KR100983386B1 - 난소암 진단을 위한 ａｇｒ-2의 신규한 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 난소암 진단을 위한 AGR-2의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 AGR-2에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 난소암 진단용 키트, 난소암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 시료로부터 AGR-2 단백질을 검출하는 방법 및 AGR-2 유전자의 발현을 억제하는 제제를 선별하는 것을 특징으로 하는 난소암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 AGR-2는 난소암 조직에서만 특이적으로 과량 발현되며 난소암의 종류에 따라 발현양에 차이를 나타내는 단백질이므로 난소암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하기 위한 진단 마커로서 사용할 수 있다. 나아가, AGR-2가 세포 밖으로 분비되는 단백질이므로 혈액 내에서 AGR-2의 존재여부를 확인함으로써 난소암을 조기 진단할 수 있다.

AGR-2, 난소암, 진단

Description

난소암 진단을 위한 ＡＧＲ-2의 신규한 용도{Novel use of AGR-2 for diagnosing ovarian carcinoma}

본 발명은 난소암 진단을 위한 AGR-2의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 난소암에 특이적으로 발현되는 AGR-2에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 난소암 진단용 키트, 난소암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 시료로부터 AGR-2 단백질을 검출하는 방법 및 AGR-2 유전자의 발현을 억제하는 제제를 선별하는 것을 특징으로 하는 난소암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

난소암은 부인암중에서 가장 치명적인 암으로써, 미국 내에서 여성의 암 사망 중 5번째로 가장 많은 원인이 되고 있다. 더욱이, 발병은 산업화된 나라에서 일어나고 있다. 장애를 일으키는 내분비 기능과 연관되는 역학적 증거는 있어도 종양성 형질 전환의 병인은 알려져 있지 않다. 난소암의 발병은 아이를 낳지 않은 여성과 초기 폐경을 갖는 여성에서 더 높게 나타난다. 난소암은 한국에서 두 번째로 발병 빈도가 높은 부인암으로 초기증상이 없고 적절한 진단 마커의 부재로 인하여 조 기진단이 어려워 70% 이상의 환자들이 3기 이상 진행된 상태에서 발견되기 때문에 매우 사망률이 높은 부인암이다. 난소암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 조기발견이 최선이며 항암치료 시 치료효과 및 치료반응을 모니터링할 수 있는 마커의 개발이 시급하다.

난소암은 암 조직을 구성하는 세포에 따라 크게 상피세포암, 생식세포암 및 간장세포암 등으로 나눌 수 있으며 이를 세분하면 점액성(mucinous) 난소암, 장액성(serous) 난소암 및 경계성 난소암 등이 있다.

난소암으로 진단이 될 경우 대부분의 경우, 암이 많이 진행된 상태로 나타나기 때문에 예후가 좋지 않으며, 5년 생존율이 약 28%로 낮은 편에 속한다 (Ries et al., Natioal Cancer Institute statistics, 1998). 반면에 난소암이 조기 진단될 경우, 5년 생존율은 약 90%정도에 이른다. 따라서 난소암으로 인한 피해를 줄이기 위해서는 조기진단이 명백하게 필요하다.

현재 난소암 진단용 마커로는 CA125가 알려져 있으며, 혈청 CA125는 난소암의 선별, 양성과 악성 난소 덩어리간의 구별 및 예후에 사용되어 왔다 (Zurawski, V. R. et al., Int J. Cancer, 42:677-80, 1988; Vasilev S.A et al., Obstet Gynecol. 71:751-6, 1988; Rubin S.C. et al., Am J Obstet Gynecol. 160:667-71, 1989; Bridgewater J.A. et al., J. Clin Oncol. 17:501-8, 1999). 그러나 상기 CA125는 단지 I기 난소암 여성의 약 1/2에서만 상승되는 경향이 있기 때문에 단일 마커로서 한계가 있다. 따라서 난소암에 대한 새로운 진단 마커의 개발이 절실히 필요하다.

이에 따라 CA15-3, CA19-9, OVX1, 리소포스파드산(LPA) 및 암배아 항원(CEA) 등과 같은 새로운 난소암 마커들이 개발되었다. 그러나 이들 역시 난소암을 정확하게 진단하기에 충분하지 않기 때문에 현재에는 오직 CA125와 초음파 촬영술을 함께 병행하는 방법만이 이용되고 있다.

AGR-2(Anterior Gradient-2)는 에스트로겐 수용체(ER)-양성 MCF7 및 ER-음성 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 다르게 발현되는 유전자로서 최초로 클로닝되었으며, 유방암 세포주의 패널에서 ER과 함께 발현되는 것으로 발견된 바 있다. 그러나 현재까지 상기 AGR-2가 난소암의 진단 마커로 사용될 수 있음은 전혀 보고 된 바 없다.

이에 본 발명자들은 난소암을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 새로운 진단마커를 개발하고자 연구한 결과 AGR-2가 난소암 조직에서 특이적으로 높게 발현되므로 점액성 난소암의 조기 진단 및 치료 전후의 예후를 판단하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 난소암 진단을 위한 AGR-2의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AGR-2에 특이적인 항체를 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 AGR-2에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 난소암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 AGR-2 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 AGR-2 유전자의 발현을 억제하는 점액성 난소암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 점액성 난소암의 신규한 진단 마커에 관한 것이다. 본 발명의 AGR-2는 정상 조직에서는 검출되지 않으나 난소암 조직에서만 그 발현이 급격하게 증가하여 검출되는 특징이 있다.

본 발명자들은 난소암 조직에서 AGR-2의 발현이 급격하게 증가함을 mRNA 수준에서 마이크로어레이 분석을 통해 확인하였고(실시예 2, 도 1 및 도 2 참조), 난소암 조직에서 AGR-2의 발현정도를 AGR-2에 특이적인 항체를 이용하여 단백질 수준에서 분석한 결과 AGR-2가 난소암 조직에서만 특이적으로 발현되며 난소암의 종류에 따라 그 발현량에 차이가 있음을 알 수 있었다(실시예 3 및 도 3 참조). 또한, 본 발명자들은 난소암 조직에서 발현되는 AGR-2를 AGR-2 항체를 이용한 면역조직화학염색으로도 확인하였다(실시예 4 및 도 4 참조). 나아가, 난소암 세포주를 AGR-2 항체로 형광면역염색한 결과 AGR-2가 주로 세포질에 존재하고 있어 AGR-2가 세포 밖으로 분비되는 단백질임을 알 수 있었다(실시예 5 및 도 5 참조). 아울러, AGR-2가 세포 외로 배출되는 단백질로서, 난소암 환자의 혈청을 이용하여 난소암 진단을 할 수 있음을 알 수 있었다(실시예 6, 도 6 및 도 7 참조). 따라서 본 발명자들은 상기 AGR-2가 난소암 조직에서만 특이적으로 과량 발현되는 단백질이므로 난소암의 진단 마커로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 특히 난소암의 종류에 따라 발현양이 차이가 나므로 난소암의 타입에 따른 분류 및 개별화된 치료를 위한 마커로 서 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 나아가, AGR-2가 세포 밖으로 분비되는 단백질이므로 환자의 혈액 내에서 AGR-2의 존재여부를 확인함으로써 난소암을 조기 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 AGR-2는 난소암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 AGR-2를 이용한 난소암의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 AGR-2 단백질 또는 핵산을 검출함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “암 진단 마커”란 암 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 암의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상 조직과 암 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명에서 암 진단 마커는 난소암 조직 및 세포에서만 특이적으로 발현되는 AGR-2이며 AGR-2의 발현을 단백질 수준 또는/및 mRNA 수준 에서 확인함으로써 난소암을 진단할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “생물학적 시료” 또는 “시료”는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “검출”은 표적 AGR-2 핵산 또는 그 단백질, 그의 서브유닛의 존재 또는 부재를 분석, 영상화, 확인, 확립하는 것을 말한다.

본 발명에서 “AGR-2 단백질”은 바람직하게는 인간 앤테리어 그래디언트-2(human Anterior Grandient-2)를 말한다. 바람직하게는, 상기 AGR-2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다(Genbank Accession No. NP_006399.1). 또한, 본 발명에서 상기 AGR-2 단백질의 범주로 이의 기능적 동등물 및 전구체도 포함한다. 상기에서 기능적 동등물이란 AGR-2 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내며 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질을 말한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노 산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 AGR-2 단백질의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 AGR-2 단백질의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP (Green Fluorescent Protein)와　같은　다른　단백질과　융합으로　만들어진　융합단백질 등이 이에 포함된다.

본 발명에서 “AGR-2 핵산”은 상기 AGR-2 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 말한다. 바람직하게는 상기 AGR-2 핵산은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 갖는다(Genbank Accession No. NM_006408, 서열번호 5). 상기 핵산은 이중쇄 또는 단쇄일 수 있다.

본 발명에서 AGR-2의 발현을 단백질 수준에서 검출하는 방법으로는 당 업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 시료를 AGR-2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정한다.

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 생물학적 시료 중의 AGR-2 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

따라서 본 발명은 AGR-2 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)₂ 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

AGR-2 단백질은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 AGR-2 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 AGR-2 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 AGR-2 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 AGR-2 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 AGR-2 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

예를 들어, 다클론 항체는 AGR-2 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.

단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol . Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 키트는 AGR-2 단백질에 특이적인 항체이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.

면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트에 포함되는 항체는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 난소암 조직에서만 AGR-2 단백질이 특이적으로 존재함을 AGR-2 항체를 이용한 웨스턴 블롯(실시예 3 참조), 면역조직화학염색(실시예 4 참조) 및 면역형광염색법(실시예 5 참조)에 의해 확인하였다.

또한, AGR-2 핵산의 검출은 AGR-2를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 증폭반응 또는 AGR-2 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하는 하이브리드화 반응에 의해 수행될 수 있다.

보다 구체적으로 프라이머를 이용한 AGR-2 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 AGR-2 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 AGR-2 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

따라서 본 발명은 AGR-2 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공한다.

상기 “프라이머”란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. AGR-2 핵산을 증폭하기 위한 프라이머는 공지된 AGR-2 핵산 서열을 바탕으로 당 분야에 공지된 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 적합한 프라이머는 AGR-2 핵산 분자의 일부를 증폭시킬 수 있는 것으로서 AGR-2 핵산 중 15개 이상의 연속적인 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 기본으로 한다. 일반적으로 상기 프라이머는 15 내지 30bp, 바람직하게는 18 내지 28bp의 길이를 가지며, AGR-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 약 60%, 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 예를 들면, 상기 프라이머는 서열번호 5 또는 서열번호 2의 정보를 통해 제작될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 3(forward primer, 5'-ATGGAGAAAATTCCAGTG-3'), 서열번호 4(reverse primer, 5'-TTACAATTCAGTCTTCAG-3')의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머쌍일 수 있다.

상기 “프로브”는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

상기 프로브는 당 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 프로브는 AGR-2 핵산 중 6개 이상의 연속적인 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 기본으로 한다. 일반적으로는 상기 프로브는 18 내지 300bp, 바람직하게는 20 내지 200bp의 길이를 가지며, AGR-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 약 60%, 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 다. 예를 들면, 상기 프로브는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 전체 또는 이의 일부를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1989)에 공지된 바와 같은 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.

상기 프로브나 프라이머를 이용하여 AGR-2 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법(Nikiforeov et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994), 올리고뉴클레오티드 연장 분석(Nickerson et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927, 1990), 대립형질 특이적 PCR법(Rust et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993), RNase 불일치 절단(RNase mismatch cleavage, Myers et al., Science, 230, 1242-1246, 1985), 단일가닥 입체 다형화(single strand conformation lymorphism, Orita et al., Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법(Lee et al., Mol Cells, 5:668-672, 1995), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Cariello et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988), 변성 고압 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography, Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997), 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션(Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1982), 인시츄 하이브리다이제이션(Jacquemier et al., Bull Cancer, 90:31-8, 2003) 및 마이크로어레이(Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3:185-200, 2003) 방법 등이 있다.

본 발명의 실시예에서는 난소암 조직으로부터 분리한 mRNA를 역전사하여 cDNA를 수득하고 이를 형광 염료로 표지한 후 AGR-2 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브가 부착된 마이크로어레이와의 혼성화 반응에 의해 AGR-2 핵산의 발현을 확인하였다(실시예 2 참조).

한편, 본 발명의 난소암 진단 키트는 공지된 다른 종류의 난소암 마커를 검출할 수 있는 시약, 상기 마커들에 대한 핵산 및 항체를 추가로 포함할 수 있다. 공지된 다른 종류의 난소암 마커로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 인간 각질층 키모트립신 효소(HSCCE), 합토글로빈 알파, 오스테오폰틴, 칼리크레인 4(hk4), 칼리크레인 5(hk5), 칼리크레인 6(hk6), 칼리크레인(hk8), 칼리크레인 10(hk10), 칼리크레인 11(hk11), CA125, CA15-3, CA72-4, CA19-9, OVX1, 리소포스파티드산(LPA), 크레아틴-키나제 BB 및 암배아 항원(CEA) 등이 있다.

또한, 본 발명은 난소암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 AGR-2 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 이 때, 시료, AGR-2 단백질 및 항원-항체 반응에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.

나아가, 본 발명은 AGR-2 유전자의 발현을 억제하는 난소암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 난소암 치료제 스크리닝 방법은 (a) 시험물질을 AGR-2(Anterior Grandient-2) 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 AGR-2 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 (a)의 시험물질이 상기 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

상기에서 “시험물질(test agent)”라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.

본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 시험물질은 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨 린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 상기 시험물질은 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 시험 물질은 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약5-20개, 보다 바람직하게는 약7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 "핵산”일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화” 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다.

상기에서 AGR-2 유전자의 발현은 단백질 및/또는 mRNA 수준에서 상술한 바와 같은 면역분석학적 방법, 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 AGR-2는 난소암 조직에서만 특이적으로 과량 발현되며 난소암의 종류에 따라 발현양에 차이를 나타내는 단백질이므로 난소암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하기 위한 진단 마커로서 사용할 수 있다. 특히 점액성난소암의 경우 종양의 크기가 크고 침윤성이 적으므로 조기발견하여 치료시 생존율을 증가 시키는데 도움이 될 수 있다. 나아가, AGR-2가 세포 밖으로 분비되는 단백질이므로 혈액 내에서 AGR-2의 존재여부를 확인함으로써 일반적인 혈액검사를 통해 난소암을 조기 진단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

세포 배양 및 조직 준비

인간 난소암 세포, 2774 세포 및 인체 신장배아세포(human embryonic kidney, HEK) 293 세포를 각각 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제(penicillin (100 units/ml) and streptomycin (100 /ml), Gibco-BRL)를 첨가한 DMEM 및 EMEM 배지에서 5% CO₂, 37 °C의 조건으로 배양하였다. 정상 세포 및 종양 세포를 포함하는 모든 난소 조직은 삼성 의료원(Department of Obstetrics and Gynecology at Samsung Medical Center)의 난소암 수술과정에서 정해진 규정에 따라 수득하였다. 시료는 수득 즉시 액체 질소에 넣고, 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다.

< 실시예 2>

마이크로어레이를 이용한 난소암 조직에서 AGR -2의 발현 조사

난소암의 수술과정에서 수득한 난소암 조직으로부터 분리한 mRNA를 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행함으로써 난소암 조직에서 AGR-2의 발현 정도를 조사하였다. 또한, 대조군으로 난소암 수술시 동시에 제거된, 난소암과 근접한 부위에 존재하는 정상난소 조직을 사용하였다.

난소암 조직에 트리졸 용액(Invitrogen, 미국)을 처리하여 다음과 같이 mRNA 를 분리하였다: 트리졸 용액을 처리하여 세포를 용해한 다음, 세포 추출물에 클로로포름을 넣고, 30℃에서 5분간 처리하였다. 이를 볼텍싱(vortexing)한 다음, 혼합물을 14000rpm에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 따로 모았다. 여기에 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시킨 다음 침전된 펠렛을 75% 에탄올로 2번 세척하고, 공기중에 말렸다. 이를 증류수에 녹인 다음 cDNA를 합성하기 위해 First-Strand cDNA Synthesis kit (Invitrogen, 미국)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA를 합성하였다.

장액성(serous) 난소암(n=17, borderline serous ovarian cancer=4, primary serous ovarian cancer=13) 및 점액성(mucinous) 난소암(n=9, borderline mucinous ovarian cancer=6, primary mucinous ovarian cancer=3)이 사용되었으며, 종양 조직의 RNA는 Cy3-dUTP로, 정상 조직의 RNA는 Cy5-dUTP로 direct labeling method에 의해 표지한 다음 표지된 탐침을 17K 마이크로어레이 칩(Genomic Tree, 한국)와 혼성화하였고, 발현 프로파일(expression profile)은 Genespring GX V7.3 software program (Agilent Technologies)으로 분석하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에서 보듯이, 난소암 조직에 대해서 발현 패턴을 프로파일링(profiling)한 결과(도 1 참조), 정상 조직에서는 AGR-2가 검출되지 않았으나, 난소암 조직에서 AGR2의 발현이 크게 증가함을 알 수 있었다. 장액성(serous) 난소암(n=17) 및 점액성(mucinous) 난소암(n=9)의 결과를 종합하여 나타낸 결 과(scattered plot analysis)(도 2), 장액성 난소암의 경우 5배 이하의 발현증가(upregulation)가 다수인 것에 비해서 점액성 난소암의 경우 모든 경우에서 5배 이상의 발현 증가를 보임을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

웨스턴 블롯을 이용한 난소암 조직에서 AGR -2의 발현 조사

난소암 조직에서 AGR-2의 발현 정도를 단백질 수준에서 분석하기 위해 AGR-2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

상기 난소암 조직과 정상조직을 질소탱크에 넣어 동결시킨 후 각각 막자사발을 이용하여 곱게 분쇄한 다음 단백질분해효소 저해제(protease inhibitor mixture; Roche Applied Science)가 들어 있는 RIPA 버퍼(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50mM TrisCl(pH 7.5))로 세포를 용해하였다. 상기 세포 용해물(cell lysate)을 소니케이터(Sonicator)로 분쇄한 후 단백질양을 정량한 다음, 동일한 양을 SDS-PAGE 방법으로 전기영동하고, ECL 니트로셀룰로오스 막(Amersham Biosciences)으로 옮겼다. 이를 AGR-2에 대한 1차 항체(1:1000 희석, loading control로는 tubulin 항체, Abnova, 대만)로 처리하고, 호오스래디시 퍼옥시다아제-부착 IgG(1:5000 희석, Santa Cruz, 미국)를 2차 항체로 처리하였다. 이를 ECL(enhanced chemiluminescence system, Amersham Biosciences)로 발색시켜 결 과를 확인하였다.

그 결과, 도 3 에서 보듯이, 정상 난소 조직에서는 AGR-2가 검출되지 않았으나 난소암 조직에서 AGR-2의 발현이 전체적으로 증가한 것으로 나타났다. 특히, 점액성(mucinous) 난소암에서 AGR-2의 발현양이 현저하게 높게 나타났으며, 장액성(serous) 난소암에서는 중간수준의 AGR2 단백질의 발현을 볼 수 있다.

< 실시예 4>

면역조직화학염색에 의한 난소암 조직에서 AGR -2의 발현 조사

난소암 조직에서 AGR-2의 발현을 면역조직화학염색(immunohistochemistry)으로 확인하였다. 점액성 난소암 조직을 10% 포름알데히드에 24시간 동안 고정하였다. 고정된 조직을 탈수시키고 파라핀 포매한 후 마이크로톰으로 슬라이스(4 )하고 슬라이스된 조직을 슬라이드에 부착시켰다. 그 다음 크실렌(xylene)을 이용하여 파라핀을 제거하고 100% 에탄올로 크실렌을 제거한 다음 PBS(phosphated buffered saline)로 세척하였다. 이를 내부의 퍼옥시다아제 활성을 억제하기 위하여 0.3% 과산화수소(hydrogen peroxide)가 포함된 PBS로 실온에서 5분간 처리하였다. 다시 10 mM 구연산 버퍼(pH 6.0)으로 10분간 2회 전자렌지에 넣은 다음 1차항체로서 AGR2 펩티드에 대한 다클론 토끼 항체 혈청(Abnova, dilution 1:250)을 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 음성 대조군으로 상기 혈청을 넣지 않은 것을 사용하였다. 그 다음 DAB(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 발색 후 헤마토실린(hematoxilin)으로 대비염색(counterstaining)하고 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 4에서 보듯이, 정상 조직에서도 기저 수준의 AGR2 단백질이 발현되나, 점액성 난소암 조직에서 그 발현양이 현저하게 증가함을 알 수 있었다(2 내지 8), 한편, 장액성 난소암의 경우 정상 조직과 점액성 난소암의 중간 수준으로 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(9 내지 14). 이러한 결과는 실시예 3에서 웨스턴 블롯을 이용하여 난소암에서 얻은 AGR2 발현결과와 유사한 결과이다.

< 실시예 5>

형광면역염색에 의한 난소암 세포주에서 AGR -2의 발현 조사

AGR-2는 세포내에만 존재하는 것이 아니고, 세포 밖으로 분비되는 단백질로 알려져 있다. 한편, 상기 AGR-2가 세포 밖으로 분비되기 위해서는 AGR-2가 세포질(Cytoplasm)에 주로 존재해야 한다. 이를 확인하기 위하여, 난소암 세포주인 2774 세포주를 AGR-2 항체로 면역형광염색하였다. 난소암 세포주 2774를 4-웰 챔버 슬라이드에서 배양한 후 4% 파라포름알데히드 용액[PBS에 용해된 4% 파라포름알데히드(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1.4 mM KH₂PO₄)으로 고정시킨 후 저온의 아세톤으로 처리하였다. 10% 고트 혈청으로 30분간 블록킹한 후 PBS에 1:100 으로 희석한 AGR-2 항체를 처리하고 알렉사 488(Sigma, 미국) 형광항체로 표지한 후 DAPI로 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰하였다. 또한, 세포 내 AGR-2의 위치를 컴퓨터로 분석하였다(http://psort. ims. u-tokyo. ac. jp)

그 결과, 도 5에서 보듯이, AGR-2는 인체 난소암세포주의 세포질에 위치하고 있음을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로 컴퓨터 분석 결과 44.4%가 세포외에 존재하고 22.2%가 세포질 및 미토콘드리아에 존재하며 11.1%가 세포골결 (사이토스켈레탈)에 존재하는 것으로 나타나 상기 AGR-2는 세포 밖으로 분비되는 형태의 단백질임을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6>

난소암 환자 혈청에서의 AGR -2 단백질의 검출

<6-1> AGR -2 단백질의 세포외 배출 여부 확인

AGR-2 단백질 서열에 대해서 SignalP 3.0 server program (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)으로 분석한 결과, 절단되는 20 아미노산 크기의 신호서열이 존재함을 알 수 있었다. 이에 세포 내에서의 위치를 확인한 결과, 세포질에 존재함을 알 수 있었다(도 3 및 도 4 결과), 아울러, 본 발명의 AGR-2 단백질이 세포 외부로 배출되는지 확인하기 위하여, AGR-2를 발현하는 2774 세포를 배양한 다음 배양액(CM, culture media) 및 세포 분해물(cell lysate)에 대 해서 AGR-2의 존재 여부를 상기 실시예 3의 방법에 따라 수행하여 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 세포 분해물과 마찬가지로 세포 배양액에서도 AGR-2가 검출됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 AGR-2가 세포에서 생성되어 세포 외부로 배출되는 단백질임을 나타낸다.

<6-2> 난소암 환자의 혈청에서 AGR -2 단백질의 검출

이에 난소암 환자의 혈청에서 AGR-2 단백질을 검출하여 난소암에 대한 진단 등의 목적으로 활용할 수 있는지를 확인하였다.

난소암 환자 또는 정상인의 혈청은 적절하게 통지하고, 동의를 얻은 상태에서 정맥천자(venipuncture)의 방법에 따라 얻었으며, 이 때, 난소암 및 양성 난소 종양 환자의 혈청은 난소를 외과적 제거를 하기 전에 얻은 것이다. 동의를 얻어 채취한 건강한 여성의 시료를 대조군으로 사용하였다. 혈청은 원심분리(3000 xg, 20 min)한 후 50ml로 분주하여 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.

혈청 내의 AGR-2 단백질을 검출하기 위하여 샌드위치 ELISA 분석 방법을 사용하였다. 다클론 AGR2 항체를 1xPBS 버퍼 하에서 96-웰 임모빌론 플레이트(96-well Immobilon plates)에 넣어 코팅하고 4℃에서 밤새 놓아 두었다. 세척한 다음, 플레이트를 0.05% Tween 20/2.5% BSA/ 1xPBS 용액에서 실온에서 1시간동안 블로킹 하였다. 환자 혈청을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간동안 반응시켰다. 결합하지 않은 항원 용액을 세척한 다음, 두 번째, 항-AGR2 단일클론 항체를 첨가한 다음 4시간 동안 반응시켰다. 결합하지 않은 항체를 세척한 다음, HRP-부착 염소 항-마우스 IgG(1:5000 희석)를 첨가하여 반응시켰다. 이를 세척한 다음 검출반응은 Super aqua blue ELISA substrate (eBioscience)를 이용하여 반응시켰으며, 반응은 0.5 M 황산을 첨가하여 종료시켰다. 플레이트를 405 nm 파장에서 Tunable microplate reader (Molecular Devices)로 읽고, SoftMax Pro v4.3 LS 소프트웨어(Molecular Devices)로 분석하였다.

그 결과, 도 7에서 보듯이, 건강한 여성의 혈청에 비해서 점액성 난소암 환자의 혈청에서 AGR-2 단백질이 수준이 높게 검출됨을 알 수 있었다(Kruskal-Wallis rank sum test (p < 0.0034)). 장액성 난소암 환자의 경우 건강한 여성의 경우와 큰 차이를 보이지 않았다.

따라서, 본 발명의 AGR-2는 난소암의 진단에 이용할 수 있으며, 특히, 점액성 난소암에 대해서는 혈청 내의 AGR-2의 수준을 측정함으로써 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 AGR-2는 난소암 조직에서만 특이적으로 과량 발현되며 난소암의 종류에 따라 발현양에 차이를 나타내는 단백질이므로 난소암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하기 위한 진단 마커로서 사용할 수 있다. 나아가, AGR-2가 세포 밖으로 분비되는 단백질이므로 혈액 내에서 AGR-2의 존재여부를 확인함으로써 난소암을 조기 진단할 수 있다.

도 1은 난소암 조직에서 AGR-2의 발현을 마이크로어레이를 이용하여 확인한 일 예이다.

도 2는 난소암 조직에서 AGR-2의 발현을 마이크로어레이를 이용하여 확인한 결과이다.

도 3은 난소암 조직에서 AGR-2의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.

도 4는 점액성 난소암 조직을 AGR-2 항체를 이용하여 면역조직화학염색한 후 현미경으로 관찰한 사진이다.(1: 정상 난소, 2 내지 4: 경계성 점액성 난소 종양, 5 내지 8: 점액성 난소 종양, 9: 경계성 장액성 난소 종양, 10 내지 14: 장액성 난소 종양, 15, 16: 전이암(metastatic cancer))

도 5는 인체 난소암 세포주를 AGR-2 항체를 이용하여 형광면역염색한 후 현미경으로 관찰한 사진이다.(control : 1차 항체를 넣지않고 형광염색한 결과, DAPI: DNA 염색한 결과, AGR2 : AGR-2 항체를 이용하여 형광염색한 결과, Merge : AGR2 항체를 이용한 형광염색결과와 DNA를 염색한 것을 합병한 결과)

도 6은 난소암 세포주에서 AGR-2를 발현시킨 후, 배양액(CM)과 세포 분해물(cell lysate)을 AGR-2 항체로 시간에 따라 웨스턴 블럿을 한 결과이다.

도 7은 난소암 환자에서 분리한 혈청에서 AGR-2 단백질의 발현수준을 샌드위치 ELISA 방법으로 확인한 것이다.

<110> Sungkyunkwan university foundation for cooperate collaboration <120> Novel use of AGR-2 for diagnosing ovarian carcinoma <130> NP08-0031 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Lys Ile Pro Val Ser Ala Phe Leu Leu Leu Val Ala Leu Ser 1 5 10 15 Tyr Thr Leu Ala Arg Asp Thr Thr Val Lys Pro Gly Ala Lys Lys Asp 20 25 30 Thr Lys Asp Ser Arg Pro Lys Leu Pro Gln Thr Leu Ser Arg Gly Trp 35 40 45 Gly Asp Gln Leu Ile Trp Thr Gln Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys 50 55 60 Ser Lys Thr Ser Asn Lys Pro Leu Met Ile Ile His His Leu Asp Glu 65 70 75 80 Cys Pro His Ser Gln Ala Leu Lys Lys Val Phe Ala Glu Asn Lys Glu 85 90 95 Ile Gln Lys Leu Ala Glu Gln Phe Val Leu Leu Asn Leu Val Tyr Glu 100 105 110 Thr Thr Asp Lys His Leu Ser Pro Asp Gly Gln Tyr Val Pro Arg Ile 115 120 125 Met Phe Val Asp Pro Ser Leu Thr Val Arg Ala Asp Ile Thr Gly Arg 130 135 140 Tyr Ser Asn Arg Leu Tyr Ala Tyr Glu Pro Ala Asp Thr Ala Leu Leu 145 150 155 160 Leu Asp Asn Met Lys Lys Ala Leu Lys Leu Leu Lys Thr Glu Leu 165 170 175 <210> 2 <211> 528 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggagaaaa ttccagtgtc agcattcttg ctccttgtgg ccctctccta cactctggcc 60 agagatacca cagtcaaacc tggagccaaa aaggacacaa aggactctcg acccaaactg 120 ccccagaccc tctccagagg ttggggtgac caactcatct ggactcagac atatgaagaa 180 gctctatata aatccaagac aagcaacaaa cccttgatga ttattcatca cttggatgag 240 tgcccacaca gtcaagcttt aaagaaagtg tttgctgaaa ataaagaaat ccagaaattg 300 gcagagcagt ttgtcctcct caatctggtt tatgaaacaa ctgacaaaca cctttctcct 360 gatggccagt atgtccccag gattatgttt gttgacccat ctctgacagt tagagccgat 420 atcactggaa gatattcaaa tcgtctctat gcttacgaac ctgcagatac agctctgttg 480 cttgacaaca tgaagaaagc tctcaagttg ctgaagactg aattgtaa 528 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 atggagaaaa ttccagtg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 ttacaattca gtcttcag 18 <210> 5 <211> 1701 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ccgcatccta gccgccgact cacacaaggc aggtgggtga ggaaatccag agttgccatg 60 gagaaaattc cagtgtcagc attcttgctc cttgtggccc tctcctacac tctggccaga 120 gataccacag tcaaacctgg agccaaaaag gacacaaagg actctcgacc caaactgccc 180 cagaccctct ccagaggttg gggtgaccaa ctcatctgga ctcagacata tgaagaagct 240 ctatataaat ccaagacaag caacaaaccc ttgatgatta ttcatcactt ggatgagtgc 300 ccacacagtc aagctttaaa gaaagtgttt gctgaaaata aagaaatcca gaaattggca 360 gagcagtttg tcctcctcaa tctggtttat gaaacaactg acaaacacct ttctcctgat 420 ggccagtatg tccccaggat tatgtttgtt gacccatctc tgacagttag agccgatatc 480 actggaagat attcaaatcg tctctatgct tacgaacctg cagatacagc tctgttgctt 540 gacaacatga agaaagctct caagttgctg aagactgaat tgtaaagaaa aaaaatctcc 600 aagcccttct gtctgtcagg ccttgagact tgaaaccaga agaagtgtga gaagactggc 660 tagtgtggaa gcatagtgaa cacactgatt aggttatggt ttaatgttac aacaactatt 720 ttttaagaaa aacaagtttt agaaatttgg tttcaagtgt acatgtgtga aaacaatatt 780 gtatactacc atagtgagcc atgattttct aaaaaaaaaa ataaatgttt tgggggtgtt 840 ctgttttctc caacttggtc tttcacagtg gttcgtttac caaataggat taaacacaca 900 caaaatgctc aaggaaggga caagacaaaa ccaaaactag ttcaaatgat gaagaccaaa 960 gaccaagtta tcatctcacc acaccacagg ttctcactag atgactgtaa gtagacacga 1020 gcttaatcaa cagaagtatc aagccatgtg ctttagcata aaagaatatt tagaaaaaca 1080 tcccaagaaa atcacatcac tacctagagt caactctggc caggaactct aaggtacaca 1140 ctttcattta gtaattaaat tttagtcaga ttttgcccaa cctaatgctc tcagggaaag 1200 cctctggcaa gtagctttct ccttcagagg tctaatttag tagaaaggtc atccaaagaa 1260 catctgcact cctgaacaca ccctgaagaa atcctgggaa ttgaccttgt aatcgatttg 1320 tctgtcaagg tcctaaagta ctggagtgaa ataaattcag ccaacatgtg actaattgga 1380 agaagagcaa agggtggtga cgtgttgatg aggcagatgg agatcagagg ttactagggt 1440 ttaggaaacg tgaaaggctg tggcatcagg gtaggggagc attctgccta acagaaatta 1500 gaattgtgtg ttaatgtctt cactctatac ttaatctcac attcattaat atatggaatt 1560 cctctactgc ccagcccctc ctgatttctt tggcccctgg actatggtgc tgtatataat 1620 gctttgcagt atctgttgct tgtcttgatt aacttttttg gataaaacct tttttgaaca 1680 gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1701

Claims (12)

1. AGR-2(Anterior Gradient-2) 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 점액성 난소암 진단용 키트.
2. 제1항에 있어서, 상기 AGR-2 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 키트.
3. AGR-2 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 점액성 난소암 진단용 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 AGR-2 핵산이 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 키트.
5. 제3항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 3과 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 키트.
6. 제3항에 있어서, 상기 프로브가 서열번호 2 또는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 키트.
7. 점액성 난소암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 AGR-2 단백질을 검출하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 AGR-2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 시료는 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
10. 삭제
11. (a) 시험물질을 AGR-2 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및

    (b) 상기 AGR-2 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 (a)의 시험물질이 상기 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 점액성 난소암 치료제의 스크리닝 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유전자의 발현 수준은 면역학적 분석법, 증폭반응 및 하이브리드화 반응으로 이루어진 군 중에서 선택된 방법에 의해 측정되는 것임을 특징으로 하는 방법.

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