 (en) | 2020-12-17 |
IL268753B1 (en) | 2024-03-01 |
CN106860867A (zh) | 2017-06-20 |
CA3053866C (en) | 2024-04-23 |
AU2020202576A1 (en) | 2020-05-07 |
NZ756855A (en) | 2021-12-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2736499C1 (ru) | Специфические ингибиторы гексокиназы-2 для применения при остром повреждении центральной нервной системы | |
Feng et al. | IL-17 induces myocardial fibrosis and enhances RANKL/OPG and MMP/TIMP signaling in isoproterenol-induced heart failure | |
US20150071941A1 (en) | Treatment of ischemic retinopathies | |
US20120328629A1 (en) | Therapeutic Applications Targeting SARM1 | |
US20050042225A1 (en) | Compositions and methods for restoring sensitivity of tumor cells to antitumor therapy and inducing apoptosis | |
KR20190013926A (ko) | 폐혈관 질환 치료용 조성물 및 방법 | |
JP2018065814A (ja) | Herv−wエンベロープタンパク質発現関連疾患において再ミエリン化遮断を治療するための化合物 | |
US20230301967A1 (en) | Methods and compositions for the treatment of retinopathy and other ocular diseases | |
WO2019037222A1 (zh) | Gpr31抑制剂在制药中的应用 | |
Yang et al. | Sevoflurane offers neuroprotection in a cerebral ischemia/reperfusion injury rat model through the E2F1/EZH2/TIMP2 regulatory axis | |
US20220260575A1 (en) | Methods for the diagnosis and treatment of gastrointestinal stromal tumors | |
KR101384360B1 (ko) | Scf 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물 | |
JP2013530934A (ja) | 結合組織成長因子を用いた薬学的組成物 | |
WO2017126655A1 (ja) | 疼痛の予防または治療用医薬組成物およびRobo4を用いる疼痛抑制物質のスクリーニング方法 | |
JP6653054B2 (ja) | Tim−3をターゲットとする脳損傷疾患治療用組成物及びこのスクリーニング方法 |