KR101515210B1

KR101515210B1 - 간 섬유화 진단용 바이오마커 elk3

Info

Publication number: KR101515210B1
Application number: KR1020130089862A
Authority: KR
Inventors: 윤승규; 리천주; 허원희; 김성민; 김성우
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2015-04-27
Also published as: KR20150014579A

Abstract

본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위한 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 또한, 간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 ELK3 를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

간 섬유화 진단용 바이오마커 ELK3 {Biomaker ELK3 for diagnosing liver fibrosis}

본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위한 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 ELK3(member of ETS oncogene family) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 또한, 간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 ELK3 를 검출하는 방법에 관한 것이다.

간질환은 질병 원인에 따라 바이러스로 인한 간질환, 과음으로 인한 알코올성 간질환, 약물 독성으로 인한 간질환, 인체 면역 계통의 이상으로 인한 자가면역성 간질환, 독성 물질이 과다하게 쌓여서 생기는 대사성 간질환 및 기타원인이 불분명한 간질환으로 구분된다. 이와 같이 간 손상의 원인은 알코올, B형 또는 C형 간염 바이러스, 면역 체계의 손상, 담즙, 약물 중독, 나이, 기생충 등 다양하지만, 초기에 완치시키지 못하고 B형 간염, C형 간염, 알코올 등과 같은 만성적인 간 손상이 오게 되면 간성상세포(hepatic stellate cell)는 TGF-β와 같은 만성적인 염증 매개체(inflammation mediator)에 의해 활성화(activation)되면서 근섬유아세포(myofibroblast)로 분화된다. 분화된 근섬유아세포는 콜라겐(collagen)과 같은 세포 외기질(extracellular matrix, ECM)을 분비하게 되면서 간 구조를 재건하게 되고 간 섬유화가 일어나게 된다. 결국 원인과는 무관하게 공통적으로 간 섬유화(liver fibrosis) 내지 간 경화(liver cirrhosis)에 이르게 되는 것이다. 간 섬유화가 더 진행이 되면 간 경화, 더 나아가서 간암까지 진행된다고 알려져 있다.

간 섬유화은 독성 물질 또는 다양한 감염성, 면역성, 대사성 질환에 수반되는 생체 적응 반응의 일부로서, 손상된 간 조직이 정상적인 간세포로 복구되지 않고 콜라겐과 같은 섬유 조직으로 변형된 상태를 말한다. 세포외 기질인 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 당단백질, 및 프로테오글리칸 등의 과도한 축적을 특징으로 하며, 상기 축적물 중 주된 성분은 콜라겐, 특히 제1형 콜라겐이다 (Olaso E 등, Molecular regulation of hepatic fibrogenesis, J Hepatol 29:836-847-, 1998). 이러한 간 섬유화는 만성적인 간 손상에 수반되는 불가피한 간의 병리학적 결과로써, 생체 물질의 대사 또는 담즙분비 등 간의 고유 기능을 수행할 수 없는 섬유 조직으로 간이 대체된다는 점에서 간 기능의 저하(간 기능부전)가 필연적으로 나타난다. 간 섬유증은 가역적이고, 가느다란 소섬유(thin fibril)로 구성되며 결절(nodule) 형성이 없는 것으로 알려져 있어, 간의 손상 원인이 소실되면 정상으로 회복되는 것이 가능할 수 있다. 그러나, 섬유화 과정이 반복적으로 지속되면 ECM 간의 교환, 결합이 증가하여 굵은 소섬유(thick fibril) 및 재생성 결절이 생성되는 비가역적인 간 경화로 진행될 수 있다.

또한, 간 섬유화 및 간 경화는 간암의 중요한 위험인자로서, 간암의 약 80%는 간 경화로 진행된 후에 발생하며, 섬유화 진행 정도에 따라 암 발병률이 최대 6배 이상 높아진다는 연구 결과가 보도된 바 있다. 이와 같이, 간 섬유화는 간 기능부전 및 말기 간질환에서 빈발하는 합병증의 근본 원인이 되며, 나아가 간암의 발생위험을 현저하게 증가시킨다.

이와 같이, 간 손상과 관련하여 간 섬유화 또는 간 경화가 진행되고 있는지에 따라 질환의 심각성, 예후의 진단이 달라지고, 간암의 예방에도 매우 중요한 역할을 하게 되므로, 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하는 것이 매우 중요하다.

최근 보고에 의하면 간 섬유화와 관련하여 새로운 기전인 상피세포의 중간 엽세포로의 전환(epithelial mesenchymal transition, EMT)를 통하여서도 간 섬유화가 유발된다고 한다. EMT는 상피성(epithelial) 세포가 표현형을 상실하고 이동성이 높은 중간엽성(mesenchymal) 세포 표현형으로 전환하는 것인데, EMT가 일어나게 되면 N-카데린(N-cadherin), 비멘틴(vimentin)과 같은 마커(marker)들이 증가하게 되고, E-카데린(E-cadherin)과 같은 마커들이 감소하게 되며 또한 이동(migration)과 침투(invasion)가 증가하게 된다.

또한, 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하는 표준 방법으로 간 생검(liver biopsy) 표본의 조직학적 검사를 수행하는데, 이는 침습적이라는 점에서 단점을 갖고 있다. 현재 점차 증가되고 있는 간 섬유화 또는 간 경화 환자들을 모두 조직검사를 하는 것은 한계가 있고, 간 생검은 통증, 출혈 및 아주 드문 경우 사망에 이르는 부작용이 있어, 항바이러스 치료 혹은 항섬유화 치료를 받고 있는 환자에 있어서 간 섬유화의 변화를 간 생검으로 모니터링 하는 것은 적절하지 않다.

따라서 침습적인 간 생검을 대체할 수 있는 신뢰할만하고, 기관 특이적(organ specific)으로, 간 섬유화 또는 간 경화를 진단할 수 있는 도구 혹은 방법의 개발이 시급한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 고지방 식이를 통하여 간 섬유화를 유도한 마우스 및 간 경화 환자에서 ELK3의 발현 정도를 측정하여, ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질이 비침습적으로 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 간 섬유화 또는 간 경화를 비침습적으로 진단하기 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.

보다 상세하게, ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 ELK3를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은, ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 ELK3 단백질을 측정하는 제제는 ELK3 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 항체는 ELK3 단백질에 특이적인 단클론(monoclonal) 항체 또는 다클론(polyclonal) 항체일 수 있다.

바람직하게, 상기 ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 제제는 ELK3 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물을 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 키트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 ELK3를 검출하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 방법은, 환자의 시료로부터 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 상기 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 정상 대조군 시료 내 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 ELK3 유전자의 mRNA 의 발현 정도를 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 ELK3 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 간 섬유화 또는 간 경화 치료제 후보물질을 처리한 후 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 간 섬유화 모델 및 간 경화 환자에서 ELK3가 과발현되는 것을 기초로, 환자 시료로부터 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정함으로써, 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 간 섬유화 모델에서 ELK3 유전자의 mRNA 및 이의 단백질의 발현 정도가 증가하는지 알아보기 위해, 마우스의 정상 간 세포주(Mouse normal hepatocyte cell line)인 FL83B 세포에 염증 매개체인 TGF-β1을 주입하여 EMT를 통하여 간 섬유화 또는 간 경화를 유도하였다. 우선, 간세포(hepatocyte)의 형태적인 변화, 상피 마커(epithelial)인 E-cadherin의 발현 정도, 중간엽성(mesenchymal) 마커인 N-cadherin과 α-sma의 발현 정도를 웨스턴 블랏(western blot)으로 측정하여, EMT를 통한 간 섬유화 또는 간 경화를 확인하여 in vitro EMT 모델을 확립하였다. 확립된 in vitro EMT 모델에서 ELK 유전자의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 통해 확인하였고, ELK3 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Balb/c 마우스에 간에 독성을 일으키는 표본물질인 사염화탄소(CCl₄ _-)를 복강 주사하여 간 섬유화 또는 간 경화를 유도하였다. 상피 마커인 E-cadherin과 β-catenin의 발현 정도 및 중간엽성(mesenchymal) 마커인 α-sma의 발현 정도를 측정하여, 간 섬유화를 확인하여 in vivo 간 섬유화 모델을 확립하였다. 또한, 확립된 in vivo 간 섬유화 모델에서 ELK3 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.

그 결과, 간 섬유화가 일어난 세포 및 마우스 모델에서 E-cadherin과 β-catenin의 발현은 감소하였고, N-cadherin과 α-sma의 발현은 증가하는 것을 확인하였다. 또한, ELK3 유전자의 mRNA 및 ELK3 단백질의 발현이 간 섬유화 또는 간 경화가 일어난 세포 및 마우스에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 2 내지 도4).

나아가, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 간 섬유화에 대한 ELK3 의 특이적 발현 증가가 임상에서도 나타난다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 만성 B형 간염환자와 간 경화 환자의 간 조직에서 상피 마커인 E-cadherin 발현 정도를 정상 간 조직과 비교하였는데, 만성 B형 간염 환자 간 조직에서는 정상 간 조직에 비해 E-cadherin이 비슷하게 발현되었지만 간 경화 환자 간 조직에서는 정상 간 조직에 비해 E-cadherin의 발현은 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 5). 따라서, 만성 B형 간염이 진행되고 악화되어 간 경화로 진행되는 것으로, 만성 B형 간염과 간 경화가 ELK3 발현 정도에 의해 구별될 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 바이오마커인 ELK3 발현 정도를 정상 간 조직과 비교하였는데, 만성 B형 간염 환자 간 조직에서는 정상 간 조직에 비해 ELK3는 비슷하게 발현되었지만 간 경화 환자 간 조직에서는 정상 간 조직에 비해 ELK3의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 5). 이를 통해, 만성 B형 간염이 진행되어 간 경화가 진행되면 ELK3의 발현이 증가함을 확인하여, ELK3를 만성 B형 간염과 간 경화를 구별할 수 있는 바이오마커로도 사용할 수 있음을 입증하였다.

따라서, 간 섬유화 또는 간 경화의 진단을 위해 ELK3 유전자 또는 ELK3 단백질을 바이오마커로 이용할 수 있고, 아울러, 만성 간염에서 간 경화로 진행되는지 여부를 확인하기 위한 바이오마커로 ELK3 유전자 또는 ELK3 단백질을 이용할 수 있음을 입증하였다.

본원에서 용어, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 확인하는 것이다. 구체적으로, 환자의 시료에서 ELK3 유전자 또는 ELK3 단백질이 정상 대조군에 비해 과발현되는지 여부를 확인하여 간 섬유화 또는 간 경화를 확인하는 것일 수 있고, 또한, 만성 간염환자의 시료에서 ELK3 유전자 또는 ELK3 단백질이 과발현되는지 여부를 확인하여 간 섬유화 또는 간 경화가 진행되고 있는지를 확인하는 것일 수 있다.

ELK3 유전자는 ETS(E-twenty six) 영역(domain)에 속하는 유전자 군을 구성하는 하나의 유전자로 알려져 있다. ETS 영역은 나선 대 나선 결합구조(helix-to-helix motif)를 형성하여 DNA 결합영역으로 기능한다. ELK3 유전자로부터 ELK3 단백질이 만들어진다. ELK3 단백질은 인산화(phosphorylation)에 의해 활성화되고, 마우스를 통한 연구에서 Ras 존재 시 전사를 활성화시키며, Ras가 존재하지 않는 경우 전사를 억제하는 것으로 알려졌다. ELK3 유전자 및 이의 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 확인할 수 있다. 보다 상세하게, 마우스 ELK3의 유전자 서열은 NM_205536, 단백질 서열은 NP_991099로 등록되어 있다. 인간 ELK3의 유전자 서열은 NM_005230, 단백질 서열은 NM_005221로 등록되어 있다. 그러나, ELK3와 간 섬유화 또는 간 경화와의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.

ELK3의 발현 정도는 ELK3 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 정도를 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명에서 "ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도 측정"이란 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 ELK3 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, ELK3 유전자의 mRNA 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 제제는, 환자의 시료 내에서 ELK3 유전자의 mRNA를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, ELK3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머(primer), 프로브(probe), 안테센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide) 등이 될 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 ELK3 유전자의 mRNA 염기 서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.

이때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링(annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 ELK3 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

일예로, 본원의 ELK3 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 는 타겟으로 하는 ELK3 유전자의 mRNA 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 ELK3 유전자의 mRNA와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, 본원의 ELK3 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있다.

다른 일예로, 본원의 ELK3 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)이며, ELK3 유전자의 염기서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 ELK3 염기서열의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 간 섬유화 또는 간 경화를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 프라이머는 ELK3 유전자의 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.

다른 일예로, 본원의 ELK3 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 프로브일 수 있다. 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling) 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 ELK3 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 간 섬유화 또는 간 경화를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "단백질 발현 정도 측정"이란 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 ELK3 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, ELK3 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에서 ELK3 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 ELK3 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, ELK3 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 상기 ELK3 유전자에 의해 코딩되는 ELK3 단백질을 얻고, 얻어진 ELK3 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 ELK3 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물은, 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다.

본 발명의 키트는 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커인 ELK3 유전자의 mRNA 또는 ELK3 단백질의 발현 정도를 확인할 수 있다. 본 발명의 키트에는 ELK3 유전자의 mRNA 또는 ELK3 단백질의 발현 정도를 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 선택적으로 ELK3 단백질을 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, ELK3 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너(container), 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩(chip)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 ELK3 단밸질의 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 ELK3를 검출하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로는, ELK3 유전자의 발현 정도를 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 환자의 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 "환자의 시료"란 간 섬유화 또는 간 경화 마커 유전자인 ELK3의 발현 정도가 차이나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출 방법들을 통하여, 간 섬유화 또는 간 경화 의심환자에서의 ELK3 의 발현 정도를 정상 대조군에서의 ELK3 발현 정도와 비교함으로써 해당 환자의 실제 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 진단할 수 있다. 즉, 간 섬유화 또는 간 경화로 추정되는 환자의 ELK3 발현 정도를 측정하고, 정상 대조군의 ELK3 발현 정도를 측정하여 양자를 비교한 후, ELK3의 발현 정도가 정상 대조군의 것보다 간 섬유화 또는 간 경화로 추정되는 환자에서 더 많이 발현되면 간 섬유화 또는 간 경화로 추정되는 환자를 간 섬유화 또는 간 경화로 진단할 수 있는 것이다.

또는, 만성 간염 환자가 간 경화로 발전했는지를 확인하기 위하여, 만성 간염 환자의 시료로부터 ELK3 발현 정도의 변화를 측정하여, ELK3 발현의 유의적인 증가가 측정되는 경우 해당 만성 간염 환자가 간 경화로 발전한 것으로 진단할 수 있다.

ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사 효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사 효소 중합효소반응, 실시간 역전사 효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도와 간 섬유화 또는 간 경화 의심환자에서의 ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도를 비교할 수 있고, ELK3 유전자의 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 간 섬유화 또는 간 경화 의심 환자의 실제 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 진단할 수 있다.

ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도 측정은 바람직하게는, 간 섬유화 또는 간 경화 마커인 ELK3 유전자의 mRNA에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사 효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사 효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 ELK3 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 비침습적으로 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간 섬유화 또는 간 경화 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, ELK3 단백질의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 간 섬유화 또는 간 경화 의심 환자의 실제 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 진단할 수 있다.

본원에서 "항원-항체 복합체"란 간 섬유화 또는 간 경화 마커인 ELK3 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스(redox) 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄W(CN)₈, [Os(bpy)₃]2⁺, [RU(bpy)₃]2⁺, [MO(CN)₈]4^- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

일 구체예로, 단백질 발현 정도 측정은 ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 간 섬유화 또는 간 경화 마커인 ELK3 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 간 섬유화 또는 간 경화 발병 여부를 확인할 수 있다.

바람직하게는, ELK3 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 ELK3 단백질의 양을 확인하여, 간 섬유화 또는 간 경화 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 ELK3 유전자의 발현량과 간 섬유화 또는 간 경화 의심 환자에서의 ELK3 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. ELK3 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 ELK3 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, ELK3 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 간 섬유화 또는 간 경화 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화를 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 ELK3 유전자의 발현 정도 또는 ELK3 유전자가 코딩하는 ELK3 단백질의 발현 정도를 측정하는 것을 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 ELK3의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 간 섬유화 또는 간 경화 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. ELK3의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 간 섬유화 또는 간 경화의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질의 부재 하에 간 섬유화 또는 간 경화 세포에서의 ELK3의 발현 정도를 측정하고, 또한 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 ELK3의 발현 정도를 측정하여 양자를 비교한 후, 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질이 존재할 때의 ELK3의 발현 정도가 간 섬유화 또는 간 경화 치료 후보 물질의 부재 하에서의 ELK3 발현 정도보다 감소시키는 물질을 간 섬유화 또는 간 경화의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.

본 발명은 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질을 바이오마커로 사용함으로써 비침습적 방법으로 간 섬유화 또는 간 경화를 진단하는 기술을 제공하며, 이를 이용하면, 보다 용이하고 신속, 정확하게 간 섬유화 또는 간 경화 환자의 진단이 가능하다.

본원 도면에서"Control 48h"는 TGF-β1을 처리하지 않은 대조군에서 48시간 경과 후 FL83B 세포를 나타내고, "TGF-β 48h"는 TGF-β1을 처리하고 48시간 경과 후 FL83B 세포를 나타낸다.
도 1은 FL83B 세포에 TGF-β1를 처리하여 세포의 형태 변화를 확인한 것이다.
도 2는 FL83B 세포에 TGF-β1를 처리하여 EMT 관련 마커인 E-cadherin, N-cadherin, α-sma, ELK3 단백질 및 대조군으로 β-actin의 발현을 웨스턴 블랏(Western Blot)으로 확인한 것이다.
도 3은 FL83B 세포에 TGF-β1를 처리하여 ELK3 유전자의 mRNA와 대조군으로 β-actin 유전자의 mRNA 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)로 확인한 것이다.
도 4는 CCl4를 복강 주사한 마우스에서 EMT 관련 마커인 E-cadherin, β-catenin, α-sma, ELK3 단백질 및 대조군으로 β-actin의 발현을 웨스턴 블랏(Western Blot)으로 확인한 것이다. "Normal"은 CCl₄를 복강 주사하지 않은 마우스를 나타내고, "CCl₄ 8wk"는 CCl4를 복강 주사하고 8주 후의 마우스를 나타낸다.
도 5는 만성 B형 간염(chronic hepatitis B)과 간 경화(liver cirrhosis) 환자에서의 EMT 관련 marker인 E-cadherin 및 ELK3의 단백질 발현을 Western Blot으로 확인한 것이다. "CHB"는 만성 B형 간염 환자를 나타내고, LC는 간 경화 환자를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. In vitro EMT 모델의 확립

FL83B 세포(Mouse normal hepatocyte cell line)(CRL-2390, ATCC) 를 2g/㎖의 인슐린(insulin)을 함유한 10% FBS, 1% 항생제(antibiotics) (Antibiotic-Antimycotic, Gibco)를 함유한 F12K배지에서 48시간 배양한 후, 2g/㎖의 인슐린과 3ng/㎖의 TGF-β을 0.5% FBS, 1% 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco)를 함유한 F12K 배지에 48시간 처리하여 in vitro EMT 모델을 구축하였다. 실험그룹은 2개 그룹으로 나뉘며 (1) 2g/㎖의 인슐린과 10% FBS, 1% 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco)를 함유한 F12K 배지에서 48시간 배양한 후 2g/㎖의 인슐린과 3ng/㎖TGF-β을 처리하지 않고 0.5% FBS, 1% 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco)를 함유한 배지에서 48시간 배양한 Control 48h 그룹, (2) 2g/㎖의 인슐린과 10% FBS, 1% 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco)를 함유한 F12K 배지에서 48시간 배양한 후 2g/㎖의 인슐린과 3ng/㎖TGF-β를 0.5% FBS, 1% 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco)를 함유한 배지에서 48시간 처리하여 배양한 EMT 48h 그룹으로 정하였다.

사용한 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco)의 성분은 페니실린(penicillin) 10,000 units/mL, 스트렙토마이신 10,000 ㎍/mL 및 Fungizone®25 ㎍/mL 으로 이루어져 있었다.

실시예 2. 간 섬유화 In vivo 모델의 확립

6주령의 Balb/c 마우스(오리엔트 바이오)를 5마리씩 몸무게(g)당 0.5L의 10% CCl₄를 매 3일 마다 8주간 복강 주사하여 간 섬유화 또는 간 경화를 유도하였다.

실시예 3. 환자 샘플

각각 7명의 만성B형 간염(chronic hepatitis B)과 간 경화 (liver cirrhosis) 환자 간 생검 조직을 가톨릭대학교 서울성모병원에서 제공 받아 본 실험에 사용하였다.

실시예 4. Total RNA 추출 및 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ( RT - PCR )

EMT가 유도된 세포에 TRIZOL reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1㎖을 넣고 혼합하여 상온에서 5분간 방치하였다. 여기에 0.2㎖의 클로로폼(chloroform)을 첨가하여 잘 섞은 다음 상온에서 2 ~ 3분간 방치한 후 4℃, 12,000g에서 15분간 원심 분리하여 무색의 상층액을 새로운 튜브(tube)로 옮겼다. 이 상층액에 0.5㎖의 아이소프로판올(isopropanol)을 혼합하고 실온에서 10분간 방치한 다음 4℃, 12,000 g에서 10분간 원심 분리하여 RNA를 침전시키고 상층을 제거하였다. 침전된 RNA에 1 ㎖의 75% 에탄올을 잘 혼합한 후 4℃, 12 000g에서 10분간 원심 분리하여 상층을 제거 하고 실온에서 10분간 건조시켰다. 건조된 RNA에 100 ㎕의 증류수를 첨가하여 녹인 후 이중 1㎕를 취하여 분광기(spectrometer)를 이용하여 흡광도를 측정하고 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 RNA의 순도를 확인하였다. 1g의 RNA을 RNA 중합효소연쇄반응 키트(polymerase chain reaction kit, Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성한 후, β-actin의 프라이머와 ELK3의 프라이머와 함께 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃ 1분, 55℃ 30초, 72℃ 1분을 한 주기로 25회 반복 증폭시킨 후 72℃에서 10 분간 반응 시켜 증폭하였다. 사용한 프라이머 서열은 아래에 나타내었다(표 1).

서열번호	유전자 이름	염기서열(5'→3')
1	β-actin Forward primer	GGCACCACACCTTCTACAATGA
2	β-actin Reverse primer	CCCTCGTAGATGGGCACAGT
3	ELK3 Forward primer	TCTACTCGTCCTTCACCATC
4	ELK3 Reverse primer	GATGTGCTTGTCGGTTTTAT

실시예 5. Western Blot 분석

EMT가 유도된 세포와 막자사발에서 파쇄시킨 간 섬유화 마우스의 간조직 또는 만성B형 간염(chronic hepatitis B)과 간 경화 (liver cirrhosis) 환자 간 생검 조직을 라이시스 버퍼(lysis buffer)로 단백질을 추출하고, 10% SDS-PAGE 겔(gel)에서 전기영동한 후, 나이트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membranes) (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)에 옮기고 이를 블로킹 버퍼(blocking buffer)로 상온에서 30분간 블로킹시켰다. 블로킹이 끝난 후 TBS-T로 10분씩 3번 세척한 후, 1차 항체에 반응시켰다. 1차 항체로는 단클론 마우스 α-sma 항체(monoclonal mouse anti α-sma) (Sigma-Aldrich), 다클론 토끼 ELK3 항체(polyclonal rabbit anti ELK3) (abCAM, UK), 단클론 토끼 E-cadherin 항체(monoclonal anti rabbit E-cadherin) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), 다클론 토끼 N-cadherin 항체(polyclonal anti rabbit N-cadherin) (Cell Signaling Technology), 단클론 마우스 β-catenin 항체(monoclonal mouse anti β-catenin) (BD Tansduction Laboratories, CA, USA)를 1% BSA가 함유된 TBS buffer에 1:1,000으로 희석하여 저온실(4℃)에서 하루 밤 반응시킨 후, 2차 항체는 겨자무과산화수소(horseradish peroxidase, HRP)가 연결된 anti rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), anti mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 각 반응은 모두 TBS-T를 이용하여 10분간 3회 세척하여 비 특이반응을 제거하였으며, ECL 용액(Amersham)을 이용하여 Las-4000(Fujifilm corporation, Japan)에 노출시켰다.

실험결과

1. In vitro EMT 모델에서의 세포의 morphology 변화 및 EMT 관련 marker 와 ELK3의 발현

FL83B cell에 TGF-β1을 48 시간 처리하여 in vitro EMT 모델을 유도한 후 세포의 형태(morphology)를 확인하였더니 Control 48h 그룹에 비해 TGF-β1 48h 그룹의 세포가 다각형의 간세포(hepatocyte)의 전형적인 형태에서 가늘고 긴 중간엽성 형태(mesenchymal morphology)로 변화한 것을 관찰할 수 있었다 (도 1).

EMT 유도 모델에서 EMT 관련 마커들의 단백질 발현을 Western Blot으로 관찰하였더니 Control 48h 그룹에 비해 TGF-β1 48h 그룹에서 상피(epithelial) 마커인 E-cadherin의 발현이 감소하였고 중간엽성(mesenchymal) 마커인 N-cadherin과 α-sma의 발현은 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 TGF-β1을 48시간 처리하여 EMT 모델이 확립되었음을 증명하였다.

또한 EMT 모델에서 ELK3의 발현을 관찰하였더니 Control 48h 그룹에 비해 TGF-β1 48h 그룹에서 ELK3의 발현이 증가한 것을 관찰할 수 있었다(도 2). 추가로 EMT 모델에서 ELK3의 발현을 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)으로 관찰하였더니 Control 48h 그룹에 비해 TGF-β1 48h그룹에서 ELK3의 mRNA 발현이 증가한 것을 관찰할 수 있었다 (도 3). 이러한 결과를 통해 EMT 모델에서 ELK3의 발현이 증가한다는 것을 확인하였다.

2. 간 섬유화 동물 모델에서의 EMT 관련 marker 와 ELK3 의 발현

Balb/c 마우스에 CCl₄를 처리하여 유도된 간 섬유화 동물 모델 조직에서 CCl₄ 처리 후 8주에서 정상 대조군에 비해 상피 마커인 E-cadherin과 β-catenin의 발현이 감소하였고 중간엽성 마커인 α-sma의 발현은 8주에서 정상 대조군에 비해 증가하였음을 확인함으로써 간 섬유화 동물 모델이 분자생물학적으로 구현되었음을 확인할 수 있었다. 또한 같은 조직에서 ELK3의 발현은 간 섬유화를 유도한 그룹에서 정상 대조군에 비해 증가한 경향을 확인할 수 있었다(도 4). 이러한 결과를 통해 EMT에 의해 유발되는 간 섬유화에 있어서 EMT와 유사한 경향성을 볼 수 있음을 확인하였다.

3. 만성 B형 간염 ( chronic hepatitis B)과 간 경화 ( liver cirrhosis ) 환자 간조직에서의 EMT 관련 marker 와 ELK3 의 발현 확인

만성 B형 간염 환자 간 조직에서는 정상 간 조직에 비해 상피 마커인 E-cadherin이 비슷하게 발현되었지만 간 경화 환자 간 조직에서는 정상 간 조직에 비해 E-cadherin의 발현이 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 만성 B형 간염 환자 간 조직에서의 ELK3의 발현은 정상 간 조직에 비해 비슷한 수준을 보였지만 간 경화 환자 간 조직에서는 정상 간 조직에 비해 ELK3의 발현이 증가한 것을 관찰할 수 있었다(도 5). 만성 B형 간염이 점차 진행이 되어 간 경화를 진행이 되면서 ELK3의 발현이 증가함을 확인하였다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomaker ELK3 for diagnosing liver fibrosis <130> DPP20132866KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Forward primer <400> 1 ggcaccacac cttctacaat ga 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Reverse primer <400> 2 ccctcgtaga tgggcacagt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELK3 Forward primer <400> 3 tctactcgtc cttcaccatc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELK3 Reverse primer <400> 4 gatgtgcttg tcggttttat 20

Claims

ELK3(member of ETS oncogene family) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 ELK3 단백질을 측정하는 제제는 ELK3 단백질에 특이적인 항체인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 항체는 ELK3 단백질에 특이적인 단클론 항체 또는 다클론 항체인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 ELK3 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 제제는 ELK3 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 진단용 키트.
간 섬유화 또는 간 경화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 간 조직 시료로부터 간 섬유화 또는 간 경화 진단 마커 ELK3를 검출하는 방법.
삭제
제6항에 있어서,
환자의 간 조직 시료로부터 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 상기 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 대조군 시료 내 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 ELK3 유전자의 mRNA 의 발현 정도를 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 ELK3 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것인 방법.
간 섬유화 또는 간 경화 치료제 후보물질을 처리한 후 ELK3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 간 섬유화 또는 간 경화 치료제의 스크리닝 방법.