KR101815253B1 - 간 섬유화 진단용 바이오마커 cxcl14 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위한 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 CXCL 14 (Chemokine (C-X-C motif) ligand 14) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물 및 키트 등에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 바이오마커로 사용함으로써 비침습적 방법으로 간 섬유화 또는 간 경화를 진단할 수 있으며, 보다 쉽고, 신속하며, 정확하게 간 섬유화 또는 간 경화 환자의 진단이 가능하다.

Description

간 섬유화 진단용 바이오마커 CXCL14{CXCL14 Biomarker for Diagnosing Liver Fibrosis}
본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위한 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 CXCL 14 (Chemokine (C-X-C motif) ligand 14) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물 및 키트 등에 관한 것이다.
간 섬유화는 독성 물질 또는 다양한 감염성, 면역성, 대사성 질환에 수반되는 생체 적응 반응의 일부로서, 손상된 간 조직이 정상적으로 복구되지 않고 섬유 조직과 같이 콜라겐 축적 등이 일어나는 상태를 말한다. 세포 외 기질인 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 당단백질, 및 프로테오글리칸 등의 과도한 축적을 특징으로 하며, 상기 축적물 중 주된 성분은 콜라겐, 특히 제1형 콜라겐이다 (Olaso E 등, Molecular regulation of hepatic fibrogenesis, J Hepatol 29:836-847-, 1998). 이러한 간 섬유화는 만성적인 간 손상에 수반되는 불가피한 간의 병리학적 결과로써, 생체 물질의 대사 또는 담즙분비 등 간의 고유 기능을 수행할 수 없는 섬유 조직으로 간이 대체된다는 점에서 간 기능의 저하(간 기능부전)가 필연적으로 나타난다. 간 섬유증은 가역적이고, 가느다란 소섬유(thin fibril)로 구성되며 결절(nodule) 형성이 없는 것으로 알려져 있어, 간의 손상 원인이 소실되면 정상으로 회복되는 것이 가능할 수 있다. 그러나, 섬유화 과정이 반복적으로 지속되면 ECM (extracellular matrix) 간의 교환, 결합이 증가하여 굵은 소섬유(thick fibril) 및 재생성 결절이 생성되는 비가역적인 간 경화로 진행될 수 있다.
또한, 간 섬유화 및 간 경화는 간암의 중요한 위험인자로서, 간암의 약 80%는 간 경화로 진행된 후에 발생하며, 섬유화 진행 정도에 따라 암 발병률이 최대 6배 이상 높아진다는 연구 결과가 보도된 바 있다. 이와 같이, 간 섬유화는 간 기능부전 및 말기 간질환에서 빈발하는 합병증의 근본 원인이 되며, 나아가 간암의 발생위험을 현저하게 증가시킨다.
상기와 같이 간 손상과 관련하여 간 섬유화 또는 간 경화가 진행되고 있는지에 따라 질환의 심각성, 예후의 진단이 달라지고, 간암의 예방에도 매우 중요한 역할을 하게 되므로, 간 섬유화 또는 간 경화를 조기에 정확히 진단하는 것이 매우 중요하다.
현재 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하는 표준 방법으로 간 생검(liver biopsy) 표본의 조직학적 검사를 사용하고 있는데, 이는 침습적 방법이라는 단점을 갖고 있다. 계속해서 증가하는 간 질환 환자들을 대상으로 모두 조직검사를 수행하는 것은 여러 가지 한계가 있고, 간 생검은 통증, 출혈 및 아주 드문 경우 사망에 이를 수도 있는 부작용이 있어, 항바이러스 치료 혹은 항섬유화 치료를 받고 있는 환자에 있어서 간 섬유화의 변화를 생검법으로 모니터링 하는 것은 적절하지 않다.
따라서 침습적인 간 생검을 대체할 수 있는 신뢰할만하고, 기관 특이적인 간 섬유화 또는 간 경화 진단 방법의 개발이 시급한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 간 섬유화를 유도한 마우스 및 간 경화 환자에서 CXCL14의 발현 정도를 측정하여, CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질이 비침습적으로 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 간 섬유화 또는 간 경화를 비침습적으로 진단하기 위한 신규 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.
보다 상세하게, 본 발명의 목적은 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 CXCL14를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 CXCL 14 (Chemokine (C-X-C motif) ligand 14) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게, 상기 CXCL14 단백질을 측정하는 제제는 CXCL14 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 항체는 CXCL14 단백질에 특이적인 단클론(monoclonal) 항체 또는 다클론(polyclonal) 항체일 수 있다.
바람직하게, 상기 CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 제제는 CXCL14 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물을 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 CXCL14를 검출하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 방법은, 환자의 시료로부터 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 상기 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 정상 대조군 시료 내 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 CXCL14 유전자의 mRNA 의 발현 정도를 측정하는 방법은 역전사 중합효소 연쇄반응, 경쟁적 역전사 중합효소 연쇄반응, 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 또는 DNA 칩에 의한 것일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 CXCL14 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테를로니 면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체고정 분석법, FACS (fluorescence activated cell sorter) 또는 단백질 칩에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 간 섬유화 또는 간 경화 치료제 후보물질을 처리한 후 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도의 변화를 검출하는 단계를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 간 섬유화 모델 및 간 경화 환자에서 CXCL14의 발현이 감소하는 것을 기초로, 환자 시료로부터 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정함으로써, 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 간 섬유화 환자에서 CXCL14 유전자의 mRNA 및 단백질의 발현 정도가 감소하는지 알아보기 위해, 간 섬유화 환자와 정상인의 간 조직 또는 혈청 시료에서 CXCL14의 발현 정도를 측정하고 비교하였다. 그 결과 간 섬유화 환자에서는 정상인에 비해 CXCL14 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 간 섬유화 환자들에 있어서 간 섬유화 병증이 진행에 따라 CXCL14의 발현이 유의적으로 점차 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 간 섬유화 또는 간 경화의 진단을 위해 CXCL14 유전자 또는 CXCL14 단백질을 바이오마커로 이용할 수 있고, 아울러, 간 경화 또는 섬유화의 진행 정도 (fibrosis grade)를 진단하기 위한 바이오마커로 CXCL14 유전자 또는 CXCL14 단백질을 이용할 수 있음을 입증하였다.
본원에서 용어, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 확인하는 것이다. 구체적으로, 환자의 시료에서 CXCL14 유전자 또는 CXCL14 단백질이 정상 대조군에 비해 저발현 되는지 여부를 확인하여 간 섬유화 또는 간 경화를 확인하는 것일 수 있고, 또한 만성 간염환자의 시료에서 CXCL14 유전자 또는 CXCL14 단백질이 저발현 되는지 여부를 확인하여 간 섬유화 또는 간 경화가 진행되고 있는지를 확인하는 것일 수 있다.
CXCL14 유전자는 염증반응 (immunoregulatory and inflammatory processes)에 관련된 유전자로서 항상성 (homeostasis)에 관여하는 것으로 알려져 있다. CXCL14 유전자 및 이의 단백질 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 확인할 수 있다. 보다 상세하게, 마우스 CXCL14의 유전자 서열은 NM_019568.2, 단백질 서열은 NP_062514.2로 등록되어 있다. 인간 CXCL14의 유전자 서열은 NM_004887.4, 단백질 서열은 NP_004878.2로 등록되어 있다. 그러나, CXCL14 유전자에 의해 발현되는 단백질의 기능은 아직 밝혀지지 않았으며, 특히, CXCL14와 간 섬유화 또는 간 경화와의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.
CXCL14의 발현 정도는 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 정도를 확인함으로써 알 수 있다.
본 발명에서 "CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도 측정"이란 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 CXCL14 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, CXCL14 유전자의 mRNA 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, 역전사 중합효소연쇄반응), 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏 (Northern blot) 및 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 제제는, 환자의 시료 내에서 CXCL14 유전자의 mRNA를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, CXCL14 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 (primer), 프로브 (probe), 안테센스 올리고뉴클레오티드 (antisense oligonucleotide) 등이 될 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 CXCL14 유전자의 mRNA 염기 서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.
이때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링 (annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 CXCL14 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적 (substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
일예로, 본원의 CXCL14 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드" 는 타겟으로 하는 CXCL14 유전자의 mRNA 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 CXCL14 유전자의 mRNA와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, 본원의 CXCL14 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있다.
다른 일예로, 본원의 CXCL14 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는 프라이머 (primer) 쌍 또는 프로브 (probe)이며, CXCL14 유전자의 염기서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플릿 (template)과 염기 쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플릿 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머라제(polymerase) 또는 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산 (nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성)이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 CXCL14 염기서열의 센스 (sense) 및 안티센스 (antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 간 섬유화 또는 간 경화를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 프라이머는 CXCL14 유전자의 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.
다른 일예로, 본원의 CXCL14 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 프로브일 수 있다. 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling) 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 CXCL14 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 간 섬유화 또는 간 경화를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "단백질 발현 정도 측정"이란 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 CXCL14 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, CXCL14 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏 (Western blot), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테를로니 면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), FACS (fluorescence activated cell sorter) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서 CXCL14 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 CXCL14 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, CXCL14 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝 (cloning)하여 상기 CXCL14 유전자에 의해 코딩되는 CXCL14 단백질을 얻고, 얻어진 CXCL14 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 CXCL14 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 (light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄 (heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물은, 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커인 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 CXCL14 단백질의 발현 정도를 확인할 수 있다. 본 발명의 키트에는 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 CXCL14 단백질의 발현 정도를 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 선택적으로 CXCL14 단백질을 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, CXCL14 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너 (container), 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩 (DNA chip)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 CXCL14 단백질의 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 또는 OPD (o-phenylenediamine), TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)가 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 CXCL14를 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, CXCL14 유전자의 발현 정도를 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 환자의 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 "환자의 시료"란 간 섬유화 또는 간 경화 마커 유전자인 CXCL14의 발현 정도가 차이나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 검출 방법들을 통하여, 간 섬유화 또는 간 경화 의심환자에서의 CXCL14 의 발현 정도를 정상 대조군에서의 CXCL14 발현 정도와 비교함으로써 해당 환자의 실제 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 진단할 수 있다. 즉, 간 섬유화 또는 간 경화로 추정되는 환자의 CXCL14 발현 정도를 측정하고, 정상 대조군의 CXCL14 발현 정도를 측정하여 양자를 비교한 후, CXCL14의 발현 정도가 정상 대조군의 것보다 간 섬유화 또는 간 경화로 추정되는 환자에서 더 적게 발현되면 간 섬유화 또는 간 경화로 추정되는 환자를 간 섬유화 또는 간 경화로 진단할 수 있는 것이다.
또는, 만성 간염 환자가 간 경화로 발전했는지를 확인하기 위하여, 만성 간염 환자의 시료로부터 CXCL14 발현 정도의 변화를 측정하여, CXCL14 발현의 유의적인 감소가 측정되는 경우 해당 만성 간염 환자가 간 경화로 발전한 것으로 진단할 수 있다.
CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소 연쇄반응, 경쟁적 역전사 중합효소 연쇄반응, 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 또는 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도와 간 섬유화 또는 간 경화 의심환자에서의 CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도를 비교할 수 있고, CXCL14 유전자의 mRNA로의 유의한 발현량의 감소 여부를 판단하여 간 섬유화 또는 간 경화 의심 환자의 실제 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 진단할 수 있다.
CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도 측정은 바람직하게는, 간 섬유화 또는 간 경화 마커인 CXCL14 유전자의 mRNA에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사 효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
상기의 역전사 중합효소연쇄반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 CXCL14 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 비침습적으로 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 간편하게 진단할 수 있다.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테를로니 면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법, 보체고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간 섬유화 또는 간 경화 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, CXCL14 단백질의 유의한 발현량의 감소 여부를 판단하여, 간 섬유화 또는 간 경화 의심 환자의 실제 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 진단할 수 있다.
본원에서 "항원-항체 복합체"란 간 섬유화 또는 간 경화 마커인 CXCL14 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 (redox) 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8,[Os(bpy)3]2+,[RU(bpy)3]2+,[MO(CN)8]4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
일 구체예로, 단백질 발현 정도 측정은 ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 간 섬유화 또는 간 경화 마커인 CXCL14 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 간 섬유화 또는 간 경화 발병 여부를 확인할 수 있다.
바람직하게는, CXCL14 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 CXCL14 단백질의 양을 확인하여, 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 CXCL14 유전자의 발현량과 간 섬유화 또는 간 경화 의심 환자에서의 CXCL14 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. CXCL14 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 CXCL14 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, CXCL14 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 간 섬유화 또는 간 경화 발병 여부를 확인할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화를 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 CXCL14 유전자의 발현 정도 또는 CXCL14 유전자가 코딩하는 CXCL14 단백질의 발현 정도를 측정하는 것을 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 CXCL14의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 간 섬유화 또는 간 경화 치료제를 스크리닝하는 데 유용하게 사용할 수 있다. CXCL14의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 간 섬유화 또는 간 경화의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 간섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질의 부재 하에 간 섬유화 또는 간 경화 세포에서의 CXCL14의 발현 정도를 측정하고, 또한 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 CXCL14의 발현 정도를 측정하여 양자를 비교한 후, 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질이 존재할 때의 CXCL14의 발현 정도가 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질의 부재 하에서의 CXCL14 발현 정도보다 감소시키는 물질을 간 섬유화 또는 간 경화의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.
본 발명은 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질을 바이오마커로 사용함으로써 비침습적 방법으로 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하는 기술을 제공하며, 이를 이용하면, 보다 용이하고 신속, 정확하게 간 섬유화 또는 간 경화 환자의 진단이 가능하다.
도 1은 간 섬유화 환자와 정상인의 간 조직에서 간 섬유화 진행 경과에 따라 CXCL14 유전자의 mRNA 발현 수준의 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 간 섬유화 환자와 정상인의 혈청(serum)에서 간 섬유화 진행 경과에 따라 CXCL14 단백질 발현 수준의 변화를 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 3은 간 섬유화 환자의 섬유화 정도에 따라 등급 (Mild, Advanced)을 나누고, 환자의 혈청에서 CXCL14 단백질 발현 수준의 변화를 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 4는 간 섬유화 환자에 있어서 간 문맥 염증 (portal inflammation) 정도에 따라 CXCL14 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 간 섬유화 환자에 있어서 조각 괴사 (piecemeal necrosis) 정도에 따라 CXCL14 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
이하에서는, 본 발명의 바람직한 실시예를 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명하기로 한다. 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 환자 샘플
본 실험에는 간 섬유화 환자(F1, F3, F4) 15명과 섬유화가 없는 사람(F0) 5명의 간 조직을 가톨릭 대학교 서울성모병원에서 제공 받아 본 실험에 사용하였으며, 간 섬유화 정도 (fibrosis grade)에 따라 F0, F1, F3, F4 환자 각각 5명의 시료가 사용되었다.
또한, 더 많은 수의 시료를 통해 CXCL14의 발현을 검증하기 위하여 만성 B형 간염으로 조직검사를 시행한 환자 78명 (남자 56명, 여자 22명)의 혈청을 실험에 사용하였다. 혈청을 획득한 만성 B형 간염 환자는 0기(stage 0)가 5명, 1기(stage 1)가 36명, 3기(stage 3)가 29명, 4기(stage 4)가 8명이었다.
실시예 2. 간 섬유화 바이오마커 후보 유전자 선별
간 섬유화 유도 동물 (DEN induced rat) 모델에서 콜라겐 2단계 관류(collagen two-step perfusion) 방법을 이용하여 간세포를 분리하였고, 분리된 간세포에서 TRISOL을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 Bianalyer를 이용하여 RNA quality control을 수행하였고, RIN (RNA integrity number) 값 8.0 이상의 RNA만을 마이크로어레이 (microarray)에 사용하였다. Rat gene expression 4x44k 마이크로어레이 키트를 이용하여 마이크로어레이를 수행하여 차별 발현하는 유전자를 획득하고, 문헌 조사를 통해 간 섬유화 진단용 바이오마커로서 가능성이 있는 유전자를 선별하였으며, 그 중 CXCL14 유전자의 발현 변화에 대해 보다 상세히 살펴보았다.
실시예 3. CXCL14 유전자의 간 조직에서 mRNA 발현 정도 측정
간 섬유화 환자에서 CXCL14 유전자의 발현 정도를 확인하기 위하여, 각 단계 별(stage 1, stage 3, stage 4)로 11명의 환자와 섬유화가 없는 사람(stage 0) 5 명 등 총 38명의 간 조직에서 간 섬유화 정도에 따라 mRNA 발현 변화를 측정하였다. 구체적으로, TRIZOL을 이용하여 RNA를 추출 한 뒤, ImProm II RTase를 사용하여 RNA를 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 기반으로 하여 CXCL14을 타겟으로 하는 프라이머(CXCL14 Forward: 5’-GCGCAGGGTCTACGAAGAAT-3’, CXCL14 Reverse: 5’-CAGGACCTCTAAGCGGAAGC-3’)와 함께 PCR을 통해 CXCL14의 발현 정도를 측정하였다. PCR 결과를 도 1A에 나타내었으며, PCR 밴드 밀도(band density)를 측정하여 그래프로 환산한 결과를 도 1B에 나타내어 비교 분석 하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 간 섬유화 정도가 증가함에 따라 CXCL14 mRNA의 발현이 감소함을 확인하였다.
실시예 4. CXCL14 유전자의 혈청에서 단백질 발현 정도 측정 (ELISA)
간 섬유화 환자에서 CXCL14 단백질의 발현 정도를 확인하기 위하여, 간 섬유화 환자 43명과 섬유화가 없는 사람5명(Stage 0: 5명, 1: 20명, 3: 18명, 4: 5명)의 혈청 시료에서 간 섬유화 정도에 따라 CXCL14단백의 발현 변화를 측정하였다. 구체적으로, 각 사람으로부터 혈액을 채취하고 원심분리기를 이용하여 12000 rpm으로 15 분간 원심 분리하여 혈청만을 획득하여 실험의 재료로 사용하였다. CXCL14의 capture Ab를 PBS에 희석하여 Nunc 96 well maxisorp plate에 하룻밤 동안 코팅하여 주었다. 다음날 원심분리 한 혈청을 사용하여 ELSIA방법을 통해 혈청 내의CXCL14의 농도를 측정하였다.
간섬유화 정도는 노델 조직학적 활성 지수 (Knodell histologic activity index)에서 사용되는 간섬유화 등급을 이용하였다. 이 간섬유화 등급은 간섬유화 정도를 4등급 (stage 0 : 섬유화 없음, stage 1 : 문맥 주위 확장, stage 3 : 가교상 섬유화, stage 4 : 간경변증)의 4등급으로 나누고, 혈청 CXCL14 농도와 간섬유화 정도 사이 관계는 스피어먼 상관 검정 (Spearman’s correlation test)을 사용하여 상관관계를 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 간 섬유화 정도가 증가함에 따라 CXCL14 단백질의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다 (p value ≤ 0.05).
실시예 5. 간 섬유화 진행 정도에 따른 CXCL14 단백질 발현 측정
간 섬유화 환자의 병증 진행 정도에 따라 CXCL14의 발현 변화를 확인하기 위하여, 간 섬유화 환자를 간섬유화 등급 0과 1을 경증 섬유화군 (mild fibrosis), 간섬유화 등급 3과 4 를 진행성 섬유화군 (advanced fibrosis)로 정의하고, 두 군 사이 혈청 내의CXCL14의 농도를 만-휘트니 검정 (Mann-Whitney’s test)을 이용하여 비교하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 경증 환자군에 비하여 중증 환자군에서 CXCL14 단백질의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다 (p value ≤ 0.05).
실시예 6. 간 문맥 염증 (portal inflammation) 정도에 따른 CXCL14 발현
간 섬유화 환자를 간 문맥 염증 (portal inflammation) 정도에 따라 등급을 매기고 각각의 환자군에서 CXCL14 발현 수준을 비교하였다. 구체적으로, 노델 조직학적 활성 지수 (Knodell histologic activity index)의 4가지 요소 중 한 가지가 문맥 염증 (portal inflammation) 정도이며, 4단계 (0 : 염증 없음, 1 : 경도 염증, 3 : 중등도 염증, 4 : 심한 염증)로 나누었다. 그 후, 혈청 내의 CXCL14 농도와 문맥 염증 정도 사이의 상관 관계를 스피어먼 상관 검정 (Spearman’s correlation test)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 간 문맥 염증 정도가 증가함에 따라 CXCL14 단백질의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다 (p value ≤ 0.05).
실시예 7. 조각 괴사 (piecemeal necrosis) 정도에 따른 CXCL14 발현
간 섬유화 환자를 조각 괴사 (piecemeal necrosis) 정도에 따라 등급을 매기고 각각의 환자군에서 CXCL14 발현 수준을 비교하였다. 구체적으로, 노델 조직학적 활성 지수 (Knodell histologic activity index)의 4가지 요소 중 한 가지는 조각괴사 정도이며, 이는 괴사 정도에 따라 7 단계 (0 : 없음, 1 : 경도 괴사, 3 : 중등도 괴사, 4 : 심한 괴사, 5 : 중등도 괴사 + 가교상 괴사(bridging necrosis), 6 : 심한 조각괴사 + 가교상 괴사, 10 : 다결절 괴사)로 분류하고, 괴사 정도와 혈청 내의 CXCL14 농도 사이 관계는 스피어먼 상관 검정 (Spearman’s correlation test)을 이용하여 상관관계를 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 조각 괴사 정도가 증가함에 따라 CXCL14 단백질의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다 (p value ≤ 0.05).
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> CXCL14 Biomarker for Diagnosing Liver Fibrosis <130> PB15-12811 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL14 Forward <400> 1 gcgcagggtc tacgaagaat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL14 Reverse <400> 2 caggacctct aagcggaagc 20

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  6. 환자의 시료로부터 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 정도를 측정하는 단계;
    상기 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 대조군 시료 내 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 정도와 비교하는 단계; 및
    상기 환자 시료 내 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도가 대조군 발현 정도보다 감소한 경우 간 섬유화 또는 간 경화가 진행된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단을 위한 정보제공 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단을 위한 정보제공 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 CXCL14 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 방법은 역전사 중합효소 연쇄반응, 경쟁적 역전사 중합효소 연쇄반응, 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 또는 DNA 칩에 의한 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 CXCL14 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테를로니 면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법, 보체고정 분석법, FACS (fluorescence activated cell sorter) 또는 단백질 칩에 의한 것인 방법.
  10. 간 섬유화 또는 간 경화 치료제 후보 물질을 처리한 후 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도의 변화를 검출하는 단계; 및
    상기 후보 물질을 처리한 후 CXCL14 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현이 증가하는 경우 간 섬유화 또는 간 경화 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 치료제의 스크리닝 방법.
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Journal of Hepatology, (2015.04.), vol. 63, pp 609-621.*

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