KR20090053223A - 대장암 마커로서의 ｅｓｍ－１ 유전자 및 이를 이용한대장암의 진단 및 치료에의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암 환자의 조직, 세포 또는 체액에서 ESM-1의 과발현 현상을 이용하여 대장암을 진단하고 치료제 개발에 활용하는 것에 대한 대장암 마커 및 이를 이용한 대장암 진단, 치료에 관한 것이다.

대장암, ESM-1, 체액, 진단키트

Description

대장암 마커로서의 ＥＳＭ－１ 유전자 및 이를 이용한 대장암의 진단 및 치료에의 용도{Characterization of ESM-1 as a tumor associated marker of colorectal cancer}

본 발명은 대장암 환자에서의 ESM-1의 임상적 중요성과 생물학적 기능을 밝히고, 대장암 진단 마커로서의 가능성을 평가하는 방법에 관한 것이다.

대장암은 동물성 지방질과 고기를 많이 먹는 서양에서 많이 발생하며, 발생률과 사망률이 모두 두번째로 높은 암이다. 서양에 비하여 발생률이 낮았던 한국이나 일본을 비롯한 아시아 국가에서도 식생활이 서구화 되어감에 따라 예전에 비하여 대장암의 발생률이 증가되어 가고 있는 추세로, 최근의 통계청 조사(2002년)에 따르면 대장암은 폐암, 위암, 간암에 이어 암 사망률에서 네 번째로 많은 암으로 발표되었다. 대장암은 현재 잠혈검사나 대장내시경 등을 통해 조기 진단율이 높아지고 있으나, 일단 발견된 대장암의 예후를 예측하고 적절한 치료방침을 정하는데 활용될 수 있는 바이오 마커는 거의 없는 실정이다. 아직까지 하나의 검사로 암이 확진되고 병기를 결정할 수 있는 방법이 없으므로 의사의 진찰, 조직검사, 세포검사, 내시경검사, 암표지자 검사, 영상진단 검사, 핵의학 검사 등 여러가지 검사들 을 종합하여 진단하고 있으며 혈액, 조직, 배설물로부터의 종양표지자 검사를 이용하고 있으나 많은 종류의 종양표지자는 암이 없이도 증가하거나 검출되는 경우가 있으므로 이것만으로 암 확진에 부적당하다.

대장암 진단의 전통적 방법으로는 colonoscopy/guaiac-based fecal occult blood test (FOB)가 개발되어 사용되고 있고, 분자 생물학의 발달에 따라 신규 마커로서, cyclooxygenase 2, SFRP2 methylation 등이 알려져 있다. 암태아성 항원 (Carcino embroynic cancer Antigen/CEA)은 1965년에 결장암과 태아결장점막에 공통적으로 존재하는 항원 물질로 발견된 당 단백으로, 태생기 2-6개월의 태아 소화기 조직 중 존재하는 항원으로서 출생 후 소실되어 버리는 태아성 항원이다. CEA는 대장암을 비롯하여 소화기암, 췌장암, 폐암 등 여러 장기 유래 암에 폭 넓게 출현함으로써, 그의 진단 보조나 수술 후, 치료 후의 경과 관찰 지표로 유용성이 인정되고 있다. 또한 대장암이나 위암에서 수술 전에 높은 측정치를 보일 경우 유의하게 재발율이 높다고 하며, 예후 관찰에도 유용하다고 판단된다. CEA는 대장암의 특이적 검사일 뿐 아니라, 췌장암(60-90%), 위암(40-60%), 폐암(60-75%),유방암(20-50%) 등 여러 종양에서도 증가되는 범종양 표지검사이다. 특히, 대장암에서는 암의 침범 정도에 따라 대장벽에 국한된 종양일 때는 20-40%, 전이된 종양일때는 80-90%의 높은 수치를 나타낸다. 또한, 간에 전이되면 급격히 상승하는 특징과 대장암 환자에서 예후 결정이나 수술 후 경과 관찰에 이용되며 악성종양 외에 간경화증, 알콜성 간염, 췌장염, 궤양성 대장염등 많은 양성 질환에서 증가한다. 대장암은 또한 생리적 변동요인인 흡연과 연령에 따라 다소 차이가 있다.

한편, 대장암의 배양세포로부터 췌장선암에 특히 양성률이 높은 항원을 발현하고, 그 항원에 대한 항체를 만들어 이것을 인식하는 탄수화물 항원을 CA 19-9라 명했는데, 상기 항원은 췌장암(84%), 위암(35%), 간암(22%) 및 담낭암(69%)에서 양성으로 나타나며, 췌장암 및 담도암에서는 1000 U/ml 이상 고농도를 보이는 예가 40-50%로 특이성을 보이므로 조기 진단 및 췌장암 보조 진단에 유용한 검사로 평가받는다. 위암 및 대장암은 특히 간 전이시 양성을 보이며 정상 조직에서는 췌장과, 담관, 위점막, 타액선 상피 세포암 근방의 비 암세포에서도 양성을 보인다.

ESM-1(Endothelial cell-specific molecule 1 precuosor)은 endocan이라고도 불리며, 184개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자량은 20KDa이며 분비단백질이다. ESM-1은 인슐린류 성장인자(insulin-like growth factor)와 특이적으로 반응하며 세포의 성장과 증식을 촉진하려는 특성이 있으며 TNF-alpha와 IL-1 beta에 의해 유도된다. ESM-1은 주로 패혈증의 진단 마커로 알려져 있으며(Reinhart K et al., Crit Care Clin, 2006, 22(3), 503-519, Filep JG. Crit Care Med, 2006,34(2), 574-575, Scherpereel A et al., 2006, 34(2), 532-537) 암 관련으로는 신장암에서 VEGF-A와 PI3K 조절 유전자로 발표된바 있으며 (Rennel E 등, Exp Cell Res, 2007, 313(7): 1285-1294), 폐암에서 leukaphereses contamination을 보기 위해 이뮤노케미스트리(Immunocytochemistry)와 RT-PCR을 이용해 esm-1의 발현을 본 보고도 있다(L Perey등, Br.J Cancer, 2001, 85(11):1713-21). 그러나, 아직까지 혈청과 조직에서의 정량 분석을 통한 ESM-1의 대장암 진단 마커로서의 효용성에 대한 연구 결과는 없었다. 또한, ESM-1의 분석은 일반적인 분자 생물학적 방법으로 분석하고 있으며 단백질 발현으로는 Western blot과 ELISA (David B 등, J. Vasc. Res, 2000, 37, 417-425, US pat 2004/0063164A1), Immunohistochemistry와 같은 항체를 이용한 분석법이 실시되고 있다. 한편 ESM-1 측정테스트 키트에 관련된 연구로는 "Kit and method for detecting the ESM-1 protein" (US pat 2004/0063164A1)가 보고된 바 있으나, 이는 본 특허에서 제공하는 대장암 진단과 치료 용도로서가 아니라 ESM-1을 측정하여 내피혈관벽의 열화를 검출하고자 한 키트이다.

본원 발명자들은 대장암에서의 ESM-1의 생물학적 기능을 살펴보고 대장암 진단 및 예후 마커로서의 가능성을 평가해 보았다. 본 발명 내용에 의하면, 정상인과 대장암 환자의 조직을 대상으로 cDNA microarray와 RT-PCR을 실시한 결과, 비종양( nontumor) 조직 또는 정상 대장 조직에서보다 대장암 조직에서 높은 ESM-1의 RNA 발현을 보였다. ESM-1에 대한 항체를 이용하여 Western blot과 Immunodot assay를 실시하여 혈청 중 ESM-1 단백질 발현정도를 비교해본 결과, 정상인의 혈청에서 보다 대장암 환자의 경우 ESM-1의 양이 많음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 실험결과들을 통해 ESM-1은 대장암의 진단과 예후에 대한 마커로서 가치가 높음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 목적은 유전자 ESM-1 또는 그의 단편 및 항체를 이용하여 대장암을 진단하는 방법 및 대장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 ESM-1 또는 그의 단편으로부터 유래되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 siRNA를 제공하고, 이를 사용하여 대장암의 발병 또는 전이를 치료 또는 예방하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 암 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 ESM-1의 생물학적 기능을 밝히고 임상적 의의를 알아보기 위하여 대장암의 조직과 혈액에서 RNA, 단백질 발현정도를 밝혀 대장암 진단, 예후마커로서의 가능성을 평가해 보았다. 이를 위하여 대장암환자의 조직을 대상으로 cDNA microarray, RT-PCR, Western blot을 실시하였으며 실험결과 ESM-1은 대장암 조직에서 비종양조직 보다 높은 RNA 및 단백질 발현율을 보임을 확인하였다.

또한 세포주를 대상으로 RT-PCR을 실시한 결과, 대장암 세포주인 SW620 및 SNU C2ADLD1 에서 ESM-1이 강한 발현을 보였다. 또한 임상혈청시료를 이용하여 ESM-1의 분포도를 조사해 본 결과, 대장암에서 높은 농도의 ESM-1이 분비됨을 볼 수 있었다.

이를 통해 ESM-1을 대장암의 조기진단, 예후, 치료 모니터링에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 ESM-1의 핵산 또는 단백질을 포함하는 대장암 진단 마커에 관한 것이다.

본 발명에서 "진단"은 대장암 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간세포암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간세포암의 발병여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 "마커"는 대장암 등의 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, ESM-1 유전자에 대한 핵산 마커 및 ESM-1 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 대장암 세포에서 발현이 증가하는 특징을 나타낸다.

본 발명의 인간 대장암 유전자인 ESM-1은 서열번호 1로 나타낸 바와 같이 1644bp 길이의 전체 염기서열을 가지며, 전체 단백질은 184개의 아미노산으로 이루어져 있고 크기는 약 20kDa이다.

본 발명의 유전자는 실시간 RT-PCR의 분석 방법에서 대장암조직에서 비교적 발현이 높기 때문에 대장암을 유발하는 발암/전이 유전자로 판단된다. 따라서, 본 발명의 대장암 유전자는 대장암의 발생에 관여하는 것으로 판단되며, 대장암의 진단, 형질전환 동물의 제조, 대장암 특이적 항암제 탐색, siRNA 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있으며, 인간의 수명을 조절하는 유전자로 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 ESM-1 유전자의 발현수준 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물에 관한 것이다.

생물학적 시료 중의 ESM-1 마커 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 이의 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, mRNA와 단백질의 양은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 "mRNA 수준 측정"이란 ESM-1 마커 유전자를 검출하기 위하여 생물학적 시료에서 ESM-1 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 대장암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, ESM-1 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 대장암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 ESM-1 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, 바람직하게는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 측정한다.

이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, ESM-1 유전자의 mRNA에 상보적인 프라이머 서열을 포함하는 대장암 진단 마커 조성물을 제공한다.

"프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 네 가지 뉴클레오사이드 3인산의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 대장암 진단 마커 검출용 조성물은, ESM-1 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머쌍을 포함한다. 구체적으로, ESM-1(서열번호 1)을 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 2 및 3으로기재되는 프라이머이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 ESM-1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 대장암 진 단 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 ESM-1 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 대장암 마커 단백질이 규명이 되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 ESM-1 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법은 ESM-1 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배 양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 ESM-1 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.

파지 항체 라이브러리 방법은 ESM-1 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 ESM-1 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, F(ab)₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단 키트를 제공한다. 바람직하게 상기 대장암 진단키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 진단 키트는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 대장암 진단용 조성물 또는 상기 대장암 진단 키트를 이용한 대장암 진단 방법을 제공한다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명은 ESM-1 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 대장암 의심환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법을 제공한다.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 ESM-1 마커 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 대장암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 대장암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드 의 두께를 확인함으로써 대장암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 대장암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다(도 1, 도 2). 한편, DNA 칩은 상기 대장암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 대장암의 발병 여부를 판독할 수 있다.

또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 ESM-1 단백질에 특이적인 항체를 대장암 의심환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 항원-항체 복합체 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 효소 면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

위와 같은 분석방법을 통하여 정상 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암 의심환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, ESM-1 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 대장암 의심환자의 실제 대장암 여부를 진단할 수 있다.

"항원-항체 복합체"란 ESM-1 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 ³H,¹⁴C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. ESM-1 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여 암 발병 여부를 확인할 수 있는 것이다.

또 다른 방법으로 ESM-1 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 방법으로 ESM-1에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 암 발병 여부를 확인할 수 있다(도 3).

위와 같은 검출방법들은 정상 대조군의 마커 유전자 발현량과 대장암 발병 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. mRNA 또는 단백질 의 수준은 ESM-1 마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서는, ESM-1 유전자의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 대장암의 치료, 예방 또는 전이 억제용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 ESM-1 유전자의 발현을 억제하는 물질로서 바람직하게 ESM-1 유전자에 대한 안티-센스 유전자 또는 siRNA(small interfering RNA)를 포함한다. 본 발명에서, "안티센스 유전자(anti-sense gene)"는 서열번호 1의 ESM-1 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA와 결합하여 리보솜에 의한 해독과정을 저해할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 발암 유전자의 발현으로 인한 암을 치료할 수 있다. 또한 상기 ESM-1 유전자의 siRNA는 21~30 뉴클레오티드의 이중가닥 RNA 조각으로 세포 내에 도입되면 다이써(Dicer)에 의해 인지되고 이는 세포 내에 존재하는 상기 유전자의 mRNA를 분해하여 ESM-1 유전자의 발현을 저해하게 된다. 본 발명에 따른 상기 조성물은 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 발암 및 /또는 전이 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들어 문헌 (Filleur 등, Cancer Res ., 63(14): 3919-22, 2003)에 따라 특별한 생체 내 도입 방법 없이 적은 양의 정맥 주사 방법(low-volume intravenous injection)에 의해 siRNA로 유전자 발현이 조절 가능하다는 것을 보여주고 있다. 또한 siRNA 생체 내 흡수량과 안정성을 증가시키기 위한 시도로써, 문헌 (Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3): 321-8, 2005)의 방법에 따라 siRNA의 정맥을 통한 주입에서 복합체를 만들어 사용하는 방법도 제시되고 있다. 이 방법은 정맥 주사의 효율이 기존의 다른 리포솜 복합체보다 약 7배 정도 높 게 나타났으며, 부작용도 적은 것이 확인되었다(Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3): 321-8, 2005).

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 ESM-1 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상의 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100㎎/㎏이고 바람직하게는 0.5 내지 10㎎/㎏이며, 하루에 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 ESM-1 발암 유전자의 프로모터를 이용한 리포터 시스템을 가진 지속적으로 증식 가능한 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 저분자 물질의 탐색을 통한 항암제 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 ESM-1단백질에 대한 특성을 규명하여 대장암의 진단과 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 발명이다. ESM-1은 정상인에 비해 대장암 환자에서 분비양이 많았다. ESM-1의 발현을 이용한다면 대장암 진단 및 치료, 그 외 암화에 관련된 ESM-1 관련연구에 유용하게 사용할 수 있으며, 대장암을 진단하는 진단제 및 치료제로서 그 활용도가 크다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 조직 시료 처리.

cDNA microarray 실험을 위하여, 삼성병원으로부터 20명의 대장암환자 조직과 정상 조직을 얻었다. 조직시료는 액체질소에서 동결시켰다. RNeasy midi kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다.

< 실시예 2> 대장암조직에서의 ESM -1의 발현 조사

2-1. cDNA 마이크로어레이에 의한 ESM -1 발현 조사

대장암 관련 유전자를 발굴하기 위해 cDNA microarrayer를 이용하여 20명의 대장암 조직과 정상조직을 대상으로 ESM-1의 유전자발현을 조사, 비교한 결과, 하기 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이 ESM-1이 대장암조직에서 중요한 발현차이를 보였다.

2-2. RT - PCR 에 의한 ESM -1 발현조사

12쌍의 종양(T)-비종양(NT) 시료쌍을 선택하여 RT-PCR를 실시하여 RNA 수준을 조사하였다. 즉, Primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 ESM-1에 상응하는 올리고 뉴클레오티드 서열을 디자인하였다. RT-PCR 분석에 대한 주형으로서 총 RNA 5 ㎍에 상응하는 first strand cDNA 혼합물을 사용하였다.

RT-PCR을 위해 사용한 프라이머는 다음과 같다.

start..end Direction Annealing Primer sequence(205bp)

(A) 66..83 Forward 프라이머 (18/ 18) atgaagagcgtcttgctg (서열번호2)

(B) 253..270 Reverse 프라이머 (18/ 18) ctgtgcggtagcaagttt (서열번호3)

Primer Anneling temperature는 47.5°C에서 실시하였다.

유전자의 발현수준은 β-actin 발현에 대해 normalization하였다.

실시예 2-1의 DNA chip 분석결과와 마찬가지로 대장암조직에서의 ESM-1 발현은 정상조직과 비교하여 발현이 크게 증가함을 볼 수 있었다 (도1).

< 실시예 3> 대장암세포주와 환자 혈청에서의 ESM -1 발현

대장암 세포주에서 단백질발현을 비교하기 위하여 다클론항체를 이용하여 Western blot 분석을 실시하였다. 이를 위하여 대장암 세포주를 배양한 후 세포를 용출용액 (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 100 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM EDTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 ㎍/ml aprotinin, 10 ㎍/ml leupeptin, 1 M PMSF)에 용출시킨 후 세포 용해물을 전기영동하고 니트로셀룰로스막 (Bio-rad, CA, USA)에 블롯팅하였다. 이뮤노 블롯팅 막을 5% non fat dry milk, 0.1% Tween 20이 포함된 PBS용액에 넣고 실온에서 2시간 동안 블로킹한 후 ESM-1에 대한 항체 (1:5,000)로 2시간 동안 반응시킨 후, 5,000배 희석된 HRP가 접합된 2차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 enhanced chemiluminescence assay kit (Pierce, IL, USA)으로 develope하여 분석하였다. 도 2에서 보여주듯이 대장암 세포주의 상등액에서 ESM-1가 많이 발현됨을 보였다. 특히 SW620 및 SNUC2A세포에서 발현이 높았다. 이로부터 ESM-1는 대장암에서 분비되는 단백질임을 알 수 있었다. 또한, 환자 혈청 실험을 통한 Western blot 분석을 통하여 ESM-1이 대장암 환자의 혈청에서 발현되는 것을 알 수 있었다(도 3).

< 실시예 4> 이뮤노닷 분석에 의한 환자 혈청 중 ESM -1 단백질 측정

다클론 항체를 이용하여 이뮤노닷 방법을 확립하여 혈청 중 ESM-1의 분비정도를 비교하였다. 나이트로 셀룰로즈 멤브레인에 5배 및 10배 희석한 혈청시료 (각 환자당 10개체)를 2㎕씩 점을 찍은 후 상온에서 건조시키고, 1% BSAT(bovine serum albumin in Tris-buffered saline)로 블로킹하였다. ESM-1에 대한 다클론 항체(1:1000)를 반응시킨 후 2차 항체 접합 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(1:2000)를 가하고 DAB 용액(0.5㎎/㎖diaminobenzidine in PBT)으로 발색시켰다. 스캔하여 발색 정도를 비교하였다. 대장암의 경우 정상보다 ESM-1 단백질이 많이 분비되는 것을 알 수 있었다. 결론적으로, 대장암에서 ESM-1은 진단 및 예후 인자로서의 가능성과 효용성이 크다.

< 실시예 5> 샌드위치형 ELISA 킷트

다음의 구성요소들을 사용하여 ESM-1 농도 측정용 킷트를 제조하였다:

A. 고상형 항체: 항체가 흡착된 마이크로타이터 플레이트로서, ESM-1 에 대한 다클론 항체 100 ㎕를 마이크로타이터 플레이트에 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켜 제조한다.

B. 검출 항체 : ESM-1 에 대한 단일클론항체

C. 효소결합 항체: 서양고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 2차항체 용액

(anti-mouse-IgG-퍼옥시다제)

D. 혈청 희석용액

E. 기질액

F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액, 및

G. 표준용액: ESM-1 표준액.

상기 킷트를 이용하여 대장암 환자 중 ESM-1의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사할 수 있다. A의 고상형 항체, 즉 마이크로타이터 플레이트에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 샌드위치형 측정방법으로 ESM-1 농도를 검사한다.

도 1은 RT-PCR에 의한 대장암환자의 비 조직과 암 조직에서의 ESM-1 발현비교한 그림이다.

도 2는 대장암 세포주에서 ESM-1의 발현 정도를 확인한 그림이다.

도 3는 Western blot 에 의한 대장암 환자 혈청에서의 ESM-1의 발현 차이를 본 그림이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biothchnology <120> Characterization of ESM-1 as a tumor associated market of colorectal cancer <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Endothelial cell-specific molecule 1 precursor <400> 1 Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro Ala His Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Trp Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln His Cys 20 25 30 Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg Cys Lys Arg Thr Val Leu 35 40 45 Asp Asp Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala Gly Arg Gly Glu Thr 50 55 60 Cys Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Asp Gly Met Lys Cys Gly Pro Gly 65 70 75 80 Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp Pro Phe Gly Glu Glu Phe 85 90 95 Gly Ile Cys Lys Asp Cys Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Met Asp Cys Arg 100 105 110 Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly Ile Cys Asp Arg Gly Thr Gly Lys 115 120 125 Cys Leu Lys Phe Pro Phe Phe Gln Tyr Ser Val Thr Lys Ser Ser Asn 130 135 140 Arg Phe Val Ser Leu Thr His Asp Met Ala Ser Gly Asp Gly Asn Ile 145 150 155 160 Val Arg Glu Glu Val Val Lys Glu Asn Ala Ala Gly Ser Pro Val Met 165 170 175 Arg Lys Trp Leu Asn Pro Arg 180 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for ESM-1 <400> 2 atgaagagcg tcttgctg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ESM-1 <400> 3 ctgtgcggta gcaagttt 18

Claims (9)

1. ESM-1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
2. 제 1항에서, 상기 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 ESM-1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 서열 한쌍으로 구성되는 프라이머를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
4. 제 1항에서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 ESM-1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
5. 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
6. 제 5항에 있어서,RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 키트.
7. (a) 대장암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 ESM-1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 mRNA의 수준을 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법.
8. ESM-1 단백질에 특이적인 항체를 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계, 및 상기 항원-항체 복합체의 형성량을 정상 대조구 시료의 항원-항체 복합체 형성량 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법.
9. ESM-1 유전자의 안티센스 유전자 또는 siRNA를 포함하는, 대장암의 치료, 예방 또는 전이 억제용 조성물.

Images