CN116144765A - 生物标志物plxnc1在结直肠癌诊断、治疗和预后预测中的应用 - Google Patents

生物标志物plxnc1在结直肠癌诊断、治疗和预后预测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生物标志物PLXNC1在结直肠癌诊断、治疗和预后预测中的应用，所述生物标志物PLXNC1对结直肠癌具有较好的诊断效能，准确性、敏感性和特异性均较高，且本发明通过实验验证首次发现抑制PLXNC1表达水平的试剂可显著抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，表明了本发明所述的生物标志物PLXNC1能够应用于结直肠癌的诊断、治疗和预后预测中，具有较好的临床应用价值。

Description

生物标志物PLXNC1在结直肠癌诊断、治疗和预后预测中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及生物标志物PLXNC1在结直肠癌诊 断、治疗和预后预测中的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal carcinoma，CRC)是常见的严重影响人类健康和生存 的消化系统恶性肿瘤之一。2018年世界癌症统计指出，在36种常见癌症中，结 直肠癌新发病例超过180万，约占总癌症新发病例的10.2％，排名第3；死亡病 例数约为88万，约占总癌症死亡病例的9.2％，排名第2；全球185个国家或地 区中，我国的恶性肿瘤发病率、死亡率位居中等偏上水平(Bray F,Ferlay J, Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancersin 185 countries[J].CA Cancer J Clin,2018,68(6):394-424.)。最新的研究数据表明，2020年新增确诊结直肠癌患 者的人数超过180万人，且发病率呈逐年上升的趋势。
结直肠癌病死率高的原因是早期临床症状不明显，发现时常是中晚期，据报 道，早期诊断的结直肠癌患者5年生存率约为90％，而晚期诊断的患者5年生存 率下降至5％-10％(Lee PY,Chin SF,Low TY,et al.Probing the colorectal cancer proteome forbiomarkers:Current status and perspectives[J].J Proteomics,2018,187: 93-105.)，因此结直肠癌的早期筛查及诊断可以大幅降低结直肠癌的发病率和死 亡率。目前临床上广泛应用的筛查方法包括粪便检测、影像学检查、内镜检查及 肿瘤标志物检测等，其中粪便检测特异性不高，影像学检查费用昂贵，内镜检查 依从性差，而肿瘤标志物的有效性、经济性及安全性可以提高筛查的整体接受度， 是结直肠癌筛查的重要手段。
随着人类基因组计划的完成以及高通量测序技术的快速发展，基因筛查技术 已成为一种新的结直肠癌诊断方法，在结直肠癌的早期诊断中具有显著的优势， 但是由于结直肠癌在疾病早期没有明显症状，潜在患者仍然需要通过肠镜检查进 一步确诊。因此，针对结直肠癌的早期诊断和筛查，提供一种准确有效的结直肠 癌相关的生物标志物，以辅助结直肠癌的早期诊断和后期治疗，对本领域而言具 有重要意义。鉴于此，本发明通过研究发现PLXNC1可用于结直肠癌的早期诊 断和预后预测中，进一步的实验研究发现降低PLXNC1的表达水平可显著降低 结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，能够用于结直肠癌的治疗中，目前尚无 PLXNC1在结直肠癌诊断、治疗和预后预测中的应用的相关报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种生物标志物PLXNC1 在结直肠癌诊断、治疗和预后预测中的应用，以实现结直肠癌的早期诊断、早期 干预、早期治疗，进一步提高患者的生存质量和生存率。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂 在制备早期诊断结直肠癌的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括采用测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白 免疫技术、色谱技术、质谱技术检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试 剂。
进一步，所述检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂包括检测样 本中生物标志物PLXNC1 mRNA表达水平的试剂、和/或检测样本中生物标志物 PLXNC1编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂；
优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1 mRNA表达水平的试剂包括 特异性识别生物标志物PLXNC1的探针、和/或特异性扩增生物标志物PLXNC1 的引物；
优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1编码的蛋白和/或多肽表达水 平的试剂包括特异性结合生物标志物PLXNC1的抗体、和/或抗体片段、和/或亲 和性蛋白；
更优选地，所述特异性扩增生物标志物PLXNC1的引物的序列如SEQ ID NO:3-SEQID NO:4所示。
进一步，所述测序技术包括(但不限于)：一代测序、二代测序、三代测序， 其中，一代测序也称Sanger测序，是利用DNA聚合酶合成反应的测序技术，一 代测序是基于Sanger方法的测序技术；二代测序基于大规模平行测序技术 (Massive parallel analysis，MPS)，它能同时完成测序模板互补链的合成和序列 数据的获取；三代测序则基于单分子测序和大规模平行测序技术。
进一步，所述核酸杂交技术是指互补的核苷酸序列(DNA与DNA、DNA 与RNA、RNA与RNA等)通过Watson-Crick碱基配对形成非共价键，从而形 成稳定的同源或异源双链分子的过程，又称为核酸杂交。
进一步，所述核酸扩增技术是指一大类技术方法的总称，目前核酸扩增技术 包括常规PCR、实时荧光PCR、等温核酸扩增技术等，可将极微量的靶DNA特 异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分 子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。
进一步，所述蛋白免疫技术是指包括放射免疫测定、直接、间接或对比酶联 免疫吸附测定、酶免疫测定、荧光免疫测定、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、基于 任何颗粒的免疫测定(例如：使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子 点)对目标物进行检测的一类方法的统称，可在微量滴定板或条的形式中实施蛋 白免疫法。
进一步，所述色谱技术是指分离和分析复杂混合物中各个组分的方法，利用 不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对 运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使 各物质达到分离。
进一步，所述质谱技术是指利用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、 分子或分子碎片、有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、 亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用产生的离子)按它们的质荷比分离后进 行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。
进一步，所述样本选自受试者的血液或组织。
本发明的第二方面提供了检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂 在制备预测结直肠癌预后的产品中的应用。
本发明的第三方面提供了一种用于早期诊断结直肠癌或预测结直肠癌预后 的产品。
进一步，所述产品包含检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂；
优选地，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台；
优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂包括检测样 本中生物标志物PLXNC1 mRNA表达水平的试剂、和/或检测样本中生物标志物 PLXNC1编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂；
更优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1 mRNA表达水平的试剂包 括特异性识别生物标志物PLXNC1的探针、和/或特异性扩增生物标志物 PLXNC1的引物；
更优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1编码的蛋白和/或多肽表达 水平的试剂包括特异性结合生物标志物PLXNC1的抗体、和/或抗体片段、和/ 或亲和性蛋白；
最优选地，所述特异性扩增生物标志物PLXNC1的引物的序列如SEQ ID NO:3-SEQID NO:4所示。
进一步，所述芯片的制备可采用本领域技术人员已知的生物芯片的常规制备 方法，包括(但不限于)：采用修饰玻片或硅片的固相载体，探针的5’端含有氨 基修饰的聚dT串，将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰 玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到 本发明所述的芯片。
进一步，所述试剂盒还包括使用说明书或标签、阳性对照物、阴性对照物、 缓冲剂、助剂或溶剂；所述说明书或标签详细记载了如何使用所述试剂盒进行样 本的检测以及所述试剂盒用于检测结直肠癌。
进一步，所述试剂盒还可包含适于实用(如针对不同的检测方法)的多种不 同的试剂，并不限于目前本发明中所列举的试剂，只要是基于生物标志物PLXNC1的检测来诊断结直肠癌的试剂均包含在本发明的保护范围内。
本发明中所述的产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领 域技术人员熟知的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备，并 不局限于本发明所述的如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示引物。本发明中所述 的产品中的抗体，可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或 其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的产品中包括的抗体或其片段可以是 单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分或含 有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二 硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。 抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶 蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使 用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合癌细胞以获得杂交瘤。 然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的标志物蛋白或其 部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对标志物蛋白的单克隆抗体。
本发明的第四方面提供了生物标志物PLXNC1在制备用于治疗和/或预防结 直肠癌的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括降低PLXNC1表达水平的抑制剂；
优选地，所述降低PLXNC1表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示。
进一步，本发明中所述的降低PLXNC1表达水平的抑制剂并不局限于如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示的抑制剂，只要能够抑制或降低PLXNC1的表达水 平的试剂，均在本发明的保护范围内。
本发明的第五方面提供了一种用于治疗和/或预防结直肠癌的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包括降低PLXNC1表达水平的抑制剂；
优选地，所述降低PLXNC1表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述药物组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、 填充剂、结合剂及其它赋形剂，主要依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)：乳 糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二 醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂、 保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其 中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效 性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂 可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此 配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进 行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应当考虑给药途径、病人的健康状况等因素，这些都在熟练的医师技能范围 之内。
本发明的第六方面提供了一种筛选用于治疗和/或预防结直肠癌的候选药物 的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测物质与含有或表达PLXNC1的体系接触；
(2)检测所述体系中PLXNC1的表达水平；
(3)选择可降低PLXNC1表达水平的物质为治疗和/或预防结直肠癌的候选 药物。
进一步，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、 组织体系、器官体系或动物体系。
进一步，所述待测物质包括(但不限于)：针对生物标志物PLXNC1或其 上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物。
本发明的第七方面提供了生物标志物PLXNC1在筛选用于治疗和/或预防结 直肠癌的候选药物中的应用。
除非另有定义，本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领 域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描 述具体的实施例，不是旨在于限制本发明，此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“表达水平”，是指特定的生物标志物序列从其基因组基 因座被转录的程度，即生物标志物在一个或多个被分析血液中的浓度。在本发明 的具体实施例中，所述特定的生物标志物为PLXNC1。
本文中使用的术语“生物标志物”，是指具有特异性生物学特性、生物化学 特征或者其他方面特性的分子指示物，其可用于确定存在或不存在某种特定疾病 或状况和/或某种特定疾病或状况的严重程度。在本发明的具体实施例中，所述 某种特定疾病或状况指结直肠癌。在本发明中，所使用的术语“生物标志物”特 指化合物，优选为基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组 受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一 组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。该术语通常是指一种基因 的存在/浓度/含量或两种或更种基因的存在/浓度/含量，在本发明的具体实施例中， 所述生物标志物为PLXNC1；
生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所 述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、 至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、 至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般 以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、 至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、 至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、 至少95％、或100％(即不存在)，优选地，所述生物标志物以具有统计显著性 (P＜0.05)。
本文中使用的术语“样本”，是指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个 体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/ 或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，样本是指来源于感兴趣的受试者的任 何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于， 组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞 裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、 乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘 液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提 取物、及其组合。作为优选的实施方式，所述样本选自血液、血清、血浆，作为 另一优选的实施方式，所述样本选自组织。
本文中使用的术语“受试者”，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。 非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是 高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、 猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。 在优选的实施方式中，所述受试者为人。
本文中使用的术语“治疗”，是指涉及人类或动物(例如，被兽医所应用) 的治疗，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发 展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防) 的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术 语“治疗”中。
本文中使用的术语“差异表达”，是指生物标志物在靶样本中的表达水平与 在对照样本中相比是改变的，所述对照样本可以是健康人的样本，其可以是上调 (即在靶样本中生物标志物的浓度增加)或下调(即在靶样本中生物标志物的浓 度降低或消失)。在本发明的具体实施例中，所述生物标志物为PLXNC1。
本文中使用的术语“抑制剂”或“降低生物标志物表达水平的抑制剂”，是 指经化学修饰的专门针对细胞中特异的生物标志物的抑制剂，特异地靶向和敲除 生物标志物。
本发明中所述的生物标志物PLXNC1(plexin C1)在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Gene ID为10154，位于12号染色体长臂2 区2带上。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
(1)本发明首次发现PLXNC1可用作结直肠癌早期诊断和预后预测的生物 标志物，其在结直肠癌组织和正常的癌旁组织之间呈现显著性的差异表达，且具 有较高的诊断效能，AUC值高达0.90，能够用于结直肠癌的早期诊断或辅助诊 断、以及预后预测中；
(2)本发明首次发现抑制PLXNC1的表达可显著抑制结直肠癌细胞的增殖、 迁移和侵袭，表明了抑制所述生物标志物PLXNC1表达水平的试剂可用于结直 肠癌的治疗中，在本领域具有非常好的临床应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示PLXNC1 mRNA在对照组和结直肠癌组之间差异表达的结果图；
图2显示PLXNC1蛋白在原发结直肠癌患者的癌组织和正常癌旁组织之间差异 表达的结果图；
图3显示原发结直肠癌患者的癌组织和正常癌旁组织芯片的染色结果图；
图4显示PLXNC1蛋白在原发结直肠癌患者的癌组织和正常癌旁组织之间差异 表达的结果图；
图5显示PLXNC1 mRNA水平用作诊断结直肠癌生物标志物的ROC曲线结果图；
图6显示PLXNC1蛋白水平用作诊断结直肠癌生物标志物的ROC曲线结果图；
图7显示在不同的数据集中PLXNC1和结直肠癌患者预后关系的结果图，其中， A图：TCGA，B图：GSE39582，C图：GSE17536，D图：GSE37892；
图8显示QPCR检测PLXNC1在NC-siRNA组和PLXNC1-siRNA组的LOVO细 胞中相对表达水平的结果图；
图9显示LOVO细胞CCK-8细胞增殖实验的结果统计图；
图10显示LOVO细胞迁移实验的结果图和结果统计图，其中，A图：结果图， B图：结果统计图；
图11显示LOVO细胞侵袭实验的结果图和结果统计图，其中，A图：结果图， B图：结果统计图；
图12显示PLXNC1在CMS1-3型结直肠癌组织和CMS4型结直肠癌组织之间差 异表达的结果图，其中，A图：TCGA，B图：GSE17536，C图：GSE37892，D 图：GSE35896；
图13显示PLXNC1对CMS1-3型、CMS4型结直肠癌分子分型的诊断效能的结 果图，其中，A图：TCGA，B图：GSE17536，C图：GSE37892，D图：GSE35896。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解 为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理 和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1与结直肠癌相关的生物标志物的筛选与验证分析
1、筛选方法
(1)病人队列
TCGA结直肠癌队列的mRNA测序数据和临床信息下载自GDC网站。所有 表达量数据在使用前都转换为TPM单位。在剔除了正常、重复、缺失样本后， 共有590个样本被用于生存和后续分析。本实施例选择了四个基因芯片数据集 (GSE39582，GSE37892，GSE17536和GSE37182)作为验证集，表达矩阵和临床 信息下载自GEO数据库。
(2)数据库查询
PLXNC1 mRNA差异表达和ROC曲线分析数据来自于GSE37182；PLXNC1 的蛋白差异表达分析数据来自于CPTAC。
(3)组织芯片
本申请的发明人从中国上海的Superbiotek获得了30对结肠癌和相邻正常结 肠组织样本的组织芯片。本研究采用商业TMA进行回顾性研究，仅用于科学研 究目的，不涉及患者敏感的临床信息；
本实施例利用TMA做免疫组化分析，将TMA脱蜡、水合、用3％H2O2孵 育10分钟以去除内源性过氧化物酶。然后用柠檬酸缓冲液(pH 6.0)在蒸锅中 煮沸样品90秒。然后将标本在10％山羊血清中封闭30分钟，并与兔抗人原代 PLXNC1抗体(HPA066899,Sigma-Aldrich,Darmstadt,Germany)在4℃下孵育过 夜。之后将标本与山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(BST19013894, 博士特,中国武汉)在37℃下孵育30分钟。然后用3,3’-二氨基联苯胺(DAB) 孵育，苏木精染色；
使用APERIO ScanScope(莱卡生物系统，德国)对染色结果进行数字化分 析，并在APERIO ImageScope(莱卡生物系统，德国)中使用像素计数算法进行 评估，该算法将染色分为阴性、弱阳性、阳性或强阳性。每个标本的组织学评分 (h评分)按以下公式计算：1×(％弱阳性)+2×(％阳性)+3×(％强阳性)。这些标 本由两名对临床参数不知情的经验丰富的病理学家独立评分。
(4)生存分析
本实施例首先通过Kaplan-Meier分析评估PLXNC1对总生存期(Overallsurvival，OS)的预后影响。根据PLXNC1表达的最佳切点将患者分为两组。
2、统计方法
采用Wilcoxon符号秩和检验评估PLXNC1在TMA配对样本中的表达差异。 生存分析采用Log-rank检验。通过ROC曲线的AUC值来评估PLXNC1的预测 能力。其余数据采用Student’s t检验(正态分布变量)或Wilcoxon秩和检验(非 正态分布变量)进行分析。所有统计检验均采用R(版本：3.6.3)进行，显著性 阈值设为0.05。
3、实验结果
结果显示，与正常组织相比，PLXNC1在结直肠癌组织中的表达水平显著上 调(p<0.001)(见图1)；进一步在CPTAC数据中研究PLXNC1蛋白水平的差异 表达情况，并在含有30名结肠癌患者配对样本的组织芯片中进行了验证，结果 显示，原发结直肠癌肿瘤组织中PLXNC1蛋白的表达水平显著高于正常组织 (p＝0.005)(见图2)；组织芯片的结果显示，结直肠癌肿瘤组织中PLXNC1蛋 白的表达水平显著高于相邻正常组织(p<0.001)(见图3和图4)；
结果显示，PLXNC1的mRNA水平和蛋白水平作为结直肠癌生物标志物用 于结直肠癌的诊断时的AUC值分别高达0.90和0.76(见图5和图6)，具有较高 的准确性，表明了PLXNC1可用于结直肠癌的早期诊断中；
为了评估PLXNC1与预后的关系，本实施例将TCGA-COREAD患者根据 PLXNC1表达量分为两组，Kaplan-Meier曲线显示PLXNC1高表达的患者总体 生存期较差(见图7A)，进一步在三个GEO数据集中进行验证的结果显示，在 上述三个验证集中，PLXNC1高表达的患者总体生存率均较低(图7B、7C和7D)， 以上结果表明了PLXNC1对结直肠癌的预后预测具有较好的预测性能，能够用 于结直肠癌预后的准确预测中。
实施例2 PLXNC1的表达与结直肠癌的关系研究
1、细胞培养与siRNA转染
LoVo细胞系(人结肠癌细胞系)购自于BNBIO公司(北京，中国)，在添 加10％胎牛血清(Gibco,Carlsbad,CA,USA)和1％青霉素链霉素(Gibco,Carlsbad, CA,USA)的F-12K培养基(Gibco,Carlsbad,CA,USA)中培养，培养条件为 37℃和5％CO2的培养箱中培养。将LoVo细胞接种在12孔板中，使用
Figure BDA0003362876080000121
(Polyplus转染公司，Illkirch，法国)和50nMsiRNA转染48小时；
其中，针对PLXNC1的siRNA的序列如下：
正义链为5’-GAAACAACUCUUGCAUGUAAATT-3’(SEQ ID NO:1)；
反义链为5’-UUUACAUGCAAGAGUUGUUUCTT-3’(SEQ ID NO:2)。
2、QPCR检测细胞中PLXNC1的表达水平
根据制造商的说明使用RNeasy试剂盒从LoVo细胞中提取总RNA(Beyotime,Shanghai,456中国,R0027)。用SuperScript II逆转录酶对1μg总RNA进行逆转 录(TaKaRa,日本RR047)。根据制造商说明采用SYBR Green Mix(TaKaRa,Japan, RR820)和ABI 7900 HTReal-Time PCR系统进行实时定量PCR检测分析，分为 两步法PCR标准扩增程序，包括第一步预变性(98℃ 30秒)和第二部PCR扩 增(95℃ 5秒，60℃ 30秒，40个循环)，采用2-ΔΔCT进行相对定量；
首先设计QPCR的扩增引物，具体引物序列如下：
PLXNC1：
正向引物为5’-GGTCTGGTCCCCATTGAAGG-3’(SEQ ID NO:3)；
反向引物为5’-TTGGGCAACTCTCCTACCCT-3’(SEQ ID NO:4)；
内参基因GAPDH：
正向引物为5’-CTGACTTCAACAGCGACACC-3’(SEQ ID NO:5)；
反向引物为5’-TGAGCTTGACAAAGTGGTCGT-3’(SEQ ID NO:6)；
3、CCK-8细胞增殖实验
本实施例利用试剂盒对细胞进行计数(CCK-8；DOJINDO、熊本、日本)。将 LoVo细胞接种于96孔板(1×104cells/well)中，并用siRNA转染。每孔加CCK-8 试剂10μL，37℃的条件下孵育4h。用酶标仪(PerkinElmer EnVision,MA,USA) 在450nm处测量吸光度值。
4、细胞迁移实验与细胞侵袭实验
本实施例将2×104个LoVo细胞接种于Transwell上室(24孔，8μm,Corning, NY,USA)用于研究迁移反应；将2×104个LoVo细胞接种于Transwell上室(BD Biosciences,SanJose,CA,USA)，用于研究侵袭反应。siRNA转染后，在底室加 入添加10％胎牛血清的500μL培养基作为诱导剂。Transwell室在37℃和5％CO2的培养箱中培养48小时。然在每个Transwell小室的上下两面加入浓度为4％的 多聚甲醛(PFA)固定细胞20分钟。用0.1％结晶紫染色10分钟后去除上层的细 胞，在光学显微镜下计算细胞数量。
5、统计方法
采用Wilcoxon符号秩和检验评估PLXNC1在TMA配对样本中的表达差异。 生存分析采用Log-rank检验。通过ROC曲线的AUC值来评估PLXNC1的预测 能力。其余数据采用Student’s t检验(正态分布变量)或Wilcoxon秩和检验(非 正态分布变量)进行分析。所有统计检验均采用R(版本：3.6.3)进行，显著性 阈值设为0.05。
6、实验结果
为了进一步阐明PLXNC1在结直肠癌中的作用，本实施例通过转染PLXNC1 siRNA敲低了肿瘤细胞中的PLXNC1的表达水平，PCR的结果显示，相对于转 染NC-siRNA的对照组而言，转染PLXNC1 siRNA的LOVO细胞中的PLXNC1 的表达水平显著下降(见图8)；
CCK-8细胞增殖实验的结果显示，在结直肠癌细胞系LOVO细胞中，转染 PLXNC1siRNA的实验组的OD450值显著低于转染NC-siRNA的对照组的 OD450值(见图9)，表明了PLXNC1能够显著影响结直肠癌细胞的增殖活性， 降低PLXNC1的表达水平可显著降低结直肠癌细胞的增殖能力；
细胞迁移实验的结果显示，在结直肠癌细胞系LOVO细胞中，转染PLXNC1 siRNA的实验组的迁移细胞数显著低于转染NC-siRNA的对照组的迁移细胞数 (见图10)，表明了PLXNC1能够显著影响结直肠癌细胞的迁移能力，降低 PLXNC1的表达水平可显著降低结直肠癌细胞的迁移能力；
细胞侵袭实验的结果显示，在结直肠癌细胞系LOVO细胞中，转染PLXNC1 siRNA的实验组的侵袭细胞数显著低于转染NC-siRNA的对照组的侵袭细胞数 (见图11)，表明了PLXNC1能够显著影响结直肠癌细胞的侵袭能力，降低 PLXNC1的表达水平可显著降低结直肠癌细胞的侵袭能力；
综上所述可知，降低PLXNC1的表达水平可显著降低结直肠癌细胞的增殖、 迁移和侵袭能力，提示降低PLXNC1表达水平的试剂能够用于结直肠癌的治疗 中。
实施例3 PLXNC1作为结直肠癌分子分型标志物的研究
1、分析方法和验证方法
(1)病人队列
TCGA结直肠癌队列的mRNA测序数据和临床信息下载自GDC网站。所有 表达量数据在使用前都转换为TPM单位，并剔除了正常、重复、缺失的样本； 本实施例共选择了三个基因芯片数据集(GSE17536，GSE37892，GSE35896)，其 中，TCGA结直肠癌数据集、GEO数据集GSE17536、GSE37892、GSE35896均 作为验证集，表达矩阵和临床信息下载自GEO数据库；
在验证集TCGA中，CMS1-3型的结直肠癌患者共353例，CMS4型的结直 肠癌患者共136例；
在验证集GSE17536中，CMS1-3型的结直肠癌患者共120例，CMS4型的 结直肠癌患者共40例；
在验证集GSE37892中，CMS1-3型的结直肠癌患者共79例，CMS4型的结 直肠癌患者共41例；
在验证集GSE35896中，CMS1-3型的结直肠癌患者共70例，CMS4型的结 直肠癌患者共22例。
结直肠癌的分子分型(Consensus molecular subtype，CMS)是国际结直肠癌 分型协作组(The CRC Subtyping Consortium，CRCSC)于2015年综合了六套 CRC分型数据开发了一套基于网络生物学的整合性分型算法，根据该算法建立 得到的标准分子分型，具体分子分型如下：
CMS1型：又称为MSI免疫型，表现为高的MSI和CIMP，低的CIN和强 免疫原性，近70％的BRAF突变的患者都集中在这一型中；
CMS2型：又称为经典型，表现为高CIN和低CIMP特征，因此肿瘤具有典 型的上皮分化特征，并存在大量的体细胞拷贝数改变(Somatic copy number alterations，SCNAs)；
CMS3型：又称为代谢型，表现为中等程度的CIN和CIMP，30％的个体还 具有MSI特征，KRAS突变的患者也在此型中相对富集。此型患者最突出的特 征是细胞代谢谱的改变和代谢重编程，各种糖、脂、氨基酸、核苷酸代谢均处于 活跃状态，尤其是谷氨酰胺分解和脂肪生成通路异常活化。CMS3型肿瘤的免疫 原性同样较低，但患者整体预后较好；
CMS4型：又称为间质型，表现为高CIN、低MSI和CIMP，它与CMS2型 的主要区别是癌旁组织中有大量的基质细胞，CMS4型的表现为间充质表型和免 疫微环境的改变，在四个CMS型中预后最差。
(2)差异表达分析
使用R软件中的student’t检验对TCGA、GSE17536、GSE37892、GSE35892 数据集中的PLXNC1表达量做差异分析。
(3)PLXNC1对结直肠癌分子分型诊断效能的验证
使用R包“pROC”执行接收器工作特性(ROC)分析，绘制四个验证集中 的受试者工作特征(ROC)曲线，在上述四个验证集中，分别将生物标志物 PLXNC1作为检测变量，分析其用于结直肠癌分子分型标志物的AUC值、敏感 性和特异性，判断PLXNC1对结直肠癌分子分型的诊断效能。其中，使用PLXNC1 的表达量进行分析。首先调用pROC包，然后读入PLXNC1构建的表达量矩阵， 运行绘制ROC曲线的命令，其中命令采用for循环，同时涉及添加AUC、Thres (阈值)、Smooth(拟合曲线)的命令。
2、实验结果
结果显示，在四个验证集中，与CMS1-3型的结直肠癌组织相比，PLXNC1 在CMS4型结直肠癌组织中的表达水平均显著高于CMS1-3型结直肠癌组织(见 图12A-12D)，表明了PLXNC1在CMS1-3型结直肠癌和CMS4型结直肠癌之间 存在显著性的差异表达(p＜0.001)；
结果显示，在四个验证集中，PLXNC1对结直肠癌CMS1-3型、CMS4型的 分子分型区分诊断具有较高的准确性，AUC值均大于0.80(见图13A-13D)，表 明了PLXNC1能够用于结直肠癌分子分型的准确区分诊断中。
虽然为了清楚理解起见已通过图例和实例非常详细地描述了前述发明，但明 显地，在所述权利要求的范围内可以作出某些改变和修改，所作出的这些改变和 修饰也将落入本发明权利要求保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂在制备早期诊断结直肠癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括采用测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、色谱技术、质谱技术检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂包括检测样本中生物标志物PLXNC1 mRNA表达水平的试剂、和/或检测样本中生物标志物PLXNC1编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂；
优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1 mRNA表达水平的试剂包括特异性识别生物标志物PLXNC1的探针、和/或特异性扩增生物标志物PLXNC1的引物；
优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂包括特异性结合生物标志物PLXNC1的抗体、和/或抗体片段、和/或亲和性蛋白；
更优选地，所述特异性扩增生物标志物PLXNC1的引物的序列如SEQ ID NO:3-SEQ IDNO:4所示。
4.检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂在制备预测结直肠癌预后的产品中的应用。
5.一种用于早期诊断结直肠癌或预测结直肠癌预后的产品，其特征在于，所述产品包含检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂；
优选地，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台；
优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1表达水平的试剂包括检测样本中生物标志物PLXNC1 mRNA表达水平的试剂、和/或检测样本中生物标志物PLXNC1编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂；
更优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1 mRNA表达水平的试剂包括特异性识别生物标志物PLXNC1的探针、和/或特异性扩增生物标志物PLXNC1的引物；
更优选地，所述检测样本中生物标志物PLXNC1编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂包括特异性结合生物标志物PLXNC1的抗体、和/或抗体片段、和/或亲和性蛋白；
最优选地，所述特异性扩增生物标志物PLXNC1的引物的序列如SEQ ID NO:3-SEQ IDNO:4所示。
6.生物标志物PLXNC1在制备用于治疗和/或预防结直肠癌的药物组合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括降低PLXNC1表达水平的抑制剂；
优选地，所述降低PLXNC1表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示。
8.一种用于治疗和/或预防结直肠癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括降低PLXNC1表达水平的抑制剂；
优选地，所述降低PLXNC1表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示。
9.一种筛选用于治疗和/或预防结直肠癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测物质与含有或表达PLXNC1的体系接触；
(2)检测所述体系中PLXNC1的表达水平；
(3)选择可降低PLXNC1表达水平的物质为治疗和/或预防结直肠癌的候选药物。
10.生物标志物PLXNC1在筛选用于治疗和/或预防结直肠癌的候选药物中的应用。
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