CN114805588B - 一种己糖激酶2（hk2）乙酰化位点特异性抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基础医学领域，具体涉及一种己糖激酶2(HK2)K451乙酰化位点特异性抗体及其制备方法和用途。本发明人首次提出了HK2的K451位点乙酰化修饰与癌症(特别是结直肠癌)转移和预后密切相关，并且基于这一发现，开发出了相应的己糖激酶2(HK2)K451乙酰化位点特异性诊断抗体，为临床上判断癌症的转移和预后提供更多选择。

Description

一种己糖激酶2(HK2)乙酰化位点特异性抗体及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于基础医学领域，具体涉及一种己糖激酶2(HK2)K451乙酰化位点特异性抗体及其制备方法和用途。
背景技术
己糖激酶2(Hexokinase 2，HK2)作为有氧糖酵解途径的第一个关键酶，在多种肿瘤细胞中高表达，且受到多种途径调控。HK2含有917个氨基酸，分子量为102KD，包含N端和C端两个结构域，之间通过一小段螺旋结构helix-α13连接。其N端和C端的两个结构域均具有催化活性。但HK2的酶活性取决于C端结构域，N端结构域则对HK2的活性起调节作用。N端还有一个含15个氨基酸残基的疏水结构域，即线粒体结合模体，使HK2能够与线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道蛋白相结合。研究发现HK2在肿瘤细胞中高表达，与线粒体的结合增强，活性也显著增高，并且伴随有氧条件下糖酵解的增强，即增强的“Warburg效应”。许多研究者认为，HK2在肿瘤细胞中表达及活性的上调是肿瘤细胞有氧糖酵解的主要原因，与多种类型的肿瘤生长，存活和转移都密切相关，因此是肿瘤诊断和治疗的理想靶点。
在肿瘤细胞中，HK2的表达和功能受到多种途径调控，包括遗传，表观遗传，转录/转录后和翻译/翻译后等。例如，有研究表明，在肝癌中，己糖激酶活性增强与基因扩增相关。HK2启动子在正常肝细胞中被甲基化，而去甲基化药物会增加HK2的表达，这表明表观遗传修饰(甲基化/去甲基化)参与调控肝细胞转化过程。在转录水平，转录因子HIF-1在缺氧等不利的代谢条件下诱导HK2的表达并促进其活性，从而促进有氧糖酵解。在翻译后修饰水平，AKT磷酸化HK2的第473位苏氨酸，使HK2定位于线粒体，从而避免产物抑制，促进HK2的酶活性。c-Src磷酸化HK2的第686位酪氨酸，从而增加HK2催化活性和糖酵解。赖氨酸乙酰化修饰是调节细胞代谢的重要机制，糖酵解途径中的许多酶都受乙酰化作用的调控，如M2型丙酮酸激酶(PKM2)，乳酸脱氢酶A(LDHA)，磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，磷酸甘油酸变位酶(PGAM)，二磷酸果糖酶(ALDOA)，烯醇化酶(ENO1)和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)等，然而至今未见关于HK2乙酰化修饰及其相应生物学功能的报道。
基于以上的研究背景和前期的研究成果，本发明人首次发现了HK2第451位赖氨酸的乙酰化修饰与癌症的转移和预后密切相关。这些研究将为肿瘤研究以及临床上对于癌症的预后判断提供理论基础和新线索。
发明内容
为了解决临床上能够有效预测癌症预后的诊断工具不足的问题，本发明人首次提出了HK2的K451位点乙酰化修饰与癌症(特别是结直肠癌)的转移和预后密切相关，并且基于这一发现，开发出了相应的己糖激酶2(HK2)K451乙酰化位点特异性诊断抗体。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
在第一个方面中，本发明提供了一种用于检测己糖激酶2(HK2)的K451位点乙酰化的特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)人工合成RSEDGSGKGAAMVT序列HK2-K451多肽，并将K位点进行乙酰化处理；
(2)利用步骤(1)合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中抗体效价，并对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤(1)中，所述K位点的乙酰化处理使用的乙酰化酶为乙酰转移酶P300/CBP。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤(2)中，免疫兔的具体过程为：初次免疫，每只兔用600μg HK2-K451多肽加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射(优选，6点)，分别于初次免疫28天后、42天后、56天后进行三次加强免疫，每只兔用400μgHK2-K451多肽加等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射(优选，4点)；第三次加强免疫后取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，待抗体效价达到指标后，在检测效价后第2天以心脏穿刺方法采集全血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤(2)中，ELISA测定血清中抗体效价采用间接ELISA，对抗体进行纯化处理使用的抗原亲和柱为CnBr-activated Sepharose 4B。
在第二个方面中，本发明提供了一种用于检测HK2的K451位点乙酰化的特异性抗体，其特征在于：所述抗体由上述第一个方面所述的制备方法制备得到，所述抗体针对HK2-K451多肽检测灵敏度为3.3ng/mL。
在第三个方面中，本发明提供了上述第二个方面所述特异性抗体在制备用于检测HK2的K451位点乙酰化的试剂中的用途，所述试剂用于HK2的K451位点乙酰化的体外或体内检测。
在第四个方面中，本发明提供了上述第二个方面所述特异性抗体在制备用于判断肿瘤转移和预后的诊断试剂中的用途。
作为可选的方式，在上述用途中，所述癌症选自食管癌、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌或结直肠癌。
作为可选的方式，在上述用途中，所述癌症为结直肠癌。
作为可选的方式，在上述用途中，HK2的K451位点低水平乙酰化提示所述癌症的转移和不良预后。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明人首次提出了HK2的K451位点乙酰化修饰与癌症(特别是结直肠癌)的转移和预后密切相关，并且基于这一发现，开发出了相应的己糖激酶2(HK2)K451乙酰化位点特异性诊断抗体，为临床上判断癌症的转移和预后提供了更多选择。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：HK2能够发生乙酰化。(a)HCT116细胞中转染Flag-HK2，转染24小时后，1μMTSA处理12小时，5mM NAM处理16小时，提取NP40可溶性蛋白，用Flag-M2抗体做免疫沉淀实验，Western blotting检测其乙酰化水平。(b)未转染的HCT116细胞，细胞传代24小时后，1μM TSA处理12小时，5mM NAM处理16小时，提取NP40可溶性蛋白，用HK2抗体做免疫沉淀实验，Western blotting检测其乙酰化水平。
图2：HK2乙酰化位点的确定。(a)在HCT116细胞中转染Flag-HK2质粒，转染24小时后加入5mM NAM处理16小时，然后收集细胞提取NP40可溶性蛋白，再用Flag-M2珠子进行免疫共沉淀及SDS-PAGE实验。将FLAGHK2位置处取出用胰酶消化，高场静电场轨道阱质谱仪对乙酰化位点进行分析。图中展示的HK2赖氨酸乙酰化修饰的二级质谱图。(b)HCT116细胞中分别转染Flag-HK2-WT和Flag-HK2-K451R质粒，转染24小时后，5mM NAM处理16小时，提取NP40可溶性蛋白，用Flag-M2抗体做免疫沉淀实验，Western blotting检测其乙酰化水平。(c)在HCT116细胞中分别共同转染空载，GFPSIRT7和Flag-HK2-WT、Flag-HK2-K451R质粒，转染48小时后收集细胞，提取NP40可溶性蛋白，用Flag-M2抗体做免疫沉淀实验，Westernblotting检测其乙酰化水平。(d)HK2在不同物种中的赖氨酸451位点周围氨基酸序列及其保守性。
图3：将HK2乙酰化所使用的乙酰转移酶的筛选。(a)将HA-P300，HA-CBP，Flag-PCAF，Flag-TIP60，Myc-MOF与Flag-HK2共转入HEK293T细胞中，60小时后收集细胞，提取NP40可溶性蛋白，在蛋白裂解液中加入Flag-M2珠子来进行免疫沉淀实验，Westernblotting检测HK2乙酰化水平。(b-c)在HCT116细胞中，分别转染P300 siRNA和CBP siRNA，72小时后提取NP40可溶性蛋白，用HK2抗体进行免疫沉淀实验，Western blotting检测HK2乙酰化水平。(d-e)在HEK293T细胞中分别转染HA-P300和HA-CBP，60小时后收集细胞，用琼脂糖珠将P300和CBP吸附出来作为酶，从细菌内中纯化出来的的His-HK2作为底物，进行体外乙酰化催化实验，Western blotting检测HK2乙酰化水平。
图4：SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度。M.蛋白Marker(从上往下依次：
170KD/130KD/95KD/72KD/55KD/43KD/34KD/26KD/17KD)；1.JXR4581抗原亲和纯化抗体。
图5：AcK451-HK2抗体的特异性的验证。(a)斑点杂交实验检测AcK451-HK2抗体的特异性。有451位乙酰化修饰的肽段(445-462aa:SEDGSG-K(AcK)-GAAMVTAVAYR)或没有修饰的肽段(445-462aa:SEDGSG-K-GAAMVTAVAYR)以剂量梯度点到硝酸纤维素膜上，封闭后用AcK451-HK2抗体进行检测。(b)HCT116细胞转染Flag-HK2-WT或者Flag-HK2-K451R质粒48小时后，收集细胞提取NP40可溶性蛋白，用Flag-M2抗体做免疫沉淀实验，AcK451-HK2抗体检测HK2乙酰化水平。
图6：HK2的K451位点乙酰化修饰与结直肠癌及其预后的关系。(a)应用结直肠癌组织芯片技术对结直肠癌组织及邻近组织进行HK2-K451乙酰化的免疫组化染色。图示分别为正常结直肠上皮，肠上皮发育不良，结直肠癌的染色结果。(b)使用免疫组化方法分析HK2-K451乙酰化在结直肠癌组织和邻近正常组织中的水平。(c)HK2-K451低乙酰化和高乙酰化结直肠癌患者总生存率的Kaplan-Meier生存曲线。(d)提取NP40可溶性蛋白，Westernblotting检测正常结直肠细胞系和不同Duke期的结直肠癌细胞系的HK2蛋白及HK2-K451乙酰化水平。其中NCM460为人正常结肠细胞，其他为结直肠癌细胞系。SW480为Duke A级，DLD1，HCT116+，LoVo为Duke C级细胞系。SW480为原发性结肠癌，SW620为转移性结肠癌细胞系。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1：考察HK2能够发生乙酰化
首先验证HK2是否能发生乙酰化修饰。将Flag-HK2质粒转染进HCT116细胞，转染24小时后用去乙酰基转移酶抑制剂TSA(第一、二、四类HDAC抑制剂)处理12小时，NAM(第三类HDAC Sirtuins的抑制剂)处理16小时。之后收集细胞提取NP40可溶性蛋白，用Flag-M2珠子进行免疫沉淀实验，泛乙酰化抗体检测HK2的乙酰化水平。
结果显示：外源转入的Flag-HK2在NAM处理后乙酰化水平显著增加，而TSA处理则没有如此明显的作用(图1a)。同样，在HCT116细胞中做相同处理，再用HK2抗体进行免疫沉淀实验，泛乙酰化抗体检测内源HK2蛋白的乙酰化，得到了相同的结果(图1b)。
这些实验证实HK2能够发生乙酰化修饰，并且主要受到第三类去乙酰化酶SIRT的调控。
实施例2：确定HK2发生乙酰化的位点
将转染进HCT116细胞并用NAM处理后的Flag-HK2用琼脂糖珠进行亲和富集，被富集的肽段再进行联合质谱分析发生乙酰化的位点。在本发明人的实验条件下，只检测出451位的赖氨酸是其唯一能发生乙酰化的位点(图2a)。
为了进一步确认451位是NAM作用下HK2唯一能发生乙酰化的位点，把HK2的451位点的赖氨酸(K)突变成精氨酸(R)，随后验证HK2 K451位突变后蛋白的乙酰化状态。实验结果表明：K451突变后，HK2乙酰化水平明显降低，并且NAM处理和过表达SIRT7都没有改变HK2K451R突变质粒的乙酰化水平(图2b-c)，由此可见HK2的保守位点K451(图2d)是HK2的主要乙酰化位点。
实施例3：筛选将HK2乙酰化的乙酰转移酶
乙酰化修饰是动态的修饰过程，为了确定HK2的乙酰转移酶，选取几种常见的乙酰转移酶，包括P300，CBP，PCAF，TIP60，MOF与HK2共转入HEK293T细胞中，60小时后收集细胞，检测细胞中HK2蛋白乙酰化水平的变化。
结果表明：P300和CBP均能够显著提高外源HK2的乙酰化水平(图3a)。接着在HCT116细胞中用特异性P300和CBP的siRNA分别敲低内源性P300和CBP蛋白的表达，结果显示敲低P300和CBP后，HK2的乙酰化水平都会明显降低(图3b-c)。
为了进一步证实P300和CBP能够直接乙酰化HK2，在HEK293T细胞中分别转染HA-P300和HA-CBP，60小时后收集细胞，将P300和CBP免疫沉淀出来，与从细菌内中纯化出来的的His-HK2作为底物进行体外乙酰化实验。如图3d-e所示，在乙酰辅酶A(Ac-CoA)存在的情况下，P300和CBP都能够乙酰化HK2，这说明P300和CBP能够在体外直接乙酰化HK2。上述结果都表明P300和CBP是HK2的乙酰转移酶。
实施例4：HK2 K451乙酰化位点特异性抗体的制备
该部分实验委托嘉暄生物进行，如有需要可以提供完整的实验报告，在本实验中所使用的动物为新西兰大耳白兔(体重约2kg)，动物编号JXR4581和JXR4582，实验动物来自北京市海淀区兴隆实验动物养殖场。
4.1抗体的制备方法
用于检测HK2的K451位点乙酰化的特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)人工合成RSEDGSGKGAAMVT序列HK2-K451多肽，并将K位点进行乙酰化处理；
(2)利用步骤(1)合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中抗体效价，并对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。
在上述制备方法中，在步骤(1)中，所述K位点的乙酰化处理使用的乙酰化酶为乙酰转移酶P300/CBP；
在步骤(2)中，免疫兔的具体过程为：初次免疫，每只兔用600μg HK2-K451多肽加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射(优选，6点)，分别于初次免疫28天后、42天后、56天后进行三次加强免疫，每只兔用400μg HK2-K451多肽加等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射(优选，4点)；第三次加强免疫后取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，待抗体效价达到指标后，在检测效价后第2天以心脏穿刺方法采集全血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清；
在步骤(2)中，ELISA测定血清中抗体效价采用间接ELISA，对抗体进行纯化处理使用的抗原亲和柱为CnBr-activated Sepharose4B。
4.2实验结果
4.2.1间接ELISA检测血清效价
表1：间接ELISA检测血清效价(OD值)结果
Figure BDA0003689642320000111
检测结果(判断标准OD阳/OD阴>2.1,且OD值>0.1)
编号为JXR4581实验动物的抗血清效价1：243000；编号为JXR4582实验动物的抗血清效价1：81000。
4.2.2 SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度
实验结果如图4所示。
4.2.3间接ELISA法检测纯化后抗体效价
表2：间接ELISA法检测纯化后抗体效价结果
Figure BDA0003689642320000112
实验结果表明，本发明抗体针对乙酰化多肽检测灵敏度大约3.3ng/mL，针对非乙酰化多肽灵敏度大约111ng/mL，可见本发明抗体具有较高的特异性。
实施例5：AcK451-HK2抗体的特异性验证
使用实施例4制备的AcK451-HK2抗体，利用斑点杂交的实验检测了定制抗体的特异性以及效率，结果显示定制的451位乙酰化的抗体具有较好的特异性及效率(图5a)。并且当转入HK2-K451R后用定制的抗体去检测，其乙酰化水平明显降低(图5b)。
实施例6：HK2的K451位点乙酰化修饰与癌症转移及其预后的关系
在本实施例中病理切片是从上海芯超生物技术有限公司购买的结直肠癌组织芯片，病例资料齐全：包括档案号、姓名、性别、年龄、病理诊断(类型及分化程度)、TNM分级和生存期等。
利用本发明制备得到的己糖激酶2(HK2)的K451位点乙酰化的特异性抗体，采用常规免疫组织化学法检测HK2的K451位点乙酰化水平，以中位数分界Kaplan-Meier分析高表达与低表达组之间的生存差异。
结果如图6显示，实验结果表明低水平K451Ace-HK2预示结直肠癌的转移和不良结直肠癌的预后。具体结果如下所示：
图6a中,应用免疫组化的方法能够检测结直肠组织芯片中正常组织和不同分化程度的肿瘤组织中HK2的K451位点乙酰化水平，即本发明制备得到的己糖激酶2(HK2)的K451位点乙酰化的特异性抗体具有有效性和特异性。最上面最左边是正常的结肠组织，第二个是腺瘤，第三个是结肠癌，三个加号的表达强阳性，下一排最左边是结肠癌，两个加号表达中等，中间是一个加号的比较弱，右边就是非常弱。从图中可见，K451Ace-HK2在正常结肠组织中几乎无表达，但在腺瘤和结直肠癌标本中可以检测到不同水平的K451Ace-HK2，随着分化程度的升高，乙酰化增加，提示K451Ace-HK2与结直肠癌有相关性。
图6b中，根据图6a的IHC结果进行半定量统计分析，比较正常组织和各组结直肠癌病例之间K451Ace-HK2的表达差异，并进行T检验，发现肿瘤组织中K451Ace-HK2水平高于正常组织，提示K451Ace-HK2与结直肠癌变有相关性。
图6c中，以中位数分界Kaplan-Meier分析K451Ace-HK2高表达与低表达组之间的生存差异，发现K451Ace-HK2低水平与患者的不良预后相关。
图6d中，提取NP40可溶性蛋白，使用HK2和AcK451-HK2抗体Western blotting检测正常结直肠细胞系和不同Duke期的结直肠癌细胞系的HK2蛋白及HK2-K451乙酰化水平。其中NCM460为人正常结肠细胞，其他为结直肠癌细胞系。SW480为Duke A级，DLD1，HCT116+，LoVo为Duke C级细胞系。从Duke A-C级，结直肠癌恶性升高。SW480为原发性结肠癌，SW620为转移性结肠癌细胞系。如图6d左图所示，HK2-K451乙酰化水平在人正常结肠细胞NCM460中很低，而在结直肠癌细胞系SW480，HCT116+，LoVo中显著升高，说明HK2-K451乙酰化水平在结直肠癌细胞系升高。如图6d右图所示，与SW480相比，SW620细胞系HK2-K451乙酰化水平明显下降，说明在转移性结肠癌细胞系中HK2-K451乙酰化水平下降。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种用于检测己糖激酶2(HK2)的K451位点乙酰化的特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)人工合成RSEDGSGKGAAMVT序列HK2-K451多肽，并将K位点进行乙酰化处理，所述K位点的乙酰化处理使用的乙酰化酶为乙酰转移酶P300/CBP；
(2)利用步骤(1)合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中抗体效价，并对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，免疫兔的具体过程为：初次免疫，每只兔用600μgHK2-K451多肽加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下6点注射，分别于初次免疫28天后、42天后、56天后进行三次加强免疫，每只兔用400μgHK2-K451多肽加等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下4点注射；第三次加强免疫后取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，待抗体效价达到指标后，在检测效价后第2天以心脏穿刺方法采集全血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，ELISA测定血清中抗体效价采用间接ELISA，对抗体进行纯化处理使用的抗原亲和柱为CnBr-activatedSepharose4B。
4.一种用于检测HK2的K451位点乙酰化的特异性多克隆抗体，其特征在于：所述抗体由权利要求1至3中任一项所述的制备方法制备得到，所述抗体针对HK2-K451多肽检测灵敏度为3.3ng/mL。
5.权利要求4所述特异性多克隆抗体在制备用于检测HK2的K451位点乙酰化的试剂中的用途，其特征在于：所述试剂用于HK2的K451位点乙酰化的体外或体内检测。
6.权利要求4所述特异性多克隆抗体在制备用于判断结直肠癌转移和预后的诊断试剂中的用途，其特征在于：HK2的K451位点低水平乙酰化提示所述结直肠癌的转移和不良预后。
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